一、马传贫强、弱毒血清抗体鉴别诊断法在古巴的应用（论文文献综述）
孔宪刚,宁希德[1]（1994）在《马传贫强、弱毒血清抗体鉴别诊断法在古巴的应用》文中认为应用中国抗马传染性贫血驴白细胞弱毒抗原株系特异性的单克隆抗体酶结合试剂，以免疫斑点试验与琼脂免疫双扩散试验相结合的方法，对古巴二省疫苗接种地区的２５６匹马进行了马传贫弱毒疫苗接种马和马传贫自然病马鉴别诊断．结果，检出自然病马２３匹．弱毒疫苗接种马２０９匹，健康马２４匹．表明，本法可用于区别古巴马传贫病马和马传贫驴白细胞弱毒疫苗免疫马．
涂亚斌[2]（2005）在《马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用》文中进行了进一步梳理马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus,EIAV）属反转录病毒科慢病毒属,是马传染性贫血（EIA,简称马传贫）的病原体。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗,是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗,该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行,是研究慢病毒免疫预防非常有价值的模型。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列（LTR）对病毒复制有重要的调控作用,影响到病毒的繁殖动力学、组织嗜性、致病力等方面。反转录病毒的囊膜蛋白,由于其基因的高度变异性,受到病毒学研究的普遍关注,通过对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒与其亲本强毒L株前病毒全基因组核苷酸序列的比较分析,发现二者的LTR和env基因（尤其是gp90编码区）差异较大。 为了研究env基因gp90在我国EIAV-DLA致弱过程中的作用,我们以EIAV强毒辽宁株（L株）接种健康马,从不同时期发热期马血清中以RT-PCR扩增包含完整S2基因和gp90基因片段;同时以EIAV-DLA接种健康驴白细胞并用RT-PCR扩增相同的基因片段,将所得的强弱毒共30个env基因gp90进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,强弱毒gp90序列存在着多个位点高度的一致性变异,所推导的氨基酸也存在19个位点极其一致性变异,这些变异包括氨基酸的点突变和插入或缺失,其中,氨基酸在极性与非极性之间的变换及氨基酸的插入和缺失造成糖基化数量非常一致的变化。在对其它慢病毒（如HIV、SIV）研究过程中发现,糖基化对病毒的细胞嗜性、毒力以及病毒逃避中和抗体的能力起到了致关重要的作用。经过序列及氨基酸的比较后发现,gp90基因V3到V5区在强毒和弱毒之间差异显着,而在各自内部相对保守,变异较小。对27个S2基因进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,S2基因中也存在着3个非常一致的点突变,没有碱基的插入或缺失。 在对我国强毒EIAV-L和弱毒EIAV-DLA env基因变异研究的基础上,我们将马传贫强、弱毒gp90全长及部分（V3-V5区）分别连接到逆转录病毒载体pBABE-puro,通过转染将马传贫强、弱毒env基因整合到包装细胞系PA317中,利用抗性筛选到稳定表达细胞系;然后将马传贫强、弱毒gp90全长及V3-V5区分别连接到高效真核表达载体pcDNA3.1（+）,转染293T细胞系并经抗性筛选及亚克隆后获得高效稳定表达马传贫强弱毒gp9及V3-V5区基因的细胞系,为研究gp90及V3-V5区结构与功能打下了良好的基础。然而,我们至今对弱毒疫苗的致弱机理尚不清楚。对以HIV为主的慢病毒研究表明LTR和env基因中N-连接糖基化与病毒的嗜性、感染性和抗体中和作用密切相关。我国马传染性贫血病毒强弱毒env基因之间N-连接糖基化存在明显的区别;根据强弱毒env基因变异的分析结果,构建了一系列N-连接糖基化突变分子克隆,力图对N-连接糖基化在我国马传染性贫血病毒致弱过程中的作用进行阐述,通过转染驴白细胞并盲传10代后仍未获得N-连接糖基化突变病毒,我们推测可能的原因是由于N-连接糖基化的突变均位于env基因的V3-V5区,影响了在驴白细胞上的细胞嗜性。 为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,我们在已构建EIAV-DLA株感染性分子克隆和EIAV-L株前病毒DNA全基因组分子克隆的基础上,用EIAV-L株的LTR和gp90编码区分别替换EIAV-DLA株感染性分子克降的相应片段,
李红梅[3]（2004）在《马传染性贫血病驴白细胞弱毒疫苗细胞免疫机理的研究》文中指出我国马传染性贫血病驴白细胞弱毒疫苗（DLV）是唯一成功应用的慢病毒疫苗，是慢病毒免疫预防很有希望的动物模型。因此，揭开DLV的免疫机制使其可能成为研究HIV等慢病毒疫苗的免疫模型。本研究采用流式细胞术（FCM）、3[H]-TDR掺入法、51Cr释放法等方法对健康马、DLV免疫马、EIA强毒感染马、EIA自然感染马外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群数量、淋巴细胞转化功能及细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能等的动态变化进行了观察。在淋巴细胞亚群水平，探索DLV的细胞免疫机理。同时，采用反转录酶活性实验和流式细胞术相结合的方法初步探索了EIAV体外对马外周血淋巴细胞的感染性。 DLV免疫马在免疫期间与免疫前相比，3／4免疫马淋巴细胞总数波动不明显，1／4免疫马淋巴细胞总数显着降低（p＜0.05）。所有免疫马CD4+T淋巴细胞数变化不明显。3／4免疫马CD8+T淋巴细胞数升高，其中1匹马显着升高（p＜0.05）；1／4免疫马CD8+淋巴细胞数降低（p＞0.05）。攻毒后，免疫马与强毒感染马（发热期）淋巴细胞总数和CD4+T淋巴细胞数均下降，免疫马比强毒感染马发热期下降少；3／4免疫马CD8+T淋巴细胞数高于免疫前，1／4免疫马比免疫前降低。攻毒期与免疫期相比，所有免疫马淋巴细胞总数和CD4+T淋巴细胞数降低；3／4免疫马CD8+T淋巴细胞数降低，1／4免疫马CD8+T淋巴细胞数升高。强毒感染组1匹马出现3次发热，CD8+T淋巴细胞数在第1次发热期升高，在第2和3次发热期降低；另1匹马出现7次发热，在所检测的4次发热期中，CD8+T淋巴细胞数均降低。结果表明，免疫马在免疫期CD8+T淋巴细胞数升高者，攻毒后完全保护；免疫期内CD8+T淋巴细胞数下降的马，攻毒后不完全保护。 DLV免疫马外周血中EIAV特异性T淋巴细胞增殖水平随着免疫时间延长而逐渐升高。免疫后2个月即能检测到EIAV特异性淋巴细胞增殖反应。在攻毒前检测的结果均高于免疫后2个月检测的结果，在攻毒后1个月所检测到的淋巴细胞增殖反应水平与攻毒前相近；免疫马攻毒后25个月淋巴细胞增殖反应水平高于免疫及免疫攻毒后1个月的马，与EIAV自然感染马检测结果接近；强毒感染马的淋巴细胞增殖反应检测结果低于免疫马。结果提示，淋巴细胞增殖水平的高低与疫苗免疫保护效力呈正相关。 免疫马外周血T淋巴细胞在体外经过EIAV弱毒二次激活后能产生EIAV特异性CTL反应，但EIAV特异性的CTL活性在免疫马之间有一些差异。2／4马攻毒后CTL活性高于免疫期，1／4马攻毒CTL活性不低于免疫期水平，且临床上未出现任何症状：而1／4马攻毒后CTL活性低于免疫期，且临床上出现一过性体温升高症状。其结果可见，CTL活性与疫苗的免疫保护效力相关，证实了DLV诱导产生的EIAV特异性CTL反应在疫苗免疫保护中所起的主导作用。本研究亦证明了DLV体外接种马外周血淋巴细胞72h时，逆转录酶活性最高，且淋巴细胞中仍以CD4+T淋巴细胞为主，为证实将其作为细胞毒性T淋巴细胞的靶细胞提供了依据。 本试验初步证明了DLV免疫马具有CTL活性的细胞为CD8+T淋巴细胞，根据CD8+T淋巴细胞数量和功能上的变化与DLV细胞免疫作用之间的相关性，首次确立了CD8+T淋巴细胞在DLV细胞免疫保护机理中的主导地位。
