一、苏云金芽胞杆菌晶体蛋白对羊捻转血矛线虫成虫的作用（论文文献综述）
刘晓艳,闵勇,黄大野,方伟,王开梅,杨自文[1]（2017）在《苏云金芽胞杆菌杀线虫活性因子分析及杀虫机制研究进展》文中研究指明苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）,是一种重要的昆虫病原细菌,对多种农业害虫包括鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目和线虫等具有高特异杀虫活性,是迄今应用最广泛的微生物杀虫剂。本文总结了杀线虫Bt菌株的活性因子种类以及不同类的活性物质杀线虫机制的分析,能够为生物杀线剂的研究与创制提供理论基础。
吕媛[2]（2016）在《苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白结构域Ⅲ的定点突变及结构与功能研究》文中进行了进一步梳理苏云金芽胞杆菌（Bt）是应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于芽胞形成过程中产生的晶体蛋白,研究杀虫晶体蛋白的分子结构与功能的关系越来越受到重视。运用定点突变技术和结合生物信息学技术研究,将有助于明确和阐释伴胞晶体蛋白的结构和功能的关系。本文运用生物信息学技术,证实β20-β21 loop为Cry1Ac5蛋白结构域III中独特的功能环,通过定点突变技术研究了β20-β21 loop的结构和功能间的相互关系,获得了毒力或稳定性提高的突变子,研究内容如下:比较了Cry1A蛋白的各级结构并进一步分析Cry1蛋白结构域III的进化树,确定Cry1Ac5蛋白的结构域III作为研究对象。分析Cry1Ac5结构域III及其β20-β21 loop的特点,发现在H518FPST522、N543WGNSSI549、F578TSSLGN584等区域不同于其它Cry1A蛋白,Cry1Ac5的β20-β21 loop含有高度保守苯丙氨酸、丝氨酸及甘氨酸残基的F578、S581、G583,由此推测F578、S581、G583这三个位点极有可能是关键位点,Cry1Ac5蛋白β20-β21 Loop结构稳定性以及蛋白构象的改变可能此有关,确定以β20-β21 loop为关键,通过定点突变研究其结构与功能的关系。运用定点突变技术对Cry1Ac5的蛋白结构β20-β21 loop上10个残基进行丙氨酸扫描突变,所有突变子包括（N576A、F578A、T579A、S580A、S581A、L582A、G583A、N584A、I585A、V586A）都能表达130 kDa蛋白和产生菱形晶体,室内生测表明,突变子I585A和S581A对棉铃虫的毒力分别提高了1.86倍和1.45倍,而突变子G583A对棉铃虫的毒力则下降明显,其余突变子的毒性也有所下降。对Cry1Ac5蛋白分子的三维结构分析发现,野生型Cry1Ac蛋白的579、580、582、585位置氨基酸的侧链的侧链向外伸向Cry1Ac5蛋白分子的表面,Cry1Ac5蛋白和其受体的相互作用很可能与T579A、S580A、L582A、I585A的功能有关,而其余位置的侧链向内伸向蛋白分子内侧,可能与维持蛋白的结构稳定性有关。对I585进一步突变,构建、表达了I585E、I585F、I585T、I585V突变子,并对其进行了毒力测定:I585F、I585E、I585T的毒力下降明显,而I585V的毒力只略有下降;对I585突变子进行了蛋白酶稳定性和存贮稳定性研究,结果发现I585E、I585T、I585F的蛋白酶及存贮稳定性降低,而I585A的蛋白酶及存贮稳定性均明显提高;I585位的侧链对Cry1Ac5蛋白稳定产生了不利影响,对比野生型Cry1Ac5、I585A的晶体形态及杀虫活性,发现I585A杀虫活性高出野生Cry1Ac1.7倍以上。本研究第一次发现了Cry1Ac5此蛋白其结构域III上的β20-β21loop结构的独特之处,并且,首次报道Cry1Ac5蛋白结构域III中的β20-β21loop结构在Cry1Ac5蛋白功能中发挥的作用,此外,从生物学结构上解释了Cry1Ac5蛋白结构域III是如何与其受体分子进行识别和结合、如何维持蛋白的结构稳定性。
熊静[3]（2014）在《利用蛋白质组学技术研究苏云金杆菌晶体蛋白Cry6Aa2对线虫的作用》文中认为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种革兰氏阳性菌,能产生多种杀虫毒素,其在芽胞形成期产生的晶体蛋白对昆虫的毒力作用被广泛研究,已经被用作防治害虫的生物防治制剂。Cry6Aa2晶体蛋白是苏云金芽胞杆菌产生的一种对线虫具有多种毒力作用的伴胞晶体蛋白,已经有研究报道Cry6Aa2对根结线虫和秀丽小杆线虫都有强毒力作用,其对根结线虫具有强致死作用,对秀丽小杆线虫除了有致死活性外,还能显着抑制其产卵、生长,并导致其运动能力降低。同时当秀丽小杆线虫受到Cry6Aa2攻击时会采取减少摄食、逃逸等方式来逃避毒素的攻击,从而达到保护自己的目的。但是,Cry6Aa2对根结线虫的毒力作用主要包括哪些方面及线虫对Cry6Aa2的防御机制并不清楚。本论文就是针对以上问题检测Cry6Aa2对根结线虫的毒力作用及利用蛋白质组学技术初步研究Cry6Aa2对线虫的作用机制和线虫对Cry6Aa2的防御机制。本文首先用Cry6Aa2对南方根结线虫（Meloidodynidae incognita）进行了致死、孵化、运动及感染等实验,证明Cry6Aa2对南方根结线虫有致死、抑制孵化、抑制线虫运动等多种活性,能阻断根结线虫生活史的多个环节达到防治线虫的效果,存在开发成生物杀线虫剂的潜力。其次,本文利用蛋白质组学技术对Cry6Aa2在对秀丽小杆线虫的作用机制及秀丽小杆线虫防御毒素蛋白中的机制进行了初步的探讨。利用蛋白质组学技术,鉴定出了喂食Cry6Aa2毒素菌的秀丽小杆线虫蛋白质组与对照蛋白质组的10种差异表达蛋白,然后运用qRT-PCR技术鉴定了10种差异蛋白及3种相关蛋白在转录水平上的变化与蛋白表达的相关性,同时还利用突变体秀丽小杆线虫验证了其中3种差异蛋白在Cry6Aa2作用秀丽小杆线虫中所起到的作用。最后的结果显示线虫在防御Cry6Aa2毒素的过程中,产生了热休克应激蛋白,包括HSP-12.2、HSP-6、HSP-25;DIM-1在线虫防御Cry6Aa2中也能起着重要作用；并且,一些与能量相关的途径,如柠檬酸循环,电子传递等途径在线虫防御Cry6Aa2的过程中也出现相应的变化为线虫提供足够的能量。同时,结果显示Cry6Aa2能够刺激DAF-2的上调,抑制DAF-16,因此可能缩短线虫的寿命。本论文首先初步对确定了Cry6Aa2对根结线虫的多种毒力作用,证明Cry6Aa2对根结线虫具有很好的防治效果,但是还需要将Cry6Aa2用于盆栽实验和田间实验,去验证其在盆栽实验和田间实验的效果。其次,该论文初步探索了Cry6Aa2与线虫之间的相互作用,在以后的研究中我们需要对以下几个方面进行深入的探讨：（1）与能量相关的酶及其所在的途径在线虫防御Cry6Aa2毒素时的具体作用过程；（2）DIM-1如何发挥防御Cry6Aa2毒素的作用；（3）Cry6Aa2如何影响线虫寿命。
牛延萍[4]（2012）在《捻转血矛线虫过氧化物酶基因的克隆和5种蛋白的抗原特性分析》文中提出捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属毛圆科（Trichostrongylidae）血矛属（Haemonchus）线虫,是山羊等反刍动物的主要胃肠道寄生虫之一,患病动物通常表现为贫血、消瘦甚至死亡,造成巨大经济损失。目前的主要防治方法是使用化学药物驱虫,但随着抗药性虫株的出现,化学药品治疗正受到严重的挑战,人们正努力寻求通过免疫学的方法,代替化学药物控制该病。目前,捻转血矛线虫免疫学方面的研究已取得了重要进展,但尚无商品化疫苗用于该病的防控。发掘新的抗原、深入研究虫体抗原的特性对其疫苗的研究具有重要意义。本文利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术首次克隆出捻转血矛线虫过氧化物酶（Peroxidase,POD）基因的全长cDNA序列,进行了序列和生物特性分析,并对其在各发育阶段的表达情况进行了定量检测；研究了HC58、Dim-1、Actin、H11-2和ES245种蛋白对山羊外周血淋巴细胞的增值效果和对细胞因子表达情况的变化；对这五种蛋白在捻转血矛线虫雌、雄虫中的分布进行了分析。1捻转血矛线虫过氧化物酶基因克隆及其生物信息学分析根据前期蛋白质谱结果,结合Caenorhabditis briggsae、Caenorhabditis remanei和Caenorhabditis elegans三种线虫的过氧化物酶（Peroxidase）基因保守序列设计引物,从捻转血矛线虫cDNA中扩增出550bp的DNA片段,经克隆测序后以此EST为基础,利用5’RACE和3’RACE技术分别获得该基因的5’端和3’端未知序列,将这些序列拼接后获得捻转线虫HcPOD基因的全长cDNA序列（2734bp）,序列分析发现,该基因含有一个2466bp的最大开放阅读框（ORF）、28bp5’非翻译区和240bp3’非翻译区。根据此ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的cDNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出2451bp的DNA片段,与推导的ORF长度一致,二者序列相似性为98%。利用DNAstar软件,结合网络资源对其分析,发现该基因编码816个氨基酸,推测蛋白的等电点为9.565,分子质量91.8kDa。有多个潜在的生物活性功能位点,蛋白的理化性质稳定。2捻转血矛线虫HcPOD、HC58、Dim-1、Actin、H11和ES24基因阶段性表达特性分析根据本实验室克隆到的捻转血矛线虫的POD、Hc58、Dim-1、Actin、Hll和ES24基因全长序列,设计荧光定量PCR引物。以β-Tubulin基因为内参,对所设计引物的扩增效率进行验证,筛选符合要求的引物,进一步对其在捻转血矛线虫的虫卵期,第三期幼虫,雌虫和雄虫中表达情况进行定量分析。结果显示5种基因在雄虫中表达量显着高于其他3个发育时期；在第三期幼虫中的表达量,除HC58基因是雌虫的1.59倍外,其他5种基因的表达量均比较低；而在虫卵中的表达量,HC58基因最高约为雌虫的7.66倍,Actin基因的最低约为雌虫的0.15倍。3捻转血矛线虫HC58、Dim-1、Actin、H11-2和ES24重组蛋白对山羊外周血淋巴细胞细胞因子表达情况影响根据GenBank中已知的山羊IL-2、 IL-4、 IL-10、 IL-17、 IFN-y、 TGF-p的序列设计荧光定量引物,以β-Actin基因为内参,对所设计引物的扩增效率进行验证,筛选符合要求的引物。用HC58、 Dim-1、 Actin、H11-2和ES24重组蛋白分别分梯度刺激的淋巴细胞cDNA为模板,进行荧光定量试验,以检测细胞因子的表达情况。结果显示,和对照组（空pET28a蛋白组）相比,细胞因子IL-2在HC58（20μg/mL）组表达量极显着高于对照组（p<0.01）; Dim-1（40μg/mL）、Actin（40μg/mL）和ES24（40μg/mL）组的IL-2表达量均极显着高于对照组（p<0.01）；H11-2的两个高浓度组的表达量都比对照组高（p<0.01）。HC58（10μg/mL）、Dim-1（10μg/mL）、Actin （20μg/mL）和ES24（20μg/mL）组IL-4表达量均明显高于对照组（p<0.05）; Dim-1（40μg/mL）和H11-2（40μg/mL）组的表达量极显着高于对照组（p<0.01）。