一、二氮嗪预处理对未成熟兔心脏的保护作用（论文文献综述）
龙宗泓[1]（2019）在《LOC339524和UQCRC1介导心/脑保护的作用和机制研究》文中研究指明目的:基础疾病、手术创伤和术中体位改变等会对患者生理功能造成不同程度的影响,病人围术期极易发生心脑脆弱器官的缺血/再灌注损伤,并且术中呼吸和循环系统的稳定直接影响病人术后恢复,因此如何保证患者围术期安全,预防围术期不良事件的发生是麻醉医生面临的重大挑战。LOC339524是课题组于2012年在研究人心脏早期停跳灌流液的蛋白质组学时通过高效液相色谱-芯片/质谱（High performance liquid chromatography-chip/mass spectrometry,HPLC-Chip/MS）技术分离、鉴定的新蛋白,随后制备了单克隆抗体5-D3。前期研究发现LOC339524可能参与了胚胎期大鼠心脏的发育,并且能调控H9C2心肌细胞的分裂增殖。除此之外,课题组前期研究还证实LOC339524参与大脑炎症的调控,其高表达可以明显减轻脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）导致的小胶质细胞炎症反应。这些均提示LOC339524具有重要的功能,可能参与器官保护。但LOC339524在心肌缺血/再灌注损伤中的作用和机制尚不清楚,并且其减轻BV-2小胶质细胞炎症反应的可能信号通路也尚未明确。因此本研究旨在通过建立LOC33524过表达的AC16和BV-2稳转细胞株,并给予相应损伤的情况下,探究LOC33524过表达在心肌氧糖剥夺/复氧损伤中的保护作用和机制,及其减轻炎症反应的可能通路,为开发特异性的心脑保护药物提供新的靶点。此外,细胞色素c还原酶核心蛋白1（Ubiquinol-cytochrome-c reductase complex core protein 1,UQCRC1）也是课题组筛选到的可能具有心肌保护作用的蛋白。前期研究提示,UQCRC1表达变化会直接影响线粒体功能,表现为线粒体功能障碍常常伴有UQCRC1下调,而过表达UQCRC1会明显增加复合体Ⅲ呼吸率,表明UQCRC1对线粒体功能的维持十分重要。多项研究表明线粒体是包括预处理在内的多种心肌保护方式的共同作用靶点,但参与预处理介导心肌内源性保护效应的线粒体蛋白尚不明确。本研究旨在通过长期注射二氮嗪（Diazoxide,DZ）构建大鼠的心肌保护模型,分离心肌线粒体内膜（Mitochondrial inner membrane,MIM）蛋白后,筛选出MIM中可能产生保护作用的靶蛋白,并从细胞水平加以证实。为进一步寻找预处理时心肌细胞主动产生内源性保护分子的机制、开发围术期心肌保护药物提供理论依据。第一部分LOC339524对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制研究第一部分方法:1.探讨LOC339524表达蛋白的可能性。1.1探讨LOC339524外源性表达蛋白。将构建C端融合有FLAG标签的LOC339524表达质粒,以lipofectamine TM 3000为载体,转染至293T细胞,48h后提取蛋白,FLAG抗体检测蛋白的表达情况。1.2探讨LOC339524内源性表达蛋白。在荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）再次证实大鼠可以表达LOC339524的前提下,提取了成年SD大鼠心,脑,脾,肾等主要组织蛋白,Western Blot分析了LOC339524蛋白在上述组织器官的内源性表达。2.探讨缺氧对LOC339524表达的影响。2.1在细胞水平明确缺氧对LOC339524表达量及位置的影响。人心肌AC16细胞置于缺氧（1%O2）环境24h或者用200μmol/L Co Cl2作用10h,提取RNA和蛋白,RT-q PCR和Western Blot分别检测了缺氧对LOC339524基因和蛋白表达的影响。同时分别提取常氧和缺氧环境中AC16细胞胞浆蛋白和胞核蛋白,Western Blot分析了LOC339524蛋白在缺氧条件下的表达位置变化。2.1在动物水平明确缺氧对大鼠心肌和血清外泌体LOC339524表达的影响。将成年SD大鼠置于模拟海拔5000m高原环境的人工实验舱072h,处死大鼠,收集血清外泌体及心肌组织。RT-q PCR检测心肌LOC339524 m RNA的表达;Western Blot评估心肌和血清外泌体LOC339524蛋白的表达。3.