马建[4]（2008）在《EIAV疫苗株gp90基因的多克隆构成和体内进化与免疫保护的相关性》文中认为中国马传贫（EIA）弱毒疫苗,是可良好诱导针对慢病毒的免疫保护并唯一被成功大规模应用的慢病毒疫苗。明确EIA弱毒疫苗致弱和诱导免疫保护的机制,将对慢病毒免疫机制研究和制定疫苗研制策略提供有益的参考。本文选择中国EIA驴胎皮细胞适应性弱毒疫苗EIAVFDDV为研究对象,对该弱毒疫苗的病毒种群构成和体内复制特点及二者与诱导免疫保护的相关性进行了探讨。使用RT-PCR和克隆测序技术,对EIAVFDDV gp90基因的多样性进行了分析。随机获得的52个gp90基因的不同克隆,同源率在96%-100%不等,推导的氨基酸序列差异最高可达6.5%。该差异结合进化树和推导的氨基酸序列的聚类分析结果,提示经过无宿主特异性免疫压力的长期体外传代培养得到的EIAVFDDV ,其病毒种群存在着丰富的基因多样性、呈混合构成状态。我们将该构成特性,称作“多克隆构成”。通过分析免疫成熟过程中不同时间点EIAVFDDV免疫马匹外周血中EIAVgp90基因的序列,可对多克隆构成的EIAVFDDV在免疫马匹体内的进化动态做如下描述:免疫后15天,EIAVFDDV的部分毒株可以克服宿主的天然免疫压力对宿主进行感染。2-4个月时,疫苗弱毒株在宿主体内以趋于单一的、且可能相对于亲本强毒珠出现回复突变的准种形式存在。免疫后4-6个月时,趋于单一的、且基因构成与EIAVFDDV较为相近的病毒种群,将替代2-4个月时发生突变的病毒种群作为免疫成熟时的准种,相对稳定地存在于宿主血浆中。同时,血浆病毒载量监测结果表明,免疫成熟过程中,外周血游离病毒粒子的RNA拷贝数在102-105拷贝/ml范围内的低拷贝水平波动。使用连续给予地塞米松的方法,对EIAVFDDV免疫成熟马匹进行了免疫功能抑制,并对比监测了免疫抑制前后马匹血浆中疫苗毒株的载量。监测结果表明,3匹免疫马在免疫功能受抑制后,2匹血浆中EIAV载量中略有下降,而1匹略有上升,但载量水平均处于免疫马匹体内EIAVFDDV载量变化的正常范围。该实验结果提示,疫苗毒株的生物学特性,而非免疫压力是EIAVFDDV在宿主血浆中低拷贝存在的主要原因。而在免疫系统功能受抑制状态下,疫苗株在马体内仍维持稳定的低拷贝复制状态,支持了疫苗株EIAVFDDV应用中的安全性。使用EIAVFDDV与基于EIAVFDDV单一毒株基因背景构建和拯救出的疫苗感染性克隆毒EIAVFDDV3-8,分别免疫马匹,并在免疫成熟后进行攻毒。攻毒实验结果表明,多克隆构成的EIAVFDDV诱导的免疫保护明显优于构成相对单一的感染性克隆毒EIAVFDDV3-8。同时中和实验提示,能够诱导明显优于EIAVFDDV3-8的高水平中和抗体,可能是EIAVFDDV诱导良好免疫保护的主要原因。该实验结果支持EIAVFDDV的多克隆构成特性,在其诱导免疫马匹产生良好免疫保护中起作用。本论文获得的研究结果,作为对EIAV疫苗弱毒株生物学特性评价的基础数据,不仅可以帮助我们更多的了解疫苗弱毒株的生物学特性,而且对深入研究疫苗弱毒株诱导免疫保护的机制也十分必要。
王柳[5]（2001）在《马传染性贫血病驴白细胞弱毒及其亲本马强毒（L株）基因组序列比较分析以及弱毒感染性分子克隆的构建》文中研究指明马传染性贫血病毒（EIAV，简称马传贫）是反转录病毒科慢病毒属的成员之一，是马传染性贫血病（EIA）的病原体。由于慢病毒给人类和动物的健康造成了严重的威胁，因此慢病毒的免疫预防，尤其是艾滋病的免疫预防成为研究的热点。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗，是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗，该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行，是研究慢病毒免疫预防非常有价值的动物模型。马传贫驴白细胞弱毒疫苗（DLA-EIAV）是将分离自辽宁省的EIAV L株通过驴体传代，使其毒力明显增强（称为驴强毒，DA-EIAV），然后在驴白细胞培养物上连续传代致弱获得的。在这一过程中，EIAV L株由强毒变为弱毒，用此弱毒疫苗接种动物后不表现临床症状，但可诱导免疫保护。为了揭示我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱及免疫保护的分子机制，为人免疫缺陷病毒及其它慢病毒的免疫预防提供借鉴，我们对马传贫驴白细胞弱毒及其亲本马强毒EIAV L株前病毒进行了全基因克隆和序列测定，比较分析了二者的前病毒基因组核苷酸序列，在此基础上构建了EIAV驴白细胞弱毒株的感染性分子克隆和三株含有EIAV强/弱毒嵌合病毒基因组的重组质粒，并对EIAV弱毒株长末端重复序列（LTR）的启动子活性进行了初步研究。 本研究以DLA-EIAV感染细胞总DNA及其亲本强毒EIAVL株感染马外周血液白细胞中DNA为模板，应用PCR方法分段扩增出DLA-EIAV和L株的前病毒，并将各段扩增产物克隆后进行测序。根据国外发表的马传染性贫血病毒核苷酸序列，推导出DLA-EIAV和L株全基因组核苷酸序列，经比较分析，DLA-EIAV株前病毒基因组全长8266个碱基，EIAV L株前病毒基因组共有8235bp。DLA-EIAV株与其亲本马强毒L株和驴强毒DA-EIAV株核苷酸序列相比，同源率分别为97.0%和97.5%。DLA-EIAV株和L株相比，长末端重复序列（LTR，由U3、R、U5组成）、编码囊膜糖蛋白的基因env及ORF S2的变异率很高，U3、R、U5、env及ORF S2核苷酸序列差异率分别达13.2%、7.5%、5.1%、2.7%和3.9%，env基因及ORF S2推导的氨基酸序列差异率分别为4.4%和8.8%。EIAV L株与国外已发表的一些相关毒株相比核苷酸序列差异很大，同源性只有79%，RTase的氨基酸同源率只有86%，Gag蛋白的的同源率只有79%，说明EIAV L株与国外已报道的几个EIAV毒株的亲缘关系较远。 通过对EIAV L株与DA-EIAV、DLA-EIAV及国外相关毒株的gp90推导的氨基酸序列进行比较，发现在同一毒株系列内，N-连接糖基化位点增多与病毒毒力具有正相关性。这一现象提示我们，DLA-EIAV株gp90 N-连接糖基化位点的减少可能是弱毒产生免疫保护的原因之一。 马传贝性贫血病驴白细跑弱耳及其亲本马强霉儿株)王 柳 基因组序列比较分析以及弱霉感染性分子克巨的构建2001年6月 DLA－EIAV与L株在前病毒U3增强子区的主要差别是，DLA－EIAV含有转录因子bHLH作用一致序列E－oX，而L株U3增强子区不存在这一基序。通过对DLA－EMV和L株比较发现二者TAR的二级结构不同，DLA－EIAV株TAR茎的起始部位发生了改变，形成一个尿啼陡突起。由于病毒基因的表达受细胞转录因子和反式激活蛋白Tat的调控，驴白细胞弱毒增强子区卜七Ox的引入和病毒反式激活应答区TAR结构的改变，可能使弱毒的细胞嗜性改变和在体内复制能力下降，表现为毒力减弱。 将克隆的DLA－EDeV株各个片段顺次连接，获得了一个含有EMV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒，将其命名为EIAV－ps．2，经核昔酸序列分析，证明ps二含有EIAV前病毒的全基因。用EMV－ps．2转染驴白细胞，将其作为种毒进行传代，于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶，说明在驴白细胞中由ps二衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后，第4天出现病变，经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子，进一步证明EMV－ps二具有感染性，获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆。 为了进一步研究弱毒LTh和env基因的变异与毒力减弱及诱导免疫保护之间的关系，我们将 DLA－EL＼V感染性分子克隆的乙h用 EInV L株的 LTR替换，另外将DLA－EMV感染性分子克隆的gp90编码区用乙株的gp90编码区替换，并将EIAV L株的LTh和gp90编码区同时替换DLA－EMV株感染性分子克隆的相应片段，获得了三株含有EIAV强溺毒嵌合病毒基因组的重组质粒。 将我国马传贫病毒弱毒株的长末端重复序列克隆于含CAT基因的载体中，获得重组质粒 pCAT七TR，用 pCAT－LTh分别转染驴胎皮肤细胞（FDD）、胶质母细胞瘤 （TJ－905）细胞、驴臼细胞及接种 EtaV弱毒的 FDD和驴白细胞，结果以 EIAV弱毒的LTR为启动于，CAT在这几种细胞中均获得了不同程度的表达，证实了我国EMV弱毒株的LTh在FDD、TJ－905及驴白细胞中确实具有一定的启动子功能，并能被反式激活表达。 总之，本研究首次获得了我国DLA－EIAV和L株前病毒全基因克隆，确定了DLA－EIAV和 L株前病毒基因组核昔酸全序列，?
