一、应用免疫酶染色法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究（论文文献综述）
李传峰[1]（2010）在《鸭病毒性肿头出血症病毒感染特性及其免疫检测技术的研究》文中认为1998-2003年四川省、重庆市、贵州省和云南省等养鸭省份发生了一种以鸭头肿胀、眼结膜充血、出血,全身皮肤广泛性出血,肝肿胀呈土黄色,并伴有出血斑点,体温43℃以上,排草绿色稀粪等特征性的急性病毒性传染病。该病目前给养鸭业带来了巨大的经济损失。程安春等通过流行病学调查、临床症状和病理学变化观察、病理组织学检查、病原的分离鉴定、人工感染试验、电镜观察、防治试验,确诊为一种新的鸭病,并命名为“鸭病毒性肿头出血症（Duck viral swollen head hemorrhagic disease, DVSHD）”。国内其他学者也称之为“鸭传染性肿头症”或“鸭肿头败血症”。本病与鸭瘟在临床特征和尸检变化上有许多相似之处,鸭病毒性肿头出血症病毒（Duck swollen head hemorrhagic disease virus, DSHDV）是该病的病原。目前有关该病的研究资料报道较少,特别是有关DSHDV感染特性以及特异、敏感、快速的检测方法等更是缺乏深入研究。因此,本文对鸭病毒性肿头出血症病毒的对成年鸭和鸭胚感染特性以及相关的免疫检测技术进行了一系列的研究。本研究获得以下系列结果：1.鸭病毒性肿头出血症实验感染模型的建立：本实验用鸭病毒性肿头出血症病毒强毒（HY-99株）作为种毒,通过肌注、口服和滴鼻三种方式感染28日龄健康鸭,攻毒后每天观察临床症状和发病鸭及死亡鸭的剖检变化。结果显示,感染鸭出现以体温升高、头颈肿胀、眼结膜充血、出血、排灰白色或草绿色稀粪为主要特征的临床症状和肝脏肿大、出血呈土黄色、免疫器官和消化道严重充血、出血为主要特征剖检变化。结果表明,临床症状和剖检变化与自然感染鸭基本一致,本实验成功构建了鸭病毒性肿头出血症实验感染模型。2. DSHDV强毒人工感染鸭组织病理学发展规律研究：本研究对实验感染模型中感染鸭各个组织器官进行了动态组织病理学变化观察。结果表明,实验感染模型中三组鸭出现的组织病理学变化基本一致,但时间存在差异：肌注组鸭于感染后72h内、滴鼻组和口服组144h内组织病理学变化以充血、出血和炎性细胞浸润为主；肌注组鸭于感染72h后、滴鼻组和口服组144h后组织病理学变化以弥漫性出血、大小不等坏死灶或粘膜上皮细胞的坏死为主。免疫器官、消化腺、消化道、呼吸器官、心脏和肾脏等是主要的靶器官。这表明DSHDV是一种泛嗜性病毒,对全身各个组织器官具有严重破坏作用。3. DSHDV强毒在人工感染鸭宿主细胞内的形态发生学和超微病理学研究：电镜下,完整DSHDV粒子呈圆形或椭圆形,无囊膜,直径为70nm-85nm。病毒粒子仅出现在感染细胞的胞浆中。电镜下,可观察到病毒粒子于感染4h后吸附于法氏囊靶细胞表面,并通过细胞的内吞作用进入细胞后,在胞浆内脱去双层衣壳,随后在胞浆内复制并合成病毒相关蛋白。这些合成结构蛋白、非结构蛋白及成熟或不成熟的病毒粒子在胞浆内聚集成圆形、椭圆形或不规则形的包涵体结构。感染后24h-72h,病毒核酸在这些基质上组装和成熟形成完整的病毒粒子。感染144h后,成熟病毒通过细胞的崩解而释放到细胞间隙。DSHDV强毒人工感染成年鸭后能够引起宿主细胞明显的超微结构变化（坏死和凋亡）。该病毒的主要靶器官包括法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏、消化道和肾脏等器官。病毒侵染靶细胞主要有：淋巴细胞、肝细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、上皮性网状细胞、粘膜上皮细胞、肠腺细胞等。4. DSHDV强毒致人工感染鸭和鸭胚宿主细胞凋亡的研究：通过TEM法观察发现,DSHDV经尿囊腔感染10日龄鸭胚后尿囊膜上皮细胞、肝细胞、肠道上皮细胞和心肌细胞发生凋亡。凋亡细胞时间分布在感染后24h-96h,同时在部分宿主细胞的胞浆内发现少量病毒粒子。本研究利用HE染色法、TEM法和TUNEL法三种方法均观察到DSHDV感染诱导鸭宿主细胞的凋亡。发生凋亡的器官包括法氏囊、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、心脏、食管、腺胃和肠道。宿主细胞的凋亡指数从感染后2h到72h逐渐增加,72h达到最高值。感染72h后,濒死鸭和死亡鸭宿主细胞死亡以典型坏死为主。DSHDV感染诱导的细胞凋亡在DVSHD的致病机制中起到重要作用。5.免疫酶组织化学检测DSHDV抗原方法的建立和应用：本研究以兔抗DSHDVIgG作为一抗、HRP-羊抗兔IgG作为二抗建立并优化了在石蜡切片中检测DSHDV抗原的间接免疫酶SP法,研究证实本方法具有较高的特异性和敏感性。该方法的应用研究揭示,三组鸭感染DSHDV后,肌注组（4h）、滴鼻组（12h）和口服组（24h）依次首先从法氏囊组织中检测阳性信号,随后抗原在多个组织中检出,包括免疫器官、消化腺、消化道、肾脏、心脏、肺脏和气管等。DSHDV侵染的靶细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、网状细胞、粘膜上皮细胞、肝细胞、间质细胞、腺泡细胞、肠腺细胞、肾小管上皮细胞、心肌细胞和柱状上皮细胞等。6.间接ELISA检测鸭病毒性肿头出血症抗体方法的建立和应用：本研究以浓缩纯化的DSHDV作为包被抗原,建立了检测DSHDV抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。试验最佳反应条件为：抗原最佳稀释度为1：40,高免血清为1：80稀释,最佳反应时间为60min；酶标抗体为1：2000稀释,最佳反应时间为60min；封闭液为1%BSA-PBST,封闭时间为60min；包被抗原最佳工作条件为37℃孵育1h后过夜；底物的最佳反应时间为37℃孵育15min。本实验建立的方法可成功应用于临床样品的检测和鸭免疫后抗体水平的评估。因此,本方法具有良好的特异性、稳定性、可重复性和较高的敏感性,可用于DVSHD抗体的检测。
朱建中,董国雄,李俊宝[2]（1998）在《抗鸡关节炎病毒单克隆抗体介导间接ELISA的建立》文中研究指明利用淋巴细胞杂交瘤技术制备出抗鸡关节炎病毒特异的、具有群反应特性的单克隆抗体，挑选其中ＡＤ８株作为一抗建立检测抗原的间接ＥＬＩＳＡ，该法具有高度的特异性和敏感性，不仅适用于大面积检测的需要，而且可用于该病的早期诊断。
陈舜[3]（2009）在《雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒生物学特性研究》文中指出雏鹅新型病毒性肠炎（new type gosling viral enteritis,NGVE）是一种主要发生于30日龄以内的雏鹅的一种以小肠出血性、纤维素性、渗出性、坏死性炎症为特征的急性传染病。经流行病学调查、病理剖解、病原的分离、初步鉴定、病毒提纯与负染电镜观察其形态学特征、及病毒结构蛋白分析等一系列研究,初步认为该病是由禽腺病毒引起的雏鹅的一种新型病毒性肠炎。该病目前对养鹅业带来了巨大的经济损失。关于鹅腺病毒,特别是致病的鹅腺病毒,目前国内外的研究资料很少。电子显微学技术是研究病毒形态结构、鉴定新病毒、阐明病毒的发育循环、研究感染宿主病理学的一个重要方法,它在病毒学研究中具有不可替代的作用。本研究首先将NGVEV鹅胚尿囊液适应10日龄鸭胚,再将NGVEV鸭胚尿囊液适应体外培养的鸭胚成纤维细胞（DEF）,并对病毒在感染鸭胚体内及DEF细胞上的形态特征和病毒形态发生学进行系统地研究,同时观察被感染宿主细胞的超微结构病变和细胞凋亡的情况,以期了解NGVEV的入侵、分布及释放特点,为揭示该病毒致宿主细胞病变的机制提供科学依据。通过人工感染NGVEV-CN强毒而复制出NGVE急性病例,建立并利用间接免疫酶组织化学SP法及间接免疫荧光抗体法探究NGVEV对感染雏鹅组织的侵染特点及病毒抗原随感染时间延伸在宿主体内的动态分布规律,同时对病毒诱导雏鹅宿主的细胞凋亡进行检测,以期为阐明该病的发病机制提供实验数据及为NGVEV的实验室诊断提供科学的方法。将制备的NGVEV灭活疫苗及添加GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅,对其诱导鹅产生的体液免疫抗体水平和细胞免疫抗体水平进行了监测,确定了该疫苗的免疫原性和最佳免疫剂量。进而将该疫苗免疫开产前种鹅,对免疫种鹅的血清抗体水平、免疫种鹅的后代卵黄抗体消长规律及后代雏鹅的攻毒免疫保护力进行监控,为研制高效NGVEV灭活疫苗提供科学依据,为防治雏鹅新型病毒性肠炎的提供了新的手段。本研究获得以下系列结果：1.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株感染鸭胚宿主细胞的超微结构变化和病毒形态发生学：在不同时间剖杀的和死亡的鸭胚的尿囊膜、心、肝、肠、脑及肌胃中均发现NGVEV粒子,其直径以70 nm-80 nm为主,以散在的形式分布,多见于细胞核内。NGVEV粒子通过与细胞膜的特异性吸附而进入宿主细胞,装配成熟的病毒粒子通过细胞核膜及细胞膜破裂的方式被释放。被NGVEV感染宿主细胞的超微结构病变以细胞核膜严重的扩张,内质网的肿胀,线粒体嵴断裂溶解成空泡样为主,其中尿囊膜上皮细胞中线粒体的凝集、固缩变化是该病毒引起的特征性超微病变。2.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株对体外培养的鸭胚成纤维细胞的适应及其增殖规律：将NGVEV鸭胚尿囊液感染DEF细胞并经连续传代获得了适应DEF细胞生长的NGVEV-CN细胞毒。细胞病变一般出现于感染后72 h,到120 h细胞病变达80%。NGVEV在DEF上的病毒滴度（TCID50）随传代次数增加而逐渐增加,直到第5代后维持在较高的水平。病毒滴度随感染时间变化表现为：感染初期首先呈现一个下降过程,4h后毒价开始迅速上升,于96h-144h病毒滴度达到并维持最高水平。NGVEV感染DEF细胞后96h-120 h是收获该NGVEV细胞毒的最适时间。3.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株感染鸭胚成纤维细胞的超微结构变化和病毒形态发生学：NGVEV在DEF细胞中呈圆形,无囊膜,直径为75nm-90 nm。病毒粒子多散在于细胞核内和集中分布于胞浆空泡内。NGVEV粒子通过吸附于DEF细胞膜表面而进入细胞,成熟的病毒粒子经由细胞核膜的破裂而进入胞浆,再通过出芽、细胞膜破裂及细胞空泡破裂的方式被释放出细胞。被NGVEV感染的DEF细胞的超微结构病变主要表现为：线粒体的固缩及聚集变化,粗面内质网扩张,胞浆出现空泡或空池样结构,及细胞凋亡现象。