一、检测猴艾滋病D型逆转录病毒抗体的ELISA技术(论文文献综述)
齐佳伟,许丽,闻艳丽,刘刚,饶品华[1](2020)在《电化学生物传感器在高致病性病毒检测中的应用》文中研究表明电化学生物传感器具有高效、灵敏、低成本等优势,已在多种高致病性病毒检测中得到应用。该文介绍电化学生物传感器的工作原理和分类,综述近年来电化学生物传感技术在肝炎病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、寨卡病毒、新型冠状病毒等多种高致病性病毒检测中的研究进展,最后讨论该技术在病毒检测领域面临的挑战和未来发展方向。
刘洁玉[2](2019)在《冀南地区鸡胚蛋有害菌的检测》文中提出鸡胚蛋制品是人们喜食的传统营养食品,但在鸡胚孵化过程中,由于多种病原菌污染,给鸡胚蛋及其制品安全带来隐患。因此,了解鸡胚蛋中病原菌的污染情况,建立快速检测食源性病原菌的方法,对提高鸡胚的健康存活率及孵化场的经济效益,保障鸡胚蛋制品安全与公共卫生具有重要意义。1、为探究鸡胚蛋污染病原菌情况,采集91枚病死鸡胚蛋,解剖胚体,从肝脏分离细菌、培养,观察菌落菌体形态,提取分离株DNA,经16S rDNA基因序列扩增和测序,在GenBank核酸数据库中,与相近序列进行BLAST比对,对分离株进行鉴定。结果发现,鸡胚蛋外观有裂痕或粪便污染物等,解剖发现皮下有胶冻状物、肝脏呈土黄色、卵黄吸收不良。从鸡胚蛋内共分离鉴定出86株细菌,污染率为59.3%(54/91),混合污染率为42.6%(23/54)。鉴定出11种细菌,其中大肠杆菌占比为37.2%(32/86)、粪肠球菌为26.7%(23/86)、志贺氏菌为9.3%(8/86)、阴沟肠杆菌为5.8%(5/86)、博得特氏菌为4.7%(4/86)、沙门氏菌为4.7%(4/86)、金黄色葡萄球菌为3.5%(3/86)、鲍氏不动杆菌为3.5%(3/86)、Pseudomonas psychrotolerans为2.3%(2/86)、Massilia alkalitolerans为1.2%(1/86)和铜绿假单胞菌为1.2%(1/86)。这些表明病死鸡胚的污染较高,涉及多种病原菌,其中以大肠杆菌和粪肠球菌为主,这为鸡胚蛋制品的安全生产与监测提供依据。2、为建立一种快速检测鸡胚蛋中大肠杆菌的方法,根据大肠杆菌fimC基因设计一对特异性引物,建立了荧光定量PCR方法。经鸡胚蛋样品试验,与沙门氏菌、志贺氏菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌等病原菌之间无交叉反应,特异性强;对大肠杆菌的最低检测限为101CFU/mL,比普通PCR方法敏感约100倍,灵敏性好;重复性试验变异系数小于2%,说明重复性好,该方法稳定,可用于鸡胚蛋制品中大肠杆菌的检测。3、为建立一种快速检测鸡胚蛋中粪肠球菌的方法,根据粪肠球菌sodA基因设计一对特异性引物,建立了荧光定量PCR方法。经鸡胚蛋样品试验,与屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌等病原菌之间无交叉反应,特异性强;对粪肠球菌的最低检测限为101CFU/mL,比普通PCR方法敏感约100倍,灵敏性好;重复性试验变异系数小于2%,说明重复性好,该方法稳定,可用于鸡胚蛋制品中粪肠球菌的检测。4、针对鸡胚蛋主要污染大肠杆菌和粪肠球菌,建立了大肠杆菌和粪肠球菌双重荧光定量PCR方法。结果显示,经鸡胚蛋样品试验,大肠杆菌产物的Tm值为85.6℃86℃,粪肠球菌产物的Tm值为83.9℃84℃,且与其他菌无交叉反应;大肠杆菌和粪肠球菌重复性试验中变异系数较小,重复性好;对大肠杆菌和粪肠球菌的检测限均为101 CFU/mL。说明该双重荧光定量PCR方法敏感、特异、稳定、可靠,一次反应同时检测大肠杆菌和粪肠球菌,可用于鸡胚蛋制品的检测。
余磊[3](2018)在《恒河猴白介素22和XC趋化因子1的研究》文中认为HIV-1感染会导致肠道固有层CD4+T淋巴细胞的大量损耗,引起肠道相关免疫系统结构和功能的异常、肠道上皮屏障损伤、微生物移位和持续的免疫激活。因此,HIV-1感染也被视为一种肠道疾病。增强肠道固有免疫以及在肠道部位建立特异的抗HIV-1免疫对HIV/AIDS防治具有重要意义。IL-22-IL-22RI和XCL1-XCRI是肠道粘膜免疫屏障维持和调节的重要细胞因子通路。已有研究证明IL-22-IL-22R1通路在炎症、抗病原菌感染和肠上皮组织维持和修复等方面具有重要作用,是粘膜系统重要的固有免疫分子,具有潜在的治疗性调节作用。XCL1-XCR1不仅能调节肠道T淋巴细胞和树突状细胞(Dendritic cells,DCs)细胞组成,而且还在肠道内抗原递呈和维持肠道免疫稳态中起重要作用。不仅如此,XCL1也被认为是有效的粘膜免疫佐剂。这些研究结论无疑都是在小鼠模型中得到的,而恒河猴作为人类疾病,特别是HIV-1研究不可替代的实验动物模型,其IL-22-IL-22R1和XCL1-XCR1通路的生物学特性目前仍知之甚少。为更好的利用恒河猴研究IL-22通路分子在HIV-1感染过程中肠道粘膜相关损伤修复中的作用以及XCL1在HIV-1疫苗创制中的应用前景。本研究做了以下几点工作:1、为了解恒河猴IL-22及其受体IL-22R1的分子特性及功能,本研究采用RT-PCR和RACE扩增方法首次克隆了 IL-22和IL-22R1cDNA核苷酸序列。IL-22 cDNA 全长 1163bp 包括 69bp-5’UTR,540bp-ORF 和 554bp-3’UTR。通过匹配基因组发现IL-22基因含有5个外显子,位于恒河猴第11号染色体上,与IFN-γ和IL-26等基因形成IFN/IL-10相关细胞因子基因簇。IL-22R1 cDNA全长2802bp(32bp-5’UTR 1725bp-ORF和1045bp-3’UTR)。通过匹配基因组发现IL-22R1基因含有7个外显子,位于第1号染色体上,而启动子分析显示IL-22R1没有保守的TATA启动元件,但在启动子上游序列分布着两个CpG岛。通过氨基酸序列比对发现恒河猴IL-22和IL-22R1与人IL-22和IL-22R1的氨基酸序列相似性分别为95.5%和96%。不仅如此,与IL-22结构和功能密切相关的保守位点如半胱氨酸、糖基化位点以及配体-受体结合位点均与人 IL-22/IL-22R1 一致。2、运用实时荧光定量RT-PCR方法分析了IL-22 IL-22R1mRNA分子在正常恒河猴组织中的表达分布,发现IL-22和IL-22R1mRNA在肠道各部位均呈现高水平表达,预示着IL-22-IL-22R1在肠道免疫系统中发挥重要作用。为进一步研究恒河猴IL-22的肠道相关功能,并比较其与人IL-22的差异。本研究利用原核表达系统体外表达并纯化获得了具有功能活性的重组恒河猴IL-22。通过体外刺激肠上皮细胞进行功能性实验,发现表达的恒河猴IL-22与人IL-22均能激活下游信号分子STAT3发生Tyr705磷酸化,而对Ser727磷酸化无影响。而相比于人IL-22,恒河猴IL-22引发的STAT3 Tyr705磷酸化出现的峰值稍早。另外,恒河猴IL-22和人IL-22都能促进上皮细胞多种抗菌肽的表达,如BD-2,S100A8,S100A9,RegⅢα以及Muc1。不仅如此,恒河猴IL-22在低浓度下促进细胞增殖,而在高浓度下却显示出抑制细胞增殖效应,而凋亡实验证明IL-22对肠上皮细胞的凋亡和抗凋亡相关蛋白表达没有明显影响。3、为了解SIV/SHIV感染后IL-22及其相关分子的病理变化。本研究首先通过实时荧光定量RT-PCR方法检测SIV/SHIV感染前后肠道六个(十二指肠近端、空回肠近端、回肠、盲肠、结肠近端和直肠)组织部位中IL-22和IL-22R1 mRNA的表达变化,结果发现在结肠部位IL-22 mRNA存在显着下调,而其受体IL-22R1 mRNA的表达却出现明显上调。结合已有文献报道,乙型结肠和结肠部位表达IL-22的细胞Th17、Th22以及ILC3s均发生大量的损耗,从而影响了 IL-22的表达。其受体IL-22R1呈现相反的变化趋势,这其中的分子机制,以及上调表达的IL-22R1所产生的生理学效应值得探究。4、为研究IL-22R1的上调表达的机制,以出现明显表达变化的结肠部位做进一步的研究。通过筛选多个炎症因子的表达,发现IL-1β呈现与IL-22R1同步上调表达,并且具有显着相关性。