一、猪传染性水泡病幼地鼠肾细胞培养灭活苗试验报告（论文文献综述）
江苏省猪传染性水泡病研究协作组[1]（1977）在《猪传染性水泡病幼地鼠肾细胞培养灭活苗试验报告》文中进行了进一步梳理 为了尽快消灭猪传染性水泡病,近年来在研制疫苗方面进行了广泛的探索。鉴于猪水泡病水泡皮灭活苗的试制成功,我们于1974年开展了幼地鼠肾细胞培养灭活苗的研究。经试验测定,较大的免疫剂量有较好的保护力。现将初步试验结果报告如下。 一、疫苗的制备 细胞的制备:用17～20日龄的地鼠肾,按组织培养常规制成单细胞,作病毒的培养材料。 种毒:采自我省连云港食品公司的病猪水泡皮毒,在地鼠肾单层细胞连续适应4代,作
甘肃省兽医研究所[2]（1976）在《细胞培养技术》文中研究说明
钟金栋[3]（2007）在《猪水泡病毒VP1基因克隆、表达及其检测技术的研究》文中研究指明猪水泡病（SVD）又名猪传染性水泡病，是由猪水泡病毒（SVDV）引起的一种烈性传染病，以口和蹄部产生水泡性损伤为特征，其临床症状与猪口蹄疫（FMD）极为相似，不容易区别，严重阻碍我国畜牧业和动物及其产品国际贸易的发展，引起严重的公共卫生问题，国际兽医局（OIE）将这疫病列为A类传染病。在国际贸易中，多数国家对SVD采取严格的检疫和控制措施已成为一种技术性贸易保护壁垒。猪水泡病和水泡性口炎（VSV）及口蹄疫临床症状相似，需要进行鉴别诊断，因此建立敏感性高、特异性强，快速、安全和可靠的诊断方法对于猪水泡病、水泡性口炎、口蹄疫的控制和出入境检验检疫至关重要。本研究应用基因克隆、基因表达等技术，对猪水泡病病毒外壳蛋白抗原（VP1）编码基因进行了克隆，构建于原核表达载体，高效表达目的蛋白，应用表达产物建立了酶联免疫吸附试验（ELISA），同时建立了猪水泡病RT-PCR、多重RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR核酸检测方法，并进行了相关病毒核酸的鉴别检测，其主要内容和结果为：1．以猪水泡病病毒核酸为模板，反转录聚合酶链式反应，扩增获得849bp的VP1基因，通过T-A克隆，将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中，构建SVDV VP1基因重组质粒，并进行核苷酸序列测定确定其基因的正确性。再将片断插入pBAD／Thio TOPO表达载体，经测序鉴定，筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆，成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达，可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明，以终浓度为0.002％的L—阿拉伯醛糖进行诱导，5h后表达可达到高峰，表达蛋白为融合蛋白，分子量为47.13kDa，表达产量约占菌体总蛋白的16％。Western blotting检测表明，诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。应用该重组抗原建立了检测猪水泡病的间接ELISA方法，以重组的猪水泡病病毒VP1蛋白为包被抗原，建立了以重组VP1蛋白为抗原检测SVDV抗体的酶联免疫吸附试验。2．根据基因库中的猪水泡病病毒高度保守的序列，设计了与SVDV互补的特异性引物，成功地建立了RT-PCR检测方法，扩增出251bp和366bp特异性条带，本试验能稳定、高效、快速地检测出猪水泡病病毒。通过检测FMDV、VSV、BHK21细胞等，对照的扩增结果均为阴性，证明该方法可特异性扩增目的基因。对SVDV RNA进行10倍系列稀释后检测，结果SVDV RNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性，说明该方法具有较好的敏感性。3．应用RT-PCR技术，建立了多重PCR同时检测鉴别口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎病毒的方法。根据基因库中的口蹄疫病毒、猪水泡病病毒和水泡性口炎病毒各基因的序列，设计了与FMDV、SVDV、VSV互补的3对特异性引物，对样品中的cDNA模板进行了多重RT-PCR扩增及反应条件的优化，结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带，分别为189bp、125bp和300bp。用这3对引物对病毒样品cDNA模板进行多次扩增，均能稳定得到与设计相符合的3条特异性条带。本试验能同时特异、敏感、快速地鉴定FMDV、SVDV和VSV。4．建立了实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的方法。