伴随着病毒的复制、装配和成熟,细胞中还出现大量的不规则形状的高电子致密物及三种不同特点的胞浆包涵体结构。4.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致体外培养的鸭胚成纤维细胞凋亡：光学显微镜及电子显微镜观察到NGVEV可诱导DEF细胞出现典型的细胞凋亡形态学变化；经琼脂糖凝胶电泳检测到感染细胞核酸降解为不同倍数的180bp-200 bp的典型梯状条带；用Annexin V-FITC/PI双标记感染DEF细胞经流式细胞仪检测发现凋亡细胞的比率从感染后48 h随感染时间延伸而明显增加,于120 h达到凋亡峰,而Annexin V-FITC/PI双标记的感染DEF细胞经荧光显微镜可观察阳性荧光信号的凋亡细胞。5.雏鹅新型病毒性肠炎病毒的提纯、超微形态观察和兔抗NGVEV高免血清IgG的制备：通过对NGVEV纯化方法的比较研究,确定以结合差速离心、氯仿处理、氯化铯不连续梯度和等密度梯度超速离心的方法来纯化NGVEV.通过该方法不仅可获得较纯净、多量的NGVEV粒子,还可区分完整的NGVEV粒子和不完整的病毒粒子。经负染电镜观察发现完整的NGVEV粒子具有腺病毒典型形态特征：圆形,无囊膜,直径75nm-90 nm,核心、核衣壳及壳粒清晰可见。最后,以纯化的病毒为免疫原成功制备了兔抗NGVEV的高免血清,并通过辛酸-硫酸铵粗提及High Q阴离子交换柱纯化兔抗NGVEV的血清IgG。6.建立并应用间接免疫酶组织化学SP法和间接免疫荧光抗体法检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒在人工感染雏鹅组织的定位和侵染规律：以纯化的兔抗NGVEV的血清IgG为一抗,分别建立检测石蜡切片NGVEV的间接免疫酶组织化学SP法和间接免疫荧光双染法,并应用该方法研究NGVEV-CN强毒株在人工感染雏鹅组织中病毒定殖及动态侵染规律。结果表明：NGVEV抗原主要侵染免疫器官（法氏囊,胸腺,哈德氏腺及脾）和胃肠道器官（腺胃,肌胃及肠道）,推测这些器官是NGVEV进入机体后首先侵染靶部位并增殖子代病毒,之后子代病毒通过血液、淋巴液或组织液而释放到其他实质性组织,使得机体在感染后期呈现NGVEV广泛性侵染（除呼吸器官）。被NGVEV侵染的细胞数量随感染时间延长而增加,直到感染后15d。NGVEV侵染的细胞主要包括：各种淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、粘膜细胞、腺细胞等等。7.雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致雏鹅宿主细胞凋亡的研究：通过光学显微镜及电子显微镜对人工感染雏鹅各个组织的宿主细胞观察发现,最先于NGVEV感染3d时在法氏囊中观察到呈凋亡变化的淋巴细胞,之后凋亡细胞广泛出现于免疫器官（法氏囊,胸腺及哈德氏腺）和消化器官（腺胃,肌胃,肠道及肝）,而气管和肺极少出现细胞凋亡变化。进一步用琼脂糖凝胶电泳和原位末端标记方法（TUNEL）对NGVEV感染宿主细胞核酸的降解情况进行了检测,发现被感染鹅的免疫器官和胃肠道均出现典型的不同倍数的180bp-200 bp的梯状条带,在经TUNEL染色的组织切片中观察到了棕色阳性信号的凋亡细胞。凋亡细胞的数量随感染时间延长而增多,于9d-12d达到最大值。8.雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗对青年鹅的免疫原性研究及重组GoIL-2对疫苗的佐剂效应研究：不同剂量的NGVEV灭活疫苗均能显着提高免疫青年鹅的细胞免疫和体液免疫抗体水平,且抗体水平与免疫剂量有一定关系,NGVEV灭活疫苗以0.5 ml/只为最佳免疫剂量。单独使用GoIL-2可提高机体的细胞免疫水平,但是不能使机体产生特异性抗NGVEV抗体。添加不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗能极显着（P<0.01）或显着（P<0.05）提高被免疫鹅细胞免疫和体液水平,且抗体水平与GoIL-2剂量有一定关系,以1000 U/只为最佳剂量。研究表明,免疫后第28 d青年鹅的血清抗NGVEV的IgG水平、中和抗体水平及细胞免疫水平达到最高,且在免疫后第175 d都维持在一个较高的水平。9.雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗对开产前种鹅的免疫效果评价：NGVEV灭活疫苗与添加GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫后5-6个月内对免疫种鹅所产后代产生确实的保护效果,其中以添加GoIL-2的灭活疫苗免疫种鹅所孵出的后代雏鹅的攻毒100%免疫保护效果更持久。另外,被免疫母鹅血清抗体水平、其所产蛋的卵黄抗体水平与后代雏鹅攻毒免疫保护效果呈现正相关性,因此建议通过对免疫鹅的卵黄抗体的监测来代替血清抗体的监测来对疫苗免疫效果的进行长期监控。
唐雨德,周宗安,翟春生,王元伦,顾志香[4]（1995）在《应用免疫酶染色法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究》文中指出用免疫酶染色法检测Ｖｅｒｏ细胞培养物、陈旧石蜡切片和人工感染试验鸡组织中的ＡＶＡＶ，并比较了ＡＶＡＶ强毒和弱毒株在组织中的分布情况。结果发现，试验鸡于感染ＡＶＡＶ弱毒株后１～５天、感染ＡＶＡＶ强毒株后１～９天出现病毒血症；跗关节、跖趾关节、趾关节、趾屈肌健、脾脏、肝脏等组织中病毒的检出率最高，存在时间也最长；在感染后３～２０天于感染鸡法氏囊、感染后３～１１天于感染鸡胸腺中检出了强毒株，在这两组织中未检出ＡＶＡＶ弱毒株。感染８小时后的Ｖｅｒｏ细胞培养物和陈旧石蜡切片均被检出ＡＶＡＶ。
王全溪[5]（2004）在《番鸭呼肠孤病毒病诊断技术研究》文中进行了进一步梳理番鸭呼肠孤病毒病主要发生于番鸭，夏季多发，发病日龄以4～45日龄为主，发病率达20％～90％，应激或混合感染下，死亡率可达90％以上。国内外未见有该病血清学诊断方法的报导。因此，临床上建立一种切实可行且快速的诊断方法越来越受到国内水禽养殖业的关注。本研究以此为出发点，建立了快速、简便、准确，而且能够在基层应用的间接ELISA检测病毒抗体和反向乳胶凝集试验检测病毒抗原两种血清学诊断方法。 本课题以本实验室分离鉴定保存的番鸭呼肠孤病毒B3分离株为研究材料，开展了番鸭呼肠孤病毒病间接ELISA和反向乳胶凝集试验两种血清学诊断方法的研究与应用工作。 1．采用番鸭胚成纤维细胞成功的培养了番鸭呼肠孤病毒，感染细胞产生了明显的CPE病变，并进行病毒的扩大培养，细胞培养物经二次差速离心和硫酸铵沉淀制备了所需的诊断抗原，病毒蛋白含量为5.628mg／ml。 2．采用细胞培养的番鸭呼肠孤病毒，按所设定的免疫程序免疫成年公番鸭，获得琼扩效价为1：16的阳性血清，经粗提和纯化获得了蛋白含量为4.242mg／ml的一抗IgG。同时采集健康番鸭的血清，纯化后获得IgG，按所设定的免疫程序免疫家兔，获得琼扩效价为1：8的兔抗番鸭二抗血清，并纯化得到蛋白含量为5.395mg／ml的二抗IgG。采用改良的过碘酸钠法成功地把HRP标记在纯化的二抗IgG上，结果表明，酶结合率=0.5312，标记率=0.6909，符合ELISA的要求。 3．用硫酸铵粗提的番鸭呼肠孤病毒作为包被抗原和HRP酶标记的兔抗番鸭二抗，成功地建立了检测番鸭呼肠孤病毒病抗体的间接ELISA法。试验结果表明，包被抗原1：80（0.0704mg／ml）稀释，待检血清1：40稀释，酶标二抗1：200稀释，是本方法最佳的工作浓度。应用研究结果表明，该法不与其它病原发生交叉反应，阻断效果明显，检测番鸭呼肠孤病毒抗体可达1：800比琼扩试验高50倍，ELISA测定临床采集的血清阳性率达70％，琼扩试验阳性率37.5％，两者符合率67.5％，批内批间重复结果稳定。因此，间接ELISA法检测番鸭呼肠病毒抗体特异性高、敏感性强、重复性好、质量稳定、结果可靠，适合于临床流行病调查。 4．用纯化的抗番鸭呼肠孤病毒抗体致敏乳胶成功地建立了反向乳胶凝集试验检测番鸭呼肠孤病毒抗原的方法。通过试验，确定了抗体致敏乳胶的最佳浓度为0.4242 mg／ml，最佳致敏温度37℃，最佳致敏时间2h。应用研究结果表明，抗体致敏乳胶无自凝性，特异性强，重复性好，质量可靠。人工攻毒雏番鸭，用本方法可于攻毒后的第三天粪便中检测到病毒抗原，直至攻毒鸭全部死亡都可从粪便中检测到病毒，可见在感染早期，病鸭即可从粪便排毒，且持续较长时间，及时无害化处理粪便对防制本病有重大意义。攻毒1日龄雏番鸭，剖检无菌采集取心、肝、脾按常规方法提取病毒抗原，检测结果表明，脾脏在攻毒后第4天3只中有2只结果阳性，第5天2只死亡鸭中有一只肝脏结果阳性，此后的病死鸭脾和肝番鸭呼肠孤病毒检测都阳性，而心脏处理物未见有阳性。
杨志刚[6]（2014）在《共表达禽（番鸭）呼肠孤病毒σB-σC-LTB蛋白亚单位疫苗载体的构建及免疫保护的研究》文中研究表明番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，ARV），其属于呼肠孤病毒属（Reovirus genus）禽呼肠孤病毒（Avian reovirus）的一员，具备禽呼肠孤病毒的一般生物学特性。临床中，此病在夏季番鸭中发病频繁，个体发病时间在4日龄～45日龄之间，发病率在20%～90%之间，但死亡比率差异较大，在约10%～30%之间。与其他病源混合感染率较高，甚至达90%以上。感染耐过番鸭个体一般表现为生长迟缓，变成僵鸭，对番鸭养殖的发展造成严重危害。该病毒基因，S3基因（片段大小1104bp）和S1基因（片段大小为810bp），分别编码该病毒的σB外衣壳蛋以及σC吸附蛋白。已有研究表明，这两种蛋白能够诱导机体产生特异性中和抗体，控制病毒的感染。因此，本实验选取σB基因和σC基因，及两者的串联基因σB-σC，同时将σB-σC基因与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）串联，将以上四种蛋白原核表达，通过动物免疫试验，分析比较了四种蛋白的免疫效果。本研究以NCBI中公布的ARV序列为模板，设计了特异性的引物，利用RT-PCR方法从细胞培养ARV中扩增了ARV约为1100bp的σB基因和约为810bp的σC基因。将目的基因片段克隆到pMD18-T simple载体上，并进行酶切、PCR鉴定和序列测定，重组质粒命名为pMD18-T-σB和pMD18-T-σC。利用相同的酶切位点将σB和σC基因串联，构建了重组质粒pMD18-T-σB-σC。另外通过重叠延伸PCR的方法，将σB-σC基因与LTB串联，构建了重组质粒pMD18-T-σB-σC-LTB。将四个重组质粒经双酶切，回收目的基因片段，分别与经同样双酶切的大肠杆菌表达载体pET30b连接，转化感受态BL21，筛选阳性克隆，并进行酶切、PCR和测序鉴定，重组质粒命名为pET30b-σB，pET30b-σC，pET30b-σB-σC，pET30b-σB-σC-LTB。将以上四种阳性重组菌，经IPTG进行诱导表达，经SDS-PAGE分析表明σB蛋白，σC蛋白，σB-σC蛋白，σB-σC-LTB四种蛋白均获得了正确的表达，分子量分别约为42kD，35kD，78kD，90kD。将表达的蛋白进行Western blot分析可知，四种蛋白都能够与ARV的阳性血清产生特异性的结合。证明这几种蛋白具备了有良好的免疫原性。四种蛋白均以包涵体形式表达。对包涵体进行提取、纯化和复性。将复性后的蛋白免疫SPF雏鸡，观察四种蛋白免疫效果。分别于免疫前、初次免疫后第7d、14d、21d、28d、35d收集雏鸡血清，经间接ELISA试验检测血清抗体产生情况。结果表明，四种蛋白实验组与免疫组比较可知，在免疫后第7天，利用间接ELISA方法检测免疫后不同时间点雏鸡血清抗体的变化。结果表明，四种蛋白免疫组均在免疫后第7d就出现了血清抗体。加强免疫后，抗体水平逐渐升高，第35d时达到最高，与对照组PBS组相比均差异极显着（p＜0.01）。四种蛋白免疫组雏鸡产生的血清抗体情况比较可知σB-σC-LTB蛋白免疫组高于σB-σC蛋白组，高于蛋白σC组，高于σB蛋白组。这些结果表明，这些重组蛋白具有较好的免疫原性，均能刺激机体产生良好的抗体水平，为进一步的临床动物保护试验提供了基础。