马建[6]（2012）在《EIAV中国弱毒疫苗株的抗原多态性及超感染抵制现象在其诱导保护性免疫中的作用研究》文中进行了进一步梳理马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus, EIAV）是感染马属动物的慢病毒。EIAV中国弱毒疫苗株,是可诱导针对同源或异质EIAV毒株的良好免疫保护并唯一被成功大规模应用的慢病毒疫苗。以该弱毒疫苗系统作为慢病毒疫苗的研究模型,明确其致弱和诱导免疫保护的机制,将对慢病毒免疫机制研究和有效疫苗研制提供有益参考,具有重要的理论意义和应用价值。本文选择马传染性贫血中国驴胎皮肤细胞适应性弱毒疫苗株EIAVFDDV13作为研究对象,对其生物学特性在已有研究基础上做进一步深入探讨。关注的重点放在对该弱毒疫苗的病毒种群构成与诱导保护性免疫、弱毒疫苗诱导的超感染抵制现象（Super-infection resistance, SIR）与固有免疫激活和特异性免疫应答建立之间是否具有相关性等问题的回答。首先,我们比较了弱毒疫苗株EIAVFDDV13和一株拯救于EIAVFDDV13前病毒DNA的分子克隆毒株EIAVFDDV3-8在诱导免疫保护上的差异。基于攻毒试验和对攻毒后无症状马匹进行免疫抑制的试验结果,我们发现EIAVFDDV13免疫马匹诱导出了5/6的发病保护和3/6的完全保护,而EIAVFDDV3-8仅诱导出了2/7的发病保护和未能实现完全保护。同时,前者免疫马匹的血清对致病毒株的中和能力要明显优于后者。上述研究表明,疫苗感染性克隆毒株显然丢掉了亲本疫苗弱毒株诱导免疫保护的能力。此外,比较二者对体外培养巨噬细胞（Monocyte derived macrophage, MDM）的固有免疫激活特征时,发现二者在固有免疫相关分子Toll样受体和I型干扰素（IFNα/β）的诱导上存在差异,而已有研究证明这些差异与特异性免疫应答的建立具有联系。这提示病毒株可能通过对感染早期固有免疫的激活影响最终建立的特异性免疫应答,而疫苗弱毒株和疫苗感染性克隆毒株通过何种机制诱导差异的固有免疫激活,以及进一步影响后续的特异性免疫应答,则需要进一步的研究予以阐明。而在病毒株方面,考虑到两毒株在体内、外复制特性上不存在显着差异,我们进一步对二者的gp90基因进行了分析,以探讨感染性克隆毒诱导免疫保护能力丢失的原因。分析结果提示,EIAVFDDV13抗原构成呈高度多样性特征,而EIAVFDDV3-8则构成相对单一且其基因背景源于亲本疫苗多样性的组成成分。由此,我们推测上述差异,是EIAVFDDV3-8未能复制亲本疫苗诱导免疫保护能力的原因。拯救带有疫苗多样性组分囊膜基因的多个感染性克隆毒株,并进行免疫诱导差异比较,是用于验证上述推测所需开展的进一步试验研究。而该差异是否与固有免疫激活存在相关性,亦需要做进一步探讨。其次,本研究中我们开展了有关EIAV中国弱毒疫苗诱导超SIR的相关研究。SIR是指一种病毒感染宿主细胞后,可以诱导细胞产生抵抗相同和近似病毒超感染的能力。包括HFV、EIAV在内的慢病毒可诱导SIR。本研究中,我们使用EIAVFDDV13和有致病力的EIAV感染性克隆毒株EIAVUK3作为慢病毒强、弱毒株的模式毒株,就二者在诱导SIR能力上是否存在差异进行了比较研究。基于可特异性区分强、弱毒株的病毒定量PCR （qPCR）和病毒RNA原位杂交技术（ViewRNA）证实,EIAVFDDY13体外感染宿主细胞MDM后诱导的针对EIAVUK3株的SIR,要强于EIAVUK3诱导的针对EIAVFDDY13的干扰作用。基于分支链DNA检测技术（Branch DNA）进一步证实,EIAVFDDY13感染MDM后,相对于EIAVUK3感染组,其上调了细胞内可溶性病毒受体ELR-IN、TLR3、INFβ和Tetherin等分子的表达。这些分子可对EIAV在MDM内的感染和复制过程通过不同机制产生抑制作用。通过适量Poly I:C激活MDM内的TLR3,可在MDM细胞中模拟出近似于EIAVFDDY13感染MDM后细胞内上述分子的表达水平,且该状态细胞获得了抵抗EIAV感染的能力。据此,推测TLR3通路的激活,在EIAVFDDY13诱导更强的SIR中发挥重要作用。此外,考虑到Toll样受体、I型干扰素等在激活固有免疫和调节特异性免疫应答中发挥的重要作用,EIAV强、弱毒株间诱导的SIR差异与二者激活固有免疫应答时的差异,并借由该差异进一步影响到特应性免应答的建立,尤其是疫苗诱导的保护性免疫应答建立的相关性和作用机制,是需要进一步关注和阐明的问题。本论文获得的上述研究结果,将促进我们对EIAV中国弱毒疫苗株生物学特性的更多了解。同时,基于对该疫苗株诱导保护性免疫机制的探讨,也将为如何设计可诱导保护性免疫的慢病毒疫苗提供参考。尽管把弱毒疫苗作为慢病毒疫苗的设计策略应用于HIV疫苗的研究,还存在争议。但在全世界投入了巨大的人力、物力,耗费了近30年的时间用于HIV相关研究,而取得的结果却只是在攻克疫苗诱导免疫保护难关上举步维艰时,对作为AIDS动物模型的EIA的研究,特别是成功的诱导了免疫保护的中国EIAV弱毒疫苗的作用机制研究,这种“从成功中学习”的策略,无疑具有其不可替代的价值。
温建新[7]（2003）在《带有HIS标签的重组EIAV感染性分子克隆的构建》文中研究指明马传染性贫血病毒（EIAV，简称马传贫）是反转录病毒科慢病毒属的成员之一，是马传染性贫血病（EIA）的病原体。我国的EIAV弱毒疫苗是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗，成功地控制了我国EIA的流行。该毒株是将EIAV L株（EIAV L）通过驴体传代，使其毒力明显增强，然后在驴白细胞培养物上连续传代致弱获得的。由于我国马传贫弱毒疫苗存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题，目前尚未得到欧美等发达国家的认证，如要进入国际市场，急需建立一种EIAV强、弱毒快速鉴别诊断方法。目前我国使用的马传贫弱毒疫苗未进行克隆纯化，如果用带有分子标签的马传贫弱毒疫苗感染性克隆衍生的病毒作为疫苗代替现有疫苗，将有利于现地使用和推广。本研究应用已构建好的EIAV驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆载体（pOK8266）为模板，通过SOE PCR方法在感染性分子克隆载体的S2基因独特区内引入突变点，形成含有酶切位点（NspV）的突变体（P1P4）。将突变体（P1P4）亚克隆至pBluescript SK（M13-）质粒，形成pB-P1P4中间载体；人工合成两条六个组氨酸的引物，作为标签，将其插入pB-P1P4中间载体的NspV位点，形成带标签的中间载体；用ApaI酶切pOK8266和中间载体，连接转化，构建带标签的重组感染性分子病毒克隆载体（EIAV-pOK8.2-HIS），经PCR、酶切和测序表明，六个组氨酸已插入pOK8266的S2基因内。分别转染驴皮肤细胞（FDD）和驴白细胞，将转染驴皮肤细胞收获物传至第六代，电镜下未观察到EIAV病毒；而将转染驴白细胞收获物传代至第六代时，电镜下观察到了典型的病毒粒子。提取前病毒DNA，PCR扩增P1P4片段，亚克隆至pMD18-T载体，测序证明前病毒DNA含有六个组氨酸，从而在体外获得了感染性克隆病毒株。本研究通过SOE法巧妙地对S2基因引入突变，插入HIS标签，成功地获得了标记感染性分子克隆，证明S2基因缺失突变株在体外巨嗜细胞上培养不影响其复制力，为野毒株和疫苗毒的鉴别诊断打下基础。但病毒的致病性、免疫原性和标签的表达情况尚需作动物实验做进一步的探索。