探讨无义介导的m RNA降解（Nonsense-Mediated m RNA Decay,NMD）途径对LOC339524调控的可能性。3.1激活或抑制NMD途径后,探讨LOC339524基因和蛋白水平的变化。构建NMD途径中关键因子上游移码蛋白1（up-frameshift protein 1,UPF1/RENT1）的高表达慢病毒（LV-TOPO-UPF1/RENT1）,将其转染至AC16、H9C2、HMO6和LO2四种细胞中,构建上述细胞的UPF1/RENT1高表达稳转细胞株;或者采用si RNA沉默上述四种细胞中UPF1/RENT1的表达后,RT-PCR和Western Blot分别检测了LOC339524基因和蛋白水平的表达变化。3.2探讨LOC339524逃逸NMD调控的可能机制。构建LOC339524高表达慢病毒（LV-TOPO-LOC339524）,将其转染至AC16细胞中,建立AC16高表达LOC339524的稳转细胞株。提取蛋白,Western Blot分析了磷酸化真核生物翻译起始因子2α（Phospho-eukaryotic translation initiation factor 2α,p-e IF2α）的表达变化。4.采取下述方法探讨LOC339524介导心肌氧糖剥夺/复氧（Oxygen and glucose deprivation/Reoxygenation,OGD/R）的保护作用及其可能机制。4.1筛选OGD/R最佳时间点。将AC16和AC16-LOC339524+/+细胞分别氧糖剥夺0/3/6/9/12/24/48/72h,复氧12h,收集细胞并对其进行Annexin V-FITC/PI或JC-1染色,采用流式细胞术评估氧糖剥夺不同时间/复氧12h的细胞凋亡变化,后续研究采用上述两种方法均检测到凋亡变化最显着的OGD/R时间点。对于筛选到的时间点,再通过Western blot检测细胞凋亡相关蛋白——活化的caspase3、聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP1）和bcl-2的表达来加以验证。4.2转录组测序（RNA-seq）分析了LOC339524过表达后的差异基因以及差异信号通路（着重分析了PI3K通路和MAPK通路）,并初步探讨了差异基因间的相互作用网络,为后续信号通路的筛选提供参考。RNA-seq结果的可靠性由RT-q PCR和Western Blot加以鉴定。4.3探讨LOC339524对PDGFR/PI3K/Akt通路蛋白的影响。在RNA-seq的提示下,对细胞进行OGD/R损伤,提取蛋白,Western Blot分析PDGFR/PI3K/Akt通路中PDGFRα（Tyr754）,PDGFRβ（Tyr751）、PIK3C2B（Y228）、Akt（Thr308）,Akt（Ser473）和GSK3β（Ser9）总蛋白及其磷酸化水平的变化,初步探究高表达LOC339524对PDGFR/PI3K/Akt通路蛋白的影响。4.4使用PDGFR和PI3K抑制剂,反向证实LOC339524产生心肌保护作用的可能机制。在细胞进行OGD/R损伤前,使用PDGFR抑制剂Crenolanib（1umol/L）和PI3K特异性抑制剂LY294002（10umol/L）或Wortmannin（100nmol/L）抑制相应蛋白的激活,采用流式细胞术评估使用上述抑制剂对细胞凋亡的影响;Western Blot检测PDGFRα（Tyr754）,PDGFRβ（Tyr751）、PIK3C2B（Y228）、Akt（Thr308）,Akt（Ser473）和GSK3β（Ser9）磷酸化水平的变化,以及cleaved caspase3、PARP1-83kd和bcl-2的改变,明确LOC339524产生心肌保护作用的可能机制。第一部分结果:1.LOC339524基因可以编码蛋白。正常情况下,采用抗体5-D3在大鼠的主要组织中均能检测到LOC339524蛋白的内源性表达,并以肝脏、心肌和子宫中表达最多。此外,FLAG抗体在29k Da处检测到蛋白条带,说明LOC339524基因可以外源性的编码蛋白。2.缺氧能诱导LOC339524表达并出现胞核到胞浆的转移。在体外,无论是物理性缺氧（1%O2）还是通过Co Cl2模拟的化学性缺氧均可诱导AC16细胞高表达LOC339524,并且可从胞核转移至胞浆;在体内,大鼠心肌组织中LOC339524的表达随着缺氧时间延长而增加,当缺氧达到72h,血清外泌体中LOC339524表达显着上升。