根据基因库中的SVDV高度保守的序列，设计合成引物和TaqMan探针，经各反应条件的优化，建立了实时荧光定量PCR技术。对SVDV进行了特异性、敏感性和重复性试验，结果表明，实时荧光TaqMan RT-PCR可检测到每个反应相当于1×102copies病毒RNA；与FMDV、VSV等其它水泡性病毒不发生交叉反应；制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽，相关系数为0.993；与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。可对样品中微量SVDV进行准确检测，是一种SVDV检测的良好方法。综上所述，本研究成功表达了猪水泡病病毒VP1基因，应用表达产物建立了酶联免疫吸附试验；并建立了猪水泡病RT-PCR、多重PCR、实时荧光定量RT-PCR核酸检测方法。该检测体系对于猪水泡病的预防和控制、出入境检验检疫以及社会公共安全显得至关重要，为我国猪水泡病的诊断和动物检疫提供了技术支撑。
甘肃省兽医研究所[4]（1974）在《猪传染性水泡病病毒鉴定》文中研究说明 猪传染性水泡病（以下简称猪水泡病）于1964～1966年开始在我国流行。随后便肯定了其病原体是一种病毒。
农林部兽医药品监察所[5]（1977）在《猪传染性水泡病细胞弱毒疫苗试制试用》文中研究指明 猪传染性水泡病在我国流行至今没能彻底控制。根据农林部提出用组织培养法生产疫苗的科研任务,我们在学习推广上海龙华四系鼠化弱毒疫苗的基础上,1974年底开展用国外引进的IB-RS-2猪肾传代细胞制取龙华毒细胞弱毒苗的研究。两年来,通过一系列试验,在北京郊区试用,1975年和甘肃省兽药厂协作,在大生产条件下,取得用大转瓶旋转培养试制
云涛[6]（2010）在《DHV-Ⅰ感染性分子克隆的建立及其衍生病毒的生物学特性研究》文中提出鸭Ⅰ型病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHV）引起的雏鸭的一种急性、高度致死性传染病,其特征以肝坏死为主。将肝组织病料碾磨液上清,接种BHK-21细胞,盲传3代后,该病毒可使BHK-21细胞病变,将细胞培养物裂解上清经浓缩、负染后电镜观察可见直径约30nm,无囊膜的球形病毒粒子;间接免疫荧光试验结果表明,该分离株与Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清反应发出强特异性荧光;以特异性引物对分离的病毒进行RT-PCR,扩增出一条238bp的单一条带,序列比对分析也表明与已知DHV-Ⅰ序列同源性97.1%。结果表明,该分离株为鸭Ⅰ型肝炎病毒株,暂命名为ZJ-V/2006。实践证明,反向遗传学技术是深入开展RNA病毒分子生物学以及病毒致病机理等方面研究的最有效手段。我们利用基因工程技术在国内外首次建立了DHV-Ⅰ的反向遗传学操作系统,在体外实施DHV-Ⅰ的遗传拯救,并系统研究拯救病毒的生物学特性。1.根据DHV-ⅠZJ-V/2006株全基因组序列设计并合成5对特异引物,进而应用RT-PCR技术分5段扩增了DHV全基因组cDNA。将扩增的cDNA重叠片段A、B、C和DE片段分别克隆到载体pBluescriptⅡK S （+）中,获得了DHV全长基因组cDNA克隆pBLDHV。在扩增5′末端时,引入ApaⅠ酶切位点和SP6启动子序列;在基因组3′末段PolyA尾引入NruⅠ酶切位点,以供cDNA模板的线性化之用。核酸序列分析表明, DHV-Ⅰ毒株基因组全长为7 711个核苷酸,与DHV-ⅠZJ-V BHK-21细胞分离株的同源性为99.9 %;全长基因组中有6个核苷酸发生突变,均未导致对应的氨基酸发生改变,为沉默突变。2.我们利用NruⅠ将pBLDHV线性化后,以之为模板,利用SP6 RNA聚合酶系统在体外进行转录,获得病毒RNA。再通过脂质体介导法,将转录物RNA导入BHK-21细胞。观察致细胞病变（CPE）产生情况。观察结果表明,转染24h后,可在显微镜下看到DHV-Ⅰ的致细胞病变的效应,细胞表现为形态变圆、聚堆、折光率增大等现象;48h,CPE变得更加明显,并有细胞脱落现象;72h,70%的细胞脱落,收集细胞培养物。随后,再分别使用RT-PCR方法、限制性内切酶消化法、间接免疫荧光技术以及电镜观察等方法,对拯救病毒进行了综合鉴定。研究结果证明,在电镜下可观察到典型的病毒颗粒,直径在30nm左右;拯救病毒能与DHV-Ⅰ的阳性血清反应;从拯救病毒的核酸抽提物中不仅能扩增出DHV-Ⅰ的特异性基因组序列,而且用EcoRⅠ可切开PCR扩增产物,从而证明,我们获得的病毒是拯救病毒,而非污染了母本病毒。综上所述,我们在体外成功拯救到了DHV-Ⅰ。3.