刘影,王雪峰,王美月,陈杰,孙君帅,马建,王晓钧[8]（2018）在《马传染性贫血病弱毒疫苗免疫马血清对同源和异源病毒株中和活性的研究》文中认为为评价马传染性贫血病毒（EIAV）弱毒疫苗免疫马血清对同源和异源病毒株的中和活性差异,本研究构建了不同EIAV株(EIAVFDDV3-8、EIAVLN、EIAVUK和EIAVYN)Env的重组表达质粒,并将这些质粒与包装质粒（pUK-Gag-pol）及表达荧光素酶的转移质粒（pONY8.1）共转染293T细胞;将假病毒与疫苗免疫马（5#、8#）血清共孵育后接种于ELR1-293T细胞单层;通过检测细胞中荧光素酶活性,计算疫苗免疫马血清中和50%假病毒感染的血清稀释倍数,评价血清对病毒的中和活性。结果显示,疫苗免疫马血清对表达不同Env假病毒的中和滴度存在差异,从高到低依次是:pVR1012-FDDV-3-8-Env、pVR1012-LN-Env、pVR1012-UK-Env、pVR1012-YN-Env,而且免疫血清对不同病毒株的中和能力与不同病毒株Env的变异呈负相关（5#,R2=0.99;8#,R2=0.96）。虽然免疫马血清中和异源病毒株的能力显着低于同源病毒株,但其对异源病毒株仍具有良好的中和作用,本研究结果表明中国EIAV弱毒疫苗可以激发抗不同病毒株的广谱中和抗体。
刘志英[9]（2002）在《马传染性贫血病弱毒疫苗感染性分子克隆株及其亲本株前病毒DNA在外周血白细胞内存在动态的研究》文中研究指明本研究在自构建的马传染性贫血病驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株（Fetal donkey dermal-adapted vaccine strain，FDD）感染性分子克隆株PFD3的基础上，又用该克隆株两个衍生的感染性分子克隆株PD9和PD9L2以及马传染性贫血病驴白细胞弱毒（Donkey leukocyte adapted vaccine strain,DLV）和FDD分别接种6匹马和4头驴（D1、D2、D3、D4），利用套式PCR方法，对接种动物的外周血白细胞的前病毒DNA进行了定期的检测。为鉴定感染性分子克隆毒是否具有与FDD和DLV同样的免疫效果，又对PD9和PD9L2分别接种的4头驴用驴系马传贫强毒（Donkey adapted equine infectious anemia virus，DA-EIAV）进行了攻击试验。同时，又选择了中国EIAV强、弱毒株存在稳定差异位点的囊膜表面糖蛋白基因（env区gp90部分）内的一段区域设计引物，利用套式PCR方法对其进行扩增和序列测定，以检测攻毒的4头驴体内前病毒DNA的存在情况。其结果如下。 通过针对EIAV前病毒DNA的LTR区的特异性套式-PCR扩增反应，发现不论是DLV或FDD，还是PD9或PD9L2，于接种动物后15天在外周血白细胞内都检测到特异性EIAV前病毒DNA的存在。接种3个月后，在部分动物外周血白细胞中的前病毒DNA LTR区检测结果一度为阴性，但随后直到接种后第390天，大部分动物的前病毒DNA LTR区检测呈阳性结果。本研究首次从分子生物学水平上证实了在一定时期内，我国EIAV弱毒疫苗株及其感染性分子克隆衍生毒免疫动物体外周血白细胞染色体内有特异性EIAV前病毒DNA基因的存在。 试验动物攻毒二周后，接种PD9的D1、D2体温有一过性升高的现象。而接种PD9L2的D3、D4在本次试验监测的时间范围内，无任何临床症状的出现。而对照组健康驴在攻毒后第17天发生典型传贫死亡。琼脂扩散实验（AGID）结果表明，D1和D2在攻毒之前P26抗体一直为阴性结果。D3、D4在接种后一个月P26抗体转为阳性，及至第3个月D3转为阴性。在这期间D4一直为阳性反应。6个月后用EIAV-DA强毒攻击后，D1、D2琼扩反应呈现为阳性结果，D3的P26抗体再次转为阳性，D4仍然保持阳性反应。在本试验监测的时间范围内，接种感染性分子克隆衍生毒后6个月攻毒的4头驴均健康存活，该批试验动物目前仍在监测之中。 通过检查外周血白细胞发现前病毒DNAenv区在攻毒后不同时期存在较大的变异，而其编码的氨基酸序列则表现为随着时间的变化而呈现较为规律性变异。在强、弱毒株存在稳定差异的位点处，攻毒后的不同时期各动物的表现不同，但 摘 要一个共同的趋势是最初由完全的强毒特征的序列向弱毒或强、弱毒株共同存在的特征序列转变。在本试验监测的时间范围内，还没有一个动物在最后监测时间点出现将强毒特征序列完全清除出体内的现象。不管如何，所有兔疫动物在观察期内，抵抗了致死剂量EIAV强毒的攻击，虽然在一定时期的前病毒DNA都可被检测到，但所有动物在大部分时间内都表现临床上的健康状态。 本研究首次对接种我国EIAV弱毒疫苗株（DLV和FDD）动物的外周血白细胞内前病毒 DNA的存在情况以及对接种感染性分子克隆衍生毒（PDg和PDgLZ）的动物在攻毒后体内的前病毒DNA成分进行了监测。这将对我国EIAV弱毒疫苗的免疫保护机理的最后阐明提供有意义的借鉴作用。
秦玉寅[10]（2014）在《马传染性贫血病毒gp45基因多样性及其进化特征研究》文中研究表明马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus，EIAV）属反转录病毒科慢病毒属，是马传染性贫血（EIA，简称马传贫）的病原体。EIAV中国弱毒疫苗株是唯一被成功大规模应用的慢病毒疫苗，其中EIAV的env基因编码的跨膜蛋白gp45在介导病毒与靶细胞融合、糖蛋白的结合、病毒复制和感染过程中起重要的作用，同时还是重要的免疫原。以EIAV gp45为研究对象，研究其致弱和诱导免疫保护的机制，将对慢病毒免疫机制研究和有效疫苗研制提供参考，因而具有重要的理论意义和应用价值。本研究采用基因序列比较分析的方法，对EIAV弱毒疫苗的亲本强毒株EIAVLN40，EIAV驴强毒株（EIAVDV117），EIAVDV117在驴白细胞传代第32代（EIAVDLV32）、62代（EIAVDLV62）、92代（EIAVDLV92）、121代（EIAVDLV121，即驴白细胞弱毒疫苗）、137代（EIAVDLV137）病毒株，EIAVDLV121在驴胎皮肤细胞传代第4代（EIAVFDDV4）、第13代（EIAVFDDV13）、23代（EIAVFDDV23）病毒株，以及EIAVFDDV13在驴外周血白细胞传代第2代（EIAVFM2）和第6代（EIAVFM6）病毒株的前病毒gp45基因序列进行比较分析。结果显示：①EIAVLN40在体外传代过程中gp45主要有39个核苷酸位点发生变异，其中有16个变异位点引起氨基酸的改变；②不同代次病毒株与EIAVLN40的平均差异在2.122.77%之间；③EIAVLN40有3个（50G、51L和277K）特有的氨基酸位点，有3个变异位点（42E/K、166I/V和256L/F）主要出现在驴胎皮肤细胞适应毒株（EIAVFDDV13和EIAVFDDV23），54V（I）/T变异位点主要发生疫苗株（EIAVDLV121和EIAVFDDV13）及其衍生病毒；④驴胎皮肤细胞适应毒株的所有克隆在核苷酸序列出现了783G/A突变，在gp45基因出现了一个终止密码子781TGA783，导致了gp45截短的现象。病毒在驴外周血白细胞EIAVFM1中有23/25的克隆存在该突变位点，EIAVFM6中有3/21的克隆，在EIAVDV117中有3/22的克隆，其余毒株均为出现该变异。