一、抗真菌植物基因工程的策略和进展（论文文献综述）
刘亚荣[1]（2021）在《甜瓜TLP家族的鉴定及CmTLP17在烟草抗枯萎病中的应用初探》文中认为甜瓜（Cucumis melo L.）是一种重要的园艺和经济作物,在生长发育的各个阶段都易遭受真菌病害如枯萎病、白粉病等的侵扰,严重影响着其生长发育及果实质量,传统上对该类病害的防治主要采用农药喷施的方法,但该方法不仅容易导致病菌产生抗药性,还会对环境造成极大的污染。近年来,利用基因工程技术指导的植物抗病育种和生物农药开发因具有绿色环保、效果显着等优点而越来越受到关注,应用该技术的关键在于抗病基因的筛选。类甜蛋白（Thaumatin-like protein,TLP）是一种在植物病害胁迫响应中扮演着重要角色的蛋白,目前在甜瓜中仍未见报道。基于此,本研究对甜瓜中的类甜蛋白进行了系统的鉴定,并对关键抗性基因CmTLP17的功能与潜在的应用进行了深入的探究。本研究主要由三部分构成。第一部分对甜瓜中的类甜蛋白进行了鉴定及特性研究。运用生物信息手段,本研究在甜瓜基因组中共鉴定到了28个类甜蛋白,分属于9个不同的亚家族。表达特性分析发现,多个成员在枯萎病菌和白粉病菌侵染后呈现出高表达量,表明它们可被病菌诱导表达。其中,成员CmTLP17在两种病菌侵染后均呈现出较高的表达量,表明该基因可能在甜瓜抗病中起到重要的作用。第二部分对CmTLP17的抗病功能进行了深入研究。利用基因工程的方法,通过将该基因在烟草中进行异源表达发现,过表达CmTLP17可以增强烟草对枯萎病的抗性,表明该基因具有抗病功能。第三部分对CmTLP17的体外抑枯萎病菌活性进行了检测。通过将该基因在大肠杆菌中进行诱导表达,摸索获得了该基因的最佳诱导表达条件。之后,通过体外抑菌实验发现CmTLP17蛋白表达产物可以抑制枯萎病菌的生长,表明其具有体外抑菌活性。综上,本研究对甜瓜中的类甜蛋白进行了鉴定和分析,并对关键基因CmTLP17的抗病功能进行了深入的研究。本研究的结果不仅可以为甜瓜的抗病育种提供指导,也可供其他植物中的相关研究借鉴。
张园[2]（2021）在《杀黑星菌素的生物合成研究》文中认为病虫害对人类生活和生存存在着极大影响,在影响农业生产的主要危害中,植物病害始终占据着不可忽视的一部分。据统计,由病原真菌侵染导致的植物病害占比约为75%左右。同样的,对于人类自身生存而言,也一直饱受包括锥虫病在内的各种感染性疾病的折磨。锥虫病是指锥虫侵染并寄生于人和动物血液或者组织中而引起的一种感染性疾病,其中被关注最多的是一种易被忽视的热带寄生虫病—非洲锥虫病,一直以来严重威胁着撒哈拉以南非洲30多个国家近六千万人民的健康和生命。针对二者,科学家们一直在不断探索各种解决措施,并从微生物中具备显着抗真菌活性和锥虫抑制活性的大环内酯类化合物杀黑星菌素。然而,到目前为止,杀黑星菌素的生物基因簇并未被鉴定,限制了人们从分子遗传水平上操纵相应产生菌的代谢途径,构建适于发酵的高产菌株;也制约着科研人员采用组合生物合成技术改造其生物合成途径,以求得到相匹配的结构类似物用于大范围的活性筛选和其化学结构与生理活性之间的关系研究。本研究以链霉菌NO1W98为研究对象,利用放大规模的有机溶剂萃取方法对其中放大规模的发酵后产物进行了提取;各种化合物的分离和纯化用正向、反向的色谱柱层析为基础进行;各种单体化合物的结构通过波谱学的手段来鉴定与分析;采用Illumina Hiseq技术对基因组序列进行了测定,对其中所得到的基因组序列数据进行了生物信息学的剖析、注释并确定了杀黑星菌素的生物合成基因簇,利用基于PCR-targeting的遗传操作系统构建vtd内相关基因的阻断突变株,同时利用p SET152AKE进行基因回补,并分析与野生菌株的发酵产物差异。结果,经过对Streptomyces sp.NO1W98发酵产物的粗提取和纯化,从中初步分离并鉴定了两个大环内酯类化合物杀黑星菌素A（1）和B（2）;基因组序列测定结果显示Streptomyces sp.NO1W98的基因组大小约为11.6 Mb,蕴涵49个次级代谢产物生物合成基因簇,其中scaffold 3上的Region 3.3可能负责杀黑星菌素的生物合成。最后通过基因阻断和回补实验初步鉴定了杀黑星菌素的生物合成基因簇,包含6个骨架基因,5个转运基因,2个调控基因以及9个后修饰基因。总之,本研究通过“经典”的生物合成研究思路,从一株链霉菌Streptomyces sp.NO1W98中分离得到了杀黑星菌素,并鉴定了其生物合成基因簇。研究结果扩充了I型PKS途径的家族成员,为杀黑星菌素基因簇内其他基因的功能研究奠定了基础。后续可通过分子遗传学手段对杀黑星菌素进行结构修饰、改造以及产量优化,以扩充该家族化合物成员,为系统的活性筛选和构效关系研究提供支撑。
郑文韬[3]（2021）在《细菌基因组多元编辑技术的开发以及应用》文中研究表明微生物次级代谢产物不仅是药物与生物农药的重要来源,也在微生物生态学中充当重要角色。假单胞菌和伯克氏菌都属变形菌门,假单胞菌合成的天然产物在人类、动物和植物的疾病预防中起着至关重要的作用,伯克氏菌是一种新兴的生物活性天然产物的来源菌,它们的基因组中含有大量未知的生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster,BGC）,具有生物合成新结构的巨大潜力。传统的基因组挖掘策略有单一启动子替换、转录调控因子操作、外源功能基因添加、非目标代谢途径失活等,由于BGC结构和调控网络的复杂性,采取单一策略往往难以激活沉默基因簇,导致挖掘基因组的效率低下,大量的BGC资源仍尚待挖掘。对基因簇资源的深度挖掘需要借助高效的多元基因编辑技术对微生物基因组进行包含多种挖掘策略的系统性“改写”才能最终将基因簇资源转化为天然产物资源。当前被广泛使用的细菌多元基因组编辑技术主要有基于CRISPR/Cas系统（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated nuclease）的多元基因编辑方法和基于Red/ET重组工程的多元基因迭代编辑方法技术（multiplex automated genome engineering,MAGE）。CRISPR/Cas 系统作为异源外切酶介导双链断裂所带来的细胞毒性以及基因组多位点编辑时需要构建复杂的crRNAs表达载体等问题限制了在假单胞菌和伯克氏菌中的应用。传统基于Red/ET同源重组工程的基因组多元迭代编辑技术一般以单链DNA（single-stranded DNA,ssDNA）为底物,这在遗传基础研究和构建优化的微生物细胞工厂等方面有很大的优势。然而,由于千碱基以上尺度的ssDNA获取耗时费力、插入效率低下导致ssDNA重组工程相关的多元编辑技术介导的基因组多元编辑存在插入片段长度受限制、突变子的筛选效率低下、需要对基因组进行预编辑、适用范围窄等问题。在本研究中,通过核糖核苷酸还原酶（RNR）过表达和脱氧核苷三磷酸（dNTP）添加介导细胞内dNTP浓度调控,建立了一种基于双链DNA（double-stranded DNA,dsDNA）recombineering的多元基因组工程（double-stranded DNA recombineering-assisted multiplex genome engineering,dReaMGE）技术,该技术兼具非 ssDNA 依赖、编辑位置灵活、筛选方法灵敏度高以及应用范围广等优点。dReaMGE可以介导大肠杆菌、假单胞菌和伯克氏菌等多种细菌的多元基因组编辑,只通过一轮重组在基因组上同时进行多个（1-6）千碱基尺度序列（0.25-90kb）的替换以及删除和插入,而无需体外制备ssDNA、构建复杂的引导质粒、引发多个基因组双链断裂以及对错配修复系统的预干扰。dReaMGE在几天内可以完成以往采用传统重组工程需要耗时数月的基因组编辑工作,例如多个生物合成途径失活、启动子或基因插入、基因组精简和转录调控因子组合编辑,证明dReaMGE是探测基因型与表型关系、系统性改造细菌基因组的便捷工具,能够促进实现微生物基因簇资源的深度挖掘以及细胞工厂的构建,是对当前基因组工程技术一种理想补充。位点特异性重组酶系统（site-specific recombination system,SSRs）由位点特异性重组酶和重组酶识别位点两部分组成,重组酶能够特异识别和结合识别位点,进而实现对两个识别位点之间目标DNA的切除、整合、倒置和移位等编辑工作,过去的工作证明对重组酶识别位点进行局部的突变能够获得仍能被重组酶有效识别和结合,但与野生型识别位点之间无法在进行反应的突变位点,从而拓展了对位点特异性重组酶系统的利用。目前最常用的位点特异性重组酶系统有Cre/lox系统和Flp/FRT系统,其中Cre/lox系统因其高效性而应用最为广泛,但是在其具有高效性的同时也具有很强的细胞毒性。Flp/FRT系统的效率远远低于Cre/lox系统同时也具有较强的细胞毒性,目前已有一系列的突变lox位点被开发并应用于基因组编辑工作。在应用dReaMGE等技术的复杂基因组编辑工程中,会涉及大量的基因和代谢途径的敲除、替换和插入等操作,因而需要借助SSRs用于筛选标记的删除以维持基因组的稳定性或者防止超级细菌的产生,而现有位点特异性重组酶系统的可用识别位点远远难以满足需求。来源于珊瑚弧菌的Vika/vox系统是一种新型的SSRs,由重组酶Vika和特异性识别位点vox组成,该系统与Cre/lox和Flp/FRT系统相比,具有细胞毒性低,使用范围广和安全性高等优势,本文中对vox位点进行突变获得了多个介导重组能力相较于原始vox位点显着增强的vox突变位点（vox2261、vox2272和vox226172）,和相较于lox位点更为安全严谨的vox突变位点（vox-66和vox-71）,为细菌基因组多元编辑工作提供了有效的工具元件,进一步扩展了位点特异性重组酶系统的应用范围。本文基于Red/ET重组工程、dReaMGE和Vika/vox等细菌基因组多元编辑技术以及工具元件的开发,通过单个或多个启动子插入、转录调控因子的组合编辑、基因簇失活等策略完成了对一种假单胞菌和两种伯克氏菌的生物合成潜力的开发,成功实现对六个基因簇的编辑,一个活跃基因簇的深度挖掘,一种目标化合物产量的提高以及抗肿瘤化合物埃博霉素高效异源表达,获得了六种新型的天然产物。其中来自假单胞菌Pseudomonas parafulva CRS01-1的massetolides有抗枯草芽孢杆菌活性,来自伯克氏菌Paraburkholderia megapolitana DSM 23488 的 haereomegapolitanin A 具有表面活性剂活性,来源于伯克氏菌DSM 7029的luminmycin G对人乳腺癌细胞株具有一定的抗肿瘤活性。以上结果显示,本文开发的包含dReaMGE和vika/vox在内的细菌基因组多元编辑技术与工具元件是对现有细菌基因组编辑工具箱的扩大和丰富,能够极大的加速对微生物基因簇资源的开发的转化。