在上述研究基础上,我们又系统研究了拯救病毒（rDHV-Ⅰ）在BHK-21细胞中的生物学特性及增殖特征等。首先,用半数组织感染量（TCID50）法测定了rDHV-Ⅰ的滴度,并绘制了一步生长曲线,结果表明与DHV-Ⅰ在BHK-21细胞中的滴度相似,具有相近的增殖动力学特征。实时定量RT-PCR检测结果表明,rDHV-Ⅰ不仅能在BHK-21细胞中进行高水平复制,而且RNA的拷贝数与培养时间具有相关性,在接毒后病毒RNA的拷贝数逐渐增加,到第48 hr,RNA的拷贝数达到峰值（3.27×109拷贝/mL） ,随后病毒基因组的拷贝数逐渐降低。此外,通过毒力试验也证明了rDHV-Ⅰ与母本病毒在引起的临床症状没有明显不同,生存曲线也相似。结果表明,我们已利用反向遗传学技术在体外成功拯救到了DHV-Ⅰ,而且这种人工拯救病毒具有与母本毒具有相似的分子生物学特征。4.为了建立一种有效快速检测DHV-Ⅰ的方法,我们根据DHV-Ⅰ基因组中最保守的编码RNA依赖RNA聚合酶（RdRP）的3D基因,在其保守区设计合成了1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ模式的实时荧光定量PCR方法,用于检测DHV-Ⅰ。以pMD-3D质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。用该方法检测DBHV、DEDSV、DPMV、DPV、DRV和RA均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50 / 0. 1 mL;对20份临床疑似的DHV-Ⅰ病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%。从而表明,建立的DHV-ⅠSYBR GreenⅠP CR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。我们建立的这种快速、敏感和特异的rPCR将为DHV-Ⅰ的临床检测,体内分布模式和分子流行病学调查提供一种强有力的工具。综上所述,我们成功地用BHK-21细胞分离得到了DHV-Ⅰ,命名为ZJ-V/2006株;首次成功构建了该毒株的感染性克隆cDNA;系统研究了该拯救病毒以及其衍生病毒的生物学特性;成功建立了一种DHV-Ⅰ快速准确的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法。这些的研究成果将为从细胞水平、分子水平上探讨DHV-Ⅰ的生物学特性、致病机理、鸡胚传代毒力减弱机理、新型疫苗以及分子流行病毒学调查等方面的研究提供了良好的技术平台。
高君恺[7]（2013）在《猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响》文中研究表明微丝是支撑细胞的蛋白纤维网架系统,在细胞迁移、胞内物质运输等细胞活动中起必不可少的作用。病毒作为严格的胞内寄生者,为了创造有利于自身入侵、复制和释放的环境,进化了多种与宿主细胞骨架相互作用的机制,从而达到顺利入侵、准确到达复制位点进行高效复制、以及快速、远距离传播的目的。而细胞微丝被干扰后,细胞内病毒的活动也会受到明显抑制。广义上的微丝骨架也包括紧密连接蛋白部分。猪流行性腹泻是一种急性、接触性、高度传染性消化道疾病,近年来给养猪业带来巨大经济损失。本文以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为试验对象,首次研究猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）与宿主细胞微丝骨架之间的相互作用,以及其对紧密连接的影响。填补猪流行性腹泻感染机理方面的研究空白,为日后进行猪流行性腹泻病毒的深入研究提供一定基础。1猪流行性腹泻病毒感染IPEC-J2细胞的病理变化本试验以vero细胞扩繁、TCID50为105.5/mL的PEDV试验材料,摸索合适的感染复数感染IPEC-J2田胞。以蔗糖密度梯度离心方法浓缩纯化病毒,电镜负染观察病毒形态。见大量散在的、形态完整的病毒粒子,病毒粒子形态呈圆形、椭圆形、肾形和多边形。以HE染色观察感染PEDV的IPEC-J2细胞,发现细胞肿胀变圆、折光性加强,细胞内出现很多小空泡；伴随空泡增多、逐渐合并形成大空泡,肿胀的细胞脱落、形成空隙；最终大量脱落的细胞碎片漂浮于细胞瓶中。RT-PCR方法检测PEDV的增殖情况,在感染6h后PEDV开始大量迅速增殖,12h达到最高峰,随后病毒量逐步下降。电镜观察IPEC-J2细胞感染PEDV的超微结构变化,通过扫描电镜观察可见细胞微绒毛大量脱落消失、微绒毛顶端膨大变圆、可见数根融合形成蘑菇样膨大。