经体外IL-1β刺激HT-29细胞实验证明IL-1β在转录水平上能显着上调细胞IL-22R1的表达,并且具有浓度依赖性。RNA稳定性实验表明,IL-1β刺激细胞与不刺激组细胞内IL-22R1具有几乎一致的降解曲线。同样通过Luciferase启动子报告实验也未能观测出IL-1β单独刺激对IL-22R1启动子活性的影响。基于SIV/SHIV感染后粘膜受损所产生的复杂的微环境,包括高水平的LPS、炎症因子以及病毒蛋白分子等,本研究体外模拟LPS及Gp140等因子协同IL-1β刺激肠上皮细胞,发现相比IL-1 β单独刺激以及LPS+Gp 140共刺激组细胞,协同刺激组细胞IL-22R1的表达大幅度的上调,而Luciferase启动子报告实验证明,IL-22R1基因启动子在LPS、Gp140和IL-1β协同刺激下发生了明显的激活。5、为进一步探究SIV/SHIV感染后IL-22与其受体IL-22R1呈现相反的变化趋势,其下游信号分子及相关抗菌肽表达变化。我们进一步对IL-22主要信号分子STAT3的表达及磷酸化进行检测,结果发现,无论是mRNA还是蛋白表达水平,感染后STAT3的表达均显着性上调。不仅如此,STAT3在SIV/SHIV感染后出现更为明显的Tyr705磷酸化。当继续筛选下游抗菌肽和粘蛋白分子的表达后发现,粘蛋白Muc1与STAT3出现同步性的上调表达。与此同时,为研究SIV/SHIV感染后上调表达的IL-22R1的生物学效应,本研究利用腺病毒包装技术将IL-22R1基因导入到肠上皮细胞内,构建体外过表达IL-22R1细胞模型。在等量的IL-22刺激后,过表达细胞会诱导更强的STAT3信号激活,而且相比腺病毒对照细胞,过表达IL-22R1细胞在继续培养2d后即出现更为明显的细胞增殖能力。6、为利用XCL1作为粘膜佐剂以及携带抗原靶向特异性CD8+DCs细胞,增强体液免疫和细胞免疫应答的作用,并探讨其在HIV-1粘膜疫苗创制中的应用。首先,本研究克隆获得了恒河猴XCL1及其特异性受体XCR1 cDNA序列,分析并比较其与人XCL1和XCR1的分子高度相似。其次,扩增XCL1 C端融合优化的SIVmac239毒株V1V2模式抗原序列,并插入p1.0疫苗载体构建真核表达p1.0-XCL1-linker-V1V2质粒。同时还构建单独表达XCL1和V1V2以及结构突变型质粒LVC11A。通过流式细胞术和Western blot证实各疫苗质粒转染后能表达相关蛋白。其次,为加强粘膜免疫应答,本研究将四个疫苗质粒用壳聚糖包裹形成纳米微球,通过凝胶阻滞和包裹率分析证实疫苗质粒均能有效的包裹在壳聚糖内。透射电子显微镜观测显示包裹的壳聚糖-质粒形成的微球大小均一(200-350nm)。通过DNaseI酶消化实验证实包裹后的纳米微球能有效保护质粒DNA的酶解。最后,将各壳聚糖-DNA包裹形成的纳米微球通过鼻腔喷雾形式免疫恒河猴。三次免疫后相关抗体水平检测结果显示,血清中IgG和口腔中IgA产生较弱。而在肠道总IgA和特异性抗V1V2区IgA均显着上调,而且LV靶向质粒免疫组相比单独V1V2免疫组具有显着差异。另外,通过XCL1携带V1V2结构域的DNA鼻腔免疫也能引起更强的细胞免疫应答。综上所述,本研究克隆获得了恒河猴IL-22及其受体IL-22R1的序列,并比较其在序列特征、组织表达方面与人IL-22和IL-22R1的相似性。同时体外研究证明恒河猴IL-22具有活化肠上皮细胞STAT3信号分子、上调抗菌肽表达及增强细胞增殖等肠道相关功能,为利用恒河猴IL-22开展肠道疾病研究提供基础。本研究全面分析了SIV/SHIV感染对肠道IL-22、IL-22R1、炎症因子、及其下游信号分子和抗菌肽的表达影响,体外论证了 IL-1β在LPS和Gp140的协同作用下通过活化IL-22R1启动子活性上调IL-22R1的表达。而过表达的IL-22R1赋予细胞更强的信号活化和细胞增殖能力,为进一步了解HIV-1感染后导致的肠道病理机制提供基础。本研究利用XCL1作为粘膜佐剂的特性,以及携带V1V2模式抗原靶向特异性XCR1+DCs的特性,并结合纳米包裹技术鼻腔免疫获得明显的肠道总IgA和特异性抗V1V2 IgA水平,为推进HIV-1疫苗在增强粘膜免疫应答方面提供借鉴。
沈晨光[4](2018)在《乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究》文中研究表明季节性流感主要由乙型流感病毒和甲型流感病毒引起,流感的季节性流行每年在全球范围内造成大量的重症和死亡病例,可在局部范围内暴发疫情的乙型流感,约占流感总发病率的25%左右,其对人类健康造成的危害不容忽视。由于病毒种类的多样性和病毒表面抗原的高变性,当今流感疫苗和抗病毒药物对乙型流感的防治效果均不理想,研制乙型流感新型特效药物和疫苗意义重大。流感表面血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白为流感病毒包膜上最主要的膜蛋白,存在包括病毒受体结合位点(Receptor binding site,RBS)在内的多个病毒生命周期中必需的功能区,可诱导宿主产生多种类型的保护性抗体,是新型广谱抗流感药物和疫苗研究的主要靶蛋白。近几年来,流感HA广谱抗体的研发和广谱表位的鉴定,为流感高效抗病毒药物及疫苗的研制带来了新希望。研究显示,乙型流感HA蛋白RBS区存在广谱中和表位,但当前的乙型流感疫苗并不能诱导机体产生针对两种病毒亚系的广谱中和抗体。因此,乙型流感RBS区广谱中和表位是否较普遍存在,何种免疫方式能够刺激此类广谱表位在机体高效诱导跨亚系广谱中和抗体,识别RBS区保守表位的跨亚系中和抗体通过何种机制发挥抗病毒作用等科学问题均值得深入研究。本研究尝试了多种乙型流感RBS区广谱抗体诱导策略,通过活毒滴鼻序贯免疫策略,制备出一株IgG亚型的乙型流感RBS区广谱中和抗体C12G6。C12G6识别病毒RBS区高度保守表位,同已报道的乙型流感HA广谱单抗相比,具更优的体外抗病毒活性,为第一株发现的对Yamagata和Victoria亚系乙型流感均具血凝抑制(Hemagglutination Inhibition,HI)活性的抗体。在小鼠和雪貂动物保护模型中,C12G6显示出良好的体内抗病毒效果,具备一定的晚期抗病毒疗效,保护活性优于已报道的其他广谱中和单抗和流感抗病毒药物“达菲”,并同“达菲”联合使用具协同抗病毒效果。Cl2G6所具备的多种高效抗病毒机制解释了其良好的体内外抗病毒活性的原因,其可通过直接抑制病毒感染细胞、抑制病毒子代释放、抑制病毒基因组释放、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(CDC)协同抑制病毒,值得关注的是,C12G6为目前发现的抗病毒机制最多样化的流感广谱抗体。乙型流感病毒不断变异,C12G6虽具备良好的抗病毒反应性,但其逃逸突变病毒株仍随时可能进化产生,开发由多种类型乙型流感广谱单抗联合组成的抗病毒鸡尾酒药物,可大大降低因病毒逃逸突变使药物失效的风险。为诱导不同类型的乙型流感RBS区广谱中和单抗,本研究发现,对于乙型流感活毒滴鼻免疫,IgM亚型抗体含量高的免疫初期血清,其抗病毒反应谱强于IgG亚型抗体含量高的免疫后期血清,提示IgM亚型抗体可能具备更为广谱的抗病毒反应性。据此,本研究制备出数株具高效效抗病毒活性的乙型流感RBS区广谱中和单抗,其中抗病毒活性最优的IgM亚型RBS区广谱抗体C7G6-IgM,可高效抑制所有测试病毒对细胞的感染,其体外抗病毒谱和活性均大大优于包括C12G6在内的本研究中的和已报道的所有乙型流感HA广谱中和抗体,并在小鼠和雪貂动物模型上显示出了良好的抗病毒保护活性。上述研究结果表明,乙型流感病毒RBS区确实存在跨亚系广谱表位,但常规的免疫策略很难激发机体产生针对此类表位的有效应答,活毒滴鼻序贯免疫策略是诱导此类表位产生应答的有效手段,为乙型流感通用疫苗的设计提供重要科学依据;本研究筛选到针对乙型流感RBS表位区的多个广谱中和单抗,证明识别乙型流感RBS区广谱中和单抗具备多种抗病毒作用机制,为乙型流感新型抗病毒药物的研制提供科学依据;本研究还发现识别乙型流感RBS区特定表位的IgM亚型抗体,可高效抑制多亚系病毒感染细胞,提示IgM亚型抗体的研究可为高变异病原体提供新的防控手段。