王彩云,侯俊,周茂嫦,徐庆祝,张翔宇,阮培均[4]（2021）在《天麻抗真菌蛋白研究进展》文中认为天麻抗真菌蛋白是从我国传统中草药天麻中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质,对许多植物病原菌具有很强的抑制作用。该研究综述了天麻抗真菌蛋白的特性、作用机理、GAFP基因克隆、表达载体构建、转基因研究等内容,以期为天麻抗真菌蛋白的开发及综合利用提供参考。
王世伟,王卿惠,翟丽萍,刘军,向文胜[5]（2020）在《解淀粉芽胞杆菌抗真菌活性研究进展》文中研究指明解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）具有很强的抑制植物病原真菌的能力。其菌体细胞能产生多种酶类、脂肽类抗生素、生物表面活性素、聚酮类化合物和抑菌蛋白,同时具有诱导植物产生系统抗性（ISR）的能力,因此在工农业、种植业、养殖业、食品加工业、果蔬的采后保鲜和饲料业等行业具有重要价值。本文对解淀粉芽胞杆菌抗真菌作用、抗真菌能力提高策略、抗菌化合物合成调节、抑制真菌机制及其引发的ISR等问题进行了深入探讨和综述。
韦春艳[6]（2020）在《大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶基因VdILV2和VdILV6的克隆及功能研究》文中进行了进一步梳理棉花黄萎病是一种土传的维管束真菌病害,被称为棉花的“癌症”,其致病菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）。V.dahliae致病机理十分复杂且其微菌核在土壤中存活时间久,至今仍无有效的防治方法。研究V.dahliae致病过程中重要基因的功能,有助于进一步揭示V.dahliae致病分子机制,对于棉花黄萎病的防治具有重要的指导意义。寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）是一种通过沉默病原菌毒力基因来防治作物病害或进行基因功能验证的实用有效技术。本研究利用HIGS技术,以V.dahliae乙酰乳酸合成酶（VdALS）基因为靶标构建了一系列烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）干扰载体,对VdILV2和VdILV6的毒力功能进行分析鉴定。并构建VdILV2基因敲除载体,进行了基因敲除突变株的筛选,以进一步解析该基因在生长发育过程中的功能。主要研究结果如下:1、通过与稻瘟病菌中乙酰乳酸合成酶（ALS）同源比对,克隆了V.dahliae中ALS催化亚基和调节亚基,分别命名为VdILV2和VdILV6;生物信息学分析结果表明V.dahliae中ALS可能与稻瘟病菌中ALS一样均与其致病性相关。VdILV2和VdILV6与稻瘟病菌MoILV2和MoILV6在氨基酸序列一致性上分别高达81.07%和78.64%。功能域预测发现VdILV2有TPPenzymeN,TPPenzymeM,TPPenzymeC三个保守的功能域,VdILV6有两个保守功能域,分别是N末端的ACT（aspartate kinase,chorismate mutase and TyrA）功能域及C末端的ALS功能域。2、建立了HIGS体系,抗性鉴定结果显示,靶向VdILV2和VdILV6的HIGS可显着提高陆地棉对黄萎病抗性。接种Vd99116 d后,TRV:00和CK植株维管束表现出明显的V.dahliae黑色素和微菌核的积累;而TRV:VdILV2-1,TRV:VdILV2-2,TRV:VdILV6-1和TRV:VdILV6-2植株仅有较少的黑色素和微菌核积累,棉花病害程度也较轻。接种20d后,CK和TRV:00棉株表现出显着的叶枯萎,病叶百分比约达到了85%;而TRV:VdILV2-2和TRV:VdILV6-1处理的棉株仅约45%;TRV:VdILV6-2和TRV2:VdILV2-1处理的棉株分别约56%和72%。3、RT-PCR（reverse transcription PCR）和qRT-PCR（quantitative real-time PCR）分析结果表明,TRV:VdILV2-1,TRV:VdILV2-2,TRV:VdILV6-1和TRV:VdILV6-2处理的棉株上大丽轮枝菌VdILV2和VdILV6基因表达水平都不同程度的降低了,说明抗性的提高与HIGS靶向抑制VdILV2和VdILV6的表达有关,VdILV2和VdILV6与V.dahliae的致病性相关。4、成功构建了致病相关基因VdILV2的敲除载体pGKO-VdILV2,经PCR鉴定后,初步筛选到了2个VdILV2基因敲除突变体。
刘云涛[7]（2020）在《转CrSMT基因棉花的鉴定与表型分析》文中指出棉花是世界上最重要的纤维作物,每年因虫害造成的棉花产量损失高达10-15%。棉花还是盐碱地开发的先锋作物,近年来为缓解粮棉争地矛盾,我国棉田逐渐向盐碱地转移。提高棉花的抗虫和耐盐性对保证棉花高产稳产具有重要意义。本研究通过农杆菌介导的遗传转化方法,将Ca MV 35S启动子驱动的Cr SMT基因导入陆地棉受体材料R15中,经过PCR鉴定,获得了多个转基因阳性株系,对随机选取的两个转基因株系L17和L25开展了进一步研究,取得如下结果:（1）q PCR和RT-PCR结果显示Cr SMT在转基因株系中均有表达,L17的表达量约为L25的2.2倍。GC-MS结果表明转基因株系中的甾醇组分发生显着变化,L17中的谷甾醇比例显着下降,菜油甾醇和豆甾醇的比例显着升高;L25中的谷甾醇比例下降,菜油甾醇的比例也显着升高。转基因株系的农艺性状与野生型无显着差异。（2）斜纹夜蛾幼虫对野生型棉花具有取食偏好性;取食L17和L25叶片后斜纹夜蛾的世代历期分别显着延缓了5.5和4.0天,其幼虫存活率、化蛹率、蛹重和羽化率都显着降低。取食转基因棉花叶片的绿盲蝽生长缓慢,死亡率较高。取食转基因植株棉叶的抗性和敏感棉铃虫其生长都比较缓慢,但死亡率与野生型比较没有显着差异。（3）转基因棉花的耐盐性也有显着的提高,盐胁迫下其长势和一些生理指标均优于野生型棉花。本研究首次在棉花中应用了改变甾醇的抗虫策略,创制出了抵抗多种害虫并具有一定耐盐能力的棉花种质,进一步丰富了棉花抗逆种质资源。这种广谱且环境友好型的抗虫策略有望在其他植物,特别是粮食作物中得以应用。
王胜强[8]（2020）在《基于转录组与真菌病毒侵染解析皮落青霉咪鲜胺抗机制》文中指出真菌病害严重影响农业丰产,潜在威胁食品安全和人类健康。柑橘采后储运与销售阶段易发生多种真菌病害。指状青霉（绿霉）、意大利青霉（青霉）和皮落青霉引发柑橘腐烂,导致采后损失严重,是制约柑橘产业发展的主要病原真菌。与青绿霉相比,皮落青霉宿主广泛,除柑橘外还感染多种瓜果和食品加工原料,危害更广。甾醇去甲基化酶抑制剂（DMI）类化学药物如咪鲜胺广泛用于真菌病害防控,但是抗药菌株频繁出现,药效逐渐下降。皮落青霉咪鲜胺抗性显着高于青绿霉菌,相对低抗菌株少。青绿霉咪鲜胺抗性机制已有比较转录组学研究,但皮落青霉由于缺乏抗性合适的对照菌株而未见报道。真菌病毒普遍存在于柑橘青绿霉菌,导致宿主毒力或抗药性下降,即产生弱毒或“药物条件弱毒”菌株。染毒真菌抗性降低可作为抗药机制研究的必要材料。研究皮落青霉病毒及其对宿主的抗药调控,为真菌病毒研究提供新资料,有助于深入认识青霉属病原真菌抗药机制和药物条件弱毒机制。本研究以两株咪鲜胺抗性水平显着差异的皮落青霉高抗菌株（CQ1和CQ15）为材料,运用转录组结合RT-qPCR解析咪鲜胺抗性基因及其作用机制。分离鉴定皮落青霉病毒并研究其对宿主真菌咪鲜胺抗性的影响。构建皮落青霉人工染毒菌株CQ1V。进一步运用转录组结合RT-qPCR 比较CQ1V、CQ1以及病毒自然宿主CQ15在咪鲜胺施药下的基因转录模式,鉴定病毒参与宿主抗药调控的靶基因及其功能。获得下列主要研究结果。1.转录组解析皮落青霉咪鲜胺抗性机制以咪鲜胺抗性差异显着的皮落青霉菌CQ1和CQ15为材料,转录组测序与生物信息学解析咪鲜胺抗性基因及其综合代谢背景。根据两者基因表达模式差异,运用COG、KOG、GO和KEGG数据库富集分类技术,筛选获得皮落青霉抗药基因包括CYP51靶标酶基因、MFS和ABC药泵蛋白基因、细胞色素b5基因、甾醇生物合成关键酶基因（ERG3、ERG4、ERG5、ERG11、ERG24和ERG27）、脂肪酸代谢关键酶基因、细胞壁多糖代谢基因、GSH抗氧化损伤相关酶基因以及细胞呼吸、氧化磷酸化关键酶基因。