透射电镜结果显示微绒毛内部微丝束消失、细胞内部微丝束紊乱、线粒体空泡化严重,细胞核膜与病毒接触部分出现溶解,未接触部分核膜界限清晰。结果说明,病毒可以在IPEC-J2细胞上复制增殖,出现典型的空泡状病变,同时引起微绒毛脱落与细胞内部微丝骨架的紊乱。提示PEDV能够引起细胞内部微丝骨架的改变。2猪流行性腹泻病毒对紧密连接的影响本试验主要从细胞跨膜电阻的测定、肠上皮细胞旁路转运试验来研究PEDV对肠上皮细胞屏障的影响,间接反映紧密连接完整性；随后通过检测细胞紧密连接蛋白表达量来直接反映紧密连接的改变情况。PEDV感染IPEC-J2细胞的跨膜电阻值在感染后有短暂的上升,60min下降,直到12h电阻值再度高于正常对照组值。肠上皮细胞的细胞旁通道转运试验显示,随着感染时间的延长,荧光渗透性标记分子在细胞旁路转运量不断加大,转运率也逐渐增高。以Western blot检测PEDV对IPEC-J2细胞紧密连接蛋白表达量的影响,发现紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）和粘附连接蛋白（E-cadherin）的表达发生了不同程度的变化。Claudin-1和ZO-1这两种蛋白的表达量下调显着。到了60min,除了E-cadherin的表达量基本正常外,其余三种蛋白的表达量均下降到了正常表达量的85%左右。结果提示,PEDV的感染对紧密连接蛋白的表达量影响较小,而结合PEDV对微丝的影响极为显着,我们推测,PEDV可能并不依赖紧密连接蛋白作为入侵受体,而是病毒引起微丝骨架的重组,诱发近微丝环的收缩,从而导致紧密连接蛋白的变动。3猪流行性腹泻病毒与微丝骨架的相互作用本试验主要探讨猪流行性腹泻病毒在感染过程中与微丝骨架之间的关系。以FTTC-phalloidin染色法对感染后的IPEC-J2细胞进行观察后发现,微丝骨架感染后发生有规律的变化,我们人为地将微丝的变化划分为五个不同时期：解聚一期（0-40min）,环膜期（60min）,解聚二期（80min-100min）,环核期（6h-48h）,凋亡期（72h）。解聚一期,微丝开始解聚,微丝在细胞内呈现绿色雾状；环膜期,部分微丝束开始恢复,在细胞膜下形成围绕细胞的环状高亮微丝束；解聚二期,微丝再次开始发生解聚,肌动蛋白弥散分布；环核期,微丝在细胞核附近堆积形成散乱的斑块,部分细胞在细胞膜下有一圈微丝形成的亮环,细胞间界限模糊；凋亡期,细胞大部分凋亡,脱落,残存的细胞微丝聚集浓染,为典型的凋亡细胞染色特征。以微丝稳定剂（Jas）和细胞松弛素D（Cyto D）改变细胞微丝的状态,通过检测细胞内病毒的TCID50来反映病毒的侵染情况。Jas和Cyto D都能够干扰PEDV入侵、复制和释放,Cyto D影响PEDV复制和释放的效果更为显着（P<0.01）。结果提示,在PEDV感染宿主细胞的过程中,病毒能够影响微丝的分布,改变F-actin的数量,同时微丝对病毒有反作用,影响病毒的入侵、复制与释放。
何希苗,刘楠楠[8]（2008）在《猪病毒病诊断识别与综合防治》文中指出阐述了猪病毒病的诊断方法及综合防治技术。
马海利[9]（2008）在《O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫》文中指出在分析FMDV抗原表位和免疫特性的基础上,结合FMD的流行特点,设计了O型FMDV复合表位与CTB的融合基因CTB-Th2-VP1和CTB-VP1-2A-Epi,将其克隆入表达载体pGEX-6P-1,在BL21中获得诱导表达,表达的融合蛋白以包涵体形式存在,具有O型FMDV和CTB双重反应原性。融合蛋白复性后具有CTB的生物活性,腹腔接种小鼠后可诱导产生特异性的体液、细胞和黏膜免疫,其中CTB-VP1-2A-Epi融合蛋白产生的免疫水平高于或接近灭活疫苗。将CTB-VP1-2A-Epi融合基因克隆到枯草芽孢杆菌表达载体pBC38C中,构建了CTB-VP1-2A-Epi重组枯草芽孢杆菌,免疫小鼠可产生O型FMDV特异性的细胞免疫和黏膜免疫。将重组枯草芽孢杆菌与重组鸡痘病毒vUTAL3CP1、核酸疫苗pIRES3CP1及O型FMDV灭活苗以不同的组合方式联合免疫小鼠。结果显示,重组枯草芽孢杆菌能够增强这三种疫苗的免疫效果,其中以核酸疫苗首免、重组鸡痘病毒加强免疫,结合重组枯草芽孢杆菌灌服的免疫策略的免疫效果最佳,可诱导机体产生较高水平的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。研究结果表明设计和表达的CTB-VP1-2A-Epi融合蛋白具有良好的FMDV免疫原性和CTB佐剂作用,为研制和使用新型、高效的FMD基因工程疫苗奠定基础。