HC58（10μg/mL）和ES24（10μg/mL）组有显着下调IL-10的作用（p<0.05）,而H11-2（20μg/mL）组极显着下调的了IL-10的表达量（p<0.01）; HC58（20μg/mL）、HC58（40μg/mL） Dim-1（40μg/mL）和Actin （40μg/mL）组IL-10表达量极显着高于对照组（p<0.01）Actin （40μg/mL）组的误差比较大。IL-17在Actin （20μg/mL）组的表达量显着高于对照组（p<0.05）,其他的除每种蛋白的0μg/mL组、ES24（10μg/mL）组和ES24（20μg/mL）组外,IL-17的表达量均极显着高于对照组（p<0.01）。HC58（20、40μg/mL）、 Dim-1（20、40μg/mL）、H11-2（10、20、40μg/mL）和Actin （10、20、40μg/mL）组IFN-y表达量极显着高于对照组（p<0.01）; IFN-y在ES24（20μg/mL）组的表达量明显高于对照组（p<0.05）。除Actin （40μg/mL）和ES24（20μg/mL） TGF-β的表达量显着高于对照组外,其他组TGF-p的变化不明显。4捻转血矛线虫HC58、Dim-1、Actin、H11-2和ES24重组蛋白对山羊外周血淋巴细胞的增殖作用为检测重组蛋白HC58、Dim-1、Actin、H11-2和ES24对山羊外周血淋巴细胞的刺激与增殖作用,将这5种重组蛋白与山羊外周血淋巴细胞共培养,用CCK-8法检测其增殖效果。结果发现HC58在浓度为20μg/mL时有明显的增殖效果（p<0.05）H11-2在添加浓度为10μg/mL和20μg/mL时增殖效果显着（p<0.05）,Actin和ES24分别在40μg/mL和20μg/mL时有极显着的增殖效果（p<0.01）。结果说明HC58、Actin、Dim-1、H11-2和ES24均有促山羊外周血淋巴细胞增殖的效应。5HC58、Dim-1、Actin、H11和ES24蛋白在捻转血矛线虫雌、雄成虫中的定位为了研究捻转血矛线虫HC58、Dim-1、Actin、H11、ES24五种蛋白在虫体中的分布与定位情况,我们用SD大鼠制备抗血清,应用即用型SABC免疫组化染色试剂盒检测五种抗原在捻转血矛线虫雌、雄虫中的分布。结果发现,五种蛋白在肠道上均有定位,HC58在雌虫中主要集中肠壁上,在雄虫中除性腺外其他组织也可以看到,但蛋白丰度不如肠道位置高；Actin主要位于雌、雄虫的肠道上,其他的管道也有微弱表达；Dim-1在雌虫虫体的肠壁上有大量表达,而在雄虫肠道中的表达量不如雌虫高；ES24在雌雄虫体内的表达部位较广,除性腺部位外,其他位置均表达,但表达量都不如肠道中的高；蛋白H11位置很单一,只在肠道中表达。
成飞雪,王忠勇,刘勇,张德咏,程菊娥[5]（2011）在《杀线虫苏云金芽胞杆菌菌株YC-10的分离鉴定及活性测定》文中研究说明自烟草中分离获得对南方根结线虫Meloidogyne incognita具有较高杀线活性的拮抗细菌菌株YC-10。研究发现该菌株有伴胞晶体产生,菌体、芽胞形态及生理生化特性与苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种B.thuringiensis subsp.kurstaki相似,16S rDNA序列分析表明其与苏云金芽胞杆菌相似性最高,初步确定该菌株为苏云金芽胞杆菌。菌株发酵液及伴胞晶体蛋白对南方根结线虫J2有很强的杀线活性,发酵液处理南方根结线虫,24h线虫死亡率为100%;伴胞晶体蛋白处理南方根结线虫,24h的LC50为5.86μg.mL-1。研究结果显示该菌株在线虫生物防治上有较大的应用潜力。
刘金辉[6]（2011）在《杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌筛选及特性研究》文中进行了进一步梳理甘薯茎线虫病是制约我国甘薯生产的三大严重病害之一,近年来已成为北方薯区最严重的病害。传统防治甘薯茎线虫病的方法主要有轮作换茬、药剂防治和选育抗病品种等,但因其高投入低效率和产生的环境问题而暴露出很大的局限性。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）由于其特异性的高毒力、对人畜无害和不污染环境等特点,作为农业生产上防治植物寄生线虫的微生物杀虫剂已得到一定应用,但是到目前为止利用Bt防治甘薯茎线虫的研究却未见公开报道。本研究以已经报道的对一些动植物寄生线虫有活性的Bt菌株为供试菌株,筛选得到了对甘薯茎线虫具有高毒力的YBT-008菌株,利用SDS-PAGE、LC-MS和PCR等方法验证了YBT-008可编码的四个杀虫晶体蛋白基因cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba,进而构建重组载体并使其表达,最后分别测定了已表达蛋白对甘薯茎线虫的杀虫活性,旨在寻找到杀甘薯茎线虫的Bt新型基因和蛋白资源。1.筛选了一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008。初筛以已经报道的对动植物寄生线虫有活性的12株Bt菌株为供试菌株,提取其杀虫晶体蛋白,分别测定在3d和7d时对供试线虫的致死率；初筛得到了三株对供试线虫致死率在50%以上的Bt菌株；将其生测样品稀释两倍后,按同样方法进行生物测定,此为复筛。通过初筛和复筛我们得到了一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008,相较其余菌株杀虫效果明显,其对甘薯茎线虫的LC50值为203.76μg/mL。2.验证了YBT-008可编码的四个杀虫晶体蛋白基因。镜检观察到YBT-008在芽胞形成过程中可形成具明显形态特征的伴胞晶体蛋白,通过SDS-PAGE和LC-MS分析,鉴定出YBT-008可产生Cry4Aa、Cry4Ba、Cry11Aa和Cyt2Ba四种杀虫晶体蛋白：设计特异性引物对,对上述四个杀虫晶体蛋白基因的PCR扩增进步验证了YBT-008基因组内含有cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba杀虫晶体蛋白基因。3.克隆并表达了cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba四个杀虫晶体蛋白基因。设计带酶切位点的特异性引物扩增上述四个基因的全长编码序列,将其连接到穿梭载体pHT304上,并转化到Bt无晶体突变株BMB171中,镜检和SDS-PAGE结果表明上述四个蛋白均已获得表达。4.检测了Cyt2Ba和Cry4Ba对甘薯茎线虫的杀虫活性。提取上述表达成功的晶体蛋白,分别检测了其对甘薯茎线虫的杀虫活性,结果表明Cyt2Ba在3d和7d时的杀虫效果明显,Cry4Ba的杀虫效果并不明显；因Cry11Aa和Cry4Aa的表达量不高,因此其表达系统还有待于进一步的优化,然后再检测其杀虫活性。
逯晋忠[7]（2010）在《苏云金芽胞杆菌对云斑天牛的抗性研究》文中研究指明研究表明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）对鞘翅目害虫有较好的防治效果。为获得对鞘翅目天牛科害虫云斑天牛（Batocera horsfieldi （Hope））具有高毒力的Bt菌株,我们用本室所保存的504株苏云金芽胞杆菌对云斑天牛成虫进行了生物测定和抗虫机理方面的研究,结果如下：（1）高毒力菌株的筛选：通过一次初筛和两次复筛生物测定,筛选到一株对云斑天牛成虫有较高毒力的菌株ZQ-89。感染喂养20天后校正死亡率达到55.33%,校正体重减少率为2.22%,产卵减少率为19.62%。ZQ-89不仅对天牛有较高的抗性,而且对天牛的生长量和繁殖力都有较高的抑制作用。（2）ZQ-89抗虫机理的初步研究：从感染ZQ-89菌株死亡的天牛肠道中分离到苏云金芽胞杆菌FZQ-89,对其菌体、芽胞及晶体蛋白的形态进行观察,生测验证和16SrDNA鉴定后发现,FZQ-89与ZQ-89菌株具有极高的相似性,因此判断FZQ-89系ZQ-89感染天牛后在体内繁殖的子代菌株,由此推测苏云金芽胞杆菌可通过天牛取食进入其肠道而发挥抗虫作用。（3）ZQ-89杀虫活性成分的研究：发现在同等浓度下,纯晶体蛋白的杀虫活性最高。推测晶体蛋白在ZQ-89对云斑天牛成虫的抗性作用中起到了主要作用。检测晶体蛋白对天牛的抗性,计算出ZQ-89对天牛的致死中浓度LCso为21.961 mg/mL（4）ZQ-89菌株抗虫基因的克隆和序列分析：对ZQ-89所产晶体蛋白进行肽指纹图谱分析,发现其与苏云金芽胞杆菌Cry1Ac类蛋白有较高的同源性。根据同源性蛋白设计引物,克隆到全长为3534 bp的抗性基因,命名为cry1Ac-89基因,编码1177个氨基酸。（5）ZAC-89工程菌的构建：将cry1Ac-89基因克隆到载体pHT304中,将其转入无晶体突变株BMB171中,对其所产晶体形状进行了观测,发现与ZQ-89相似,都是菱形；SDS-PAGE检测后发现,ZAC-89所产晶体蛋白大小和ZQ-89一样,都为133 kDa。推测ZAC-89可能与ZQ-89有相同的杀虫效果,在防治云斑天牛危害方面有着潜在的应用价值。
周前进[8]（2010）在《利用秀丽隐杆线虫表达捻转血矛线虫H11蛋白的转基因研究》文中研究说明捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是牛、羊等反刍动物的主要寄生性线虫,寄生于动物皱胃粘膜的表面,引起捻转血矛线虫病,导致动物出现贫血、消瘦,甚至引起死亡。使用抗蠕虫药物是目前防治该病的主要措施,但线虫耐药性的日益严重迫切需要发展新的防治策略,疫苗作为一种新的有效的防治策略,具有广阔的应用前景。由于线虫具有复杂的生活史,抗原成分繁多,到现在为止,还没有一种线虫疫苗应用于生产。氨肽酶H11是捻转血矛线虫L4幼虫和成虫阶段表达的一种整合膜蛋白,被认为是目前为止免疫效果最好的一种候选抗原（减卵率>90%,减虫率>75%）,而利用大肠杆菌和昆虫杆状病毒系统表达的重组形式均不能引起有效的免疫保护。秀丽隐杆线虫因其与寄生性线虫在进化上的近缘性,被认为是研究寄生性线虫基因功能和表达寄生性线虫疫苗候选抗原的理想系统。本研究的主要目的是：探明捻转血矛线虫疫苗候选抗原基因H11的基因组结构特征；同时以秀丽隐杆线虫为模式,建立研究寄生性线虫基因功能和表达寄生性线虫疫苗候选抗原的转基因技术体系；在此基础上分析H11基因5’侧翼区序列的启动子转录活性,研究利用建立的转基因技术体系,表达H11基因的可行性,为寄生性线虫的疫苗研制提供新方法。1.捻转血矛线虫疫苗候选抗原基因H11的基因组结构分析参照已发表的捻转血矛线虫疫苗候选抗原H11的基因序列,以捻转血矛线虫ZJ株的总RNA为模板,进行RT-PCR扩增,成功扩增出H11基因。对H11及其同源类似物进行比对分析,发现H11含有一个锌指结合基序HEXXHXW,具有典型的微粒体氨肽酶结构域特征。通过在功能域保守区域设计特异性引物,利用长距离PCR技术和基因步移技术,成功获得了H11的基因组序列。结果表明,H11的ORF大小为2919 bp,编码972个氨基酸；获得的H11基因组大小为14959 bp,拥有25个外显子和24个内含子,内含子和外显子之间具有典型的GT……AG结构。捻转血矛线虫H11基因组序列的获得为我们进一步开展H11的相关研究提供了重要素材。2.以秀丽隐杆线虫为模式,建立研究寄生性线虫基因功能和表达寄生性线虫疫苗候选抗原的转基因技术体系为建立秀丽隐杆线虫的转基因技术体系,利用PCR技术从秀丽隐杆线虫基因组DNA中扩增获得Act-1基因的核心启动子序列、T07F10.lA基因的核心启动子序列与3’UTR的Poly （A）信号序列,以及从表达载体pEGFP-N1上扩增获得SV40早期mRNA的Poly （A）信号序列与EGFP基因。