胡瑞鸿[7]（2020）在《抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估》文中认为小鹅瘟（Gosling plague,GP）又称为鹅细小病毒病,是由鹅细小病毒引起的一种高度接触性、败血性传染病,是危害养鹅业的主要传染病。近年来,根据遗传进化分析,小鹅瘟病毒（Gosling plague virus,GPV）的毒力有增强趋势,给该病的防治带来更大的挑战。目前GP的特异性防治主要依赖接种卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）进行被动免疫,对GP强毒感染具有明显的防治效果。由于IgY具有价格低廉、防治效果好等优点,已被广大养鹅户接受和采用。但目前使用的IgY多为粗制抗体,缺乏统一的生产、检验标准,琼扩抗体效价高低不等,故研制一种纯度及效价高,防治效果好,有统一生产标准的GPV IgY势在必行。本研究从黑龙江省某地饲养的雏鹅群中,采集疑似GP病死鹅的病料,进行GPV的分离鉴定,利用分离获得的GPV研制抗GP的IgY,并对其质量进行评价,具体研究内容和方法如下:（1）GPV的分离鉴定用氯仿提取法从疑似GP病死鹅的肝、脾组织中分离病毒,接种3日龄雏鹅和12日龄鹅胚进行病毒分离;分离的病毒经特异性检验（琼脂扩散试验（AGP）和鹅胚中和试验）、超微结构观察、毒力测定、理化特性（热敏感试验、乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、胰蛋白酶敏感试验、耐酸性试验）检验、纯净性试验、核酸检测、VP3基因序列鉴定及基因进化树分析,进行综合鉴定。（2）GPV IgY的研制将分离鉴定获得的GPV（命名为H株）,经鹅胚逐级传代至F10,F10代进行1000倍稀释,接种12日龄鹅胚,收获鹅胚液作为GPV灭活疫苗抗原,抗原无菌检验和毒力检测合格后,进行浓缩及灭活,通过接种12日龄鹅胚进行灭活检验;灭活检验合格后进行GPV灭活疫苗的配制及乳化,获得GPV灭活疫苗,对其进行物理性状、无菌检验及安全性检验;将检验合格的GPV灭活疫苗按经典免疫程序免疫产蛋鸡,当高免鸡蛋卵黄液的GPV IgY琼扩抗体效价≥1:64时,对其进行除脂、提取和灭活,制备出抗H株GPV IgY。（3）抗H株GPV IgY的质量评价通过监测GPV IgY的琼扩抗体效价对GPV IgY的理化特性（温度、酸碱度、胃蛋白酶的作用时间、冻融次数）进行评价;通过GPV IgY单次单剂量、重复单剂量和单次大剂量皮下注射3日龄雏鹅及小白鼠的安全性试验,观察雏鹅和小白鼠的健康状况,局部及全身反应情况对GPV IgY的安全性进行评价;通过不同琼扩抗体效价和不同剂量的GPV IgY对GPV强毒攻毒24 h雏鹅的治疗试验、对GPV感染不同时长和不同日龄雏鹅的治疗试验,依据雏鹅治愈率,对GPV IgY治疗效果进行评价;用不同琼扩抗体效价和不同免疫剂量的GPV IgY对雏鹅皮下接种,24 h后用GPV强毒攻毒,依据雏鹅保护率进行预防效果评价;同类产品免疫3日龄雏鹅,依据雏鹅保护率与治愈率,评价GPV IgY与同类产品的差异。通过物理性状、无菌检验、支原体检验、GPV IgY琼扩抗体效价监测及对雏鹅攻毒保护率监测,确定GPV IgY的储存温度和时间。试验结果表明:（1）GPV的分离鉴定结果分离的病毒接种雏鹅,呈现与GP一致的临床症状和病理剖检变化;接种鹅胚,可在鹅胚中增殖,且为非血凝性感染病毒;AGP显示,从雏鹅和鹅胚分离的病毒液与GP阳性血清之间出现沉淀线;鹅胚中和试验证明,病毒液能被GP阳性血清中和,中和后的病毒液接种鹅胚不引起死亡;电镜下观察,H株病毒粒子具有典型的细小病毒特征;H株鹅胚和雏鹅传代培养F6～F10代,毒价最高且稳定,病毒的ELD50和LD50分别大于10-5.0/0.2 m L和10-4.0/0.2m L;以分离到的H毒株分别接种3日龄、10日龄、20日龄雏鹅,其致病性随雏鹅日龄增大而减弱;分离的病毒在56℃3 h保持其感染性,能够抵抗乙醚、氯仿、胰蛋白酶和酸性条件（p H3.0）的作用;分离的病毒液细菌、支原体和外源病毒检查均为阴性,证明H株病毒纯净;PCR核酸检测病毒约在500 bp处出现特异性DNA条带,DNA大小与GPV相符;上述结果表明,分离的病毒符合GP生物学特性,该病毒为GPV（命名为H株）。以PCR扩增出的VP3基因,与参考毒株的VP3基因序列对比,核苷酸的同源性在95.9%～99.1%之间,氨基酸同源性为97.9%～99.6%之间;基因进化树分析表明,H株与在黑龙江省分离的SP、ZZ、ZD、DQ、JX等毒株亲缘关系较与GD（广东）、YG（扬州）等毒株近。（2）GPV IgY的制备结果GPV H株灭活疫苗抗原无菌检验呈阴性、鹅胚液ELD50为10-5.22/0.2 m L、灭活检验鹅胚全部健活。GPV灭活疫苗的物理性状、无菌检验、安全检验均合格。用该GPV灭活疫苗免疫产蛋鸡,收集AGP≥1:64高免鸡蛋的卵黄液。高免卵黄液经酸化水1:8稀释、p H5.2、4℃作用15 h、1900 g离心20 min条件下除脂;酸化水-1.5%辛酸-33%硫酸铵提取;终浓度0.05%甲醛溶液经20～25℃灭活24 h,对GPV IgY的琼扩抗体效价、蛋白浓度及蛋白纯度均无显着影响,确定上述除脂、提取和灭活条件为最佳工艺。（3）GPV IgY的质量评价结果上述制备的抗H株GPV IgY在60℃以下作用2 h,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比不降低,当温度达到70℃以上,琼扩抗体效价显着降低,当温度达到75℃作用30 min时,琼扩抗体效价呈阴性;p H范围在4.0～11.0时,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比差异不显着,p H值为3.0和12.0时,GPV IgY琼扩抗体效价显着低于对照组;当胃蛋白酶作用6 h,琼扩抗体效价无变化,作用8 h以上显着降低;GPV IgY经5次反复冻融,琼扩抗体效价与对照比无显着差异;GPV IgY免疫雏鹅和小白鼠均未出现任何注射局部和全身不良反应,精神状态良好,采食正常;GPV IgY对雏鹅治疗效果表明,琼扩抗体效价越高、注射剂量越大,雏鹅治愈率越高;病毒感染雏鹅的时间越长、雏鹅日龄越大,雏鹅治愈率越低;GPV IgY对雏鹅预防效果表明,同一注射剂量,琼扩抗体效价越高,雏鹅保护率越高,同一琼扩抗体效价,注射剂量增加,雏鹅保护率增高;GPV IgY免疫雏鹅后12 h～10 d,对雏鹅保护率高达88.00%以上,可有效抵抗病毒感染。差异对比试验表明,研制的GPV IgY的雏鹅保护率与治愈率均高于同类产品。（4）GPV IgY的储存条件2～8℃储存24个月,GPV IgY的物理性状、纯净性、琼扩抗体效价稳定,对雏鹅感染GPV的保护率达88.00%以上。（5）GPV IgY推荐使用剂量和方法对已感染GPV的雏鹅,选择GPV IgY琼扩抗体效价为1:16以上,1.0 m L/只;对未感染雏鹅进行紧急预防免疫,0.5 m L/只,皮下注射,对GPV感染的治愈率和保护率均达80.00%。
黄梅清[8]（2006）在《禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗的制备和免疫效果的研究》文中研究表明1997年以来，在我国南方番鸭养殖地区爆发一种新发疫病——禽（番鸭）呼肠孤病毒感染，俗称番鸭“肝白点病”或“花肝病”，发病率20％～90％，死亡率10％～30％，应激或混合感染时高达90％以上。由于该病潜伏期短（3～11天），易感日龄小（1～10日龄），雏番鸭免疫系统发育未成熟，难以产生足够的抗体抵挡病毒的攻击，所以获得足够的母源抗体是防控该病的重要手段。本研究以此为出发点，试制了禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗，用于免疫接种种番鸭以产生母源抗体保护雏番鸭抵抗病毒的感染，为制定免疫程序防控该病提供重要的依据。 制备疫苗的种毒来源于本实验室分离保存的禽（番鸭）呼肠孤病毒YB分离株，该病毒株具有良好的抗原性和免疫原性。用番鸭胚成纤维细胞传代培养，获得病变集中、一致、病毒含量较高(TCID50为10-7.1934／0.1ml)的细胞毒，即为疫苗抗原液。疫苗抗原液经0.3％甲醛溶液灭活后，用油乳佐剂乳化制成疫苗。 建立间接ELISA方法以检测禽（番鸭）呼肠孤病毒抗体滴度。经二次差速离心、盐析法浓缩提纯细胞毒，获得浓度为0.7355mg／ml病毒抗原液。制备了阳性血清（琼扩效价为1：16）、阴性血清、二抗（兔抗番鸭）阳性血清（琼扩效价为1：128），提纯二抗并标记HRP酶，获得合格的酶标二抗。建立了间接ELISA检测方法：抗原稀释30倍，酶标二抗稀释50倍，血清稀释50倍，临界值为0.5。结果判定：以能产生阳性反应的血清最高稀释度为该血清的终点抗体滴度。 制备的疫苗为油包水型乳白色油状物，稳定性较好。经检验安全，番鸭无不良反应。疫苗放置4℃冰箱保存3个月，免疫效力不变。用试制的疫苗于产前10天免疫种番鸭，皮下注射，1ml／只。免疫后14天，阳转率达100％，抗体水平持续上升，至免疫后60天，抗体滴度约保持在1：700，此后抗体水平开始下降。取种番鸭免疫20天后产下的种蛋，孵出雏番鸭。3日龄雏番鸭母源抗体水平平均达到1：200，7日龄时下降至1：70，14日龄时检测不到母源抗体。 当免疫种番鸭抗体效价达到高峰（抗体滴度1：900）后，取其后代雏番鸭作为免疫组番鸭进行保护力实验，未免疫种番鸭的后代雏番鸭则作为空白组。在进行雏番鸭保护力实验前，预先攻毒一批雏番鸭，待其发病后，把感染发病的番鸭与免疫组、空白组番鸭同群饲喂，检测母源抗体对雏番鸭的保护效果。结果表明：当饲养同居群中感染发病鸭数量达到13％时，有母源抗体的雏番鸭存活率为60％。当饲养同居群中感染发病鸭数量超过40％时，母源抗体无法保护雏番鸭不发病。当攻毒剂量≤5×104.1934TCID50／羽时，则有70％以上的保护。而无母源抗体的雏番鸭在受到≥103.1934TCID50／羽毒量攻击或者饲养同居群中感染发病鸭数量大于13％时，死亡率达到50％以上。 选取不同地区的2个种番鸭养殖场进行田间试验，全场免疫试制的禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗，随机采集种番鸭血清，测定抗体滴度，结果均达到实验预期水平，跟踪其后代雏番鸭的生长，饲养良好，未发生禽（番鸭）呼肠孤病毒感染。