高作信,乔莉[10]（1977）在《猪传染病的防治 第二十讲 猪传染性水泡病及其防治》文中提出猪传染性水泡病（简称猪水泡病）是猪的一种急性、接触性、病毒性传染病。临床特征是蹄部、口腔、鼻端、乳头等处发生传染性水泡和烂斑,与口蹄疫很相似。本病1966年首先发现于意大利,相继在欧洲许多国家发生,造成了严重的经济损失。病原猪水泡病病毒在分类上属于细小核糖核酸病毒群,肠病毒属,经血清学、生物学和病原试验证明,与已知7个型的口蹄疫病毒以及水泡性口炎、水泡性疹病毒无关,但同人的肠病毒科赛基B5病毒（Cox-sackie B5 Virus）关系密切,能发生血清交互中和反应,生物学和病原学亦相近似,有人认为它可能是
二、猪传染性水泡病幼地鼠肾细胞培养灭活苗试验报告（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪传染性水泡病幼地鼠肾细胞培养灭活苗试验报告（论文提纲范文）
（3）猪水泡病毒VP1基因克隆、表达及其检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 猪水泡病研究进展 |
| 1.1 SVDV病原学 |
| 1.1.1 病毒分类与特性 |
| 1.1.2 基因组结构 |
| 1.1.3 病毒蛋白质的结构和功能 |
| 1.1.4 SVDV的抗原结构 |
| 1.2 SVDV流行病学 |
| 1.2.1 流行与危害 |
| 1.2.2 病毒的繁殖与复制 |
| 1.2.3 SVDV的传播 |
| 1.3 SVDV诊断技术及其研究进展 |
| 1.3.1 动物试验 |
| 1.3.2 血清抗体检测方法 |
| 1.3.3 核酸诊断 |
| 1.4 SVD的控制和预防 |
| 1.5 本论文的研究目的和研究策略 |
| 第二章 猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要材料及试剂 |
| 2.2.2 主要试剂配制 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 技术路线 |
| 2.2.5 病毒基因组RNA的提取 |
| 2.2.6 cDNA的反转录 |
| 2.2.7 SVDV-VP1基因的PCR扩增 |
| 2.2.8 PCR产物的小量胶回收 |
| 2.2.9 感受态细胞的制备 |
| 2.2.10 克隆及表达载体的构建 |
| 2.2.11 重组表达质粒在TOPO10E.coli细胞中的诱导表达 |
| 2.2.12 SDS-PAGE分析表达蛋白 |
| 2.2.13 表达产物的Western blotting检测 |
| 2.2.14 重组蛋白的小批量生产和纯化 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 目的片段的克隆与鉴定 |
| 2.3.2 SVDV VP1基因的亚克隆及重组表达质粒的构建 |
| 2.3.3 SVDV核蛋白表达重组质粒的序列分析 |
| 2.3.4 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.3.5 表达产物的Western blotting检测 |
| 2.3.6 重组基因表达产物的纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 VP1基因的选择 |
| 2.4.2 基因表达系统的选择 |
| 2.4.3 VP1基因表达 |
| 2.4.4 表达产物的纯化 |
| 第三章 猪水泡病检测技术的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 病毒株、细胞和主要试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.2.4 猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2.5 多重PCR检测口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎的研究 |
| 3.2.6 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的研究 |
| 3.2.7 应用重组抗原建立检测猪水泡病抗体的间接ELISA方法的研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.3.2 多重PCR检测口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎的研究 |
| 3.3.3 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的研究 |