RT-qPCR验证了上述DEG的差异表达模式。证明皮落青霉咪鲜胺抗性机制不仅包括P450、药泵蛋白等传统靶标基因,还涉及以细胞膜抗逆反应如GSH抗氧化损伤为中心的碳、氮、脂、氧化磷酸化综合代谢调控。为生物学功能实验深入研究青霉属病原真菌DMI抗性机制提供了重要的线索。2.皮落青霉病毒分离、鉴定与咪鲜胺抗性调控作用从咪鲜胺抗性相对较低的皮落青霉菌CQ15中分离获得一株双链（ds）RNA病毒,运用高通量测序结合随机引物PCR克隆了全部四个节段的病毒基因组dsRNA。病毒基因组包括四个节段（dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3和dsRNA4）,全长依次为 3600、3177、3078 和 2808 bp。它们各自包含一个开放阅读框,依次编码依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp,含1113个氨基酸残基）、衣壳蛋白（CP,含981个氨基酸残基）和两个未定功能的蛋白质（分别包含912和847个氨基酸残基）。根据RdRp序列同源比对结果构建分子进化树证明该病毒属于产黄病毒科和产黄病毒属,命名为Penicillium crustosum chrysovirus 1（PcCV1）。这是第一例皮落青霉dsRNA病毒,为产黄科病毒家族增加了新成员。制备CQ15的PcCV1脱毒株CQ15C,证明CQ15C咪鲜胺抗性（EC50=4.6±0.3 mg·L-1）高于CQ15（EC50=2.5±0.4mg·L-1）。构建了皮落青霉人工染毒株 CQ1V,证明 CQ1V 咪鲜胺抗性（EC50=5.9±0.6 mg·L-1）低于 CQ1（10.5±1.9 mg·L-1）。表明PcCV1导致宿主真菌药物条件弱毒,即病毒感染可以增强咪鲜胺对皮落青霉的防控效率。3.转录组解析皮落青霉病毒调控宿主咪鲜胺抗性机制运用转录组测序与生物信息学解析CQ1V与未染毒亲本CQ1咪鲜胺处理条件下的基因表达模式,比较了 CQ1V和病毒自然宿主CQ15施药条件下的基因表达模式以及不施药条件下抗性基因的本底表达模式。根据基因表达模式差异,运用COG、KOG、GO和KEGG富集分类技术结合RT-qPCR证明PcCV1具有抑制咪鲜胺对皮落青霉抗药基因的诱导作用,即削弱了宿主对药物胁迫的适应能力。药物诱导作用被病毒削弱的抗性基因包括CYP51靶标酶、MFS和ABC药泵蛋白、细胞色素b5、甾醇生物合成关键酶以及细胞膜抗逆相关碳、氮、脂、氧化磷酸化综合代谢酶及转运蛋白基因。证明PcCV1通过调控宿主的咪鲜胺抗性基因而导致药物条件弱毒。综上所述,本研究采用转录组结合真菌病毒解析皮落青霉咪鲜胺抗性机制,在综合代谢层面揭示了皮落青霉普遍高抗的分子机制,为深入认识青霉属病原真菌抗药机制以及真菌病毒参与抗药调控提供了新的转录组证据,为新靶标真菌药物设计提供必要的理论依据。
陈秀珍[9]（2020）在《广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究》文中认为广藿香（Pogostemon cablin（Blanco）Benth.）是着名的岭南道地药材,十大广药之一,是临床常用的芳香化湿药。从广藿香中提取的广藿香油是医药工业和轻化工业的重要原料,市场需求量大。广藿香是获得广藿香油的唯一天然来源,其最主要的成分是广藿香醇（Patchoulol）,又称为“百秋李醇”,是一种代表性的倍半萜类物质,具有很好的神经保护、抗流感病毒、抗多种真菌、抗肿瘤、抗炎症等生物活性,更是我国历版药典中用于评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分。因此,广藿香醇的生物合成及其动态积累研究备受关注。随着功能基因组学、植物代谢检测分析技术和多组学技术的应用,广藿香萜类次生代谢模式和广藿香醇的生物合成途径被逐渐解析。研究表明,广藿香醇合酶（Patchoulol synthase,PatPTS）能直接催化法呢基焦磷酸（FPP）生成倍半萜类终产物广藿香醇,对于广藿香醇的合成积累最为关键。目前对广藿香的萜类合成在转录调控方面的研究尚没有报道,特别是缺乏直接剖析转录因子如何调控PatPTS的转录表达的研究,相关的转录调控机制和互作网络也未得到解析。因此,本研究率先开展了调控广藿香醇生物合成的转录因子的挖掘,采用三代测序技术构建了广藿香全长转录本数据库,结合酵母杂交技术,以PatPTS的启动子作为靶调控位点,通过文库筛选、分离克隆和体内外验证来获得一系列转录因子,并联合植物基因工程和代谢分析对其功能进行深入研究,以阐明广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制,为广藿香优良品种培养及广藿香醇合成研发工作提供理论支撑和技术参考。研究的技术方法和结果概况如下:1广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析1.1基于PacBio三代测序的转录本识别和分析采用PacBio单分子实时测序技术（Singlemolecular real-time,SMRT）构建了广藿香全长转录组参考图谱,重构获得了 82,335个全长转录本,共有65,826个转录本在Nr、Swissprot、GO、KEGG等数据库获得注释,注释率为79.95%。其中注释为萜类生物合成相关途径相关的转录本有103个,共包括广藿香醇合成相关关键酶基因16个,并分析获得3,176个转录因子序列,分别属于90个不同的家族。1.2酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析利用 Invitrogen 的 CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction Kit 构建来广藿香高质量酵母杂交cDNA文库,其库容为8.6×106CFU,重组率为>95%,满足次级文库要求,可用于后续文库筛选试验。2 PatPTS启动子克隆及其转录调控因子的筛选2.1 PatPTS及其启动子的克隆分析从广藿香转录组数据库筛选获得PatPTS的全长转录本,设计引物克隆获得PatPTS基因1,659 bp ORF序列和3,392 bp gDNA序列,以及854 bp启动子序列。采用PlantCARE和New PLACE等数据库对该启动子进行顺式作用元件分析,发现该启动子含有转录起始核心元件TATABOX、增强子核心元件CAATBOX等必须元件,同时含有E-BOX、I-BOX等多种转录因子的结合元件,还含有JA、ABA、Ethylen（乙烯,ET）等激素响应元件。2.2结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选以PatPTS的启动子为诱饵从广藿香cDNA文库中获得约200个候选基因片段。通过NCBI、Uniprot等数据库进行候选片段注释分析,从广藿香的全长转录本数据库提取候选基因的全长转录本进行分析及克隆;然后构建酵母AD载体,并与诱饵质粒共转至酵母Y187重复酵母单杂交验证,结果表明 PatDREB、PatERF061、PatSWC4、PatASIL2、PatGATA17和PatGIS2等6个蛋白在酵母体内可以结合PatPTS的启动子。3转录因子调节PatPTS基因表达参与广藿香醇合成调控的机制3.1广藿香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究（1）据文献报道MYC2转录因子在植物萜类化合物的代谢合成中具有重要的调控作用,因此本研究还对广藿香中MYC2转录因子进行了克隆,并探究其对PatPTS的转录调控功能进行分析。从广藿香的全长转录组数据库筛选出1 1条注释为MYC的全长转录本,设计引物克隆获得8个MYC编码序列,对序列进行生物信息学分析表明PatMYC2a、PatMYC2b1和PatMYC2b2具有高度保守bHLH-MYC-N、bHLH-Zip和ACT-like功能域。这3个PatMYC2在拟南芥原生质体中均定位于细胞核,均具有转录激活活性,缺失表达实验表明PatMYC2a和PatMYC2b2的转录激活功能域为bHLH-MYC-N蛋白保守结构。RT-qPCR分析表明3个PatMYC2在不同组织部位均有表达,低温和光照处理后3个PatMYC2呈现相似的表达模式。（2）在本氏烟中进行的双荧光素酶（Dual-luc）实验和在广藿香叶片中瞬时过表达实验表明分别过表达PatMYC2a和PatMYC2b2能够激活PatPTS启动子的活性并促进PatPTS基因转录表达,同时可激活广藿香醇合成通路PatFPPS、PatIPPI、PatMVD、PatPMK、PatHMGS和PatAACT等多个关键酶基因的表达来促进叶片中广藿香醇的合成积累。3.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广藿香醇合成调控机制研究（1）Y1H实验中筛选得到的两个AP2/ERF家族转录因子均含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域,均属于DREB亚家族,具有该亚家族的保守位点,其中PatDREB属于该亚族A-4组,PatERF061则属于A-6组。PatDREB在拟南芥原生质体的细胞核定位表达,而PatERF061则在细胞核和细胞质均有表达。两个DREB在不同组织均有表达,且转录表达水平受MeJA诱导,但表达模式有所差异。