一、肿瘤干细胞:恶性肿瘤的种子（论文文献综述）
王予[1]（2021）在《TLR4对鼻咽癌肿瘤干细胞的影响及其作用机制研究》文中研究表明[目的]通过研究TLR4在鼻咽癌中的表达特征与肿瘤干细胞干性及其迁移和侵袭能力的关系。为鼻咽癌早期诊断、生物靶向治疗提供实验和理论基础。[方法]选用鼻咽癌5-8F细胞系和CNE2细胞系,运用无血清悬浮成球法进行培养,依据肿瘤干细胞表达的不同表面标志物富集鼻咽癌肿瘤干细胞。随后检测TLR4在富集的鼻咽癌干样细胞中的表达水平及其特征。运用流式细胞术分选鼻咽癌TLR4阳性和鼻咽癌TLR4阴性的亚细胞群。运用细胞功能学实验检测TLR4的表达与鼻咽癌肿瘤干细胞自我更新、增殖的关系。运用划痕实验和侵袭实验,检测TLR4表达与鼻咽癌肿瘤干细胞细胞迁移、侵袭能力的关系。运用Q-PCR实验评估TLR4表达水平与细胞干性相关基因的表达关系。[结果]1.鼻咽癌肿瘤干细胞成球实验过程中,可以观察到鼻咽癌CNE2细胞相对于鼻咽癌5-8F细胞的成球能力较强,细胞球的形态较圆且结构致密。Q-PCR检测结果表明,无血清悬浮培养法培养富集的鼻咽癌肿瘤干细胞（CNE2-CS）与鼻咽癌初始的CNE2相比较,干细胞表面标记物（CD24、CD133、CD44）、干性转录基因（OCT4、Nanog、SOX2）和TLR4的表达水平相对较高。两组之前比较差异显着（P<0.05）2.鼻咽癌CNE2细胞在经过流式细胞仪分选后,TLR4阳性细胞占50.2%。分选后的TLR4阳性细胞经Q-PCR检测结果显示,干细胞的表面标志（CD24、CD44、CD133）和干性转录基因（OCT4、Nanog、SOX2）的表达表达水平相较于TLR4阴性细胞显着增加。3.无血清悬浮培养实验显示,CNE2/TLR4+细胞比CNE2/TLR4-细胞自我更新能力更强。Edu增殖实验显示,CNE2/TLR4+细胞比CNE2/TLR4-细胞增殖能力强。CNE2/TLR4+细胞在划痕愈合实验和侵袭实验中都表现出了比CNE2/TLR4-更强的迁移和侵袭能力。[结论]1.TLR4在鼻咽癌肿瘤干细胞内高表达。2.TLR4阳性的鼻咽癌细胞中含有更多的干细胞。TLR4有可能作为鼻咽癌肿瘤干细胞的标志物。3.TLR4的表达对于维持鼻咽癌肿瘤干细胞的自我更新、增殖、迁移等干性特征具有重要作用,靶向TLR4信号通路可能是治疗鼻咽癌的一种有效方法。
姜文丽[2]（2021）在《海洋来源化合物Asperolide A抑制三阴性乳腺癌细胞溶骨性破坏的作用及分子机制研究》文中提出一、研究背景乳腺癌已成为全球女性发病率（24.2%）和死亡率（15%）最高的恶性肿瘤。三阴性乳腺癌是雌激素受体（Estrogen receptor,ER）、孕激素受体（Progesterone receptor,PR）和人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2,HER2）均为阴性的乳腺癌临床亚型,约占乳腺癌人群的15～20%。与其他激素受体阳性的乳腺癌相比,三阴性乳腺癌具有侵袭性强、进展快、易转移、生存时间短等特点。由于缺乏相应受体,三阴性乳腺癌对内分泌治疗和HER-2靶向治疗均不敏感,化疗仍然是核心治疗方案。但是,化疗相关多药耐药限制了药物的选择,且化疗对晚期转移患者的治疗效果非常有限。三阴性乳腺癌因其生物侵袭性极强,极易出现复发转移。骨骼是三阴性乳腺癌最常见的转移部位之一,且以溶骨性骨转移为特征。调节三阴性乳腺癌细胞与骨微环境之间的相互作用,抑制溶骨性病变是防治三阴性乳腺癌骨转移的关键。双磷酸盐是目前乳腺癌骨转移治疗的一线药物,它能有效抑制骨转移灶中破骨细胞活性异常升高引起的骨溶解,进而达到防治溶骨性骨转移的目的。但双磷酸盐无法直接抑制三阴性乳腺癌细胞恶性表型,也不能促进成骨细胞修复受损骨质,疗效有限。因此,在针对三阴性乳腺癌伴骨转移的临床治疗中,仍亟需寻找新的药物靶点和特异性药物。从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性的先导化合物是药物研发的重要途径。天然产物来源多样,而浩瀚海洋也堪称“蓝色药库”,海洋生物生存环境特殊多样（例如:低温、高盐、低氧和高压等）,其提取物也具有结构多样、活性特殊等特性,为药物研发提供了丰富的先导化合物,海洋药物顺势成为备受关注的研究热点。海藻是海洋生物资源的重要组成部分。海藻及其附生菌提取物中包含了大量生物活性物质,具有天然、独特、新颖等优势。中医理论认为海藻具有理气散结功效,可入药用于治疗乳癖（乳腺增生、纤维腺瘤）等疾患,且对骨质疏松具有潜在防治作用。本课题组前期从海洋褐藻门马尾藻属温特曲霉菌中,提取了Wentilactone A、Wentilactone B、Botryosphaerin B、LL-Z1271-β、Asperolide A、Asperolide B、Asperolide C等四降二萜双内酯类衍生物。近期研究中发现,这类化合物具有潜在抗肿瘤活性。此外,在我们的前期初筛过程中,还发现Asperolide A对破骨细胞活性还具有明显的抑制作用。因此,本课题选定Asperolide A作为候选研究的小分子,在细胞、动物水平研究其对三阴性乳腺癌骨破坏的抑制作用及分子机制。二、研究目的本课题拟从实际问题出发,明确Asperolide A对三阴性乳腺癌细胞周期、迁移、侵袭和转移等恶性表型的抑制作用,并阐明Asperolide A抑制三阴性乳腺癌的作用靶点及分子机制。明确Asperolide A对破骨细胞分化、溶骨作用的影响,探究三阴性乳腺癌骨转移微环境中,Asperolide A对骨破坏的抑制作用及分子机制。结合临床数据,初步探索Asperolide A作用靶点在三阴性乳腺癌中的表达情况及预后相关性。综上,为开发针对三阴性乳腺癌骨转移的个体化治疗新药奠定研究基础。三、研究方法首先,我们培养了人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-436和正常乳腺细胞系MCF-10A,进行了Asperolide A细胞毒检测;通过平板划痕实验验证Asperolide A对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响;通过Western blot实验检测Asperolide A细胞迁移相关蛋白MMP9和MMP7表达情况的影响;通过Transwell侵袭实验评估Asperolide A对三阴性乳腺癌细胞侵袭能力的影响;通过流式细胞术检测Asperolide A对三阴性乳腺癌细胞周期的影响;最后设计裸鼠三阴性乳腺癌全身转移模型,给药并观察评估裸鼠肿瘤转移情况。为了进一步寻找Asperolide A的潜在作用靶点,明确其在三阴性乳腺癌中的调控作用,运用Swissdock分子对接服务器预测Asperolide A的靶蛋白,模拟Asperolide A-靶蛋白的结合模式;利用表面等离子共振（Surface plasma resonane,SPR）技术检测Asperolide A与靶蛋白的结合力;通过荧光探针标记技术观察Asperolide A在活细胞中的作用部位;利用RNA干扰技术和蛋白印迹（Western blot）对Asperolide A靶点后效应进行了验证;运用Oncomine数据库和UALCAN数据库分析靶蛋白在三阴性乳腺癌中的表达情况,及其与预后的关系;制备组织芯片观察靶蛋白在三阴性乳腺癌组织与癌旁组织中表达的差异。随后,我们通过实验验证Asperolide A对原代小鼠骨髓来源单核巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMMs）向破骨细胞分化的影响。在评估细胞毒后,运用含巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony stimulating factor,M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL）的培养基诱导BMMs向破骨细胞分化,同时加入安全浓度Asperolide A尝试抑制该过程;运用抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色技术、F-actin染色技术、骨吸收实验、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）检测实验评价抑制效果;运用酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）技术检测Asperolide A处理后对三阴性乳腺癌分泌RANKL的影响;与此同时,运用成骨细胞分化培养基诱导骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向成骨细胞分化,并通过碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红（Alizarin red,AR）染色检测化合物对成骨分化进程的影响;通过Western blot检测了Asperolide A对靶蛋白下游信号通路、破骨和成骨调控相关信号通路的影响。最后,我们设计了裸鼠胫骨髓腔荷瘤模型,给药并观察评估了裸鼠肿瘤骨破坏情况。四、研究结果体外细胞实验中,我们观察到Asperolide A在一定浓度下能显着抑制MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞迁移和侵袭,并阻滞细胞周期进程。此外,在体内肿瘤转移模型中,我们观察到Asperolide A能抑制三阴性乳腺癌转移。生物信息学预测结果提示:Asperolide A与Stem cell factor/c-KIT的TYR568和TYR570发生弱中等强度相互作用,ΔG为-6.93 kcal/mol;SPR、RNA干扰技术、荧光探针标记技术和Western blot验证了Asperolide A能够与c-KIT发生相互作用,并抑制其下游PI3K、AKT和m TOR蛋白的磷酸化活化。与此同时,肿瘤基因芯片数据库分析结果提示:与非三阴性乳腺癌相比,c-KIT基因在三阴性乳腺癌中表达量显着升高,c-KIT表达与预后负相关。此外,实验结果显示Asperolide A通过抑制NF-κB和JNK信号的磷酸化活化,进而抑制c-FOS和NFATC1表达,最终抑制破骨分化和骨吸收功能。但是,Asperolide A对成骨分化进程无显着影响。同时,我们的动物实验结果也表明Asperolide A能抑制三阴性乳腺癌导致的骨破坏:与模型组相比,Asperolide A高剂量给药组,肿瘤生长受限,骨组织中破骨细胞数量显着降低,胫骨受肿瘤破坏程度下降,骨小梁完整度提高。五、结论通过本研究,我们论证了海洋微生物来源小分子化合物Asperolide A在不损伤机体正常乳腺细胞的浓度下,能够抑制三阴性乳腺癌恶性表型和趋化破骨细胞的能力。同时,Asperolide A通过抑制小鼠BMMs细胞中NF-κB信号通路、PI3K/AKT/m TOR信号通路以及JNK蛋白的磷酸化活化,进而抑制破骨标记基因的表达,最终抑制破骨分化和骨吸收功能。本研究为开发Asperolide A成为抗三阴性乳腺癌骨转移和继发性骨破坏药物提供理论基础。
