一、禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白S_1基因的RFLP与序列比较分析（论文文献综述）
王露[1]（2020）在《2018-2019年广西IBV分离株S1基因序列分析及4株代表性IBV变异株的免疫原性研究》文中研究说明鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。IBV基因组极易发生变异,导致基因型、血清型、致病性和免疫原性多样化,不同基因型或血清型的毒株之间交叉保护效果不理想,生产上免疫失败时有发生,给养禽业带来较大经济损失。因此,及时了解掌握本地区IBV流行毒株的变异情况并筛选出具有良好免疫原性的毒株作为地方疫苗候选株,对IB防控具有很重要的现实意义。之前课题组完成了至2017年的广西IBV分离株的分子流行病学调查,以及对4株广西代表性IBV变异株致病性进行了研究,本研究在此基础上,继续对2018-2019年的广西IBV分离株进行跟踪研究,同时对此4株广西代表性IBV变异株的免疫原性进行研究,具体如下。一、2018-2019年广西IBV分离株S1基因序列分析应用鸡胚接种和RT-PCR技术对2018-2019年间广西疑似病鸡进行IBV的分离鉴定,并对分离株的S1基因进行扩增、测序以及相似性、进化树、重组、高变区、糖基化位点和S蛋白裂解位点分析。结果表明共分离鉴定到19个IBV分离株,此19株IBV的S1基因ORF为1611-1629 bp,编码537-543个氨基酸;分离株之间S1基因核苷酸相似性为66.2%-99.9%,分离株与疫苗株4/91、H120、QXL87、LDT3-A、LX4的S1基因核苷酸相似性分别为65.9%-78.9%、65.6%-83.2%、67.7%-96.0%、66.2%-99.1%、78.0%-99.1%。进化树分析表明,19株IBV分属于5个基因型:LX4型为优势基因型,占42.10%（8/19）,LDT3-A型占26.31%（5/19）,TaiwanⅡ型占15.78%（3/19）,TaiwanⅠ型占10.52%（2/19）,4/91型占5.26%（1/19）。重组分析表明,19株IBV中有5株出现基因重组,其中GX-NN190716、GX-NN190923、GX-NN191006和GX-GG190815四株重组株的主亲本均为GX-YL161022（QXⅡ型）株,次亲本均为CK/CH/LSC/99I株;GX-NN191213的主亲本为GX-GL（Taiwan型）株,次亲本为CK/CH/LSC/99I株。高变区分析结果表明,19株IBV三个高变区均发生了大量氨基酸的替换、插入和缺失。糖基化位点分析表明,19株IBV分别有9-18个N-糖基化位点;GX-YL191121株有2个O-糖基化位点,其余18株均无O-糖基化位点;S蛋白裂解位点分析表明,12株为RRFRR,6株为HRRRR,1株为HRRKR。二、4株代表性IBV变异株的免疫原性研究在本课题组前期研究基础上,对已进行了致病性试验的4株代表性广西IBV变异株GX-NN160421、GX-QZ170728、GX-QZ171023和GX-NN130048进行免疫原性和交叉免疫保护试验。将330只5日龄三黄鸡随机分为6组,分别为GX-NN160421组、GX-QZ170728组、GX-QZ171023组、GX-NN130048组、H120组和PBS组。GX-QZ171023组80只,其余各组50只。5日龄首免,19日龄（首免后两周）加强免疫。33日龄（加强免疫后两周）进行交叉攻毒。攻毒后5天宰杀部分试验组鸡,观察组饲养至47日龄（攻毒后14天）。以免疫后血清中的特异性抗体及中和抗体水平、外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞含量、攻毒鸡临床发病率和死亡率以及气管、肾脏、肺脏的病毒载量、咽拭子和肛拭子排毒情况作为判断交叉免疫保护力的指标。IBV特异性抗体及中和抗体检测结果表明,GX-NN130048株灭活油乳剂疫苗能诱导较高水平的体液免疫应答;CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分含量检测结果表明,GX-NN130048株免疫后能引起鸡只出现高水平的细胞免疫应答;病毒载量检测结果表明,各组平均病毒载量为:GX-NN160421组（27）GX-QZ170728组（27）GX-NN130048组（27）H120组（27）PBS组;发病率、死亡率统计结果表明GX-NN130048株的免疫保护效果最好;观察组咽拭子、肛拭子排毒量检测结果表明,各免疫观察组排毒至5dpi,非免疫观察组排毒至7dpi,且各免疫观察组鸡的咽拭子、肛拭子排毒量均远低于非免疫观察组,与非免疫观察组差异极显着（P（27）0.01）。综合各检测指标,分离株GX-NN130048能诱导较高水平的细胞免疫和体液免疫,且攻毒保护效果较好,可作为研制本地区IBV疫苗的候选毒株。综上所述,本研究结果表明2018-2019年广西地区IBV流行的基因型有LX4型、LDT3-A型、Taiwan型和4/91型,其中优势基因型是LX4型;分离株GX-NN130048免疫原性较好,可作为研制本地区IBV疫苗的候选毒株。
黄梦姣,张芸,薛春宜,曹永长[2]（2019）在《应对日益严峻的挑战:中国禽传染性支气管炎研究》文中研究表明自1937年禽传染性支气管炎病毒在美国被首次分离以来,该病毒的传播给世界养禽业带来了严重的经济损失。中国地域辽阔、气候多样,国内该病毒的流行情况十分复杂。本文就传染性支气管炎在国内的病原分离、分子流行病学、检测技术、疫苗及综合防控技术等方面的研究与实践进行总结。目前,该病毒在中国多种类型毒株并存,优势流行毒株为QX基因型毒株。除广泛使用的H120等Mass血清型疫苗外,4/91血清型疫苗和LDT3-A株疫苗也被逐步使用,多采用弱毒疫苗和灭活疫苗联合免疫的方法有效控制了其对养禽业造成的经济损失。
张琳婧[3]（2019）在《两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达》文中研究说明鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）感染引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。由于IBV基因组易发生变异和重组,IBV的基因型和血清型复杂多样,且不同血清型间交叉保护性效果不理想。新基因型甚至新血清型不断出现,给IBV的有效防控带来了巨大困难。本研究从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群分离鉴定出2株IBV,并对其全基因组进了测序分析以及克隆表达了S1基因。为进一步了解丰富国内IBV流行株的重组变异情况,潜在的免疫逃逸机制以及疫苗毒株筛选依据等积累了数据。1、两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定本研究首先从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群采集发病鸡脏器进行鸡胚接种病毒分离。5天后发现接种两个肾脏样品的鸡胚出现典型的卷曲侏儒胚。但其尿囊液不具有血凝现象,以尿囊液提取的RNA反转录的cDNA为模版。用IBV的S基因特异性引物进行了 PCR扩增鉴定,PCR扩增以及序列测序表明能从两个尿囊液样品中扩增出IBV的S基因特异性片段,同时将分离到的这两个毒株分别命名为IBV34以及IBV216。应用DNAStar分析软件的Clustal W将克隆到的IBV34以及IBV216毒株S1基因分别与Gen Bank中国内外IBV参考毒株的S1基因进行序列比较和同源性分析发现IBV34以及IBV216毒株均属于QX型IBV。IBV34以及IBV 216毒株的S1基因与QX型的LX4毒株同源性分别高达95.5%以及95.4%。值得注意的是,与IBV34毒株以及Gen Bank中其它国内外IBV的S1基因不同,IBV 216毒株的S1基因缺了 12个碱基。从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV 216毒株对进一步探究IBV免疫逃逸机制提供了材料。2、两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析为进一步分析从从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV 216毒株可能存在的变异以及重组现象。本研究利用21对引物,通过PCR扩增,TA克隆以及序列测序对分离株IBV34及IBV216的全基因组进行了解析。结果发现分离株IBV34以及IBV216全基因组全长分别为27647bp与27654bp（不包括5’端帽子和3’端polyA尾巴）。基因组结构符合IBV的基因组基本特征。IBV34以及IBV 216毒株的全基因组序列与QX型的YXI0毒株的全基因组序列同源性分别高达96.6%以及96.7%。重组事件分析进一步发现,IBV34毒株基因组中鉴定出2个重组事件。分别位于IBV 34基因组5567-8121片段、8672-11925片段。IBV216毒株基因组中同样鉴定出2个重组事件。分别位于5564-7886片段、8402-11923片段。重组来源分析显示IBV34和IBV216来源于QX型与TC07-2型基因型IBV重组。3、两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆为进一步探究这两株来自IBV免疫鸡群的IBV毒株的S1蛋白的抗原性。本研究将IBV34以及IBV 216毒株的S1基因分别克隆至线性化载体pGEX-6p-I和pcDNA3.1上。成功构建了 S1原核表达载体pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-1-IBV216-S1及真核表达载体 pcDNA3.1-IBV34-S1、pcDNA3.1-IBV216-SI。将重组子 pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-I-IBV216-S1分别转化至BL-21感受态中。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现GST-S1蛋白不仅可以以包涵体形式表达,而且还可以以可溶性形式表达。利用抗QX型IBV血清对真核表达载体pcDNA3.1-IBV34-S1以及pcDNA3.1-IBV216-S1的表达进行了验证。结果发现,所用的抗QX型IBV血清能很好的识别转染pcDNA3.1-IBV34-S1的LMH细胞。可见亮绿色荧光;而在转染pcDNA3.1-IBV216-S1的LMH细胞以及转染对照载体pcDNA3.1的DF-1细胞中未见亮绿色特异性荧光。这一结果提示IBV216毒株S1蛋白中缺失的4个氨基酸（62-65aa）可能影响S1蛋白的抗原性以及血清的免疫反应性。