刘助红,王静,李秀珍,尹雪琴,张钰,郭鹏举,黄韧[5](2017)在《猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立》文中进行了进一步梳理目的构建猴D型逆转录病毒的p27蛋白,并建立流式免疫荧光微球检测技术用于猴D型逆转录病毒的检测。方法通过PCR扩增p27基因片段,与p GEX-4T-1表达载体进行连接,转化至BL21(DE3)进行表达。通过SDS-PAGE分析蛋白表达的形式及最佳诱导时间。采取GST树脂纯化目标蛋白,包被磁珠,建立流式免疫荧光微球检测技术,用于临床样本的检测。结果重组蛋白以可溶的上清液进行表达,诱导的最佳时间为4 h。包被磁珠后,成功建立流式免疫荧光微球检测技术,对阳性血清稀释81倍仍可检测为阳性,对猴类其他病原的阳性血清无交叉反应,特异性强,与ELISA法同时对24份临床样本进行检测,其中3份样品的流式免疫荧光微球检测结果为阳性,ELISA检测结果为2份阳性,1份阴性,两种方法的检测结果符合率为96%。结论成功表达猴D型逆转录病毒p27蛋白,并运用该蛋白建立了灵敏度高,特异性强,样本需求少的流式免疫荧光微球检测技术,为后续推广应用多重流式免疫荧光微球检测技术奠定了基础。
何小周[6](2017)在《多载体艾滋病疫苗序贯和重复免疫动物的实验研究》文中提出由人免疫缺陷病毒(HIV)感染导致的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)已在全球范围内流行了超过30年,迄今尚未研制出安全有效的HIV疫苗。本课题组在前期的研究中,提出了使用多载体H1V疫苗进行序贯和重复免疫的策略。动物实验的结果证明,该策略能够诱导持续时间较长、反应强度较高的HIV特异性免疫应答。基于这一免疫策略,本研究中继续开展了多载体HIV/SIV疫苗序贯和重复免疫的相关工作。我们首先在小鼠中进行了表达SIVmac239-gag/env基因的三载体疫苗联合免疫试验,以评价疫苗免疫原性,为后续的恒河猴实验提供依据。其后,我们应用前期构建的四种载体 SIVmac239Gag 疫苗,包括 DNA 疫苗、rAd5-SIVgag、rMVA-SIVgag 和 rAd5F35-SIVgag在SIV感染恒河猴模型中对多载体疫苗预防或治疗SIV感染的有效性进行了评价。15只中国恒河猴被分为预防性免疫组、治疗性免疫组和对照组,分别以上述四种载体疫苗免疫,并以500TCID50与疫苗同源的SIVmac239通过静脉途径进行攻击。实验结果显示,通过四种载体序贯和重复免疫,能够在部分受试动物中诱导强度较高、抗原表位识别范围较广以及维持有效应答时间较长的SIV Gag特异性Elispot反应。有效的免疫反应强度与SIV感染后病毒载量变化呈负相关性,对被感染动物的免疫功能具有保护作用,具有改善疾病进展和结局的能力。预防性免疫组中80%(4/5)的受试动物受疫苗诱导产生了有效的特异性免疫反应。在受到SIV感染后,虽未能阻断感染,但病毒载量峰值显着低于对照组,提示疫苗对降低急性期病毒载量起到了保护作用。其中,40%(2/5)的受试动物病毒载量下降了2 log10copies/mL以上。治疗性免疫组对疫苗的反应显示出较大的个体差异,40%(2/5)的受试动物受诱导产生了有效强度的免疫应答,随之病毒载量下降了约2 log10 copies/mL,下降水平优于对照组,显示多载体疫苗有能力修复或重建被SIV感染动物受损的免疫功能。在先前多载体HIV疫苗序贯免疫恒河猴研究工作的基础上,我们分别使用Ad5载体疫苗和MVA载体疫苗,在恒河猴中进行了多载体疫苗重复免疫策略的评价。结果显示,受试动物接受rAd5-HIVgag疫苗重复免疫后,在疫苗的诱导作用下,高水平的HIV gag特异性细胞免疫应答被重新激活,并且高强度的特异性Elispot反应分别持续了 52w和69w,免疫应答的宽度亦得到了一定程度的增强。多载体HIV疫苗重复免疫的策略具有重新诱导并维持较长时间的高水平特异性免疫应答的能力。Ad5-HIVgag是本课题组实施的多载体联合免疫治疗HIV感染者/AIDS病人临床研究中继DNA疫苗和rMVA疫苗后的第三个疫苗。在临床研究实施之前,我们建立了基于HIV感染者PBMCs在体外对Ad5-HIVgag的免疫原性进行评价的检测方法。分别使用健康人和AIDS病人PBMCs对检测模型中Ad5-HIVgag的使用剂量、刺激时间进行了探索和优化。根据优化的检测条件,我们采集了 24份HIV感染者的PBMCs,对Ad5-HIVgag的免疫原性进行了评价。结果表明,Ad5-HIVgag能够在体外有效的激活HIVgag特异性的细胞免疫应答,并且,病人是否曾接受过药物治疗对Ad5-HIVgag的激活能力没有影响。此外,由于我国近年来HIV-1优势流行株发生了显着的变化,CRF01 AE和CRF07/08BC亚型逐渐成为了主要的流行毒株,我们构建了表达HIV-1 AE/BC亚型gag基因的治疗性DNA疫苗和重组MVA疫苗。以从HIV-1感染者中分离的病毒基因组为模板,分别对AE/BC亚型gag基因进行表达优化设计。使用经优化的AEgagi和BCgagi基因分别构建了 DNA疫苗(pVR-HIVAEgagi/pVR-HIVBCgagi)和重组MVA 疫苗(rMVA-HIVAEgagi/rMVA-HIVBCgagi)。初步鉴定结果显示,重组MVA能够在允许细胞中携带外源基因进行稳定的传代和复制;同时,DNA疫苗和rMVA疫苗均能够在细胞内高效表达HIV-1 Gag抗原。我们将继续对以上疫苗的免疫效果进行评价,并联合同样基于优化AE/BC gagi基因构建的重组Ad5疫苗开展多载体HIV疫苗序贯和重复免疫的相关研究。
郭铭[7](2017)在《中国恒河猴结核模型建立的实验研究》文中研究表明世界卫生组织估计,全球约三分之一的人口感染了结核分枝杆菌。而目前由于卡介苗的保护力较弱以及缺乏高效的抗结核药物,世界各国都在积极研究新型高效的抗结核疫苗和药物。在这些研究中都少不了结核动物模型这一重要工具。不仅如此结核动物模型也为结核病的发生发展过程以及疾病过程中的病理和免疫相关研究提供了平台支撑。标准化的结核动物模型可以用于新型疫苗和药物的临床前药效评价。在本课题中我们建立了三种非人灵长类结核动物模型,并研究其疾病发生中的临床和免疫学变化规律。1.中国恒河猴结核模型非人灵长类感染结核后和人类结核疾病表现十分相似,它常常被用于研究结核的致病机制以及结核相关药物疫苗的评价实验。我们通过采用三种感染方式(纤维支气管镜,气管内滴注以及滴鼻的方式)分别以20 CFU和100 CFU的结核分枝杆菌H37Rv成功感染了中国恒河猴。实验动物感染后持续观察其临床(食欲、咳嗽、体温、体重),血液学(血沉和C反应蛋白)以及免疫学(结核特异性抗体ELISA检测和结核特异性IFN-γELISPOT检测)指标。在低剂量(20CFU)感染情况下,有恒河猴表现为亚临床结核状态。结核感染实验动物的临床指标和疾病的转归有明显相关性,而影像学结果也和疾病的严重程度有一定相关性。但免疫学指标却和疾病的进展没有明显关系。这些结果证明中国恒河猴适合用于建立结核动物感染模型。2.中国恒河猴结核自然感染模型人类结核病主要通过结核患者咳嗽产生含结核杆菌的气溶胶传播。90%被结核感染的人处于结核潜伏感染状态。虽然恒河猴结核模型和人类结核病十分相似,但目前通过人工方式感染的恒河猴绝大多数会进展为活动性结核,并在较短的时间内死于结核病。因此有必要通过一种类似自然感染的气溶胶传播方法建立恒河猴结核感染模型以期获得和人类疾病发生更为接近的动物模型。这种模型不仅可以用于研究结核潜伏感染的机制,同时也为新型抗结核疫苗和药物的研发提供全新的动物测试平台。在第一次实验中,6只中国恒河猴置于改造的6联体猴笼中,该猴笼中的空气可在不同猴笼间循环。其中两只恒河猴被人工感染34 CFU结核分枝杆菌Erdman株,剩余4只恒河猴定期通过结核菌素皮肤试验和ELISPOT试验以及胸部X光片,胸部CT扫描以及血沉和C反应蛋白等指标检测其结核感染状态。结果表明4只恒河猴分别在第22,24,27和42周确认被结核感染。影像学结果显示,自然感染恒河猴肺部结核初始病灶部位位于肺部上叶,这和人工感染恒河猴初始结核病灶部位有区别。我们随后又利用8只恒河猴进行第二次类似的自然感染实验。在有限的观察期内,也有一只恒河猴被证实在实验第16周成功自然感染结核。实验结果说明中国恒河猴适合用于建立结核自然感染模型。3.SIV感染加重中国恒河猴结核病的进展结核病是艾滋病患者最容易机会性感染的疾病之一,同时也是造成其死亡的主要原因之一。因此我们有必要深入了解这两种病原菌之间的相互作用机制。在本实验中,我们建立了结核和猴免疫缺陷病毒合并感染中国恒河猴模型。尽管实验结果显示结核感染对SIV疾病进展影响不大,但SIV感染却能加速结核病的进程。胸部X光片结果显示,共感染动物出现双肺弥散性结核病变,而结核单感染动物结核病变主要集中在右肺。大体病理结果显示共感染动物结核病变不仅广泛分布在肺部而且还扩散到肺外脏器(脾、胰腺、肝、肾以及心脏)。共感染组各脏器中的结核杆菌载量明显高于结核单感染组。另外共感染实验动物外周血中结核特异性IFN-γ和IL-22水平也低于结核单感染组。这些结果说明中国恒河猴适合用于结核和艾滋病的共感染研究,而免疫缺陷病毒感染造成的结核特异性免疫反应的损伤可能是加速结核病病程进展的重要原因之一。