张彪[3]（2020）在《新型有机硒化合物CU27通过靶向c-MYC转录功能抑制肝癌转移及肿瘤干细胞性能》文中进行了进一步梳理“肿瘤干细胞”理论的提出,为恶性肿瘤的复发和转移提供了新的理论基础,也为肿瘤治疗指出了新的方向和策略。肿瘤干细胞理论认为:恶性肿瘤组织中存在一小群自我更新能力很强的细胞,它们既具有肿瘤细胞的特性,又具有干细胞的特性,所以被称为肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells,CSCs）。目前的观点认为,肿瘤干细胞对化疗药物具有很强的耐药性,是恶性肿瘤复发和转移的真正根源,所以靶向治疗肿瘤干细胞已经成为抗肿瘤治疗的重点研究方向。c-MYC蛋白（MYC Proto-Oncogene Protein,c-MYC）是各种类型癌症中扩增程度最高的癌基因之一,所有类型癌症中约有75%均呈现过度表达,c-MYC在恶性肿瘤的发生发展和肿瘤干细胞性能维持中都具有重要作用,也是治疗肿瘤干细胞的重要靶点。但与RAS等着名的癌基因相似,它被认为是一种“难以用药物治疗”的蛋白质,因为其蛋白结构缺乏药物结合的合适位点,至今临床上仍缺乏有效的c-MYC靶向药物,以c-MYC为治疗靶点已经成为抗癌研究领域的关键挑战之一。我国是肝癌大国,肝癌患者基数庞大且增长迅速,晚期肝癌往往难以手术治疗,而晚期肝癌一线用药索拉菲尼的远期治疗效果也不理想,患者迫切需要更加有效的治疗药物。针对晚期肝癌患者治疗的重大需求、肿瘤干细胞的特殊性能、以及上述相关癌基因的特性分析,我们的研究目的就是寻找能够有效抑制肝癌肿瘤干细胞性能的小分子候选药物,并研究其发挥作用的分子机制和治疗靶点,从而抑制晚期肝癌的复发和转移,为晚期肝癌的靶向治疗提供新的途径。在抗肿瘤干细胞的药物研究中,硒化合物具有出色的治疗作用,已有文献报道硒化合物能改变肿瘤干细胞的氧化还原代谢,还有的硒化合物能靶向Wnt/β-catenin信号通路降低肿瘤干细胞的干性。在本研究中,我们通过筛选比对,发现了一种新的有机硒化合物CU27,通过抑制c-MYC的转录功能,有效的降低肝癌肿瘤干细胞的干性,显着抑制肝癌细胞在体内的成瘤能力和转移能力,并揭示了c-MYC-hn RNPU通路对肝癌肿瘤干细胞性能的重要作用,从而为靶向肝癌肿瘤干细胞提供了新的治疗靶点。本研究主要包括四部分内容:一、具有抑制肝癌肿瘤干细胞性能的小分子化合物的筛选我们首先从小分子化合物库中初选了16种候选分子,并对其进行了三维培养体系的功能验证,以肝癌肿瘤干细胞标志物CD13、CD133的表达和肿瘤细胞成球（Tumor-Sphere forming）能力作为筛选标准,用来评价小分子对肝癌肿瘤干细胞的作用。其中小分子CU27效果最为显着,且正常肝细胞毒性较小,具有良好的抑制肝癌肿瘤干细胞性质和功能的潜力,因而成为我们进一步研究的候选靶分子。二、CU27抑制肝癌肿瘤干细胞性能的体内外实验验证通过筛选我们获得较为理想的候选分子CU27,为进一步明确CU27对肝癌肿瘤干细胞的作用,我们根据肿瘤干细胞的特有的生物学性能,设计了体外实验和体内试验来检验CU27的治疗作用。体外实验中我们考察了CU27对肝癌细胞成球能力、耐药能力、侵袭能力和干性标志物表达等的影响,实验结果显示CU27能使Huh7.5.1、PLC/PRF/5和Hep3B等肝癌细胞的成球能力分别降低68.8%、78.5%和86.1%;对其耐药能力、侵袭能力以及多种肝癌肿瘤干性标志物的表达也有显着抑制作用,而且也能有效抑制富集的肝癌肿瘤干细胞的干性相关功能,说明CU27在体外能有效抑制肝癌肿瘤干细胞性能。体内试验中我们考察了CU27对肝癌细胞体内成瘤能力、侵袭转移能力和耐药能力的影响,结果显示CU27能显着抑制肝癌细胞在小鼠体内的成瘤能力,分别使106、105和104组荷瘤小鼠的成瘤率降低28.6%、87.5%和66.7%;还能抑制体内肝癌细胞的转移能力,与对照组相比CU27治疗组小鼠肺转移结节总数降低67.9%,转移灶总体积降低43.6%;与阿霉素（Doxorubicin,DOX）联用能明显的改善荷瘤小鼠的生存率和生存状态,且CU27与索拉菲尼联用能显着增强对索拉菲尼耐药型肝癌的治疗效果。综上所述,CU27在体内外实验中都能显着降低肝癌肿瘤干细胞的性能,具有很好的治疗潜力和应用价值。三、CU27结合c-MYC蛋白并抑制其对靶基因启动子的转录激活为了进一步研究CU27发挥作用的分子机制,我们检测了CU27作用肝癌细胞后的基因表达谱芯片,并筛选出在两种肝癌细胞系中共同表达的差异基因,将这些共同差异基因进行生物信息学分析并利用独创性生物通路分析（Ingenuity Pathway Analysis,IPA）预测上游调控点,结果提示c-MYC很有可能是CU27的关键生物靶分子,CU27通过抑制c-MYC蛋白的转录功能,降低下游靶基因的表达,特别是以RNA剪切调控因子的相关基因下调最为明显。为了明确CU27与c-MYC之间的相互作用,我们设计了双荧光素酶报告实验、染色质免疫共沉淀实验（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）、免疫共沉淀实验（Co-Immunoprecipitation,Co IP）和表面等离子共振实验（Surface Plasmon Resonance,SPR）来探究CU27对c-MYC的作用,实验结果显示CU27能直接结合c-MYC蛋白的b HLH结构域,阻碍其与DNA启动子的有效结合,使c-MYC无法激活下游靶基因的转录,降低了c-MYC靶基因的表达。同时,我们在肝癌细胞中过表达c-MYC能显着削弱CU27的治疗作用,也说明了c-MYC是CU27发挥作用的关键生物靶分子。四、CU27通过抑制c-MYC-hn RNPU通路降低肝癌肿瘤干细胞的性能在前面实验基础上,我们进一步探究了下调的c-MYC靶基因中哪些是CU27发挥作用的关键基因,通过IPA分析和实验验证,结果提示hn RNPU很可能是CU27的关键靶基因。为了验证c-Myc-hn RNPU通路在肝癌细胞中的生物学作用,我们敲低和过表达肝癌细胞中hn RNPU的表达以及其他实验,结果显示c-Myc-hn RNPU通路对肝癌细胞干性性能有协同促进作用,包括增殖、自我更新能力和克隆形成能力等。改变其中任何一个的表达都会影响另一个,两者随着肝癌病程的进展不断上调彼此的表达强度。此外肝癌组织芯片结果显示hn RNPU和c-Myc具有共定位和正相关性,其二者的表达强度与肝癌患者病理分级和不良预后具有相关性,说明hn RNPU在c-Myc介导的肝癌中的具有重要的临床意义。本研究中我们阐述了CU27通过抑制c-MYC转录功能降低hn RNPU的表达,有效的阻断c-MYC-hn RNPU调控环路,进而抑制肝癌肿瘤干细胞的干性和功能,降低肝癌细胞自我更新能力和转移能力。首次揭示了c-MYC-hn RNPU通路在维持和促进肝癌肿瘤干细胞性能中的重要作用,为靶向肝癌肿瘤干细胞的治疗提供了新的途径和策略。
刘慧阳[4]（2020）在《LRP5基因促进结直肠癌发生的分子机制研究》文中进行了进一步梳理背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是位于全球癌症发病率第三位的一种消化系统恶性肿瘤,经典Wnt/β-catenin信号通路（经典Wnt通路）的异常激活是结肠癌发生的病理基础之一。低密度脂蛋白受体相关蛋白5（Low density lipoprotein receptor-related protein 5,LRP5）是经典Wnt通路信号转导的关键辅助受体,其表达水平与结直肠癌发生的关系仍不清楚,因此探究LRP5在CRC发生中的作用及其分子机制对于CRC的诊断和治疗具有重要意义。目的探究LRP5基因在结直肠癌发生中作用,有望从新的角度揭示CRC发生的分子机制,并为CRC的诊断及防治提供新的标志物和药物作用靶点。方法1.分析LRP5基因表达水平与CRC发生之间的关系（1）以不同肿瘤分级的CRC组织以及常用CRC细胞系Caco2、HCT-116、LoVo和SW480为研究对象,使用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR,RT-PCR）和免疫组织化学（Immunohistochemical,IHC）等技术分析LRP5表达水平的差异。（2）挖掘Oncomine和TCGA等数据库,分析结直肠癌组织和正常组织中LRP5基因的mRNA水平差异,确定LRP5基因表达水平与患者生存时间、肿瘤分期与分级等临床指标之间的相关性。同时通过Human Protein Atlas数据库,挖掘结直肠癌组织和正常组织中LRP5蛋白表达水平的相关数据。2.构建稳定激活或抑制LRP5基因表达的CRC细胞系（1）构建激活或抑制LRP5基因的CRC细胞系:对CRC细胞系HCT-116转染特异性靶向抑制LRP5基因的CRISPR/Cas9 KO质粒或激活LRP5基因表达的CRISPR质粒。嘌呤霉素筛选,通过RT-PCR分析鉴定LRP5基因mRNA水平的变化情况。（2）筛选稳定激活或抑制LRP5基因的CRC单克隆细胞系:流式细胞仪将激活或抑制LRP5基因的杂合CRC细胞分选至96孔细胞培养板并扩大培养。RT-PCR和Western blot鉴定,以LRP5基因上调或下调最为明显的细胞株作为稳定激活或抑制LRP5表达的单克隆细胞株。3.细胞和动物水平上鉴定激活LRP5基因表达对CRC的进展及其分子机制影响（1）选取稳定激活LRP5基因的CRC单克隆细胞系及其阴性对照细胞,考察激活LRP5基因的表达能力对细胞恶性表型以及裸鼠体内移植瘤形成能力的影响。给予顺铂处理,检测CRC细胞凋亡情况的变化。（2）激活LRP5基因表达后CRC细胞内经典Wnt通路关键基因的变化。（3）检测激活LRP5基因表达后CRC细胞内IL-6/STAT3通路关键基因分子水平上的变化。（4）检测激活LRP5基因表达后CRC细胞内肿瘤干性标记分子和肿瘤干性相关基因的变化。（5）分析结直肠癌肿瘤干细胞中经典Wnt通路及IL-6/STAT3通路相关基因的表达以肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）表面特异性标记分子CD133作为分选标记,将CRC细胞分成CD133+、CD133-两群细胞,检测其中经典Wnt通路及IL-6/STAT3通路相关基因的表达情况。