为进一步研究EIAV gp45基因783G/A突变在体内的变化规律，本研究对EIAVLN40、EIAVDLV121和EIAVFDDV13感染马匹后gp45基因的部分序列进行扩增分析，结果显示EIAVLN40、EIAVDLV121的克隆存在极低比例的783G/A突变，EIAVFDDV13感染马匹后随着感染时间增加，783G/A突变逐渐减少，甚至完全丢失。另一方面，本研究根据本课题相关研究单位南开大学研究人员对EIAV gp45的晶体结构解析结果，通过反向遗传学操作手段对影响gp45螺旋六聚体结构稳定性的8个位点分别进行突变，构建感染性克隆并拯救病毒，以及比较各突变病毒株与野生型病毒株在体外复制能力，结果显示，T491I突变病毒株复制能力明显降低，其余7个变异位点对病毒株复制影响不明显。通过病毒感染能力分析，尽管在41℃下各突变株的感染能力均有下降，尤其是V505T和L512T突变株的病毒感染力降低最为明显，表明不同变异位点对温度变化的敏感性存在差异，推测V505T和L512T的突变株减弱了gp45螺旋六聚体结构稳定性，而其余变异位点可能会增加其稳定性。以上研究结果表明：EIAV gp45基因存在明显的基因多样性特点，gp45截短突变是病毒适应在驴胎皮肤细胞培养的结果，在疫苗株中出现的V505/I的突变可能会改变gp45螺旋六聚体结构稳定性进而影响病毒的感染性。
二、马传贫强、弱毒血清抗体鉴别诊断法在古巴的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、马传贫强、弱毒血清抗体鉴别诊断法在古巴的应用（论文提纲范文）
（2）马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用（论文提纲范文）
| 引言 |
| 一、马传染性贫血病病毒概述 |
| 1 国内外EIAV毒株及特性 |
| 2 gag基因及其编码蛋白 |
| 3 pol基因及其编码产物 |
| 4 env基因及其编码产物 |
| 4.1 表面蛋白(SU／gp90) |
| 4.2 跨膜蛋白(TM／gp45) |
| 5 调节蛋白及其编码区 |
| 5.1 Tat蛋白及其作用元件TAR |
| 5.2 S2开放阅读框架(ORF) |
| 5.3 S3开放阅读框架和Rev蛋白 |
| 5.4 EIAV的非编码区——LTR |
| 二、慢病毒与糖基化 |
| 1 SIV与糖基化 |
| 2 HIV与糖基化 |
| 三、本研究的主要内容和意义 |
| 研究报告 |
| 实验一 EIAV-DLA株与其亲本强毒EIAV-L株env基因及S2基因变异分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 质粒和菌株 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 质粒的小量提取 |
| 2 方法 |
| 2.1 驴白细胞的培养 |
| 2.2 EIAV病毒RNA的提取 |
| 2.3 强、弱毒包含完整S2和gp90基因的扩增 |
| 2.4 强、弱毒代表性gp90部分基因的原核表达载休克隆的构建 |
| 2.5 强、弱毒部分gp90蛋白的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 包含完整S2和gp90基因的克隆与鉴定 |
| 3.2 EIAV-DLA及EIAV-L株gp90核苷酸和氨基酸序列比较 |
| 3.3 从EIAV-L株到DLA后gp90氨基酸比较 |
| 3.4 从EIAV-L株到DLA后gp90氨基酸点突变 |
| 3.5 EIAV-DLA及EIAV-L株S2基因核苷酸和氨基酸序列比较 |
| 3.6 EIAV-DLA及EIAV-L株S2基因氨基酸变异分析 |
| 3.7 强弱毒代表性gp90部分基因的原核表达 |
| 实验二 马传染性贫血强、弱毒gp90在真核细胞系中的稳定表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及细胞系 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 细胞培养用试剂 |
| 1.4.1 Hank's液 |
| 1.4.2 0.25％胰酶 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组逆转录病毒载体的构建 |
| 2.2 重组真核表达载体的构建 |
| 2.3 转染用质粒的纯化 |
| 2.4 重组逆转录病毒的产生 |
| 2.5 表达EIAV gp90的SP20的产生 |
| 2.6 RT-PCR检测EIAV gp90在SP-20中的表达 |
| 2.7 表达EIAV gp90的293T细胞系的产生 |
| 2.8 免疫荧光检测EIAV gp90在293T细胞系的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 包含强、弱毒gp90重组逆转录病毒载体的构建 |
| 3.2 包含强、弱毒gp90重组真核表达载体的构建 |
| 3.3 强、弱毒gp90重组逆转录病毒的制备 |
| 3.4 强、弱毒gp90在SP-20中的表达 |
| 3.5 表达强、弱毒gp90真核细胞系293T的筛选 |
| 实验三 EIAV一系列N-连接糖基化突变克隆和嵌合感染性分子克隆的构建及生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物的合成和克隆或者亚克隆片段的序列测定 |
| 1.4 驴白细胞的分离培养及FDD细胞、EFK细胞的培养 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 质粒的提取与纯化 |
| 1.6.1 质粒的小量提取 |
| 1.6.2 质粒的大量提取和纯化 |
| 2 方法 |
| 2.1 pOK-LTR-DLA／L、pOK-env-DLA／L和pOK-LTRenv-DLA／L嵌合分子克隆的构建 |
| 2.2 N-连接糖基化突变分子克隆的构建 |
| 2.2.1 N-191，N-236，N-246突变分子克隆的构建 |
| 2.2.2 N-191+N-236，N-191+N-246，N-236+N-246突变分子克隆的构建 |
| 2.2.3 N-191+N-236+N-246突变分子克隆的构建 |
| 2.3 转染 |
| 2.4 转录酶(RT)活性的测定 |
| 2.5 电镜观察 |
| 2.6 嵌合病毒前病毒基因组的提取 |
| 2.7 嵌合病毒前病毒基因组LTR的扩增及测序 |
| 2.8 动物试验 |
| 2.9 血清抗体的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒pOK-LTR-DLA／L的构建 |
| 3.2 重组质粒pOK-env-DLA／L的构建 |
| 3.3 重组质粒pOK-LTRenv-DLA／L的构建 |
| 3.4 N-191，N-236，N-246突变分子克隆的获得 |
| 3.5 N-191+N-236，N-191+N-246，N-236+N-246突变分子克隆的获得 |
| 3.6 N-191+N-236+N-246突变分子克隆的获得 |
| 3.7 马传染性贫血病毒感染性分子克隆衍生病毒的获得 |
| 3.8 嵌合病毒LTR的扩增及鉴定 |
| 3.9 人工感染马临床表现及血清学检测 |
| 讨论 |
| 1 EIAV env及S2基因变异及其生物学意义 |
| 2 LTR变异对EIAV毒力及细胞嗜性的影响 |
| 3 EIAV env基因点突变对病毒的复制影响及其它结构蛋白特异性抗体对试验马致病性的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）马传染性贫血病驴白细胞弱毒疫苗细胞免疫机理的研究（论文提纲范文）
| 第一章 前言 |
| 1 马传染性贫血病及其病原概述 |
| 2 马传染性贫血病驴白细胞弱毒疫苗(DLV)免疫机理的研究进展 |
| 3 国外EIAV免疫学研究进展 |
| 4 本研究要解决的问题和意义 |