周海生[4]（2017）在《2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究》文中提出传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要引起鸡群呼吸道与肾脏疾病,是影响养禽业重要的病毒性病原之一。虽然IBV疫苗广泛使用,但IB仍然频繁爆发,特别是以引起肾脏损伤的肾型IBV分离报道较多,给我国养禽业造成巨大的经济损失。由于IBV血清型众多,且各血清型间交叉保护作用较低,同时IBV很容易发生基因突变和同源重组,导致新基因型甚至新血清型不断出现,这给养禽业IB的防控带来巨大的困难。提示我们在防控IB中对病毒进行流行病学监测,并对新型病毒或变异株的流行病学特点进行分析,从而为制定IB有效的免疫防控策略提供重要的理论依据。目前IBV临床分型包括呼吸型、肾型、生殖道型和腺胃型等,其中肾型IBV是近年来我国主要的IB病变型。肾型IBV主要引起鸡肾脏肿大,尿酸盐沉积,进而引起鸡群死亡率增加。病毒S蛋白在IBV的血清学分型、基因分型、病毒组织嗜性及致病性中发挥了决定性的作用,而S蛋白中中和抗原位点、受体结合区域都是位于S1亚基上。因此,研究IBVS1蛋白与宿主之间相互作用,可以为病毒组织嗜性与致病性方面的机理提供一定参考。本研究主要内容包括以下4个部分。1、2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学分析2010～2016年间,本研究共从华东地区疑似IB发病鸡群分离到IBV 36株,其中从肉鸡分离毒株35株,从蛋鸡分离毒株1株。在所有分离株中,我们发现1例IB与H9亚型AIV混合感染。对36株IBV S1基因序列进行测定,发现S1基因长度存在4种:1620/540（28 株）、1617/539（4 株）、1611/537（3 株）及 1638/546（1 株）。S 蛋白裂解位点存在 5种:HRRRR（25 株）、RRFRR（6 株）、RRSRR（3 株）、RRLRR（1 株）及 HRRKR（1株）。序列比对显示本研究分离的36株IBV之间的S1基因核苷酸序列同源性在65.2%～99.9%,分离株与参考株之间S1基因核苷酸序列同源性在65.0%～99.9%。S1基因分型结果表明,36株IBV可划分为七个基因型:QX型（26株）、Mass型（3株）、4/91型（3 株）、tl/CH/LDT3/03 型（1 株）、TW-Ⅰ型（1 株）、TC07-2 型（1 株）和新发现的 New-Ⅰ型（1株）。结合GenBank中2001～2016年中国分离的396株IBV毒株S1基因序列,S1基因分型结果显示,2001～2016年间我国流行的432株IBV可以分为13个基因型,包括QX（321 株）、tl/CH/LDT3/03（25 株）、TW-I（20 株）、4/91（18 株）、Mass（18 株）、CK/CH/LSC/99I（7 株）、TC07-2（4 株）、TW-II（2 株）、Ck/CH/LDL/97I（1 株）、Arkansas（1株）、Vis S（1株）、及新鉴定的基因分支New-Ⅰ（8株）与New-Ⅱ（3株）。值得注意的是,属于美国相关基因分支的ck/CH/LSD/110712已在我国出现。重组分析显示,新出现的New-Ⅰ基因型IBV S1基因来源于4/91与tl/CH/LDT3/03型毒株之间的重组,基因分支New-Ⅱ病毒S1基因来源于tl/CH/LDT3/03型与QX型毒株重组。研究结果表明我国华东地区2001～2016年间流行的IBV基因型众多,基因重组导致IBV新的基因型或变异株出现。本研究为今后IBV疫苗的研发和IB的防控提供一些参考。2、2001～2016年间我国IBV基因组序列重组分析为了解我国IBV分离株基因组重组特点,特别是疫苗株基因参与IBV基因重组情况,本研究对分离株 CK/CH/2010/JT-1、CK/CH/2014/FJ14 及 CK/CH/2014/QL1403 全基因组序列进行测定,同时收集2001～2016年间分离于我国的55株全基因组序列,并与参考株进行了序列重组分析。序列分析显示分离株CK/CH/2010/JT-1与CK/CH/2014/QL1403基因组中共鉴定出4个重组事件,分别位于CK/CH/2010/JT-1基因组24709-365、17160-19811、21136-21770片段及CK/CH/2014/QL1403基因组20395-24840片段。进一步对基因组序列重组来源分析显示 CK/CH/2010/JT-1 来源于 QX、CK/CH/LSC/99I、tl/CH/LDT3/03 及 4/91基因型IBV重组,CK/CH/2014/QL1403来源于QX与TC07-2型毒株重组,而CK/CH/2014/FJ14是一株典型的QX型IBV。应用RDP4对我国2001～2016年间分离的55株IBV基因组序列进行重组分析,结果显示我国2001～2016年间流行的55株IBV中有52株IBV基因组存在重组事件,其中25个IBV分离株基因组中发现有疫苗型（Mass,tl/CH/LDT3/03及4/91型等）病毒基因组片段的重组,这一结果在SimPlot分析中进一步得到确认。根据生物信息学分析结果,证明流行于我国的IBV基因组序列存在许多基因重组事件,而且疫苗毒株基因频繁参与了 IBV基因重组,导致IBV新的基因型或变异株出现,提示在防控IB时注意合理使用IBV疫苗。3、我国IBV分离株致病性分析及交叉保护研究为了探究分离株 CK/CH/2010/JT-1、CK/CH/2014/FJ14 及 CK/CH/2014/QL1403 致病特点及不同毒株间抗原关系,本研究对分离株进行动物攻毒、交叉中和及交叉保护实验。动物攻毒实验结果显示CK/CH/2010/JT-1与CK/CH/2014/FJ14可引起雏鸡严重的呼吸道症状、肾脏病变及高死亡率（43.75%与50%）,而CK/CH/2014/QL1403不引起雏鸡产生明显的临床症状与病理变化。中和实验结果表明现有抗H120与4/91疫苗株鸡多抗血清不能有效中和 IBV 分离株 CK/CH/2010/JT-1 与 CK/CH/2014/FJ14,而抗 QX 型毒株 CK/CH/2014/FJ14鸡多抗血清能够有效中和TC07-2型IBV CK/CH/2014/QL1403。交叉保护实验结果表明CK/CH/2014/QL1403免疫雏鸡后能为鸡群提供有效保护来抵抗QX型毒株CK/CH/2014/FJ14 攻击。本研究结果显示 CK/CH/2010/JT-1 与 CK/CH/2014/FJ14 属于 IBV强毒株,且目前常用H120与4/91疫苗株不能有效防控该毒株,而CK/CH/2014/QL1403是一株天然弱毒株,而且可以作为疫苗候选株来防控QX型IBV。4、IBV S1蛋白的天然免疫应答研究为了探究IBV S1蛋白引起鸡胚肾细胞（Chickenembryokidneycell,CEKC）天然免疫应答反应,特别是肾型与呼吸型毒株S1蛋白引起CEKC天然免疫应答差异,本研究成功构建了肾型毒株CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14与呼吸型IBVM41株S1基因真核表达载体,通过转染CEKC研究其在细胞中的天然免疫应答。结果表明IBV S1基因在CEKC中成功获得了瞬时表达,而且S1蛋白主要表达于细胞浆中。在mRNA水平上,转染后12 h,IBV 肾型毒株 CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 S1 蛋白引起 TLR3、MDA5 的表达明显高于呼吸型M41;转染后24h,肾型毒株CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 S1蛋白引起TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6的表达显着高于呼吸型M41。在蛋白水平上,S1蛋白在 CEKC 中瞬时表达后 24h,肾型毒株 CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 引起 TLR3、IFN-β及IL-6的表达显着高于经典株M41。重组质粒转染CEKC 24 h时,使用配体poly（I:C）和LPS刺激后,IBV不同致病性毒株S1蛋白引起肾细胞天然免疫没有产生进一步放大作用。本研究结果表明肾型与呼吸型毒株S1蛋白引起CEKC天然免疫应答中TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6的表达存在差异,暗示IBV对肾脏致病性差异可能与毒株S1蛋白引起肾细胞天然免疫中TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6表达差异相关。