同时结合肿瘤数据挖掘,分析CD133+、CD133-标记的其他CRC细胞系中LRP5表达水平的差异,以及LRP5、CD133和STAT3表达水平之间的相关性。4.鉴定敲除内源性LRP5基因对CRC的进展及其分子机制影响（1）选取LRP5基因表达明显降低的CRC细胞系及其阴性对照细胞,考察抑制内源性LRP5基因表达对细胞恶性表型以及裸鼠体内移植瘤形成能力的影响。（2）检测抑制内源性LRP5基因表达后CRC细胞内经典Wnt通路和IL-6/STAT3通路关键基因mRNA和蛋白水平的变化情况。检测顺铂处理后相关凋亡基因的变化情况。（3）检测抑制内源性LRP5基因表达后CRC细胞内肿瘤干性关键基因表达水平的变化情况。结果1.LRP5基因表达水平与CRC发生之间的相关性分析RT-PCR和IHC结果显示:与正常组织对比,CRC组织中LRP5基因的表达水平升高。肿瘤分级、TNM分期等与LRP5基因表达水平的相关性结果显示,LRP5基因的表达水平与CRC的恶性进展程度呈明显正相关。2.成功构建稳定激活或抑制LRP5基因表达的CRC细胞系RT-PCR和Western bolt结果显示:稳定激活或敲低LRP5基因表达的CRC稳转单克隆细胞系构建成功。3.激活或抑制LRP5基因能够促进或抑制CRC的恶性表型（1）实时无标记细胞分析技术（Real time cellular analysis,RTCA）检测结果:激活LRP5基因表达增强CRC稳转细胞系的细胞增殖速度。反之,敲除内源性LRP5基因抑制CRC细胞的增殖速度。（2）细胞划痕结果:激活LRP5基因表达后CRC细胞的划痕愈合速率增加,抑制LRP5基因表达降低CRC细胞的划痕愈合速率。（3）集落克隆实验结果:激活LRP5基因表达后,细胞集落克隆形成的数目增多;反之,抑制LRP5基因表达后细胞集落克隆形成数目减少。（4）细胞瘤球实验结果显示:激活LRP5基因表达后,CRC细胞形成的瘤球体积增大;相反,抑制LRP5基因表达后,CRC细胞形成的瘤球数目减少、体积变小,提示抑制LRP5基因表达会降低肿瘤细胞的干性。（5）顺铂敏感性结果:激活LRP5基因后HCT-116细胞对化疗药物的敏感性降低;相反,抑制LRP5基因表达会提高HCT-116细胞对化疗药物的敏感性。（6）裸鼠成瘤实验:激活LRP5基因能够促进CRC细胞在裸鼠体内的成瘤速度,抑制LRP5基因表达会可抑制CRC细胞在裸鼠体内的成瘤速度。4.激活或抑制LRP5基因促进或抑制CRC进展的机制研究（1）激活LRP5基因后HCT-116细胞内经典Wnt通路关键基因CTNNB1、c-Myc、CCND1和COX2等的mRNA水平上调。抑制LRP5基因表达后,上述经典Wnt信号通路关键基因的mRNA表达水平下调。（2）激活LRP5基因后HCT-116细胞内肿瘤干细胞干性标记分子和干性相关基因CDI33、ALDH1A1、Bmil、Oct3/4和Nanog的mRNA水平升高。抑制LRP5基因表达后HCT-116细胞内上述基因表达水平下降。（3）生物信息学数据分析显示LRP5表达水平与CD133的表达水平呈正相关。（4）以肿瘤干细胞表面特异标记分子CD133为标记,流式分选出CD133+、CD133-的HCT-116细胞群,CD133+细胞群中目标基因LRP5表达水平上调,并且经典Wnt通路关键基因的mRNA水平也明显升高。（5）在CD133+细胞群中IL-6和STAT3基因的表达水平也明显上调。（6）RT-PCR和Western blot结果显示:激活LRP5基因后HCT-116细胞内IL-6和STAT3的表达水平上调,抑制LRP5表达会降低HCT-116细胞中IL-6和STAT3基因的表达水平。（7）生物信息学数据分析显示LRP5基因的mRNA水平与STAT3基因的mRNA水平呈明显正相关,CD133基因的mRNA水平与STAT3基因的mRNA水平呈明显正相关。结论1.LRP5基因在CRC组织和细胞系中的表达水平明显上调,此发现为CRC临床诊断提供了一个潜在的诊断标志物。2.激活LRP5基因通过激活经典Wnt通路和IL-6/STAT3通路增强CRC细胞的干性特征,降低其对化疗药物的敏感性,促进CRC的发生和发展。3.抑制LRP5基因通过抑制经典Wnt通路和IL-6/STAT3通路抑制CRC细胞的干性,增强其对化疗药物的敏感性,抑制CRC的发生和发展。4.本课题的顺利实施,从一个全新的角度揭示CRC发生的机制,LRP5基因有望为CRC的诊断及防治提供新的标志物和药物作用靶点。
杨业国[5]（2020）在《源于白钻的Gomisin M2抗乳腺癌干细胞机制及体内抗增殖作用的研究》文中指出肿瘤干细胞（CSCs）在肿瘤的发生、复发和转移中起着重要作用。到目前为止,还没有发现针对CSCs的特异性药物,因为CSCs对大多数传统疗法都有耐药性,并且无限期增殖。三阴性乳腺癌是一种难以治疗而且特殊的乳腺癌亚型,缺乏针对三阴性乳腺癌的有效靶向疗法与富集肿瘤干细胞群和耐药密切相关。本课题研究,我们通过磁激活细胞分选法从MDA-MB-231和HCC1806细胞中富集了CD44+/CD24-乳腺癌干细胞,并将其在无血清培养基中培养。本研究的目的是评价从白钻（S.viridis A.C.Smith）中分离得到的Gomisin M2对MDA-MB-231和HCC1806乳腺癌细胞的抑制作用,并通过体内外细胞凋亡的方法靶向MDA-MB-231和HCC1806乳腺癌干细胞。首先,我们研究了白钻衍生出来的天然化合物的抗增殖活性。我们用11种化合物对两株人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和HCC1806给药两天,并用Alamar blue测定法测量了细胞活力。Gomisin M2被认为是从白钻提取的11种化合物中最有效的细胞毒性化合物。我们发现Gomisin M2以剂量依赖的方式抑制三阴性乳腺癌细胞活力,并以时间依赖的方式减小3D球体形成的大小。Gomisin M2对两种三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231,IC50=60μM;HCC1806,IC50=57μM)最具细胞毒性。我们根据BCSCs标志物通过磁激活细胞分选（MACS）对癌症干细胞进行了分选。我们使用MACS从正常癌细胞中分离出CD44+/CD24-细胞,并检测CD44的表达,以通过流式细胞术确定CD44的纯度。用MACS分离的癌症干细胞（CD44+/CD24-）比例的细胞计数分析结果>99%。我们发现,BCSCs具有形成肿瘤球的能力,并且使用高内涵系统免疫荧光技术发现CD44在肿瘤球中的表达显着增加。一小部分CD44+/CD24-细胞形成了肿瘤球。我们移植了从肿瘤球和非癌干细胞收集的200–300个癌症干细胞,并将它们注入受精后2 d的斑马鱼胚胎,以评估它们的增殖和迁移行为。在细胞移植后第6 d,观察到了来自2-dpf斑马鱼胚胎中乳腺球的MDA-MB-231-GFP细胞迁移至躯干。此外,与非CSC组相比,斑马鱼异种移植物中荧光颗粒的数量增加。然而,在细胞移植后的第3 d,用Di I标记并来源于肿瘤球的HCC1806细胞迁移到了2-dpf斑马鱼胚胎的躯干中。与非肿瘤干细胞相比,肿瘤干细胞在体内具有更高的致瘤性。为了探讨Gomisin M2是否能在体外抑制肿瘤球的形成,我们用Gomisin M2处理了MDA-MB-231 CSC和HCC1806 CSC群体48 h,并在没有Gomisin M2的情况下进行了另外两次肿瘤球培养。结果表明,Gomisin M2治疗后肿瘤球的大小和数量显着减少。使用高内涵筛选观察到核浓缩,细胞通透性,线粒体膜电位和细胞色素c释放。根据总强度除以体积,定量结果表明,阿霉素和Gomisin M2处理48 h后,细胞通透性和细胞色素c的荧光强度增加,而线粒体膜电位显着降低。阿霉素和Gomisin M2处理48 h后,总核强度的蓝色荧光减弱。此外,Western blot结果表明在MDA-MB-231和HCC1806中,应用不同浓度的Gomisin M2作用48 h后,细胞色素c的表达显着增加。为了确定最有效的Gomisin M2化合物对癌细胞的细胞毒性是否是由凋亡引起的,我们使用IC50值小于60μmol/L的Gomisin M2化合物在MDA-MB-231和HCC1806细胞中进行了凋亡分析。我们通过流式细胞仪分析了Gomisin M2治疗的乳腺癌细胞的凋亡。细胞分别用20μM,40μM和60μM Gomisin M2处理48 h。结果表明,Gomisin M2以剂量依赖性方式显着增加了MDA-MB-231和HCC1806细胞系中凋亡细胞的数量。然后流式细胞术分析了MDA-MB-231和HCC1806细胞凋亡的百分比。此外,Gomisin M2以剂量依赖性方式诱导了两种细胞系中Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达。为了研究Gomisin M2是否通过阻断DNA合成来诱导细胞增殖抑制,我们评估了Gomisin M2对MDA-MB-231和HCC1806中DNA复制的影响。Brd U分析的结果表明Gomisin M2对细胞增殖和DNA合成具有抑制作用。为了进一步评估Gomisin M2在体内的抗乳腺癌肿瘤干细胞效果,使用了斑马鱼模型进行评估。从MDA-MB-231-GFP和HCC1806（用Di I标记）富含的肿瘤干细胞重悬于PBS中将200-300个干细胞显微注射到2-dpf斑马鱼胚胎中。然后,斑马鱼胚胎用10μM Gomisin M2处理。植入后0 h,24 h和48 h通过荧光显微镜捕获荧光密度。结果表明,Gomisin M2处理显着降低了富含CSC的MDA-MB-231或HCC1806细胞的生长和增殖。定量结果表明,与对照组相比,Gomisin M2组在48 h内荧光强度逐渐降低。另外,与DMSO组相比,在48 h内没有增殖的胚的百分比显着增加。为了研究Gomisin M2对乳腺肿瘤干细胞的作用所涉及的机制,我们通过蛋白质印迹分析评估了涉及肿瘤进展的关键信号转导通路的参与。许多研究表明,Wnt/β-catenin通路在调节干细胞自我更新中起关键作用。我们的结果清楚地表明,在MDA-MB-231和HCC1806细胞中,Gomisin M2以剂量和时间依赖性方式显着下调Cyclin D1,β-catenin或p-GSK3β,并上调p-β-catenin或GSK3-β。综上所述,Gomisin M2是源自白钻的天然化合物,已被证明具有抗癌活性。这项研究表明Gomisin M2在体外和体内均能抑制乳腺癌干细胞,这为Gomisin M2或白钻提取物对乳腺癌化学预防的未来临床评估提供了强有力的依据。乳腺癌是由少数乳腺癌干细胞引发并维持的。当前可用的化学疗法和放射疗法不能抑制癌症干细胞群体。乳球形成试验表明,Gomisin M2在体外能抑制乳腺癌干细胞。斑马鱼异种移植模型显示Gomisin M2在体内消除了乳腺癌干细胞。此外,我们的结果表明,通过Gomisin M2对Wnt/β-catenin信号通路的下调是其功效的可能机制之一。这些数据表明Gomisin M2可能在乳腺癌治疗中具有潜能。
