一、鸭瘟鸡胚化疫苗毒的电镜观察（论文文献综述）
杨承槐[1]（2014）在《鸭肠炎病毒及其致弱毒株基因组的分子特征和生物学特性》文中研究指明鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）,又名鸭瘟（Duck plague, DP）,是鸭、鹅及其它雁形目禽类的一种急性、接触性传染病,其特征是血管损伤、组织出血、消化道粘膜损伤、淋巴器官受损和实质性器官退行性病变,死亡率高,造成重大经济损失。该病的病原为鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）,又称为鸭瘟病毒,属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、马立克病毒属、鸭疱疹病毒1型。本研究利用鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast, CEF）,将我国鸭肠炎病毒强毒参考株（DEV CSC）进行连续传代致弱,分析了强、弱毒株的全基因组序列特征以及致弱毒株的生物学特性,以期揭示DEV在体外传代致弱的分子基础；构建出DEV gE和gI基因的缺失毒株,分析了gE和gI基因对病毒毒力的影响,旨在为揭示DEV的分子致病机理奠定基础以及为开发DEV基因缺失疫苗提供科学依据。利用454测序平台,对DEV CSC进行了全基因组序列测定。结果表明,DEV CSC基因组全长162,131bp,共78个ORF,编码76个蛋白。全基因组比较发现,DEV CSC与2000年四川分离的DEV CHv株同源性高达99.99%,只有21个核苷酸替换（15个非同义和6个同义）和52个核苷酸缺失或插入,除了在UL41中有3个核苷酸连续插入外,其余核苷酸缺失或插入均在非编码区内；大部分非同义突变（10/15）位于基因组的5’末端。DEV CSC与2005年德国分离的DEV2085株的同源性为98.92%,主要差异是DEV2085株的UL区的5’端连续缺失1,170bp。与DEV CSC相比,鸡胚传代致弱株DEV K p63基因组短4,040bp,在UL区的5’端利3’端分别缺失3,513bp和528bp;76个ORF中有63个ORF的核苷酸序列完全一致,2个ORF（UL56和US10）在C端有移框变异,UL2连续缺失176个氨基酸。将DEV CSC经CEF连续传80代,进行全基因组序列测定,分析了基因组和生物学特性的变化。结果表明,前4代无明显细胞病变,第5代出现少量蚀斑样细胞病变,随代次增加,出现细胞病变时间提前；第25代蚀斑面积显着减小（p<0.01）,随后蚀斑面积稳定,各代次间无明显差异；第80代毒（DEV p80）基因组全长为160,328bp。与亲本病毒DEV CSC基因组相比,DEV p80基因组的145,818-147,618nt连续缺失共1,801bp,导致US7（gI）基因3’端和US8（gE）基因5’端缺失,此外,还有12个点突变,其中8个位于预测的ORF内,导致LORF4、UL51、UL9、UL7、UL4和US3共6个蛋白存在单个氨基酸变异。经临床症状、体温、病毒血症、泄殖腔排毒、大体病变、组织学病变、免疫组化和荧光定量PCR检测,比较了传代前后DEV致病性的差异,结果显示,DEV p80接种鸭未出现体温明显升高或临床症状,对消化道和淋巴器官无明显病理学损伤,消化道和淋巴器官中病毒拷贝数明显下降,表明DEV p80对鸭无致病性。攻毒保护试验结果表明,DEV p80具有良好的免疫原性,鸭免疫后5d,即可100%抵抗致死性强毒的攻击。gI和gE基因是疱疹病毒重要的毒力决定因子。为了证实gI和gE基因对DEV毒力的影响,以DEV CSC为亲本病毒,应用同源重组技术,构建出一株缺失145,818～147,618nt的重组病毒DEV-△US78-GFP,并比较了重组病毒及其亲本病毒的体内体外生物学特性。结果表明,重组病毒DEV-△US78-GFP在DEF中产生的蚀斑明显小于亲本病毒（p<0.001）：一步生长曲线也有所不同,DEV-△US78-GFP在细胞和上清中病毒含量峰值均为亲本病毒1/80左右,且到达峰值的时间分别延迟了24h和36h；重组病毒DEV-AUS78-GFP接种4周龄鸭,未出现明显的临床症状和大体病变。这些结果表明,gI利/或gE对DEV在细胞间传播和细胞中的复制有重要影响,是DEV重要的毒力决定因子。综上所述,本研究完成了我国鸭肠炎病毒强毒参考株的全基因组序列测定与分析；发现DEV经鸡胚成纤维细胞连续传代可导致gI和gE基因的缺失,失去对鸭的致病力,并具有良好的免疫原性；构建了缺失gI和gE基因的DEV突变株,经体内、体外试验证实,与其他疱疹病毒一样,DEV gI和／或gE基因对病毒在细胞间传播和毒力具有重要影响。本研究结果为DEV的分子致病机理以及基因缺失疫苗开发提供了科学依据。
陈淑红[2]（2006）在《鸭肠炎病毒部分基因组序列的克隆与分析》文中研究说明鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）,又名鸭瘟（Duck plague, DP）,是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）引起的鸭、鹅及多种雁形目动物的一种急性、热性、败血性传染病。DEV系疱疹病毒科成员之一,其分子生物学方面的研究十分有限,相对落后于其它疱疹病毒,其基因组结构和物理图谱尚属未知。目前已知DEV TK、UL24和gH基因ORF,对于UL6、UL7和UL30基因仅已知部分核苷酸序列,其基因组90%以上属于未知,与此相关的基础研究,如病毒的基因功能以及病毒在机体细胞和组织中的复制机理、病毒感染过程以及机体抗病毒感染机制等多方面研究均有许多不明之处。同时,与此相关的预防、控制等措施以及基于基因组序列的基因工程疫苗的研究应受到重视。本实验研究主要以蚀斑纯化株DEV Clone-03的基因组未知序列为主要对象,以分子生物学技术为主要手段,提供病毒基因分子特性,为后续研究奠定基础。首先进行DEV的蚀斑纯化、增殖以及PCR检测;然后使用靶基因步行PCR（targeted gene walking PCR）方法扩增DEV基因组未知序列;之后进行病毒基因的ORF预测和序列分析;最后进行UL6基因的原核表达及融合蛋白兔体高免血清的制备。用CEF单层细胞对DEV疫苗株进行蚀斑纯化,将蚀斑纯化毒命名为DEV克隆疫苗（DEV Clone-03）株,将此毒通过绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚。根据GenBank发表的DEV LA（Lake Andes）株UL6基因部分核苷酸序列（登录号:AF043730）设计引物P1和P2;根据GenBank发表的DEV疫苗（DP-VAC）株UL30区域核苷酸序列（登录号:AF064639）设计引物P11和P12,用这两对引物对DEV Clone-03进行PCR检测。用P1和P2引物检测DEV Clone-03在鸡胚体内的分布,结果表明:接毒死亡鸡胚的尿囊膜、心、肝、脾、肺、肾和肌肉皮肤内均存在病毒;PCR敏感试验表明此方法可以检测到100μl尿囊液中提取的10-3稀释的病毒DNA。收取接毒死亡鸡胚尿囊液,磷钨酸负染电镜观察,可以见到典型的疱疹病毒粒子。Targeted gene walking PCR方法是以一段已知序列为出发点,采用特异性引物与非特异性引物相结合的方法扩增已知序列周围的未知序列部分,从而使已知序列不断延伸。本实验以DEV Clone-03基因组DNA为模板,用此方法扩增DEV Clone-03基因组未知序列,结果表明targeted gene walking PCR方法扩增DNA病毒基因组未知序列切实可行。选取两段核苷酸序列作为扩增起始点,其中一段是UL6区域的由引物P1和P2扩增的516 bp核苷酸序列（A）,另一段是UL30区域的由引物P11和P12扩增的234 bp核苷酸序列（B）。以A为起点扩增得到9 732 bp片段,从中预测到7个基因ORF,它们编码的多肽分别与单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus 1,HSV-1）的UL1、UL2、UL3、UL4、UL5、UL6和UL7蛋白具有同源性,将这7个基因分别命名为DEV Clone-03的UL1、UL2、UL3、UL4、UL5、UL6和UL7 HSV-1同源基因,各基因ORF大小依次为711 bp、474 bp、720 bp、714 bp、2 568 bp、2 373 bp和966 bp,编码氨基酸数量依次为236、157、239、237、855、790和321。以B为起点扩增得到17 841 bp的片段,从中预测到7个基因ORF,它们编码的多肽分别与HSV-1的UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29和UL30蛋白具有同源性,将这7个基因分