以pBluescript SK+或pEGFP-4.1为基本载体骨架,分别构建由Act-1基因的核心启动子序列、T07F1O.lA基因的核心启动子序列调控,EGFP作为报告基因的重组表达载体。通过显微注射将重组载体与Marker质粒pRF4共注射到秀丽隐杆线虫性腺,结果发现重组载体Pact-EGFP中Act-1基因的核心启动子能够指导EGFP在秀丽隐杆线虫的皮层、副皮层以及咽部表达。利用脂质体介导转染Vero细胞,发现重组载体Pact-EGFP和pB-Pact-EGFP-SV40T中的核心启动子能够指导EGFP在Vero细胞中表达,但表达强度具有较大的差异,表明秀丽隐杆线虫Act-1基因的核心启动子区域上游以及基因下游的转录终止信号区域可能存在与转录水平密切相关的独特的转录调节元件。该研究为进一步实现寄生性线虫基因在秀丽隐杆线虫体内的表达奠定了基础。3.利用建立的转基因技术体系,分析H11基因5’侧翼区序列的启动子转录活性为进一步分析H11基因的5’侧翼区的转录活性,在获得的H11基因组序列的基础上,再次利用基因步移技术扩增5’上游的部分基因组序列,确认H11基因5’侧翼区大小为1517 bp；同时获得了H11亚型H11-4最后一个外显子和3’UTR序列,发现H11-4基因与H11基因在染色体上不仅是连锁的,而且具有相同的基因延伸方向。将获得的5’侧翼区序列单独或联合H11基因的前两个外显子、第一内含子以及第二内含子的部分序列克隆到表达载体ppd95.77 GFP基因的上游,显微注射到线虫的性腺。结果表明H11基因5’侧翼区序列能够指导GFP在秀丽隐杆线虫L4幼虫和成虫肠管的前端和末端特异性表达,且显示出与H11在捻转血矛线虫体内不完全相同的表达模式；H11的部分外显子和内含子序列在秀丽隐杆线虫体内不能实现正确的剪接,这可能与H11是捻转血矛线虫寄生阶段特异性表达的蛋白有关。4.利用建立的转基因技术体系,筛选用于指导H11疫苗候选抗原表达的启动子序列,并在该启动子的指导下实现H11基因在秀丽隐杆线虫体内的表达选择秀丽隐杆线虫体内H11的同系物T07F1O.1a基因以及肠道特异性表达的cpr-1和elt-2基因的5’侧翼区序列作为筛选对象,用以在秀丽隐杆线虫体内表达H11疫苗候选抗原。T07F10.1α、cpr-1和elt-2基因的1885 bp、1985 bp和1998 bp的5’侧翼区序列克隆到表达载体ppd95.77 GFP基因的上游,显微注射到线虫的性腺。结果显示,在T07F10.1a基因的5’侧翼区的转录下, GFP能够在秀丽隐杆线虫除去胚胎期的整个生命周期中都有表达,表达部位主要集中在秀丽隐杆线虫的尾部神经元、咽部、分泌细胞、肠道细胞以及神经系统；在cpr-1基因的5’侧翼区的转录下,GFP能够特异性的在线虫的整个肠道表达,尤其在L4幼虫和成虫阶段,GFP呈现较高强度的表达；在elt-2基因的5’侧翼区的转录下GFP能够在L3幼虫到成虫阶段的肠道表达,且呈现明显的区段性,即肠道最前端的肠环1（int1,前肠）、中肠（肠道最中间的部分）以及肠道末端,尤其int1位置的GFP呈现较高强度的表达,但表达强度与部位因虫体个体不同有较大差异。根据GFP表达的组织定位、L4幼虫和成虫阶段GFP的表达强度以及虫体表达GFP的稳定性等差异,最后采用cpr-1的5’侧翼区序列作为在秀丽隐杆线虫表达H11的启动子。在已获得的重组载体cpr-1 5’侧翼区∷GFP基础上,利用特异性引物ppdF/ppdR,在高保真酶作用下,通过长距离PCR扩增切除GFP基因,进行载体自连、环化,同时在载体上引入SacⅠ.SaccⅡ等4个酶切位点构建重组表达载体cpr-pPD95.77（G-）；通过引入EGFP基因对重组载体验证后,利用SacⅠ和SacⅡ限制性内切酶将基因两端加有6×His标签的H11及其部分基因片段Trans-HSP分别引入重组表达载体。cpr-pPD95.77（G-）中crp-1 5’则翼区能够指导EGFP在秀丽隐杆线虫的肠道特异性表达表明改造后的重组载体在秀丽隐杆线虫体内具有表达外源基因的功能。Western-blot分析结果显示,在cpr-1 5’侧翼区的启动下,H11基因在秀丽隐杆线虫体内没有明显表达,而Trans-HPS能够在秀丽隐杆线虫体内表达；尽管His单克隆抗体与多克隆抗体能够检测到大小一致的特异性目的条带,利用镍琼脂糖凝胶的方法却未能实现对Trans-HPS的纯化,因此,我们选择Trans-HPS转基因线虫的全虫抗原作为免疫原进行动物免疫保护性试验。5.利用获得的转基因蛋白免疫山羊,比较分析免疫保护效果采用液体培养的方法大量获取转基因表达Trans-HPS蛋白的秀丽隐杆线虫成虫,制备全虫抗原,以250μg/只的剂量免疫山羊,加强免疫一次,用捻转血矛线虫L3幼虫5000条/只的感染强度感染山羊,结合各种指标检测含有Trans-HPS蛋白的全虫抗原的免疫保护效果。ELISA检测结果表明首免后两周既可检测到较高的IgG抗体水平,二免后两周达到高峰,二免后7周抗体水平仍可维持较高水平；外周血淋巴增殖试验结果显示,Trans-HSP蛋白能够显着增强Trans-HPS蛋白免疫组（p<0.01）和HPS蛋白免疫组（p<0.05）淋巴细胞的增殖活性；对不同免疫组山羊排出虫卵数、幼虫孵化率和成虫数进行统计分析,发现Trans-HPS蛋白免疫组减卵率为41.4%,且能明显延缓排卵高峰期的到来；Trans-HPS蛋白免疫组成虫减少率为17.79%,与感染阳性组比较差异不显着。综上,本研究首次获得了H11的基因组序列,发现了亚型H11-4与H11之间的基因连锁现象；建立了以秀丽隐杆线虫为模式的转基因技术体系,利用该体系成功实现了H11部分基因片段Trans-HPS的转基因表达,并对该转基因表达蛋白的免疫保护性进行了评估。本研究为开发寄生性线虫疫苗提供了新技术,为进一步研究寄生性线虫的基因功能奠定了理论基础。
徐金华[9]（2009）在《苏云金杆菌对松墨天牛及松材线虫的毒力研究》文中指出苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）简称Bt,在形成芽孢的同时会在菌体的一端或两端形成蛋白晶体,这种蛋白晶体被称为杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins, ICPs）或δ-内毒素（delta-endotoxin）。因ICPs具有杀虫高效、广谱,对人畜无害等优点,Bt已广泛应用于害虫防治。本研究对松墨天牛（Monochamus alternatus）进行了室内常年人工饲养;17个苏云金杆菌菌株对松墨天牛及松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）进行了室内毒力实验;研究并分析了毒力菌株生物学特性和伴孢晶体蛋白。初步得到以下结论:（1）通过饲养成功建立了稳定的实验种群,实现了室内常年人工饲养,保证了实验虫源的供应。说明该人工饲料是松墨天牛的成功饲料。明确了人工饲养条件下其各种生物学指标。（2）对17个苏云金杆菌菌株的初筛,发现菌株RBT-200701、RBT-200702的孢晶混合物对松墨天牛的毒杀活性较高,对松墨天牛23龄幼虫的校正死亡率都大于70%;未死亡幼虫不能正常取食、蜕皮、生长。进一步测定发现菌株孢晶混合物在测定的浓度范围内（2000125μg·g-1）和时间范围内（020d）,其浓度的对数和松墨天牛的校正死亡率呈正相关,随时间延长杀虫效果提高。（3）菌株RBT-200701、RBT-200702孢晶混合物对松墨天牛23龄幼虫引起的明显拒食现象,进而影响幼虫正常的生长发育,同样起到了阻碍害虫取食危害的作用。SDS-PAGE蛋白分析发现2个菌株的电泳图谱相同,都有2条明显的条带,分子量分别为65KD、140KD左右。（4）菌株RBT-200701、RBT-200702形态特征基本相同,主要区别是营养细胞平均长度RBT-200702比RBT-200701大10μm左右;RBT-200702产生的伴孢晶体少数游离,主要是长方形,而RBT-200701产生的大多数游离,主要是菱形。（5）菌株RBT-200701、RBT-200702最优发酵条件为30℃、pH7.2、200r·min-1振荡培养36h。（6）17个苏云金杆菌菌株对松材线虫的毒力测定表明菌株RBT-200701、020对松材线虫有明显毒杀作用,校正死亡率分别大于70%、80%。020菌株伴孢晶体蛋白24h、48h时对松材线虫的LC50分别为183.20μg·mL-1、80.13μg·mL-1;RBT-200701菌株伴孢晶体蛋白24h、48h时对松材线虫的LC50分别为368.00μg·mL-1、82.73μg·mL-1。SDS-PAGE电泳分析发现2个菌株的电泳图谱不同,020有一条清晰的蛋白条带,分子量为90KD左右,RBT-200701有2条清晰的条带,分子量分别为65KD和140KD左右。
吴昌标[10]（2009）在《源自动物粪便的Bt分离鉴定及对鸡球虫的作用效应研究》文中研究说明鸡球虫病是一种重要的寄生虫病,分布广,感染率高,常发生在15-50日龄的雏鸡,若不能有效控制,其现场发病率可达50%-70%,死亡率可达20%-30%,严重爆发时其死亡率可高达80%。据统计,全球养鸡业每年仅球虫病造成经济损失就达80亿美元。目前对该病的防治仍以化学合成药及抗生素为主,但由于长期应用,易产生抗药性,且在畜产品中因药物残留而影响人类的健康。因此,人们将目光转向非抗生素防治研究。苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）晶体蛋白是广泛使用的微生物杀虫剂,与化学药物相比较,由于其对脊椎动物无毒性而选择性地作用于害虫、对环境无污染且能通过转基因技术应用于农作物而持久地发挥植物保护作用,这些毒素已被应用于有机农业。近些年来的研究证实,其对动物寄生虫也有强效作用。有关Bt对鸡球虫的作用,国内外尚未见报道。为了寻求新的苏云金杆菌菌株,本研究对动物园动物粪便中Bt进行调查。从福建省福州市动物园和三明市动物园41种动物（其中哺乳动物33种、禽类8种）50个粪便样品中共分离到253株芽胞杆菌,其中有15株含有晶体蛋白,确定为Bt,Bt分离率为30%。在所分离的粪便样品中,采自草食动物粪便的Bt分离率最高,达35.5%;其次是杂食动物粪便的Bt分离率为25%,肉食性动物粪便的Bt分离率最低,仅18.2%。结果表明,植物源日粮动物粪便中的Bt含量较高。采用单卵囊分离技术,从福建省莆田市、福清市和连江县等地鸡场采集的病鸡盲肠内容物样品中,分离获得3株（PT0705、FQ0709、LJ0711）柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）纯种;为比较这三种虫株对雏鸡的毒性,分别用1×104、5×104和10×104个孢子化卵囊的剂量感染14日龄和21日龄健康无球虫感染雏鸡,通过临床表现、死亡率、增重情况、病变计分等指标比较,发现PT0705虫株呈现最强毒性。用鸡胚感染柔嫩艾美耳球虫子孢子作为苏云金杆菌晶体蛋白抗球虫活性测定的模型。每一鸡胚接种1×104个子孢子,于感染前24h注入苏云金杆菌晶体蛋白,以不同苏云金杆菌晶体蛋白对鸡胚卵囊所产生的抑制率的差异,判定苏云金杆菌的活性。结果表明,各种苏云金杆菌晶体蛋白对球虫卵囊都有一定抑制作用,其中苏云金杆菌BT6菌株作用尤其明显。根据实验结果,我们认为本方法具有操作简单,结果可信及成本低廉的特点,可作为抗球虫苏云金杆菌的筛选方法。为比较苏云金杆菌晶体蛋白和化学抗球虫药对鸡球虫病的疗效。将50只雏鸡随机均分为5组,Ⅰ组为无感染不用药空白对照组,Ⅱ-Ⅳ组各鸡均感染,每只鸡人工感染柔嫩艾美耳球虫PT0705卵囊10×104个,Ⅱ组为不用药对照组,Ⅲ组为苏云金杆菌晶体蛋白组,Ⅳ组为地克珠利组,Ⅴ组为氨丙啉组,观察效果。苏云金杆菌晶体蛋白组与地克珠利组和氨丙啉组的抗球虫指数（ACI）分别为202.3、184.1和128.2,说明苏云金杆菌晶体蛋白的抗球虫效果明显优于这两种化学药物,其中地克珠利仍属高效抗球虫药,但氨丙啉的ACI仅为128.2,为低效抗球虫药;Ⅲ组雏鸡平均增重量为458.9 g,经t检验,与Ⅰ组、Ⅳ组比较差异显着（p<0.05）,与Ⅱ组、Ⅴ组比较差异极显着（p<0.01）。试验表明,苏云金杆菌晶体蛋白对雏鸡球虫病有防治作用,并有促进雏鸡生长的作用。为了解BT6菌株的生物学特性,对其进行了形态学、生理生化指标研究;通过PCR-RFLP鉴定体系对其cry基因型进行分析。结果表明:该菌株含有cry1Aa,cry1Ba,cry1Ea和cry1Ia类基因。所有结果证明,苏云金杆菌BT6是鸡球虫的敏感高效菌株。BT6菌株晶体蛋白对鸡柔嫩艾美耳球虫有较好的毒杀作用,而且对鸡无毒副作用,因而具有广泛地应用于鸡生产的兽医临床实际的前景。