贺钰超[6]（2020）在《cPLA2α调控宫颈癌干细胞不同亚群可逆性转化的机制研究》文中进行了进一步梳理宫颈癌作为严重危害女性健康的常见恶性肿瘤,是20-39岁女性癌症死亡的第二大原因,尤其发展中国家更为严重。尽管早期筛查、HPV疫苗、手术及放化疗等联合治疗手段一直在不断改善,但是淋巴结转移、放化疗耐药及盆腔复发等问题仍相继出现,使得治疗现状并不乐观。肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）作为放化疗抵抗、肿瘤转移及复发的驱动因素,可能是造成这一治疗现状的主要根源。肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化能力,能够在不同的状态之间调节转化以适应新的环境。越来越多的研究也发现肿瘤干细胞在表型和功能上具有异质性,这种异质性导致传统放化疗无法完全杀灭肿瘤干细胞,最终导致肿瘤干细胞重新形成肿瘤,并引起肿瘤的复发、转移。因此,明确肿瘤干细胞标记物、阐明肿瘤干细胞异质性的相关分子机制,对优化肿瘤治疗方案、改善病人预后具有重要的意义。cPLA2α作为一种常见的胞浆型磷脂酶,在肿瘤发生发展过程中发挥了重要作用。课题组前期研究发现cPLA2α通过影响肿瘤细胞的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程影响肿瘤细胞的侵袭和转移。本研究通过在无血清干细胞培养基中富集干细胞球,发现cPLA2α表达水平不同的宫颈癌干细胞呈现不同的形态,过表达cPLA2α的宫颈癌干细胞球呈疏松葡萄串样,而下调cPLA2α表达富集到的干细胞球呈致密实心球;RT-PCR及Western blotting分析进一步发现,cPLA2α高表达的干细胞球富集间质型相关基因信号;而cPLA2α低表达的干细胞球富集上皮型相关基因信号;通过对宫颈癌细胞和组织进行流式分选、Smart-seq方法扩增及干性标记物的表征,我们发现宫颈癌中确实存在cPLA2α表达水平不同的干细胞亚群,而且它们的干性分子表面标志物表达不同,cPLA2α低表达的上皮型干细胞亚群高表达CD133;而cPLA2α高表达的间质型亚群以CD44+CD24-的表达模式为特征;转录组芯片分析进一步发现,不同干细胞亚群之间的差异基因与肿瘤细胞的增殖、克隆形成、周期、粘附及侵袭转移过程密切相关。由此我们通过一系列功能学实验验证,发现cPLA2α低表达的干细胞亚群增殖速度减慢,细胞周期停滞在G0/G1期,处于一种相对静止的状态,细胞与细胞间粘附能力增加,侵袭迁移能力降低;而cPLA2α高表达的干细胞亚群,具有较高的增殖、克隆形成、侵袭转移及体外成球和体内成瘤能力,与细胞基质间的粘附增加,位于肿瘤组织侵袭的边缘;在此基础上,我们结合转录组芯片分析、Tet-on系统及质谱分析等方法,解析cPLA2α对不同干细胞亚群的调控机制,结果发现cPLA2α可调控不同肿瘤干细胞亚群的可逆转化,其通过介导PKCζ的磷酸化,进而反馈给Wnt/β-catenin信号通路,抑制β-catenin与E-cadherin之间的连接,使β-catenin从胞膜解离,刺激β-catenin转位入核,激活EMT过程,使原本静止的上皮型肿瘤干细胞向间质型转化;99例宫颈癌组织的临床病理分析和免疫组化染色结果进一步揭示了cPLA2α高表达的宫颈癌患者具有更高的转移复发率和更差的预后。不同肿瘤干细胞亚群的存在,以及以cPLA2α为核心诱导的肿瘤干细胞EMT的激活和可逆转化,可能是诱使肿瘤脱离休眠期或潜伏期,最终导致肿瘤转移复发的原因。针对cPLA2α可能为宫颈癌的干细胞靶向治疗提供新的靶点,为有效去除不同状态的肿瘤干细胞,降低患者的转移风险提供新的治疗方案和理论依据。
蔺莉[7]（2020）在《幽门螺杆菌慢性感染与MNNG协同诱导胃黏膜上皮恶性转化的细胞分子机制研究》文中研究说明【背景】胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率、死亡率呈逐年上升趋势,在我国发病率与死亡率均位居癌症总发病率和死亡率的第三位。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）被认为是胃癌的一类致癌因子,细菌毒力因子及引发的慢性炎症都参与了胃黏膜细胞恶性转化的过程。H.pylori单独的致癌性并不强,许多内外协同因素可能会增强H.pylori的致癌性,比如亚硝酸盐的协同作用。H.pylori感染与胃癌的关系以及H.pylori诱发胃粘膜上皮细胞恶性转变的细胞分子机制仍不明确。阐明H.pylori长期慢性感染的致病机制对于胃癌的早期预防、早期诊断和早期治疗具有重要意义。【目的】模拟H.pylori临床感染过程建立H.pylori慢性感染的胃黏膜上皮细胞模型和小鼠模型,探讨H.pylori慢性感染或协同亚硝基化合物（MNNG）诱导黏膜上皮细胞恶性转化的细胞分子机制。【方法】1以人永生化胃黏膜上皮细胞GES-1为靶细胞,选取CagA+H.pylori J99株单独或联合MNNG连续感染诱导12个月,建立H.pylori慢性感染细胞模型,光镜及电镜观察细胞形态变化;MTT比色法、细胞克隆形成、Annexin V/PI双染色法检测细胞增殖和凋亡;细胞划痕和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;ELISA法检测IL-8的浓度;克隆球形成和细胞表面标志测定细胞的肿瘤干细胞（CSC）样和上皮-间质转化（EMT）样改变;实时荧光定量RT-PCR、Western blotting和免疫荧光染色检测相关基因mRNA和蛋白质的表达。2以C57BL/6J小鼠为对象,使用CagA+H.pylori SS1株单独或联合MNNG灌胃,反复感染胃黏膜12个月,建立H.pylori慢性感染动物模型,定期处死部分小鼠,采集胃黏膜标本和血清,快速尿素酶和Warthin-Starry银染色法观察H.pylori的感染状况;ELISA检测血清中IL-8的浓度;电镜和HE染色光镜观察胃黏膜组织形态学变化;Western blotting和免疫组织化学染色检测细胞增殖、细胞凋亡、EMT和CSC等相关蛋白的表达。3收集72例临床病理学明确诊断、手术切除的胃癌标本,获取胃癌组织和癌旁组织,快速尿素酶法和Warthin-Starry银染色分为H.pylori感染组（40例）和H.pylori非感染组（32例）。HE染色光镜观察胃黏膜组织形态学变化,免疫组织化学染色检测胃癌和癌旁组织中IL-8和Wnt2表达。结合患者临床病理资料,分析H.pylori感染与临床表现、IL-8和Wnt2之间的相互关系;以生存曲线和生存回归分析H.pylori感染、IL-8表达、Wnt2表达与胃癌患者预后的相关性。【结果】1 CagA+H.pylori长期慢性感染后,随着感染时间的延长,胃黏膜上皮GES-1细胞异常增殖、抵抗凋亡、耐药性增高、IL-8表达和分泌加强,迁移和侵袭能力增强,CSCs样和间质细胞样的标志物显着增高。同时,NF-κB和Wnt/β-catenin信号途径均被活化。联合应用MNNG可显着加强H.pylori慢性感染对GES-1细胞的诱导效应。提示在NF-κB和Wnt/β-catenin通路的共同调控下,CagA+H.pylori长期慢性感染诱发胃粘膜上皮细胞发生CSC样和间质细胞样改变。2 CagA+H.pylori SS1株能够成功感染小鼠胃黏膜,在H.pylori长期、反复、慢性感染刺激下,小鼠胃黏膜逐渐发生了异常增生、粘膜内囊肿及腺瘤样息肉变、癌前病变等病理学改变,IL-8表达和释放增高、炎性反应明显;Cyclin D1、Bcl2和Bax蛋白表达显示粘膜细胞异常增生和凋亡降低。同GES-1一样,小鼠胃黏膜上皮细胞CSCs样和间质细胞样的标志物增高,NF-κB和Wnt/β-catenin通路被异常激活。协同MNNG作用显着提高H.pylori的感染效应。提示CagA+H.pylori长期慢性感染致小鼠胃黏膜Wnt/β-catenin/IL-8通路异常活化,粘膜细胞发生炎性反应、呈现CSC样、EMT样及癌前病变病理改变。3临床胃癌患者癌组织IL-8和Wnt2的表达明显高于癌旁正常黏膜组织,H.pylori感染胃癌组织IL-8和Wnt2的表达显着高于未感染者,且IL-8表达与Wnt2的表达呈正相关。早期及无淋巴结转移者IL-8和Wnt2表达阳性率均低于进展期及有淋巴结转移者;IL-8和Wnt2阳性表达的胃癌患者生存率显着低于阴性表达者。【结论】CagA+H.pylori慢性感染协同MNNG激活胃黏膜细胞Wnt/β-catenin/NF-κB/IL-8调控通路,诱导胃黏膜上皮细胞异常增殖及肿瘤干细胞样和间质细胞样改变,促发胃黏膜炎性反应和癌前恶性转化。临床H.pylori感染阳性胃癌活化Wnt/β-catenin和NF-κB通路降低患者生存率。