李孟[5]（2013）在《广西鸡IBV分子流行病学及泛素介导的病毒主要抗原基因免疫应答的研究》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎（infectiousbronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（avianinfectious bronchitis virus,IBV）引发的一种鸡的传染性疾病。IBV主要侵害鸡的呼吸道、肠道、输卵管及肾脏,可引起相应组织的上皮细胞病变和损伤,而且更重要的是容易因此而引起细菌及其它病原的继发感染,引起更大的损失,是造成目前生产上最普遍而且危害最大的鸡呼吸道综合症的重要病因之一。由于IBV在鸡群中感染的广泛性和普遍性,以及IBVRNA聚合酶有着特殊的校对机制和间歇性的复制过程,使得IBV基因组极易发生碱基的缺失、插入、点突变及不同来源的病毒基因之间发生重组。这样的结果是IB病毒的血清型、基因型和致病性等生物学特性极易发生变异,造成IB临床表现复杂及血清型众多,而各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用,从而给本病的免疫防控带来很大的困难。虽然我们在实际生产中使用IB疫苗对鸡群进行多次免疫,但是该病在广西仍不断发生并对养禽场造成了不小的损失。为了全面了解IB在广西家禽中的感染和流行情况,探明IBV主要流行株的类型及其地域分布;从基因水平上寻找IBV的传播、流行和危害的分子机制;同时建立泛素介导的IBV DNA多价疫苗构建技术平台,为高效安全的新型疫苗的研发提供技术平台和理论依据,彻底解决目前因疫苗所用毒株血清型与本地的存在差异而造成免疫效果不佳的难题,开展了本课题的研究。主要研究内容及结果如下:1、1985年-2012年广西IBV分子流行病学研究本研究对课题组1985-2012年间从广西主要养殖地区分离到的60株IBV,应用RT-PCR方法扩增其纤突蛋白（S1）、膜蛋白（M）、核蛋白（N）和3’UTR基因并进行了序列的测定、分析和比较,同时还构建它们的系统进化树,分析了 60株广西IBV分离毒株之间及与参考毒株之间的关系。结果表明,与我国常用IBV疫苗毒株及国外IBV毒株相比,广西大部分IBV分离毒株在这些结构基因的核苷酸及推导氨基酸序列存在广泛的基因突变、缺失或插入现象,广西IBV分离株具有多个基因进化群而且与常用疫苗株亲缘关系较远,这可能是造成广西IBV分离毒株基因组发生变异以及常用疫苗效果不佳的主要原因之一。从S1、N和M基因的进化关系上分析的结果显示广西IBV基因的遗传变异正处在一个不断演化的过程当中,其特征是同一时间段内分离到的病毒之间的核苷酸有较高的同源性,不同地域毒株之间无差异或存在的差异性较小;3’UTR基因研究结果表明大部分毒株之间亲缘较近,少部分毒株与参考株相比较存在不同程度的基因缺失。从进化树的分群关系我们发现,GX-NN1和GX-NN2存在明显的野毒株与疫苗株重组现象、GX-NN09093则可能是由疫苗株H120通过点突变演化而来。同时,对57株分离病毒和3株参考毒株进行了血清分型研究的结果显示,广西存在有7种不同血清型而且大部分的分离毒株血清型与疫苗株血清型不同,不同时期流行的优势血清型也不同,这也可能是导致目前所用疫苗免疫不佳的另外一个原因。此外,课题还对基因分型与血清分型之间的关系进行了探讨。2、鸡IBV广西不同时期分离株GX-C和GX-NN09032的全基因组序列测定及其生物信息学分析根据前面研究的结果,本研究选取不同时期广西IBV代表分离毒株GX-C和GX-NN09032.进行全基因组序列的测定。以GenBank公布的IBV全基因组序列作为参考进行引物设计和合成。在序列5’端和3’端RACE中使用商品化试剂盒,得到了两个分离毒株序列的5’端和3’端全长序列。测序结果表明GX-C基因组全长为27 701 bp,GX-NN09032基因组全长为27684bp。通过对这两个毒株全基因组的基因注释及各部分的同源性分析、全基因组序列与参考毒株的系统发育树构建、各个结构蛋白基因系统发育树构建等生物信息学分析,结果表明GX-C和GX-NN09032全基因组在核苷酸序列水平上分别与H120和GX-YL5的亲缘关系最近;各结构蛋白基因系统发育分析结果显示,两个分离毒株与参考株之间存在着不同程度的基因重组现象;进一步的分析还发现,GX-NN09032在S和3’ UTR基因分别存在明显基因重组和缺失现象。3、泛素介导鸡IBV主要抗原基因免疫应答的研究本研究应用基因重组技术,以pVAX1为载体将鸡的泛素（ubiquitin,Ub）基因与广西主要流行毒株GX-YL5的S1、N基因通过引入一段编码（G4S）3多肽的碱基linker进行连接,然后分别插入其多克隆位点,构建四个重组质粒pVAX1-N、pVAX1-Ub-linker-N、pVAX1-Ub-linker-N-S1及pVAX1-N-S1。经RT-PCR及间接免疫荧光技术确定目的基因及其蛋白在Vero细胞中的转录及表达情况。在动物免疫保护试验中,利用酶联免疫吸附试验、qPCR及流式细胞技术对不同试验组鸡的各项免疫指标进行了检测,最后应用攻毒试验进一步确定其免疫保护效果。RT-PCR检测的结果表明,转染了构建的重组表达质粒的Vero细胞中均能扩增出特异的N基因片段,表明四个质粒在细胞内分别转录出了目的基因的mRNA;间接免疫荧光检测结果表明,转染了四个质粒的Vero细胞均显示出特异性的绿色荧光,表明构建的重组表达质粒的均能在Vero细胞中表达出目的蛋白而且具有免疫原性;动物免疫试验结果表明,构建的重组表达质粒和商品疫苗H120免疫组各个日龄的免疫指标都高于空质粒对照组,其中泛素介导的重组表达质粒免疫组的外周血液中CD4+和CD8+T淋巴细胞数量、抗IBV特异性抗体水平以及免疫器官中IL-12和IFN-γmRNA的表达量,均有显着提高（P<0.05）,而以pVAX1-Ub-linker-N-S1免疫组最为明显。攻毒试验的结果表明不同免疫组的免疫保护率存在差异,细胞免疫应答水平高的免疫组保护率较高。结论:本研究的结果表明广西地区的IBV基因正在进行不断的演化和变异,加之已有的IB血清分型的结果我们可确定广西IB疫苗候选株。不同时期分离毒株的全基因组测序及分析发现IB毒株的进化与该时期毒株流行因素有关。通过对泛素与IBV抗原基因融合表达质粒的构建及其免疫应答的研究,建立了泛素介导的IBVDNA多价疫苗构建技术平台,为高效安全的新型疫苗的研发提供技术平台和理论依据。
刘文杰[6]（2011）在《鸡传染性支气管炎病毒河南地方株分离鉴定及HN104株与HN091株全基因组序列测定》文中研究指明鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。主要引起鸡支气管、气管、肾脏、输卵管、腺胃、肠道等病变,在饲养环境差的情况下,易引起大肠杆菌、支原体等继发感染而提高鸡群的发病死亡率,导致产蛋鸡的生产性能降低。单一疫苗免疫很容易失败,给世界养禽业带来巨大损失。为此,掌握河南省养鸡业中IBV流行变异株的分子特征有利于IB的检测防控工作。本试验鉴定了20082010年自河南开封、新密、许昌、新郑、荥阳等市县分离的7株IBV毒株,代号分别为HN081、HN082、HN091、HN092、HN101、HN102和HN104。将分离株进行910日龄SPF鸡胚尿囊腔接种后收集尿囊液进行常规细菌、血凝试验检测阴性后、用RT-PCR方法扩增IBV Sl与N基因。对分离株HN104尿囊液用新配制l%胰酶处理尿囊液后血凝滴度为28,EID50为10-5.5/0.1ml,对NDV在鸡胚增值产生干扰作用,动物回归试验显示:HN104株可致SPF雏鸡出现呼吸道和“花斑肾”症状。通过对4株河南分离株进行S1基因的序列测定,核苷酸同源性在77.496.9%,与39株参考IBV同源性为76100%,并且构建进化树,分离株HN104与HN082为基因I型属于近10多年优势流行致肾病变LX4基因型;HN091为基因III型属于台湾独特TW2296/95型基因型毒株;HN092为基因II型与疫苗株型M41核苷酸同源性高为99%,可能是免疫压力下变异的疫苗株。除HN092外的其它3株分离毒与美国Mass型疫苗株、澳大利亚T株、欧洲4/91株亲缘关系远低于78%。对N基因进化树分析6株分离株中5株属LX4基因型。通过对2009年分离的HN091株和2010年分离的HN104株进行全基因组序列测定和分析,其基因组全长序列和各个基因均表现出与国内分离株较高的相似性。HN091与HN104分离株与已报道的12株全基因代表性毒株的各基因同源性比较分析,发现全基因组中最保守的是非结构基因5b,变异最大是非结构基因3b;5’UTR与病毒起始复制起重要作用非常保守同源性92.099.8%。3’UTR变异大同源性59.199.5%,3’UTR缺失的大片段可能有利于病毒复制与发转录。HN091分离株是一自然重组株,其S1基因重组于台湾独特基因型TW2575/98型毒株,3a、3b基因重组与广西GX-YL5型毒株,HN091全基因主体于另一河南分离株HN104型毒株同源性高,推断是不同毒株基因重组或点突变的结果。HN104株全基因与2007年四川德阳分离株DY07同源性高达95%;通过对HN104的每个基因与5’UTR与3’UTR进行BLAST检索及系统进化树分析表明HN104株是DY07遗传演化的结果。河南是养禽业大省,地处中原交通便利,也为IB的传播流行提供了前提条件。研究表明,河南省鸡群中IBV存在多种基因型变异病毒,本次试验分离出大多是中国最流行LX4基因型毒株。河南分离株HN104与HN091全基因扩增为进一步研究IBV变异分子机制及为IBV反向遗传操作构建奠定了基础。
刘巍[7]（2011）在《鸡传染性支气管炎病毒0801株的分离鉴定及S1基因序列分析》文中认为鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis, IB）是由冠状病毒科（Coronaviridae）传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起的一种急性高度接触性传染病。该病主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统和泌尿生殖系统,可以引起雏鸡死亡,蛋鸡产蛋量及蛋品质下降,给养禽业造成巨大的经济损失。IBV突出的特点是血清型众多,且新的血清型和变异株不断出现,给本病的防治带来很大困难,免疫失败现象时有发生,所以从现地分离株中筛选疫苗株对控制IB非常重要。IBV的基因组为不分节段的单股正链RNA,编码三种主要结构蛋白（纤突蛋白S,膜蛋白M和核衣壳蛋白N）及其它蛋白。IBV的S蛋白可以裂解成S1和S2两个亚单位。S1是重要的免疫原蛋白,能诱导产生中和抗体和血凝抑制抗体,并且与病毒的组织嗜性有关。S1基因的点突变、插入、缺失或者重组是IBV产生新血清型,亚型和变异株的主要原因,对于S1基因的变异与病毒的抗原性的改变之间是否存在一致性尚不清楚。故对S1基因深入研究具有重要意义。从分子水平研究S1基因的分子结构和遗传进化特点,可以为IB的防控提供可靠的理论依据。2008年1月,河北沧州某产蛋鸡场鸡群出现以呼吸道症状为主的疾病症候,并迅速波及全群,少数几只出现死亡,死亡率约0.5%。剖检发现鸡只肾脏肿大,有尿酸盐沉积,呈“花斑肾”样,其它脏器器官未见明显病变。已知该鸡群曾按正常程序进行接种过IBV H120疫苗。本试验收集患病鸡只肾脏、气管等组织,进行病毒分离培养。通过新城疫病毒干扰试验、致鸡胚矮小化试验、血凝特性试验、动物回归试验以及分子生物学试验等证实分离到的0801株为一株传染性支气管炎病毒。交叉中和实验结果显示,0801株与Ma5、W93、H120、M41、H52株的关系系数R分别为80.7%、67.7%、73.3%、54.0%、70.8%。依据判定标准（R>80%,两毒株为同一亚型;25%<R<80%,两毒株为同一血清型的不同亚型;R<25%,两毒株为不同的血清型）,判定0801株与疫苗株Ma5、W93、H120、M41、H52株均为同一血清型,其中与疫苗株Ma5株为同一血清型的同一亚型。本研究中对0801株S1基因进行了序列测定,并与国内外已发表参考株S1基因进行了比较分析,结果表明,0801株与当前普遍应用的Massachusetts型疫苗株H120、H52、Ma5、M41及国内疫苗株W93株核苷酸同源性约为75%,推导氨基酸序列对比结果显示同源性亦约为75%,同时与Genbank注册的Arkansas、Conn、Gray、793/B等血清型同源性差异亦在20%以上。而Genbank BLAST对比结果显示0801株S1基因与国内分离株LC2、WF株S1基因同源性最高,其核苷酸同源性高达99%,氨基酸同源性亦接近99%。序列分析结果显示0801株S蛋白裂解位点序列为RRFRR,符合传支毒株裂解位点序列。