| 3.3.4 应用重组抗原建立检测猪水泡病抗体的间接ELISA方法的研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.4.2 多重PCR检测口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎的研究 |
| 3.4.3 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的研究 |
| 3.4.4 应用重组抗原建立检测猪水泡病抗体间接ELISA方法的研究 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）DHV-Ⅰ感染性分子克隆的建立及其衍生病毒的生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 鸭Ⅰ型肝炎病毒研究进展 |
| 1.1 病原研究 |
| 1.1.1 病原形态学特性 |
| 1.1.2 病毒的培养增殖 |
| 1.1.3 病毒的纯化 |
| 1.2 DHV-Ⅰ基因组结构与功能 |
| 1.2.1 DHV-Ⅰ基因组非编码区 |
| 1.2.2 DHV-Ⅰ的编码区 |
| 1.3 致病机理 |
| 1.4 DHV-Ⅰ病原检测 |
| 1.4.1 血清学 |
| 1.4.2 免疫学 |
| 1.4.3 分子生物学方法 |
| 1.5 防控方法 |
| 1.6 研究方向与前景 |
| 第二章 RNA 病毒的反向遗传操作研究研究进展 |
| 2.1 感染性CDNA 克隆的构建基础 |
| 2.1.1 病毒基因组全长cDNA 分子的扩增 |
| 2.1.2 载体的选择 |
| 2.1.3 RNA 聚合酶系统的选择 |
| 2.1.4 全长cDNA 分子的装配过程 |
| 2.2 感染性转录物的产生 |
| 2.3 影响感染性的因素 |
| 2.3.1 转录物异质性 |
| 2.3.2 基因突变 |
| 2.3.3 5′端和3′端冗余序列 |
| 2.3.4 帽子结构 |
| 2.3.5 VPg |
| 2.4 感染性分子克隆的应用 |
| 2.4.1 病毒基因组结构与功能的研究 |
| 2.4.2 分子致病机理的研究 |
| 2.4.3 病毒与宿主互作的研究 |
| 2.4.4 新型疫苗的研究 |
| 2.4.5 病毒载体的研究 |
| 2.4.6 基因治疗 |
| 2.5 RNA 病毒感染性克隆构建的国内外研究进展 |
| 2.5.1 正链RNA 病毒感染性克隆研究进展 |
| 2.5.2 负链RNA 病毒感染性克隆研究进展 |
| 2.5.3 双链RNA 病毒感染性克隆研究进展 |
| 2.5.4 逆转录病毒感染性克隆研究进展 |
| 2.6 研究方向与前景 |
| 试验研究 |
| 第三章 鸭Ⅰ型肝炎病毒ZJ-V/2006 在BHK-21 细胞上的分离与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 病毒分离 |
| 3.2.2 电镜观察 |
| 3.2.3 间接免疫荧光试验 |
| 3.2.4 RT-PCR 鉴定 |
| 3.2.5 序列分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 鸭Ⅰ型肝炎病毒（ZJ-V/2006）基因组全长CDNA 克隆的构建与分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 DHV-ⅠZJ-V/2006 株全长cDNA 序列各片段的RT-PCR 扩增 |
| 4.2.2 DHV-ⅠZJ-V/2006 株全长cDNA 的构建与鉴定 |
| 4.2.3 序列分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 DHV-Ⅰ感染性克隆病毒的体外拯救与鉴定 |
| 5.1 方法与材料 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 拯救病毒的鉴定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 体外转录物RNA 完整性检测结果 |
| 5.2.2 拯救病毒的鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 DHV-Ⅰ感染性克隆衍生病毒在BHK-21 细胞中的生物学特性研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 质粒、细胞株及毒株 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器与设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 BHK-21 细胞的培养与冻存 |