吕庆[8]（2019）在《转录因子E2F5对三阴性乳腺癌的影响和相关机制研究》文中提出背景及目的乳腺癌是全世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤之一,而其中三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）恶性程度最高,预后最差。本研究即通过对E2F家族成员在乳腺癌中表达水平的检测,筛选出了乳腺癌潜在相关基因E2F5,并通过临床病理特征及预后分析研究其与乳腺癌的相关性,进而通过体内、体外的一系列实验,揭示E2F5的在TNBC中的生物学功能,并进一步探讨E2F5发挥作用的可能的分子机制。方法本课题采用实时定量逆转录-聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT–PCR）方法检测了E2F家族基因在10对乳腺癌组织与癌旁组织中的表达,并进一步通过TCGA（the Cancer Genome Atlas）和GEO（Genome Expression Omnibus）数据库中的公共数据进行验证。采用免疫组织化学（immunohistological chemistry,IHC）方法检测E2F5在258例乳腺癌组织及60例癌旁组织中的表达,分析组织水平上E2F5蛋白表达与258例乳腺癌患者临床病理特征及预后之间的关系。在细胞水平的实验中,通过慢病毒稳定转染与si RNA瞬时转染技术构建E2F5过表达细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468和敲降细胞株SUM159、BT549,并通过平板克隆形成实验、CCK-8实验、裸鼠体内成瘤实验、Transwell迁移与侵袭实验、成球培养实验等研究E2F5对TNBC细胞增殖、迁移、侵袭以及肿瘤干细胞特性的影响,并通过CCK-8法检测E2F5基因敲降对三阴性乳腺癌细胞化疗药物敏感性的影响。采用q RT-PCR检测细胞干性、化疗耐药和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的相关标志物。进一步在E2F5过表达细胞系中通过si RNA瞬时转染敲降ZEB2的表达,Western blot法检测si RNA对ZEB2的敲降效率,采用低吸附板成球培养法检测ZEB2基因沉默对E2F5过表达三阴性乳腺癌细胞干细胞特性的影响。结果RT-PCR结果显示E2F基因家族m RNA在乳腺癌组织中表达上调,其中E2F1、E2F3和E2F5上调最为显着,结合TCGA、GEO公共数据的表达分析结果筛选出了差异表达最显着的基因E2F5。免疫组化结果显示在乳腺癌组织中E2F5阳性表达率为36.0%,而癌旁组织中E2F5不表达（P<0.001）。在E2F5阳性与阴性两组患者中统计临床病理特征,结果显示,E2F5表达与患者年龄、绝经期状态、TNM分期、淋巴结转移以及分子分型有关,在年龄≤45岁组、未绝经组、有淋巴结转移组、III期组的表达阳性率较年龄>45岁组、绝经组、无淋巴结转移组、I-II期组更高,表达率有统计学差异（P<0.001）;在TNBC组阳性率为61.5%,显着高于Luminal B组、Luminal A组及Her-2组（p<0.001）。Kaplan-Miere生存分析表明,E2F5阴性组患者的无病生存和总生存均优于阳性组（P<0.001）,亚组分析显示在三阴性乳腺癌中尤为明显。而Cox回归分析结果则说明E2F5蛋白表达是乳腺癌独立风险因素（OR=1.587,95%CI=1.355-2.386,P=0.027）。体外实验中,CCK-8、克隆形成及体内成瘤实验结果表明过表达E2F5显着促进TNBC细胞的增殖,Transwell实验表明E2F5显着促进三阴性乳腺癌细胞的体外迁移和侵袭能力。成球培养实验中敲降E2F5能够降低三阴性乳腺癌干细胞特性,且q PCR检测发现CD44、SOX2和SOX9等干性相关标志物显着下调。同时,敲降E2F5能够增加TNBC细胞对阿霉素、紫杉醇和吉西他滨等化疗药物的敏感性,并可导致多药耐药基因MDR1和BCRP表达水平降低。RT-PCR检测发现E2F5与EMT的发生显着相关,并影响包括ZEB2在内的多种EMT相关转录因子的表达水平。进一步敲降ZEB2表达后,成球培养实验表明敲降ZEB2可逆转E2F5对三阴性乳腺癌细胞的干性增强作用。结论本研究表明E2F5在乳腺癌的发生、转移以及复发中起着重要作用。E2F5在体内和体外水平都能促进三阴性乳腺癌细胞的干细胞特性,表现为增强三阴性乳腺癌的增殖、迁移、侵袭、成瘤能力及化疗抵抗性。E2F5通过促进EMT相关转录因子ZEB2表达,促进三阴性乳腺癌细胞上皮间质转化,提高三阴性乳腺癌细胞干细胞特性。
曹晓诚[9]（2019）在《组成性活化DNMT1沉默miR-34a-5p对肝癌干细胞特性的影响》文中研究说明有研究表明表观遗传调控在促进和维持肿瘤干细胞（CSC）特性中发挥重要作用。然而,在肝细胞癌（HCC）中,促进肝癌干细胞（LCSCs）特性的表观遗传调控机制以及靶向表观遗传调控的药物作用机制尚未完全阐明。本文的预实验结果表明,SMMC-7721细胞系LCSCs较亲本细胞有更高DNMT1活性,更低miR-34a-5p表达。此外,抗肿瘤活性药效学筛选实验发现蔓荆子总黄酮（FVTF）有效抑制LCSCs球形成和DNMT1活性,上调miR-34a-5p水平。计算机模拟发现miR-34a-5p与FoxM1 3′端非翻译区有特异结合位点。据此,我们假设:DNMT1/miR-34a-5p/FoxM1信号轴在促进LCSCs特性中起重要作用;同时,FVTF通过抑制DNMT1活性和表达、上调miR-34a-5p表达、直接靶向抑制FoxM1,从而抑制LCSCs特性。为了验证该科学假设,本研究以SMMC-7721细胞系CD133+肝癌球细胞作为LCSCs模型。分别应用ELISA、蛋白质印迹、定量逆转录PCR（qRT-PCR）和甲基化特异性PCR（MSP）比较SMMC-7721细胞与LCSCs DNMT1活性以及蛋白和mRNA表达、miR-34a-5p表达及其启动子甲基化水平。分别用球形成法、琼脂集落形成法、流式细胞术分析、蛋白质印迹法和qRT-PCR检测SMMC-7721细胞与LCSCs的肝癌球形成率、集落形成率、CD133阳性细胞百分率、CSCs标志物（CD133、CD44和ALDH1）以及多能性转录因子（Bmi1、Sox2和Oct4）蛋白和（或）mRNA表达水平;以体外评价LCSCs特性。通过测定LCSCs裸鼠移植瘤生长速率和CD133及CD44蛋白表达,以体内评价LCSCs特性。利用地西他滨（DAC）和DNMT1 shRNA或DNMT1cDNA等抑制或过表达DNMT1基因确定DNMT1组成性活化促进LCSCs特性以及抑制DNMT1介导FVTF抑制LCSCs特性作用。分别采用miR-34a-5p模拟物和抑制物鉴定低表达miR-34a-5p促进LCSCs特性以及上调miR-34a-5p介导FVTF抑制LCSCs特性作用。分别使用荧光素酶报告基因、FoxM1敲低或过表达、DAC或硫链丝菌素（THI）处理鉴别miR-34a-5p靶基因FoxM1和FoxM1过表达促进LCSCs特性以及FVTF通过下调FoxM1表达抑制LCSCs特性。在拓展性研究中,MHCC97H细胞系肝癌球细胞用作肝癌干细胞样细胞（LCSLCs）;并明确DNMT1/miR-34a-5p/FoxM1信号轴在MHCC97H细胞系LCSLCs的表型和功能以及FVTF的药理作用。基于TCGA和GEO数据库肝细胞癌队列的生物信息学分析,以评价DNMT1/miR-34a-5p/FoxM1信号轴在肝细胞癌发生和肝细胞癌病人预后中的作用。结果表明,SMMC-7721细胞系LCSCs展示出DNMT1活性和表达增高、miR-34a-5p表达降低、体外LCSCs特性增强以及裸鼠皮下移植瘤生长速率加快。DAC处理和敲低DNMT1有效的抑制LCSCs DNMT1活性和表达、上调miR-34a-5p表达、降低miR-34a启动子甲基化水平和减弱体外LCSCs特性;同时,抑制LCSCs裸鼠移植瘤生长。过表达DNMT1增强亲本细胞DNMT1活性和表达、下调miR-34a-5p表达、增高miR-34a-5p启动子甲基化水平和增强体外LCSCs特性。miR-34a-5p模拟物上调LCSCs miR-34a-5p表达和减弱体外LCSCs特性,抑制裸鼠移植瘤生长。miR-34a-5p抑制物能降低亲本细胞miR-34a-5p表达和增强体外LCSCs特性,但是,miR-34a-5p模拟物或抑制物均不影响DNMT1活性及蛋白和mRNA表达。此外,miR-34a模拟物救援过表达DNMT1抑制miR-34a-5p表达和增强体外LCSCs特性作用。荧光素酶报告基因试验证实FoxM1是miR-34a-5p的靶基因;FoxM1敲低或过表达能模拟或拮抗miR-34a-5p抑制LCSCs特性作用。FVTF以浓度依赖方式抑制LCSCs DNMT1活性和mRNA表达、上调miR-34a-5p表达、降低miR-34a-5p启动子甲基化水平、下调FoxM1表达和减弱体外LCSCs特性;同时,抑制裸鼠移植瘤生长。DAC、miR-34a-5p模拟物、THI协作FVTF抑制LCSCs特性,并分别表现出协作FVTF抑制DNMT1活性和表达、上调miR-34a-5p表达以及下调FoxM1表达作用。过表达DNMT1、miR-34a抑制物或过表达FoxM1能减弱FVTF抑制LCSCs特性作用,同时,分别展示出拮抗FVTF抑制DNMT1活性和表达、上调miR-34a-5p表达以及下调FoxM1表达作用。然而,变动FoxM1表达水平不影响FVTF调节DNMT1活性和表达以及miR-34a-5p表达作用;改变miR-34a-5p表达对FVTF抑制DNMT1活性和表达作用无明显影响。此外,MHCC97H细胞系LCSLCs呈现出DNMT1活化、miR-34a-5p低表达、FoxM1过表达和LCSLCs特性增强等表型;FVTF能有效地减弱上述表型。源自TCGA和GEO数据库的肝癌队列数据分析证实DNMT1和FoxM1在肝细胞癌组织高表达,而miR-34a-5p呈现出低表达;DNMT1和FoxM1正相关,而两者与miR-34a-5p负相关;且与肝细胞癌患者预后不良有关。整合上述结果,可以得出如下结论:1.组成性活化DNMT1表观沉默miR-34a-5p去抑制激活FoxM1在LCSCs特性的促进和维持中起重要作用。2.FVTF具有抑制LCSCs特性作用;其作用分子机制涉及抑制DNMT1活性和表达、上调miR-34a-5p表达,靶向下调FoxM1表达。
乔书培[10]（2019）在《miR-486-3p特异性过表达系统构建及在癌症中的作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理miRNA是一类由18-24个碱基组成的物种间保守的非编码RNA,在多种生物学过程中发挥着重要的作用,参与发育,分化以及干性维持。miRNA的异常表达跟许多人类疾病（如癌症）的发生以及发展密切相关。本研究发现miR-486-3p在癌症组织中的表达相对于癌旁组织显着下调,随后TCGA数据库miR-486-3p表达数据与乳腺癌患者生存率相关性分析发现,miR-486-3p高表达病人生存率显着高于低表达病人,预示miR-486-3p在癌症中发挥着重要作用。因此,本研究将开展miR-486-3p在癌症中的作用以及机制分析。随着miRNA存贮平台的建立以及生物信息学的发展,miRNA互补对特殊结构被发现,而本研究的miR-486刚好能够被加工成互补miRNA对,即miR-486-5p与miR-486-3p成熟体互补配对,本研究发现miRNA-486互补对特殊结构导致利用传统的miRNA模拟物以及过表达pri-miRNA的方法均不能实现miR-486-3p的特异性过表达,为此,在sh RNA慢病毒表达系统的基础上,本研究建立了针对miR-486-3p特异性过表达的慢病毒系统,且该系统同时适用于其他miRNA互补对单一miRNA的特异性过表达。利用建立的miR-486-3p的特异过表达慢病毒系统,本研究分析了miR-486-3p对癌症生物学特性的影响,发现miR-486-3p能够通过调控癌细胞周期显着抑制癌细胞增殖以及克隆形成,且荷瘤鼠表皮瘤实验证实,在体内miR-486-3p也具有抑制癌细胞增殖的作用。