一、猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1_株N基因的原核表达（论文文献综述）
宋健颖[1]（2021）在《规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整》文中进行了进一步梳理随着我国养猪业的规模化发展,猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和猪伪狂犬五种主要疾病防控尤为重要,一旦发病就会造成重大经济损失。本研究通过对新疆南疆某地区3个规模化母猪场母猪群的猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬和口蹄疫等五种主要疫病进行抗体水平监测、病原检查,了解规模化母猪场抗体水平、是否存在野毒感染、野毒基因型,更好地评价免疫程序是否合理,以期提高免疫效果。1.2018年至2020年,对新疆南疆某地区3个规模猪场（A～C）采集的1604份血液进行了猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和圆环病毒2型的抗体检测。检测结果显示,猪瘟抗体阳性率分别为:A场92.30%（2018）、97.74%（2019）和89.22%（2020）;B场95.27%（2018）、93.04%（2019）和86.81%（2020）;C场91.67%（2018）、86.50%（2019）和90.80%（2020）;伪狂犬病抗体分阳性率别为:A场100.00%（2018）、99.25%（2019）和97.06%（2020）;B场98.82%（2018）、93.67%（2019）和94.44%（2020）;C场98.12%（2018）、84.00%（2019）和96.55%（2020）;猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性率分别为:A场86.15%（2018）、75.19%（2019）和55.88%（2020）;B场86.39%（2018）、88.61%（2019）和88.89%（2020）;C场91.94%（2018）、96.50%（2019）和95.40%（2020）。口蹄疫抗体阳性率分别为:A场90.77%（2018）、100%（2019）和98.04%（2020）;B场100%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场95.97%（2018）、97.50%（2019）和96.55%（2020）;圆环病毒2型抗体阳性率分别为:A场80.00%（2018）、100.00%（2019）和92.16%（2020）;B场95.27%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场97.04%（2018）、97.50%（2019）和98.85%（2020）。2.以“发现疫病或证明无疫”的抽样策略采集A规模化母猪场血清样本,采用圆环病毒2型抗原ELISA检测,检测结果阳性率为4.4%,证明A场存在圆环病毒2型感染。3.对A规模化母猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征发病猪的样本,采用猪繁殖与呼吸综合征ORF5基因序列特异性引物经RT-PCR扩增、测序、核苷酸同源性比较、系统进化树分析,结果证明,该样本测序结果与NADC30毒株同源性最高,为93.5%,属于类NADC30毒株。4.猪繁殖与呼吸综合征免疫程序进行调整初探,调整后母猪每年普免3次,每次免疫间隔4个月,采集调整后试验的猪群50份血清,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测,抗体阳性率达到96%以上。
邓自腾[2]（2020）在《PRRSV GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立和单克隆抗体的研制》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）具有高度传染性,可引起仔猪呼吸系统障碍,怀孕母猪出现生殖障碍,其他年龄猪出现高热、腹泻;部分病猪耳发绀变蓝等主要症状的疾病。根据氨基酸序列分析,可将PRRSV分为欧洲型（PRRSV-1）和美洲型（PRRSV-2）两个血清型,在国内流行的毒株主要是美洲型。GP5蛋白是PRRSV编码最重要的结构蛋白,具有良好的免疫原性,可诱导机体产生中和性抗体。1.PRRSV GP5重组蛋白的原核表达根据本实验室PRRSV RD2007毒株公布的序列,通过软件预测了 GP5蛋白的信号肽区域和跨膜区,避开信号肽区域和跨膜区设计了两对引物,分段扩增目的基因,通过Overlap PCR拼接成完整的GP5基因。将完整的GP5基因克隆入pET-32a原核表达载体,并转化入E.coli DH5a,挑取单克隆进行培养和酶切鉴定,对鉴定为阳性的质粒送测序,结果与公布序列完全一致。将测序正确的质粒转化入E.coli BL21,测定最佳诱导表达条件。结果当温度28℃、诱导时间5h、IPTG浓度为1mM时表达效果最佳。对表达的GP5重组蛋白经SDS-PAGE分析,结果显示在30KDa处出现相应的条带,而pET-32a空载体对照无此条带。纯化浓缩后的蛋白经Western-blot验证,结果发现与PRRSV 阳性猪血清发生特异性反应,表明GP5重组蛋白成功获得表达。2.间接ELISA检测PRRSV GP5蛋白抗体方法的建立及初步应用将上述表达的GP5重组蛋白进行纯化,作为包被抗原,包被96孔ELISA酶标板,结合方阵滴定试验,成功建立了检测PRRSV GP5蛋白抗体的间接ELISA方法。进一步研究表明,该方法的最佳条件为,抗原包被浓度为1.25μg/mL,5%脱脂乳封闭液、封闭2h,待检血清稀释度为1:500、孵育45min,酶标二抗反应1h,显色20min。ELISA结果的判定标准:当OD450nm≥0.325时判定为阳性,OD450nm≤0.295时判定为阴性,OD450nm处于两者之间时判定为可疑,需重检。特异性试验显示,该方法与猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的阳性血清均不发生交叉反应。敏感性试验显示,该方法能检出1:12800稀释的标准阳性PRRSV猪血清,批内和批间的变异系数均小于10%。对江苏省温氏猪场96份猪血清进行检测,该方法的PRRSV抗体阳性率为78.13%,与IDEXX公司的PRRSV ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为82.29%,与IFA的总体符合率为90.63%。间接ELISA检测PRRSV GP5蛋白抗体方法的建立,可为PRRSV流行病学的调查和疫苗免疫前后抗体水平的监测提供有效的手段。3.抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的研制将上述纯化的GP5重组蛋白与适量的佐剂乳化后免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,三次免疫后测定小鼠血清抗体效价,取抗体效价高的小鼠加强免疫,加强免疫后72-96h,采取脾脏淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。以感染PRRSV RD2007毒株的Marc-145细胞作为抗原,对融合成功的杂交瘤细胞进行间接免疫荧光筛选和亚克隆。结果筛选了五株能分泌抗GP5蛋白单抗的细胞株,分别命名为PRRSV-2H3、PRRSV-1G8、PRRSV-2E9、PRRSV-2D5 和 PRRSV-2F9,Ig 亚类鉴定结果均为 IgG1。腹水的IFA抗体效价为1:1600～1:6400。WB的结果显示,这5株单克隆抗体均能与纯化的GP5重组蛋白反应。进一步研究表明,这5株单抗与GP5蛋白的识别位点均位于130～201aa。抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的成功研制,为下一步研究PRRSV主要结构蛋白的功能奠定重要的基础。
刘晓东[3]（2019）在《2015～2017年国内部分地区PRRSV分子流行病学调查及PRRSV-TJ毒株疫苗评价》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是以母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道疾病为主要症状的一种高度接触性、高死亡率传染病,由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起,属于国家规定的一类动物疾病。20世纪80年代末,美国猪群首次暴发猪繁殖与呼吸综合征,随后席卷北美、亚洲、欧洲的养猪国家,给当时世界生猪养殖行业带来了巨大的经济损失。1996年郭宝清等从国内猪群的阳性血清中分离到PRRSV。随后,疾病在我国北方和东北地区的大部分养殖场迅速蔓延。本研究对我国2015～2017年间部分地区的PRRSV分子流行病学情况、PRRSV野毒株遗传学特性、抗体水平及高致病性蓝耳病活疫苗（TJM-F92株）的安全性及有效性进行系统研究。2015～2017年间,不同年份的猪繁殖与呼吸综合征检出率表明:2017年检出率最低为27.5%,2016年检出率最高为36.2%;不同季度检出率:第三季度>第一季度>第四季度>第二季度;不同地区检出率:西北地区连续三年检出率最低,华南与华中地区的检出率在三年内均位于前三名;在不同阶段猪群的阳性病料中,保育仔猪感染率最高（64.9%68.3%）,种猪感染率最低（12.6515.6%）。对猪繁殖与呼吸综合征与猪瘟、伪狂犬病、猪圆环二型病毒及猪圆环三型病毒等病毒性疾病混合感染情况进行调查发现:与猪圆环二型病毒混合感染比例最高（12.4%20.7%）,与伪狂犬的混感比例最低（0.60%1.47%）,并在2016年首次发现猪圆环三型病毒感染,猪圆环三型病毒与猪繁殖与呼吸综合征的混感比例为（1.89%2.83%）。上述流行病学调查数据表明,虽然近几年来猪繁殖与呼吸综合征多为点状散发,但仍应该保持对此疫病的高度警惕。2015～2017年间,在国内部分地区先后分离得到58株PRRSV野毒株,将其核苷酸序列与标准毒株进行同源性对比分析发现:我国存在至少六个PRRSV亚群,属于第一亚群6株野毒株与第一亚群同源性为93.7%99.3%,与其他亚群同源性为83.1%91.4%;属于第四亚群的35株野毒株与第四亚群核苷酸同源性为94.9%99.7%,与其他亚群同源性为83.3%94.4%;NADC30为代表的第五亚群同属一分支的11株野毒与第五亚群核苷酸同源性为94.2%99.7%,与其他82.3%90.2%;6株新亚群之间的同源性为93.7%99.2%,与其他亚群同源性为82.1%85.6%。