曲新泽[8]（2010）在《传染性支气管炎病毒的基因分型及S1基因和N基因遗传多样性分析》文中提出鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis virus,IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道病,主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。以临床症状复杂、病理变化多、血清型多和容易发生变异等为特征,是一种生产意义巨大、影响广泛的传染性疫病。IBV目前有20多个血清型,不同血清型之间缺乏交叉保护,但中和试验十分繁琐,从而给本病的诊断和防治带来困难。分子克隆测序是进行IBV分子病原研究的重要手段,通过生物信息学比较,可以快速了解IBV不同病毒之间、不同基因的演化趋势。本论文结合1992-2008年间从山东乃至全国分离鉴定的IBV毒株,在进行抗原性和致病性研究的基础上,对17株IBV毒株分别进行了S1基因和N基因的克隆测序。选取GenBank中具有代表意义的50多株参考株（含疫苗株）,结合我们所测定的序列,分别进行核苷酸和氨基酸同源比较,进而分析探讨IBV S1和N基因之间遗传变异的相关性及其全长与片段遗传变异的相关性。结果表明:S1基因和N基因之间的遗传变异均具有多样性。与常规疫苗株和国外参考株相比,无论是核苷酸还是氨基酸均发生了较大的变异。以S1基因为例,17株IBV流行株仅有一株与疫苗株（H120）同源,比例较低（占5.88%）;与H120的nt/aa同源性均低于80%。不同IBV毒株S1基因片段与其全长之间遗传变异高度相关（r=0.963）;N基因呈现出与S1基因同样的规律性（r=0.976）!不同IBV毒株S1基因和N基因全长之间遗传变异高度相关（r=0.645）,显示出S1基因和N基因之间的遗传变异既具有同步性,又具有一定的独立性!此外,IBV流行株与疫苗株的遗传距离,无论在S1基因还是N基因,愈来愈远,彰显出IBV流行株在H120的免疫压力下,已经发生了较大程度的变异。根据IBV流行株S1基因和N基因的核苷酸同源性,按病毒发生的年代和地域以及致病性,初步将S1基因和N基因分为6种基因型。比较发现:S1或N基因的分型结果十分相似。对同时具有S1和N基因的40株IBV毒株的分型结果比较显示:符合率75%（30/40）,而差异仅25%（10/40）,其分型差异最明显的是从2000年以来的IBV分离株,13株中有6株分型结果不一致,符合率仅仅53.8%,显示出S基因和N基因的遗传变异的多样性和复杂性,同时发现部分IBV毒株间可能存在重组。
孙宁[9]（2009）在《鸡传染性支气管炎病毒（793/B）M基因与截短M基因的克隆测序、原核表达及鉴定》文中提出鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性高度接触性传染病。自30年代在美国爆发以来,现已成为世界各地流行的重要禽病。IBV是单股RNA病毒,该病毒基因可因点突变和重组而发生变异,故传染性支气管炎病毒血清型较多。已知的血清型有以侵害呼吸道为主的Conn、Iowa97、JMK、Florida、Arkansas99等和以侵害肾脏为主的M41、Holte、Gray、Australia“T”等30余种。Gough等（1992）报道了英国一种新的793/B血清型的IBV,该毒株和其它血清型传支毒株之间无交叉血清学关系;其免疫原基因S1的序列与欧洲17个传支毒株之间差异高达21～25%。目前,该血清型IBV在西班牙、德国、荷兰、意大利、泰国等国均有发生和流行,对养鸡业危害较大。2003年刁有祥、杨杰华等从山东省某蛋鸡饲养场产蛋异常下降鸡群中分离到一株793/B传染性支气管炎毒株,命名为TA03株。在此基础上,于申业等建立了鸡传染性支气管炎病毒（IBV）793/B RT-PCR检测方法及IBV（793/B）TA03株S1基因的克隆与表达;孟凡磊等对IBV（793/B）TA03株N基因进行了序列分析及地高辛标记探针、双重RT-PCR检测方法的建立与应用。根据GenBank已发表的传染性支气管炎病毒（IBV）全基因组序列设计引物,对793/B型IBV分离毒株TA03 M基因进行克隆与序列分析。结果表明,793/B型IBV的M基因由669bp组成,与GenBank已发表的15株IBV的M基因相比较,793/B型IBV的M基因在第4～15位发生了3～12个核苷酸的缺失,对应1～4个氨基酸的缺失,共有30多处点突变。与其它各毒株M基因的核苷酸同源性为84.2%～93.6%,氨基酸同源性为82.1%～96.0%;进化分析显示TA03株与H52和IBN毒株之间的亲缘关系较近。该研究为进一步探讨793/B型IBV M基因（蛋白）在遗传变异和免疫等方面的作用奠定了理论基础。应用生物信息学技术推测鸡传染性支气管炎病毒（IBV）变异株（793/B）M基因的抗原位点,应用DNAStar软件针对M基因及其抗原表位片段设计3对引物,PCR扩增并成功构建了M基因的pGEX6p-M和2种截短M基因的pGEX6p-M1、pGEX6p-M2原核表达质粒,SDS-PAGE检测分别在50 kDa、32 kDa和29 kDa处有特异性表达条带,表明GST-M、GST-M1和GST-M2重组蛋白获得成功表达;Western blot检测显示GST-M和GST-M1重组蛋白能被鼠抗IBV（793/B）血清识别,而GST-M2重组蛋白不能被识别。试验结果表明GST-M与GST-M1重组蛋白具有良好的抗原性,初步证实了M蛋白抗原表位的存在,为进一步研究IBV（793/B）M蛋白的免疫原性和制备基因工程疫苗提供了重要依据。
路希山[10]（2009）在《2006-2008年山东鸡传染性支气管炎病毒分离株S1与N基因的分子特征》文中认为鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由冠状病毒科、冠状病毒属的传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV主要侵害雏鸡的呼吸道、生殖系统及肾脏,引起产蛋鸡的产蛋量和蛋的品质下降,导致鸡的生产性能降低。最初认为IB主要是幼鸡的一种疾病,但后来发现该病在育成鸡和产蛋鸡群中也普遍存在。IB可引起鸡的增重和饲料报酬降低,参与混合感染引起气囊炎使肉鸡在加工过程中被淘汰,引起产蛋鸡的产蛋率和蛋品质量下降,该病的高度传染性和传染性支气管炎病毒众多的血清型,使免疫预防复杂化并增加了防控成本。因此具有重要的经济意义。IBV粒子含有纤突糖蛋白（S）、膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）3种主要结构蛋白。S蛋白由S1和S2两种糖蛋白组成,血凝抑制（HI）抗体和大部分病毒中和（VN）抗体由S1诱导产生。本研究从我省6个地市分离或收集到2006-2008年间的16株IBV病毒,并对其生物学特性进行了研究,以说明我省IBV毒株之间以及与参考毒株之间基因的遗传变异情况及系统进化关系,同时阐明我省IBV的基因型,探讨我省IB流行的背景和原因。疑似IB病鸡病变组织处理后接种9-11日龄SPF鸡胚,接种鸡胚后72h内收集尿囊液,同时观察胚体病变。传2-5代后,发现死亡鸡胚表现出生长发育障碍（侏儒胚）,胚体弥漫性出血,尤其是头部出血比较明显,未死亡鸡胚呈现典型的卷曲胚。病毒尿囊液对鸡外周血红细胞无凝集活性。病毒尿囊液在电镜下表现为病毒粒子大多呈球形,直径约为80-120nm,有囊膜,表面有松散、均匀排列的冠状突起,呈现典型的冠状病毒特征,而且未发现有其它病毒粒子的存在。所以可初步断定本研究所分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。本研究应用RT-PCR方法扩增到了我省2006-2008年6个地市的16株IBV现地分离株的S1基因和N基因,并将其进行了克隆、序列测定及分析,同时构建了系统进化树,分析了我省IBV分离株与参考毒株之间的系统进化关系。对此16株病毒的S1基因序列利用限制性内切酶HaeⅢ进行了限制性片段长度多态性（RFLP）分析,可以将IBV毒株分为三种不同的基因型。其中13个毒株与LX4毒株有相同的RFLP分型,两株病毒属于Mass基因型,一个毒株有特异的RFLP分型。通过S1基因系统进化树分析发现,本实验中所分离的13株IBV毒株与分布于同一群内的国内IB分离株LX4具有较高的同源性（94.5%—99.7%）,并且此群毒株间的S1基因推导氨基酸序列具有较高的同源性（≥93%）,亲缘关系较近,而与我国目前用于IB预防的主要活疫苗H120疫苗株属于不同的基因型且氨基酸序列同源性较低,这可能是导致IB疫苗免疫失败或只能产生部分免疫保护作用,以致IB在鸡群中不断发生的主要原因之一。结合S1及N基因系统进化树分析可知:在N基因系统进化树分析中,毒株SDTA06111和SDJY0701与毒株LX4属于同一进化群,并且此三个毒株具有较高的氨基酸同源性,然而经过S1基因系统进化树分析得知,毒株SDTA06111和SDJY0701与毒株LX4属于不同的基因进化群;同时毒株SDWF0608在N基因和S1基因分析中也归为不同的基因群。此外还发现,毒株SDYT0605与疫苗株H120的N基因和S1基因的同源性都很高。以上分析表明毒株SDYT0605可能是在IB疫苗免疫选择压力下所产生的变异毒株,毒株SDTA06111、SDJY0701和毒株SDWF0608可能发生了基因重组。同时,以疫苗株H120作为参考毒株,分析发现,16株IBV分离株在S1蛋白基因内含有较多插入和缺失现象,N基因及其局部功能区序列存在广泛的氨基酸替代现象。以上分析结果表明,我省IBV分离株存在较为广泛的基因突变、插入和缺失,同时,IBV毒株间的基因重组也可能是我省IBV变异株产生的另一主要原因。