（2）酵母双杂交（Y2H）和荧光素酶互补（BiFC）实验结果表明,PatDREB和PatERF061分别能与茉莉酸信号通路的抑制蛋白PatJAZ4互作,而PatERF061能与PatJAZ4在拟南芥原生质体的细胞核共表达。Dual-luc实验进一步表明,PatDREB和PatERF061能显着激活PatPTS启动子的活性,它们的转录调控功能受PatJAZ4和MeJA水平影响,其中PatJAZ4通过与PatERF061结合而抑制其转录调控功能,而MeJA能够逆转这种抑制作用。外源MeJA能够抑制PatDREB转录调控功能,而PatJAZ4对PatDREB的转录功能影响不大。（3）广藿香叶片瞬时过表达实验表明,PatDREB和PatERF061均能通过激活广藿香醇合成途径的关键酶基因的表达,从而促进广藿香醇的合成积累。PatERF061与PatJAZ4共过表达则抑制广藿香醇的合成积累,与dual-luc结果一致。说明PatDREB和PatERF061是促进广藿香醇合成的重要转录因子,而且是茉莉酸信号通路的重要组分。3.3 MYBrelated转录因子PatSWC4调控广藿香醇合成机制研究（1）Y1H筛选获得的PatSWC4为MYBrelated家族转录因子,含有SANT/Myb-like domain of DAMP 1 和 DNA methyltransferase 1-associated protein 1（DMAP1）两个保守功能域。PatSWC4主要于细胞核定位表达,在广藿香各个组织部位均有表达,且其转录表达水平受MeJA诱导。Y2H和Dual-luc实验结果表明,PatSWC4能激活PatPTS启动子的活性,添加MeJA后,激活作用更显着提高;PatJAZ4通过与PatSWC4结合而抑制其转录激活功能,而施加MeJA则能逆转这种抑制作用。在广藿香叶片中瞬时过表达PatSWC4,能激活广藿香醇合成酶PatPTS和MVA途径PatFPPS等关键酶基因的表达;另外广藿香醇合成相关转录因子PatDREB、PatERF061和3个PatMYC2的表达也显着提高,从而促进了叶片中广藿香醇的合成和积累。（2）Y2H 和 Dual-luc 实验表明 PatSWC4 能分别与 PatDREB、PatERF061形成转录复合体,复合体能激活PatPTS的启动子活性,外源MeJA能抑制其激活作用。PatJAZ4能分别与PatSWC4、PatDREB、PatERF061结合,抑制转录复合体的形成,从而抑制PatPTS启动子的活性,这种作用在施加MeJA后可消除,甚至逆转。将PatSWC4分别与PatDREB、PatERF061在广藿香叶片中进行瞬时共过表达,也能显着促进广藿香醇的合成和积累。3.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广藿香醇合成机制研究（1）是Trihelix家族SIP1亚家族转录因子,N端有一个Trihelix保守结构域和一个第四α螺旋结构域,C端有一个卷曲螺旋结构域。预测发现在蛋白序列的中、下游共有两个核定位信号（NLS）,PatASIL2在拟南芥原生质体亚细胞定位于细胞核,与预测一致。PatASIL2在不同的组织均有表达,且转录表达水平受MeJA的诱导。Dual-luc实验表明PatASIL2能抑制PatPTS启动子活性,施加MeJA后,PatASIL2则激活PatPTS启动子转录活性。广藿香叶片瞬时过表达PatASIL2能促进广藿香醇的合成和积累,激活广藿香醇合成途径PatFPPS、PatMVD等多数关键酶基因的表达,但抑制PatPTS的表达。（2）Y2H 和 BiFC 实验,表明 PatASIL2 能分别与 PatDREB、PatERF061 在细胞核形成转录复合体。PatASIL2分别与两个DREB瞬时共过表达都能促进广藿香叶片中广藿香醇的合成和积累。说明PatASIL2为广藿香醇合成的重要调控因子,且能与两个DREB形成转录调控复合体。3.5两个锌指蛋白可能调控广藿香醇的合成酵母单杂交筛选获得的PatGATA17和PatGIS2均为锌指蛋白。PatGATA17属于Zf-GATA转录因子家族,主要于细胞核表达;具有转录激活活性。该基因在广藿香根和成熟叶表达量较高,且受MeJA和低温诱导。PatGATA17能够结合PatPTS的启动子并激活其转录活性,进而促进广藿香醇的合成积累。而PatGIS2属于Zf-CCHC基因家族,通过结合PatPTS的启动子并抑制其转录活性,进而抑制广藿香醇的合成积累。综上所述,为挖掘鉴定广藿香醇生物合成的转录调控因子,本研究首先构建了广藿香的全长转录组和酵母杂交文库,根据转录组注释分离克隆了广藿香MYC2转录因子,并研究其在广藿香醇生物合成中的重要作用,以PatPTS的启动子为诱饵筛选并首次鉴定了 6个特异性调控PatPTS基因表达进而参与调控广藿香醇生物合成的转录因子,并利用瞬时过表达对其功能进行验证分析。PatDREB、PatERF061、PatSWC4和PatASIL2的基因表达和转录调控功能受外源MeJA诱导,可能为JA信号通路的下游响应转录因子。蛋白互作结果还表明两个DREB转录因子能够与MYB-like转录因子（PatSWC4、PatASIL2）形成转录复合体调控广藿香醇的合成。同时PatGATA17和PatGIS2作为调控广藿香醇合成的候选转录因子开展初步鉴定。本研究首次筛选获得多个转录因子,功能分析揭示了其调控广藿香醇生物合成的可能模型,不仅促进从转录调控上揭示广藿香醇的生物合成分子机制,在广藿香响应激素诱导的分子调控网络机理的解析取得突破,而且有助于广藿香及广藿香挥发油的质量控制,为利用代谢调控手段提高药用植物活性成分合成提供理论基础和应用借鉴。
张旭冉[10]（2020）在《LfcinB等抗菌肽原核和真核表达体系构建的初步研究》文中研究表明近年来抗生素在人类生产生活中的大量使用,导致了超级耐药菌的产生,带来了诸多安全隐患,找寻传统抗生素的替代品迫在眉睫。抗菌肽是生物体内产生的一种带正电荷,参与生物体免疫反应的小分子多肽,广泛存在于动植物体内,具有广谱的抑菌活性且不易产生耐药性。在饲料添加剂、食品抑菌剂等方面有巨大的应用潜力。抗菌肽在生物体内的含量极微,但随着分子生物学和DNA重组技术的发展,利用基因工程表达抗菌肽成为有效生产方法,与传统方法相比较,基因工程具有可以大规模生产、生产周期短、成本相对较低等优势。牛乳铁蛋白肽（LfcinB）是近年发现的一种抗菌肽,它是牛乳铁蛋白经过胃蛋白酶水解产生,仅含有25个氨基酸,抑菌效果是目前发现的几种乳铁蛋白肽中最强的。本文研究了LfcinB在酿酒酵母中的异源表达。为使表达LfcinB更便于检测纯化,本实验在LfcinB基因的C端融合了红色荧光蛋白DsRed2与His-Tag,成功构建了以DsRed2为报告基因的三种质粒:pYES2-α-LfcinB-DsRed2、pYES2-α-LfcinB-DsRed2-HIS和pYES2-α-LfcinB-HIS-DsRed2,通过电转化将质粒导入到酿酒酵母W303和INVSC1菌株中。利用牛津杯法检测诱导发酵液对大肠杆菌的抑制活性,并对表达产物进行了热稳定性和pH敏感性的检测;利用激光共聚焦荧光显微镜检测诱导表达的酵母菌体荧光;利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白。实验结果显示,通过比较酵母诱导组与未诱导组OD600和pH值的变化趋势,重组蛋白LfcinB-DsRed2-HIS的诱导表达对酵母的生长未产生明显不利的影响;使用牛津杯法检测,显示诱导组发酵液上清具有抑制大肠杆菌生长的活性,并且证明抑菌活性具有热稳定性;通过激光共聚焦检测,观察到诱导组有明显的红色荧光,说明重组蛋白被诱导表达,但SDS-PAGE在培养液上清以及菌液沉淀均未检测出目的蛋白条带,说明表达产量较低;推测可能有以下原因:（1）抗菌肽在胞内表达对于酿酒酵母仍然具有一定的毒性;（2）重组蛋白的稳定性问题;（3）糖基化对表达的影响所导致。在对表达产物进行纯化时,以抑菌活性来追踪目的蛋白的去向,结果发现硫酸铵、丙酮沉淀法无法将诱导培养液上清中带有抑菌活性的成分沉淀下来,而经过透析、超滤会造成抑菌活性的丧失。该酿酒酵母菌株在诱导表达过程中,由于表达产物在胞内对于宿主可能存在的毒性,使得宿主产生应激反应,生成了有抑菌活性的小分子物质。因此牛津杯法所检测到的抑菌活性主要是这种小分子所致。拟对发酵液进行非靶向代谢组学鉴定。大肠杆菌等原核表达体系有其无可比拟的优点,但抗菌肽对大肠杆菌具有杀伤作用,无法直接利用大肠杆菌宿主进行表达生产。常用带有负电荷的融合头与抗菌肽连接,抑制抗菌肽对大肠杆菌的毒性。在生物体内,抗菌肽以前导肽（prodomain）—抗菌肽的形式被合成,经过特定的蛋白酶水解后,成熟的抗菌肽再参与机体免疫反应,前导肽同样含有大量的负电荷。本实验利用Cherry或抗菌肽本身所携带的前导肽来做融合头,在大肠杆菌中表达Piscidin和R-2PLx等抗菌肽,探索前导肽对抗菌肽活性的影响。本实验将连接扩增好的六种基因片段:cherry-piscidin、piscidin-prodomain、sig-piscidin-prodomain、cherry-piscidin-prodomain、piscidin、prodomain-R-2PLx,与载体pET22b（+）连接,转化大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。结果发现cherry-piscidin、piscidin-prodomain、cherry-piscidin-prodomain三种表达产物导致大肠杆菌诱导前期无法生长,cherry与piscidin自身所带的前导肽无法抑制其抑菌活性;prodomain-R-2PLx与sig-piscidin-prodomain两种表达产物在诱导期间未明显影响宿主生长,但后期蛋白电泳未检测出蛋白条带,推测可能是在翻译过程中,mRNA在二级结构上产生的茎环结构从而导致蛋白无法正常翻译,后续将对诱导条件调整后再进行相关实验。