3.LOC33924可能通过调控p-e IF2α表达逃逸NMD调控。无论是通过慢病毒高表达UPF1/RENT1或采用si RNA沉默UPF1/RENT1,LOC33924基因和蛋白水平均不符合NMD调控理论上的下降或增高;而高表达LOC339524后,p-e IF2α表达显着高于对照组。4.当氧糖剥夺24h/复氧12h时,LOC339524通过调控PDGFR/PI3K/Akt通路,明显减轻AC16细胞遭受的OGD/R损伤。4.1氧糖剥夺24h/复氧12h是LOC339524保护AC16心肌细胞的最佳作用时间点。在氧糖剥夺09h/复氧12h时,Annexin V-FITC/PI和JC-1检测到的细胞凋亡率均随着氧糖剥夺时间的延长而略微增加,此时LOC339524过表达组的凋亡率略少于对照组（无统计学意义）;当氧糖剥夺1224h/复氧12h时,细胞凋亡率明显增加,此时LOC339524过表达组凋亡率较对照组大大降低（具有统计学意义）,且在氧糖剥夺24h/复氧12h组最为明显;当氧糖剥夺达4872h/复氧12h时,尽管LOC339524过表达组仍表现出明显的保护作用,考虑到此时细胞整体的凋亡率极高,故最终将氧糖剥夺24h/复氧12h作为后续血细胞损伤的时间点。在此时间点上,Western Blot的检测LOC339524高表达组活化的caspase3及其下游蛋白PARP1-83kd的表达显着少于对照组,保护性蛋白bcl-2明显增加。4.2 LOC339524可能通过PDGFR/PI3K/Akt通路保护心肌细胞。4.2.1 RNA-seq结果提示,LOC339524过表达后PI3K通路的16个基因以及MAPK通路的15个基因明显高表达。4.2.2 Western Blot证实LOC339524过表达会明显增加PI3K通路中PDGFRα（Tyr754）,PDGFRβ（Tyr751）、PIK3C2B（Y228）、Akt（Thr308）,Akt（Ser473）和GSK3β（Ser9）磷酸化水平,进而使OGD/R损伤后Annexin V-FITC/PI染色阳性的细胞比例以及线粒体膜电位JC-1下降的细胞比例均显着少与对照组。4.2.3在OGD/R前,使用Crenolanib预处理1h,抑制PDGFRα和PDGFRβ激活,尽管此时整体凋亡增加,但相较于Control+Crenolanib组,p-PDGFRα（Tyr754）仍然明显增加,活化的Caspase3和PARP1-83kd的表达显着降低,bcl-2蛋白明显增高,线粒体膜电位下降的细胞比例也较对照组明显减少,即LOC339524过表达组仍然具有减轻凋亡的作用。4.2.4在OGD/R前,使用LY294002或Wortmannin抑制Akt激活,尽管p-Akt（Thr308）、p-Akt（Ser473）和p-GSK3β（Ser9）表达均显着下降,但LOC339524过表达组仍明显高于对照组,活化的caspase3和PARP1-83kd的表达少于对照组,bcl-2表达高与对照组,Annexin V-FITC/PI染色阳性细胞比例也显着低于对照组。第二部分LOC339524抑制脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应的机制研究第二部分方法:5.以生物信息学分析和转录组学为基础,在细胞水平探讨LOC339524减轻BV-2小胶质细胞炎症的机制。5.1明确LOC339524对LPS诱导炎症介质的影响。在BV-2细胞高表达LOC339524或通过si RNA沉默LOC339524后,100ng/m L LPS作用12h,免疫荧光检测炎症介质环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,i NOS）的变化。5.2探讨NF-κB与LOC339524启动子结合情况,以及对LOC339524表达的影响。构建LOC339524启动子1509-1520、2000-2009、2758-2769和2971-2981区域的野生型及其相应突变型载体,给予25ng/m L肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα）TNF-α刺激24h或者刺激前使用IκBα特异性抑制剂PDTC（0.5μmol/L）预处理1h,通过双荧光素酶实验,检测各组荧光OD值。5.3在细胞水平探讨LOC339524减轻LPS诱导的炎症反应的可能机制。5.3.1明确LOC339524对NF-κB/p65核移位的影响。