| 6.2.2 DHV-Ⅰ拯救病毒的传代 |
| 6.2.3 DHV-Ⅰ拯救病毒与母本病毒TCID50 的测定 |
| 6.2.4 DHV-Ⅰ拯救病毒动力学特性 |
| 6.2.5 拯救病毒与母本病毒毒力的测定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 DHV-Ⅰ亲本毒和拯救病毒的动力学特性 |
| 6.3.2 实时荧光定量RT－PCR 结果 |
| 6.3.3 拯救病毒的攻毒试验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 鸭Ⅰ型肝炎病毒SYBR GREENⅠ实时荧光PCR 鉴别方法 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 毒株与细胞 |
| 7.1.2 试剂 |
| 7.1.3 引物的设计与合成 |
| 7.1.4 标准品质粒的构建与鉴定 |
| 7.1.5 病毒TCID50 的测定 |
| 7.1.6 病毒RNA 的提取及反转录 |
| 7.1.7 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 反应体系的建立及优化 |
| 7.1.8 标准曲线的制作 |
| 7.1.9 特异性试验 |
| 7.1.10 重复性试验 |
| 7.1.11 敏感性试验 |
| 7.1.12 临床样品的检测 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 荧光定量PCR 引物的特异性 |
| 7.2.2 SYBR Green ⅠPCR 的优化 |
| 7.2.3 标准曲线的绘制 |
| 7.2.4 SYBR Green ⅠPCR 的敏感性试验 |
| 7.2.5 SYBR Green ⅠPCR 的特异性试验 |
| 7.2.6 SYBR GreenⅠPCR 的重复性试验 |
| 7.2.7 对病料样品的检测 |
| 7.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文部分缩写的中英文对照 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪流行性腹泻病毒的研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 病理变化 |
| 4 细胞培养 |
| 5 感染受体 |
| 6 诊断 |
| 7 防治措施 |
| 7.1 灭活疫苗 |
| 7.2 弱毒疫苗 |
| 7.3 基因工程疫苗 |
| 7.4 其他免疫措施 |
| 参考文献 |
| 第二章 病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响 |
| 1 微丝骨架 |
| 1.1 微丝的结构 |
| 1.2 肌动蛋白结合蛋白 |
| 2 紧密连接 |
| 2.1 跨膜蛋白 |
| 2.2 胞质蛋白 |
| 3 微丝在病毒生命周期中的作用 |
| 3.1 微丝与病毒入胞 |
| 3.2 病毒复制和组装 |
| 3.3 病毒释放与传播 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 猪流行性腹泻病毒感染IPEC-J2细胞的病理变化 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒的培养与滴定 |
| 2.2 病毒的形态观察 |
| 2.3 猪流行性腹泻病毒对IPEC-J2感染复数的摸索以及HE染色观察 |
| 2.4 猪流行性腹泻病毒在IPEC-J2细胞中的增殖情况 |
| 2.5 电镜观察IPEC-J2细胞感染猪流行性腹泻病毒的超微结构变化 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪流行性腹泻病毒电镜负染 |
| 3.2 猪流行性腹泻病毒感染IPEC-J2细胞 |
| 3.3 猪流行性腹泻病毒在IPEC-J2中的增殖曲线 |
| 3.4 猪流行性腹泻病毒对IPEC-J2细胞的微绒毛的影响 |
| 3.5 猪流行性腹泻病毒对IPEC-J2细胞内部结构的影响 |
| 4 讨论与小结 |
| Abstract |
| 参考文献 |
| 第四章 猪流行性腹泻病毒对紧密连接的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要设备 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 猪流行性腹泻病毒感染IPEC-J2细胞跨膜电阻的测定 |