对上述58株PRRSV野毒株进行基因序列分析发现,不同亚群的毒力及中和保护位点存在差异,甚至同一亚群的不同毒株之间在毒力及保护位点也存在差异,为该类疫病防控带来较大压力。同时与2014年所分离毒株进行比较发现:2014年所检测的36株分离株均属于第四亚群,自2015年后新的亚群不断出现,并表现出明显向新亚群变异的趋化性,说明PRRSV的变异是不断地。因此进行PRRSV防疫时,必须先进行田间毒株的检测和基因分析,再选择相应种类的疫苗进行准确免疫。2015～2017年间,对来源于国内2012个猪场PRRSV抗体监测表明:PRRSV平均抗体阳性率呈逐年递增趋势,由75.6%逐步升至81.3%;根据不同区域检测发现,华东地区PRRSV抗体阳性率平均值最高（82.9%）,西南最低（74.1%）;不同阶段猪群PRRSV抗体阳性率检测显示,种猪群抗体阳性率最高,约在83.7%87.6%之间。对2015～2017年间,不同分布区间猪繁殖与呼吸综合征抗体比例分析显示,其S/P值主要分布于0.42.0区间内,小于0.4的区间比例次之,大于3.5区间比例最小。基于上述PRRSV抗体监测数据,我们可以推测,随着养殖场对猪繁殖与呼吸综合征的重视,我国对该类疫病的整体防控水平也在逐年提高。对高致病性蓝耳病弱毒疫苗（TJM-F92株）的安全性及有效性研究发现,该弱毒疫苗免疫种猪后,对其采食量、体温、反情率、死胎与木乃伊胎数均无显着影响,且免疫后各阶段猪群PRRSV抗体均可达到合格水平。上述数据表明,TJM-F92株弱毒疫苗具有良好的安全性。此外,TJM-F92株弱毒疫苗与猪瘟脾淋苗联合免疫不会对猪瘟疫苗抗体产生抑制,因此可以更合理优化猪场免疫程序。
于洁[4]（2019）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒N和Nsp7蛋白单克隆抗体的制备及应用》文中指出猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的,并以仔猪明显的呼吸困难和母猪繁殖障碍为显着特征的急性接触性传染病,因其发病猪特有的耳朵发绀现象,又俗称“蓝耳病”,还会造成母猪发热、流产、产木乃伊胎、弱仔和死胎等临床表现,对全世界养猪业造成了经济上的重创。该病毒N基因长约372bp,N蛋白有很强的免疫原性优势,是PRRSV感染机体产生最早同时量最多的抗体,但其产生的抗体不具备中和活性。PRRSVNsp7基因长约777bp,Nsp7抗体产生较早,抗体水平很高,甚至比N蛋白抗体持续时间更长,可用于该病毒感染抗体早期检测。本研究表达并纯化了 N和Nsp7蛋白,并作为抗原免疫小鼠制备单抗,还建立了间接ELISA方法检测PRRSV,具体内容如下:1.PRRSV浓缩纯化及其N和Nsp7蛋白原核表达及纯化本研究采用含PRRSV N和Nsp7基因的重组表达质粒pET-28a-N和pET-28a-Nsp7,分别转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,制备获得N和Nsp7重组蛋白,再采用亲和层析法纯化,SDS-PAGE、Western blot鉴定和Quantity One软件分析,证明目的蛋白具有良好抗原性,蛋白纯度均达90%以上。PRRSV扩增培养,采用蔗糖梯度离心,观察显示,蔗糖梯度离心管中病毒出现明显分层,取每层部分样品进行Western blot鉴定,结果显示病毒主要存在于30%～40%蔗糖浓度之间,制备获得纯化病毒,为后续单克隆抗体的制备和ELISA抗体检测方法的建立提供了必要材料。2.PRRSVN和Nsp7蛋白单克隆抗体的研制用上述制备的PRRSVN蛋白和Nsp7重组蛋白,分别免疫BALB/c小鼠。利用淋巴瘤细胞融合技术和间接ELISA抗体筛选方法,制备获得4株N蛋白单克隆抗体和7株Nsp7单克隆抗体。通过Western blot和IFA鉴定,证明其中4株N蛋白单抗均属于IgG1亚类,轻链均为κ链。7株Nsp7单抗中有1株7C5属于IgG2a亚类,轻链为κ链,其余6株均属于IgG1亚类,轻链均为κ链。ELISA结果显示,4株N蛋白单抗之间的叠加系数均在50%以上,选择N蛋白的3个主要抗原表位合成肽进行ELISA检测,证明4株单抗识别的抗原表位均为30-52aa。7株Nsp7单抗的抗原表位进行了初步鉴定,从而为该病诊断及病毒蛋白结构研究提供了重要材料。3.PRRSV Nsp7蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立以上述纯化的Nsp7重组蛋白作为包被抗原,建立了 Nsp7间接ELISA方法,其优化反应条件为:抗原的最佳包被浓度为1μg/mL,包被时间为37℃2h后4℃过夜,封闭液为5%脱脂乳,封闭时间为37℃3h,待检血清的最佳稀释度为1:100、最佳作用时间为37℃1h,酶标二抗的最佳稀释倍数为1:10000、最佳作用时间为37℃45min,TMB的最佳作用时间为37℃15min,根据酶标仪读数的OD450nm值计算P/N值作为判定标准。当P/N值≥0.43时判定其为阳性,P/N值<0.36时为阴性。该ELISA方法与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒、猪脑心肌炎病毒、猪塞尼卡病毒和副猪嗜血杆菌阳性血清均无交叉反应。相对于IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒,该方法的相对敏感性、相对特异性和符合率分别为92.24%、80.95%和90.51%,证明该方法具有较高特异性和敏感性,可用于该病诊断和流行病学调查。
邹昊博[5]（2018）在《黑龙江省双鸭山地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查》文中认为猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸综合征”（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性高致死性猪传染病。该病毒不仅致病力非常强,传播速度也极快,猪群发病率极高,猪只感染后表现为体温迅速升高到40℃以上,精神沉郁,呼吸困难、败血症和共济失调等症状,还有的猪只耳和躯体末端发绀。发病率可达100%,死亡率可达50%以上,母猪流产率达30%以上。猪只一旦感染猪繁殖与呼吸综合征病毒,绝大多数会长期带毒,且难以消灭,可导致重大的经济损失。本研究采用问卷调查、ELISA方法以及PCR方法对黑龙江省双鸭山地区规模化养猪场、散养户的猪血清样品、病料、拭子样品、粪便样品进行检测,初步了解该病在双鸭山地区的流行情况,并根据临床实践,总结防控猪繁殖与呼吸综合征的技术措施,为该市各养猪户提供参考。本研究从2016年10月至2017年10月,对黑龙江省双鸭山市8个县（区）内存栏量500头以上的59个规模化养猪场以及散养殖户341户进行数据采集,采集包括保育猪、生长育肥猪、后备母猪和种猪四种不同生长阶段的猪群。通过问卷调查的方式进行流行病情况调查,为进一步开展血清学调查和病原学调查奠定基础。调查内容包括猪群基本信息,临床症状、治疗情况、消毒情况、免疫情况、疫病史、自然环境和发病猪舍的情况等。总共发出了400份调查问卷表,回收372份。从回收到的调查问卷表的统计结果看,临床上确诊为PRRS的总共有20份,占回收调查问卷表的5.38%。说明双鸭山地区部分猪场（户）的猪只临床上具有猪繁殖与呼吸障碍综合征的症状。在此期间内不间断地从黑龙江省双鸭山市宝清县、友谊县、集贤县和饶河县,四方台区、宝山区、岭东区以及尖山区共8个县（区）共采集临床表现健康且未进行PRRSV疫苗接种的猪血清样品780份。其中,存栏量500头以上的27个规模化养猪场采集到496份血清样本,存栏量500头以下的散养殖户53户共采集到血清样本284份,应用酶联免疫吸附试验进行PRRS抗体检测。结果显示153份血清样品阳性,阳性率为19.62%,其中,规模化养猪场的阳性率为19.76%,散养殖户的阳性率为19.37%,27个规模化养猪场中有15个场,53户散养殖专业户中有37个场的血清样品抗体检测全为阴性。根据统计结果显示,47月为该病的发病高峰期,不同日龄的猪群均可感染,以保育猪发病率最高。规模化养殖场的PRRSV感染率低于散养殖户。自2016年10月至2017年10月间不间断地从黑龙江省双鸭山地区的部分猪场无菌采集发生疑似PRRSV感染且未进行PRRSV疫苗接种的160头病死猪的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结等组织器官,应用RT-PCR方法进行病原检测,结果显示有34份病料PCR检测结果为PRRSV阳性,阳性率为21.25%。同时随机采集外观正常健康无临床症状且未进行PRRSV免疫的30个猪场猪只样品,包括鼻拭子和粪便共156份进行病原检测,结果确诊为PRRSV感染的共有24份,阳性率为15.38%;阳性猪场数为9个,阳性率为30.00%。自2017年10月至2018年4月针对蓝耳病的防治,对宝清县、友谊县、集贤县和饶河县四个地区开展了一系列综合防控措施,同时也对以上四个地区按原有方式进行饲养管理,不间断地从黑龙江省双鸭山地区的部分猪场无菌采集发生疑似PRRSV感染且未进行PRRSV疫苗接种的180头病死猪的肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结等组织器官进行病原检测。结果显示阳性样品数为35份,其中在加强饲养管理条件的宝清县、友谊县、集贤县以及饶河县四个地区阳性数为14份,阳性率为15%,四个地区的阳性率均有所下降,按原有方式饲养管理的地区宝清县、友谊县、集贤县以及饶河县阳性数为21份,阳性率为23%,四个地区蓝耳阳性率基本保持不变。通过以上调查表明猪繁殖与呼吸综合征在该市各大小猪场均有所存在,是该市养猪业健康发展的一大潜在危险,一旦大面积爆发流行,将造成巨大损失。因此,做好诸多防控措施以应对病毒的感染和传播是非常必要的。根据此次调查走访过程中出现的问题总结出以下防控综合措施:做好猪场几种主要疫病的免疫工作,确保免疫效果;加强生物安全措施以及饲养管理;感染后控制细菌继发感染;血清学阳性或病原学检测阳性但未见明显临床症状的猪场,应做好各阶段猪只的药物保健,尽可能淘汰带毒猪只,以保证猪群健康。