伍熙源[8](2017)在《HIV-1膜融合抑制剂SC29EK和SFT耐药机制研究》文中认为在HIV-1侵入细胞的过程中,包膜蛋白(Env)发挥了关键作用,介导了病毒与宿主细胞受体、共受体的结合以及病毒包膜与宿主细胞细胞膜的融合。在膜融合过程中,6-HB结构的形成是必需的步骤,因此其成为膜融合抑制药物作用的关键靶点。SC29EK与SFT同属于通过抑制病毒6-HB形成来阻断病毒与细胞膜融合过程的第三代HIV-1膜融合抑制剂,都具有螺旋内盐桥的设计,相比前代抑制剂其拥有更好的结构稳定性和抗病毒效果。我们前期利用SC29EK筛选出了耐药株gp41蛋白保守序列上发生的氨基酸突变位点(Gln39、Asn43、Glu49),分别简称Q39R、N43K、E49A,利用SFT筛选出了耐药株gp41蛋白保守序列上发生的氨基酸突变位点(Val38、Ala47、Gln52),分别简称V38A、A47I、Q52R。本课题以能够表达HIV-1病毒Env包膜蛋白的质粒作为模板进行定点突变,获得了 15份突变质粒,分别对应筛选出来的点突变及点突变组合。利用capture ELISA技术检测证实了这些点突变或者点突变组合不会影响Env蛋白的表达。利用转染表达的包含点突变或者点突变组合的假病毒,我们分析了突变对病毒入侵能力、膜融合能力以及对膜融合抑制剂SC29EK与SFT耐药性的影响。利用以病毒NHR多肽N36为模板合成的包含有待研究点突变以及点突变组合的12种多肽,我们分析了突变对6-HB结构稳定性的影响,对N36与膜融合抑制剂之间结合力的影响。利用ELISA技术和6-HB构象特异性抗体,我们还探索了突变对6-HB构象的影响。综合来说,本课题主要从发现的点突变以及点突变组合对病毒耐药性、病毒Env功能、病毒6-HB结构稳定性、病毒N肽与膜融合抑制剂结合能力的影响这几个方面,来探讨SC29EK、SFT耐药株的耐药机制。通过对实验结果的分析,本课题研究得出以下结论:(1)N43K使得突变毒株对SC29EK高度耐药,当N43K与Q39R或者E49A组合,其对SC29EK耐药性会进一步提升,Q52R使得突变毒株对SFT高度耐药,Q52R与V38A、A47I结合会使其对SFT耐药性大幅提升;(2)这些突变同时使得毒株获得对T20、C34、2P23等不同膜融合抑制剂的交叉耐药能力;(3)部分突变能降低N肽与抑制剂的结合能力,部分突变能增强N肽与内源性C肽的结合能力,点突的组合还能发挥协同作用,从而产生更强的耐药性;(4)突变使病毒获得耐药性的同时,会使病毒Env蛋白的功能部分丧失;(5)点突变会改变病毒6-HB的构象。本课题研究为理解HIV-1耐药株的耐药机制提供了新的视角,加深了对gp41蛋白结构与功能关系的理解。
汪婷婷[9](2016)在《RNA解旋酶P82在核糖体DNA转录方面的功能研究》文中研究表明P82是一种RNA解旋酶,由DDX17基因通过非AUG起始密码子(CUG)选择性翻译形成,与RNA的活动密切相关,如双链RNA的解旋、RNA二级结构的重排等。DDX17可表达P72和P82两种蛋白。目前研究DDX17都是将P72和P82作为一个复合体来研究,并没有相关报道来区分二者的功能。核糖体DNA转录是细胞内核糖体RNA形成的重要过程。核糖体RNA是核糖体的组成成分,因此核糖体DNA转录水平直接影响了核糖体的生成。核糖体是细胞内蛋白质合成场所,直接影响了细胞的生长。因而核糖体DNA转录对细胞生长有着不可或缺的作用。Oncomine数据库分析显示DDX17在肿瘤组织中高表达。我们的研究发现在DDX17翻译出来的两个蛋白P72、P82中,P82能够显着促进肿瘤细胞的生长,而P72作用却不明显。因此本课题重点研究了 P82在肿瘤细胞生长方面的作用及其分子机制。P82低表达的肿瘤细胞生长速率显着下降,P82过表达的肿瘤细胞生长速率明显高于对照组。我们发现P82作为核仁蛋白可以与UBF、SirT7相互结合,并且三者协同作用共同促进核糖体DNA转录起始前复合物的形成,继而加强核糖体DNA转录,提高核糖体RNA水平,核糖体生成增多,最终促进肿瘤细胞的生长。通过进一步研究发现,抗肿瘤药物放线菌素D(ACTD)处理细胞后,核仁中的P82蛋白释放到核质中,同时P82蛋白表达量也相应减少。综上所述,本课题的研究意义在于首次发现P82是个原癌基因,并揭示了 P82在促进肿瘤细胞生长方面的分子机制,也为P82作为抗肿瘤药物新靶点提供了理论依据。
孙涛[10](2015)在《猴B病毒gD蛋白表达、纯化及单克隆抗体的制备》文中指出猴B病毒(SimianB virus,BV)是一种引起人畜共患病的双链DNA病毒,猕猴为其自然宿主。猴在感染B病毒后,通常不表现明显的临床症状,有时表现出口腔的疱疹样损伤如口腔溃疡、结膜炎或牙龈炎,随后转变成慢性感染。B病毒主要通过唾液或生殖道分泌物经被感染猴所咬伤及抓伤传染给人类,造成的死亡率超过70%,且病患多表现为脑炎、脑脊髓炎等严重症状,且目前无特效的抗病毒治疗法。BV能够引起人和非猕猴灵长类的高致死率,给实验动物研究人员带来巨大的潜在危害。在猴B病毒编码的各种蛋白质中,gD蛋白具有种群和型特异性,是保守的结构蛋白,在病毒的进化中变异率比较低,携带有群特异性抗原决定簇,能刺激被感染机体产生强的群特异性免疫反应,对于易发生变异的猴B病毒的血清学诊断具有重要的应用价值。本研究在对猴B病毒gD基因进行分析和密码子优化的基础上,进行基因的人工合成和gD蛋白的原核表达,并制备其相应的单克隆抗体,为建立一种快速、有效的检测BV的诊断试剂研制奠定基础。主要研究内容和结果如下:1.猴B病毒gD蛋白的原核表达及纯化产物鉴定参照已公布的猴B病毒E2490毒株全序列,分析其中编码gD蛋白的基因序列,根据大肠杆菌的密码子偏爱性进行密码子优化,并由苏州金唯智生物科技有限公司进行DNA合成。合成的基因片段选用pET-32a原核表达载体进行表达。将gD基因片段克隆于pET-32a表达载体中、经抗性筛选、PCR扩增、限制性内切酶分析、测序分析,筛选获得BV-gD基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆。阳性克隆质粒在E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达,筛选到重组载体pET-32a/gD。镍琼脂糖凝胶亲和层析柱分离重组载体pET-32a/gD表达的带His标签的重组gD蛋白。SDS-PAGE、Western blotting实验表明,表达蛋白为融合蛋白,分子量约为53kDa,这些重组蛋白得到正确表达。2.猴B病毒gD蛋白的单克隆抗体制备及鉴定本研究通过原核表达的猴B病毒囊膜蛋白(gD)为免疫原,纯化后经皮下免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。以重组gD蛋白作为检测原进行包被,用间接ELISA筛选抗gD阳性细胞株,采用有限稀释法对其进行亚克隆,经过3次亚克隆,共获得5株能稳定分泌抗BV gD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4E3、3E7、3F8、1H3和4B6,其细胞培养上清ELISA效价均为1:640,腹水ELISA效价分别为1:2X 106、1:2×105、1:2×105、1:2×103和 1:2×102。亚类鉴定结果显示,单抗 1H3 和 4E3 为IgG2b亚型,单抗3E7、3F8和4B6为IgG1亚型,轻链均为K链。SDS-PAGE分析表明,五株单抗纯化后均能有两条明显的条带。间接免疫荧光实验结果表明,5株单抗均能很好的识别HSV-2感染Vero细胞中的gD同源蛋白,Western-blotting实验结果显示,3E7、3F8及4E3均能很好的识别HSV-2感染Vero细胞中的gD同源蛋白,而4B6和1H3则不能很好的识别。说明单抗3E7、3F8以及4E3株识别的gD蛋白抗原表位为HSV-2和BV之间相对较为保守的线性表位,而4B6和1H3可能仅别gD蛋白中的构象型表位,或识别的表位为BV gD蛋白中不同于HSV-2的区段,对BV病毒有较强的特异性。本研究制备了大量的重组BV-gD蛋白抗原,并通过ELISA实验验证了,其与感染BV的猴血清有特异性反应,总符合率为75%,这为猴B病毒检测试剂盒的研制奠定了基础。制备的单克隆抗体为进一步研究gD囊膜蛋白功能、建立BV检测方法以及HSV-2的基础研究均可提供一种有力的工具。