BV-2细胞改变LOC339524表达后,100ng/m L LPS作用3h,免疫荧光检测核因子-κB/p65（Nuclear factor-κB/p65,NF-κB/p65）的变化;同时分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白,Western Blot分析NF-κB/p65在胞质和胞核的表达。5.3.2明确LOC339524对Src/NF-κB和p38MAPK通路的影响。BV-2细胞改变LOC339524表达后,100ng/m L LPS作用30min,提取蛋白,Western Blot检测了Src和NF-κB通路中的核因子-κB抑制物激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,Ikk）、核因子-κB抑制因子α（NF-kappa-B inhibitorα）以及NF-κB/p65的磷酸化。或在LPS刺激前,使用IκBα特异性抑制剂PDTC（0.5μmol/L）或p38MAPK特异性抑制剂SB203580（20μmol/L）预处理1h,Western Blot分析了IκBα、NF-κB/p65和p38MAPK的磷酸化。第二部分结果5.LOC339524可能通过Src/NF-κB和p38MAPK通路减轻LPS诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应。5.1 LOC339524减少炎症介质的表达。过表达的LOC339524可显着减少LPS诱导的BV-2细胞COX-2和i NOS表达以及NF-κB/p65的核移位,LOC339524沉默则结果相反。5.2 NF-κB与LOC339524启动子1509-1520区域结合并激活该基因的表达。TNF-α刺激后,LOC339524-1520启动子载体荧光OD值明显高于非刺激组和突变组（LOC-MUT-1520组）,而其他启动子区域载体的荧光OD值则没有明显变化。5.3 Src/NF-κB和p38MAPK通路是LOC339524减轻炎症反应的可能机制。5.3.1 LOC339524抑制Src的活性。LOC339524高表达后,LPS刺激引起的Src（Tyr527）（磷酸化后抑制Src）的磷酸化明显增多,而对Src（Tyr 416）（磷酸化后激活Src）位点磷酸化无影响;LOC339524沉默后,则Src（Tyr 527）磷酸化减少,Src（Tyr 416）位点磷酸化仍无变化。5.3.2 LOC339524显着降低LPS诱导的NF-κB和p38MAPK通路的激活。与con+LPS组相比,Ikkα/β、IκBα和NF-κB/p65磷酸化均显着减少;当LOC339524沉默后,则Ikkα/β、IκBα和NF-κB/p65磷酸化明显高于NC+LPS组。而在LPS刺激前,使用PDTC特异性抑制IκB的激活后,可以显着减少LOC339524沉默对IκB和NF-κB/p65的磷酸化;而在LPS刺激前,使用SB203580特异性抑制p38MAPK的激活,则能够明显减少LOC339524沉默对p38MAPK的磷酸化。第三部分UQCRC1在药物预处理大鼠心肌保护中的作用研究第三部分方法6.通过以下方法筛选和初步证实线粒体内膜中可能参与预处理介导心肌保护的靶蛋白。6.1建立大鼠心肌保护模型。首先采用腹腔单次注射50 mg·kg-1异丙肾上腺素素（isoproterenol hydrochloride,ISO）来建立大鼠心肌损伤模型;或在构建大鼠心肌损伤模型前,腹腔连续注射20mg·kg-1·d-1二氮嗪（diazoxide,DZ）不同时间（3d8W）;或在给与DZ的同时联合使用80 mg·kg-1·d-1 5-羟基癸酸（5-hydroxydecanoic acid,5-HD）,具体分组如下:1)第1组为control组。2)第2组为ISO组:仅皮下注射ISO（50 mg·kg-1溶于生理盐水中）。3)第3组为DZ+ISO组:在注射ISO之前,大鼠连续3天每天腹腔注射20mg·kg-1·d-1的DZ。4)第4,5,6,7和8组大鼠在注射ISO之前,分别接受腹腔注射1,2,4,6和8周的DZ（20 mg·kg-1·d-1,每天注射一次）。在给药期间,所有其他组给予等体积的生理盐水。5)第9组中,大鼠在注射ISO之前,5-HD与DZ一起给予8周。6.2在ISO注射后4h,断颈处死大鼠,收集心脏,筛选MIM中的靶蛋白。