二、抗真菌植物基因工程的策略和进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗真菌植物基因工程的策略和进展（论文提纲范文）
（1）甜瓜TLP家族的鉴定及CmTLP17在烟草抗枯萎病中的应用初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 甜瓜及其病害防治方法 |
| 1.2 病程相关蛋白研究概述 |
| 1.2.1 病程相关蛋白家族 |
| 1.2.2 病程相关蛋白的生物学功能 |
| 1.3 类甜蛋白研究概述 |
| 1.3.1 类甜蛋白及其结构特征 |
| 1.3.2 类甜蛋白的生物学功能 |
| 1.3.3 类甜蛋白的功能研究策略 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 2 甜瓜类甜蛋白家族的鉴定及表达特性分析 |
| 2.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 甜瓜与白粉病菌的培养及接种 |
| 2.2.2 总RNA的提取和反转录 |
| 2.2.3 TLP家族成员的鉴定及序列分析 |
| 2.2.4 基因结构及保守基序分析 |
| 2.2.5 多序列比对及进化关系分析 |
| 2.2.6 染色体定位及基因复制现象分析 |
| 2.2.7 组织特异性分析 |
| 2.2.8 病菌侵染下的表达特性分析 |
| 2.2.9 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 TLP家族成员的序列特性 |
| 2.3.2 TLP家族的进化关系 |
| 2.3.3 TLPs的基因结构及保守基序分布 |
| 2.3.4 TLPs的染色体定位及基因复制现象 |
| 2.3.5 TLP家族成员的组织特异性 |
| 2.3.6 病菌侵染下的表达特性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 CmTLP17 在烟草中的异源表达及抗病功能研究 |
| 3.1 实验材料及仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 枯萎病菌的培养 |
| 3.2.2 CmTLP17 的克隆及表达载体的构建 |
| 3.2.3 农杆菌工程菌株的创制 |
| 3.2.4 农杆菌介导的遗传转化 |
| 3.2.5 转基因烟草植株的检测 |
| 3.2.6 转基因烟草的抗病性鉴定 |
| 3.2.7 组织化学染色 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 CmTLP17 克隆及表达载体的获得 |
| 3.3.2 农杆菌工程菌株的获得 |
| 3.3.3 过表达CmTLP17 烟草植株的获得 |
| 3.3.4 转基因烟草植株的鉴定 |
| 3.3.5 CmTLP17 对烟草抗病性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 CmTLP17 的原核表达及体外抑菌效果研究 |
| 4.1 实验材料及仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 枯萎病菌的培养 |
| 4.2.2 CmTLP17 蛋白编码序列的克隆 |
| 4.2.3 CmTLP17 克隆及表达载体的构建 |
| 4.2.4 原核表达工程菌株的创制 |
| 4.2.5 融合蛋白的诱导表达及变、复性 |
| 4.2.6 表达蛋白的体外抗菌活性检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 CmTLP17 原核表达载体的获得 |
| 4.3.2 融合蛋白最佳诱导表达条件的确定 |
| 4.3.3 可溶性蛋白的获得 |
| 4.3.4 表达蛋白的体外抗菌活性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 实时定量PCR引物 |
| 附录 B 甜瓜TLP家族成员的详细信息 |
| 附录 C 本论文所用培养基及试剂配方 |
| 附录 D CmTLP17 序列全长及测序结果 |
| 附录 E SDS-PAGE电泳流程 |
| 附录 F 本论文所用质粒图谱 |
| 攻读硕士学位期间科研成果情况 |
| 致谢 |
（2）杀黑星菌素的生物合成研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 病虫害对人类生活和生存的影响 |
| 1.1.2 大环内酯类药物研究进展 |
| 1.2 大环内酯类抗生素生物合成研究进展 |
| 1.2.1 大环内酯类抗生素的生物合成和组合生物合成 |
| 1.2.2 生物合成基因簇分析与鉴定方法研究进展 |
| 1.3 杀黑星菌素已有研究进展 |
| 1.4 本文研究意义与思路 |
| 第二章 Streptomyces sp.NO1W98 中杀黑星菌素的分离和结构鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 培养基和培养条件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Streptomyces sp.NO1W98 菌株的发酵 |
| 2.2.2 Streptomyces sp.NO1W98 发酵产物的提取 |
| 2.2.3 结构鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Streptomyces sp.NO1W98 发酵提取物的HPLC检测 |
| 2.3.2 化合物1和2 的分离和结构鉴定 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 Streptomyces sp.NO1W98 基因组文库的构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.1.3 实验所用试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Supercos1 质粒载体的提取(碱裂解法) |
| 3.2.2 Streptomyces sp.NO1W98 基因组DNA的提取 |
| 3.2.3 基因组DNA Sau3 AI部分酶切 |
| 3.2.4 SuperCos1质粒载体的Xba I酶切 |
| 3.2.5 酶切后的基因组DNA及质粒载体去磷酸化 |
| 3.2.6 SuperCos1质粒载体BamHI酶切 |
| 3.2.7 酶切后的基因组DNA和载体的连接反应 |
| 3.2.8 包装蛋白,包装反应 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 Streptomyces sp.NO1W98 中杀黑星菌素生物合成基因簇的鉴定 |
| 4.1 实验设备 |
| 4.2 试剂和菌株 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Streptomyces sp.NO1W98的测序及蕴含基因簇的生物信息学分析 |
| 4.3.2 Streptomyces sp.NO1W98 基因组文库的筛选 |
| 4.3.3 Streptomyces sp.NO1W98 抗生素敏感性实验及基因阻断突变株构建 |
| 4.3.4 接合转移及PCR验证 |
| 4.3.5 vtdA1基因阻断突变株(vtdA1)的回补 |
| 4.3.6 Streptomyces sp.NO1W98 相关突变株的HPLC检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Streptomyces sp.NO1W98 菌株的生物信息学分析和杀黑星菌素生物合成基因簇的初步定位 |
| 4.4.2 Streptomyces sp.NO1W98 中杀黑星菌素基因簇和边界基因的初步鉴定 |
| 4.4.3 杀黑星菌素生物合成途径的推导 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间出版或发表的论着、论文 |
| 致谢 |
（3）细菌基因组多元编辑技术的开发以及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细菌基因组挖掘 |
| 1.1.1 假单胞菌天然产物挖掘的意义 |
| 1.1.2 伯克氏菌天然产物挖掘的意义 |
| 1.1.3 细菌多元基因组编辑技术在天然产物挖掘中的重要性 |
| 1.2 基因组多元编辑技术 |
| 1.2.1 基于Red/ET重组工程的迭代基因组多元编辑技术 |
| 1.2.2 基于CRISPR/Cas的基因组多元编辑技术 |
| 1.3 位点特异性重组系统 |
| 1.4 立题的依据和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 基因组编辑工具促进细菌基因组挖掘 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 寡核苷酸合成和DNA测序 |