二、苏云金芽胞杆菌晶体蛋白对羊捻转血矛线虫成虫的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、苏云金芽胞杆菌晶体蛋白对羊捻转血矛线虫成虫的作用（论文提纲范文）
（1）苏云金芽胞杆菌杀线虫活性因子分析及杀虫机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 Bt杀线虫的种类 |
| 2 Bt杀线虫晶体蛋白基因 |
| 3 Bt中其他杀线虫活性成分 |
| 4 Bt中活性因子的杀线虫机制 |
| 4.1 杀虫晶体蛋白的穿孔机制 |
| 4.2 苏云金素的RNA聚合酶抑制机制 |
| 4.3 蛋白酶和几丁质酶的降解机制 |
| 5 结语 |
（2）苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白结构域Ⅲ的定点突变及结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表(中英文对照) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 Bt生物学特性及分类 |
| 1.1.1 Bt生物学特性 |
| 1.1.2 Bt分类 |
| 1.1.3 Bt活性谱 |
| 1.1.4 Bt产生的活性物质 |
| 1.2 Bt产生的杀虫晶体蛋白及其编码基因 |
| 1.2.1 杀虫晶体蛋白及其编码基因的应用 |
| 1.2.2 杀虫晶体蛋白及其编码基因 |
| 1.2.3 杀虫晶体蛋白基因的分类 |
| 1.2.4 杀虫晶体蛋白的结构与功能 |
| 1.3 Bt产生的营养期杀虫蛋白及其编码基因 |
| 1.3.1 营养期杀虫蛋白蛋白及其编码基因的应用 |
| 1.3.2 营养期杀虫蛋白蛋白及其编码基因 |
| 1.3.3 营养期杀虫蛋白基因的分类 |
| 1.3.4 营养期杀虫蛋白蛋白的结构与功能 |
| 1.4 Bt产生的伴胞蛋白（PS）及其编码基因 |
| 1.4.1 伴胞蛋白对癌细胞的活性 |
| 1.4.2 伴胞蛋白及其编码基因 |
| 1.4.3 伴胞蛋白基因的分类 |
| 1.4.4 伴胞蛋白的结构与功能 |
| 1.5 Bt杀虫晶体蛋白基因的高效表达 |
| 1.5.1 高效目的基因的克隆 |
| 1.5.2 目的基因的改造 |
| 1.5.3 高表达载体的构建 |
| 1.5.4 增效基因的转录调控 |
| 1.6 Bt杀虫晶体蛋白的改造 |
| 1.6.1 定点突变的研究进展 |
| 1.6.2 杀虫晶体蛋白结构域Ⅰ的改造 |
| 1.6.3 杀虫晶体蛋白结构域Ⅱ的改造 |
| 1.6.4 杀虫晶体蛋白结构域Ⅲ的改造 |
| 1.6.5 突变蛋白对提高活性、延缓抗性、扩大杀虫谱的影响 |
| 1.7 苏云金芽胞杆菌在医学上的研究和应用进展 |
| 1.7.1 苏云金芽胞杆菌防治医学昆虫 |
| 1.7.2 苏云金芽胞杆菌抗寄生虫的作用 |
| 1.7.3 Bt抗癌作用的展望 |
| 1.8 立题依据和意义 |
| 第二章 Cry1Ac5蛋白的分析和突变位点确定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 Cry1Ac5蛋白序列 |
| 2.1.2 软件和数据库 |
| 2.1.3 分析方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Cry1Ac5蛋白与其它Cry1A蛋白的比较 |
| 2.2.2 三维结构特征 |
| 2.2.3 Cry1Ac5蛋白结构域Ⅲ的特点 |
| 2.2.4 β20-β21 loop在Cry1Ac5蛋白三维结构中的位置 |
| 2.2.5 β20-β21 loop的特点及作用 |
| 2.2.6 Cry1Ac5与其它Cry蛋白的β20-β21 loop比较 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Cry1Ac5蛋白β20-β21 loop丙氨酸扫描突 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Cry1Ac蛋白的丙氨酸扫描突变 |
| 3.2.2 突变子表达载体的构建 |
| 3.2.3 突变子在cry-B宿主菌中的表达 |
| 3.2.4 突变株生物活性测定分析 |
| 3.2.5 软件分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 PCP定点突变原理 |
| 3.3.2 突变效果 |
| 3.3.3 突变前后的变化 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 I585的定点突变及其功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 I585在Cry1Ac5三维结构中的作用 |
| 4.2.2 突变子的测序结果分析 |
| 4.2.3 I585突变子镜检和SDS-PAGE验分析 |
| 4.2.4 生测分析 |
| 4.2.5 毒蛋白的纯化 |
| 4.2.6 稳定性分析 |
| 4.2.7 突变前后结构变化比较 |
| 4.2.8 I585A与野生Cry1Ac晶体的形态比较 |
| 4.2.9 荧光光谱分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 I585 在Cry1Ac5蛋白中的作用 |
| 4.3.2 I585 突变稳定性和杀虫活性之间的联系 |
| 4.3.3 I585A增强蛋白稳定性的意义 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 主要结论和今后的研究设想 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 本研究的创新点和科学意义 |
| 5.3 下一步的研究设想 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间撰写和发表的论文 |
| 致谢 |
（3）利用蛋白质组学技术研究苏云金杆菌晶体蛋白Cry6Aa2对线虫的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 根结线虫的防治进展 |
| 1.1 根结线虫的危害 |
| 1.2 根结线虫的防治 |
| 2 苏云金芽胞杆菌杀线虫机制的研究 |
| 2.1 苏云金芽胞杆菌的生物学特征、分布及产生的活性物质 |
| 2.2 苏云金芽胞杆菌杀线虫的研究进展 |
| 3 秀丽小杆线虫简介 |
| 4 蛋白质组学的应用与发展 |
| 5 立题目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 抗生素浓度 |
| 1.4 PCR引物合成 |
| 1.5 主要试剂盒和试剂 |
| 1.5.1 主要试剂盒 |
| 1.5.2 主要试剂 |
| 1.6 主要仪器 |
| 1.7 相关溶液的配制 |
| 1.7.1 Cry6Aa2对根结线虫的孵化率、半致死率、运动和感染实验的试剂配制 |
| 1.7.2 双向电泳实验及质谱相关溶液 |
| 1.7.3 秀丽小杆线虫RNA提取及荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂的配制 |
| 1.7.4 Cry6Aa2对秀丽小杆线虫突变体LC_(50)测定试剂的配制 |
| 2 实验路线 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 Cry6Aa2对根结线虫的孵化率、半致死率、运动和感染实验 |
| 3.1.1 Cry6Aa2晶体蛋白的纯化 |
| 3.1.2 蛋白含量的测定 |
| 3.1.3 Cry6Aa2对根结线虫孵化率影响的实验 |
| 3.1.4 根结线虫二龄幼虫的获得 |
| 3.1.5 Cry6Aa2对根结线虫半致死率实验 |
| 3.1.6 Cry6Aa2对根结线虫运动恢复能力的影响 |
| 3.1.7 Cry6Aa2对根结线虫感染实验的影响 |
| 3.2 双向电泳秀丽小杆线虫蛋白样品的制备 |
| 3.2.1 Cry6Aa2的IPTG诱导表达 |
| 3.2.2 秀丽小杆线虫四龄幼虫的获得 |
| 3.2.3 秀丽小杆线虫蛋白的提取及样品蛋白的SDS-PAGE检测 |
| 3.3 双向电泳 |
| 3.3.1 等点聚焦 |
| 3.3.2 IPG胶条的平衡 |
| 3.3.3 第二向SDS-PAGE |
| 3.3.4 银染 |
| 3.3.5 凝胶图像扫描 |
| 3.3.6 双向电泳图谱分析 |
| 3.3.7 质谱样品准备及鉴定 |
| 3.3.8 生物信息学软件分析 |
| 3.4 秀丽小杆线虫RNA提取和qRT-PCR |
| 3.4.1 秀丽小杆线虫的获取 |
| 3.4.2 秀丽小杆线虫RNA提取 |
| 3.4.3 秀丽小杆线虫RNA检测 |
| 3.4.4 qRT-PCR检测 |
| 3.5 Cry6Aa2晶体蛋白对秀丽小杆线虫突变体的毒力测定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 Cry6Aa2对根结线虫的作用 |
| 1.1 Cry6Aa2晶体蛋白的提取及纯化 |
| 1.2 Cry6Aa2对根结线虫虫卵孵化率的抑制 |
| 1.3 Cry6Aa2对二龄根结线虫的毒力作用 |
| 1.4 Cry6Aa2对二龄根结线虫运动的抑制 |
| 1.5 Cry6Aa2对二龄根结线虫感染效率的抑制 |
| 2 秀丽小杆线虫蛋白组的双向电泳分析和质谱鉴定 |
| 2.1 Cry6Aa2在BL21中的诱导表达 |
| 2.2 SDS-PAGE检测秀丽小杆线虫蛋白质组 |
| 2.3 双向结果图包括差异点分析 |
| 3 差异蛋白质谱鉴定结果及差异蛋白的功能分析 |
| 3.1 差异蛋白质谱鉴定结果 |
| 3.2 差异蛋白的功能分析 |
| 4 利用qRT-PCR技术,检测差异蛋白点在转录水平上的差异 |
| 4.1 秀丽小杆线虫总RNA提取检测 |
| 4.2 利用qRT-PCR检测处理和对照组秀丽小杆线虫蛋白质组中10种差异蛋白及3种相关蛋白在转录水平上差异 |
| 5 对秀丽小杆线虫突变体活力测定的结果 |
| 第四章 讨论 |
| 1 Cry6Aa2对南方根结线虫(M.incognita)的作用 |