郭宇飞[3]（2005）在《鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株部分生物学特性的研究及荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用》文中研究指明本论文对鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株（DEV-CHv）部分生物学特性及荧光实时定量PCR对其检测方法的建立和应用进行了研究,主要内容可归纳如下: 1.对DEV-CHv进行了适应在DEF上生长的研究。10日龄鸭胚经胰酶消化和机械分散后,其成纤维细胞在含10%小牛血清的MEM营养液中生长36h左右后成为致密的细胞单层。DEV-CHv人工感染成年健康鸭后,取病死鸭肝脏组织接种绒毛尿囊腔经10日龄鸭胚连续传代2次,然后取病毒致死鸭胚绒毛尿囊液接种DEF的方法可以使DEV-CHv开始适应在DEF上生长;而病死鸭肝脏组织中的DEV-CHv直接接种在DEF上不能生长。刚刚适应了在DEF上生长的DEV-CHv以细胞变圆,细胞折光度增强,细胞间隙有颗粒状缺失出现为主要病变特征;DEV-CHv经过连续传代6次适应了在DEF上生长以后,细胞病变以成纤维细胞的脱落和形成圆形蚀斑为主要病变特征。DEV-CHv接种DEF后通常30h左右出现细胞脱落,36h左右在细胞单层上形成明显的蚀斑,到48h时细胞病变可达80%以上。通过对飞片的染色镜检可以发现,DEV-CHv可在DEF中形成嗜酸性核内包涵体,可使DEF发生细胞融合而产生含有10多个细胞核的合胞体。 2.通过超薄切片和透射电子显微镜技术对DEV-CHv在DEF中的形态学和形态发生学进行了研究。其中形态学方面的研究结果表明:DEV-CHv病毒核酸呈圆形颗粒状,直径35nm—45nm,在胞核内常集中分布;病毒核衣壳呈圆形,直径90nm—100nm,在胞核和胞浆内都有分布;病毒核衣壳根据所含核酸形态的差异可分为空心核衣壳、内壁附有颗粒型核衣壳、同心圆形核衣壳和实心核衣壳,其中的内壁附有颗粒型核衣壳又可分为三角星形、四角星形、五角星形、六角星形核衣壳等多种类型;DEV-CHv成熟病毒粒子具有囊膜和皮层结构,呈圆形,直径150nm—300nm,常见位于胞浆空泡内;DEV-CHv在DEF中可形成胞浆内包涵体和胞核内包涵体结构;伴随子代病毒在细胞中的出现,胞浆内还出现了豆荚状、马
李成,谷守林,姜绍德,郝桂玉,张坦,蔡虹,黄金华[4]（1996）在《鸭瘟鸡胚化疫苗毒的电镜观察》文中认为鸭瘟鸡胚化疫苗毒的电镜观察李成，谷守林，姜绍德，郝桂玉，张坦，蔡虹，黄金华（中国农科院哈尔滨兽医研究所）鸭瘟（Ｄｕｃｋｐｌａｑｕｅ）是鸭、鹅及天鹅的一‘种急性、接触性、败血性传染病。临诊特征是软弱、腹泻、流泪，两脚麻痹和部分病鸭头颈部发生肿大。肝脏有...
袁桂萍[5]（2007）在《鸭瘟强毒在实验感染鸭体内的致病与复制特征及dUTPase基因发现和初步鉴定》文中指出鸭瘟病毒（Duck plague virus，DPV）属于α-疱疹病毒，是一种泛嗜性全身性感染的病毒，可引起鸭、鹅、雁及其它雁形目禽类的一种急性、接触性、败血性传染病，是目前对养鸭业的一大危害。电子显微学技术是研究病毒形态结构、鉴定新病毒、阐明病毒的发育循环、研究感染宿主病理学的一个重要方法，它在病毒学研究中具有不可替代的作用。相对其它α-疱疹病毒而言，DPV研究的总体水平较低。本文通过人工感染DPV强毒复制鸭瘟（Duck Plague，DP）急性病例，对病毒的形态结构和病毒形态发生学以及病毒在体内的分布情况进行研究，同时观察病毒引起宿主细胞的超微结构变化和诱导宿主细胞凋亡情况，以期系统地了解DPV的入侵方式和复制机理，为阐明鸭瘟的发病机制提供关键的实验数据。dUTP焦磷酸酶是DNA合成中的一种重要的酶，病毒dUTPase在病毒DNA的合成及病毒的复制增殖起重要作用。疱疹病毒dUTPase常与病毒的毒力有关，尤其是与病毒的神经毒力和神经侵袭力以及病毒从潜伏感染状态活化的能力相关。本文在DPV基因文库的大量测序结果中发现一个1344bp的完整dUTPase基因，开展了该基因在DPV基因组的酶切图谱定位研究，并建立基于该基因的区分DPV强毒和弱毒的PCR方法。结果如下：1．鸭瘟强毒致实验感染鸭细胞超微结构变化用DPV CHv强毒株感染成年鸭复制鸭瘟急性病例，分别于接种后不同时间，取心、肝、肾、脾、胸腺、十二指肠、法氏囊、脑和胰组织，制作超薄切片。电镜观察结果表明：DPV感染宿主后，超微结构变化最早发生于肝和肾，而鸭死亡后以免疫器官和消化器官损伤最严重。各种细胞的变化主要为肿胀坏死，表现为细胞肿胀，染色质或浓缩、碎裂或溶解，线粒体肿胀，嵴断裂、溶解至呈空泡样结构，其它细胞器破坏；脾、胸腺、法氏囊以及小肠固有层中的淋巴细胞在感染24h后在出现细胞坏死的同时还出现较为明显的细胞凋亡变化。而鸭死亡后淋巴细胞主要表现为黑洞核样变化，整个细胞凝聚深染，染色质固缩，细胞浆均质深染，细胞膜模糊或不完整。2．鸭瘟强毒在实验感染宿主细胞内的形态发生学电镜观察病毒在宿主体内的分布和形态发生学结果表明：感染后12h在脾脏和法氏囊首先观察到少量的子代DPV出现，24h后在脾、胸腺和法氏囊以及死亡鸭的肝、肠中均观察到具有典型的疱疹病毒粒子及其核衣壳形态的DPV，而在胰腺和大脑组织中也观察到少量的病毒颗粒。DPV病毒核衣壳有空心型、致密核心型、双环型、拟核型和内壁附有颗粒型等多种形态。病毒核内核衣壳通过内外核膜进入胞浆，核内和胞浆内的核衣壳在细胞浆中获得皮层，然后在各种质膜上获得囊膜，最后成熟病毒通过细胞破裂或其他方式释放到细胞外。伴随着病毒的复制、装配和成熟，细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密颗粒、核内微管和中空短管等病毒相关结构。3．鸭瘟强毒致感染鸭淋巴细胞凋亡利用电镜技术观察DPV人工感染宿主细胞超微结构变化时，我们发现了典型的细胞凋亡现象：感染鸭脾、胸腺、法氏囊以及小肠固有层中的淋巴细胞在感染24h后在出现细胞坏死的同时还出现较为明显的细胞凋亡变化。疾病发生过程中，淋巴细胞凋亡数量明显增多。凋亡细胞的形态学变化表现为细胞体积缩小，细胞器结构正常，染色质初期浓集成团，聚集于核膜的周边，随后出现染色质凝聚，核碎裂，细胞膜上出现空泡，带有单位膜结构的凋亡小体形成，凋亡细胞和凋亡小体随即被临近细胞或巨噬细胞吞噬消化。没有被吞噬的凋亡细胞细胞膜逐渐皱缩、溶解。进一步用琼脂糖凝胶电泳（DNAladder）和原位末端标记（TUNEL）方法对DPV致宿主淋巴细胞的凋亡情况进行了检测，感染鸭的胸腺、法氏囊、脾脏出现典型的180-200bp的梯状条带（ladder），TUNEL染色也在这些组织切片中观察到了棕色的阳性细胞。研究结果表明，DPV感染造成宿主淋巴细胞的坏死和凋亡共同导致淋巴细胞的大量损耗，而淋巴细胞的这种变化可能在鸭瘟的发病机制中起着重要的作用。4．鸭瘟病毒dUTPase基因的发现及分子特征分析选取本实验室构建的DPV DNA基因文库中的一个重组质粒并测序后用NCBI的BLASTN和ORF Finder工具初步分析发现一个全长为1344bp完整ORF片段。通过NCBI的BLASTP分析，初步确定为dUTPase基因（在GenBank注册的登录号为DQ486149）。运用CLUSTALX、DNAstar、SignalP、TMHMM、NetPhos2.0和ESyPred3D等工具对该ORF1344编码蛋白进行了全面的生物信息学分析。结果显示，该基因编码一个447个氨基酸的多肽，没有信号肽切割位点，其分子量理论值约为49.7KD。通过CLUSTALX与Genbank中的dUTPase的氨基酸序列进行比较并构建系统进化树，结果表明：该基因编码的肽链与疱疹病毒的dUTPase有较高的同源性。通过进化树分析表明该肽链与α-疱疹病毒（禽疱疹病毒、马疱疹病毒、牛疱疹病毒和伪狂犬病毒等）编码的dUTPase在遗传上一致。ORF1344编码肽链具有dUTPase蛋白质家族保守区域，抗原性分析表明该肽链上存在多个抗原表位。该蛋白质为一种膜外蛋白，没有跨膜区存在。该蛋白有23个潜在的磷酸化位点，有3个潜在的N-糖基化位点，二级结构中存在5段主要的疏水区域。空间结构分析表明DPV dUTPase肽链中的两个区域的空间结构与Ⅰ型dUTPase的空间结构一致。