1)部分组织进行石蜡包埋,TUNEL染色观察上述分组中心肌组织的凋亡情况;2)部分心肌用于提取MIM蛋白,通过二维荧光差异凝胶电泳（two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis,2D-DIGE）结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS）分析了DZ 0w,4w和6w心肌MIM中的差异蛋白;3)Western Blot检测了DZ处理0w,4w和6w后筛选到的UQCRC1表达变化。6.3在细胞水平进一步探讨UQCRC1的心肌保护作用。使用100μmol/L DZ作用H9C2细胞24h,或100μmol/L DZ和100μmol/L 5-HD共同作用H9C2 24h,Western Blot评估上述分组中UQCRC1表达的改变;随后将细胞进行OGD/R损伤,Hoechst33342染色检测细胞的凋亡情况;H9C2细胞进行OGD/R损伤前,采用si RNA沉默UQCRC1表达,Hoechst33342染色进一步评估细胞的凋亡变化。第三部分结果:6.UQCRC1可能是二氮嗪预处理时心肌细胞主动产生内源性保护的靶蛋白。6.1成功建立大鼠心肌保护模型。ISO组中大鼠心肌TUNEL阳性细胞比例明显高于对照组;当DZ作用时间较短（<4w）,此时DZ表现出明显的保护效应:TUNEL阳性细胞比例较ISO组显着减少;当DZ作用时间>4w后,DZ的保护效应不仅消失,反而表现为损伤作用:TUNEL阳性细胞比例明显上升;在使用DZ的同时联合5-HD,可以部分逆转因DZ长时间作用引起的保护丧失。6.2 DZ长时间处理后心肌MIM的差异蛋白中,UQCRC1的表达变化与DZ处理后心肌保护变化一致。当DZ作用时间较短（<4w）时,心肌MIM蛋白中UQCRC1表达显着增加;而当时间>4w时,UQCRC1表达明显减少。6.3 UQCRC1明显减轻H9C2细胞遭受OGD/R损伤。相较于Control组,DZ 24h组可明显增加UQCRC1的表达,而在联合使用5-HD后,DZ 24h组高表达UQCRC1的作用消失;与之对应的是,在OGD/R损伤后,DZ 24h组Hoechst33342染色为强蓝色的细胞比例明显低于Control组,联合使用5-HD则Hoechst33342染色为强蓝色的细胞比例显着增加。通过si RNA明显减少UQCRC1的表达,再对细胞进行OGD/R损伤,si UQCRC1组Hoechst33342染色为强蓝色的细胞比例明显多于NC组。结论:1.首次证实一个被注释为Lnc RNA的LOC339524可以编码蛋白,且该蛋白在主要的组织器官中均有表达,具有重要的功能。2.缺氧可以诱导LOC339524在大鼠心肌和AC16细胞中高表达。而LOC339524可以通过激活AC16细胞PDGFR/PI3K/Akt通路,减轻OGD/R损伤,增加存活率。3.LOC339524减轻LPS诱导培养的BV-2小胶质细胞炎症反应,是通过抑制Src活性,进而抑制下游的两条信号通路。一条是NF-κB通路,另一条是p38MAPK通路,从而减少炎症介质i NOS和COX-2的表达来实现。4.在大鼠心肌线粒体内膜蛋白中筛选到的差异蛋白——UQCRC1可能是预处理时心肌细胞主动产生内源性保护的靶蛋白。
聂佳[2]（2018）在《microRNA在mitoKATP开放抗心肌缺血—再灌注损伤中差异表达的初步研究》文中认为目的:本文拟采用大鼠心脏缺血-再灌注模型,对mitoKATP正常、缺血、mitoKATP开放与阻断四种状态心肌细胞miRNA和基因表达模式进行分析,筛选和鉴定mitoKATP不同状态下的特征miRNA;利用生物信息学等方法分析特征mi RNA介导的调控网络及其关键节点,获得mitoKATP介导的抗MIRI与miRNA调控网络,为临床预防和治疗MIRI的研究提供新的理论依据。方法:标准健康SD大鼠,体重250-300克,予以戊巴比妥钠对大鼠行腹腔注射麻醉,麻醉完成后将大鼠用平板固定,沿着肋骨边缘迅速剪开腹壁暴露膈肌后剪下心脏,建立大鼠离体心脏Langendorff灌注模型,将48只大鼠随机分为4组:N组、I/R组、DZ组、5HD组,每组12只。N组:K-H液持续逆灌120min。I/R组:K-H液逆灌并平衡20min后,心肌缺血30min后,再复灌70min。DZ组:K-H液逆灌并平衡20min后,心肌缺血30min后,停灌末后立刻给予mitoKATP特异性开放剂二氮嗪（Diazoxide,DZ）灌注5min。5HD组:K-H液逆灌平衡20min,心肌缺血25min后,停灌末立刻给予mitoKATP特异性阻滞剂五羟基葵酸（5-Hydroxy decanoic acid,5HD）灌注5min后再继续给予二氮嗪灌注5min。