二、禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白S_1基因的RFLP与序列比较分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白S_1基因的RFLP与序列比较分析（论文提纲范文）
（1）2018-2019年广西IBV分离株S1基因序列分析及4株代表性IBV变异株的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒病原学研究概况 |
| 1.1.1 IBV的生物学分类 |
| 1.1.2 IBV的生物学特性 |
| 1.1.3 IBV基因组结构 |
| 1.1.4 IBV的结构蛋白及其功能 |
| 1.2 IBV的流行情况 |
| 1.2.1 IBV在中国的流行情况 |
| 1.2.2 IBV在世界各国的流行情况 |
| 1.2.3 IBV广泛流行的原因 |
| 1.3 IBV的基因分型研究概况 |
| 1.3.1 IBV的基因分型的方法 |
| 1.3.2 IBV基因分型研究进展 |
| 1.4 IBV的基因分型和血清分型相关性研究概况 |
| 1.4.1 国内研究概况 |
| 1.4.2 国外研究概况 |
| 1.5 IBV的免疫原性研究概况 |
| 1.5.1 国内研究概况 |
| 1.5.2 国外研究概况 |
| 1.6 本课题研究的目的与意义 |
| 第二章 2018-2019年广西地区IBV的分离鉴定和S1基因序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂和试验仪器 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试验鸡胚 |
| 2.1.4 病料来源 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒增殖 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 RT-PCR扩增 |
| 2.2.4 RT-PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.5 纯化产物的连接 |
| 2.2.6 重组质粒的转化、鉴定及序列测定 |
| 2.2.7 序列的分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 病毒的分离鉴定结果 |
| 2.3.2 各分离株序列测定结果 |
| 2.3.3 相似性分析结果 |
| 2.3.4 进化树分析结果 |
| 2.3.5 重组分析结果 |
| 2.3.6 高变区分析结果 |
| 2.3.7 糖基化位点分析结果 |
| 2.3.8 S蛋白质裂解位点分析结果 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 4株广西代表性IBV变异株的免疫原性试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂及试验仪器 |
| 3.1.2 毒株来源 |
| 3.1.3 试验鸡和鸡胚 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 毒株增殖 |
| 3.2.2 各毒株TOC-ID50的测定 |
| 3.2.3 灭活油乳剂疫苗(OEV)的制备 |
| 3.2.4 动物免疫和攻毒试验 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 各毒株TOC-ID50的测定结果 |
| 3.3.2 免疫后鸡血清中IgG抗体水平 |
| 3.3.3 免疫后鸡血清中和抗体水平 |
| 3.3.4 免疫后鸡外周血中特异性T淋巴细胞百分含量 |
| 3.3.5 攻毒后5天各组鸡气管、肾脏、肺脏的病毒载量 |
| 3.3.6 各组鸡发病率和死亡率 |
| 3.3.7 各观察组鸡只攻毒后的排毒情况 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（2）应对日益严峻的挑战:中国禽传染性支气管炎研究（论文提纲范文）
| 1 禽传染性支气管炎病毒 |
| 2 中国IBV毒株分离与鉴定 |
| 3 IBV分子流行病学研究 |
| 4 IBV检测技术研究 |
| 5 IBV疫苗开发 |
| 6 IBV免疫程序研究 |
| 7 IBV综合防控措施 |
| 8 结语 |
（3）两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 第一节 鸡传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒概况 |
| 1.2 IBV病毒的形态结构与理化特性 |
| 1.3 IBV的流行病学 |
| 1.4 IBV的致病性 |
| 1.5 IBV主要蛋白及其功能 |
| 1.5.1 S蛋白 |
| 1.5.2 M蛋白 |
| 1.5.3 N蛋白 |
| 1.5.4 E蛋白 |
| 1.5.5 非结构蛋白 |
| 1.6 IBV的变异与重组 |
| 1.7 IBV分型 |
| 1.8 IBV的免疫防控 |
| 1.8.1 弱毒疫苗 |
| 1.8.2 灭活疫苗 |
| 1.8.3 核酸疫苗 |
| 第二节 研究目的及意义 |
| 研究内容一 两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的繁殖 |
| 2.2 引物的设计 |
| 2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.4 cDNA的制备 |
| 2.5 目的片段的扩增 |
| 2.6 PCR纯化产物的连接和转化 |
| 2.7 连接反应产物转化涂板 |
| 2.8 菌落PCR鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 病毒鸡胚接种结果 |
| 3.2 两株IBV病毒与20株IBV参考毒株S1基因序列比较 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的增殖 |
| 2.2 引物的设计 |
| 2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.4 cDNA的制备 |
| 2.5 目的片段的扩增 |
| 2.6 PCR纯化产物的连接和转化 |
| 2.7 连接反应产物转化涂板 |
| 2.8 全基因组测序分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV34与IBV216两株病毒各个基因片段扩增结果 |
| 3.2 IBV34和IBV216毒株全基因组结构 |
| 3.3 分离株IBV 34基因组的同源重组分析 |
| 3.4 分离株IBV216基因组的同源重组分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 RNA的提取 |
| 2.3 cDNA的制备 |
| 2.4 目的片段的扩增 |
| 2.5 RT-PCR产物的胶回收 |
| 2.6 重组质粒的构建 |
| 2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.8 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 两株IBV病毒S1基因片段的扩增及重组子构建 |
| 3.2 重组蛋白GST-S1表达的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.3 重组蛋白GST-S1表达的Western-blot鉴定 |
| 3.4 间接免疫荧光鉴定S1蛋白真核表达 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英对照缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现、命名与分类 |
| 1.2 生物学特性 |
| 1.3 基因组结构与主要功能蛋白 |
| 1.4 生活周期 |
| 1.5 致病机理 |
| 1.6 毒株分型 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 自然宿主 |
| 2.2 实验室宿主 |
| 2.3 传播方式 |
| 3 临床症状及病理变化 |
| 3.1 呼吸道 |
| 3.2 肾脏 |
| 3.3 生殖道 |
| 3.4 消化道 |
| 3.5 其它 |
| 4 诊断 |
| 4.1 病原的分离鉴定 |
| 4.2 血清学诊断技术 |
| 4.3 分子生物学检测技术 |
| 5 防治 |
| 5.1 免疫预防 |
| 5.2 治疗 |
| 综述二 传染性支管炎病毒在世界范围内流行现状 |
| 1 亚洲国家IBV流行现状 |
| 2 欧洲国家IBV流行现状 |
| 3 非洲国家IBV流行现状 |
| 4 北美洲国家IBV流行现状 |
| 5 南美洲国家IBV流行现状 |
| 6 大洋洲国家IBV流行现状 |
| 综述三 禽冠状病毒纤突蛋白研究进展 |
| 1 禽冠状病毒S蛋白概述 |
| 1.1 结构特点 |
| 1.2 序列多样性 |
| 1.3 其它禽类冠状病毒S蛋白 |
| 2 禽冠状病毒S蛋白功能 |
| 2.1 组织吸附中的作用 |
| 2.2 细胞亲和性中的作用 |
| 2.3 体内组织嗜性与致病性中的作用 |
| 3 病毒吸附中宿主影响因素 |
| 3.1 唾液酸 |
| 3.2 蛋白受体 |
| 3.3 凝集素 |
| 3.4 硫酸肝素 |
| 3.5 宿主蛋白酶 |