| 2 对Cry6Aa2毒素在对秀丽小杆线虫的作用机理及秀丽小杆线虫防御毒素蛋白机制的初步探讨 |
| 2.1 热休克蛋白 |
| 2.2 能量代谢酶 |
| 2.3 DIM-1蛋白 |
| 2.4 与线虫寿命相关的蛋白 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文专利 |
| 课题受资助的基金项目 |
（4）捻转血矛线虫过氧化物酶基因的克隆和5种蛋白的抗原特性分析（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫及捻转血矛线虫病概述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 虫体形态特征 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.2 捻转血矛线虫病 |
| 1.2.1 症状及病理变化 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 诊断与防控 |
| 参考文献 |
| 第二章 捻转血矛线虫的免疫机理 |
| 2.1 排斥免疫反应 |
| 2.2 细胞反应 |
| 2.2.1 肥大细胞和嗜酸性粒细胞 |
| 2.2.2 T淋巴细胞和细胞因子的合成与调节 |
| 2.3 体液反应 |
| 2.4 免疫记忆 |
| 2.5 遗传因素 |
| 参考文献 |
| 第三章 捻转血矛线虫HcPOD、HC58、Actin、Dim-1、H11和ES24基因的研究进展 |
| 3.1 过氧化物酶 |
| 3.2 肌动蛋白(Actin) |
| 3.3 H11 |
| 3.4 ES24 |
| 3.5 HC58 |
| 3.6 Dim-1 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 捻转血矛线虫过氧化物酶基因克隆及其生物信息学分析 |
| 摘要 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 生物信息学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 捻转血矛线虫POD基因全长cDNA的扩增 |
| 4.2.2 HcPOD基因的生物信息学分析 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第五章 捻转血矛线虫HcPOD、HC58、Dim-1、Actin、H11和ES24基因阶段性表达特性分析 |
| 摘要 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 六种基因荧光定量PCR各引物扩增效率验证试验 |
| 5.2.2 HcPOD、Hc58、Dim-1、Actin、H11和ES24基因在捻转血矛线虫各期cDNA中荧光定量结果 |
| 5.3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第六章 捻转血矛线虫HC58、Dim-1、Actin、H11-2和ES24重组蛋白对山羊外周血淋巴细胞细胞因子表达情况影响 |
| 摘要 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 重组质粒的酶切验证 |
| 6.2.2 重组蛋白表达 |
| 6.2.3 荧光定量PCR各引物扩增效率 |
| 6.2.4 不同重组蛋白刺激后细胞因子的表达情况 |
| 6.4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第七章 捻转血矛线虫HC58、Dim-1、Actin、H11-2和ES24重组蛋白对山羊外周血淋巴细胞的增殖作用 |
| 摘要 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 重组质粒的小量提取及双酶切鉴定 |
| 7.2.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 7.2.3 重组蛋白的变性、复性 |
| 7.2.4 重组蛋白对山羊淋巴细胞的增殖试验 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 重组蛋白对山羊淋巴细胞的增殖试验 |
| 7.4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第八章 HC58、Dim-1、Actin、H11和ES24蛋白在捻转血矛线虫雌、雄成虫中的定位 |
| 摘要 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 本论文的创新点 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（5）杀线虫苏云金芽胞杆菌菌株YC-10的分离鉴定及活性测定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源及培养基 |
| 1.2 芽胞杆菌菌株的分离与杀线菌株的筛选 |
| 1.3 YC-10菌株的鉴定 |
| 1.3.1 形态特征 |
| 1.3.2 生理生化特性 |
| 1.3.3 16S r DNA序列的测定分析 |
| 1.4 YC-10菌株伴胞晶体检测 |
| 1.5 YC-10菌株生物活性测定 |
| 1.5.1 发酵滤液杀线活性测定 |
| 1.5.2 伴胞晶体蛋白杀线活性测定 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 杀线虫细菌菌株的分离 |
| 2.2 YC-10菌株的鉴定 |
| 2.2.1 形态鉴定 |
| 2.2.2 生理生化特征 |
| 2.2.3 16S r DNA序列同源性分析和系统发育树分析 |
| 2.3 YC-10菌株的伴胞晶体蛋白 |
| 2.4 YC-10菌株的生物活性 |
| 2.4.1 发酵滤液对南方根结线虫J2幼虫的活性 |
| 2.4.2 伴胞晶体蛋白对南方根结线虫J2幼虫的活性 |
| 3 讨论 |
（6）杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌筛选及特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 甘薯茎线虫病及其防治 |
| 1.1.1 引言 |
| 1.1.2 甘薯茎线虫病的发生与分布 |
| 1.1.3 甘薯茎线虫的生物学特性 |
| 1.1.4 甘薯茎线虫的侵染机制和危害症状 |
| 1.1.5 植物寄生线虫的综合防治 |
| 1.1.5.1 化学防治 |
| 1.1.5.2 物理防治 |
| 1.1.5.3 生物防治 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌及其杀虫晶体蛋白基因的表达调控 |
| 1.2.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.2.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白及其编码基因 |
| 1.2.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的表达调控 |
| 1.2.3.1 转录水平的调控 |
| 1.2.3.2 转录后水平的调控 |
| 1.2.3.3 翻译后水平的调控 |
| 1.2.4 影响cry基因表达的几个其他因素 |
| 1.2.4.1 基因拷贝数 |
| 1.2.4.2 cry基因之间的协同作用 |
| 1.2.4.3 宿主细胞的影响 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌防治植物寄生线虫研究进展 |
| 1.3.1 苏云金芽胞杆菌对植物寄生线虫的杀虫活性 |
| 1.3.2 苏云金芽胞杆菌的杀线虫基因和产物 |
| 1.3.3 苏云金芽胞杆菌对线虫的作用机制 |
| 1.3.3.1 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对昆虫的作用机制 |
| 1.3.3.2 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白对线虫的作用机制研究 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株来源 |
| 2.1.2 PCR引物 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 抗生素及使用浓度 |
| 2.1.5 供试线虫 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 常用缓冲液和溶液 |
| 2.2.3 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 供试苏云金芽胞杆菌的培养 |
| 2.3.2 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的SDS-PAGE |
| 2.3.2.1 电泳样品的制备 |
| 2.3.2.2 晶体蛋白的SDS-PAGE |
| 2.3.3 苏云金芽胞杆菌生物测定样品的制备 |
| 2.3.4 晶体蛋白样品的浓度测定 |
| 2.3.5 甘薯茎线虫的接种、培养和收集 |
| 2.3.5.1 甘薯茎线虫的接种和培养 |
| 2.3.5.2 甘薯茎线虫的收集 |
| 2.3.6 对甘薯茎线虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌筛选 |
| 2.3.6.1 初筛 |
| 2.3.6.2 复筛 |
| 2.3.7 DNA操作方法 |
| 2.3.7.1 大肠杆菌质粒的抽提 |
| 2.3.7.2 苏云金芽胞杆菌质粒的抽提 |
| 2.3.8 DNA的体外重组操作 |
| 2.3.8.1 PCR扩增操作 |
| 2.3.8.2 酶切反应 |
| 2.3.8.3 连接反应 |
| 2.3.8.4 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备与热激转化 |
| 2.3.8.5 BMB171感受态细胞的制备和电转化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 甘薯茎线虫的接种、培养和收集 |
| 3.2 对甘薯茎线虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌筛选 |
| 3.2.1 苏云金芽胞杆菌供试菌株 |
| 3.2.2 供试苏云金芽胞杆菌的初筛 |
| 3.2.3 供试苏云金芽胞杆菌的复筛 |
| 3.2.4 YBT-008对甘薯茎线虫的LC_(50)测定 |
| 3.3 YBT-008杀虫晶体蛋白基因的鉴定和验证 |
| 3.3.1 YBT-008的生物学特性 |
| 3.3.2 YBT-008晶体蛋白的SDS-PAGE |
| 3.3.3 YBT-008的LC-MS及结果分析 |
| 3.3.4 YBT-008杀虫晶体蛋白基因的PCR验证 |
| 3.4 YBT-008杀虫晶体蛋白基因的克隆与表达 |
| 3.4.1 cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba重组表达载体的构建 |