唐雨德,周宗安,翟春生,王元伦,顾志香,胡拗根[9]（1994）在《鸡病毒性关节炎病毒（AVAV）的分离与鉴定》文中提出用ＳＰＦ鸡胚细胞培养，从临床上呈现类似鸡病毒性关节炎症状病鸡的趾屈肌组织中分离出一株病毒，电镜观察，病毒直径约为７５ｎｍ，无囊膜，呈六边形，双层衣壳，理化检查，病毒对５－氟脱氧尿核苷、ｐＨ５．０和乙醚耐受，胰蛋白酶对病毒感染价无影响；核酸电泳分析，病毒由１０个核酸片段组成，呈３－３－１－３分布；血清学试验，该病毒与ＡＶＡＶＳ＿（１１３３）株呈交叉反应。上述检查结果表明分离的病毒为鸡病毒性关节炎病毒，结合现场病鸡的临床症状和双份血清抗体检测结果，认定该鸡场此次发生的传染病为鸡病毒性关节炎。
李爽[10]（2010）在《鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究》文中研究指明本研究以临床分离的鸭源禽呼肠孤病毒感染7d龄樱桃谷雏鸭72羽,复制鸭源禽呼肠孤病毒感染模型,分别在感染后1d、3d、5d、7d、9d及14d对鸭源禽呼肠孤感染过程中雏鸭临床症状、各器官组织病理学及超微病理学变化、病毒定位、外周血CD3+、CD8+T淋巴细胞阳性率,脾脏、法氏囊IgY+生成细胞的分布和数量变化进行了动态的观察。结果报告如下。人工感染后临床症状及大体病变：7d龄雏鸭感染鸭源禽呼肠孤病毒3d后,鸭群开始表现出临床症状,7d发病率为100%,死亡率为5.56%（2／36）,剖检后可见肝脏、脾脏表面出现黄白色坏死点。感染鸭的组织病理学结果显示：脾脏表现为局灶性坏死,7d后形成肉芽肿结构；肝脏1-3d出现局灶性坏死,之后肝细胞变性坏死严重。其他组织出现淤血、出血,异嗜性粒细胞浸润；感染雏鸭的超微病理学结果显示：3d-7d法氏囊及脾脏上皮细胞核内出现环状结构及细胞质出现“片层小体”结构为特征病变。雏鸭体内鸭源禽呼肠孤定位结果显示：病毒阳性细胞主要为脾脏巨噬细胞,法氏囊上皮细胞、巨噬细胞,胸腺巨噬细胞、十二指肠、腺胃腺体细胞等,病毒在脾脏、法氏囊存留时间最长。感染鸭外周血CD3+、CD8+T细胞数量变化：试验组CD3+及CD8+T淋巴细胞始终小于对照组,CD3+T淋巴细胞阳性率在感染3d及7d后有下降趋势,7d后开始回升,试验组CD8+T淋巴细胞阳性率在感染5d后达到最低之后回升但仍然少于对照组。感染鸭免疫器官中IgY+生成细胞的数量变化：法氏囊IgY+生成细胞低于对照组,5d数量上升到最高；脾脏IgY+生成细胞高于对照组,1d-7d数量增加,9d回落。结果表明,7d鸭感染鸭源禽呼肠孤病毒后,免疫器官受到严重的损伤,并出现病毒阳性信号,说明免疫器官为鸭源禽呼肠孤病毒的主要靶器官。感染鸭外周血CD3+、CD8+T细胞数降低,法氏囊IgY+生成细胞数低于对照组,脾脏IgY+生成细胞数高于对照组,一方面说明病毒能够引起机体的免疫抑制,另外一方面说明病毒对免疫器官损伤同时,机体中枢免疫器官仍然继续发挥作用,诱导免疫细胞的增殖,促进外周免疫器官进行免疫应答造成机体免疫耐过。
二、应用免疫酶染色法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用免疫酶染色法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究（论文提纲范文）
（1）鸭病毒性肿头出血症病毒感染特性及其免疫检测技术的研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 鸭主要病毒性传染病病原的感染特性 |
| 1 概况 |
| 2 鸭病毒性传染病流行特点 |
| 3 鸭主要病毒性传染病病原的感染特性 |
| 3.1 鸭病毒性肠炎病原的感染特性 |
| 3.2 鸭病毒性肝炎病原的感染特性 |
| 3.3 鸭流感病原的感染特性 |
| 3.4 鸭病毒性肿头出血症病原的感染特性 |
| 4 存在的问题和研究方向 |
| 第二章 免疫酶技术在病毒病研究中的应用 |
| 1 免疫酶技术基本原理 |
| 2 免疫酶技术发展简史 |
| 3 酶标技术的研究进展 |
| 3.1 标记酶的特点 |
| 3.2 标记酶的种类 |
| 3.3 标记酶底物的种类 |
| 3.4 酶标记技术的种类 |
| 4 免疫酶技术的研究就进展 |
| 4.1 免疫酶组化技术研究进展 |
| 4.2 免疫酶测定法的研究进展 |
| 5 免疫酶组化在病毒病研究中的应用 |
| 5.1 免疫酶组化技术在家畜病毒病研究中的应用 |
| 5.2 免疫酶组化技术在家禽病毒病研究中的应用 |
| 6 酶联免疫吸附测定法在病毒病研究中的应用 |
| 6.1 ELISA在家畜病毒病研究中的应用 |
| 6.2 ELISA在家禽病毒病研究中的应用 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 DSHDV强毒人工感染鸭实验模型构建及组织病理学发展规律研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验鸭分组及人工感染 |
| 2.2 临床症状及病理剖检 |
| 2.3 病理切片的制备和观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 剖检变化 |
| 3.3 组织病理学变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DVSHD病理学模型构建及其特征 |
| 4.2 DVSHD与鸭常见传染病的临床症状及剖检变化的异同 |
| 4.3 DVSHD与鸭常见传染病的组织学变化的异同 |
| 4.4 病理学变化的特征及意义 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第四章 DSHDV强毒在人工感染鸭宿主细胞内的形态发生学和超微病理学研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 人工复制病例 |
| 2.2 透射电镜样品制备及观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 DSHDV的形态特征 |
| 3.2 DSHDV分布及形态发生特点 |
| 3.3 宿主细胞的超微结构变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DSHDV病毒粒子在感染鸭体内形态特征与形态发生学过程 |
| 4.2 DSHDV致感染鸭的超微结构变化及意义 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第五章 DSHDV强毒人工感染鸭和鸭胚致宿主细胞凋亡研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸭胚的人工感染 |
| 2.2 实验鸭的人工感染及样品的采集 |
| 2.3 HE染色法观察 |
| 2.4 透射电镜法观察 |
| 2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 3 结果 |
| 3.1 DSHDV在鸭胚上的培养特性 |
| 3.2 DSHDV致鸭胚宿主细胞凋亡的观察 |
| 3.3 DSHDV致鸭宿主细胞凋亡的观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞凋亡的基本特征 |
| 4.2 细胞凋亡的检测方法 |
| 4.3 DSHDV感染与宿主细胞凋亡 |
| 4.4 DSHDV致宿主细胞凋亡的规律 |
| 4.5 DSHDV致宿主细胞凋亡机制的探讨 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第六章 免疫组化检测DSHDV方法的建立和在检测病毒侵染规律研究中的应用 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要试剂及配制 |
| 1.5 主要仪器及设备 |
| 1.6 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 人工复制病例 |
| 2.2 实验鸭的人工感染及样品采集 |
| 2.3 兔抗DSHDV高免血清IgG的提取和纯化 |
| 2.4 载玻片和盖玻片的处理 |
| 2.5 免疫组化检测材料的固定、包埋和切片 |
| 2.6 免疫组化检测鸭病毒性肿头出血症病毒方法的建立及优化 |
| 2.7 间接免疫酶法检测DSHDV在鸭体中的侵染规律 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔抗DSHDV高免血清效价及IgG纯化 |
| 3.2 免疫组化SP染色方法的建立和优化 |
| 3.3 特异性实验结果 |
| 3.4 重复性和稳定性实验结果 |
| 3.5 间接免疫酶法检测组织中DSHDV在鸭体中的侵染规律 |
| 4 讨论 |
| 4.1 检测DSHDV抗原的间接免疫酶法的建立与优化 |
| 4.2 DSHDV抗原的定位和DSHDV的侵染规律 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第七章 间接ELISA检测鸭病毒性肿头出血症抗体方法的建立和应用 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 1.6 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗原的制备与纯化 |
| 2.2 鸭病毒性肿头出血症阳性、阴性血清的制备 |
| 2.3 间接ELISA的基本操作程序 |
| 2.4 间接ELISA最佳工作条件的确定 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 敏感性试验 |