其次,过表达miR-486-3p能够显着诱导癌症细胞的凋亡,增加癌细胞的化疗敏感性。另外,还发现miR-486-3p能够通过影响癌细胞形态进而抑制癌细胞的侵袭以及迁移。为进一步探讨miR-486-3p影响癌症生物学特性的分子机制,本研究利用RNA-Seq技术筛选出与细胞形态改变相关的基因TBCA、HMGA1、ARPC1B以及Rac3作为miR-486-3p的潜在靶基因,通过报告基因活性以及Western blot验证,本研究首次证实miR-486-3p靶向调控TBCA、HMGA1、ARPC1B以及Rac3基因。随后对靶基因是否参与miR-486-3p调控癌症生物学特性过程进行探究,结果表明,分别下调TBCA、HMGA1、ARPC1B以及RAC3均影响癌细胞的细胞周期,下调TBCA、HMGA1以及ARPC1B能够通过影响细胞形态来抑制癌细胞的侵袭以及迁移,但RAC3基因的下调对细胞形态以及癌细胞的侵袭迁移没有影响。最后,利用尾静脉注射稳转萤火虫荧光素酶的癌细胞制备小鼠体内转移模型,结合小动物活体成像,本研究证实过表达miR-486-3p以及下调其靶基因TBCA、HMGA1以及ARPC1B表达均能够抑制癌细胞体内的转移。利用GO以及KEGG富集分析RNA-Seq数据,本研究发现并验证miR-486-3p的过表达能够使MAPK信号通路发生改变,MAPK信号通路的改变会影响癌细胞增殖,凋亡以及侵袭迁移等生物学特性。且本研究证实miR-486-3p至少能够通过靶向下调其靶基因影响ERK的磷酸化水平从而对癌症的生物学特性产生影响。癌症干细胞是癌症复发以及转移的根源,为了进一步明确miR-486-3p在癌症转移中的作用,本研究通过模拟癌症干细胞微环境构建了简单高效的癌症干细胞筛选以及富集平台来探究miR-486-3p在癌症干细胞中的作用。结果表明,过表达miR-486-3p以及敲低其靶基因TBCA、HMGA1以及ARPC1B显着抑制癌症干细胞团的生长以及体内的转移。miR-486-3p至少能够通过靶向下调其靶基因TBCA、HMGA1以及ARPC1B调控MAPK信号通路来抑制癌症干细胞的自我增殖以及体内的转移。综上所述,本研究成功构建了miR-486-3p特异性过表达的慢病毒系统。利用构建的系统证实miR-486-3p至少能够通过靶向下调其靶基因TBCA、HMGA1、ARPC1B以及RAC3调控MAPK信号通路在癌症的发生发展以及癌症干细胞自我复制增殖以及体内转移中发挥着重要的作用。本研究为癌症的分子治疗提供了一个新的作用靶点,也为miR-486-3p用于临床的癌症治疗提供了理论依据。
二、肿瘤干细胞:恶性肿瘤的种子（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肿瘤干细胞:恶性肿瘤的种子（论文提纲范文）
（1）TLR4对鼻咽癌肿瘤干细胞的影响及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Toll样受体在鼻咽癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）海洋来源化合物Asperolide A抑制三阴性乳腺癌细胞溶骨性破坏的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一部分:Asperolide A对三阴性乳腺癌恶性表型的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:Asperolide A抑制三阴性乳腺癌的分子机制 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分:Asperolide A对破骨细胞功能及对三阴性乳腺癌继发性骨破坏功能的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 转移性三阴性乳腺癌及其治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和科研工作情况 |
| 致谢 |
（3）新型有机硒化合物CU27通过靶向c-MYC转录功能抑制肝癌转移及肿瘤干细胞性能（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 具有抑制肿瘤干细胞性能的小分子化合物的筛选 |
| 1.1 小分子化合物库的合成过程、名称和筛选策略 |
| 1.2 小分子化合物对肝癌细胞系CD13、CD133表达和成球能力的影响 |
| 1.3 实验小结 |
| 第二章 CU27抑制肝癌细胞干性性能的体外实验研究 |
| 2.1 CU27对肝癌干细胞标志物、肿瘤标志物和分化标志物表达的影响 |
| 2.2 CU27对肝癌细胞自我更新能力和耐药侵袭能力的影响 |
| 2.3 CU27对富集分选的肝癌肿瘤干细胞的抑制作用 |
| 2.4 实验小结 |
| 第三章 CU27抑制肝癌细胞干性的体内动物实验研究 |
| 3.1 CU27对肝癌细胞体内成瘤能力的影响 |
| 3.2 CU27对肝癌细胞体内转移能力的影响 |
| 3.3 CU27联合化疗药对荷瘤小鼠的治疗作用 |
| 3.4 实验小结 |
| 第四章 CU27抑制肝癌肿瘤干细胞的分子机制探究 |
| 4.1 CU27表达谱芯片的分析和验证 |
| 4.2 CU27通过抑制C-MYC转录功能下调其靶基因的表达 |
| 4.3 外源性过表达C-MYC能削弱CU27对肝癌干细胞的抑制作用 |
| 4.4 实验小结 |
| 第五章 CU27通过抑制C-MYC-HNRNPU通路来发挥抑制肝癌干细胞的作用 |
| 5.1 敲低HNRNPU能降低肝癌干细胞的干性性能 |
| 5.2 过表达HNRNPU能削弱CU27对肝癌干细胞的抑制作用 |
| 5.3 HNRNPU的临床意义以及C-MYC-HNRNPU之间的调控关系 |
| 5.4 实验小结 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 主要仪器 |
| 在学期间发表的学术论文(首页) |
| 简历 |
| 致谢 |
（4）LRP5基因促进结直肠癌发生的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1. 材料、试剂、仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 实验方法及步骤 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 质粒扩增提取 |
| 2.3 稳定激活LRP5基因或敲除LRP5基因的CRC细胞系筛选 |
| 2.4 单克隆细胞株筛选 |
| 2.5 提取RNA、反转录cDNA和RT-PCR |
| 2.6 蛋白样品制备 |
| 2.7 Western blot |
| 2.8 免疫组织化学 |
| 2.9 细胞增殖实验 |
| 2.10 细胞划痕实验 |
| 2.11 细胞集落克隆形成实验 |
| 2.12 顺铂敏感性实验 |
| 2.13 瘤球形成实验 |
| 2.14 裸鼠成瘤实验 |
| 2.15 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 LRP5分子水平与CRC发生的关系 |
| 3.2 LRP5表达水平与CRC临床病理参数的关系 |
| 3.3 激活LRP5基因促进CRC细胞的恶性表型 |
| 3.4 激活LRP5基因表达通过激活经典Wnt通路和IL-6/STAT3通路增强CRC细胞干性 |
| 3.5 激活经典Wnt通路及IL-6/STAT3通路增强结直肠癌CSCs的干性 |
| 3.6 激活LRP5基因降低CRC细胞对化疗药物敏感性 |
| 3.7 敲低LRP5基因抑制CRC细胞的恶性表型 |
| 3.8 敲低LRP5基因表达通过抑制经典Wnt通路和IL-6/STAT3通路降低CRC细胞干性 |
| 3.9 敲低LRP5基因提高CRC细胞对化疗药物敏感性 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 经典Wnt通路与结直肠癌干细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）源于白钻的Gomisin M2抗乳腺癌干细胞机制及体内抗增殖作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌 |
| 1.2 肿瘤干细胞 |
| 1.3 中药及其活性化合物作为抗肿瘤干细胞的潜在疗法 |
| 1.4 斑马鱼作为肿瘤研究中的模式生物 |
| 1.5 肿瘤干细胞和乳腺癌 |
| 1.6 瑶药抗肿瘤研究进展 |
| 1.7 本课题研究意义 |
| 第二章 高内涵对瑶药白钻化合物体外抗肿瘤的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 CD44+/CD24-乳腺癌细胞系的分选以及生物学特性的鉴定研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 化合物GOMISIN M2对CD44+/CD24-乳腺癌干细胞系的影响研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 化合物GOMISIN M2对乳腺癌干细胞体外线粒体启动的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 化合物GOMISIN M2对三阴性乳腺癌细胞诱导凋亡的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 实验结果与讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 GOMISIN M2诱导的抗乳腺癌干细胞体内斑马鱼异种移植以及信号通路的研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.3 实验结果与讨论 |
| 7.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 本论文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）cPLA2α调控宫颈癌干细胞不同亚群可逆性转化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、cPLA2α不同表达水平的宫颈癌干细胞表型 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 实验试剂及仪器耗材 |