蛋白质定位分析表明该蛋白主要定位于胞质和胞核中。本研究在国内外首次发现了鸭瘟病毒的dUTPase基因，为DPVdUTPase基因的克隆和后续的DPV分子生物学研究提供了基础数据。5．鸭瘟dUTPase基因克隆和在基因组中的定位研究根据测序和分析结果，设计一对引物DU1／DU2（扩增幅度为1344bp，含完整的DPV dUTPase基因）对DPV基因组DNA进行扩增并克隆到pGEM-T载体上，测序结果表明克隆片断的序列与预期一致。将DPVCHv株经鸭胚成纤维细胞进行培养增殖后，收集病毒液，病毒经初步提纯后提取DNA。采用HindⅢ和SacⅠ限制性内切酶对DPV CHv株基因组进行酶切消化，用标记有生物素的引物进行PCR扩增并获得的dUTPase基因探针，将dUTPase探针与DPV基因酶切条带杂交以进行dUTPase基因在酶切图谱上的定位分析，试验结果证实该基因存在于DPVCHv株基因组HindⅢ酶切的Ⅰ片段上和SacⅠ酶切的M片段上。6．基于dUTPase基因强弱毒PCR方法的建立和应用利用DPV dUTPase引物DU1／DU2，建立基于DPV dUTPase基因的PCR方法。对正常DEF细胞、尿囊液，DPVCHa弱毒株进行扩增，只能在DPV强毒株中能扩增特异性条带，而其它病原体（鸭病毒性肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒、鸭沙门氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、小鹅瘟病毒、马立克病毒和鸡传染性喉气管炎病毒）的核酸提取物不能扩增出任何条带。该对引物的灵敏度可达到10pg。应用该PCR方法对15份DPV感染病料进行PCR检测，均能扩增出与预期大小一致的特异性条带。结果表明该方法可应用于临床鸭瘟的诊断与检测和DPV强毒株和疫苗株的PCR鉴别诊断。
王文洁[6]（2008）在《鸭病毒性肠炎病毒gB基因主要抗原区域原核表达及其ELISA检测方法的建立》文中研究指明鸭病毒性肠炎（Duck virus enteritis,DVE）,俗称鸭瘟（Duck plague,DP）,是鸭、鹅、大雁等多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,由鸭病毒性肠炎病毒（Duckenteritis virus,DEV）引起。病毒基因组编码十几种糖蛋白,其中gB蛋白是病毒囊膜表面展示的主要蛋白之一,也是主要的免疫原蛋白。本试验使用鸡胚成纤维细胞培养鸭病毒性肠炎病毒,提纯病毒后提取病毒DNA作模板。根据GenBank获取DEV基因序列（登录号EF203709）,利用生物学软件DNAstar分析DEV gB蛋白氨基酸序列,筛选出其抗原性高、水溶性和表面展示概率高的2个区域(分别命名为gBaAsp113～Ala478;gBb Thr218～Val584),PCR扩增出这两段主要抗原区域并且克隆进入载体pMD18-T Vector,目的基因经PCR酶切鉴定后连接至原核表达载体pET-32a（+）。获得的重组质粒分别转化E coli BL21（DE3）感受态细胞,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下以包涵体的形式高效表达,Western-blotting分析及重组蛋白免疫小鼠实验中血清抗体ELISA检测结果表明表达产物具有良好的抗原性,具有DEV诊断抗原及亚单位疫苗的应用前景。表达重组蛋白pET-32a-gBa经过初步纯化之后用作包被抗原,建立了针对DEV血清抗体的间接ELISA检测方法。并且确定了最适抗原包被浓度为2.5μg/mL、最适血清稀释度为1:800、血清最适作用时间90min、最佳封闭条件为0.15%的BSA 4℃封闭24h、酶标抗体最适稀释度为1:1000,最适作用时间为30min,底物最适显色时间为37℃5min,判定标准为OD450≥0.446为阳性。应用该间接ELISA方法检测了实验室保存的DEV阳性血清。结果表明该诊断方法具有良好的特异性及敏感性,显示了良好的应用前景。本研究成功克隆表达了DEV gB基因的主要抗原区域,获得了可溶性表达的目的蛋白,为研究gB基因的功能奠定了良好的基础。利用表达的重组蛋白pET-32a-gBa成功建立了快速简便的ELISA诊断方法,为开发DEV商品化试剂盒,进行DEV流行病学调查及对其控制消灭提供了一定的技术支撑。
李慧昕[7]（2007）在《鸭肠炎病毒部分基因结构及相关功能的初步研究》文中研究表明鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis，DVE），又名鸭瘟（Duck plague，DP），是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病，曾在多个国家和地区发生流行，给养鸭业造成巨大的经济损失。DEV是疱疹病毒科成员，第八次病毒分类报告将其划分为疱疹病毒科未分类病毒。由于DEV分子生物学研究相对滞后，其基因组组成和结构未知，在很大程度上限制了DEV致病机制及该病在防控方面的研究。本研究根据本实验室提交至GenBank上的DEV clone-03部分基因组序列，选择在疱疹病毒中较为保守的囊膜蛋白UL27、主要衣壳蛋白UL19以及在绝大多数疱疹病毒成员基因组排列中保守的基因簇（UL22-TK-UL24）进行测序。选取同源性较高的α-疱疹病毒同源蛋白作为参考毒株，应用DNAStar软件对5个基因进行序列比对，分析各个基因编码蛋白的保守区。结果表明，DEV clone-03 UL19和UL27保守，UL22次之，TK具有胸苷激酶特征性结构域：ATP结合结构域和核苷结合结构域。与HSV-1相似，UL24也存在5个保守位点。UL22和UL27编码的蛋白具有跨膜糖蛋白典型特征，UL22具有7个糖基化位点，6个跨膜区，在N末端1～21位氨基酸为信号肽序列，符合疱疹病毒gH糖蛋白的特点；UL27有9个潜在的糖基化位点，3个跨膜区，符合疱疹病毒gB糖蛋白的特点。此外，根据5个基因编码氨基酸序列进行系统发育进化分析，发现DEV clone-03与马立克病毒属亲缘关系较近，但又形成独立分支。根据这5个基因比较结果，建议将鸭肠炎病毒归类为疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科。为了鉴定DEV clone-03结构基因，将DEV clone-03 UL19基因分成UL19-N、UL19-M、UL19-C三段进行原核表达并制备抗血清。同时表达UL27基因中段UL27-M和UL6基因的UL6-1和UL6-2二段，应用Western blot和间接免疫荧光方法检测6个重组蛋白的单因子血清与DEV clone-03全病毒的反应性。结果表明UL19-N、UL19-M和UL19-C三段蛋白制备的抗血清均能够与全病毒发生特异性反应，在大约150kDa处检测到特异性蛋白条带，大小与DNAStar软件预测的DEVclone-03 UL19蛋白大小一致，说明DEV clone-03 UL19是病毒的结构蛋白，大小约为150kDa，结合与其他疱疹病毒同源蛋白共有的保守区，初步认为DEV clone-03 UL19可能是病毒的衣壳蛋白。应用Western blot方法检测UL27，未能够在DEV clone-03中检测到预期大小的蛋白条带，但是，应用间接免疫荧光方法检测，UL27-M抗血清能够与全病毒发生抗原抗体反应，说明DEVclone-03 UL27是病毒的组成成分，结合与其他疱疹病毒同源蛋白共有的保守区，以及UL27具有跨膜糖蛋白特征，推测DEV clone-03 UL27可能是病毒的囊膜糖蛋白。应用UL6-2蛋白抗血清检测DEV全病毒，在大约88kDa处检测到特异性蛋白条带，与DNAStar软件预测DEV clone-03 UL6蛋白大小一致，结合其他研究报道，初步认为DEV clone-03 UL6是病毒的结构蛋白。应用DNAStar软件对上述检测抗原性较好的DEV clone-03 UL19蛋白从蛋白的亲水性、抗原性以及表面可及性进行表位预测，三段蛋白均存在抗原表位优势区，因此选取UL19-C段蛋白制备单克隆抗体，拟对UL19抗原表位进行初步定位。将UL19-C蛋白作为抗原免疫6-8周龄的BALB／c小鼠，制备单克隆抗体，经过3次克隆，分别采用间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光方法筛选，最后得到4株（185、3A1、4F9、6F6）稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。将DEV clone-03 UL19-C分成两段进行表达，N端命名为UL19-C1、C端命名为UL19-C2，二者有16个氨基酸的重叠。Western blot检测，4株单克隆抗体均能够识别UL19-C1蛋白，而不能够与UL19-C2发生特异性反应，说明获得的4株单克隆抗体都是针对UL19-C1蛋白的，即在DEV clone-03 UL19蛋白C端921～1162位氨基酸的片段内有能够被4株单克隆抗体识别的抗原表位。