| 2.7 重复性试验 |
| 2.8 临床血清样品的检测 |
| 2.9 免疫鸭特异性抗体的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒抗原的含量和阳性血清效价 |
| 3.2 间接ELISA法最佳工作条件的选择 |
| 3.3 特异性试验 |
| 3.4 敏感性试验 |
| 3.5 重复性试验 |
| 3.6 临床血清样品的检测结果 |
| 3.7 免疫鸭特异性抗体的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 间接ELISA技术参数的选择 |
| 4.2 间接ELISA特异性和敏感性 |
| 4.3 间接ELISA试验质量控制 |
| 4.4 间接ELISA在临床上的应用 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 第五部分 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（3）雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒生物学特性研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 禽腺病毒的研究进展 |
| 1 腺病毒的概况 |
| 1.1 腺病毒的分类 |
| 1.2 腺病毒的特点 |
| 1.3 腺病毒的感染及复制 |
| 2 禽腺病毒的概况 |
| 2.1 禽腺病毒的分类 |
| 2.1.1 Ⅰ群禽腺病毒 |
| 2.1.2 Ⅱ群禽腺病毒 |
| 2.1.3 Ⅲ群禽腺病毒 |
| 2.2 禽腺病毒的形态结构及形态发生特点 |
| 2.3 禽腺病毒的浮力密度 |
| 2.4 禽腺病毒的体外培养 |
| 2.5 禽腺病毒的致病机理 |
| 2.6 禽腺病毒的诊断方法 |
| 2.7 腺病毒感染 |
| 2.7.1 鹅的疑是腺病毒性肝炎 |
| 2.7.2 鹅的腺病毒感染 |
| 3 雏鹅新型病毒性肠炎的研究概况 |
| 3.1 雏鹅新型病毒性肠炎概述 |
| 3.2 雏鹅新型病毒性肠炎病毒病原学 |
| 3.3 雏鹅新型病毒性肠炎流行情况 |
| 3.4 雏鹅新型病毒性肠炎临床症状 |
| 3.5 雏鹅新型病毒性肠炎病理变化 |
| 3.5.1 眼观变化 |
| 3.5.2 组织学变化 |
| 3.6 雏鹅新型病毒性肠炎实验室诊断 |
| 3.6.1 病毒的分离和鉴定 |
| 3.6.2 电镜检测技术 |
| 3.6.3 血清学诊断 |
| 3.7 防治措施 |
| 3.7.1 疫苗免疫 |
| 3.7.2 高免血清防治 |
| 3.7.3 不从疫区引进雏鹅和种鹅 |
| 3.7.4 加强饲养管理 |
| 第二章 腺病毒感染与宿主细胞凋亡研究进展 |
| 1 细胞凋亡概况 |
| 2 病毒感染与细胞凋亡关系 |
| 3 腺病毒诱导细胞凋亡的发现 |
| 4 腺病毒感染与细胞凋亡的作用机制 |
| 4.1 EIA |
| 4.2 EIB |
| 4.2.1 E1B-19K |
| 4.2.2 E1B-55K |
| 4.3 E3 |
| 4.3.1 E3区域编码的三个蛋白对细胞凋亡的阻遏作用 |
| 4.3.2 E3区域编码的ADP蛋白的致细胞凋亡作用 |
| 4.4 E4 |
| 4.4.1 E4-ORF6 |
| 4.4.2 E4-ORF4 |
| 5 结语 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 NGVEV-CN强毒在感染鸭胚体内的形态发生学以及宿主细胞超微病理学研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 NGVEV适应鸭胚 |
| 2.2 鸭胚的人工感染NGVEV试验 |
| 2.3 透射电镜样品制备及观察 |
| 2.3.1 透射电镜样品的制备具体步骤操作 |
| 2.3.2 超薄切片和染色 |
| 2.3.3 透射电镜观察和记录 |
| 3 结果 |
| 3.1 NGVEV在鸭胚中的传代情况 |
| 3.2 感染鸭胚眼观病理变化及电镜下NGVEV颗粒的形态特征 |
| 3.3 NGVEV病毒粒子在感染鸭胚体内的分布及其形态发生特点 |
| 3.4 感染鸭胚宿主的超微结构变化 |
| 3.4.1 尿囊膜 |
| 3.4.2 肝 |
| 3.4.3 肌胃 |
| 3.4.4 肠道 |
| 3.4.5 心 |
| 3.4.6 脑 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGVEV鹅胚尿囊液在鸭胚的适应 |
| 4.2 NGVEV病毒粒子在感染鸭胚中的形态特征和形态发生过程 |
| 4.3 NGVEV感染鸭胚的主要靶器官和靶细胞器 |
| 4.4 人工感染NGVEV雏鹅和鸭胚的宿主细胞超微结构病变的比较 |
| 5 小结 |
| 第四章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株适应鸭胚成纤维细胞及其体外培养的增殖特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 单层鸭胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2 NGVEV在原代鸭胚成纤维细胞上的适应 |
| 2.3 NGVEV-CN细胞毒在DEF上增殖研究 |
| 2.3.1 不同代次NGVEV细胞毒的病毒滴度测定 |
| 2.3.2 F_5代NGVEV细胞毒在不同感染时间的病毒滴度测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 NGVE-CN在原代鸭胚成纤维细胞上的适应情况 |
| 3.2 NGVEV-CN细胞毒在DEF细胞的增殖情况 |
| 3.2.1 不同传代次数的NGVE-CN细胞毒的TCID_(50)测定 |
| 3.2.2 F_5代不同感染时间点的NGVEV-CN细胞毒TCID_(50)测定 |
| 3.3 被NGVEV感染的DEF细胞的细胞病变特征 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGVEV对DEF细胞的适应 |
| 4.2 NGVEV-CN细胞毒的释放 |
| 4.3 NGVEV在DEF细胞的增殖规律 |
| 5 小结 |
| 第五章 NGVEV-CN强毒株在鸭胚成纤维细胞上的形态发生学和宿主细胞超微结构病变研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 细胞培养相关试剂 |
| 1.3.2 透射电子显微镜观察样品制备相关试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 原代单层鸭胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2 NGVEV感染DEF细胞及采样 |
| 2.3 透射电镜样品准备及操作方法 |
| 2.3.1 透射电镜样品制备的具体步骤 |
| 2.3.2 超薄切片和染色 |
| 2.3.3 观察和记录 |
| 3 结果 |
| 3.1 电镜下NGVEV病毒粒子的确认和形态特征 |
| 3.2 NGVEV在感染细胞内的形态发生过程 |
| 3.3 NGVEV的胞浆包涵体结构 |
| 3.4 被NGVEV感染的DEF细胞的超微结构变化 |
| 3.4.1 线粒体的固缩变化 |
| 3.4.2 细胞浆中不规则的电子致密物质 |
| 3.4.3 细胞浆的粗面内质网扩张 |
| 3.4.4 细胞浆内空泡的形成 |
| 3.5 NGVEV致DEF细胞凋亡现象 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGVEV在DEF细胞中的形态特征和形态发生过程 |
| 4.2 NGVEV的胞浆包涵体结构 |
| 4.3 NGVEV致DEF细胞线粒体的固缩和异常聚集变化 |
| 5 小结 |
| 第六章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致鸭胚成纤维细胞凋亡的相关研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 细胞培养相关试剂 |
| 1.3.2 光学显微镜观察细胞凋亡的相关试剂 |
| 1.3.3 透射电子显微镜观察细胞凋亡的相关试剂 |
| 1.3.4 DNA提取及电泳试剂 |
| 1.3.5 Annexin V-FITC/PI双标记试剂盒 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸭胚成纤维细胞体外培养 |
| 2.2 光学显微镜观察 |
| 2.3 透射电镜观察 |
| 2.3.1 制样 |
| 2.3.2 超薄切片和染色 |
| 2.3.3 观察和记录 |
| 2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.5 Annexin V-FITC/PI双标记的流式细胞仪检测 |
| 2.6 Annexin V-FITC/PI双标记的荧光显微镜观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 HE染色法的光镜观察 |
| 3.2 透射电子显微镜观察 |
| 3.3 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 3.4 Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测 |
| 3.5 Annexin V-FITC/PI双标记的荧光显微镜观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGVEV致DEF细胞凋亡 |
| 4.2 NGVEV致DEF细胞凋亡的形态学观察 |
| 4.3 细胞凋亡与细胞病变的关系 |
| 4.4 NGVEV致DEF细胞凋亡的意义 |
| 5 小结 |
| 第七章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒的提纯、负染超微结构观察和兔抗NGVEV高免血清IgG的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 细胞培养相关试剂 |
| 1.3.2 CsCl密度梯度离心相关试剂配制 |
| 1.3.3 负染电镜相关试剂 |
| 1.3.4 SDS-PAGE试剂的配制 |
| 1.3.5 马斯亮兰染色的配制 |