上述分组除N组外,均在平衡20 min后调整冠脉流量使平均灌注压维持在6070 mmHg之间,于平衡末停灌,32℃全心缺血30 min后,继续灌注37℃含氧K-H液70 min,使平均灌注压维持在6070 mmHg之间。检测指标:（1）在平衡末和复灌末分别观察和记录各组心脏心功能指标;（2）在复灌末,用TTC染色检测心肌梗死面积;（3）在复灌注末将左心室心肌组织取下迅速放入液氮中冻存,各组每4个心脏混合为一个样本,即每组3个样本。TRIzol法提取心肌总RNA。将12个样本（4组×3个样本/组）mRNA和miRNA碎片化处理后,构建测序文库。Illumina测序平台测序;（4）选取差异表达的miRNA,用qRT-PCR技术验证测序结果可靠性;（5）通过Gene Ontology、KEGG Pathway等数据库分析差异基因所在的生物调控通路及网络。结果:（1）在再灌末,除HR外,LVDP、LVEDP、CF以及+dp/dtmax等指标在各组间比较均有显着差异。（2）与N组相比,I/R组的心肌梗死面积显着增多（P<0.05）;DZ组心肌梗死面积比I/R组显着降低（P<0.05）;5-HD组心肌梗死面积比DZ组显着增多（P<0.05）。（3）测序结果显示,与N组比较,I/R组上调miRNA有192个,下调的miRNA为77个;与I/R组比较,DZ组上调的miRNA为118个,下调的为48个;与DZ组比较,5-HD组上调的miRNA为37个,下调的为123个。（4）选取在各组间具有显着性差异表达的且表达量高的17个miRNA,利用qRT-PCR进行验证,其中8个mi RNA的qRT-PCR结果同样在各组间具有显着性差异,分别为:rno-miR-328a-3p、rno-miR-676、rno-miR-128-3p、rno-miR-30c-5p、rno-miR-30d-5p、rno-miR-148a-3p、rno-miR-novel-chr559812、rno-mi R-novel-chr1-36162。（5）通过Gene Ontology、KEGGPathway等数据库分析上述8个miRNA及可能调控的mRNA的调控通路及网络。结论:（1）二氮嗪后处理对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,使用5-HD处理后会使心肌缺血再灌注损伤加重,结果显示mitoKATP通道在心肌缺血再灌注损伤中十分重要;（2）通过测序技术及qRT-PCR方法,选出9个候选mi RNA,其中miR-128、miR-328a-3p、miR30d-5p、miR-30c以及miR-676、mi R-361可能参与调控mitoKATP通道对心肌缺血再灌注损伤的作用机制。
文婷[3]（2016）在《异甜菊醇钠对豚鼠心肌细胞sarcKATP和mitoKATP通道的调控作用及机制》文中指出KATP通道是一种ATP敏感型钾离子通道,在心肌细胞中广泛存在。KATP通道无论是在生理条件下还是在病理条件下对代谢调节都起着非常重要的作用。正常条件下,胞内ATP的浓度能够抑制心肌KATP通道开放,KATP通道可以将细胞代谢条件与膜电信号耦联起来;在心肌肥大等病理条件下,KATP通道对其开放剂或是ATP的敏感性降低,会使心肌对代谢压力的适应性降低,对于药物治疗是不利的。异甜菊醇（isosteviol,STV）是由甜菊醇（stevioside）酸水解得到的,异甜菊醇钠（STVNa）是异甜菊醇的钠盐形式。STV已经被证实对心血管疾病具有保护作用,比如具有抗缺血复灌损伤,抗高血压、抗高血糖等。本文主要研究了STVNa对细胞膜KATP通道(sarcKATP通道)和线粒体KATP通道(mitoKATP通道)的影响,研究内容如下:（1）以急性分离的豚鼠心室肌细胞为研究对象,研究了STVNa对sarcKATP通道的影响。结果表明STVNa可以增加心肌细胞sarcKATP通道对Pinacidil的敏感性,不仅增大了通道的电流密度,而且还加大了sarcKATP通道的开放速度,且STVNa对sarcKATP通道的影响是时间、剂量依赖性的。（2）研究了STVNa对心肌细胞膜上L型钙电流（Ica）、快速延迟整流钾离子电流（Ikr）以及动作电位（AP）的影响。结果表明,STVNa对L型钙电流、快速延迟整流钾离子电流和动作电位都没有显着影响。（3）研究了STVNa对mitoKATP通道的影响。