文明[8]（2005）在《DEV基因文库构建、核衣壳蛋白基因的发现及克隆与表达》文中研究说明鸭病毒性肠炎（Duck virus enteritis,DVE）,俗称鸭瘟（Duck plague,DP）是鸭、鹅和大雁等雁形目水禽的一种急性接触性传染病。感染后,患鸭主要表现为急性败血性过程,其特征是血管损伤、体腔出血、消化道出血（或炎症、坏死）、淋巴器官受损及实质器官退行性变化等,具有较高的发病率和死亡率,是目前水禽养殖业的重要传染病之一。本病病原为鸭病毒性肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）,俗称鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）,亦称鸭疱疹病毒1型（Anatid herpesvirus 1,AHV-1）,系疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科成员之一,是一种泛嗜性全身性感染的病毒。本研究以DEV CHv株为基本材料,对该毒株进行了提纯研究和基因组酶切分析;构建了DEV基因文库,经比对发现并克隆、鉴定了其核衣壳蛋白基因;利用该基因片段设计引物,建立了基于DEV核衣壳蛋白基因的一种PCR检测方法;同时将该基因克隆到原核表达载体pET32a中,对其进行了表达及其表达产物抗原性的研究。主要内容包括: 1.比较了四种方法对DEV Chv株的提纯效果,并对病毒结构蛋白进行了初步分析:将DEV CHv株经鸭胚和鸭胚成纤维细胞（DEF）进行培养增殖后,收集病毒液,采用沉淀法、层析法、差速离心法和蔗糖密度梯度离心法等4种方法对DEV进行了提纯比较,结果表明:通过DEF增殖、经不连续蔗糖密度梯度法提纯DEV,效果较好,电镜下能观察到纯净、多量的完整病毒粒子;病毒粒子由囊膜、衣壳和核芯等三个部分组成,直径为170nm～190nm;在囊膜与衣壳之间还存在一层较厚的皮层结构。用Bradford法测得纯化病毒液中的病毒含量为0.71mg/mL;经SDS—PAGE电泳发现,DEV结构蛋白主要由11种多肽组成,即VP1（190kD）、VP2（136kD）、VP3（106kD）、VP4（88kD）、VP5（75kD）、VP6（68kD）、VP7（56kD）、VP8（48kD）、VP9（42kD）、VP10（38kD）
刘峰源[9]（2008）在《鸭肠炎病毒糖蛋白gC基因的克隆、表达及部分功能的研究》文中指出鸭病毒性肠炎（duck virus enteritis,DVE）,又名鸭瘟（duck plague virus）,是由鸭肠炎病毒（duck enteritis virus,DEV）引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,曾在多个国家和地区发生流行,给养鸭业造成巨大的经济损失。DEV是疱疹病毒科成员,第八次国际病毒分类报告将其划分为疱疹病毒科未分类病毒属。糖蛋白C（gC）是疱疹病毒的第二种主要囊膜蛋白,它对病毒的吸附、释放和毒力起着重要作用,而且能诱导中和抗体产生。因此,对gC蛋白的研究不仅对病毒分子生物学功能特征有重要意义,而且在临床诊断、疾病预防、基因工程疫苗研究也具有重要意义。本研究以鸭肠炎病毒（DEV）C-KCE株基因组为模板,通过Tail-PCR的方法扩增了DEV C-KCE毒株未知的糖蛋白C（gC）基因及其两侧的序列,包括部分UL43同源序列、完整的UL44同源序列（gC基因）以及与UL45基因之间的部分非编码区,将其克隆到pMD18-T载体上,构建了pMD18-T-UL45-44和pMD18-T-UL44-43质粒,并进行了测序。DNA序列分析发现gC基因全长1296bp,编码431个氨基酸,有两个可能的启动子和poly（A）信号;部分UL43同源基因长600bp,编码200个氨基酸。对gC基因进行信号肽、糖基化位点（N-X-T/S）和跨膜区预测发现,gC基因的1-22位氨基酸为其信号肽区域;1-398位氨基酸位胞外区,399-421位氨基酸为跨膜区,422-431位氨基酸为胞质区;有四个潜在的糖基化位点。与12株已报道的具有完整gC （UL44）同源基因序列的疱疹病毒参考株进行比较,DEV C-KCE gC基因与α疱疹病毒gC同源基因有3个保守区域。系统进化分析DEV的gC基因,发现其与α-疱疹病毒亚科中禽的疱疹病毒亲缘关系较近。利用大肠杆菌表达系统pET30a（+）（E. coli Rosetta）,对不含信号肽部分的gC基因胞外区进行了原核表达,SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小为49kDa且具有较高的表达水平,目的蛋白（His-gC）占菌体蛋白的比例为30%。His-gC融合蛋白是以包涵体的形式存在的。Western-blotting分析表明所表达的蛋白具有良好的抗原性。经分离纯化融合蛋白His-gC,制备了抗DEV gC蛋白的兔抗血清,并进行了特异性鉴定,特异性良好。以生长在盖玻片上的CEF细胞中DEV病毒为抗原,以上述制备的兔抗DEV gC血清为一抗,进行间接免疫荧光染色,发现荧光主要集中于细胞膜和细胞质中。以兔抗DEV gC血清为中和抗体,进行蚀斑减数中和试验。结果显示,所制得的血清有中和活性,从而间接证明了糖蛋白gC上含有中和抗原表位。以表达的重组gC蛋白为刺激原,进行鸭淋巴细胞增殖试验,试验结果表明:gC蛋白具有刺激机体T细胞的增殖功能。采集刺激鸭的淋巴细胞上清,用USCN公司的鸭IFN-γ检测试剂盒检测其中的IFN-γ水平。结果表明,gC蛋白能刺激淋巴细胞产生IFN-γ,说明糖蛋白C能刺激机体的细胞免疫。
闫虹光[10]（2008）在《鸭肠炎病毒的提纯和间接ELISA诊断方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）又名鸭瘟（Duck plague, DP）,是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）引起的鸭、鹅、天鹅及其它雁形目禽类的一种急性、热性、接触性的传染病,其特征是流行广泛、传播迅速、发病率和死亡率高。当前迫切需要建立可靠的检测手段,以便能正确地了解鸭群的健康状态和免疫抗体水平。本试验将DEV鸡胚化弱毒AV1222株通过鸡胚成纤维细胞增殖,细胞毒经反复冻融、差速离心收集病毒沉淀。将其等量分成三份,分别用蔗糖不连续密度梯度离心法、酒石酸钾不连续密度梯度离心法、氯化铯不连续密度梯度离心法三种纯化方法提纯。通过对三种纯化方法提纯的病毒进行电镜观察、浓度测定及ELISA抗原性检测,确定蔗糖不连续密度梯度离心法提纯的病毒纯度和浓度都高、ELISA抗原性好,是DEV较为理想的纯化方法。蔗糖密度梯度离心后的30%-40%、40%-50%、50%-60%三层收集的病毒经SDS-PAGE电泳,三层病毒条带清晰,Western-Blot检测结果表明:30%-40%、40%-50%层收集的病毒能够与DVE阳性血清发生特异性结合,确定以这两层病毒作为ELISA的包被抗原。以经蔗糖梯度纯化的DEV包被酶联板,建立了鸭病毒性肠炎间接ELISA诊断方法。通过方阵试验确定了包被抗原的浓度为3.64μg/ mL,血清稀释度为1:100;通过检测190份阴性血清确定了ELISA的判定标准,S/P≥0.125判为阳性,S/P<0.100判为阴性。阻断试验表明,细胞毒能在49.32%的程度上阻断与阳性血清的反应,对阴性血清没有明显影响。交叉试验表明:包被抗原与鸭其它7种疾病的阳性血清不发生交叉反应。本诊断方法与血清中和试验相比较,符合率为100%;与本实验室已经建立的DEV UL19重组蛋白间接ELISA诊断方法相比较,符合率为95.35%。批内变异系数为2.20%-8.40%,批间变异系数为1.61%-8.26%,均小于10%。上述结果表明本诊断方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。应用本诊断方法对免疫鸭的特异性抗体水平进行了监测,免疫后第7天就已经产生抗DEV特异性抗体,28天抗体达到峰值;对免疫攻毒鸭抗体监测结果显示,抗体在攻毒后第2周时达到峰值,攻毒后第13周仍维持较高的抗体水平。对哈尔滨、齐齐哈尔、大庆送检的507份血清样品进行了检测,阳性检出率为35.1%,显示出良好的应用前景。本研究以提纯的鸭肠炎病毒作为包被抗原建立了间接ELISA诊断方法,本诊断方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为开发商品化试剂盒、免疫鸭的抗体监测和DVE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。