王聪[6]（2017）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白SUMO化修饰对病毒复制及N蛋白功能的影响》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是危害世界养猪生产的重要病原,并造成巨大的经济损失。其核衣壳蛋白（N蛋白）是病毒粒子重要的内部结构蛋白及免疫原性蛋白,参与病毒RNA合成及感染性病毒颗粒装配,且N蛋白核定位（Nuclear Localization Signal, NLS）与PRRSV致病性密切相关。SUMO是一类重要的类泛素蛋白,广泛参与生物体生命活动,病毒蛋白的SUMO化修饰在抑制宿主先天性免疫、参与病毒免疫逃逸及复制中发挥重要作用。本论文围绕PRRSV N蛋白SUMO化修饰对病毒体外复制、N蛋白亚细胞定位和抑制β干扰素产生的影响开展研究,旨在从蛋白翻译后修饰的新视角为PRRSV致病机制研究提供线索,也为抗PRRSV药物研发提供新靶点。为了验证PRRSV蛋白的SUMO化修饰,利用分析软件SUMOSp1.0a、SUMOplot和seeSUMO进行预测,并以SUMOE2结合酶Ubc9蛋白作为“诱饵”蛋白,采用酵母回复杂交技术筛选,发现Ubc9与PRRSV的Nsp1β、Nsp4、Nsp9、Nsp10及N存在相互作用。进一步利用免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down和激光共聚焦技术证实Ubc9与上述蛋白存在互作。为了分析Ubc9对PRRSV体外复制和基因组RNA合成的影响,利用RNA干扰和慢病毒包装技术分别沉默和过表达MARC-145细胞中Ubc9,结果显示,MARC-145细胞中过表达Ubc9在24 h可显着抑制PRRSV复制（尸<0.01）及在24 h和36 h显着抑制PRRSV基因组RNA的合成（P<0.001）。最后,为了分析SUMO化抑制剂是否有利于PRRSV复制,银杏酸（Ginkgolic acid, GA）处理MARC-145细胞4 h,数据显示,PRRSV在12 h和24 h于GA处理后的MARC-145细胞中的复制能力显着高于对照组。为了阐明PRRSV N蛋白SUMO化修饰的途径,利用定点突变技术对N蛋白中的赖氨酸进行组合突变,发现只有当N蛋白中的赖氨酸全部突变为精氨酸时,SUMO化修饰现象才消失,突变其任何一点或多点赖氨酸N蛋白仍能发生SUMO化修饰,由此证明N蛋白赖氨酸对其SUMO 化修饰是冗余的。PIAS1 （Protein inhibitor of activated STAT1）作为一种 SUMO E3 连接酶,可以促进靶蛋白的SUMO化修饰,进而影响靶蛋白的功能,参与基因转录调控过程。本研究利用SUMO化修饰体外检测试剂盒和免疫共沉淀技术对N蛋白SUMO修饰途径进行鉴定,验证PIAS1与N蛋白的相互作用以及分析PIAS1在N蛋白SUMO化修饰及PRRSV复制中的作用。研究结果表明,PIAS1能与N蛋白相互作用,两者共定位于胞浆中;外源转染PIAS1不能增加N蛋白SUMO化修饰水平;在MARC-145细胞中,PIAS1的表达有利于PRRSV的复制。鉴于赖氨酸对N蛋白SUMO化修饰是冗余的,本研究构建了系列N蛋白赖氨酸突变体并拯救病毒,进一步验证N蛋白中赖氨酸与其亚细胞定位、干扰素产生和PRRSV复制之间的相关性。基于赖氨酸在N蛋白中的分布,以pCMV-HA-N为模板,利用定点突变技术构建出系列N蛋白赖氨酸突变体;同时,以PRRSV高致病性毒株JXwn06的感染性cDNA克隆（pWSK-JXwn）为骨架,定点突变N蛋白中的赖氨酸,共拯救出6株N蛋白赖氨酸突变病毒,分别命名为RvJXwn、RvJXNK7,28,39,52R、RvJXNmutNLS1、RvJXNmutNLS2、RvJXNmutNLS1,2 和 RvJXNKR。分析突变体拯救病毒在MARC-145细胞和原代PAMs细胞上的增殖动态,发现当位于N蛋白NLS1、NLS2、NLS1,2上的赖氨酸及N蛋白中的全部赖氨酸突变为精氨酸后,突变体拯救病毒的体外增殖能力显着低于亲本病毒RvJXwn。利用激光共聚焦方法观察N蛋白赖氨酸突变体及突变体拯救病毒的亚细胞定位,结果表明,野生型N蛋白和NmutNLS2位于细胞核核仁,而其余N蛋白赖氨酸突变体则分布在细胞核除核仁外的核质中;突变体拯救病毒N蛋白则同亲本病毒一样分布于细胞核核仁和胞浆中。利用双荧光素试验分析N蛋白及其赖氨酸突变体对IFN-β和IRFs启动子活性的影响,证实NK7,28,39,52R和野生型N蛋白一样可以抑制IFN-β和IRFs启动子活性,而其余N蛋白赖氨酸突变体对IFN-β和IRFs启动子活性的抑制能力明显减弱。针对突变体拯救病毒在MARC-145细胞和原代PAMs细胞诱导产生IFN-β能力的检测结果表明,不同突变体拯救病毒感染宿主细胞诱导产生IFN-β的能力有明显差异,其中RvJXNmutNLS1、RvJXNmutNLS2、RvJXNmutNLS1,2 和 RvJXNKR 在感染后 24 h 和 36h诱导产生 IFN-β 水平极显着高于亲本病毒RvJXwn（P<0.001 ）,而RvJXNK7,28,39,52R与亲本病毒差异不显着（P>0.05）。综上,本研究验证了 PRRSVNsp1β、Nsp4、Nsp9、Nsp10及N蛋白与宿主细胞蛋白Ubc9存在相互作用,证实了 PRRSVN蛋白存在SUMO化修饰现象,并确定赖氨酸对N蛋白SUMO化修饰是冗余的。通过构建N蛋白赖氨酸突变体及拯救其突变病毒,证实N蛋白赖氨酸突变体可影响IFN-β和IRFs启动子活性及改变N蛋白的亚细胞定位;除第7,28,39,52位赖氨酸外,N蛋白其余赖氨酸与病毒的体外增殖能力密切相关,且与诱导IFN-β水平有关。
马军[7]（2017）在《猪繁殖与呼吸综合征TJ株疫苗免疫与野毒株感染鉴别诊断的研究》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）,是引起妊娠母猪繁殖失败,仔猪乃至各年龄段的猪呼吸障碍的病毒性传染病,俗名“猪蓝耳病”。PRRS死亡率高、传播迅速、产生免疫抑制,PRRS的暴发给许多国家养猪业造成了极大的损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒不同毒株在致病力、抗原性和生物学特性上存在一定差异,毒株的变异、重组时有发生,所以导致了单一PRRSV疫苗不能完全保护猪免受异源毒株的感染,使得该病的疫苗大量、多种的滥用,虽然能减轻临床症状,但不能阻止强毒的感染和持续性感染的发生,难以从根本上消除PRRS的威胁,所以PRRS的净化正在成为许多猪场的选择。由于传统的血清学检测在野毒株和疫苗株的检测上缺乏稳定准确的方法,所以迫切需要建立鉴别区分PRRSV野毒感染抗体与疫苗免疫抗体的检测方法。本研究通过比对PRRSV毒株序列发现PRRSV TJ株Nsp2基因中缺失307个碱基,设计特异性引物。试验提取包含完整Nsp2基因的PRRSVJX 株病毒抗原 RNA,通过 RT-PCR 扩增 PRRSV-Nsp2-N1N2 基因（缺失片段基因）,并构建表达质粒pET-32a-N1N2。通过E.coliBL21大肠杆菌原核表达系统诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE验证融合蛋白为可溶性表达,存在于处理菌液的上清中。融合蛋白经His-tag亲和层析柱纯化,得到了纯度和特异性都较高的融合蛋白。用纯化的融合蛋白pET-32a-N1N2作为固相包被抗原,建立间接酶联免疫吸附试验方法,对反应的各项条件进行选择优化,确定阴阳性判断的临界值。最佳抗原包被浓度为75ng/孔,待检猪血清稀释度为1:200,酶标抗体工作浓度为1:5000,封闭液、待检血清和TMB显色时间分别为 60min、60min、20min;阴阳性判断:P>0.4401,且 P/N>2.5 判为阳性。符合性试验中选取138份阳性血清和50份阴性血清与PRRSV商品化间接ELISA检测试剂盒比对,符合率为100%。通过本试验表明,建立的ELISA检测方法敏感性、重复性和特异性都较高,可区分蓝耳病的TJ株疫苗抗体和野毒感染抗体,为种猪场蓝耳病的净化提供了技术保障。
徐晓杰[8]（2017）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学研究与NSP2蛋白单克隆抗体研制》文中认为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是猪的一种重要的病原,给全球养猪业造成重大的经济损失,临床上主要是以母猪流产、早产、木乃伊胎以及死胎等,仔猪和育肥阶段的猪发生呼吸道疾病为特征。GP5是一个主要的膜蛋白,包含大约200个氨基酸。它有氨基酸信号肽、糖基化位点和可以诱导中和抗体的抗原决簇。由于它的免疫学意义和多态性,GP5已经用于分析PRRSV基因的多样性。而NSP2有多个B细胞表位,具有较强的免疫原性,能够刺激机体产生特异性抗体。本研究于2015-2016年对我国12省市流行毒株进行了 GP5基因测序分析,并采用PCR方法将NSP2基因克隆至原核表达载体中进行表达,制备获得1株NSP2单克隆抗体。具体内容如下:1.2015-2016年我国猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学调查采集2015-2016年我国江苏、浙江、四川、安徽、山东、河北、河南、上海、广东、广西、福建、江西等12省市362份临床发病猪的肺脏病料,用RT-PCR检测RRRSV,结果191份为阳性,阳性率为52.8%。34株PRRSV毒株ORF5长度均为603bp,同源性为88.9%-99.4%。基因进化树分析结果显示,34株PRRSV毒株均是美洲型,分为4个基因亚型,其中2个毒株与VR2332属于亚型Ⅱ,6个毒株和MN184C毒株属于亚型Ⅲ,2个毒株属于亚型Ⅳ,其余毒株属于亚型Ⅰ,证明我国PRRSV存在遗传多样性,为该病防控提供了理论依据。2.猪猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白原核表达与单克隆抗体研制采用PCR方法从重组质粒pCMV-TJM中分段扩增获得Nsp2四个基因片段,分别克隆至原核表达载体pET32a,在大肠杆菌BL21中表达获得4种重组蛋白NSP2-1、NSP2-2、NSP2-3和NSP2-4,大小约为65kDa。Western blot结果显示,重组的四种重组蛋白均能被HIS单抗识别。用纯化的重组NSP2蛋白,免疫6-8周龄Balb/c小鼠,制备获得1株抗NSP2单克隆抗体5D2,亚型为IgG1型,其轻链为κ链。细胞培养上清液ELISA效价为1:160,将细胞连续传代20次,抗体效价基本一致。间接免疫荧光表明5D2与PRRSV的S1和TJM株产生特异性反应,而不能与BB0907和FJ1402毒株反应,为NSP2功能研究奠定了基础。