用10μM STVNa孵育后,Dizoxide诱导的细胞线粒体黄素荧光蛋白的荧光强度显着增加(Dizoxide诱导的黄素荧光蛋白荧光强度变化可以间接的反应KATP通道活性的变化)。STVNa组Dizoxide诱导的黄素蛋白相对荧光强度是control组的2.5倍左右,P<0.05,而且STVNa本身不会引起黄素荧光蛋白荧光强度的改变。（4）为了验证STVNa对sarcKATP通道和mitoKATP通道的增敏作用是否与活性氧（ROS）有关,我们用ROS清除剂（NAC）和STVNa共孵育细胞。结果表明,100μM NAC与STVNa共孵育抑制了sarcKATP电流的增加,而100μM NAC本身并不影响sarcKATP电流大小;在线粒体中,NAC与STVNa共孵育也使Diazoxide激发的黄素荧光强度变弱。同样地,100μM NAC本身对Dizoxide激发的荧光强度也没有影响。结论:（1）STVNa增加了sarcKATP通道和mitoKATP通道的敏感性,增加了sarcKATP通道的开放速率;（2）STVNa对L型钙电流、Ikr电流以及动作电位都没有影响;（3）STVNa对KATP通道的增敏作用与ROS有关。
李琳[4]（2015）在《川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用》文中认为目的 观察川芎嗪（Ligustrazine）预处理促进骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用,并探讨其可能作用机制。方法①采用全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代,流式细胞仪检测BMSCs阳性抗原（CD29和CD90）及阴性抗原（CD34和CD45）鉴定BMSCs纯度,不同终浓度BrdU（5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L）标记BMSCs24 h、48h和72 h,检测BrdU标记率。②采用线栓法诱导大鼠右侧大脑中动脉阻塞模型,缺血90min,缺血24 h后除假手术组外,随机分为模型组,MCAO+未预处理BMSCs组（BMSCs组）,MCAO+50 μM川芎嗪预处理BMSCs组（50μM川芎嗪组）,MCAO+100μM川芎嗪预处理BMSCs组（100 μM川芎嗪组）,50 μM川芎嗪预处理BMSCs+CXCR4拮抗剂AMD3100组（AMD3100）,每组各12只,模型组和假手术组,经尾静脉缓慢注射1 mLPBS,其它各组经尾静脉缓慢注射1mL细胞悬液（1×106mmL）。③在缺血后第1、7、14和28d采用改良神经损伤严重程度评分、粘胶揭除试验和角试验进行神经功能评价。④缺血后第28 d,采用免疫荧光法检测缺血周边区BMSCs数量,采用甲苯胺蓝染色检测脑缺血梗死体积。⑤缺血后第14 d,采用免疫荧光法检测缺血周边区BMSCs数量、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、血管性血友病因子（vWF）、血管内皮生长因子（VEGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。结果①采用全骨髓贴壁法,可得到生长良好,形态均一性的BMSCs,第3代BMSCs的表型鉴定CD29、CD90、CD34和CD45阳性表达率分别为99.0%、99.3%、0.2%和4.1%,符合BMSCs的特点,说明是分离培养纯度较高的BMSCs。②在缺血后第7 d、14 d和28 d,川芎嗪预处理（50 μM和100 μM）组显着改善大鼠脑缺血后神经症状（P<0.01或<0.05）,减少大鼠黏胶揭除时间（P<0.01或P<0.05）,大鼠右转次数显着减少（P<0.01或P<0.05）。③缺血后第28 d,与模型组和BMSCs组比较,川芎嗪预处理（50 μM和100 μM）组大鼠脑缺血的梗死体积显着性减少（P<0.01或P<0.05）。④缺血后第14 d,与模型组、BMSCs组和AMD3100组比较,川芎嗪预处理（50μM和100μM）组缺血周边区的BrdU、SDF-1、vWF、VEGF和BDNF免疫阳性细胞明显增加（P<0.01）。结论 川芎嗪（50 μM和100 μM）预处理BMSCs治疗脑缺血的疗效优于BMSCs,川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移,促进神经功能恢复,缩小脑梗死体积,机制可能与促进脑缺血周边区血管生成及上调脑缺血周边区的SDF-1、VEGF和BDNF的表达有关。