| 4 禽冠状病毒S蛋白引起宿主天然免疫反应 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 2001～2016年间华东地区传染性支气管炎病毒分子流行病学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 病毒增殖 |
| 2.3 病毒总RNA提取 |
| 2.4 S1基因扩增与序列测定 |
| 2.5 S1基因序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒分离结果 |
| 3.2 分离株S1蛋白长度与裂解位点的多样性 |
| 3.3 分离株S1基因分型的多样性 |
| 3.4 新分支New-Ⅰ与New-Ⅱ基因型IBV S1基因的来源 |
| 4 讨论 |
| 第二章 2001～2016年间我国传染性支气管炎病毒基因组序列重组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 分离株全序列扩增引物设计 |
| 2.2 分离株全基因组序列RT-PCR |
| 2.3 病毒基因组5'与3'端序列扩增 |
| 2.4 分离株基因组序列测定与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离株基因组结构 |
| 3.2 分离株CK/CH/2010/JT-1基因组的重组来源 |
| 3.3 分离株CK/CH/2014/QL1403基因组的重组来源 |
| 3.4 我国2001～2016年间IBV基因组重组现象普遍 |
| 4 讨论 |
| 第三章 我国鸡传染性支气管炎病毒分离株致病性分析及交叉保护研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒扩增 |
| 2.2 SPF鸡致病性实验 |
| 2.3 病毒中和实验 |
| 2.4 交叉保护实验 |
| 2.5 鸡IBV血清抗体ELISA |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV分离株致病性 |
| 3.2 交叉中和实验结果 |
| 3.3 天然弱毒CK/CH/2014/QL1403对QX型IBV交叉保护实验 |
| 4 讨论 |
| 第四章 传染性支气管炎病毒S1蛋白的天然免疫应答研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 真核表达载体的构建 |
| 2.3 CEKC的制备 |
| 2.4 CEKC的质粒转染 |
| 2.5 共聚焦显微镜荧光分析 |
| 2.6 Western-blot |
| 2.7 荧光定量PCR方法检测相关因子 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 S1基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒转染CEKC后S1蛋白的表达 |
| 3.4 IBV S1蛋白引起CEKC天然免疫相关因子表达差异 |
| 3.5 配体刺激后IBV S1蛋白引起CEKC天然免疫相关因子表达差异 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间所获成果 |
（5）广西鸡IBV分子流行病学及泛素介导的病毒主要抗原基因免疫应答的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 IBV的流行变异及其防控 |
| 1.2.1 IBV的分类及组成 |
| 1.2.2 IBV的复制转录机制 |
| 1.2.3 IBV分子遗传变异的机制 |
| 1.2.3.1 基因突变引起的IBV遗传变异 |
| 1.2.3.2 基因重组的引起的IBV遗传变异 |
| 1.2.4 IBV疫苗免疫的研究现状 |
| 1.2.5 IBV全基因组研究现状 |
| 1.2.6 泛素和泛素-蛋白酶体途径 |
| 1.2.7 泛素在增强DNA疫苗免疫应答中的应用 |
| 1.3 课题研究目的和意义 |
| 第二章 1985年-2012年广西IBV分子流行病学研究 |
| 2.1 材料及方法 |
| 2.1.1 毒株及其来源背景 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 目的基因的引物设计 |
| 2.1.4 IB病毒的增殖及其总RNA的提取 |
| 2.1.5 RT-PCR扩增目的基因 |
| 2.1.6 目的基因的克隆及其核苷酸序列测定 |
| 2.1.7 目的基因序列的确定及其与参考株的比较和分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 S1、N、M基因和3'UTR RT-PCR扩增结果 |
| 2.2.2 S1、N、M基因和3'UTR序列的确定及比较分析 |
| 2.2.2.1 IBV分离株S1基因序列的确定及比较分析 |
| 2.2.2.2 IBV分离株N基因序列的确定及比较分析 |
| 2.2.2.3 分离株M基因的序列测定及其变异的比对与分析 |
| 2.2.2.4 IBV毒株3'UTR核苷酸序列测定及对比分析 |
| 2.2.3 基因分型与血清分型关系的探讨 |
| 2.2.3.1 血清分型结果分析 |
| 2.2.3.2 血清分型与基因分型关系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 IBV分离株基因序列的变异情况 |
| 2.3.2 1985-2012年IBV分离毒株之间的遗传进化关系 |
| 2.3.3 血清分型与基因分型之关系的探讨 |
| 第三章 鸡IBV广西不同时期分离株GX-C和GX-NN09032的全基因组序列测定及其生物信息学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 IBV分离株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 全基因扩增引物 |
| 3.1.4 生物信息学分析所用的数据 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 毒株的增殖 |
| 3.2.2 病毒RNA的提取 |
| 3.2.3 RT-PCR扩增 |
| 3.2.4 基因组5'RACE和3'RACE |
| 3.2.5 PCR产物的鉴定及纯化 |
| 3.2.6 连接及转化 |
| 3.2.7 克隆的鉴定及序列测定 |
| 3.2.8 测序结果的拼接及分析 |
| 3.2.9 全基因组序列的同源性分析 |
| 3.2.10 全基因组序列的系统发育分析 |
| 3.2.11 结构蛋白基因的系统发育分析 |
| 3.2.12 基因组全序列的生物信息学分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 GX-C和GX-NN09032全基因组序列RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.2 GX-C和GX-NN09032全基因组序列的基因注释 |
| 3.3.3 全基因组序列的系统发育分析 |
| 3.3.4 结构蛋白基因的系统发育分析 |
| 3.3.5 序列相似性分析 |
| 3.3.6 GX-NN09032和GX-C的S、N和M蛋白二级结构及糖基化和磷酸化位点分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 IBV广西分离株GX-C和GX-NN09032在全基因组核苷酸序列水平上分析 |
| 3.4.2 IBV广西分离株GX-C和GX-NN09032在结构蛋白基因的系统发育分析 |
| 3.4.3 GX-NN09032中可能存在的重组位点及其产生的机制 |
| 3.4.4 GX-NN09032和GX-C主要抗原蛋白二级结构及糖基化和磷酸化位点分析 |
| 第四章 泛素介导鸡传染性支气管炎病毒主要抗原基因真核表达质粒的构建及其免疫应答的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒株、细胞株、菌株和载体 |
| 4.1.2 主要的分子生物学试剂及试剂盒 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要的生化试剂和血清 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 构建质粒引物的设计 |
| 4.2.2 Ub、N和S1基因的RT-PCR扩增 |
| 4.2.3 pVAX1-Ub-linker-N、pVAX1-Ub-linker-N-S1、pVAX1-N及pVAX1-N-S1的构建策略 |
| 4.2.4 pVAX1-Ub-N、pVAX1-Ub-linker-N-S1及pVAX1-N-S1的构建过程 |
| 4.2.4.1 构建的融合基因及其相应融合蛋白二级结构的预测 |
| 4.2.4.2 各个目的基因的PCR及pVAX1双酶切产物的纯化与回收 |
| 4.2.4.3 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 4.2.4.4 重组质粒的测序鉴定 |
| 4.2.5 构建重组质粒的体外表达及其产物的检测 |
| 4.2.5.1 构建重组质粒的体外转染 |
| 4.2.5.2 免疫荧光方法检测转染重组质粒的基因表达 |
| 4.2.5.3 RT-PCR方法检测重组质粒在Vero细胞中的表达 |
| 4.2.6 重组质粒免疫应答效果的检测 |
| 4.2.6.1 动物试验的分组和处理 |
| 4.2.6.2 样品的采集和处理 |
| 4.2.6.3 免疫雏鸡血液T淋巴细胞亚型检测 |
| 4.2.6.4 血液中抗IBVIgG抗体的ELISA检测 |
| 4.2.6.5 雏鸡免疫器官IL-12和IFN-ymRNA表达的检测 |
| 4.2.6.6 IBV攻击雏鸡后感染率及保护率 |
| 4.2.7 数据处理与分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 Ub基因和IBVN及S1基因PCR扩增结果 |
| 4.3.2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 4.3.2.1 融合基因表达蛋白特性的软件预测结果及分析 |