| 2.2.3 分子生物学试剂 |
| 2.2.4 主要试验仪器 |
| 2.2.5 数据分析软件 |
| 2.2.6 试验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 利用重组技术实现假单胞菌P.parafulva的基因组挖掘 |
| 2.3.2 利用重组技术实现伯克氏菌P.megapolitana的基因组挖掘 |
| 2.4 总结与讨论 |
| 第三章 dsDNA recombineering介导的细菌基因组多重编辑技术 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 寡核苷酸合成和DNA测序 |
| 3.2.3 合成的基因序列 |
| 3.2.4 试验方法 |
| 3.3.实验结果与分析 |
| 3.3.1 在三种细菌中dsDNA介导的基因组多重编辑 |
| 3.3.2 确认dsDNA recombineering介导双区域替换的决定因素 |
| 3.3.3 dReaMGE技术的建立 |
| 3.3.4 dReaMGE技术在多种细菌中的应用 |
| 3.3.5 dReaMGE在基因组挖掘中应用 |
| 3.4 总结与讨论 |
| 第四章 位点特异性重组系统Vika/vox的优化与应用 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 寡核苷酸合成和DNA测序 |
| 4.2.3 试验方法 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 低毒性高效位点特异性重组酶系统的筛选 |
| 4.3.2 vox位点结构的确定 |
| 4.3.3 严谨高效突变vox位点的构建 |
| 4.3.4 突变vox位点的功能和严谨性测定 |
| 4.3.5 Vika/voxM介导生物合成基因簇异源整合实现epothilone在伯克氏菌DSM7029 的高效表达 |
| 4.4 总结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 基因组编辑工具促进细菌基因组挖掘 |
| 5.2 dsDNA recombineering介导的细菌基因组多重编辑技术 |
| 5.3 位点特异性重组系统Vika/vox的优化与应用 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表文章和申请专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）天麻抗真菌蛋白研究进展（论文提纲范文）
| 1 天麻抗真菌蛋白基因的克隆 |
| 2 天麻抗真菌蛋白的特点 |
| 3 天麻抗真菌蛋白的抑菌活性 |
| 4 天麻抗真菌蛋白的作用机制 |
| 4.1 天麻抗真菌蛋白的作用位点 |
| 4.2 天麻抗真菌蛋白的合成部位 |
| 5 天麻抗真菌蛋白表达载体构建 |
| 6 天麻抗真菌蛋白的应用 |
| 6.1 天麻抗真菌蛋白基因转化辣椒的研究 |
| 6.2 天麻抗真菌蛋白基因转化棉花的研究 |
| 6.3 天麻抗真菌蛋白基因转化烟草的研究 |
| 6.4 天麻抗真菌蛋白基因转化大豆的研究 |
| 6.5 天麻抗真菌蛋白基因转化油菜的研究 |
| 6.6 天麻抗真菌蛋白基因转化小麦的研究 |
| 6.7 天麻抗真菌蛋白基因转化李树的研究 |
| 6.8 天麻抗真菌蛋白基因转化水稻的研究 |
| 6.9 天麻抗真菌蛋白基因转化其它作物的研究 |
| 7 展望 |
| 7.1 天麻抗真菌蛋白的作用机制探讨 |
| 7.2 天麻抗真菌蛋白的协同作用探讨 |
（5）解淀粉芽胞杆菌抗真菌活性研究进展（论文提纲范文）
| 1 解淀粉芽胞杆菌抗真菌作用研究 |
| 1.1 解淀粉芽胞杆菌的生境多样性 |
| 1.2 解淀粉芽胞杆菌分离鉴定及其产生的抗菌活性物质的研究 |
| 1.3 解淀粉芽胞杆菌抗植物病原真菌的多样性 |
| 2 提高解淀粉芽胞杆菌抗真菌能力的策略 |
| 2.1 优化发酵条件提高解淀粉芽胞杆菌抗菌能力 |
| 2.2 采用不同发酵方式提高解淀粉芽胞杆菌抗真菌能力 |
| 2.3 利用有效组合模式提高解淀粉芽胞杆菌抗真菌能力 |
| 2.4 利用基因重排和基因工程手段提高解淀粉芽胞杆菌抗真菌能力 |
| 3 解淀粉芽胞杆菌抗菌活性物质合成调节机制的研究 |
| 3.1 利用前体物研究解淀粉芽胞杆菌活性物质合成的调节 |
| 3.2 利用基因组和转录组学手段研究解淀粉芽胞杆菌活性物质合成的调节 |
| 3.3 利用基因组和转录组学手段研究解淀粉芽胞杆菌活性物质合成的调节 |
| 4 解淀粉芽胞杆菌抗菌机理的研究 |
| 4.1 解淀粉芽胞杆菌活性物质对真菌的直接抑制作用 |
| 4.2 解淀粉芽胞杆菌诱导植物产生的系统抗性 |
| 5 结 语 |
（6）大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶基因VdILV2和VdILV6的克隆及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 棉花黄萎病及其危害 |
| 1.1.1 棉花黄萎病与黄萎病菌概述 |
| 1.1.2 棉花黄萎病的危害 |
| 1.2 大丽轮枝菌侵染过程及致病机理 |
| 1.2.1 大丽轮枝菌侵染循环过程 |
| 1.2.2 大丽轮枝菌致病机理 |
| 1.3 大丽轮枝菌致病相关基因研究进展 |
| 1.3.1 V.dahliae效应因子及细胞壁降解酶相关基因 |
| 1.3.2 V.dahliae生长-致病相关基因 |
| 1.4 乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase,ALS)研究进展概述 |
| 1.4.1 异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸合成途径 |
| 1.4.2 ALS概述 |
| 1.4.3 ALS抑制剂的使用 |
| 1.4.4 ALS在病原真菌中的研究进展 |
| 1.5 寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing)概述 |
| 1.5.1 HIGS沉默机制 |
| 1.5.2 跨界RNA转移机制 |
| 1.5.3 HIGS的应用概述 |
| 1.6 本研究目的和意义 |
| 第二章 乙酰乳酸合成酶基因的克隆及毒力功能分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 棉花品种 |
| 2.1.2 大丽轮枝菌菌株 |
| 2.1.3 实验菌株和质粒载体 |
| 2.1.4 实验用培养基及仪器试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 Vd ILV2与VdILV6 的基因克隆与引物设计 |
| 2.2.2 进化树构建 |
| 2.2.3 大丽轮枝菌RNA的提取和反转录 |
| 2.2.4 引物设计 |
| 2.2.5 HIGS体系载体的构建 |
| 2.2.6 农杆菌注射棉株幼苗 |
| 2.2.7 大丽轮枝菌的侵染 |
| 2.2.8 HIGS处理棉株的病害调查 |
| 2.2.9 RNA提取和逆转录PCR(RT-PCR) |
| 2.2.10 荧光定量PCR(qPCR)分析靶基因的表达量 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 乙酰乳酸合成酶蛋白序列及系统发育树分析 |
| 2.3.2 TRV2 重组质粒的构建 |
| 2.3.3 HIGS处理棉株的抗病分析 |
| 2.3.4 RT-PCR分析 |
| 2.3.5 侵染棉株的V.dahliae乙酰乳酸合成酶基因的表达分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 大丽轮枝菌VdILV2 基因敲除突变体的筛选 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 大丽轮枝菌菌株 |
| 3.1.2 实验菌株和质粒载体 |
| 3.1.3 实验用培养基及试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 大丽轮枝菌材料的收集及基因组DNA的提取 |
| 3.2.2 敲除载体的构建 |
| 3.2.3 重组质粒转化农杆菌及验证 |
| 3.2.4 阳性转化子的筛选 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 敲除载体的构建 |
| 3.3.2 敲除质粒转化农杆菌 |
| 3.3.3 VdILV2 基因敲除突变体的筛选 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 4.1 全文结论及创新点 |
| 4.2 今后工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文和研究成果 |
| 资助项目 |
（7）转CrSMT基因棉花的鉴定与表型分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 棉花基因工程研究进展 |
| 1.1.1 转基因棉花发展概况 |
| 1.1.2 棉花抗逆基因工程研究进展 |
| 1.1.2.1 棉花抗虫基因工程研究进展 |