| 1.3.6 琼脂板的制备 |
| 1.3.7 抗原制备及抗体纯化的相关试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒增殖 |
| 2.1.1 经鸭胚尿囊腔增殖 |
| 2.1.2 经体外培养的鸭胚成纤维细胞增殖 |
| 2.2 NGVEV的提纯方法 |
| 2.2.1 沉淀法纯化病毒 |
| 2.2.2 差速离心法纯化病毒 |
| 2.2.3 CsCl密度梯度和等密度超速离心纯化病毒 |
| 2.3 应用透射电镜对NGVEV超微结构进行负染观察 |
| 2.4 兔抗NGVEV高免血清的制备 |
| 2.4.1 病毒蛋白含量的测定(Bradford法) |
| 2.4.2 差速离心法纯化病毒 |
| 2.4.3 NGVEV免疫抗原的制备 |
| 2.4.4 抗体效价的检测 |
| 2.4.5 兔抗NGVEV血清IgG的提取和纯化 |
| 2.4.6 兔抗NGVEV血清IgG蛋白含量的测定 |
| 2.4.7 兔抗NGVEV血清IgG纯度的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 NGVEV在鸭胚及DEF细胞的增殖情况 |
| 3.2 不同纯化方法的结果 |
| 3.2.1 沉淀法纯化病毒 |
| 3.2.2 差速离心法纯化病毒 |
| 3.2.3 CsCl不连续密度梯度和等密度超速离心纯化病毒 |
| 3.3 兔抗NGVEV高免血清的制备 |
| 3.3.1 免疫兔子的抗原的浓度 |
| 3.3.2 抗体效价检测 |
| 3.3.3 兔抗NGVEV血清IgG的纯化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于NGVEV的提纯 |
| 4.2 完整NGVEV粒子与不完整NGVEV粒子 |
| 4.3 兔抗NGVEV高免血清IgG的纯化 |
| 5 小结 |
| 第八章 利用免疫组化SP法对雏鹅新型病毒性肠炎病毒感染雏鹅的侵染规律研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 组织固定液 |
| 1.3.2 脱水剂 |
| 1.3.3 组织包埋剂 |
| 1.3.4 APES粘片剂 |
| 1.3.5 苏木素染染色剂 |
| 1.3.6 免疫组化染色试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 NGVEV的增殖及兔抗NGVEV的IgG制备 |
| 2.2 病理模型的构建 |
| 2.3 人工感染NGVEV雏鹅的组织材料的采集 |
| 2.4 载玻片和盖玻片的处理 |
| 2.5 免疫组化检测材料的固定、包埋和切片 |
| 2.6 免疫组化检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒方法的建立及优化 |
| 2.6.1 免疫组化SP法检测NGVEV方法的条件优化 |
| 2.6.2 特异性试验 |
| 2.6.3 重复性和稳定性实验 |
| 2.6.4 免疫组化SP法染色程序 |
| 2.6.5 结果的判定 |
| 3 结果 |
| 3.1 雏鹅人工急性感染NGVE-CN强毒的临床症状 |
| 3.2 雏鹅人工急性感染NGVE-CN强毒的大体病变 |
| 3.3 免疫组化SP染色方法的建立和优化 |
| 3.4 特异性实验结果 |
| 3.5 重复性和稳定性实验结果 |
| 3.6 应用免疫组织化学SP法检测NGVEV在感染鹅各组织中的定位及动态分布 |
| 3.6.1 NGVEV在感染雏鹅的免疫器官的定位及动态分布 |
| 3.6.2 NGVEV在感染雏鹅的消化器官的定位及动态分布 |
| 3.6.3 NGVEV在感染雏鹅的其他器官的定位及动态分布 |
| 3.7 应用免疫组织化学SP法检测NGVEV在死亡鹅组织中的定位及动态分布 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫组织化学染色法检测NGVEV的建立与优化 |
| 4.2 NGVEV侵染鹅免疫器官的意义 |
| 4.3 NGVEV侵染鹅消化器官的意义 |
| 5 小结 |
| 第九章 利用免疫荧光抗体法对雏鹅新型病毒性肠炎病毒感染雏鹅的侵染规律研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 免疫荧光染色试剂 |
| 1.3.2 称染试剂 |
| 1.3.3 其余试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 NGVEV的增殖及兔抗NGVEV的IgG制备 |
| 2.2 病理模型的构建 |
| 2.3 人工感染NGVEV雏鹅的组织材料的采集 |
| 2.4 载玻片和盖玻片的处理 |
| 2.5 间接免疫荧光检测材料的固定、包埋和切片 |
| 2.6 间接免疫荧光检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒方法的建立及优化 |
| 2.6.1 间接免疫荧光检测NGVEV条件的优化 |
| 2.6.2 特异性试验 |
| 2.6.3 间接免疫荧光法检测石蜡切片中NGVEV的染色程序 |
| 2.6.4 免疫荧光染色结果判定 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫荧光染色方法的建立和优化结果 |
| 3.2 特异性实验结果 |
| 3.3 应用间接免疫荧光检测NGVEV在感染鹅组织中的定位及动态分布 |
| 3.4 应用间接免疫荧光检测NGVEV在死亡鹅组织中的定位及动态分布 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于荧光抗体技术的应用和优化 |
| 4.2 免疫荧光法和免疫组化SP法检测NGVEV的比较 |
| 4.3 NGVEV的组织嗜性及分布规律 |
| 4.4 其他腺病毒的感染和组织嗜性 |
| 5 小结 |
| 第十章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒CN强毒株致雏鹅宿主细胞凋亡的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 光学显微镜观察细胞凋亡的相关试剂 |
| 1.3.2 透射电子显微镜观察细胞凋亡的试剂 |
| 1.3.3 DNA提取及电泳试剂 |
| 1.3.4 TUNEL法检测相关试剂 |
| 1.3.5 其它常规试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验鹅的人工感染及组织样品的采集 |
| 2.2 HE染色的光学显微镜观察 |
| 2.3 透射电子显微镜观察 |
| 2.4 琼脂糖凝胶电泳检测宿主细胞DNA Ladder |
| 2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 3 结果 |
| 3.1 HE染色的可见光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化 |
| 3.2 透射电子显微镜观察凋亡细胞的超微形态学变化 |
| 3.3 DNA Ladder检测 |
| 3.4 TUNEL法检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞凋亡的检测方法 |
| 4.2 NGVEV感染与宿主鹅的细胞凋亡 |
| 5 小结 |
| 第十一章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗对青年鹅的免疫原性研究及重组GOIL-2对疫苗的佐剂效应研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株及佐剂 |
| 1.2 试验青年鹅及鸭胚 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.3.1 MTT相关溶液的配制 |
| 1.3.2 ELISA相关溶液的配制 |
| 1.3.3 中和实验相关试剂 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 NGVEV灭活疫苗的制备 |
| 2.2 28日龄青年鹅的分组免疫程序及血样采集 |
| 2.3 细胞免疫水平检测 |
| 2.3.1 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.3.2 淋巴细胞的诱导培养 |
| 2.3.3 样品检测及数据处理 |
| 2.4 体液免疫水平检测 |
| 2.4.1 间接ELISA实验 |
| 2.4.2 中和抗体水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 被疫苗免疫青年鹅的健康状况 |
| 3.2 NGVEV强毒株的TCID_(50)测定 |
| 3.3 抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 |
| 3.4 HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 |
| 3.5 疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.5.1 不同剂量的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.5.2 辅佐不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.5.3 NGVEV灭活疫苗与辅佐GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后淋巴细胞增殖试验结果的比较 |
| 3.6 被疫苗免疫青年鹅的血清IgG水平检测结果 |
| 3.6.1 不同剂量的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后血清抗NGVEV的IgG水平的检测结果 |
| 3.6.2 辅佐不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后血清抗NGVEV-IgG水平的检测结果 |
| 3.6.3 NGVEV灭活疫苗与辅佐GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅后血清抗NGVEV的IgG水平的检测结果的比较 |
| 3.7 被疫苗免疫的青年鹅中和抗体水平的检测结果 |