二、鸭瘟鸡胚化疫苗毒的电镜观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸭瘟鸡胚化疫苗毒的电镜观察（论文提纲范文）
（1）鸭肠炎病毒及其致弱毒株基因组的分子特征和生物学特性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图与附表清单 |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 国内外研究现状 |
| 1.2 研究的目的和意义 |
| 1.3 研究内容和技术路线 |
| 1.4 研究目标 |
| 第二章 鸭肠炎病毒强毒参考株全基因组序列测定与分析 |
| 摘要 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸭肠炎病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传代及基因组变异分析 |
| 摘要 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 鸭肠炎病毒传代致弱毒株的致病性与免疫原性分析 |
| 摘要 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 鸭肠炎病毒gE和gI基因缺失株的构建与致病性分析 |
| 摘要 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 第七章 创新点 |
| 第八章 文献综述 |
| 8.1 历史 |
| 8.2 病原学 |
| 8.3 分子生物学 |
| 8.4 流行病学 |
| 8.5 病理学 |
| 8.6 诊断 |
| 8.7 预防和控制 |
| 8.8 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）鸭肠炎病毒部分基因组序列的克隆与分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 引言 |
| 1.1 疱疹病毒分类 |
| 1.2 疱疹病毒形态结构 |
| 1.3 疱疹病毒基因组结构 |
| 1.4 疱疹病毒基因及其编码产物 |
| 1.5 鸭病毒性肠炎的国内外研究进展 |
| 1.5.1 鸭病毒性肠炎简介 |
| 1.5.2 鸭肠炎病毒简介 |
| 1.5.3 鸭肠炎病毒形态发生 |
| 1.5.4 鸭病毒性肠炎的诊断 |
| 1.5.5 鸭病毒性肠炎的防制 |
| 1.5.6 鸭肠炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.6 鸭病毒性肠炎存在的问题与展望 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 1.8 研究内容和方法 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、鸡胚和鸡胚成纤维细胞 |
| 2.1.2 载体与受体菌 |
| 2.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鸭肠炎病毒的纯化 |
| 2.2.2 病毒的鉴定 |
| 2.2.3 PCR 检测病毒在鸡胚体内的分布 |
| 2.2.4 PCR 敏感性测定 |
| 2.2.5 Targeted gene walking PCR 扩增DEV Clone-03 未知基因 |
| 2.2.6 PCR 产物的克隆和序列测定 |
| 2.2.7 病毒基因的ORF 预测和序列分析 |
| 2.2.8 分段进行DEV Clone-03 UL6 基因的原核表达 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 DEV 的纯化、增殖与鉴定 |
| 3.1.1 DEV 引起的细胞和鸡胚病变 |
| 3.1.2 PCR 鉴定产物及电镜观察 |
| 3.1.3 引物P1/P2 PCR 扩增产物的核苷酸序列 |
| 3.1.4 引物P11/P12 PCR 扩增产物的核苷酸序列 |
| 3.1.5 PCR 检测病毒在鸡胚体内的分布 |
| 3.1.6 PCR 检测的敏感性 |
| 3.2 DEV Clone-03 基因的扩增 |
| 3.2.1 DEV Clone-03 UL1～UL7 基因区和UL25～UL30 基因区 |
| 3.2.2 UL1 基因序列分析 |
| 3.2.3 UL2 基因序列分析 |
| 3.2.4 UL3 基因序列分析 |
| 3.2.5 UL4 基因序列分析 |
| 3.2.6 UL5 基因序列分析 |
| 3.2.7 UL6 基因序列分析 |
| 3.2.8 UL7 基因序列分析 |
| 3.2.9 UL25 基因序列分析 |
| 3.2.10 UL26 基因序列分析 |
| 3.2.11 UL26.5 基因序列分析 |
| 3.2.12 UL27 基因序列分析 |
| 3.2.13 UL28 基因序列分析 |
| 3.2.14 UL29 基因序列分析 |
| 3.2.15 UL30 基因序列分析 |
| 3.3 DEV Clone-03 UL6 基因的分段表达 |
| 3.3.1 表达载体pET-UL6-1 的构建 |
| 3.3.2 表达载体pET-UL6-2 的构建 |
| 3.3.3 表达产物的SDS-PAGE 分析 |
| 3.3.4 Western-blot 鉴定免疫后血清效价 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 DEV 的蚀斑纯化、增殖和检测 |
| 4.2 DEV UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的扩增和序列分析 |
| 4.2.1 Targeted gene walking PCR 方法扩增DEV 基因 |
| 4.2.2 DEV Clone-03 UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的排列 |
| 4.2.3 DEV Clone-03 UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的起始密码子 |
| 4.2.4 DEV Clone-03 UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的特征 |
| 4.3 DEV Clone-03 UL6 基因的原核表达 |
| 4.4 实验创新 |
| 5. 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株部分生物学特性的研究及荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用（论文提纲范文）
| 作者声明 |
| 目录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 本论文中常用的英文缩写词汇含义说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章． 鸭病毒性肠炎研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第二章． 鸭病毒性肠炎病毒 CH强毒株适应鸭胚成纤维细胞的研究 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章图示 |
| 第三章． 鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株在鸭胚成纤维细胞中形态结构和形态 |
| 发生学的研究 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章图示 |