| 第二章 流式细胞术分析健康马外周血中T淋巴细胞亚群方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 马传染性贫血病驴白细胞弱毒疫苗(DLV)免疫马及其攻毒后外周血中T淋巴细胞亚群动力学变化的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 马传染性贫血病毒特异性T淋巴细胞增殖反应动力学变化的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 马传染性贫血病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外增殖和杀伤功能检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 马传染性贫血病驴白细胞弱毒疫苗(DLV)体内诱生马传贫病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| CURRICULUM VITAE |
（4）EIAV疫苗株gp90基因的多克隆构成和体内进化与免疫保护的相关性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 国外 EIAV 的研究进展 |
| 1.1.1 EIAV 基因结构和病毒蛋白功能研究 |
| 1.1.2 EIAV 与感染马间的相互作用 |
| 1.2 中国 EIA 弱毒疫苗及相关研究进展 |
| 1.2.1 中国EIA 弱毒疫苗研制的路线 |
| 1.2.2 中国EIA 弱毒疫苗致弱和诱导免疫保护机制的研究 |
| 1.3 将要开展的研究工作及本实验的目的与意义 |
| 第二章 EIAVFDDVgp90 基因的多克隆构成及体内复制动态 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 EIAVFDDV免疫马匹及实验样本的采集 |
| 2.1.3 马PBMC 的分离及前病毒DNA 的提取 |
| 2.1.4 病毒RNA 的制备和反转录 |
| 2.1.5 PCR 和nest PCR |
| 2.1.6 Nest PCR 的敏感性实验 |
| 2.1.7 PCR 产物的克隆、测序和分析 |
| 2.1.8 Real time RT-PCR 标准曲线建立 |
| 2.1.9 免疫马体内病毒载量的定量分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 Nest PCR 敏感性实验结果 |
| 2.2.2 EIAV_(FDDV) gp90 基因的多样性构成 |
| 2.2.3 EIAV_(FDDV) gp90 基因在免疫马体内的进化动态 |
| 2.2.4 Real time RT-PCR 标准曲线建立 |
| 2.2.5 EIAV_(FDDV)在免疫马体内的载量动态 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 免疫抑制对 EIAV_(FDDV)免疫马体内 EIAV 载量的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验动物、临床指标监测与样本采集 |
| 3.1.2 免疫抑制程序与抑制效果评价（淋巴细胞增殖实验和DTH 检测） |
| 3.1.3 Nest PCR 和real time RT-PCR |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 免疫抑制过程中的临床指标监测 |
| 3.2.2 DTH 实验结果 |
| 3.2.3 PHA-P 作为刺激原的非特异性淋巴细胞增殖实验结果 |
| 3.2.4 Nest PCR 检测和序列分析结果 |
| 3.2.5 Real time RT-PCR 的检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 EIAV_(FDDV)与感染性克隆毒 EIAV_(FDDV)3-8 诱导免疫保护的差异比较 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 实验动物和细胞 |
| 4.1.2 病毒 |
| 4.1.3 攻毒实验 |
| 4.1.4 反转录酶活性检测 |
| 4.1.5 Nest PCR 和real time RT-RCR |
| 4.1.6 中和实验（中和实验、MTT 染色和巨噬细胞生长状态的显微镜观察） |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 攻毒后实验马匹的临床体征和病毒载量 |
| 4.2.2 中和抗体水平检测 |
| 4.2.3 攻毒后未出现EIA 临床症状免疫马体内病毒gp90 基因序列的扩增与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）马传染性贫血病驴白细胞弱毒及其亲本马强毒（L株）基因组序列比较分析以及弱毒感染性分子克隆的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前 言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一 马传染性贫血病毒概述 |
| 1 EIAV的历史及分类地位 |
| 2 EIAV的形态、理化及生物学特性 |
| 3 EIAV的致病性 |
| 4 毒株分类 |
| 二 马传染性贫血病毒的分子生物学 |
| 1 EIAV基因组的结构 |
| 2 EIAV的基因及其编码的蛋白 |
| 3 EIAV的复制、蛋白质合成和形态发生 |
| 4 EIAV基因表达的调控 |
| 5 EIAV的持续性感染、致病及免疫保护机制 |
| 6 小结 |
| 三 动物和人慢病毒的比较病毒学研究进展 |
| 1 HIV研究的模型系统 |
| 2 动物和人慢病毒的比较病毒学研究进展 |
| 3 自然慢病毒宿主模型研究展望 |
| 第二部分 研究报告 |
| 一 马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组的克隆及序列分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 二 马传染性贫血病毒L株前病毒全基因组的克隆及序列分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 三 DLA-EIAV、EIAV L株、已报道毒株基因组序列及结构的比较分析 |
| 1 DLA-EIAV株与L株、DA-EIAV、1369株核苷酸和氨基酸序列比较 |
| 2 EIAV L株与已报道的国外毒株核苷酸和氨基酸序列比较 |
| 3 gag、pol基因及其编码蛋白的比较结果 |
| 4 表面糖蛋白分子特性的比较结果 |
| 5 跨膜蛋白的比较结果 |
| 6 LTR的比较结果 |
| 7 反式激活蛋白Tat的比较结果 |
| 8 S2蛋白的比较 |
| 9 Rev蛋白的比较结果 |
| 四 马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 五 马传染性贫血病毒强/弱毒嵌合病毒重组质粒的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 六 马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒株LTR启动子功能的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 七 讨论 |
| 1 EIAV L株与国外已报道EIAV每株亲缘关系较远 |
| 2 EIAV L株和DLA-EIAV株基因组保守区的生物学意义 |
| 3 EIAV Gag-Pol的移框阅读机制 |
| 4 Gag和gp90在疫苗保护中的作用 |
| 5 gp90的糖基化方式与病毒毒力的关系 |