二、检测猴艾滋病D型逆转录病毒抗体的ELISA技术(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、检测猴艾滋病D型逆转录病毒抗体的ELISA技术(论文提纲范文)
(1)电化学生物传感器在高致病性病毒检测中的应用(论文提纲范文)
0 引言 |
1 电化学生物传感器 |
2 电化学生物传感器在高致病性病毒检测中的研究进展 |
2.1 肝炎病毒 |
2.2 流感病毒 |
2.3 人乳头瘤病毒 |
2.4 人类免疫缺陷病毒 |
2.5 寨卡病毒 |
2.6 新型冠状病毒 |
2.7 其他病毒 |
3 病毒检测电化学生物传感器面临的挑战 |
3.1 核酸型电化学生物传感器的挑战 |
3.2 免疫型电化学生物传感器的挑战 |
4 结束语 |
(2)冀南地区鸡胚蛋有害菌的检测(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第1章 绪论 |
1.1 病原菌引起的食品安全问题 |
1.2 鸡胚蛋在食品加工中的应用 |
1.3 鸡胚蛋致病菌的研究及流行情况 |
1.4 鸡胚蛋中常见的致病菌 |
1.4.1 大肠杆菌 |
1.4.2 粪肠球菌 |
1.4.3 志贺氏菌 |
1.4.4 沙门氏菌 |
1.4.5 金黄色葡萄球菌 |
1.5 食源性致病菌检测技术研究进展 |
1.5.1 传统检测方法 |
1.5.2 免疫学方法 |
1.5.3 分子生物学技术 |
1.5.4 生物传感器技术 |
1.5.5 聚合酶链式反应技术 |
1.6 本研究的目的及意义 |
第2章 鸡胚蛋污染菌的分离鉴定 |
2.1 材料 |
2.1.1 污染样品与菌株 |
2.1.2 试验试剂与耗材 |
2.1.3 试验仪器与设备 |
2.2 方法 |
2.2.1 培养基制备 |
2.2.2 细菌培养 |
2.2.3 细菌分离纯化 |
2.2.4 菌落菌体观察 |
2.2.5 模板DNA提取 |
2.2.6 分离株的PCR扩增 |
2.2.7 分离株序列测定分析 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 鸡胚蛋大体观察 |
2.3.2 分离株PCR扩增结果 |
2.3.3 分离株鉴定 |
2.3.4 分离株鉴定结果分析 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第3章 大肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立 |
3.1 材料 |
3.1.1 菌株 |
3.1.2 试验试剂与耗材 |
3.1.3 试验仪器与设备 |
3.2 方法 |
3.2.1 DNA提取 |
3.2.2 大肠杆菌特异性引物设计与合成 |
3.2.3 大肠杆菌引物特异性检测 |
3.2.4 定量PCR反应体系和反应程序 |
3.2.5 线性范围的测定和标准曲线的建立 |
3.2.6 定量PCR特异性检测 |
3.2.7 定量PCR敏感性检测 |
3.2.8 定量PCR重复性检测 |
3.2.9 鸡胚蛋样品检测 |
3.3 结果 |
3.3.1 大肠杆菌引物特异性检测结果 |
3.3.2 线性范围及定量标准曲线的制作 |
3.3.3 定量PCR特异性检测结果 |
3.3.4 定量PCR敏感性检测结果 |
3.3.5 定量PCR重复性检测结果 |
3.3.6 鸡胚蛋样品检测结果 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第4章 粪肠球菌荧光定量PCR检测方法的建立 |
4.1 材料 |
4.1.1 菌株 |
4.1.2 试验试剂与耗材 |
4.1.3 试验仪器与设备 |
4.2 方法 |
4.2.1 DNA提取 |
4.2.2 粪肠球菌特异性引物设计与合成 |
4.2.3 粪肠球菌引物特异性检测 |
4.2.4 定量PCR反应体系和反应程序 |
4.2.5 线性范围的测定和标准曲线的建立 |
4.2.6 定量PCR特异性检测 |
4.2.7 定量PCR敏感性检测 |
4.2.8 定量PCR重复性检测 |
4.2.9 鸡胚蛋样品检测 |
4.3 结果 |
4.3.1 粪肠球菌引物特异性检测结果 |
4.3.2 线性范围及定量标准曲线的制作 |
4.3.3 定量PCR特异性检测结果 |
4.3.4 定量PCR敏感性检测结果 |
4.3.5 定量PCR重复性检测结果 |
4.3.6 鸡胚蛋样品检测结果 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第5章 大肠杆菌和粪肠球菌双重荧光定量PCR检测方法的建立 |
5.1 材料 |
5.1.1 菌株 |
5.1.2 试验试剂与耗材 |
5.1.3 试验仪器与设备 |
5.2 方法 |
5.2.1 DNA提取 |
5.2.2 双重荧光定量PCR特异性检测 |
5.2.3 双重荧光定量PCR敏感性检测 |
5.2.4 双重荧光定量PCR重复性检测 |
5.2.5 鸡胚蛋样品检测 |
5.3 结果 |
5.3.1 双重荧光定量PCR特异性检测结果 |
5.3.2 双重荧光定量PCR敏感性检测结果 |
5.3.3 双重荧光定量PCR重复性检测结果 |
5.3.4 鸡胚蛋样品检测结果 |
5.4 讨论 |
5.5 小结 |
结论 |
创新点 |
致谢 |
参考文献 |
作者简介 |
攻读硕士学位期间发表的论文 |
参加科研情况 |
(3)恒河猴白介素22和XC趋化因子1的研究(论文提纲范文)
缩略词 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
第一部分 恒河猴IL-22和IL-22R1基因的克隆、表达与功能分析 |
引言 |
材料与方法 |
1.1. 实验材料 |
1.2. 实验方法 |
实验结果 |
1.3.1. 恒河猴IL-22和IL-22R1基因的序列特征 |
1.3.2. IL-22和IL-22R1在正常恒河猴体内的分布 |
1.3.3. 重组恒河猴IL-22蛋白的表达及抗体制备 |
1.3.4. IL-22R1剪接变异体和SNP的检测 |
1.3.5. 恒河猴IL-22的生物功能 |
讨论 |
结论 |
第二部分 免疫缺陷病毒感染对IL-22和IL-22R1以及上下游基因表达的影响 |
引言 |
材料与方法 |
2.1. 实验材料 |
2.2. 实验方法 |
实验结果 |
2.3.1. IL-22和IL-22R1的表达水平在SIV/SHIV感染后显着改变 |
2.3.2. SIV/SHIV感染后恒河猴肠粘膜的IL-1β和IL-22R1表达水平显着升高 |
2.3.3. IL-1β上调HT-29细胞IL-22R1的表达 |
2.3.4. SIV/SHIV感染后恒河猴肠粘膜的下游信号分子及抗菌肽表达变化 |
2.3.5. IL-1β直接活化HT-29细胞下游STAT3信号 |
2.3.6. IL-22R1过表达促进细胞STAT3激活和细胞增殖 |
讨论 |
结论 |
第三部分 恒河猴XCL1和XCR1分子特性及在粘膜免疫反应诱导中的作用 |
引言 |
材料与方法 |
3.1. 实验材料 |
3.2. 实验方法 |
实验结果 |
3.3.1. 恒河猴XCL1和XCR1的分子特性 |
3.3.2. 靶向恒河猴XCR1~+DCs的重组质粒构建 |
3.3.3. 壳聚糖纳米粒的制备及理化性质 |
3.3.4. 壳聚糖包裹重组DNA质粒在恒河猴体内的免疫原性 |