| 第四章． 鸭病毒性肠炎病毒 CH强毒株致鸭胚成纤维细胞发生细胞凋亡作用的研究 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四章图示 |
| 第五章． TaqMan-MGB探针荧光实时定量 PCR检测鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株方法的建立和应用 |
| 材料方法 |
| 结果与讨论 |
| 小结 |
| 第六章． 从鸭胚成纤维细胞中分离纯化鸭病毒性肠炎病毒 CH强毒株方法的研究 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第七章． 鸭病毒性肠炎病毒 CH强毒株的结构蛋白分析 |
| 材料方法 |
| 结果与讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 附录 论文附表和附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介以及攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）鸭瘟强毒在实验感染鸭体内的致病与复制特征及dUTPase基因发现和初步鉴定（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 本论文中常用英文缩写词汇含义说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 疱疹病毒在感染宿主细胞内复制及致病特征 |
| 第二章 脱氧尿苷焦磷酸酶研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 鸭瘟强毒致实验感染鸭宿主细胞超微结构变化研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 鸭瘟强毒在实验感染鸭宿主细胞内的形态发生学研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 鸭瘟强毒致感染鸭宿主细胞凋亡的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 鸭瘟病毒dUTPase基因的发现及其分子特征分析 |
| 1 序列相似性搜索 |
| 2 ORF预测 |
| 3 采用NCBI的BLASTP对该1344bp的ORF进行分析 |
| 4 ORF编码蛋白(即dUTPase)的生物信息学分析 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第七章 鸭瘟强毒dUTPase基因克隆和在基因组中的定位研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第八章 基于dUTPase基因鉴别鸭瘟强弱毒PCR方法的建立和应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介以及攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）鸭病毒性肠炎病毒gB基因主要抗原区域原核表达及其ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鸭病毒性肠炎研究进展 |
| 2 鸭病毒性肠炎病毒囊膜糖蛋白gB研究进展 |
| 3 实验研究目的和意义 |
| 4 研究内容和方法 |
| 参考文献 |
| 研究内容 |
| 第二章 鸭病毒性肠炎gB基因主要抗原区域原核表达及其产物的抗原性分析 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第三章 鸭病毒性肠炎病毒重组抗原间接ELISA诊断方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）鸭肠炎病毒部分基因结构及相关功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.2 鸭肠炎病毒生物学特性 |
| 1.2.1 鸭肠炎病毒特性 |
| 1.2.2 鸭肠炎病毒形态发生 |
| 1.3 鸭肠炎病毒分子生物学研究进展 |
| 1.4 鸭病毒性肠炎诊断方法研究进展 |
| 1.4.1 综合分析流行病学、临床症状和病理变化 |
| 1.4.2 病毒的分离和鉴定 |
| 1.4.3 血清学方法 |
| 1.4.4 分子生物学方法 |
| 1.5 鸭病毒性肠炎的防制 |
| 1.5.1 灭活苗 |
| 1.5.2 弱毒疫苗 |
| 1.5.3 治疗 |
| 1.6 疱疹病毒分类及基因组结构 |
| 1.6.1 疱疹病毒分类 |
| 1.6.2 疱疹病毒形态结构 |
| 1.6.3 疱疹病毒基因组结构 |
| 1.6.4 疱疹病毒基因及其表达调节 |
| 1.6.5 疱疹病毒主要结构蛋白 |
| 1.7 B细胞抗原表位的筛选 |
| 1.7.1 抗原表位概述 |
| 1.7.2 B细胞抗原表位的研究方法 |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 第二章 鸭肠炎病毒部分基因系统发育进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 质粒与菌种 |
| 2.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 扩增引物 |
| 2.1.6 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 2.1.7 鸭肠炎病毒的增殖 |
| 2.1.8 鸭肠炎病毒滴度的测定 |
| 2.1.9 鸭肠炎病毒基因组DNA提取及PCR扩增 |
| 2.1.10 基因的分子特征及系统发育进化分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 鸭肠炎病毒在鸡胚成纤维细胞上的TCID_(50)、细胞病变及蚀斑形态 |
| 2.2.2 DEV clone-03 UL19、TK及其侧翼序列及UL27的PCR扩增 |
| 2.2.3 DEV clone-03 UL19、UL22、TK、UL24及UL27基因的分子特征 |
| 2.2.4 鸭肠炎病毒系统发育进化分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 鸭肠炎病毒增殖 |
| 2.3.2 鸭肠炎病毒部分基因的分子特征 |
| 2.3.3 鸭肠炎病毒系统发育进化分析 |
| 第三章 鸭肠炎病毒部分功能基因的鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒与细胞 |
| 3.1.2 质粒与菌种 |
| 3.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 扩增引物 |
| 3.1.6 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 3.1.7 鸭肠炎病毒的增殖 |
| 3.1.8 鸭肠炎病毒基因组DNA提取及PCR扩增 |
| 3.1.9 DEV clone-03 TK、UL19-N、UL19-M、UL19-C及UL27-M重组表达质粒的构建 |
| 3.1.10 DEV clone-03 TK、UL19-N、UL19-M、UL19-C及UL27-M表达及纯化 |
| 3.1.11 抗血清的制备 |
| 3.1.12 Western blot检测UL6、UL19及UL27 |
| 3.1.13 间接免疫荧光检测DEV clone-03 UL6、UL19及UL27 |
| 3.1.14 DEV clone-03 UL19作为诊断抗原的初步应用 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PCR扩增 |
| 3.2.2 重组质粒p19N、p19M、p19C、pTK及p27M的鉴定 |
| 3.2.3 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.4 重组蛋白的表达及纯化 |
| 3.2.5 DEV clone-03 UL6、UL19及UL27的Western blot鉴定 |