赵蕾[9]（2017）在《我国部分地区PRRSV的分子流行病学分析与NADC30-like株GP5蛋白的原核表达》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种广泛传播且致病性较强的病毒性疾病,其特征是母猪繁殖障碍,不同年龄段猪群表现出呼吸系统症状,对全球养猪业造成严重的经济损失。由于该病毒具有很高的变异性,为了解我国近两年内PRRS的流行状况及变异特点,同时对流行毒株进一步探索。本研究对我国部分地区PRRSV分子流行病学进行分析,完成了流行毒株的毒株分离及GP5蛋白的原核表达,主要内容如下:1.对20152016年收集自我国23个省份的发病猪场PRRS疑似病料进行PRRSV病原检测,并对部分具有代表性的阳性病料进行ORF5基因的扩增测序,得到了177个PRRSV ORF5基因序列。结果显示,在3078份疑似病料中,共检测出阳性样本889份,阳性率为28.88%;对得到的ORF5基因序列进行分析,结果显示,177个毒株均属于美洲型毒株,其中90株与我国的HP-PRRSV亚群代表株JXA1高度同源,34株与NADC30高度同源。与2015年相比,2016年我国PRRSV的流行仍以HP-PRRSV为主要流行毒株,NADC30-like毒株在流行毒株中的占比上升了12.04%。同时,PRRSV的流行不具有明显的地域特性。对ORF5基因的推导氨基酸序列进行分析,结果显示部分NADC30-like毒株在N34位糖基化位点存在缺失,提示有必要继续进行PRRSV的分子流行病学监测,为下一步的防控提供依据。2.将PRRSV阳性组织病料进研磨后接种到Marc-145细胞中,连续传代进行病毒分离,在传至第34代时出现明显细胞病变。继续传代的同时,对其进行RT-PCR鉴定和测定病毒效价,通过测序验证后确定分离到的3株病毒均为PRRS病毒,分别命名为JX1、JX2、SD1。毒株序列分析后显示3株毒株均属于NADC30-like毒株,对第5代病毒液的病毒效价进行测定,结果显示病毒含量分别为10-6TCID50/0.1m L、10-5.33TCID50/0.1mL、10-5.67TCID50/0.1mL。3.对分离的一株PRRSV流行毒株（JX1）的GP5基因进行扩增,以GP5基因的重组质粒载体为模板分别扩增两条片段,通过融合PCR得到缺失GP5信号肽和跨膜区的基因片段（dORF5）,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1上。将原核表达载体pGEX-6P-1转化大肠杆菌BL21,用浓度为1 mmol/L的IPTG在37℃条件下诱导。SDS-PAGE电泳检测,所表达蛋白的分子量约为38 kDa,对诱导时间进行优化后发现在5 h时表达量达到最大。对蛋白可溶性进行鉴定显示所表达的部分蛋白具有良好的可溶性。Western Blot结果表明表达出的蛋白与PRRSV阳性血清发生发应,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性。
王芳蕊[10]（2016）在《天津市高致病性猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及活疫苗应用试验》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征是影响全球养猪业最为严重的一种急性传染病,以妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状为特征。20世纪80年代末,猪繁殖与呼吸综合征相继在北美洲和欧洲暴发,并迅速在世界各地蔓延、流行,引起国际社会的高度关注。2006年,我国首次暴发由毒力增强的猪繁殖与呼吸综合征变异毒株引起的猪“高热病”疫情,其临床表现、发病率和死亡率较经典猪繁殖与呼吸综合征更为严重,并随后在越南、老挝等东南亚国家暴发流行,对我国及东南亚地区养猪业造成了沉重打击。2008年,我国新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将高致病性猪繁殖与呼吸综合征列为一类动物疫病,经典猪繁殖与呼吸综合征列为二类动物疫病。猪是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的唯一宿主,不同日龄、不同品种的猪均可感染发病,感染猪经飞沫、唾液、粪便、尿液、精液和乳分泌物等排出病毒。PRRSV的主要传播途径是直接和间接接触传播,也可发生垂直传播。为了明确天津地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征的流行病学情况,自2012年4月至2014年6月期间,采用RT-PCR的方法,对采集于12个区（县）共245份疑似病料和3086份猪血清,进行了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测。结果检出阳性病料222份（222/245）,阳性血清46份（46/3086）;同时采用ELISA抗体检测方法,对采自各区县的12645份样品展开血清学流行病学调查,其中948份猪（未免疫HP-PRRS疫苗）血清的PRRS抗体阳性数量为395份（395/948）,11697份猪（已免疫HP-PRRS疫苗）血清抗体阳性数量为10186份（10186/11697）。结果显示,2012年4月至2014年6月天津市各区县疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病料的检出率较高,而在正常存栏猪中也有部分带毒,该病当前在我市具有一定的流行趋势。对猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制主要依赖于良好的生物安全管理和综合防控措施。同时,疫苗接种可有效降低发病率和致死率,是稳定并控制疫情发生的有效措施。多种因素可以影响PRRSV疫苗免疫后的保护效果,其中,与流行毒株相同或相近的疫苗株可有效地激发机体产生免疫反应,免疫效果最好。免疫后的抗体水平是评价免疫效果的重要指标,高水平的抗体（中和抗体）可有效地阻止PRRSV的传播,并能中和体内感染的病毒。各种类型的疫苗包括弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗等相继被用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征的防控,而弱毒疫苗和灭活疫苗的应用最为广泛。弱毒疫苗能够有效地刺激机体产生免疫反应,产生高水平的中和抗体和细胞免疫,有效地抵抗同源或相近PRRSV野毒的感染。目前市场上PRRS商品化疫苗主要是弱毒疫苗和灭活疫苗两种传统的常规疫苗。在我国PRRS流行的主要是美洲型毒株,所以国内使用的疫苗也以美洲型灭活疫苗和弱毒疫苗为主。经典毒株疫苗主要有猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗（CH-1R株）,高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗主要有JXA1株,Hu N4-F112株,TJM-F92株等。2014年9月至12月,我们在天津市某种猪场对新疆某生物技术有限公司提供的高致病性猪PRRS活疫苗（TJM-F92株）进行了母猪临床应用效果试验。通过观察体温、精神状态及采食量变化验证试验疫苗安全性;通过抗体检测评估疫苗的免疫效果。试验结果表明,该疫苗免疫后能够很好地激发机体建立免疫反应,100%出现抗体升高,并提高猪群抗体的整齐度。
二、猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1_株N基因的原核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1_株N基因的原核表达（论文提纲范文）
（1）规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪瘟的研究概况 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 病原学 |
| 1.1.3 猪瘟流行病学和临床症状 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.2 伪狂犬的研究概况 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 病原学 |
| 1.2.3 伪狂犬流行病学和临床症状 |
| 1.2.4 诊断方法 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征的研究概况 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 病原学 |
| 1.3.3 猪繁殖与呼吸综合征流行病学和临床症状 |
| 1.3.4 诊断方法 |
| 1.4 口蹄疫病的研究研究概况 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 病原学 |
| 1.4.3 口蹄疫病流行病学和临床症状 |
| 1.4.4 诊断方法 |
| 1.5 圆环病毒2 型的研究概况 |
| 1.5.1 概述 |
| 1.5.2 病原学 |
| 1.5.3 圆环病毒2型病流行病学和临床症状 |
| 1.5.4 诊断方法 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 3 个规模化母猪场5 种疫病抗体检测与分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品来源 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 样品处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 规模母猪场猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.2 规模母猪场伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.3 规模母猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.4 规模母猪场口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.5 规模母猪场圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.4.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测结果分析 |
| 第三章 A规模化母猪场圆环病毒2 型抗原检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验样品来源及抽样原则 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 样品处理 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 圆环病毒2 型抗原ELISA检测 |
| 3.3 检测结果 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 第四章 A规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒基因型鉴定及分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病料采集 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 引物设计与合成 |