| 4.3.2.2 重组质粒的双酶切鉴定结果 |
| 4.3.2.3 重组质粒的测序鉴定 |
| 4.3.3 融合基因真核表达质粒体外转染及其检测 |
| 4.3.3.1 RT-PCR方法检测融合基因的mRNA表达 |
| 4.3.3.2 间接免疫荧光方法检测目的基因的蛋白表达 |
| 4.3.4 动物免疫保护试验结果 |
| 4.3.4.1 雏鸡免疫器官IL-12和IFN-γmRNA表达水平 |
| 4.3.4.2 雏鸡血液CD4~+和CD8~+T淋巴细胞动态变化 |
| 4.3.4.3 IBV IgG抗体在雏鸡外周血液中的动态变化 |
| 4.3.4.4 IBV攻毒试验雏鸡后免疫保护的观察结果 |
| 4.3.4.5 临床保护率的计算结果及IB病毒含量的比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 融合基因真核载体表达质粒的设计及其构建策略 |
| 4.4.2 雏鸡血液CD4~+和CD8~+T淋巴细胞动态的变化及分析 |
| 4.4.3 雏鸡脾脏中IL-12和IFN-γmRNA表达水平的变化及分析 |
| 4.4.4 雏鸡外周血液抗IBVIgG抗体含量动态变化结果及其分析 |
| 4.4.5 感染率及保护率计算结果的讨论与分析 |
| 4.4.6 不同免疫组免疫保护效果的比较分析 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间参与研究的课题 |
| 攻读博士学位期间发表的研究论文 |
（6）鸡传染性支气管炎病毒河南地方株分离鉴定及HN104株与HN091株全基因组序列测定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 禽传染性支气管炎进展 |
| 1.1 病原分类 |
| 1.2 理化特性 |
| 1.3 生物学特性 |
| 1.4 宿主系统 |
| 2 IB 的流行病学研究进展 |
| 2.1 IB 不同致病型的研究 |
| 2.2 IB 的流行病学 |
| 2.2.1 国外IB 的流行病学 |
| 2.2.2 国内IB 的流行病学 |
| 3 IB 的检测方法 |
| 3.1 血清学检测 |
| 3.2 病原学检测 |
| 3.3 分子生物学检测 |
| 4 IBV 的分子生物学研究 |
| 4.1 IBV 基因组 |
| 4.2 IBV 的结构蛋白基因与生物学功能 |
| 4.3 IBV 的非结构蛋白基因与生物学功能 |
| 4.4 IBV 51 基因研究进展 |
| 4.4.1 高变区和保守区与抗原决定簇 |
| 4.4.2 血清型 |
| 4.4.3 毒力与组织嗜性 |
| 引言 |
| 试验一 河南部分地区鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定及分子流行病学研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 SPF 种蛋及SPF 鸡 |
| 1.1.3 病料来源及7 株分离株背景 |
| 1.1.4 主要试剂及配制 |
| 1.1.5 酶和主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病料处理与病毒培养 |
| 1.2.2 HA 试验 |
| 1.2.3 侏儒胚试验 |
| 1.2.4 l%胰酶处理HN104 株鸡胚尿囊液试验 |
| 1.2.5 HN104 株对NDV-LaSota 株干扰试验 |
| 1.2.6 HN104 株EID50 测定 |
| 1.2.7 HN104 株对SPF 鸡的致病力试验 |
| 1.2.8 RT-PCR 试验 |
| 1.2.8.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.8.2 病毒总RNA 的提取及RT-PCR |
| 1.2.8.3 第一链cDNA 合成 |
| 1.2.8.4 基因的PCR 扩增 |
| 1.2.9 基因的克隆与序列测定 |
| 1.2.9.1 PCR 产物的回收与纯化 |
| 1.2.9.2 PCR 纯化产物与载体的连接 |
| 1.2.9.3 连接产物转化于感受态细胞 |
| 1.2.9.4 HN104 株对SPF 鸡的致病力试验 |
| 1.2.9.5 IBV Sl 序列的测定及序列比较分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 侏儒胚试验 |
| 2.2 胰酶处理HN104 株尿囊液后HA 试验及EID50 测定 |
| 2.3 HN104 株对NDV 干扰试验 |
| 2.4 HN104 株对SPF 鸡的致病力试验 |
| 2.5 分离株的Sl 与N 基因核苷酸序列Blast 检索结果 |
| 2.6.S1 基因序列分析及遗传进化分析 |
| 2.6.1 S1 基因序列分析 |
| 2.6.2 Sl 基因的遗传进化分析 |
| 2.7 N 基因序列分析及遗传进化分析 |
| 2.7.1 N 基因序列分析 |
| 2.7.2 N 基因遗传进化分析 |
| 2.8 HN104 株Sl 基因分子特征分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验二 IBV 分离株HN104 与HN091 全基因组序列测定及遗传进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 酶和主要试剂 |
| 1.1.3 毒株和SPF 种蛋 |
| 1.1.4 细胞培养相关试剂的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 病毒的纯化与增殖 |
| 1.2.2 分子生物学软件 |
| 1.2.3 分段扩增IBV 全基因组17 对引物的设计与合成 |
| 1.2.4 常规分子实验 |
| 1.2.4.1 病毒基因组RNA 的提取方法 |
| 1.2.4.2 cDNA 第一链的合成 |
| 1.2.4.3 基因的克隆与序列测定 |
| 1.2.5 IBV 全基因组的5’端和3’端扩增 |
| 1.2.5.1 IBV 全基因组的5’端RACE 扩增 |
| 1.2.5.2 IBV 全基因组的3’端RACE 扩增 |
| 1.2.6 IBV 全基因组全长cDNA 序列的测定及序列比较分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR 扩增结果 |
| 2.2 基因组cDNA 序列的测定与BLAST 分析 |
| 2.3 部分分离株IBV 全基因组序列分析 |
| 2.3.1 IBV HN104 株全基因组序列特点 |
| 2.3.2 IBV HN091 株全基因组序列特点 |
| 2.3.3 分离株HN104 和HN091 全基因遗传进化分析 |
| 2.4 分离株HN104 和HN091 的各个编码基因片段序列比较及遗传进化分析 |
| 2.5 5’UTR 与3’UTR 结构基因片段的序列比较及遗传进化分析 |
| 3 结论讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 附录 |
（7）鸡传染性支气管炎病毒0801株的分离鉴定及S1基因序列分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎概述 |
| 1.1.1 IBV 的分类 |
| 1.1.2 IBV 的粒子结构 |
| 1.1.3 IBV 的基因组 |
| 1.1.4 IBV 的理化特性 |
| 1.1.5 IBV 的生物学特性 |
| 1.2 IBV 的分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 IBV 的主要结构蛋白及功能 |
| 1.2.2 IBV 的复制机制 |
| 1.2.3 IBV 的变异机制 |
| 1.3 IBV 的分型研究进展 |
| 1.3.1 国外对IBV 的分型研究 |
| 1.3.2 国内对IBV 的分型研究 |
| 1.3.3 IBV 血清型鉴定方法 |
| 1.4 IBV 的检测与防控 |
| 1.4.1 检测方法 |
| 1.4.2 防控技术 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料及毒株背景资料 |
| 2.1.2 供试毒株与鸡胚 |
| 2.1.3 主要材料及试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 参考毒株及其 GeneBank 登录号 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.2 鸡胚交叉中和试验 |
| 2.2.3 S1 基因的克隆与序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒的分离鉴定 |
| 3.1.1 病毒的鸡胚传代结果 |
| 3.1.2 新城疫病毒干扰试验 |
| 3.1.3 致鸡胚矮小化试验 |
| 3.1.4 血凝试验 |
| 3.1.5 鸡胚半数感染量（EID50）测定 |
| 3.1.6 动物回归试验 |
| 3.2 鸡胚交叉中和试验 |
| 3.2.1 试验毒株的鸡胚半数感染量（EID50）测定 |
| 3.2.2 鸡胚交叉中和试验结果 |
| 3.3 S1 基因的克隆及序列分析 |
| 3.3.1 RT-PCR 扩增结果 |
| 3.3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.3.3 S1 基因的克隆和序列测定 |
| 3.3.4 S1 基因系统发育分析 |
| 3.3.5 S1 基因同源性分析 |
| 3.3.6 氨基酸序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 |
（8）传染性支气管炎病毒的基因分型及S1基因和N基因遗传多样性分析（论文提纲范文）
| 符号及缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 IBV的分类 |
| 1.1.2 理化性质 |
| 1.1.3 生物学活性 |
| 1.1.4 宿主系统 |
| 1.2 IBV 的基因组 |
| 1.3 IBV 的粒子结构 |