| 3.2.6 DEV clone-03 UL6、UL19及UL27的间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2.7 DEV clone-03 UL19检测疑似鸭病毒性肠炎血清样品 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 表达载体的选择 |
| 3.3.2 DEV clone-03 UL19、TK和UL27的表达 |
| 3.3.3 DEV clone-03 UL19、TK及UL27的纯化和复性 |
| 3.3.4 DEV clone-03 UL19、UL27和UL6的鉴定 |
| 3.3.5 DEV clone-03 UL19检测鸭病毒性肠炎 |
| 第四章 鸭肠炎病毒UL19抗原表位的初步定位 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 质粒与菌种 |
| 4.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 4.1.4 实验动物 |
| 4.1.5 扩增引物 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.1.7 动物免疫 |
| 4.1.8 间接ELISA检测方法的建立 |
| 4.1.9 细胞融合 |
| 4.1.10 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.1.11 杂交瘤细胞的克隆化 |
| 4.1.12 细胞冻存及复苏 |
| 4.1.13 单克隆抗体腹水的制备 |
| 4.1.14 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定 |
| 4.1.15 DEV clone-03 UL19抗原表位的初步定位 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 抗原的制备 |
| 4.2.2 ELISA筛选方法的建立 |
| 4.2.3 动物免疫与抗体水平检测 |
| 4.2.4 细胞融合率 |
| 4.2.5 杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.2.6 腹水效价的测定 |
| 4.2.7 杂交瘤细胞染色体分析 |
| 4.2.8 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 4.2.9 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 4.2.10 DEV clone-03 UL19-C1、UL19-C2基因片段的扩增 |
| 4.2.11 重组质粒的鉴定 |
| 4.2.12 重组表达质粒的构建 |
| 4.2.13 DEV clone-03 UL19-C1、UL19-C2的表达 |
| 4.2.14 DEV UL19抗原表位的初步定位 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 DEV clone-03 UL19单克隆抗体的制备 |
| 4.3.2 DEV clone-03 UL19抗原表位的初步定位 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）DEV基因文库构建、核衣壳蛋白基因的发现及克隆与表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 文献综述 |
| 第一章 几种家禽疱疹病毒研究概况 |
| 第二章 病毒结构蛋白的功能及其体外表达优化策略 |
| 实验研究 |
| 第三章 DEV CHv株的增殖、提纯及其结构蛋白初步分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第四章 DEV CHv株基因组 DNA的限制性内切酶分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第五章 DEV基因文库构建及核衣壳蛋白基因的发现、克隆与鉴定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第六章 基于DEV核衣壳蛋白基因PCR方法的建立与应用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第七章 DEV核衣壳蛋白基因原核表达载体的构建 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第八章 DEV重组核衣壳蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及其抗原性初探 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 读书期间发表或参与发表论文情况 |
（9）鸭肠炎病毒糖蛋白gC基因的克隆、表达及部分功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 鸭肠炎病毒(DEV)的特点、诊断及其防治的研究现状 |
| 1.1.1 DEV 的特性 |
| 1.1.2 鸭病毒性肠炎的诊断 |
| 1.1.3 鸭肠炎病毒的防治 |
| 1.2 α-疱疹病毒糖蛋白 C 的特点、功能及应用 |
| 1.2.1 α-疱疹病毒糖蛋白C 的特点 |
| 1.2.2 α-疱疹病毒糖蛋白C 的生物学功能 |
| 1.2.3 α-疱疹病毒糖蛋白C 的应用 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 毒株、菌株、细胞和载体 |
| 2.1.3 常用生物学试剂 |
| 2.1.4 细胞培养用试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 鸭肠炎病毒GC 基因的克隆 |
| 2.2.1 病毒的增殖 |
| 2.2.2 DEV 基因组DNA 的提取 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.4 Tail-PCR 扩增DEV 未知基因 |
| 2.2.5 PCR 产物的克隆和转化 |
| 2.2.6 重组质粒阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 2.2.7 序列测定 |
| 2.2.8 病毒基因ORF 预测和序列拼接 |
| 2.2.9 鸭肠炎病毒gC 基因及其编码蛋白的生物信息学分析 |
| 2.3 鸭肠炎病毒GC 蛋白的表达、鉴定和抗体的制备 |
| 2.3.1 表达引物的设计与合成 |
| 2.3.2 目的基因的获取 |
| 2.3.3 表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.4 目的基因的表达和纯化 |
| 2.3.5 表达条件优化 |
| 2.3.6 表达产物的Western blot 分析 |
| 2.3.7 兔抗重组gC 蛋白高免血清的制备及鉴定 |
| 2.4 鸭肠炎病毒GC 基因部分功能的研究 |
| 2.4.1 鸭肠炎病毒gC 基因定位的研究 |
| 2.4.2 鸭肠炎病毒gC 蛋白中和活性的鉴定 |
| 2.4.3 鸭肠炎病毒gC 蛋白刺激细胞免疫的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸭肠炎病毒GC 基因的克隆 |
| 3.1.1 鸭肠炎病毒gC 基因的扩增 |
| 3.1.2 重组克隆载体的鉴定 |
| 3.1.3 序列拼接及ORF 初步分析 |
| 3.1.4 鸭肠炎病毒gC 基因及其编码蛋白的生物信息学分析 |
| 3.2 鸭肠炎病毒GC 蛋白的表达、鉴定和抗体的制备 |
| 3.2.1 目的基因的获取 |
| 3.2.2 表达载体的构建及鉴定 |
| 3.2.3 目的基因的表达 |
| 3.2.4 表达条件优化 |
| 3.2.5 表达产物的Western blot 分析 |
| 3.2.6 原核表达目的蛋白的抗体的制备和鉴定 |
| 3.3 鸭肠炎病毒GC 基因部分功能的研究 |
| 3.3.1 鸭肠炎病毒gC 基因定位的研究 |
| 3.3.2 鸭肠炎病毒gC 蛋白中和活性的鉴定 |
| 3.3.3 鸭肠炎病毒gC 蛋白刺激细胞免疫的检测 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 TAIL-PCR |