| 4.1.5 样品处理 |
| 4.1.6 病毒核酸提取 |
| 4.1.7 PCR产物纯化回收、测序 |
| 4.1.8 序列分析 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 PCR扩增结果 |
| 4.2.2 基因核苷酸同源性分析 |
| 4.2.3 基因遗传进化树分析 |
| 4.3 .讨论 |
| 第五章 A规模化母猪场猪繁殖与呼吸综合征免疫程序调整试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 调整后母猪抗体检测结果 |
| 5.2.3 调整前后母猪抗体合格率对比 |
| 5.3 讨论与分析 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）PRRSV GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立和单克隆抗体的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1. 猪繁殖与呼吸综合征 |
| 2. PRRSV的流行病学规律 |
| 2.1 传播方式 |
| 2.2 流行现状 |
| 3. PRRSV的病原学特点 |
| 3.1 PRRSV的分类 |
| 3.2 PRRSV的理化特性 |
| 3.3 PRRSV的培养特性 |
| 3.4 PRRSV的抗原性 |
| 3.5 PRRSV的生物学特性 |
| 4. PRRS的临床特征及病理机制 |
| 4.1 临床症状 |
| 4.2 病理变化 |
| 4.3 主要感染和发病的机理 |
| 5. PRRS疫苗研究进展 |
| 5.1 弱毒疫苗和灭活疫苗 |
| 5.2 新型疫苗的研究进展 |
| 6. PRRS诊断方法研究进展 |
| 6.1 病毒的分离与鉴定 |
| 6.2 分子生物学诊断 |
| 6.3 间接免疫荧光 |
| 6.4 血清抗体中和试验 |
| 6.5 酶联免疫吸附试验 |
| 7. PRRSV分子生物学研究进展 |
| 7.1 PRRSV的基因结构 |
| 7.2 主要编码的蛋白 |
| 8. PRRS的综合防控 |
| 第一章 PRRSV GP5重组蛋白的原核表达 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 毒株和细胞 |
| 1.2 菌株和载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器和耗材 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 目的基因的扩增 |
| 2.1.1 细胞的复苏与培养 |
| 2.1.2 病毒的增殖 |
| 2.1.3 病毒RNA的提取 |
| 2.1.4 反转录 |
| 2.1.5 PCR引物的设计与合成 |
| 2.1.6 GP5基因的扩增 |
| 2.2 原核表达载体pET-32a-GP5的构建 |
| 2.2.1 PCR产物的胶回收及纯化 |
| 2.2.2 目的基因和pET-32a原核表达载体的酶切及回收 |
| 2.2.3 目的基因和pET-32a原核表达载体的连接 |
| 2.2.4 连接产物转化至E.coli DH5a |
| 2.2.5 阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.6 阳性质粒转化至E.coli BL21 |
| 2.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.2 重组蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.3.3 最佳诱导条件的摸索 |
| 2.3.4 重组蛋白的大量表达 |
| 2.4 重组蛋白的纯化及鉴定 |
| 2.4.1 重组蛋白的纯化 |
| 2.4.2 包涵体的复性 |
| 2.4.3 纯化蛋白的浓缩 |
| 2.4.4 纯化蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.4.5 纯化蛋白的Western-blot分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 目的基因的扩增 |
| 3.2 pET32a-GP5重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.4 最佳诱导条件的摸索 |
| 3.5 纯化蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.6 纯化蛋白的Western-blot分析 |
| 4. 讨论与小结 |
| 第二章 间接ELISA检测PRRSV GP5蛋白抗体方法的建立及初步应用 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 标准阳性血清 |
| 1.2 包被抗原的制备 |
| 1.3 血清样本 |
| 1.4 主要试剂耗材和仪器 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的摸索 |
| 2.2 最佳封闭液和封闭时间的摸索 |
| 2.3 最佳一抗反应时间的摸索 |
| 2.4 最佳二抗反应时间的摸索 |
| 2.5 最佳显色时间的摸索 |
| 2.6 阴阳性临界值的判定 |
| 2.7 特异性试验 |
| 2.8 灵敏性试验 |
| 2.9 批内重复性试验 |
| 2.10 批间重复性试验 |
| 2.11 与IDEXX公司试剂盒和间接免疫荧光比较试验 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 3.2 最佳封闭液和封闭时间的确定 |
| 3.3 最佳一抗反应时间的确定 |
| 3.4 最佳二抗反应时间的确定 |
| 3.5 最佳显色时间的确定 |
| 3.6 阴阳性临界值的确定 |
| 3.7 特异性试验 |
| 3.8 灵敏性试验 |
| 3.9 批内重复性试验 |
| 3.10 批间重复性试验 |
| 3.11 与IDEXX公司试剂盒和间接免疫荧光比较试验 |
| 4. 讨论与小结 |
| 第三章 抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的研制 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞及病毒 |
| 1.3 主要试剂耗材及仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 小鼠的免疫 |
| 2.2 细胞融合 |
| 2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.5 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 2.6 腹水的制备 |
| 2.7 腹水效价的测定 |
| 2.8 单克隆抗体的反应性鉴定 |
| 2.9 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.10 单克隆抗体识别表位的初步鉴定 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 小鼠血清抗体效价的测定 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.3 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 3.4 腹水的效价测定 |
| 3.5 Western-Blot鉴定单克隆抗体的反应性 |
| 3.6 IFA鉴定单克隆抗体的特异性 |
| 3.7 单克隆抗体识别表位的初步鉴定 |
| 4. 讨论与小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）2015～2017年国内部分地区PRRSV分子流行病学调查及PRRSV-TJ毒株疫苗评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.2 PRRS的分子生物学特征及研究进展 |
| 1.2.1 形态结构及理化性质 |
| 1.2.2 基因组结构 |
| 1.2.3 PRRSV的主要蛋白 |
| 1.3 PRRSV遗传变异 |
| 1.4 致病机制与临床表现 |
| 1.4.1 致病机制 |
| 1.4.2 PRRS的临床症状 |
| 1.4.3 剖检病变 |
| 1.4.4 镜检病变 |
| 1.5 PRRS的防治 |
| 1.6 PRRS的流行病学 |
| 1.7 国内PRRS的流行特点 |
| 1.7.1 猪场感染率高 |
| 1.7.2 病毒毒株多,变异速度快 |
| 1.7.3 临床表现复杂 |
| 1.7.4 猪场持续循环感染 |
| 1.8 PRRSV的免疫特点 |
| 1.8.1 抗PRRSV感染的体液免疫反应 |
| 1.8.2 抗PRRSV感染的细胞免疫 |
| 1.8.3 抗体依赖性增强作用 |
| 1.8.4 PRRSV感染与免疫抑制 |
| 1.9 PRRS诊断方法研究 |
| 1.9.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.9.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.9.3 免疫过氧化酶单层试验 |
| 1.9.4 免疫荧光技术 |
| 1.9.5 聚合酶链反应 |
| 1.9.6 基因芯片 |
| 1.10 猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究状况 |
| 1.10.1 猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗 |
| 1.10.2 猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗 |
| 1.10.3 猪繁殖与呼吸综合征新型疫苗 |
| 1.11 猪繁殖与呼吸综合征防控对策 |
| 1.11.1 谨慎引种并做好引种检疫。 |
| 1.11.2 制定科学的免疫程序并严格实施。 |
| 1.11.3 加强对猪群的饲养管理。 |
| 1.12 本研究的目的意义 |
| 第2章 2015 年~2017 年国内部分地区猪繁殖与呼吸综合征流行情况分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 RT-PCR检测结果 |