| 1.4 IBV 的主要结构蛋白及功能 |
| 1.4.1 纤突蛋白（S） |
| 1.4.2 膜基质蛋白（M） |
| 1.4.3 核衣壳蛋白（N） |
| 1.4.4 其他蛋白 |
| 1.5 IBV 的复制机制 |
| 1.6 IBV 的变异机制 |
| 1.6.1 重组与基因工程苗 |
| 1.7 IBV 的血清型和基因分型研究进展 |
| 1.7.1 国外对IBV 的分型研究 |
| 1.7.2 国内对IBV 的分型研究 |
| 1.7.3 血清抗体分析 |
| 1.7.4 分子生物学分型 |
| 1.8 IBV 的检测与防控 |
| 1.8.1 检测方法 |
| 1.8.2 防控技术 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.1.2 毒株序列 |
| 2.1.3 参考毒株 |
| 2.1.4 器材与试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 病毒的增值与浓缩 |
| 2.2.3 病毒基因组RNA 的提取 |
| 2.2.4 RT-PCR |
| 2.2.5 cDNA 合成 |
| 2.2.6 PCR 扩增 |
| 2.2.7 PCR 产物的克隆和序列测定 |
| 2.2.8 序列分析 |
| 2.2.9 S1 基因的基因分型 |
| 2.2.10 N 基因的基因分型 |
| 2.2.11 S1 基因和N 基因的分型比较 |
| 2.2.12 免疫压力下的IBV 毒株S1 基因和N 基因的遗传变异分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 病毒的分离鉴定 |
| 3.2 RT-PCR 的扩增结果 |
| 3.3 重组质粒的鉴定 |
| 3.4 测序结果及核苷酸、氨基酸序列比较 |
| 3.5 同源性分析 |
| 3.6 IBV S1 基因不同片段的nt/aa 遗传变异相关性 |
| 3.7 IBV N 基因不同片段的nt/aa 遗传变异相关性 |
| 3.8 IBV 不同毒株间S1 和N 基因的核苷酸变异相关性 |
| 3.9 IBV S1 基因的基因分型结果 |
| 3.10 IBV N 基因的基因分型结果 |
| 3.11 40 株相同毒株S1 基因和N 基因的分型比较 |
| 3.12 免疫压力下的IBV 毒株S1 基因的遗传变异趋势 |
| 3.13 免疫压力下的IBV 毒株N 基因的遗传变异趋势 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 个人简介 |
（9）鸡传染性支气管炎病毒（793/B）M基因与截短M基因的克隆测序、原核表达及鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 文献综述 鸡传染性支气管炎病毒793/B 的研究进展 |
| 1. IBV 分类 |
| 2. IBV 基因组 |
| 3. IBV 病毒粒子结构 |
| 4. IBV 主要结构蛋白及功能 |
| 4.1 纤突蛋白（S 蛋白或E1） |
| 4.2 包膜蛋白（基质蛋白或M 蛋白） |
| 4.3 核衣壳蛋白（N 蛋白） |
| 4.4 其它蛋白 |
| 5. IBV 复制 |
| 6. IBV 血清型 |
| 6.1 国外对 IBV 的分型研究 |
| 6.2 国内对 IBV 分型的研究 |
| 6.3 血清抗体分析 |
| 7. IBV RNA 重组与基因工程苗 |
| 8. IBV 793/B 特性 |
| 8.1 分子生物学特性 |
| 8.1.1 793/B 血清亚群 |
| 8.1.2 核苷酸序列 |
| 8.1.3 氨基酸序列 |
| 8.2 793/B 致病性 |
| 8.3 流行病学 |
| 8.4 诊断 |
| 8.4.1 病毒的分离 |
| 8.4.2 血清学鉴定 |
| 8.4.3 分子生物学诊断方法 |
| 8.5 防制及存在的问题 |
| 9. 研究的意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 鸡传染性支气管炎病毒变异株（793/B）M 基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒株和菌株 |
| 1.2 器材和试剂 |
| 1.3 SPF 鸡胚 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 病毒的增殖与浓缩 |
| 1.6 病毒基因组 RNA 的提取 |
| 1.7 RT-PCR |
| 1.7.1 cDNA 合成 |
| 1.7.2 PCR 扩增 |
| 1.8 PCR 产物的克隆和序列测定 |
| 1.8.1 PCR 产物的纯化回收 |
| 1.8.2 PCR 产物与pMD 18-T Vector 的连接反应 |
| 1.8.3 TG1 感受态细胞的制备 |
| 1.8.4 连接产物转化感受态细胞 |
| 1.8.5 重组质粒的鉴定 |
| 1.9 序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增结果 |
| 2.2 重组质粒的鉴定 |
| 2.3 测序结果及核苷酸、氨基酸序列比较 |
| 2.4 同源性分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 IBV（793/B）M基因与2种截短M基因原核表达及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 质粒及菌种 |
| 1.2 主要试剂和器材 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 鼠抗IBV（793/B）血清的制备 |
| 1.5 引物的设计与合成 |
| 1.6 pGEX6p-M、pGEX6p-M1 和 pGEX6p-M2 原核表达质粒的构建 |
| 1.6.1 M 基因及M1、M2 截短基因的扩增 |
| 1.6.2 pGEX6p-M、pGEX6p-M1 和 pGEX6p-M2 原核表达质粒的构建 |
| 1.6.3 重组质粒的鉴定 |
| 1.7 GST-M1、GST-M2 和 GST-M 重组蛋白的诱导表达 |
| 1.7.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 1.7.2 SDS-PAGE 样品的制备 |
| 1.7.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） |
| 1.8 Western blot 鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 pGEX6p-M、pGEX6p-M1 和 pGEX6p-M2 原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.2 GST-M、GST-M1 和 GST-M2 重组蛋白的诱导 |
| 2.3 Western blot 鉴定 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（10）2006-2008年山东鸡传染性支气管炎病毒分离株S1与N基因的分子特征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 1 鸡传染性支气管炎概述 |
| 2 鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 3 鸡传染性支气管炎的诊断 |
| 4 研究目的和意义 |
| 试验一 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及N基因的序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 IBV 分离株致鸡胚病变特征 |
| 2.2 尿囊液对鸡红细胞的凝集活性 |
| 2.3 形态学观察 |
| 2.4 N基因的扩增与鉴定 |
| 2.5 N基因序列的比较分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 IBV 分离株的分离及鉴定 |
| 3.2 IBV N 基因序列的分析 |
| 试验二 IBV S1 基因的遗传变异及RFLP分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RFLP分型结果 |
| 2.2 S1 基因的扩增与鉴定 |
| 2.3 基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白S_1基因的RFLP与序列比较分析（论文参考文献）
- [1]2018-2019年广西IBV分离株S1基因序列分析及4株代表性IBV变异株的免疫原性研究[D]. 王露. 广西大学, 2020
- [2]应对日益严峻的挑战:中国禽传染性支气管炎研究[J]. 黄梦姣,张芸,薛春宜,曹永长. 微生物学通报, 2019(07)
- [3]两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达[D]. 张琳婧. 扬州大学, 2019
- [4]2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究[D]. 周海生. 扬州大学, 2017(05)
- [5]广西鸡IBV分子流行病学及泛素介导的病毒主要抗原基因免疫应答的研究[D]. 李孟. 广西大学, 2013(06)
- [6]鸡传染性支气管炎病毒河南地方株分离鉴定及HN104株与HN091株全基因组序列测定[D]. 刘文杰. 河南农业大学, 2011(06)
- [7]鸡传染性支气管炎病毒0801株的分离鉴定及S1基因序列分析[D]. 刘巍. 山东农业大学, 2011(08)
- [8]传染性支气管炎病毒的基因分型及S1基因和N基因遗传多样性分析[D]. 曲新泽. 山东农业大学, 2010(06)
- [9]鸡传染性支气管炎病毒（793/B）M基因与截短M基因的克隆测序、原核表达及鉴定[D]. 孙宁. 山东农业大学, 2009(03)
- [10]2006-2008年山东鸡传染性支气管炎病毒分离株S1与N基因的分子特征[D]. 路希山. 青岛农业大学, 2009(11)