| 4.2 糖蛋白GC 的分子特征 |
| 4.3 DEV GC 基因表达、纯化、鉴定及抗体的制备 |
| 4.4 鸭肠炎病毒GC 基因部分功能的研究 |
| 4.4.1 鸭肠炎病毒gC 基因定位的研究 |
| 4.4.2 鸭肠炎病毒gC 蛋白中和活性的鉴定 |
| 4.4.3 鸭肠炎病毒gC 蛋白刺激细胞免疫的检测 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）鸭肠炎病毒的提纯和间接ELISA诊断方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.1 历史回顾 |
| 1.2 病原 |
| 1.2.1 病毒的形态特征与理化特性 |
| 1.2.2 病毒基因组 |
| 1.2.3 鸭肠炎病毒形态发生 |
| 1.3 流行病学及致病性 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床症状及病理变化 |
| 2 诊断方法研究进展 |
| 2.1 病原分离鉴定 |
| 2.2 分子生物学诊断方法 |
| 2.2.1 核酸探针技术 |
| 2.2.2 原位杂交技术（ISH） |
| 2.2.3 常规PCR 诊断技术 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR 技术 |
| 2.3 血清学诊断方法 |
| 2.3.1 血清中和试验（SN） |
| 2.3.2 琼脂糖凝胶沉淀试验(AGP) |
| 2.3.3 反向间接血凝试验(RPHA) |
| 2.3.4 间接免疫荧光试验（IFA） |
| 2.3.5 微量固相放射免疫试验(Micro-SPRIA) |
| 2.3.6 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 3 防治 |
| 3.1 预防 |
| 3.1.1 灭活苗 |
| 3.1.2 弱毒疫苗 |
| 3.2 治疗 |
| 4 研究的目的和意义 |
| 第一章 鸭肠炎病毒抗原的提纯 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 SPF 鸡胚 |
| 1.1.2 病毒 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 阴阳性血清的制备 |
| 1.2.2 间接ELISA 操作程序 |
| 1.2.3 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.2.4 病毒的增殖 |
| 1.2.5 半数细胞感染量（TCID_(50)）的测定 |
| 1.2.6 病毒的粗纯 |
| 1.2.7 蔗糖不连续密度梯度离心法 |
| 1.2.8 酒石酸钾不连续密度梯度离心法 |
| 1.2.9 氯化铯不连续密度梯度离心法 |
| 1.2.10 病毒含量的测定 |
| 1.2.11 病毒的电镜观察 |
| 1.2.12 间接ELISA 抗原性分析 |
| 1.2.13 SDS-PAGE 凝胶电泳 |
| 1.2.14 Western-Blot 分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CEF 细胞的病变情况 |
| 2.2 阴阳性血清的制备 |
| 2.3 病毒毒价的测定 |
| 2.4 三种密度梯度离心结果 |
| 2.5 病毒浓度测定结果 |
| 2.6 电镜观察结果 |
| 2.7 ELISA 分析结果 |
| 2.8 蔗糖不连续密度梯度纯化的病毒SDS-PAGE 凝胶电泳结果 |
| 2.9 WESTERN-BLOT 分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 病毒增殖材料的选择 |
| 3.2 病毒纯化方法的比较 |
| 3.3 病毒的抗原性比较 |
| 第二章 鸭病毒性肠炎间接ELISA 诊断方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株及疫苗 |
| 1.1.2 包被抗原 |
| 1.1.3 血清 |
| 1.1.4 实验鸭 |
| 1.1.5 主要试剂 |
| 1.1.6 主要的仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 血清中和试验操作程序 |
| 1.2.2 酶联板均一性试验 |
| 1.2.3 抗原最佳包被浓度与阴阳性血清最佳稀释度的确定 |
| 1.2.4 阴阳性血清最佳作用时间的确定 |
| 1.2.5 酶标抗体最佳工作浓度的确定 |
| 1.2.6 酶标抗体最佳作用时间的确定 |
| 1.2.7 最佳封闭液的确定 |
| 1.2.8 底物显色时间的确定 |
| 1.2.9 间接ELISA 方法判定标准的确定 |
| 1.2.10 敏感性试验 |
| 1.2.11 交叉反应试验 |
| 1.2.12 阻断试验 |
| 1.2.15 批内重复性试验 |
| 1.2.16 批间重复性试验 |
| 1.2.13 与血清中和试验比较 |
| 1.2.14 与鸭肠炎病毒UL19 重组蛋白间接ELISA 诊断方法比较 |
| 1.2.17 免疫及免疫攻毒鸭抗体水平监测 |
| 1.2.18 现地应用试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 酶联板均一性试验结果 |
| 2.2 抗原最佳包被浓度与阴阳性血清最佳稀释度的确定 |
| 2.3 阴阳性血清作用时间的确定 |
| 2.4 酶标抗体工作浓度的确定 |
| 2.5 酶标抗体作用时间的确定 |
| 2.6 封闭液的确定 |
| 2.7 底物显色时间的确定 |
| 2.8 间接ELISA 方法判定标准的确定 |
| 2.9 敏感性试验结果 |
| 2.10 交叉反应试验结果 |
| 2.11 阻断试验结果 |
| 2.12 批内重复试验 |
| 2.13 批间重复试验 |
| 2.14 与血清中和试验检测结果的比较 |
| 2.15 与UL19 重组蛋白间接ELISA 诊断方法的比较 |
| 2.16 免疫鸭抗体水平监测结果 |
| 2.17 免疫攻毒鸭抗体水平监测结果 |
| 2.18 现地应用试验结果 |
| 3 小结和讨论 |
| 3.1 间接ELISA 诊断方法的优势 |
| 3.2 间接ELISA 反应条件的优化 |
| 3.3 间接ELISA 诊断方法判定标准的确定 |
| 3.4 与血清中和试验和UL19 重组蛋白间接ELISA 的比较 |
| 3.5 间接ELISA 诊断方法的应用 |
| 3.6 间接ELISA 的质量控制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、鸭瘟鸡胚化疫苗毒的电镜观察（论文参考文献）
- [1]鸭肠炎病毒及其致弱毒株基因组的分子特征和生物学特性[D]. 杨承槐. 中国农业大学, 2014(08)
- [2]鸭肠炎病毒部分基因组序列的克隆与分析[D]. 陈淑红. 东北农业大学, 2006(02)
- [3]鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株部分生物学特性的研究及荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用[D]. 郭宇飞. 四川农业大学, 2005(08)
- [4]鸭瘟鸡胚化疫苗毒的电镜观察[J]. 李成,谷守林,姜绍德,郝桂玉,张坦,蔡虹,黄金华. 中国畜禽传染病, 1996(01)
- [5]鸭瘟强毒在实验感染鸭体内的致病与复制特征及dUTPase基因发现和初步鉴定[D]. 袁桂萍. 四川农业大学, 2007(02)
- [6]鸭病毒性肠炎病毒gB基因主要抗原区域原核表达及其ELISA检测方法的建立[D]. 王文洁. 南京农业大学, 2008(08)
- [7]鸭肠炎病毒部分基因结构及相关功能的初步研究[D]. 李慧昕. 中国农业科学院, 2007(05)
- [8]DEV基因文库构建、核衣壳蛋白基因的发现及克隆与表达[D]. 文明. 四川农业大学, 2005(08)
- [9]鸭肠炎病毒糖蛋白gC基因的克隆、表达及部分功能的研究[D]. 刘峰源. 东北农业大学, 2008(03)
- [10]鸭肠炎病毒的提纯和间接ELISA诊断方法的建立及应用[D]. 闫虹光. 中国农业科学院, 2008(10)