讨论 |
结论 |
全文结论 |
附录 |
文献综述 |
参考文献 |
发表文章 |
个人简介 |
致谢 |
(4)乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第一章 前言 |
1.1 乙型流感病毒综述 |
1.1.1 流感病毒的分类和命名 |
1.1.2 乙型流感病毒的结构 |
1.1.3 乙型流感的编码蛋白 |
1.1.4 流感病毒的生命周期 |
1.1.5 乙型流感的进化 |
1.1.6 乙型流感的宿主 |
1.1.7 乙型流感的流行病学和临床特征 |
1.1.8 乙型流感的抗病毒治疗及预防 |
1.2 流感病毒血凝素广谱单抗的研究概述 |
1.2.1 甲型流感病毒血凝素广谱单抗概述 |
1.2.2 乙型流感病毒血凝素广谱单抗概述 |
1.2.3 乙型流感病毒血凝素广谱单抗的中和机制 |
1.2.4 流感病毒血凝素广谱单抗的制备策略 |
1.3 本研究的意义及主要研究内容 |
第二章 材料与方法 |
2.1 研究中用到的主要仪器 |
2.2 主要试剂及实验动物 |
2.2.1 E.coli菌株 |
2.2.2 质粒 |
2.2.3 细胞株 |
2.2.4 流感病毒 |
2.2.5 实验动物 |
2.2.6 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
2.2.7 其他常规试剂 |
2.3 实验用溶液及培养基配制 |
2.3.1 细胞培养用溶液的配制 |
2.3.2 常规分子生物学实验溶液的配制 |
2.3.3 抗原和分子检测用溶液的配置 |
2.3.4 病毒培养及检测用溶液的配置 |
2.4 实验方法 |
2.4.1 常规分子克隆实验方法 |
2.4.2 常规细胞生物学实验方法 |
2.4.3 流感病毒相关实验方法 |
2.4.4 鼠单克隆抗体的制备和纯化 |
2.4.5 免疫学相关实验方法 |
2.4.6 单抗可变区编码序列的测定及分析 |
2.4.7 单克隆抗体Fab片段的制备 |
2.4.8 人鼠嵌合抗体的构建与表达纯化 |
2.4.9 高效排阻色谱和抗体亲和力测定方法 |
2.4.10 逃逸突变病毒株筛选方法 |
2.4.11 小鼠动物实验方法 |
2.4.12 雪貂动物实验方法 |
2.4.13 结构生物学相关实验方法 |
2.4.14 抗体中和机制研究相关实验方法 |
2.4.15 本研究的抗体和病毒序列在Genbank中的检索号 |
2.4.16 本研究的统计学分析 |
第三章 结果与分析 |
3.1 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗的筛选与鉴定 |
3.1.1 乙型流感的进化及抗原性分析 |
3.1.2 乙型流感RBS区广谱单抗制备策略的初步摸索 |
3.1.3 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗活性鉴定 |
3.1.4 乙型流感RBS区亚系内广谱单抗研究小结 |
3.2 乙型流感RBS区跨亚系广谱单抗的筛选与鉴定 |
3.2.1 乙型流感RBS区跨亚系广谱单抗的诱导 |
3.2.2 乙型流感RBS区多功能性广谱单抗的筛选 |
3.2.3 乙型流感RBS区广谱单抗12G6体外抗病毒活性鉴定 |
3.2.4 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6体外抗病毒活性鉴定 |
3.2.5 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6体内保护活性鉴定 |
3.2.6 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6识别表位鉴定 |
3.2.7 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6中和病毒机制分析 |
3.2.8 乙型流感RBS区广谱单抗C12G6研究小结 |
3.3 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的筛选与鉴定 |
3.3.1 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的制备 |
3.3.2 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗的初步活性鉴定 |
3.3.3 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗嵌合抗体的制备 |
3.3.4 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗体外抗病毒活性鉴定 |
3.3.5 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗体内保护活性分析 |
3.3.6 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗识别表位分析 |
3.3.7 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗抗病毒机制分析 |
3.3.8 乙型流感RBS区IgM亚类广谱单抗研究小结 |
第四章 讨论 |
4.1 流感HA广谱表位诱导机体产生有效免疫应答的困难与对策 |
4.2 多功能抗体作为新型治疗性药物的重要性 |
4.3 IgM广谱抗体在防治高变异病原体中的重要性 |
4.4 流感HA广谱抗体应用于流感治疗的前景与挑战 |
4.5 流感HA广谱表位应用于通用流感疫苗设计的前景与挑战 |
4.6 本研究的局限性 |
第五章 结论与展望 |
参考文献 |
在校期间的科研成果及奖励 |
致谢 |
(5)猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立(论文提纲范文)
1 材料和方法 |
1.1 毒株、菌种和载体 |
1.2 主要试剂和仪器 |
1.2.1 主要试剂 |
1.2.2 主要仪器 |
1.3 实验方法 |
1.3.1 SRV基因组RNA的提取及c DNA合成 |
1.3.2 SRV p27目标基因的克隆 |
1.3.3 p GEX-4T-1-SRV p27重组质粒的构建 |
1.3.4 重组蛋白的表达 |
1.3.5 重组蛋白的纯化 |
1.3.6 流式免疫荧光微球检测技术建立 |
1.3.7 灵敏度分析 |
1.3.8 特异性分析 |
1.3.9 临床样本分析 |
2 结果 |
2.1 SRV p27蛋白的结构分析 |
2.2 PCR对SRV p27基因的扩增结果 |
2.3 原核表达条件的优化 |
2.4 重组蛋白的纯化 |
2.5 流式免疫荧光微球检测技术的灵敏度检测 |
2.6 流式免疫荧光微球检测技术的特异性验证 |
2.7 临床样本检测结果比对 |
3 讨论 |
(6)多载体艾滋病疫苗序贯和重复免疫动物的实验研究(论文提纲范文)
英文缩略词表 |
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
第一部分: 多载体SIV-Gag疫苗序贯和重复免疫恒河猴的研究 |
前言 |
实验材料 |
实验方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第二部分: 多载体HIV疫苗序贯和重复免疫恒河猴的长期观察研究 |
前言 |
实验材料 |
实验方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第三部分: 三载体SIV疫苗联合免疫小鼠的细胞免疫研究 |
前言 |
实验材料 |
实验方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第四部分: 体外细胞刺激评价重组腺病毒艾滋病gag疫苗( Ad5-HIVgag)免疫原性方法的建立及优化 |
前言 |
实验材料 |
实验方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第五部分: 表达HIV-1 AE/BC亚型gag基因的的DNA疫苗和重组痘苗病毒的构建与初步鉴定 |