| 3.4.1.1 cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba全长编码序列的PCR扩增 |
| 3.4.1.2 cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba与pHT304载体的连接 |
| 3.4.2 重组载体的表达验证 |
| 3.5 重组表达蛋白对甘薯茎线虫的杀虫活性验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌及其筛选 |
| 4.2 对YBT-008杀虫晶体蛋白和基因的分析 |
| 4.3 Cyt2Ba、Cry11Aa、Cry4Aa和Cry4Ba的表达及杀线虫活性 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）苏云金芽胞杆菌对云斑天牛的抗性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 云斑天牛 |
| 1.1.1 云斑天牛的形态特征及生物学特性 |
| 1.1.2 云斑天牛的危害 |
| 1.1.3 云斑天牛的寄主范围及地域分布 |
| 1.1.4 云斑天牛的防治措施 |
| 1.1.4.1 改造杨树种植方式和培育新品种 |
| 1.1.4.2 物理防治方法 |
| 1.1.4.3 化学防治方法 |
| 1.1.4.4 生物防治方法 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.2.1 苏云金芽胞杆菌生物学特性 |
| 1.2.2 苏云金芽胞杆菌的杀虫活性成分 |
| 1.2.3 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白及其编码基因 |
| 1.2.4 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白基因的命名和分类 |
| 1.2.5 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白作用机制 |
| 1.2.6 苏云金芽胞杆菌防治鞘翅目害虫的研究状况 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒与供试昆虫 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 溶液 |
| 2.1.3.1 常用溶液的配制 |
| 2.1.3.2 SDS-PAGE相关溶液的配制 |
| 2.1.4 所用试剂 |
| 2.1.4.1 抗生素 |
| 2.1.4.2 试剂 |
| 2.1.4.3 试剂盒 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 云斑天牛成虫采集和饲养 |
| 2.2.1.1 云斑天牛成虫的采集 |
| 2.2.1.2 室内饲养方法 |
| 2.2.2 生物测定 |
| 2.2.2.1 苏云金芽胞杆菌菌悬剂的制备 |
| 2.2.2.2 晶体蛋白粉剂、芽胞粉剂、胞晶混合物粉剂的制备 |
| 2.2.2.3 初筛 |
| 2.2.2.4 复筛 |
| 2.2.2.5 从云斑天牛体内重新分离苏云金芽胞杆菌 |
| 2.2.2.6 云斑天牛肠道分离菌株的生测验证和16SrDNA鉴定 |
| 2.2.2.7 ZQ-89菌株杀虫活性成份的分析 |
| 2.2.2.8 生测结果的分析方法 |
| 2.2.3 ZQ-89菌株形态观察及晶体蛋白的分析 |
| 2.2.3.1 ZQ-89菌株形态观察 |
| 2.2.3.2 ZQ-89菌株晶体蛋白的分析 |
| 2.2.4 ZQ-89菌株质粒和总DNA的制备 |
| 2.2.4.1 ZQ-89菌株质粒的抽提 |
| 2.2.4.2 ZQ-89菌株总DNA的抽提 |
| 2.2.5 ZQ-89菌株抗虫基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.5.1 Cry1Ac-89基因的克隆 |
| 2.2.5.2 抗虫基因cry1Ac-89的TA克隆及测序 |
| 2.2.5.3 Cry1Ac-89基因和蛋白质氨基酸序列的分析 |
| 2.2.6 ZQ-89菌株中含启动子cry1Ac-89基因片段的扩增 |
| 2.2.6.1 反向PCR(inversePCR)法扩增cry1Ac-89基因的启动子 |
| 2.2.6.2 含启动子的cry1Ac-89基因片段的扩增 |
| 2.2.7 pHT304-Ac89载体的构建 |
| 2.2.7.1 大肠杆菌E. coli DH5 α的质粒抽提 |
| 2.2.7.2 含启动子cry1Ac-89基因片段和质粒pHT304的双酶切与连接 |
| 2.2.7.3 pHT304-Ac89转化大肠杆菌E. coli DH5 α并验证 |
| 2.2.8 工程菌ZAC-89构建 |
| 2.2.8.1 pHT304-Ac89载体DNA去盐 |
| 2.2.8.2 pHT304-Ac89转化BMB171 |
| 2.2.9 工程菌ZAC-89的基本特征 |
| 2.2.9.1 ZAC-89菌体和伴胞晶体形态观察 |
| 2.2.9.2 ZAC-89伴胞晶体产生过程观察 |
| 2.2.9.3 ZAC-89晶体蛋白SDS-PAGE检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 生物测定结果 |
| 3.1.1 初筛结果 |
| 3.1.2 复筛结果及分析 |
| 3.1.2.1 第一次复筛 |
| 3.1.2.2 第二次复筛 |
| 3.1.3 FZQ-89的分离、生测验证和16SrDNA鉴定 |
| 3.1.3.1 FZQ-89的分离与形态观察 |
| 3.1.3.2 FZQ-89菌株的生测验证 |
| 3.1.3.3 FZQ-89菌株的16SrDNA鉴定 |
| 3.1.4 ZQ-89抗虫活性成分分析 |
| 3.1.4.1 ZQ-89菌株抗虫活性成分确定 |
| 3.1.4.2 ZQ-89菌株晶体蛋白抗虫活性分析 |
| 3.2 ZQ-89菌株晶体蛋白的分析 |
| 3.2.1 ZQ-89菌株晶体蛋白SDS-PAGE检测 |
| 3.2.2 ZQ-89菌株晶体蛋白的肽指纹图谱分析 |
| 3.3 ZQ-89菌株质粒和基因组DNA的提取 |
| 3.4 ZQ-89抗虫基因的克隆及分析 |
| 3.4.1 Cry1Ac-89基因的克隆 |
| 3.4.2 ZQ-89菌株cry1Ac-89基因及蛋白序列的分析 |
| 3.5 工程菌ZAC-89的构建 |
| 3.6 工程菌ZAC-89基本特征 |
| 3.6.1 ZAC-89菌体及伴胞晶体形态观察 |
| 3.6.2 ZAC-89伴胞晶体产生过程观察 |
| 3.6.3 ZAC-89晶体蛋白SDS-PAGE检测 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
（8）利用秀丽隐杆线虫表达捻转血矛线虫H11蛋白的转基因研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫与捻转血矛线虫病 |
| 1 捻转血矛线虫病概述 |
| 1.1 病原及其形态特征 |
| 1.2 生活史 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 病理变化 |
| 2 捻转血矛线虫生物化学与分子生物学研究进展 |
| 2.1 线虫从营自由生活转变为寄生生活的基因表达差异 |
| 2.2 发育过程中的发育调节蛋白 |
| 2.3 发育过程中的信号转导 |
| 3 捻转血矛线虫保护性抗原研究进展 |
| 3.1 隐蔽抗原(hidden antigen) |
| 3.1.1 H11 |
| 3.1.2 血矛线虫半乳糖糖蛋白复合物(Haemonchus galactose-containingglycoprotein complex.H-gal-GP) |
| 3.1.3 半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease) |
| 3.2 天然抗原 |
| 3.2.1 成虫15/24 kDa ES抗原 |
| 3.2.2 成虫66 kDa ES抗原 |
| 3.2.3 捻转血矛线虫感染性三期幼虫表面抗原(Hc-sL3) |
| 3.3 捻转血矛线虫组织蛋白酶L(Hc-CPL-1) |
| 4 捻转血矛线虫疫苗研制 |
| 4.1 重组抗原的免疫保护效果 |
| 4.2 疫苗开发中存在的主要困难 |
| 4.2.1 利用抗原的重组形式不能取得与天然提取物同等的免疫保护效果 |
| 4.2.2 免疫策略难以制定,免疫佐剂难以选择 |
| 4.2.3 不同品种或年龄阶段的羊针对线虫抗原产生的应答反应差异大 |
| 4.3 捻转血矛线虫疫苗研究的发展方向 |
| 4.3.1 秀丽隐杆线虫作为表达系统大量制备疫苗候选抗原 |
| 4.3.2 新的疫苗候选抗原的鉴定 |
| 4.3.3 利用寄生性线虫的细胞系表达抗原 |
| 4.4 结语 |
| 5 胃肠道蠕虫感染及免疫应答机制研究 |
| 5.1 胃肠道蠕虫感染及免疫应答机制 |
| 5.2 捻转血矛线虫感染诱导的免疫应答 |
| 第二章 秀丽隐杆线虫及其在寄生性线虫研究中的应用 |
| 1 秀丽隐杆线虫简介 |
| 1.1 秀丽隐杆线虫的生物学特性 |
| 1.2 秀丽隐杆线虫的基因组工程 |
| 1.2.1 秀丽隐杆线虫基因组简介 |
| 1.2.2 秀丽隐杆线虫的选择性剪接(alternative splicing) |
| 1.2.3 秀丽隐杆线虫基因组数据库 |
| 2 秀丽隐杆线虫在寄生性线虫基因功能研究中的应用 |
| 2.1 秀丽隐杆线虫的分类学地位 |
| 2.2 利用RNAi技术进行基因功能分析 |
| 2.2.1 利用RNAi鉴定基因 |
| 2.2.2 秀丽隐杆线虫体内的RNAi |
| 2.2.3 寄生性线虫体内的RNAi研究 |
| 2.3 秀丽隐杆线虫在寄生性线虫基因功能研究中的应用 |
| 2.3.1 药物抗性研究 |
| 2.3.2 酶活性研究 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 捻转血矛线虫H11基因cDNA克隆及基因组结构分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 虫体 |
| 1.2 菌株与质粒 |
| 1.3 工具酶与试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 溶液配制 |
| 1.6 H11 cDNA序列的RT-PCR扩增 |
| 1.6.1 捻转血矛线虫ZJ株总RNA的提取 |
| 1.6.2 用于扩增H11 cDNA序列的引物的设计 |
| 1.6.3 H11基因的RT-PCR扩增 |
| 1.6.4 捻转血矛线虫ZJ株H11基因的克隆 |
| 1.7 H11基因组序列的获得 |
| 1.7.1 捻转血矛线虫基因组DNA的提取 |
| 1.7.2 用于扩增H11部分基因组序列的引物的设计 |
| 1.7.3 利用长距离PCR技术扩增H11部分基因组序列 |
| 1.7.4 用于基因步移技术的特异性引物的设计 |
| 1.7.5 利用基因步移技术扩增获得H11基因组序列 |
| 1.7.6 H11基因组序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 捻转血矛线虫ZJ株H11基因的克隆、PCR鉴定及酶切分析 |