| 2.3 肠上皮细胞旁路转运试验 |
| 2.4 猪流行性腹泻病毒对IPEC-J2细胞连接蛋白表达的影响 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 IPEC-J2细胞跨膜电阻的变化 |
| 3.2 猪流行性腹泻病毒对肠上皮细胞的细胞旁通道转运的影响 |
| 3.3 猪流行性腹泻病毒对IPEC-J2细胞连接蛋白表达的影响 |
| 4 讨论与小结 |
| Abstract |
| 参考文献 |
| 第五章 猪流行性腹泻病毒与微丝骨架的相互作用 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要设备 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 猪流行性腹泻病毒对IPEC-J2细胞微丝的影响 |
| 2.3 微丝稳定剂对猪流行性腹泻病毒滴度的影响 |
| 2.4 细胞松弛素D对猪流行性腹泻病毒的影响 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪流行性腹泻病毒对细胞微丝的影响 |
| 3.2 微丝稳定剂和细胞松弛素D对病毒入侵、复制与释放的影响 |
| 4 讨论与小结 |
| Abstract |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
（9）O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 动物新型疫苗研究进展 |
| 1 现代分子生物学技术与新型疫苗研究 |
| 2 新型免疫原与疫苗 |
| 3 载体与疫苗 |
| 4 结语 |
| 第二章 霍乱毒素研究进展 |
| 1 CT 的结构特性 |
| 2 CTB 黏膜免疫佐剂研究 |
| 3 小结 |
| 第三章 口蹄疫疫苗研究进展 |
| 1 口蹄疫传统疫苗研究 |
| 2 口蹄疫新型疫苗研究 |
| 3 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 O 型FMDV 复合表位与CTB 融合基因的分子设计 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 O 型FMDV 复合表位与CTB 融合基因的构建与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 O 型FMDV 复合表位与CTB 融合蛋白的实验免疫 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 O 型FMDV 复合表位/CTB 重组枯草芽孢杆菌 构建与实验免疫 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 O 型FMDV 复合表位/CTB 重组枯草芽孢杆菌 与多种FMDV 基因重组体联合实验免疫 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
四、猪传染性水泡病幼地鼠肾细胞培养灭活苗试验报告（论文参考文献）
- [1]猪传染性水泡病幼地鼠肾细胞培养灭活苗试验报告[J]. 江苏省猪传染性水泡病研究协作组. 兽医科技资料, 1977(S1)
- [2]细胞培养技术[J]. 甘肃省兽医研究所. 兽医科技资料, 1976(04)
- [3]猪水泡病毒VP1基因克隆、表达及其检测技术的研究[D]. 钟金栋. 昆明理工大学, 2007(02)
- [4]猪传染性水泡病病毒鉴定[J]. 甘肃省兽医研究所. 兽医科技资料, 1974(01)
- [5]猪传染性水泡病细胞弱毒疫苗试制试用[J]. 农林部兽医药品监察所. 兽医科技资料, 1977(S1)
- [6]DHV-Ⅰ感染性分子克隆的建立及其衍生病毒的生物学特性研究[D]. 云涛. 西北农林科技大学, 2010(10)
- [7]猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响[D]. 高君恺. 南京农业大学, 2013(08)
- [8]猪病毒病诊断识别与综合防治[J]. 何希苗,刘楠楠. 农技服务, 2008(09)
- [9]O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫[D]. 马海利. 吉林大学, 2008(11)
- [10]猪传染病的防治 第二十讲 猪传染性水泡病及其防治[J]. 高作信,乔莉. 农业科技通讯, 1977(09)