前言 |
实验材料 |
实验方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
全文总结 |
文献综述 |
参考文献 |
致谢 |
(7)中国恒河猴结核模型建立的实验研究(论文提纲范文)
本论文的创新点 |
摘要 |
Abstract |
第一章 研究背景 |
1.1 结核病 |
1.1.1 概述 |
1.1.2 结核的流行病学调查 |
1.1.3 结核发病机制的研究 |
1.2 结核感染动物模型 |
1.2.1 概述 |
1.2.2 小鼠结核模型 |
1.2.3 豚鼠结核感染模型 |
1.2.4 兔结核感染模型 |
1.2.5 非人灵长类结核感染模型 |
1.3 结核和免疫缺陷病毒共感染动物模型 |
1.3.1 概述 |
1.3.2 结核和人免疫缺陷病毒合并感染的小鼠模型 |
1.3.3 猴免疫缺陷病毒和鸟分枝杆菌合并感染的猕猴模型 |
1.3.4 猴免疫缺陷病毒和卡介苗合并感染的猕猴模型 |
1.3.5 猴免疫缺陷病毒促进结核感染的猕猴模型 |
1.3.6 猴免疫缺陷病毒诱导结核潜伏感染复发的猕猴模型 |
1.4 小结 |
第二章 恒河猴结核模型建立的实验研究 |
2.1 前言 |
2.2 实验材料 |
2.2.1 实验动物 |
2.2.2 结核分枝杆菌菌株 |
2.2.3 主要试剂 |
2.2.4 主要仪器 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 动物实验伦理 |
2.3.2 实验分组 |
2.3.3 实验安排 |
2.3.4 结核分枝杆菌感染 |
2.3.5 临床观察 |
2.3.6 结核菌素皮肤实验 |
2.3.7 ESR和CRP监测 |
2.3.8 胸部X光片检测 |
2.3.9 特异性结核抗体水平检测 |
2.3.10 ELISPOT检测结核特异性IFN-γ平 |
2.3.11 动物组织中M.tb菌落计数 |
2.3.12 结核病变病理学观察和评分标准 |
2.3.13 组织病理学分析 |
2.3.14 实验数据的统计学处理 |
2.4 实验结果 |
2.4.1 结核感染导致恒河猴死亡 |
2.4.2 结核感染导致恒河猴食欲下降 |
2.4.3 结核感染导致恒河猴体重下降 |
2.4.4 结核感染导致恒河猴体温异常升高 |
2.4.5 结核感染导致恒河猴咳嗽 |
2.4.6 结核感染导致恒河猴ESR和CRP异常升高 |
2.4.7 结核感染恒河猴结核菌素皮肤试验阳性 |
2.4.8 结核感染恒河猴血清中结核特异性抗体水平 |
2.4.9 结核感染恒河猴结核特异性IFN-γ反应 |
2.4.10 结核感染恒河猴X光胸片结果 |
2.4.11 结核感染恒河猴大体病理结果 |
2.4.12 结核感染恒河猴组织结核载量 |
2.4.13 结核感染恒河猴组织病理结果 |
2.4.14 结核感染恒河猴不同指标间的相关性分析 |
2.5 讨论 |
第三章 恒河猴结核自然感染模型的初步建立 |
3.1 前言 |
3.2 实验材料 |
3.2.1 实验动物 |
3.2.2 结核分枝杆菌菌株 |
3.2.3 主要试剂 |
3.2.4 主要仪器 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 动物实验伦理 |
3.3.2 结核分枝杆菌感染 |
3.3.3 临床观察 |
3.3.4 结核菌素皮肤实验 |
3.3.5 ESR和CRP监测 |
3.3.6 胸部X光片检测 |
3.3.7 ELISPOT检测结核特异性IFN-γ水平 |
3.3.8 动物组织中M.tb菌落计数 |
3.3.9 结核病变病理学观察和评分标准 |
3.3.10 CT扫描方法 |
3.4 实验结果 |
3.4.1 第一次自然感染实验结果 |
3.4.1.1 自然感染实验用猴笼 |
3.4.1.2 实验设计 |
3.4.1.3 人工感染恒河猴临床表现 |
3.4.1.4 人工感染恒河猴感染后胸部X光片变化 |
3.4.1.5 结核感染后恒河猴PPD特异性IFN-γ分泌细胞增多 |
3.4.1.6 结核感染导致恒河猴结核菌素皮肤试验结果阳性 |
3.4.1.7 自然感染结核导致恒河猴死亡 |
3.4.1.8 自然感染结核导致恒河猴ESR和CRP异常 |
3.4.1.9 结核自然感染导致恒河猴胸部影像学变化 |
3.4.1.10 结核自然感染恒河猴肺部结核严重感染 |
3.4.1.11 结核自然感染恒河猴组织病理结果 |
3.4.2 第二次自然感染实验结果 |
3.4.2.1 自然感染实验用猴笼 |
3.4.2.2 实验设计 |
3.4.2.3 猴笼内二氧化碳浓度监测 |
3.4.2.4 人工感染恒河猴临床表现 |
3.4.2.5 结核感染后恒河猴PPD特异性IFN-y分泌细胞增多 |
3.4.2.6 结核感染后恒河猴结核菌素皮肤试验反应阳性 |
3.5 讨论 |
第四章 恒河猴艾滋和结核共感染的实验研究 |
4.1 前言 |
4.2 实验材料 |
4.2.1 实验动物 |
4.2.2 结核分枝杆菌菌株和猴免疫缺陷病毒毒株 |
4.2.3 主要试剂 |
4.2.4 基因扩增所需引物 |
4.2.5 主要仪器 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 动物实验伦理 |
4.3.2 结核分枝杆菌感染 |
4.3.3 猴免疫缺陷病毒感染 |
4.3.4 临床观察 |
4.3.5 结核菌素皮肤实验 |
4.3.6 ESR和CRP监测 |
4.3.7 胸部X光片检测 |
4.3.8 ELISPOT检测结核特异性IFN-γ水平 |
4.3.9 动物组织中M.tb菌落计数 |
4.3.10 结核病变病理学观察和评分标准 |
4.3.11 外周血中CD4~+/CD8~+T细胞流式检测 |
4.3.12 血浆病毒载量检测 |
4.3.13 Realtime RT-PCR |
4.4 实验结果 |
4.4.1 实验设计 |
4.4.2 猴免疫缺陷病毒感染加速结核感染恒河猴的死亡 |
4.4.3 猴免疫缺陷病毒和结核感染恒河猴临床表现 |
4.4.4 猴免疫缺陷病毒和结核感染导致恒河猴ESR和CRP升高 |
4.4.5 结核感染对猴免疫缺陷病毒RNA和CD4~+/CD8~+T细胞比例影响较小 |
4.4.6 猴免疫缺陷病毒感染影响结核特异性IFN-γ和IL-22的表达 |
4.4.7 猴免疫缺陷病毒感染促进结核在肺部和肺外器官的扩散 |
4.5 讨论 |
本课题的主要结论和创新点 |
参考文献 |
缩略词表 |
攻博期间主要成果 |
致谢 |
(8)HIV-1膜融合抑制剂SC29EK和SFT耐药机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
正文 |
1. 实验材料 |
1.1. 实验相关多肽 |
1.2 相关感受态细菌和培养用细胞 |
1.3 相关溶液 |
1.4 相关培养基 |
1.5 实验相关工具酶 |
1.6 实验相关抗体 |
1.7 试剂盒 |
1.8 主要仪器 |
2. 实验方法 |
2.1 以实验株HIVNL4-3的Env质粒为模板进行核酸的定点突变 |
2.2 Env蛋白的表达与收集 |
2.3 ELISA方法检测Env的表达情况 |
2.4 利用圆二色谱仪检测6-HB结构的α螺旋比例与热稳定性 |
2.5 质粒转染293T细胞获取HIV-1假病毒 |
2.6 功能性假病毒的滴定测定 |
2.7 假病毒p24抗原定量 |
2.8 单次入侵实验 |
2.9 检测多肽抑制剂对假病毒半数有效抑制浓度(IC50) |
2.10 六聚体构象形成实验 |
2.11 质粒提取 |
3. 实验结果 |
3.1 突变对Env蛋白表达的影响 |
3.2 SC29EK,SFT诱导的突变对毒株耐药性的影响 |
3.3 突变对病毒Env蛋白功能的影响 |
3.4 突变对6-HB结构构象的影响 |
3.5 突变对N肽抗病毒活性的影响 |
3.6 突变对NHR螺旋稳定性的影响 |
3.7 突变对N肽结合C肽能力的影响 |
4. 讨论 |
5. 小结 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
(9)RNA解旋酶P82在核糖体DNA转录方面的功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 绪论 |