| 2.3 序列测定 |
| 2.4 序列比对 |
| 2.5 长距离PCR扩增获得的部分基因组序列分析 |
| 2.6 利用基因步移技术获得基因组片段及其鉴定 |
| 2.7 H11基因组序列分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 秀丽隐杆线虫转基因体系的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 秀丽隐杆线虫 |
| 1.1.2 菌株与质粒 |
| 1.1.3 工具酶与试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.2 秀丽隐杆线虫基因组DNA的提取 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 重组表达载体的构建策略 |
| 1.5 基于Act-1基因核心启动子表达载体的构建 |
| 1.5.1 秀丽隐杆线虫Act-1基因启动子的克隆、测序 |
| 1.5.2 秀丽隐杆线虫T07F10.1a基因3’UTR序列的克隆、测序 |
| 1.5.3 SV40早期mRNA终止信号序列的PCR扩增、克隆及测序 |
| 1.5.4 EGFP基因的PCR扩增 |
| 1.5.5 以pBluescript SK+载体为骨架,秀丽隐杆线虫表达重组载体的构建 |
| 1.5.6 以pEGFP-4.1载体为骨架,秀丽隐杆线虫表达重组载体的构建 |
| 1.6 基于T07F10.1a核心启动子的表达载体的构建 |
| 1.7 携带有EGFP基因的重组表达载体在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达 |
| 1.7.1 显微注射前所需器材的准备 |
| 1.7.2 秀丽隐杆线虫显微注射用虫体的传代培养 |
| 1.7.3 携带EGFP基因的重组表达质粒的制备 |
| 1.7.4 携带EGFP基因的重组表达质粒的显微注射 |
| 1.7.5 具有roller表型的转基因虫体的单虫PCR鉴定 |
| 1.8 携带有EGFP基因的重组表达载体在Vero细胞中的转染试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达载体所需转录元件PCR产物的鉴定 |
| 2.1.1 秀丽隐杆线虫Act-1基因核心启动子克隆的PCR鉴定及酶切分析 |
| 2.1.2 秀丽隐杆线虫T07F10.1a基因3’UTR序列的PCR鉴定及酶切分析 |
| 2.1.3 SV40早期mRNA终止信号序列的PCR鉴定及酶切分析 |
| 2.1.4 EGFP基因的PCR扩增 |
| 2.1.5 秀丽隐杆线虫T07F10.1a启动子克隆的PCR鉴定及酶切分析 |
| 2.2 重组表达载体启动子序列测序及功能基序分析 |
| 2.2.1 Act-1基因核心启动子转录相关基序分析 |
| 2.2.2 T07F10.1a基因启动子转录相关基序分析 |
| 2.2.3 T07F10.1a基因3’UTR序列转录相关基序分析 |
| 2.2.4 SV40早期mRNA poly(A)信号序列分析 |
| 2.3 以Act-1基因核心启动子为转录元件重组表达载体的鉴定 |
| 2.4 秀丽隐杆线虫组织特异性表达重组载体的鉴定 |
| 2.5 核心启动子转录的EGFP基因在秀丽隐杆线虫体内中的表达 |
| 2.5.1 具有roller表型的后代的获得 |
| 2.5.2 转基因线虫后代的荧光观察 |
| 2.6 核心启动子转录的EGFP基因在Vero细胞中的表达 |
| 3 讨论 |
| 第三章 捻转血矛线虫H11基因5’上游序列转录活性分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 虫体 |
| 1.1.2 菌株与质粒 |
| 1.1.3 工具酶与试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.2 捻转血矛线虫基因组DNA的提取 |
| 1.3 H11基因5’上游区域分析 |
| 1.3.1 用于扩增H11基因5’上游部分基因组序列的引物设计 |
| 1.3.2 利用基因步移技术扩增H11基因5’上游部分基因组序列 |
| 1.3.3 H11基因5’上游部分基因组序列分析 |
| 1.4 H11基因5’侧翼区启动子基序分析 |
| 1.5 重组表达载体的构建策略 |
| 1.6 H11基因5’侧翼区重组表达载体的构建 |
| 1.6.1 H11基因5’侧翼区的PCR扩增 |
| 1.6.2 H11基因5’侧翼区表达载体的构建 |
| 1.7 携带有GFP基因的重组表达载体在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达 |
| 1.7.1 显微注射前所需器材的准备 |
| 1.7.2 秀丽隐杆线虫显微注射用虫体的传代培养 |
| 1.7.3 携带GFP基因的重组表达质粒的制备 |
| 1.7.4 携带GFP基因的重组表达质粒的显微注射 |
| 1.7.5 具有roller表型的转基因虫体的单虫PCR鉴定 |
| 1.7.6 具有roller表型的转基因虫体的基因组整合试验 |
| 1.7.7 具有roller表型转基因虫体的RT-PCR鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 利用基因步移技术获得基因组片段及其鉴定 |
| 2.2 序列分析 |
| 2.3 启动子元件分析 |
| 2.4 重组表达载体HcHPS-pPD95.77和HcHPL-pPD95.77的鉴定 |
| 2.5 转基因线虫后代的荧光观察 |
| 2.6 HcHPL-pPD95.77注射的转基因虫体的PCR和RT-PCR鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 利用秀丽隐杆线虫表达H11蛋白的启动子筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 秀丽隐杆线虫 |
| 1.1.2 菌株与质粒 |
| 1.1.3 工具酶与试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.2 秀丽隐杆线虫基因组DNA的提取 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 5’UTR的克隆 |
| 1.5 构建策略 |
| 1.6 5 ’-flanking region::GFP表达载体的构建 |
| 1.7 携带有GFP基因的重组表达载体在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 基因5’侧翼区序列PCR产物的鉴定 |
| 2.2 基因5’侧翼区序列主要启动子基序分析 |
| 2.3 重组表达载体的鉴定 |
| 2.4 转基因线虫后代的荧光观察 |
| 3 讨论 |
| 第五章 H11蛋白的转基因表达研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 秀丽隐杆线虫 |
| 1.1.2 菌株与质粒 |
| 1.1.3 工具酶与试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.2 捻转血矛线虫H11蛋白多克隆抗体的制备 |
| 1.2.1 捻转血矛线虫H11基因完整cDNA序列及部分基因片段HPS(H11 PartialSequence)的PCR扩增 |
| 1.2.2 原核表达载体的构建 |
| 1.2.3 IPTG诱导的重组蛋白表达与检测 |
| 1.2.4 重组蛋白的纯化 |
| 1.2.5 多克隆抗体的制备 |
| 1.3 利用秀丽隐杆线虫转基因表达H11的策略 |
| 1.4 cpr-1 5’-flanking region::GFP重组表达载体的改造 |
| 1.4.1 去掉cpr-1 5’-flanking region::GFP重组载体GFP基因的引物设计 |
| 1.4.2 cpr-pPD95.77(G-)载体的获得 |
| 1.4.3 EGFP基因验证 |
| 1.5 利用秀丽隐杆线虫表达H11基因 |
| 1.5.1 H11基因的扩增与重组表达载体cpr-H11-ppd(G-)的构建 |
| 1.5.2 显微注射 |
| 1.5.3 单虫PCR鉴定 |
| 1.5.4 具有roller表型的转基因虫体的基因组整合试验 |
| 1.5.5 RT-PCR鉴定 |
| 1.6 利用秀丽隐杆线虫表达H11基因的部分片段(Transgenic H11 PartialSequence,Trans-HPS) |
| 1.6.1 H11基因部分片段Trans-HPS的PCR扩增与表达载体cpr-Trans-HPS-ppd(G-)的构建 |
| 1.6.2 显微注射 |
| 1.6.3 单虫PCR鉴定 |
| 1.6.4 具有roller表型的转基因虫体的基因组整合试验 |
| 1.6.5 RT-PCR鉴定 |
| 1.7 转基因蛋白的western-blot分析 |
| 1.8 利用镍琼脂糖凝胶柱纯化转基因蛋白的尝试 |
| 1.9 转基因秀丽隐杆线虫的保存 |
| 2 结果 |
| 2.1 原核表达载体H11-pET32和HPS-pET28的鉴定 |
| 2.2 原核表达蛋白的检测与分析结果 |
| 2.3 多克隆抗体制备的结果分析 |
| 2.4 重组表达载体的改造与鉴定 |
| 2.5 重组载体cpr-EGFP-pPD95.77在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达 |
| 2.6 重组载体cpr-H11-pPD95.77和cpr-Trans-HPS-pPD95.77的鉴定 |
| 2.7 携带有cpr-H11-pPD95.77重组质粒的转基因线虫的鉴定 |
| 2.8 携带有cpr-Trans-HPS-pPD95.77重组质粒的转基因线虫的鉴定 |
| 2.9 转基因蛋白的Western-Blot分析 |
| 2.10 利用镍琼脂糖凝胶柱纯化转基因蛋白的尝试 |
| 3 讨论 |
| 第六章 转基因秀丽隐杆线虫全虫抗原的粗提及免疫保护性试验 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验场地及试验动物 |
| 1.1.2 捻转血矛线虫L3感染性幼虫的准备 |
| 1.1.3 秀丽隐杆线虫 |
| 1.1.4 工具酶与试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.1.6 溶液配制 |
| 1.2 Trans-HPS转基因线虫成虫全虫蛋白的准备 |
| 1.2.1 Trans-HPS转基因线虫成虫的液体培养 |
| 1.2.2 Trans-HPS转基因线虫成虫全虫蛋白的粗制备 |
| 1.3 原核表达蛋白HPS的制备与纯化 |
| 1.4 实验分组及免疫 |
| 1.4.1 组别设计 |
| 1.4.2 免疫及攻虫 |
| 1.5 各免疫指标测定 |
| 1.5.1 ELISA检测抗体水平 |
| 1.5.2 外周血淋巴细胞转化试验(MTT法) |
| 1.5.3 虫卵计数 |
| 1.5.4 幼虫孵化率 |
| 1.5.5 减虫率计数 |
| 2 结果 |
| 2.1 ELISA检测外周血血清抗体结果 |
| 2.2 外周血淋巴细胞增殖活性 |
| 2.3 虫卵计数及减卵率测定结果 |