| 1.1.2.2 棉花抗病基因工程研究进展 |
| 1.1.2.3 棉花耐盐碱基因工程研究进展 |
| 1.1.2.4 棉花耐高低温基因工程研究进展 |
| 1.1.2.5 棉花耐旱涝基因工程研究进展 |
| 1.1.3 棉花高产基因工程研究进展 |
| 1.1.4 棉花优质基因工程研究进展 |
| 1.1.5 基因工程在改良棉花其他特性上的应用 |
| 1.2 植物甾醇的作用研究进展 |
| 1.2.1 植物甾醇参与生物胁迫研究进展 |
| 1.2.2 植物甾醇参与非生物胁迫研究进展 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 供试材料 |
| 2.1.1 棉花与供试昆虫 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.1.3 试剂和耗材 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 常用培养基和溶液配制 |
| 2.2.1 常用培养基配制 |
| 2.2.2 常用溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 棉花遗传转化 |
| 2.3.2 阳性植株鉴定 |
| 2.3.3 qPCR测定表达量 |
| 2.3.4 GC-MS测定甾醇含量 |
| 2.3.5 农艺性状调查 |
| 2.3.6 昆虫饲喂条件 |
| 2.3.7 盐胁迫及相关指标测定 |
| 2.3.8 数据分析与绘图 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 转基因棉花的获得与鉴定 |
| 3.1.1 农杆菌介导的遗传转化 |
| 3.1.2 基因表达分析 |
| 3.1.3 棉花甾醇含量分析 |
| 3.2 转基因棉花的抗虫性鉴定 |
| 3.2.1 非选择性拒食实验 |
| 3.2.2 选择性取食偏好实验 |
| 3.2.3 转基因棉花对斜纹夜蛾生长发育的影响 |
| 3.2.4 转基因棉花的绿盲蝽抗性 |
| 3.2.5 转基因棉花的棉铃虫抗性 |
| 3.3 转基因棉花的耐盐性鉴定 |
| 3.3.1 盐胁迫下的表型分析 |
| 3.3.2 盐胁迫下的生理指标分析 |
| 3.4 植株表型分析 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 4.1 环境问题与抗虫策略 |
| 4.2 改变甾醇组成的抗虫策略应用前景 |
| 4.3 耐盐性的评判指标 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）基于转录组与真菌病毒侵染解析皮落青霉咪鲜胺抗机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章: 文献综述 |
| 1.1 柑橘病原真菌与皮落青霉 |
| 1.1.1 柑橘真菌病害 |
| 1.1.2 青霉属植物病原真菌 |
| 1.1.3 皮落青霉 |
| 1.2 抗真菌药物分类与真菌抗药性 |
| 1.2.1 抗真菌药物 |
| 1.2.2 真菌抗药性 |
| 1.3 真菌药物DMIs抗性机制 |
| 1.3.1 唑类药物靶标突变或过量表达 |
| 1.3.2 药泵蛋白参与真菌抗药机制 |
| 1.3.3 转录因子与代谢调控 |
| 1.3.4 甾醇生物合成与真菌抗药 |
| 1.3.5 脂代谢调控细胞膜应激反应与真菌抗药 |
| 1.3.6 碳-氮基础代谢与营养调控 |
| 1.3.7 真菌抗性机制的组学研究 |
| 1.4 真菌病毒及其生物学效应 |
| 1.4.1 真菌病毒的分类与一般特征 |
| 1.4.2 真菌病毒弱毒效应及其机制研究 |
| 1.5 真菌病毒感染对宿主真菌的抗逆影响 |
| 1.5.1 真菌病毒感染对宿主真菌的非药物抗逆影响 |
| 1.5.2 真菌病毒感染对宿主真菌的药物条件弱毒 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 转录组解析柑橘病原真菌皮落青霉的咪鲜胺抗性机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 真菌材料培养与药物处理 |
| 2.2.2 咪鲜胺EC50检测 |
| 2.2.3 转录组样品处理与RNA制备 |
| 2.2.4 转录组cDNA文库构建与测序 |
| 2.2.5 转录组序列组装与基因(Unigene)功能注释 |
| 2.2.6 基因表达量(转录量)计算与差异表达基因(DEG)鉴定 |
| 2.2.7 DEG功能富集与分类 |
| 2.2.8 荧光定量PCR检测基因转录量 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 皮落青霉菌CQ1和CQ15咪鲜胺抗性分析 |
| 2.3.2 转录组样品RNA质量评估 |
| 2.3.3 转录组测序质量评价 |
| 2.3.4 单基因(Unigene)组装与质量分析 |
| 2.3.5 差异表达基因(DEG)分析 |
| 2.3.6 DEG的COG和KOG富集与功能分类 |
| 2.3.7 DEG的GO富集分析 |
| 2.3.8 DEG的KEGG富集分析 |
| 2.3.9 实时荧光定量PCR验证皮落青霉菌咪鲜胺抗性基因 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 皮落青霉dsRNA病毒分离鉴定与咪鲜胺抗性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 真菌材料与培养 |
| 3.2.2 基因工程菌株与质粒 |
| 3.2.3 培养基及相关试剂 |
| 3.2.4 真菌基因组DNA提取 |
| 3.2.5 病毒dsRNA提取与鉴定 |
| 3.2.6 病毒基因组dsRNA基因组高通量测序与拼接 |
| 3.2.7 病毒基因组dsRNA克隆测序与末端序列扩增 |
| 3.2.8 病毒基因组序列生物信息学分析 |
| 3.2.9 真菌病毒粒子提取与透射电镜观察 |
| 3.2.10 病毒粒子结构蛋白的检测 |
| 3.2.11 病毒dsRNA分子杂交(Northe blot) |
| 3.2.12 皮落青霉脱毒株与染毒株的制备 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 皮落青霉菌CQ15病毒核酸的电泳分析 |
| 3.3.2 皮落青霉菌CQ15病毒dsRNA高通量测序与分析 |
| 3.3.3 PcCV1系统进化分析 |
| 3.3.4 PcCV1病毒粒子鉴定 |
| 3.3.5 PcCV1生物学效应分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 转录组解析PcCV1调控皮落青霉咪鲜胺抗性机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 真菌材料培养与药物处理 |
| 4.2.2 咪鲜胺EC_(50)检测 |
| 4.2.3 转录组样品处理与RNA制备 |
| 4.2.4 转录组cDNA文库构建与测序 |
| 4.2.5 转录组序列组装与基因(Unigene)功能注释 |
| 4.2.6 基因表达量(转录量)计算与差异表达基因(DEG)鉴定 |
| 4.2.7 DEG功能富集分类与代谢通路分析 |
| 4.2.8 荧光定量PCR检测基因转录量 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 皮落青霉染毒株CQ1V咪鲜胺抗性分析 |
| 4.3.2 转录组样品RNA质量评估 |
| 4.3.3 转录组测序质量与unigene组装 |
| 4.3.4 差异表达基因(DEG)分析 |
| 4.3.5 DEG的COG、KOG和GO富集与功能分类 |
| 4.3.6 DEG的KEGG富集分类与代谢通路分析 |
| 4.3.7 实时荧光定量PCR验证PcCV1抗性调控相关基因 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 缩写中英文对照表 |
| 攻读博士期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（9）广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 广藿香和广藿香油 |
| 1.2 广藿香萜类生物合成的研究概况 |
| 1.3 植物萜类次生代谢的转录调控研究概况 |
| 1.4 转录因子调控药用植物萜类代谢物合成的研究进展 |
| 2 立题依据及研究思路 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.2 研究思路 |
| 2.3 技术路线 |
| 第二章 广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析 |
| 1 基于PacBio三代测序的转录本识别和分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 小结与讨论 |
| 2 酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 广藿香醇合酶(PatPTS)启动子克隆及其转录调控因子的初步筛选和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2. 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广藿香醇合酶(PatPTS)及其启动子的克隆分析 |