| 3.7.1 不同剂量NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅的中和抗体水平检测结果 |
| 3.7.2 辅佐不同剂量GoIL-2的NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅的中和抗体水平检测结果 |
| 3.7.3 NGVEV灭活疫苗与辅佐GoIL-2 NGVEV灭活疫苗免疫青年鹅的中和抗体水平检测结果的比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGVEV灭活疫苗对青年鹅的细胞免疫效果 |
| 4.2 NGVEV灭活疫苗对青年鹅的体液免疫效果 |
| 4.3 GoIL-2对疫苗诱导的细胞免疫及体液免疫反应的影响 |
| 5 小结 |
| 第十二章 雏鹅新型病毒性肠炎病毒灭活疫苗在开产前种鹅的免疫效果评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株及佐剂 |
| 1.2 试验种鹅 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 开产前鹅的分组免疫程序及样品的采集 |
| 2.2 卵黄的收集及处理方法 |
| 2.3 细胞免疫水平检测 |
| 2.4 体液免疫水平检测 |
| 2.5 后代雏鹅的攻毒免疫保护力测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 被免疫种鹅的健康状况 |
| 3.2 被免疫种鹅的淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.3 被免疫种鹅的血清IgG水平检测结果 |
| 3.4 被免疫种鹅的血清中和抗体水平检测结果 |
| 3.5 被免疫种鹅的卵黄抗NGVEV的IgG水平检测结果 |
| 3.6 被免疫种鹅的卵黄中和抗体水平的检测结果 |
| 3.7 被免疫种鹅的后代雏鹅攻毒保护实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间以第一作者身份发表的论文 |
| 攻读博士学位期间以非第一作者身份发表的论文 |
（5）番鸭呼肠孤病毒病诊断技术研究（论文提纲范文）
| 1 封面 |
| 2 目录 |
| 3 中文摘要 |
| 4 英方摘要 |
| 5 正文 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 综述 |
| 5.2.1 呼肠孤病毒的研究现状 |
| 5.2.2 免疫酶技术的研究进展 |
| 5.2.3 乳胶凝集试验的研究进展 |
| 5.3 抗原与抗体的制备和二抗的酶标 |
| 5.3.1 抗原的制备 |
| 5.3.2 血清的制备及酶的标记 |
| 5.3.3 小结 |
| 5.4 间接ELISA检测番鸭呼肠孤病毒抗体方法的建立 |
| 5.4.1 材料与方法 |
| 5.4.2 结果 |
| 5.4.3 小结 |
| 5.5 反向乳胶凝集试验检测番鸭呼肠孤病毒抗原方法的建立 |
| 5.5.1 材料与方法 |
| 5.5.2 结果 |
| 5.5.3 小结 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 结论 |
| 5.8 参考文献 |
| 5.9 附录 |
| 6 致谢 |
（6）共表达禽（番鸭）呼肠孤病毒σB-σC-LTB蛋白亚单位疫苗载体的构建及免疫保护的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 ARV 病原生物学特性 |
| 1.2 ARV 的流行病学特征 |
| 1.3 临床症状与病理变化 |
| 1.4 ARV 基因组与蛋白功能 |
| 1.4.1 λA 蛋白 |
| 1.4.2 λB 蛋白 |
| 1.4.3 λC 蛋白 |
| 1.4.4 μA 蛋白 |
| 1.4.5 μB 蛋白 |
| 1.4.6 μNS 蛋白 |
| 1.4.7 σC 蛋白 |
| 1.4.8 σB 蛋白 |
| 1.4.9 σA 蛋白 |
| 1.5 ARV 诊断方法 |
| 1.5.1 临床诊断 |
| 1.5.2 琼脂扩散试验 |
| 1.5.3 免疫荧光技术 |
| 1.5.4 ELISA 检测 |
| 1.5.5 RT- PCR 检测 |
| 1.5.6 cDNA 探针 |
| 1.6 ARV 疫苗研究 |
| 1.6.1 弱毒疫苗 |
| 1.6.2 油乳剂灭活疫苗 |
| 1.6.3 ARV σC 基因亚单位载体疫苗 |
| 1.7 ARV 的防治 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物、质粒和菌种 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 番鸭呼肠孤病毒σB 和σC 基因的克隆及鉴定 |
| 2.2.2 番鸭呼肠孤病毒σB-σC 基因的克隆及鉴定 |
| 2.2.3 目的基因σB-σC-LTB 的扩增 |
| 2.2.4 番鸭呼肠孤病毒基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.5 重组菌在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.2.6 表达蛋白的 Western blot 鉴定 |
| 2.2.7 重组表达蛋白的纯化 |
| 2.2.8 重组蛋白的免疫原性研究 |
| 第三章 试验结果 |
| 3.1 ARV σB 和σC 基因克隆与序列测定 |
| 3.1.1 RT-PCR 扩增σB 和σC 基因结果 |
| 3.1.2 重组阳性质粒 pMD18-T-σB 和 pMD18-T-σC 的鉴定结果 |
| 3.1.3 σB 和σC 基因序列测定结果 |
| 3.1.4 重组质粒 pMD18-T-σB -σC 的鉴定结果 |
| 3.1.5 PCR 扩增σB –σC-LTB 基因结果 |
| 3.1.6 原核表达载体 pET-30b- σB 和 pET-30b- σC 的鉴定结果 |
| 3.1.7 原核表达载体 pET-30b-σB -σC 的鉴定结果 |
| 3.1.8 原核表达载体 pET-30b-σB –σC-LTB 的鉴定结果 |
| 3.2 σB 和σC 基因在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 3.3 σB -σC 和σB –σC-LTB 基因在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 3.4 表达产物的纯化 |
| 3.5 表达蛋白的 Western blot 鉴定 |
| 3.6 ARV ELD50的确定 |
| 3.7 血清抗体的检测 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 目的基因的选择 |
| 4.2 基因的表达与纯化 |
| 4.3 免疫效果的分析 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（7）抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 小鹅瘟病毒研究现状 |
| 1.1.1 小鹅瘟病毒及小鹅瘟病简介 |
| 1.1.2 小鹅瘟病毒的鉴定方法 |
| 1.2 小鹅瘟生物制剂研究进展 |
| 1.2.1 小鹅瘟病毒活疫苗 |
| 1.2.2 小鹅瘟病毒灭活疫苗 |
| 1.2.3 小鹅瘟病毒基因疫苗 |
| 1.2.4 小鹅瘟病毒重组活载体疫苗 |
| 1.2.5 小鹅瘟抗血清 |
| 1.2.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体 |
| 1.3 卵黄抗体的研究进展 |
| 1.3.1 卵黄抗体的结构特点 |
| 1.3.2 卵黄抗体的提取方法 |
| 1.3.3 卵黄抗体的灭活方法 |
| 1.3.4 卵黄抗体应用 |
| 1.3.5 卵黄抗体的优势与展望 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 主要材料和试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 研究技术路线图 |
| 2.3.2 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 2.3.3 小鹅瘟病毒的鉴定 |
| 2.3.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备及检验 |
| 2.3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体质量评价 |
| 2.3.7 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 2.4 试验数据分析及统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 3.1.1 小鹅瘟病毒在雏鹅分离培养结果 |
| 3.1.2 小鹅瘟病毒在鹅胚分离培养结果 |
| 3.2 小鹅瘟病毒鉴定 |
| 3.2.1 小鹅瘟病毒特异性试验结果 |
| 3.2.2 小鹅瘟病毒粒子超微结构观察结果 |
| 3.2.3 小鹅瘟病毒毒力测定 |
| 3.2.4 小鹅瘟病毒理化特性 |
| 3.2.5 小鹅瘟病毒的纯净性试验结果 |
| 3.2.6 小鹅瘟病毒核酸检测结果 |
| 3.2.7 小鹅瘟病毒VP3基因序列鉴定 |
| 3.3 小鹅瘟病毒灭活疫苗抗原的制备及成品检验 |
| 3.3.1 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗制备抗原用病毒的检验 |
| 3.3.2 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗检验 |
| 3.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 3.4.1 产蛋鸡选择结果 |
| 3.4.2 高免鸡蛋的琼扩抗体效价监测结果 |
| 3.4.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定 |
| 3.4.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的确定 |
| 3.4.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体外源性病毒灭活方法确定 |