| 2.4 幼虫孵化率测定结果 |
| 2.5 减虫率测定结果 |
| 3 讨论 |
| 总结与展望 |
| 1 论文主要结论及创新点 |
| 2 研究展望 |
| 附录1 溶液配制 |
| 附录2 英文缩写注释 |
| 附录3 实验过程中涉及的主要引物序列 |
| 附录4 H11的基因组序列 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 |
| 参考文献 |
（9）苏云金杆菌对松墨天牛及松材线虫的毒力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 松墨天牛 |
| 1.1.1 松墨天牛的危害及生物学特性 |
| 1.1.2 松墨天牛的生物防治概述 |
| 1.2 苏云金芽孢杆菌 |
| 1.2.1 苏云金芽孢杆菌概述 |
| 1.2.2 苏云金芽孢杆菌杀虫毒素 |
| 1.3 苏云金杆菌防治应用 |
| 1.3.1 苏云金杆菌防治鞘翅目的的研究现状 |
| 1.3.2 苏云金杆菌防治植物寄生线虫研究进展 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试松墨天牛 |
| 2.1.2 供试菌株 |
| 2.1.3 供试松材线虫及培养方法 |
| 2.1.4 实验仪器与供试试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 松墨天牛人工实验种群建立 |
| 2.2.2 孢晶混合物粉剂的制备和伴孢晶体蛋白的提取 |
| 2.2.3 菌株对松墨天牛毒力测定及其生物学特性研究 |
| 2.2.4 苏云金杆菌伴孢晶体蛋白对松材线虫的毒力作用 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 松墨天牛人工实验种群建立 |
| 3.1.1 室内人工饲养条件下松墨天牛的发育历期 |
| 3.1.2 室内人工饲养条件下松墨天牛各龄期幼虫，各虫态形态特征 |
| 3.2 菌株对松墨天牛毒力测定及其生物学特性研究 |
| 3.2.1 17 个苏云金杆菌菌株对松墨天牛的毒力测定 |
| 3.2.2 从死虫中 Bt 镜检情况 |
| 3.2.3 菌株 RBT-200701、RBT- 200702 对松墨天牛的毒力测定 |
| 3.2.4 菌株RBT-200701、 RBT- 200702 的形态特征 |
| 3.2.5 发酵条件筛选结果 |
| 3.2.6 菌株 RBT-200701、 RBT-200702 伴孢晶体蛋白 SDS-PAGE 电泳分析 |
| 3.3 苏云金杆菌伴孢晶体蛋白对松材线虫的毒力作用 |
| 3.3.1 伴孢晶体蛋白含量测定 |
| 3.3.2 对松材线虫有活性的苏云金杆菌的筛选 |
| 3.3.3 菌株020、RBT-200701 对松材线虫的活性测定 |
| 3.3.4 菌株020、RBT-200701 晶体蛋白 SDS-PAGE 电泳分析 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（10）源自动物粪便的Bt分离鉴定及对鸡球虫的作用效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 鸡球虫与鸡球虫病 |
| 1.1 球虫的生物学分类 |
| 1.2 鸡球虫的生活史 |
| 1.3 鸡球虫病的发生及防治措施 |
| 1.3.1 流行病学特征 |
| 1.3.2 发病机制 |
| 1.3.3 临床症状和病理变化 |
| 1.3.4 诊断要点 |
| 1.3.5 防治措施 |
| 1.4 鸡球虫耐药性的产生及其延缓措施 |
| 1.4.1 鸡球虫耐药性的危害 |
| 1.4.2 鸡球虫耐药性的主要特点 |
| 1.4.3 鸡球虫耐药性的机理 |
| 1.4.4 鸡球虫耐药性的检测方法 |
| 1.4.5 延缓耐药性产生的措施 |
| 1.5 鸡球虫的免疫预防 |
| 1.5.1 鸡疫苗研究概况 |
| 1.5.2 鸡球虫疫苗免疫的主要问题 |
| 1.6 展望 |
| 2 苏云金杆菌 |
| 2.1 苏云金杆菌生物学及各种活性成份 |
| 2.1.1 苏云金杆菌的生物学特性 |
| 2.1.2 苏云金杆菌的分类地位 |
| 2.1.3 苏云金杆菌的生态学分布 |
| 2.1.4 苏云金杆菌的活性成分 |
| 2.2 苏云金杆菌对动物安全性评估 |
| 2.2.1 Bt 对动物的安全性评估 |
| 2.2.2 Bt 基因工程菌对动物的安全性评估 |
| 2.2.3 转Bt 基因作物对动物的安全性评估 |
| 2.2.4 Bt 对人类的安全性评估 |
| 2.3 苏云金杆菌从动物体上的分离 |
| 2.3.1 从动物肠道中分离Bt |
| 2.3.2 从动物粪便中分离Bt |
| 2.3.3 从牛乳中分离Bt |
| 2.3.4 从患病蟹体分离Bt |
| 2.4 苏云金杆菌已在动物疾病防治上的应用 |
| 2.4.1 用Bt 防治动物捻转血矛线虫 |
| 2.4.2 用Bt 研制热稳定性禽流感口服疫苗 |
| 2.4.3 用Bt 防治动物血吸虫病 |
| 2.4.4 用Bt 防治猪蛔虫病 |
| 2.4.5 用Bt 防治绵羊绿铜蝇 |
| 2.4.6 用Bt 防治细菌引起的感染性疾病 |
| 3 本研究目的和意义 |
| 第二章 动物园动物粪便中苏云金杆菌调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物粪便样品的来源 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 药剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物分组 |
| 1.2.2 醋酸钠加抗生素加热法分离Bt |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 哺乳动物粪便中Bt 的分离 |
| 2.2 禽类动物粪便中Bt 的分离 |
| 2.3 哺乳动物和禽类动物粪便中Bt 分离率的比较 |
| 2.4 不同食性动物粪便中Bt 分离率的比较 |
| 3 讨论 |
| 第三章 柔嫩艾美耳球虫的分离、鉴定和致病性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试剂和器材 |
| 1.3 卵囊的分离 |
| 1.3.1 初步分离 |
| 1.3.2 单卵囊分离 |
| 1.4 虫种鉴定 |
| 1.5 致病性比较 |
| 1.5.1 试验分组 |
| 1.5.2 致病力指标 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 分离株鉴定 |
| 2.2 致病性比较 |
| 2.2.1 临床症状和病理变化 |
| 2.2.2 致病力 |
| 3 讨论 |
| 第四章 鸡胚法筛选具有抗鸡球虫病作用的Bt 菌株 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验球虫 |
| 1.1.1 鸡胚适应株的建立 |
| 1.1.2 孢子化卵囊 |
| 1.2 鸡胚 |
| 1.3 苏云金杆菌晶体蛋白制备及测定 |
| 1.3.1 苏云金杆菌晶体蛋白制备 |
| 1.3.2 苏云金杆菌晶体蛋白测定 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 晶体蛋白浓度测定结果 |
| 2.2 苏云金杆菌晶体蛋白抑制鸡胚球虫卵囊的效果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 苏云金杆菌晶体蛋白和化学抗球虫药对鸡球虫病的疗效对比试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.2.1 苏云金杆菌晶体蛋白 |
| 1.2.2 化学药物 |
| 1.3 试验卵囊 |
| 1.4 试验饲料 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.5.1 试验动物分组 |
| 1.5.2 卵囊接种 |
| 1.5.3 病变记分 |
| 1.6 抗球虫药效果判断标准 |
| 1.6.1 相对增重率 |
| 1.6.2 存活率 |
| 1.6.3 病变计分及病变值 |
| 1.6.4 卵囊数 |
| 1.6.5 卵囊比数 |
| 1.6.6 卵囊值 |
| 1.6.7 抗球虫指数（ACI） |
| 1.7 促生长指标 |
| 1.7.1 增重 |
| 1.7.2 饲料转化率 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 抗球虫效果 |
| 2.2 球虫卵囊排出情况 |
| 2.3 增重和料肉比情况 |
| 3 讨论 |
| 第六章 BT6 菌株 的生物学特性及其 cry 基因型鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 PCR 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 BT6 菌株的生理生化指标鉴定 |
| 1.2.2 镜检 |
| 1.2.3 总DNA 的提取 |
| 1.2.4 PCR 扩增 |
| 1.2.5 扩增产物的RFLP 分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BT6 菌株的生理生化指标鉴定 |
| 2.2 Bt 菌株裂解期观察 |
| 2.3 PCR-RFLP 鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1 在GenBank 上登录的序列 |
| 附录2 论文中使用的缩写词及中英文对照 |
| 附录3 攻博期间发表论文、申请专利及主持的课题 |
| 致谢 |
四、苏云金芽胞杆菌晶体蛋白对羊捻转血矛线虫成虫的作用（论文参考文献）
- [1]苏云金芽胞杆菌杀线虫活性因子分析及杀虫机制研究进展[J]. 刘晓艳,闵勇,黄大野,方伟,王开梅,杨自文. 中国生物防治学报, 2017(05)
- [2]苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白结构域Ⅲ的定点突变及结构与功能研究[D]. 吕媛. 湖南师范大学, 2016(06)
- [3]利用蛋白质组学技术研究苏云金杆菌晶体蛋白Cry6Aa2对线虫的作用[D]. 熊静. 湖南师范大学, 2014(09)
- [4]捻转血矛线虫过氧化物酶基因的克隆和5种蛋白的抗原特性分析[D]. 牛延萍. 南京农业大学, 2012(01)
- [5]杀线虫苏云金芽胞杆菌菌株YC-10的分离鉴定及活性测定[J]. 成飞雪,王忠勇,刘勇,张德咏,程菊娥. 中国生物防治学报, 2011(04)
- [6]杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌筛选及特性研究[D]. 刘金辉. 华中农业大学, 2011(05)
- [7]苏云金芽胞杆菌对云斑天牛的抗性研究[D]. 逯晋忠. 华中农业大学, 2010(04)
- [8]利用秀丽隐杆线虫表达捻转血矛线虫H11蛋白的转基因研究[D]. 周前进. 浙江大学, 2010(12)
- [9]苏云金杆菌对松墨天牛及松材线虫的毒力研究[D]. 徐金华. 浙江林学院, 2009(02)
- [10]源自动物粪便的Bt分离鉴定及对鸡球虫的作用效应研究[D]. 吴昌标. 福建农林大学, 2009(11)