| 1.1.2 主要溶液配制 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 cPLA2α不同表达水平的宫颈癌干细胞的形态及表征 |
| 1.2.2 不同宫颈癌干细胞亚群中EMT相关基因表达模式 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、不同宫颈癌干细胞亚群的表面干性标记物特征 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验试剂及仪器耗材 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同cPLA2α表达水平的干细胞亚群中干性标记物表达不同 |
| 2.2.2 cPLA2α特异性区分不同标记物表达的干细胞亚群 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、不同宫颈癌干细胞亚群的功能 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验试剂及仪器耗材 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同干细胞亚群间的差异基因功能富集情况 |
| 3.2.2 cPLA2α对宫颈癌干细胞增殖、体外成球和体内成瘤能力的影响 |
| 3.2.3 cPLA2α对宫颈癌干细胞侵袭、迁移及粘附能力的影响 |
| 3.2.4 cPLA2α对宫颈癌肿瘤细胞侵袭迁移与克隆增殖的影响 |
| 3.2.5 cPLA2α对宫颈癌化疗抵抗性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、cPLA2α调控宫颈癌干细胞可逆性转化的作用机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验试剂及耗材 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 cPLA2α可逆地调节不同CCSCs亚群的上皮间质转化 |
| 4.2.2 cPLA2α通过PKCζ调节不同CCSCs亚群的可逆转化 |
| 4.2.3 cPLA2α通过Wnt/β-catenin通路影响干细胞表型 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、cPLA2α高表达与宫颈癌转移和预后不良相关 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验试剂及仪器耗材 |
| 5.1.2 溶液配置及准备 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 宫颈癌组织中不同CCSCs亚群 |
| 5.2.2 cPLA2α的表达水平对宫颈癌转移及预后的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 CSCs与 EMT在肿瘤转移及肿瘤休眠中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）幽门螺杆菌慢性感染与MNNG协同诱导胃黏膜上皮恶性转化的细胞分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 幽门螺杆菌感染与胃癌 |
| 1 幽门螺杆菌致病机制 |
| 1.1 幽门螺杆菌的生物学特征 |
| 1.2 幽门螺杆菌的毒力因子 |
| 1.3 慢性炎症与胃癌 |
| 2 胃癌发病的危险因素 |
| 2.1 遗传 |
| 2.2 食物因素 |
| 2.3 幽门螺杆菌感染 |
| 2.4 幽门螺杆菌感染与亚硝酸盐的协同作用 |
| 3 幽门螺杆菌感染在胃癌发生发展中的作用 |
| 4 幽门螺杆菌感染与胃癌干细胞 |
| 4.1 肿瘤干细胞 |
| 4.2 胃癌干细胞(gastric CSCs,GCSCs) |
| 4.3 上皮间质样转化(EMT)与胃癌干细胞 |
| 5 幽门螺杆菌感染激活的相关信号通路 |
| 5.1 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 5.2 Sonic hedgehog(Shh)信号通路 |
| 5.3 Nuclear factor kappa B(NF-κB)信号通路 |
| 5.4 Toll样受体家族(Toll-like receptors,TLRs) |
| 6 H.pylori感染与胃黏膜病理性损伤 |
| 6.1 H.pylori共存性胃炎(coexisting gastritis) |
| 6.2 与H.pylori相关的胃黏膜病变 |
| 7 结语 |
| 第二章 CagA~+H.pylori慢性感染协同亚硝基化合物诱导胃黏膜上皮细胞发生间质样和干细胞样改变 |
| 材料与方法 |
| 1 主要试剂 |
| 2 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 结果 |
| 1 CagA~+H.pylori慢性感染协同MNNG诱导GES-1 细胞异常增殖 |
| 2 CagA~+H.pylori慢性感染协同MNNG诱导GES-1 细胞凋亡抵抗 |
| 3 CagA~+H.pylori慢性感染协同MNNG诱导GES-1 细胞发生EMT,迁移、侵袭能力增强 |
| 4 CagA~+H.pylori慢性感染协同MNNG诱导GES-1 细胞出现肿瘤干细胞样特性 |
| 5 CagA~+H.pylori慢性感染协同MNNG诱导后GES-1 细胞致炎因IL-8 分泌增高 |
| 6 Wnt/β-catenin/NF-κB/IL-8 通路调控CagA~+H.pylori诱导的GES-1 细胞EMT和CSCs样特性 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 CagA~+H.pylori慢性感染协同亚硝基化合物诱导小鼠胃黏膜上皮异常增生和癌前病变 |
| 材料与方法 |
| 1 主要试剂 |
| 2 主要仪器 |
| 3实验动物及幽门螺杆菌SS1 |
| 4 实验方法 |
| 结果 |
| 1 小鼠CagA~+H.pylori慢性感染模型的建立 |
| 2 CagA~+H.pylori慢性感染协同MNNG诱导后小鼠胃黏膜的变化 |
| 3 CagA~+H.pylori慢性感染协同MNNG诱导后小鼠胃黏膜发生EMT和 CSCs样转化 |
| 4 CagA~+H.pylori慢性感染协同MNNG诱导后小鼠胃黏膜炎性反应 |
| 5 CagA~+H.pylori慢性感染协同MNNG诱导激活胃黏膜细胞的Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 幽门螺杆菌感染患者胃癌组织IL-8和Wnt2的表达及临床意义 |
| 材料与方法 |
| 1 临床资料 |
| 2 临床标本获取 |
| 3 实验研究 |
| 结果 |
| 1 胃癌组织和癌旁组织H.pylori感染状况 |
| 2 胃癌组织中IL-8 的表达与H.pylori感染的相关性 |
| 3 胃癌组织中Wnt2 蛋白的表达与H.pylori感染的相关性 |
| 4 胃癌组织中IL-8与Wnt2表达相关性 |
| 5 H.pylori、IL-8和Wnt2 与胃癌临床、病理指标的关系 |
| 6 H.pylori感染、IL-8和Wnt2 的表达与胃癌的预后分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间完成的科研成果 |
| 致谢 |
（8）转录因子E2F5对三阴性乳腺癌的影响和相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 序言 |
| 第一部分 E2F5的表达及其与乳腺癌临床病理特征的相关性 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.TCGA及 GEO数据库中公共数据的利用 |
| 4.数据的统计分析 |
| 结果 |
| 1.E2F基因家族在乳腺癌中的表达 |
| 2.E2F5蛋白的表达及其与乳腺癌临床病理特征的相关性 |
| 3.E2F5表达水平与乳腺癌预后的相关性 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 E2F5在三阴性乳腺癌中的生物学功能及其机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.数据处理与统计 |
| 结果 |
| 1.过表达E2F5 促进TNBC细胞的增殖 |
| 2.敲降E2F5 表达抑制TNBC细胞的迁移与侵袭 |
| 3.敲降E2F5 表达抑制TNBC细胞的肿瘤干细胞特性 |
| 4.敲降E2F5 表达增加TNBC细胞的化疗敏感性 |
| 5.E2F5 促进TNBC细胞发生上皮-间充质转化 |
| 6.ZEB2在TNBC细胞中受E2F5 的正向调控 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 上皮间质转化与乳腺癌耐药 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读博士期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（9）组成性活化DNMT1沉默miR-34a-5p对肝癌干细胞特性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肝细胞癌与肝癌干细胞 |
| 1.2 表观遗传调控与肿瘤干细胞 |
| 1.3 FoxM1与肿瘤干细胞 |
| 1.4 蔓荆子有效部位及活性成分抗肿瘤作用研究进展 |
| 1.4.1 蔓荆子有效部位抗肿瘤作用及其机制 |
| 1.4.2 紫花牡荆素抗肿瘤作用及其机制 |
| 1.4.3 木犀草素抗肿瘤作用及其机制 |
| 1.4.4 芹菜素抗肿瘤作用及其机制 |
| 1.4.5 芹菜素糖苷类抗肿瘤作用及其机制 |
| 1.5 立题依据和意义 |
| 第二章 DNMT1表观沉默miR-34a促进SMMC-7721源性LCSC特性作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SMMC-7721源性CD133~+肝癌球细胞LCSC特性的鉴定 |