第一节 P82概述 |
1.1 P82基因 |
1.2 P82蛋白 |
1.3 P82蛋白的生理功能 |
第二节 核糖体DNA转录概述 |
2.1 核糖体 |
2.2 核糖体DNA |
2.3 核糖体DNA转录 |
第二章 实验材料与方法 |
第一节 实验材料、试剂和仪器 |
1.1 细胞株与菌株 |
1.2 质粒 |
1.3 载体及引物 |
1.4 酶和抗体 |
1.5 实验试剂及药品 |
1.6 实验仪器 |
第二节 实验原理及方法 |
2.1 质粒构建 |
2.2 半定量PCR |
2.3 细胞培养技术 |
2.4 细胞转染技术 |
2.5 蛋白质免疫印迹技术(western blot) |
2.6 MTT实验技术 |
2.7 免疫共沉淀技术 |
2.8 免疫荧光染色技术 |
2.9 双荧光素酶报告基因检测技术 |
2.10 慢病毒包装、感染及稳转细胞株的筛选技术 |
2.11 抗体制备技术 |
第三章 结果与分析 |
第一节 P82在肿瘤中高表达并促进肿瘤细胞生长 |
1.1 Oncomine数据库显示DDX17 mRNA在肿瘤组织中高表达 |
1.2 P82促进肿瘤细胞生长 |
第二节 P82能促进核糖体DNA转录 |
2.1 P82激活核糖体DNA启动子 |
2.2 P82促进pre-rRNA生成 |
第三节 核仁蛋白P82促进核糖体DNA转录起始前复合物的形成 |
3.1 P82是一种核仁蛋白 |
3.2 P82是核糖体DNA转录起始前复合物的成员 |
3.3 P82增强核糖体DNA转录起始前复合物的形成 |
第四节 P82响应抗肿瘤药物ACTD的刺激 |
第四章 总结与讨论 |
第一节 总结 |
第二节 讨论 |
参考文献 |
附录 |
附录Ⅰ 缩略词 |
附录Ⅱ 硕士攻读期间科研工作成果 |
致谢 |
(10)猴B病毒gD蛋白表达、纯化及单克隆抗体的制备(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩写词表 |
第一章 绪论 |
1.1 研究背景 |
1.2 研究现状 |
1.2.1 猴B病毒的生物学特征 |
1.2.2 猴B病毒的病毒增殖周期 |
1.2.3 猴B病毒的理化特征 |
1.2.4 猴B病毒的基因组结构 |
1.2.5 猴B病毒的细胞培养 |
1.2.6 致病性及临床症状 |
1.2.7 猴B病毒的检测方法 |
1.2.8 猴B病毒的治疗与预防 |
1.2.9 单克隆抗体在猴B病毒研究中的应用 |
1.3 抗原与抗体 |
1.3.1 抗原简介 |
1.3.2 抗原的制备 |
1.3.3 抗体简介 |
1.3.4 抗原与抗体的反应 |
1.3.5 抗体的制备 |
1.3.5.1 多克隆抗体的制备 |
1.3.5.2 单克隆抗体的制备 |
1.4 免疫分析 |
1.4.1 Western blot分析方法 |
1.4.2 酶联免疫吸附分析方法 |
1.4.3 间接免疫荧光分析方法 |
1.5 本研究的目的及意义 |
1.6 实验技术路线图 |
第二章 猴B病毒重组gD蛋白的原核表达 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 菌株载体与酶类 |
2.1.2 主要仪器 |
2.1.3 主要试剂 |
2.1.4 主要试剂配制 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 目的基因BV-gD基因的获得 |
2.2.2 pET-32a-gD重组质粒的提取 |
2.2.3 重组质粒双酶切和菌液PCR验证 |
2.2.4 重组质粒转化E.coli Rosetta (DE3)感受态细胞 |
2.2.5 重组蛋白的诱导表达 |
2.2.6 确定表达产物在细胞内存在形式 |
2.2.7 重组蛋白的大量表达 |
2.2.8 重组蛋白的纯化 |
2.2.9 蛋白浓度的测定(BCA方法) |
2.2.10 目的蛋白的Western-Blot验证 |
2.2.11 间接ELISA检测方法的建立 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 BV-gD基因的获得 |
2.3.2 重组质粒pET-32a-gD的酶切鉴定 |
2.3.3 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 |
2.3.4 重组蛋白的纯化条件 |
2.3.5 重组蛋白浓度的测定结果 |
2.3.6 目的蛋白的Western-Blot验证结果 |
2.3.7 间接ELISA检测方法的建立 |
2.4 讨论 |
2.5 本章小结 |
第三章 抗BV单克隆抗体的制备 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 实验动物和细胞 |
3.1.2 实验试剂 |
3.1.3 实验溶液的配制 |
3.1.4 实验仪器 |
3.1.5 免疫小鼠及多抗血清效价检测 |
3.1.6 SP2/0骨髓瘤细胞的准备 |
3.1.7 免疫脾细胞以及饲养细胞的制备 |
3.1.8 细胞融合 |
3.1.9 杂交瘤细胞上清检测 |
3.1.10 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法) |
3.1.11 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
3.1.12 BV单克隆抗体细胞上清效价测定 |
3.1.13 BV单克隆抗体的亚型鉴定 |
3.1.14 BV单克隆抗体腹水制备及其抗体效价测定 |
3.1.15 HSV-2病毒的培养 |
3.1.16 单克隆抗体纯化及浓度测定 |
3.1.17 间接免疫荧光验证单抗与HSV-2gD同源蛋白的特异性 |
3.1.18 Western-Blot鉴定单抗对病毒编码蛋白的反应性 |
3.1.19 单克隆抗体稳定性鉴定 |
3.2 实验结果 |
3.2.1 间接ELISA法检测多抗血清效价 |
3.2.2 杂交瘤细胞株的建立 |
3.2.3 单克隆抗体细胞上清效价的测定 |
3.2.4 单克隆抗体亚型鉴定结果 |
3.2.5 单克隆抗体腹水效价测定 |
3.2.6 单克隆抗体纯化及浓度测定 |
3.2.7 HSV-2病毒培养 |
3.2.8 五株单抗的间接免疫荧光验证结果 |
3.2.9 五株单抗的Western-Blot验证结果 |
3.2.10 gD重组蛋白单克隆抗体的稳定性分析 |
3.3 讨论 |
3.4 本章小结 |
第四章 全文结论 |
致谢 |
参考文献 |
附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
附录B 其他需要说明的内容 |
四、检测猴艾滋病D型逆转录病毒抗体的ELISA技术(论文参考文献)
- [1]电化学生物传感器在高致病性病毒检测中的应用[J]. 齐佳伟,许丽,闻艳丽,刘刚,饶品华. 中国测试, 2020(10)
- [2]冀南地区鸡胚蛋有害菌的检测[D]. 刘洁玉. 河北工程大学, 2019(02)
- [3]恒河猴白介素22和XC趋化因子1的研究[D]. 余磊. 中国疾病预防控制中心, 2018(01)
- [4]乙型流感病毒血凝素受体结合区广谱中和单抗的制备及其抗病毒机制研究[D]. 沈晨光. 厦门大学, 2018(08)
- [5]猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立[J]. 刘助红,王静,李秀珍,尹雪琴,张钰,郭鹏举,黄韧. 中国比较医学杂志, 2017(09)
- [6]多载体艾滋病疫苗序贯和重复免疫动物的实验研究[D]. 何小周. 中国疾病预防控制中心, 2017(11)
- [7]中国恒河猴结核模型建立的实验研究[D]. 郭铭. 武汉大学, 2017(06)
- [8]HIV-1膜融合抑制剂SC29EK和SFT耐药机制研究[D]. 伍熙源. 北京协和医学院, 2017(02)
- [9]RNA解旋酶P82在核糖体DNA转录方面的功能研究[D]. 汪婷婷. 华东师范大学, 2016(01)
- [10]猴B病毒gD蛋白表达、纯化及单克隆抗体的制备[D]. 孙涛. 昆明理工大学, 2015(05)