| 6 DLA-EIAV株跨膜蛋白是否截短尚存在争议 |
| 7 病毒复制调控成分对DLA-EIAV和EIAV L株生物学特性的影响 |
| 8 S2蛋白发生很大变异 |
| 9 马传贫驴白细胞弱毒疫苗免疫保护的初步认识 |
| 10 DLA-EIAV株感染性分子克隆的构建为进一步的研究奠定了基础 |
| 11 EIAV-p8.2克隆毒对FDD细胞是否具有嗜性有待进一步证实 |
| 12 我国ELAV强/弱毒嵌合病毒的构建具有重要意义 |
| 13 对EIAV弱毒株LTR启动子功能的初步认识 |
| 结 论 |
| 参考文献 |
| 致 谢 |
（6）EIAV中国弱毒疫苗株的抗原多态性及超感染抵制现象在其诱导保护性免疫中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 EIAV中国弱毒疫苗研制的路线 |
| 1.2 EIAV中国弱毒疫苗的致弱和诱导免疫保护机制的研究 |
| 1.2.1 强弱毒株基因组间的差异分析及对病毒致弱机制的提示意义 |
| 1.2.2 免疫指标检测平台的建立与强弱毒诱导免疫差异的初步分析 |
| 1.3 本论文中主要开展的研究工作及意义 |
| 2 研究报告一 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 细胞和病毒株 |
| 2.2.2 实验材料、临床指标评价和样本采集 |
| 2.2.3 免疫和攻毒 |
| 2.2.4 免疫抑制实验 |
| 2.2.5 病毒RNA的提取和RT-PCR |
| 2.2.6 克隆和测序 |
| 2.2.7 测序分析 |
| 2.2.8 病毒载量的确定 |
| 2.2.9 反转录酶活性检测 |
| 2.2.10 血清学分析 |
| 2.2.11 Branch-DNA技术检测细胞内多种分子mRNA的表达 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 EIAV_(FDDV13)对强毒株的攻毒发病保护明显优于EIAV_(FDDV)3-8 |
| 2.3.2 免疫抑制状态下,EIAV_(FDDV13)诱导的感染保护明显优于EIAV_(FDDV)3-8 |
| 2.3.3 EIAV_(FDDV13)诱导中和抗体能力明显高于EIAV_(FDDV)3-8 |
| 2.3.4 EIAV弱毒疫苗株和其感染性克隆株体外和体内复制特性相似 |
| 2.3.5 EIAV_(FDDV13)和EIAV_(FDDV)3-8感染MDM后激活Toll样受体的差异比较 |
| 2.3.6 EIAV_(FDDV13)和EIAV_(FDDV)3-8感染MDM内Ⅰ型干扰素mRNA的表达差异 |
| 2.3.7 EIAV_(FDDV13)和EIAV_(FDDV)3-8gp90基因的体内演化具有相似特征 |
| 2.3.8 EIAV_(FDDV13)和EIAV_(FDDV)3-8gp90基因的相关性和多样性比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 研究报告(二) |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 病毒株和细胞 |
| 3.2.2 Realtime定量RT-PCR检测 |
| 3.2.3 EIAV感染细胞内基因组RNA的原位荧光杂交 |
| 3.2.4 基于Branch-DNA技术对细胞内多种分子mRNA表达的检测 |
| 3.2.5 Poly I：C处理细胞和EIAV的感染 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 EIAV_(FDDV13)和EIAV_(UK3)在宿主细胞MDM上的复制特性比较 |
| 3.3.2 EIAV_(FDDV13)和EIAV_(UK3)在MDM上诱导的SIR |
| 3.3.3 EIAV_(FDDV13)和EIAV_(UK3)感染MDM后诱导的ELR1和可溶性ELR1(ELR1-IN)的表达差异 |
| 3.3.4 EIAV_(FDDV13)和EIAV_(UK3)感染MDM后诱导TLR3、7、8、9的表达差异 |
| 3.3.5 EIAV_(FDDV13)和EIAV_(UK3)感染MDM后诱导Ⅰ型干扰素的表达差异 |
| 3.3.6 EIAV_(FDDV13)和EIAV_(UK3)感染MDM后诱导的A3Z3、Trim5a、SAMHD1和Tetherin的表达差异 |
| 3.3.7 TLR3的激活有效抑制了EIAV对MDM的感染 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小节 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）带有HIS标签的重组EIAV感染性分子克隆的构建（论文提纲范文）
| 符号与缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 综述 |
| 1 马传染性贫血概述 |
| 2 马传染性贫血病病毒及其特性 |
| 3 马传染性贫血病病毒分子生物学研究进展 |
| 第二部分 研究报告 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 引物与标记引物 |
| 1.5 细胞与血清 |
| 1.6 细胞培养用试剂的配制 |
| 1.7 ELISA专用液 |
| 2 方法 |
| 2.1. SOEPCR法构建S2基因突变点 |
| 2.1.1 质粒载体POK8266和BluescriptSKM（13-）质粒的酶切鉴定 |
| 2.1.2 P1P2和P3P4片段的扩增 |
| 2.1.3 SOE法扩增P1P4片段 |
| 2.1.4 P1P4片段突变点的酶切鉴定 |
| 2.1.5 P1P4片段纯化产物与载体质粒的酶切消化 |
| 2.1.6 质粒载体BluescriptSK去磷酸化 |
| 2.1.7 酶切产物的回收 |
| 2.1.8 外源DNA片段与载体连接 |
| 2.1.9 感受态细胞的制备 |
| 2.1.10 转化 |
| 2.1.11 质粒DNA的小量制备-碱裂解法 |
| 2.1.12 阳性克隆的PCR鉴定 |
| 2.1.13 序列测定 |
| 2.2 马传贫病毒弱毒标记感染性分子克隆载体的构建 |
| 2.2.1 人工合成标记物 |
| 2.2.2 NspV酶切PB-P1P4突变载体及去磷酸化 |
| 2.2.3 HIS-tag外源DNA片段与NspV酶切PB-P1P4突变载体连接 |
| 2.2.4 转化、提质粒 |
| 2.2.5 中间标记载体的鉴定 |
| 2.2.6 ApaI酶切POK8266质粒载体及去磷酸化 |
| 2.2.7 EIAV标记载体EIAV-p8.2-HIS的鉴定 |
| 2.3 标记感染性分子克隆的检测与表达 |
| 2.3.1 重组质粒EIAV-p8.2-HIS的纯化 |
| 2.3.2 驴白细胞的制备 |
| 2.3.3 转染 |
| 2.3.4 HIS-EIAV病毒的检测 |
| 2.3.5 HIS-EIAV病毒插入物的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 SOEPCR法构建S2基因突变点结果 |
| 3.1.1 质粒载体POK8266和BluescriptSKM（13-）质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.1.2 SOE法扩增P1P4结果 |
| 3.1.3 序列测定结果 |
| 3.2 马传贫病毒弱毒标记感染性分子克隆载体的构建 |
| 3.2.1 阳性克隆PB-P1P4的获得及鉴定 |
| 3.2.2 序列测定结果 |
| 3.2.3 突变标记载体POK8266-HIS的获得和鉴定 |
| 3.3 标记感染性分子克隆的检测与表达 |
| 3.3.1 重组质粒EIAV-p8.2的纯化结果 |
| 3.3.2 转染结果 |
| 3.3.3 连接T载体并测序 |