| 2.2.2 2015 年~2017 年国内部分省份猪繁殖与呼吸综合征样品数 |
| 2.2.3 2015 年~2017 年国内部分省份猪繁殖与呼吸综合征感染阳性率 |
| 2.2.4 2015 年~2017 年对猪繁殖与呼吸综合征感染率的时间规律调查 |
| 2.2.5 2015 年~2017 年对猪繁殖与呼吸综合征感染率的空间规律调查 |
| 2.2.6 2015 年~2017 年猪繁殖与呼吸综合征阳性样品中猪群不同阶段感染率 |
| 2.2.7 2015 年~2017 年猪繁殖与呼吸综合征在不同症状类型的规律调查 |
| 2.2.8 2015 年~2017 年猪繁殖与呼吸综合征混合感染情况调查 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 猪繁殖与呼吸综合征不同年份感染情况 |
| 2.3.2 猪繁殖与呼吸综合征不同时间与空间感染情况 |
| 2.3.3 猪繁殖与呼吸综合征在猪群不同阶段情况 |
| 2.3.4 猪繁殖与呼吸综合征在猪群中的不同症状及混感 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 2015 年~2017 年国内猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 PRRSV GP5 测序 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RT-PCR检测结果 |
| 3.2.2 分离毒株与代表毒株进化树: |
| 3.2.3 分离毒株与标准毒之间核苷酸及氨基酸同源性分析 |
| 3.2.4 氨基酸序列进化分析 |
| 3.2.5 与2014 年分离毒株结果对比: |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 2015 年~2017 年国内部分猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体监测与初步分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 调查猪场数量及区域分布 |
| 4.2.2 调查猪场不同规模数量 |
| 4.2.3 调查国内各区域猪场样品猪繁殖与呼吸道综合征抗体监测结果 |
| 4.2.4 调查猪场不同季度样品猪繁殖与呼吸综合征抗体监测结果 |
| 4.2.5 调查猪场不同生产阶段样品猪繁殖与呼吸综合征抗体监测结果 |
| 4.2.6 不同分布区间猪繁殖与呼吸综合征抗体比例 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 不同猪场分布情况及猪场规模分布分析 |
| 4.3.2 我国不同空间、不同时间猪繁殖与呼吸综合征抗体监测分析 |
| 4.3.3 猪群不同阶段猪繁殖与呼吸综合征抗体检测调查结果分析 |
| 4.3.4 猪繁殖与呼吸综合征抗体在不同区间比例分析 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 高致病性蓝耳病弱毒疫苗(TJM-F92 株)安全性及有效性实验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 检测方法: |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 田间免疫高致病蓝耳疫苗(TJM-F92)检验TJM-F92 株蓝耳苗安全性评估 |
| 5.2.2 田间免疫高致病蓝耳疫苗(TJM-F92)观察免疫TJM-F92株蓝耳苗有效性 |
| 5.2.3 实验室分开免疫猪瘟疫苗(脾淋苗)与蓝耳疫苗(TJM-F92)结果 |
| 5.2.4 实验室同时联合免疫猪瘟疫苗(脾淋苗)与蓝耳疫苗(TJM-F92)结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 本文的创新点 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）猪繁殖与呼吸综合征病毒N和Nsp7蛋白单克隆抗体的制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 1 病原学特性 |
| 1.1 病毒分类及理化特征 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 致病机理 |
| 1.4 病毒基因组及编码蛋白 |
| 1.4.1 非结构蛋白 |
| 1.4.2 结构蛋白 |
| 2 诊断 |
| 2.1 临床诊断和病理学变化 |
| 2.1.1 临床诊断 |
| 2.1.2 病理学变化 |
| 2.2 病毒分离与鉴定 |
| 2.3 分子生物学诊断方法 |
| 2.3.1 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.3.2 荧光定量PCR(FQ-PCR) |
| 2.3.3 环介导等温扩增(LAMp) |
| 2.3.4 原位杂交技术(ISH) |
| 2.4 血清学诊断方法 |
| 2.4.1 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.4.2 免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA) |
| 2.4.3 血清中和试验(SN) |
| 2.4.4 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 参考文献 |
| 第二章 PRRSV浓缩纯化及其N和NSP7蛋白原核表达及纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备 |
| 1.2.2 重组质粒转化感受态BL21 |
| 1.2.3 重组蛋白的表达 |
| 1.2.4 重组蛋白SDS-PAGE分析 |
| 1.2.5 重组蛋白的纯化 |
| 1.2.6 重组蛋白Western blot鉴定 |
| 1.2.7 PRRSV浓缩纯化与鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的表达 |
| 2.1.1 重组N蛋白的表达 |
| 2.1.2 重组Nsp7蛋白的表达 |
| 2.2 重组蛋白的纯化与鉴定 |
| 2.2.1 N蛋白的纯化与鉴定 |
| 2.2.2 Nsp7蛋白的纯化与鉴定 |
| 2.3 病毒浓缩纯化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 PRRSV N和NSP7蛋白单克隆抗体的研制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 小鼠免疫 |
| 1.3 间接ELISA法测定免疫小鼠血清效价 |
| 1.4 细胞融合 |
| 1.4.1 培养SP2/0骨髓瘤细胞 |
| 1.4.2 制备饲养细胞 |
| 1.4.3 制备脾细胞 |
| 1.4.4 细胞融合 |
| 1.5 杂交瘤细胞株的建立 |
| 1.5.1 筛选阳性杂交瘤细胞 |
| 1.5.2 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 1.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 1.7 单克隆抗体腹水的制备 |
| 1.8 单克隆抗体的鉴定 |
| 1.8.1 杂交瘤细胞上清和腹水效价的测定 |
| 1.8.2 Western blot鉴定 |
| 1.8.3 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 1.8.4 杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性测定 |
| 1.8.5 单抗亚类与型的鉴定 |
| 1.8.6 叠加Elisa分析单克隆抗体表位 |
| 1.8.7 抗原表位的分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫小鼠血清抗体效价的测定 |
| 2.2 阳性杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.3 单抗株抗体效价及稳定性测定 |
| 2.4 Western blot鉴定 |
| 2.4.1 N蛋白单抗特异性 |
| 2.4.2 Nsp7蛋白单抗特异性 |
| 2.5 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.5.1 N蛋白单抗IFA鉴定 |
| 2.5.2 Nsp7蛋白单抗IFA鉴定 |
| 2.6 单抗亚类与型的鉴定 |
| 2.6.1 N蛋白单抗亚型的鉴定 |
| 2.6.2 Nsp7蛋白单抗亚型的鉴定 |
| 2.7 叠加ELISA分析单克隆抗体表位结果 |
| 2.7.1 N蛋白单抗分析结果 |
| 2.7.2 Nsp7蛋白单抗分析结果 |
| 2.8 抗原表位的分析 |
| 2.8.1 间接ELISA分析N单抗表位 |
| 2.8.2 Western blot识别Nsp7抗原表位 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 PRRSV NSP7蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的筛选 |
| 1.2.2 抗原包被时间的筛选 |
| 1.2.3 封闭液的筛选 |
| 1.2.4 封闭时间的筛选 |
| 1.2.5 血清最佳作用时间的筛选 |
| 1.2.6 酶标二抗最佳稀释倍数的筛选 |
| 1.2.7 酶标二抗最佳反应时间的筛选 |
| 1.2.8 最佳显色时间的筛选 |
| 1.2.9 临界值的确定 |
| 1.2.10 特异性试验 |
| 1.2.11 敏感性试验 |
| 1.2.12 重复性试验 |
| 1.2.13 临床血清样品测定及其商品试剂盒的比对分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的筛选 |
| 2.2 抗原包被时间的筛选 |
| 2.3 封闭液的筛选 |
| 2.4 封闭时间的筛选 |
| 2.5 血清最佳作用时间的筛选 |
| 2.6 酶标二抗最佳稀释倍数的筛选 |
| 2.7 酶标二抗最佳反应时间的筛选 |
| 2.8 最佳显色时间的筛选 |
| 2.9 临界值的确定 |
| 2.10 特异性试验 |
| 2.11 敏感性试验 |
| 2.12 重复性试验 |