| 3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 3.5.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体的理化特性 |
| 3.5.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体的安全性评价 |
| 3.5.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体对人工感染雏鹅的治疗效果评价 |
| 3.5.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体对雏鹅注射后攻毒的预防效果评价 |
| 3.5.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体与试验选用的同类产品差异试验 |
| 3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 3.6.1 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体物理性状的影响 |
| 3.6.2 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体纯净性的影响 |
| 3.6.3 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体琼扩抗体效价的影响 |
| 3.6.4 储存温度及时间对雏鹅攻毒预防效果的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小鹅瘟病毒的分离鉴定及生物学特性分析 |
| 4.2 小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析 |
| 4.3 影响HA与HI效果的因素分析 |
| 4.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备 |
| 4.5 鸡群的选择管理与高免蛋黄收集 |
| 4.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定及主要影响因素分析 |
| 4.7 最优小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法确定及分析 |
| 4.7.1 辛酸终浓度对小鹅瘟病毒卵黄抗体的影响 |
| 4.7.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的对比分析及验证 |
| 4.7.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的琼扩抗体效价与蛋白浓度的相关性分析 |
| 4.8 小鹅瘟病毒卵黄抗体灭活条件的确定 |
| 4.9 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 4.9.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体安全性评价 |
| 4.9.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体治疗效果评价 |
| 4.9.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的预防效果评价 |
| 4.9.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体试验选用的同类产品差异 |
| 4.10 储存条件的确定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
（8）禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗的制备和免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 综述 |
| 1.禽呼肠孤病毒研究现状 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒简介 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒历史 |
| 1.3 禽呼肠孤病毒特征 |
| 1.4 禽呼肠孤病毒的诊断 |
| 1.5 防治方法的研究 |
| 2.酶联免疫吸附试验概述 |
| 2.1 酶免疫技术简介 |
| 2.2 酶免疫技术的发展 |
| 2.3 酶联免疫吸附试验的原理 |
| 2.4 酶联免疫吸附试验的类型 |
| 2.5 用的酶及显色底物 |
| 2.6 酶标记物的制备 |
| 3.兽用疫苗研究现状 |
| 3.1 兽用生物制品简介 |
| 3.2 兽用疫苗研究现状 |
| 材料与方法 |
| 1.抗原抗体及酶标二抗的制备 |
| 2.间接ELISA检测番鸭呼肠孤病毒抗体方法的建立 |
| 3.禽(番鸭)呼肠孤病毒灭活疫苗的制备 |
| 4.禽(番鸭)呼肠孤病毒油乳剂灭活苗的质量检验 |
| 实验结果 |
| 1.抗原抗体制备与二抗的酶标 |
| 2.间接ELISA检测禽(番鸭)呼肠孤病毒抗体方法的建立 |
| 3.禽(番鸭)呼肠孤病毒病油乳剂灭活苗的制备 |
| 4.试制疫苗的质量检验 |
| 分析与讨论 |
| 1.对实验方法与操作的讨论 |
| 2.对实验结果的讨论 |
| 3.实验的创新之处 |
| 4.实验存在的问题 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1 禽呼肠孤病毒研究概述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状及病理组织学变化 |
| 1.3.1 禽呼肠孤病毒感染的临床症状及组织病理学变化 |
| 1.3.2 番鸭呼肠孤病毒感染的临床症状及组织病理学变化 |
| 1.3.3 鸭源呼肠孤病毒感染的临床症状及组织病理学变化 |
| 2 禽类免疫抑制性疾病的致病机理 |
| 2.1 免疫抑制疾病对免疫器官的损伤 |
| 2.2 免疫抑制疾病对机体免疫水平的影响 |
| 2.3 免疫抑制疾病与细胞凋亡 |
| 3 免疫抑制疾病的危害及防控 |
| 本研究的目的与意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试毒株及相关抗体、试剂盒 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器、型号及生产厂家 |
| 2 方法 |
| 2.1 供试鸭源禽呼肠孤病毒的准备 |
| 2.1.1 病毒处理 |
| 2.1.2 毒力测定 |
| 2.1.3 病毒的处理 |
| 2.2 试验动物分组及处理 |
| 2.3 感染鸭源禽呼肠孤病毒雏鸭的发病情况及临床症状观察 |
| 2.4 试验样品采集与保存 |
| 2.5 感染鸭源禽呼肠孤病毒雏鸭的各器官组织病理学动态观察 |
| 2.6 鸭源禽呼肠孤病毒在雏鸭体内的定位 |
| 2.7 感染鸭源禽呼肠孤病毒雏鸭的免疫病理学观察 |
| 2.7.1 外周CD3~+、CD8~+T细胞阳性率的测定 |
| 2.7.2 免疫器官指数测定 |
| 2.7.3 脾脏、法氏囊IgY~+抗体生成细胞数量测定 |
| 2.8 数据统计与处理 |
| 试验结果 |
| 1 鸭源禽呼肠孤病毒毒力测定 |
| 2 鸭源禽呼肠孤病毒感染后临床症状 |
| 3 鸭源禽呼肠孤病毒感染后剖检病理学变化 |
| 4 鸭源禽呼肠孤病毒感染后组织病理学变化 |
| 5 鸭源禽呼肠孤病毒感染后超微组织病理学变化 |
| 6 鸭源禽呼肠孤病毒在鸭体内的定位 |
| 7 鸭源禽呼肠孤病毒感染后免疫病理学指标检测 |
| 7.1 外周血液CD3~+、CD8~+T淋巴细胞检测结果 |
| 7.2 免疫器官指数测定结果 |
| 7.3 脾脏、法氏囊IgY~+抗体生成细胞检测结果 |
| 讨论 |
| 1 鸭源禽呼肠孤病毒人工感染的临床症状及剖检变化 |
| 2 鸭源禽呼肠孤病毒引起的组织病理学变化 |
| 3 鸭源禽呼肠孤病毒在雏鸭体内的定位 |
| 4 鸭源禽呼肠孤病毒对雏鸭免疫功能的影响 |
| 4.1 鸭源禽呼肠孤病毒对雏鸭外周血CD3~+、CD8~+T细胞的影响 |
| 4.2 鸭源禽呼肠孤病毒对雏鸭脾脏、法氏囊IgY~+抗体生成细胞的影响 |
| 结论 |
| 图版说明 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、应用免疫酶染色法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究（论文参考文献）
- [1]鸭病毒性肿头出血症病毒感染特性及其免疫检测技术的研究[D]. 李传峰. 四川农业大学, 2010(12)
- [2]抗鸡关节炎病毒单克隆抗体介导间接ELISA的建立[J]. 朱建中,董国雄,李俊宝. 江苏农学院学报, 1998(03)
- [3]雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒生物学特性研究[D]. 陈舜. 四川农业大学, 2009(05)
- [4]应用免疫酶染色法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究[J]. 唐雨德,周宗安,翟春生,王元伦,顾志香. 中国畜禽传染病, 1995(01)
- [5]番鸭呼肠孤病毒病诊断技术研究[D]. 王全溪. 福建农林大学, 2004(04)
- [6]共表达禽（番鸭）呼肠孤病毒σB-σC-LTB蛋白亚单位疫苗载体的构建及免疫保护的研究[D]. 杨志刚. 中国农业科学院, 2014(03)
- [7]抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估[D]. 胡瑞鸿. 东北农业大学, 2020(07)
- [8]禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗的制备和免疫效果的研究[D]. 黄梅清. 福建农林大学, 2006(12)
- [9]鸡病毒性关节炎病毒（AVAV）的分离与鉴定[J]. 唐雨德,周宗安,翟春生,王元伦,顾志香,胡拗根. 畜牧与兽医, 1994(04)
- [10]鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D]. 李爽. 华中农业大学, 2010(06)