| 2.3.2 地西他滨抑制SMMC-7721源性LCSC特性 |
| 2.3.3 DNMT1敲低抑制SMMC-7721源性LCSC特性 |
| 2.3.4 DNMT1过表达促进SMMC-7721细胞LCSC特性 |
| 2.3.5 miR-34a-5p mimic抑制SMMC-7721源性LCSC特性的作用 |
| 2.3.6 miR-34a-5p inhibitor促进SMMC-7721细胞LCSC特性 |
| 2.3.7 miR-34a-5p mimic救援DNMT1过表达促进SMMC-7721细胞LCSC特性作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 LCSCs的制备 |
| 2.4.2 DNMT1组成性活化促进SMMC-7721源性LCSC特性 |
| 2.4.3 组成性活化DNMT1表观沉默miR-34a-5p促进SMMC-7721源性LCSC特性 |
| 第三章 miR-34a-5p直接靶向抑制FoxM1抑制SMMC-7721源性LCSC特性作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 FoxM1作为miR-34a直接功能靶标的鉴定 |
| 3.3.2 FoxM1敲低抑制SMMC-7721源性LCSC特性 |
| 3.3.3 FoxM1过表达救援miR-34a-5p mimic抑制SMMC-7721源性LCSC特性作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 miR-34a直接靶向FoxM1 |
| 3.4.2 FoxM1促进LCSC特性 |
| 第四章 FVTF调控DNMT1/miR-34a/FoxM1信号轴抑制LCSC干性的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 FVTF抑制SMMC-7721源性LCSC特性作用 |
| 4.3.2 地西他滨增强FVTF抑制LCSC特性 |
| 4.3.3 DNMT1过表达拮抗FVTF抑制SMMC-7721细胞LCSC特性 |
| 4.3.4 miR-34a-5p mimic协作FVTF抑制LCSC特性 |
| 4.3.5 miR-34a-5p inhibitor拮抗FVTF抑制SMMC-7721细胞LCSC特性 |
| 4.3.6 硫链丝菌素(THI)协作FVTF抑制SMMC-7721源性LCSC特性 |
| 4.3.7 FoxM1过表达拮抗FVTF抑制SMMC-7721细胞LCSC特性 |
| 4.3.8 FVTF抑制MHCC97H源性LCSLC特性 |
| 4.3.9 DNMT1、miR-34a和FoxM1表达在肝细胞癌发生中的作用以及对于肝细胞癌病人预后影响的生物信息学分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 FVTF抑制SMMC-7721源性LCSC特性 |
| 4.4.2 FVTF调控DNMT1/miR-34a-5p/FoxM1轴抑制LCSC特性 |
| 4.4.3 DNMT1/miR-34a-5p/FoxM1轴可能是靶向抑制LCSLC特性的新靶点 |
| 第五章 研究结论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表(中英文对照) |
| 攻读博士学位期间撰写和发表的论文 |
| 致谢 |
（10）miR-486-3p特异性过表达系统构建及在癌症中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究目的和意义 |
| 1.2 miRNA概述 |
| 1.2.1 miRNA的发现历程 |
| 1.2.2 miRNA生物起源以及生物学功能 |
| 1.3 miRNA与肿瘤及肿瘤干细胞 |
| 1.3.1 miRNA表达异常与肿瘤 |
| 1.3.2 肿瘤与肿瘤干细胞 |
| 1.3.3 miRNA与肿瘤干细胞 |
| 1.4 miRNA研究方法概述 |
| 1.5 miR-486研究概述 |
| 1.6 本文的主要研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及细胞 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 癌症干细胞的筛选以及培养 |
| 2.2.3 质粒构建 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 病毒颗粒的制备以及稳转细胞系的构建 |
| 2.2.6 细胞活性氧检测 |
| 2.2.7 细胞活力检测 |
| 2.2.8 细胞周期检测 |
| 2.2.9 细胞凋亡检测 |
| 2.2.10 细胞侵袭以及迁移检测 |
| 2.2.11 荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.12 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.13 RT-q PCR |
| 2.2.14 细胞免疫荧光 |
| 2.2.15 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.2.16 裸鼠转移瘤实验 |
| 2.2.17 石蜡包埋切片 |
| 2.2.18 石蜡包埋切片HE染色 |
| 2.2.19 本文主要用的统计分析软件 |
| 第3章 miR-486-3p特异过表达慢病毒系统的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 miR-486-3p在癌症中的表达规律分析 |
| 3.3 传统过表达mi RNA方法未能实现mi R-486-3p特异性过表达 |
| 3.3.1 化学合成mi RNA模拟物未能实现mi R-486-3p的特异性过表达 |
| 3.3.2 病毒介导的pri-mi RNA未能实现特异mi RNA的过表达 |
| 3.4 特异性过表达miR-486-3p慢病毒系统的构建 |
| 3.4.1 sh RNA慢病毒系统用于mi RNA过表达初步探索 |
| 3.4.2 特异性过表达miR-486-3p慢病毒系统的建立 |
| 3.5 miR-486-3p种子区域的突变对下游靶基因的影响分析 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 miR-486-3p对癌细胞生物学特性的影响分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 miR-486-3p在癌症细胞中的表达规律分析 |
| 4.3 miR-486-3p对癌细胞增殖与克隆形成的影响 |
| 4.4 miR-486-3p对癌细胞周期的影响分析 |
| 4.5 过表达miR-486-3p对癌细胞凋亡的影响分析 |
| 4.6 过表达miR-486-3p对癌细胞化疗敏感性的影响分析 |
| 4.7 miR-486-3p对癌细胞形态以及侵袭迁移的影响 |
| 4.8 过表达miR-486-3p对荷瘤鼠皮下成瘤的影响分析 |
| 4.9 本章小结 |
| 第5章 miR-486-3p影响癌症生物学特性的分子机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 RNA-sequencing数据分析以及验证 |
| 5.2.1 过表达miR-486-3p癌细胞差异表达基因分析 |
| 5.2.2 差异基因GO以及KEGG功能富集分析 |
| 5.2.3 RNA-seq数据定量验证 |
| 5.3 miR-486-3p调控信号通路以及靶基因验证 |
| 5.4 靶基因敲低对癌症生物学特性影响及其机制分析 |
| 5.4.1 靶基因敲低对癌细胞周期以及凋亡的影响 |
| 5.4.2 靶基因敲低对癌细胞细胞形态以及侵袭迁移的影响 |
| 5.4.3 靶基因敲低对MAPK信号通路的调控分析 |
| 5.5 miR-486-3p过表达以及靶基因下调对癌细胞体内的转移影响分析 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 过表达miR-486-3p对癌症干细胞的影响分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 模拟肿瘤微环境癌症干细胞筛选平台的建立 |
| 6.3 miR-486-3p以及靶基因下调对癌症干细胞增殖以及体内转移的影响分析 |
| 6.4 mi R-486-3p通过下调靶基因影响MAPK信号通路进而影响癌症干细胞增殖 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 附录 Ⅲ |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、肿瘤干细胞:恶性肿瘤的种子（论文参考文献）
- [1]TLR4对鼻咽癌肿瘤干细胞的影响及其作用机制研究[D]. 王予. 昆明医科大学, 2021(01)
- [2]海洋来源化合物Asperolide A抑制三阴性乳腺癌细胞溶骨性破坏的作用及分子机制研究[D]. 姜文丽. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]新型有机硒化合物CU27通过靶向c-MYC转录功能抑制肝癌转移及肿瘤干细胞性能[D]. 张彪. 军事科学院, 2020
- [4]LRP5基因促进结直肠癌发生的分子机制研究[D]. 刘慧阳. 河南大学, 2020(04)
- [5]源于白钻的Gomisin M2抗乳腺癌干细胞机制及体内抗增殖作用的研究[D]. 杨业国. 华南理工大学, 2020(02)
- [6]cPLA2α调控宫颈癌干细胞不同亚群可逆性转化的机制研究[D]. 贺钰超. 天津医科大学, 2020(06)
- [7]幽门螺杆菌慢性感染与MNNG协同诱导胃黏膜上皮恶性转化的细胞分子机制研究[D]. 蔺莉. 兰州大学, 2020(01)
- [8]转录因子E2F5对三阴性乳腺癌的影响和相关机制研究[D]. 吕庆. 苏州大学, 2019(06)
- [9]组成性活化DNMT1沉默miR-34a-5p对肝癌干细胞特性的影响[D]. 曹晓诚. 湖南师范大学, 2019(04)
- [10]miR-486-3p特异性过表达系统构建及在癌症中的作用及其机制研究[D]. 乔书培. 哈尔滨工业大学, 2019(01)