| 3.3.4 EIAV-p8.2-his克隆毒感染驴白细胞的电镜检测结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（8）马传染性贫血病弱毒疫苗免疫马血清对同源和异源病毒株中和活性的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.2 不同EIAV株Env重组表达质粒的构建 |
| 1.3 不同EIAV Env的表达鉴定 |
| 1.4 利用EIAV假病毒滴定EIAV中和抗体 |
| 1.5 EIAV囊膜蛋白的同源性分析 |
| 1.6 数据分析及处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 EIAV e nv重组质粒的构建及表达 |
| 2.2 病毒微量中和试验 |
| 2.3 血清中和滴度与Env变异的关联性分析 |
| 3 讨论 |
（9）马传染性贫血病弱毒疫苗感染性分子克隆株及其亲本株前病毒DNA在外周血白细胞内存在动态的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 引言 |
| 马传染性贫血病毒研究进展 |
| 1 EIAV的研究历史和现状 |
| 2 EIAV的形态和结构 |
| 3 EIAV的细胞嗜性和在感染动物体内的组织分布 |
| 4 EIAV的分子生物学研究进展 |
| 5 EIAV的生命周期 |
| 6 本研究的背景、目的和意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 FDD和DLV及PD9和PD9L2接种试验马和驴外周血白细胞的前病毒DNA跟踪监测 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 FDD感染性分子克隆衍生毒在接种驴体后前病毒DNA的存在情况及其对驴体诱生的免疫保护性反应 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）马传染性贫血病毒gp45基因多样性及其进化特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 马传染性贫血病毒概述 |
| 1.1.1 EIAV 的历史及分类地位 |
| 1.1.2 EIAV 形态、理化性质 |
| 1.1.3 EIAV 基因组结构 |
| 1.1.4 EIAV 的基因及其编码蛋白 |
| 1.1.5 调节蛋白及其编码的蛋白 |
| 1.1.6 长末端重复序列(LTR) |
| 1.1.7 EIAV 的感染过程 |
| 1.1.8 EIAV 中国弱毒疫苗研制的路线 |
| 1.2 跨膜蛋白( TM ,GP45)概述 |
| 1.3 本实验的目的与意义 |
| 第二章 EIAV GP45 基因多样性分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 质粒和菌株 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 驴白细胞的培养 |
| 2.2.2 驴胎皮肤细胞的培养 |
| 2.2.3 病毒复壮 |
| 2.2.4 核酸提取 |
| 2.2.5 cDNA 的合成 |
| 2.2.6 引物设计和目的片段扩增 |
| 2.2.7 PCR 产物的电泳检测及纯化 |
| 2.2.8 目的片段与 pMD18-T 载体的连接 |
| 2.2.9 转化及鉴定 |
| 2.2.10 序列分析比较 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 EIAV 在体外培养过程中及体内 gp45 PCR 结果鉴定 |
| 2.3.2 EIAV 在体外培养过程中 gp45 的变异 |
| 2.3.3 EIAV gp45 在体内的变异分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 EIAV GP45 突变株的拯救及生物学活性的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 细胞和菌株 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 EIAVUK3GP45 基因突变感染性克隆的构建 |
| 3.2.1.1 EIAVuk3 的点突变 |
| 3.2.1.2 电泳检测 |
| 3.2.1.3 PCR 产物的纯化 |
| 3.2.1.4 PCR 产物的消化 |
| 3.2.1.5 转化 |
| 3.2.1.6 质粒大量提取 |
| 3.2.2 病毒拯救 |
| 3.2.2.1 细胞转染 |
| 3.2.2.2 病毒的收获及浓缩 |
| 3.2.2.3 马胎皮肤细胞培养 |
| 3.2.2.4 逆转录酶活性检测 |
| 3.2.2.5 病毒盲传 |
| 3.2.2.6 突变病毒株拷贝数定量 |
| 3.2.3 突变病毒在宿主细胞 ED 上的复制动力学分析 |
| 3.2.3.1 接毒及培养 |
| 3.2.3.2 病毒 RNA 的提取 |
| 3.2.3.3 cDNA 的合成 |
| 3.2.3.4 REAL-TIME PCR 试验检测病毒体外复制能力 |
| 3.2.4 强毒株与突变毒株的温度敏感性实验 |
| 3.2.4.1 强毒株与衍生毒株在不同温度下的培养 |
| 3.2.4.2 病毒感染细胞 RNA 的提取 |
| 3.2.4.3 cDNA 的合成 |
| 3.2.4.4 Real-time PCR 引物 |
| 3.2.4.5 标准品及标准曲线的建立 |
| 3.2.4.6 强毒株和突变毒株的 ED 上清病毒载量的定量分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 序列比对结果 |
| 3.3.2 逆转录酶活性检测 |
| 3.3.3 检测强毒株和突变毒株的 Real-time PCR 标准曲线的建立 |
| 3.3.4 qPCR 对突变病毒拷贝数定量 |
| 3.3.5 强毒株和突变毒株在宿主细胞 ED 上的复制特性比较 |
| 3.3.6 强毒株和突变毒株不同温度下在宿主细胞ED 上的感染能力比较 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、马传贫强、弱毒血清抗体鉴别诊断法在古巴的应用（论文参考文献）
- [1]马传贫强、弱毒血清抗体鉴别诊断法在古巴的应用[J]. 孔宪刚,宁希德. 中国畜禽传染病, 1994(01)
- [2]马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用[D]. 涂亚斌. 中国农业科学院, 2005(07)
- [3]马传染性贫血病驴白细胞弱毒疫苗细胞免疫机理的研究[D]. 李红梅. 中国农业科学院, 2004(04)
- [4]EIAV疫苗株gp90基因的多克隆构成和体内进化与免疫保护的相关性[D]. 马建. 中国农业科学院, 2008(10)
- [5]马传染性贫血病驴白细胞弱毒及其亲本马强毒（L株）基因组序列比较分析以及弱毒感染性分子克隆的构建[D]. 王柳. 中国农业科学院, 2001(01)
- [6]EIAV中国弱毒疫苗株的抗原多态性及超感染抵制现象在其诱导保护性免疫中的作用研究[D]. 马建. 中国农业科学院, 2012(12)
- [7]带有HIS标签的重组EIAV感染性分子克隆的构建[D]. 温建新. 新疆农业大学, 2003(01)
- [8]马传染性贫血病弱毒疫苗免疫马血清对同源和异源病毒株中和活性的研究[J]. 刘影,王雪峰,王美月,陈杰,孙君帅,马建,王晓钧. 中国预防兽医学报, 2018(02)
- [9]马传染性贫血病弱毒疫苗感染性分子克隆株及其亲本株前病毒DNA在外周血白细胞内存在动态的研究[D]. 刘志英. 中国农业科学院, 2002(02)
- [10]马传染性贫血病毒gp45基因多样性及其进化特征研究[D]. 秦玉寅. 塔里木大学, 2014(03)