| 2.13 临床血清样品测定及其商品试剂盒的比对分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（5）黑龙江省双鸭山地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 蓝耳病的历史和分布 |
| 1.2 蓝耳病的流行特点 |
| 1.2.1 流行病学 |
| 1.2.2 临床症状 |
| 1.2.3 病理变化 |
| 1.3 蓝耳病的致病机理 |
| 1.4 蓝耳病病毒的分类地位 |
| 1.5 PRRSV的病原学特性和生物学特性 |
| 1.5.1 PRRSV的病原学特性 |
| 1.5.2 PRRSV的生物学特性 |
| 1.6 蓝耳病病毒基因组编码的蛋白及病毒复制过程 |
| 1.6.1 病毒蛋白 |
| 1.6.2 病毒复制过程 |
| 1.7 蓝耳病的诊断 |
| 1.7.1 病原学检测 |
| 1.7.2 血清学检测 |
| 1.7.3 存在问题及发展趋势 |
| 1.8 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 试剂盒 |
| 2.1.3 工具酶及相关试剂 |
| 2.1.4 主要仪器与实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 问卷调查 |
| 2.2.2 PRRS的血清学抗体检测 |
| 2.2.3 PRRS的病原学检测 |
| 2.2.4 PRRS综合防控效果对比 |
| 3 结果 |
| 3.1 调查问卷的发放与回收 |
| 3.2 双鸭山市PRRS血清学抗体检测 |
| 3.2.1 不同地区PRRSV抗体的检测结果 |
| 3.2.2 不同季节猪只PRRSV抗体的检测结果 |
| 3.2.3 不同生长阶段猪只PRRSV抗体的检测结果 |
| 3.3 双鸭山市PRRS的病原学检测 |
| 3.3.1 PCR检测结果 |
| 3.3.2 不同地区样品的病原学检测结果 |
| 3.3.3 不同生长阶段猪只的PRRS病原学检测结果 |
| 3.3.4 PRRS综合防控效果对比结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 黑龙江省双鸭山地区PRRS的流行病学特点 |
| 4.2 RT-PCR和ELISA两种方法检测PRRSV的应用 |
| 4.3 不同防控措施的效果比较 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（6）猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白SUMO化修饰对病毒复制及N蛋白功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 国内外研究现状 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 技术路线 |
| 1.4 研究目标 |
| 第二章 与Ubc9相互作用的PRRSV结构蛋白、非结构蛋白的筛选和验证 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 猪源Ubc9基因的扩增及表达载体的构建 |
| 2.3.2 生物信息学软件预测PRRSV蛋白存在潜在的SUMO化修饰位点 |
| 2.3.3 酵母回复杂交筛选与Ubc9互作PRRSV蛋白 |
| 2.3.4 免疫共沉淀验证Ubc9与PRRSV蛋白的相互作用 |
| 2.3.5 GST pull-down验证Ubc9与病毒蛋白的相互作用 |
| 2.3.6 慢病毒包装验证内源Ubc9与病毒蛋白的相互作用 |
| 2.3.7 激光共聚焦验证Ubc9与PRRSV蛋白内、外源共定位 |
| 2.3.8 干扰Ubc9对PRRSV增殖的影响 |
| 2.3.9 过表达Ubc9对PRRSV复制的影响 |
| 2.3.10 SUMO化抑制剂银杏酸对PRRSV复制的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PRRSV N蛋白SUMO化修饰鉴定及修饰途径的初步探索 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 SUMO1、SUMO2、SUMO3和PIAS1基因的扩增和表达载体的构建 |
| 3.3.2 N蛋白赖氨酸突变体的构建 |
| 3.3.3 体外转染验证N蛋白存在SUMO化修饰现象 |
| 3.3.4 PRRSV感染验证N蛋白存在SUMO化修饰现象 |
| 3.3.5 质谱鉴定N蛋白存在SUMO化修饰现象 |
| 3.3.6 免疫共沉淀鉴定N蛋白突变体SUMO化修饰现象 |
| 3.3.7 N蛋白SUMO化修饰途径非SCM介导 |
| 3.3.8 N蛋白SUMO化修饰途径非SIM介导 |
| 3.3.9 PIAS1与N蛋白相互作用的验证 |
| 3.3.10 PIAS1对N蛋白SUMO化修饰的影响 |
| 3.3.11 干扰PIASl对PRRSV增殖的影响 |
| 3.3.12 过表达PIASl对PRRSV增殖的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PRRSV N蛋白赖氨酸突变体病毒拯救及其生物学功能研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 N蛋白赖氨酸突变体真核表达载体的构建 |
| 4.3.2 N蛋白赖氨酸突变体中间质粒的构建 |
| 4.3.3 表达N蛋白赖氨酸突变体的JXwn06全长cDNA质粒的构建 |
| 4.3.4 PRRSV N蛋白赖氨酸突变体病毒拯救和鉴定 |
| 4.3.5 激光共聚焦鉴定N及N蛋白突变体在vero细胞定位 |
| 4.3.6 双荧光素检测N蛋白及其突变体对IFN-β和IRFs启动子活性的影响 |
| 4.3.7 激光共聚焦鉴定拯救病毒N蛋白突变体在MARC-145细胞定位 |
| 4.3.8 拯救病毒N蛋白突变体SUMO化修饰鉴定 |
| 4.3.9 拯救病毒在MARC-145细胞上增殖特性 |
| 4.3.10 拯救病毒在原代PAMs细胞上增殖特性 |
| 4.3.11 拯救病毒感染MARC-145细胞IFN-β水平 |
| 4.3.12 拯救病毒感染原代PAMs细胞IFN-β水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 创新点 |
| 第七章 文献综述 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染与SUMO化修饰 |
| 7.1 SUMO化修饰研究进展 |
| 7.1.1 SUMO分子发现 |
| 7.1.2 SUMO化修饰过程 |
| 7.1.3 SUMO化酶 |
| 7.1.4 SUMO化修饰底物特点 |
| 7.2 SUMO修饰与病毒复制 |
| 7.3 SUMO修饰与免疫反应 |
| 7.4 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）猪繁殖与呼吸综合征TJ株疫苗免疫与野毒株感染鉴别诊断的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征概况 |
| 1.2 PRRS病原学 |
| 1.3 PRRS流行病学 |
| 1.4 PRRS免疫学 |
| 1.5 临床症状和病理变化 |
| 1.6 PRRS疫苗 |
| 1.7 PRRSV检测方法 |
| 1.8 PRRS的净化 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、菌株和载体 |
| 2.1.2 血清 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.1.5 主要耗材 |
| 2.1.6 主要设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PPRSV-Nsp2-N1N2基因的克隆 |
| 2.2.2 pET-32a-N1N2原核表达载体构建 |
| 2.2.3 PRRSV-Nsp2-N1N2基因蛋白的诱导表达 |
| 2.2.4 PPRSV-Nsp2-N1N2基因蛋白间接ELISA的建立 |
| 2.2.5 PPRSV-Nsp2-N1N2基因蛋白间接ELISA方法的鉴定 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 PRRSV-Nsp2-N1N2基因的克隆与分析 |
| 3.1.1 N1N2基因PCR扩增结果 |
| 3.1.2 重组质粒pMD18-T-N1N2的构建 |
| 3.2 重组质粒pET-32a-N1N2的构建 |
| 3.3 融合蛋白pET-2a-N1N2的原核表达 |
| 3.3.1 重组菌表达结果 |
| 3.3.2 重组菌最佳诱导时间的优化 |
| 3.3.3 重组菌最佳诱导浓度的优化 |
| 3.3.4 重组蛋白的可溶性分析 |
| 3.3.5 pET-32a-N1N2重组蛋白的纯化结果 |
| 3.3.6 纯化pET-32a-N1N2融合蛋白的Western blot检测 |
| 3.4 间接ELISA方法建立 |
| 3.4.1 间接ELISA最适反应条件的确定 |
| 3.4.2 间接ELISA阴阳临界值的确定 |
| 3.4.3 特异性检验 |
| 3.4.4 敏感性评价 |
| 3.4.5 符合性检验结果 |
| 3.4.6 批内和批间重复性试验结果 |
| 3.4.7 板内和板间重复性试验结果 |
| 3.5 应用建立的ELISA方法检测猪场血清 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 PRRSV疫苗毒株和野毒株鉴别 |
| 4.2 原核表达系统 |
| 4.3 间接ELISA方法的建立 |
| 4.3.1 间接ELISA方法特性 |
| 4.3.2 间接ELISA方法的优化 |
| 4.3.3 间接ELISA方法的初步应用 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（8）猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学研究与NSP2蛋白单克隆抗体研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒基本特性 |
| 1.2 病毒基因结构 |
| 1.3 病毒蛋白结构功能 |
| 2 流行病学 |
| 3 遗传变异 |
| 4 诊断技术与单克隆抗体研究进展 |
| 4.1 诊断技术 |
| 4.2 单克隆抗体研究进展 |