| 2.2 结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定 |
| 3 小结与讨论 |
| 第四章 调控广藿香醇生物合成的转录因子的表达及功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2. 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广藿香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究 |
| 2.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广藿香醇合成调控机制研究 |
| 2.3 MYB related转录因子PatSWC4调控广藿香醇合成机制研究 |
| 2.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广藿香醇合成机制研究 |
| 2.5 两个参与调控广藿香醇合成的锌指蛋白 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 1 结论 |
| 2 综合讨论 |
| 2.1 两个DREB功能和调控机制差异 |
| 2.2 广藿香MYC2转录因子的结构与功能 |
| 2.3 转录复合体在广藿香醇生物合成的复杂调控机制 |
| 2.4 茉莉酸信号介导的广藿香醇合成转录调控机制探讨 |
| 2.5 参与调控广藿香醇合成转录因子在植物代谢工程的利用 |
| 3 创新点 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 miRNA前体预测结果 |
| 附录2 萜类合成通路相关转录本汇总表 |
| 附录3 本研究所用引物列表 |
| 附录4 全长转录组中PatPTS全长转录本 |
| 附录5 MYC转录因子同源比对 |
| 附录6 GIS2的同源蛋白 |
| 附录7 图表目录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 参与课题 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 详情摘要 |
（10）LfcinB等抗菌肽原核和真核表达体系构建的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 抗菌肽 |
| 1.2 抗菌肽的分类 |
| 1.2.1 昆虫抗菌肽 |
| 1.2.2 鱼类抗菌肽 |
| 1.2.3 两栖类抗菌肽 |
| 1.2.4 哺乳类抗菌肽 |
| 1.2.5 植物抗菌肽 |
| 1.3 抗菌肽的抑菌机理 |
| 1.3.1 膜损伤机制 |
| 1.3.1.1 桶-板模型 |
| 1.3.1.2 环孔模型 |
| 1.3.1.3 地毯模型 |
| 1.3.2 损伤胞内物质机制 |
| 1.4 抗菌肽的生物活性 |
| 1.4.1 抗细菌活性 |
| 1.4.2 抗真菌活性 |
| 1.4.3 抗病毒活性 |
| 1.4.4 抗寄生虫活性 |
| 1.4.5 免疫调节活性 |
| 1.5 抗菌肽的应用前景 |
| 1.5.1 在养殖业中的应用 |
| 1.5.2 在食品贮存中的应用 |
| 1.5.3 在医药方面的应用 |
| 1.6 抗菌肽的生产制备 |
| 1.6.1 生化提取法 |
| 1.6.2 化学合成法 |
| 1.6.3 基因工程法 |
| 1.6.3.1 原核表达体系 |
| 1.6.3.2 真核表达体系 |
| 1.7 研究内容和意义 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 研究意义 |
| 第二章 牛乳铁蛋白肽LfcinB与红色荧光蛋白DsRed2在酿酒酵母中的融合表达 |
| 2.1 引论 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器设备 |
| 2.2.2 质粒与菌株 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液配制 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 引物的设计与合成 |
| 2.3.2 目的基因的PCR扩增 |
| 2.3.3 目的基因的平末端连接 |
| 2.3.4 融合蛋白基因的PCR扩增 |
| 2.3.5 载体质粒的构建 |
| 2.3.5.1 目的基因片段和p YES2-α质粒的双酶切 |
| 2.3.5.2 目的基因片段和p YES2-α质粒的连接 |
| 2.3.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.3.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞重组质粒的转化 |
| 2.3.8 筛选阳性克隆 |
| 2.3.9 酿酒酵母W303、INVSc1 感受态细胞的制备 |
| 2.3.10 重组质粒p YES2-TPI-LfcinB转化酿酒酵母 |
| 2.3.11 工程菌的诱导表达 |
| 2.3.12 表达产物的抑菌活性检测 |
| 2.3.13 表达产物的热敏感与碱敏感性检测 |
| 2.3.14 荧光检测 |
| 2.3.15 表达产物的纯化 |
| 2.3.16 SDS-PAGE凝胶电泳检测表达产物 |
| 2.3.17 表达产物沉淀重溶、透析后抑菌活性检测 |
| 2.3.17.1 丙酮沉淀 |
| 2.3.17.2 硫酸铵沉淀 |
| 2.3.17.3 超滤与透析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 目的片段的扩增与重组质粒的构建 |
| 2.4.2 表达产物的抑菌活性 |
| 2.4.3 表达产物的热敏感性与碱敏感性 |
| 2.4.4 重组酵母菌荧光检测 |
| 2.4.5 重组酵母菌的生长曲线 |
| 2.4.6 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 2.4.7 表达产物沉淀重溶、超滤、透析过后的抑菌活性 |
| 2.5 总结与讨论 |
| 第三章 天然前导肽与Cherry对抗菌肽活性抑制效果的对比及提高原核表达产量的策略 |
| 3.1 引论 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 主要仪器设备 |
| 3.2.2 菌株与质粒 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 常用试剂配制方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 引物的设计与合成 |
| 3.3.2 目的基因的PCR扩增 |
| 3.3.3 目的基因与质粒p ET22b(+)的酶切 |
| 3.3.4 目的基因与质粒p ET22b(+)的连接 |
| 3.3.5 连接产物转化大肠杆菌BL21 感受态细胞 |
| 3.3.6 筛选阳性克隆 |
| 3.3.7 工程菌的诱导表达 |
| 3.3.8 表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 目的片段的扩增与重组质粒的构建 |
| 3.4.2 重组大肠杆菌的生长曲线 |
| 3.4.3 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 第四章 小结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
四、抗真菌植物基因工程的策略和进展（论文参考文献）
- [1]甜瓜TLP家族的鉴定及CmTLP17在烟草抗枯萎病中的应用初探[D]. 刘亚荣. 大连理工大学, 2021(01)
- [2]杀黑星菌素的生物合成研究[D]. 张园. 淮北师范大学, 2021(12)
- [3]细菌基因组多元编辑技术的开发以及应用[D]. 郑文韬. 山东大学, 2021(10)
- [4]天麻抗真菌蛋白研究进展[J]. 王彩云,侯俊,周茂嫦,徐庆祝,张翔宇,阮培均. 北方园艺, 2021(08)
- [5]解淀粉芽胞杆菌抗真菌活性研究进展[J]. 王世伟,王卿惠,翟丽萍,刘军,向文胜. 中国微生态学杂志, 2020(08)
- [6]大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶基因VdILV2和VdILV6的克隆及功能研究[D]. 韦春艳. 河南科技学院, 2020
- [7]转CrSMT基因棉花的鉴定与表型分析[D]. 刘云涛. 江西农业大学, 2020(07)
- [8]基于转录组与真菌病毒侵染解析皮落青霉咪鲜胺抗机制[D]. 王胜强. 华中师范大学, 2020(01)
- [9]广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究[D]. 陈秀珍. 广州中医药大学, 2020(06)
- [10]LfcinB等抗菌肽原核和真核表达体系构建的初步研究[D]. 张旭冉. 安徽大学, 2020(07)