| 5 疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 2015-2016年我国猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品的采集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 RT-PCR |
| 1.5 PCR产物回收与纯化 |
| 1.6 PCR产物与T载体的连接 |
| 1.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.8 连接产物的转化 |
| 1.9 菌液PCR |
| 1.10 ORF5基因遗传进化分析和氨基酸序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR检测PRRSV |
| 2.2 ORF5基因PCR扩增和克隆 |
| 2.3 ORF5基因序列分析与氨基酸序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白原核表达与单克隆抗体研制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要的试剂与材料 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 重组表达载体的构建 |
| 1.4 重组NSP2蛋白的诱导表达 |
| 1.5 重组NSP2蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 1.6 重组NSP2蛋白的大量表达 |
| 1.7 重组NSP2蛋白的纯化 |
| 1.8 纯化的重组NSP2蛋白的鉴定 |
| 1.9 Balb/c小鼠免疫程序 |
| 1.10 间接ELISA法检测小鼠血清多抗效价 |
| 1.11 杂交瘤细胞株建立与筛选 |
| 1.12 单抗的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 NSP2基因的PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.3 纯化重组蛋白的鉴定和分析 |
| 2.4 间接ELISA法检测小鼠多抗的效价 |
| 2.5 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.6 单克隆抗体的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）我国部分地区PRRSV的分子流行病学分析与NADC30-like株GP5蛋白的原核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征及其病原的研究进展 |
| 1.1 PRRS的简介 |
| 1.1.1 PRRS的历史 |
| 1.1.2 PRRS的临床症状 |
| 1.2 PRRSV的病原学研究 |
| 1.2.1 PRRSV的分类地位 |
| 1.2.2 PRRSV的形态特征和理化特性 |
| 1.2.3 PRRSV的生物学特性 |
| 1.3 PRRS的流行病学研究 |
| 1.3.1 PRRSV的传染源和传播途径 |
| 1.3.3 PRRS的国内流行情况 |
| 1.4 PRRSV的分子生物学研究 |
| 1.4.1 PRRSV的基因组结构 |
| 1.4.2 PRRSV的非结构蛋白 |
| 1.4.3 PRRSV的结构蛋白 |
| 1.4.4 PRRSV基因的变异 |
| 1.5 PRRS诊断方法的研究 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 2015～2016 年我国部分地区猪群PRRSV的分子检测及ORF5基因的遗传变异分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验病料采集 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试验设备仪器 |
| 2.1.4 相关试验试剂的配制 |
| 2.1.5 PRRSV参考毒株序列 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病料的采集与处理 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.2.4 RT-PCR检测PRRSV |
| 2.2.5 PCR产物的凝胶电泳 |
| 2.2.6 阳性样品RT-PCR扩增ORF5基因 |
| 2.2.7 序列的测定与分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 PRRSV病原检测结果 |
| 2.3.2 PRRS的空间分布 |
| 2.3.3 不同种群PRRS的流行情况 |
| 2.3.4 ORF5基因RT-PCR扩增及毒株分类 |
| 2.3.5 毒株的分类及分布 |
| 2.3.6 ORF5基因核苷酸同源性分析 |
| 2.3.7 ORF5基因推导的氨基酸同源性分析 |
| 2.3.8 ORF5基因推导氨基酸的变异分析 |
| 2.3.9 ORF5基因序列的遗传演化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 NADC30-like毒株的分离鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 病料的收集 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 主要使用试剂 |
| 3.1.4 主要的仪器设备 |
| 3.1.5 主要使用试剂的配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 样品的处理 |
| 3.2.2 引物的设计 |
| 3.2.3 细胞的培养 |
| 3.2.4 病毒的分离培养 |
| 3.2.5 分离病毒的检测 |
| 3.2.6 外源病毒的检测 |
| 3.2.7 TCID_(50)的测定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 病毒的分离培养结果 |
| 3.3.2 RT-PCR鉴定病毒增殖结果 |
| 3.3.3 外源病毒检测结果 |
| 3.3.4 TCID_(50)测定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PRRSV NADC30-like毒株GP5蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 病毒与阳性血清 |
| 4.1.2 载体与菌株 |
| 4.1.3 主要使用的仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂与工具酶 |
| 4.1.5 试验所用溶液的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 目的片段的扩增 |
| 4.2.2 原核表达载体的构建 |
| 4.2.3 重组载体的诱导表达 |
| 4.2.4 诱导表达条件的优化 |
| 4.2.5 目的蛋白可溶性的鉴定 |
| 4.2.6 表达产物的鉴定 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 重组质粒TOPO-ORF5的鉴定 |
| 4.3.2 目的片段的扩增结果 |
| 4.3.3 重组质粒pGEX-dORF5的鉴定 |
| 4.3.4 最佳诱导表达时间的鉴定 |
| 4.3.5 目的蛋白可溶性的鉴定结果 |
| 4.3.6 重组表达产物Western blot鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）天津市高致病性猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及活疫苗应用试验（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.2 PRRSV的生物学特性 |
| 1.3 PRRS的流行病学特征 |
| 1.4 PRRS常用诊断技术研究 |
| 1.5 PRRS的免疫与防治 |
| 1.6 PRRS综合性防控措施 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 第2章 天津市高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 高致病性PRRSV活疫苗母猪临床应用效果试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果及分析 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1_株N基因的原核表达（论文参考文献）
- [1]规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整[D]. 宋健颖. 塔里木大学, 2021(08)
- [2]PRRSV GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立和单克隆抗体的研制[D]. 邓自腾. 扬州大学, 2020
- [3]2015～2017年国内部分地区PRRSV分子流行病学调查及PRRSV-TJ毒株疫苗评价[D]. 刘晓东. 吉林大学, 2019(02)
- [4]猪繁殖与呼吸综合征病毒N和Nsp7蛋白单克隆抗体的制备及应用[D]. 于洁. 南京农业大学, 2019(08)
- [5]黑龙江省双鸭山地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查[D]. 邹昊博. 东北农业大学, 2018(02)
- [6]猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白SUMO化修饰对病毒复制及N蛋白功能的影响[D]. 王聪. 中国农业大学, 2017(02)
- [7]猪繁殖与呼吸综合征TJ株疫苗免疫与野毒株感染鉴别诊断的研究[D]. 马军. 广西大学, 2017(02)
- [8]猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学研究与NSP2蛋白单克隆抗体研制[D]. 徐晓杰. 南京农业大学, 2017(05)
- [9]我国部分地区PRRSV的分子流行病学分析与NADC30-like株GP5蛋白的原核表达[D]. 赵蕾. 西北农林科技大学, 2017(01)
- [10]天津市高致病性猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及活疫苗应用试验[D]. 王芳蕊. 吉林大学, 2016(09)