陈燕[5]（2013）在《HTK液对在体未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用及应用研究》文中研究说明研究总体思路：HTK （Histidine-tryptophane-ketoglutarate）液是1975年由德国Bretschneider等研制的一种仿细胞内液的晶体液,目前仍广泛用作肝、肾、心脏、肺和胰腺等移植供体的保存液,也可用作心脏手术中的停搏液或经肺动脉灌注的肺保护液。作为心脏停搏液,HTK液有单次灌注、作用时间长、不影响手术操作、减少预充血量等优点,对成年瓣膜置换、主动脉手术等病人可提供与冷含血停搏液相似的心肌保护作用。两项Meta分析的结果显示,含血停搏液改善术后早期心功能,但晶体停搏液有利于改善患者长期预后。对儿科病人心脏手术中的心肌保护,国内外不同心脏中心选择的停搏液种类和成分有差异,含血停搏液是否优于晶体停搏液仍是有争议的问题。国际上对HTK液在小儿心脏手术中的应用报道很少。有研究观察了HTK液用于30例新生儿大动脉转位矫治术中的心肌保护,术后24h内血清TnI水平≤3mg/ml,但缺乏对照组病例。另有研究发现189例采用HTK液的新生儿术中血钠波动明显,显着血钠下降（血钠下降>15mmol/L）的发生与患儿术后癫痫发作有关。最近有研究回顾分析218例行大动脉调转（Arterial switch operation, ASO）手术的新生儿,其中30例采用冷HTK液,188例采用温血停搏液,在进行病例匹配和排除高危因素影响后,HTK液组患儿术后血清心肌酶的浓度明显高于温血停搏液组,但30天死亡率无差别。本课题组曾回顾分析HTK液和改良St.Thomas液在118例婴幼儿心脏手术中的应用,发现前者有更高的自动复跳率和更低的死亡率,HTK液用于阻断时间在105-242min的小儿复杂先心病手术是安全、可行的。国内其它中心也有HTK液对婴幼儿心肌保护作用优于St.Thomas液的报道。迄今为止,没有前瞻性随机对照试验评价HTK液和含血停搏液对未成熟心肌保护的作用优劣,尤其HTK液用于长时间心脏停跳（阻断时间在75min以上）的安全性尚无随机对照研究评价。近年来随着低龄、复杂、重症先心病手术患儿比例的上升,对阻断时间较长的未成熟心脏采用何种停搏液能达到更好的保护效果成为我们面临的重要问题。目前国内无儿童和婴幼儿专用的心脏停搏液,阜外医院小儿心脏外科中心率先在复杂先心病矫治或根治术中常规采用HTK液进行心肌保护,有效减少了预充血量和异体血用量,前期临床资料的总结显示,HTK液有良好的心肌保护效果和安全性,但它是否是未成熟心肌保护最适宜的停搏液仍有待深入研究,本课题围绕HTK液及改良HTK液对长时间缺血心肌的保护作用开展基础和临床研究。第一部分模拟临床上婴幼儿CPB心脏手术过程,建立乳猪深低温低流量CPB模型,麻醉和体外循环管理方法,包括麻醉用药、预充成分、预充量、血气管理、停跳液灌注方法、改良超滤等均与临床相似,主动脉阻断时间为2h,停机后2h为实验终点。利用酶联免疫吸附法、免疫组化、光镜、电镜等技术手段对血清、冠脉、心肌组织标本进行检测,从心肌代谢、组织学、细胞形态学等不同层面探讨HTK液和含血停搏液对在体未成熟心肌的保护作用差异,以期为临床上停搏液的选择提供实验依据。第二部分基于近年来对先心病手术后死亡婴儿的心肌病理检测发现氧化损伤是最主要的损伤类型以及HTK液相对于含血停搏液存在抗氧化能力的不足,我们提出假设：在HTK液中添加靶向线粒体的抗氧化剂依布硒啉,可能通过减轻氧化应激使心肌线粒体得到保护,从而更好地保护未成熟心肌。与第一部分实验方法相同,建立乳猪深低温低流量CPB模型,主动脉阻断2h,停机后2h取心肌组织标本,利用电镜、比色法、免疫组化、Western blot （WB）、RT-PCR等技术对心肌组织进行检测,探讨含依布硒啉HTK液对在体缺血再灌注未成熟心肌的保护作用机制,以期为含依布硒啉HTK液的临床应用提供科学依据。第三部分对HTK液在小儿复杂先心病手术中的应用进行了临床观察,同时进行了大样本病例回顾分析,重点探讨HTK液对术中心脏传导阻滞、血钠浓度和血浆渗透压的影响及其与临床预后的相关性。第一部分HTK液和含血停搏液对在体缺血再灌注未成熟心肌保护作用的对比研究背景与目的对长时间缺血的未成熟心肌采用何种停搏液能达到更好的保护效果仍是有争议的,目前也无随机对照试验评价HTK液和含血停搏液对未成熟心肌保护作用的优劣。本研究拟在模拟临床情况的乳猪深低温低流量CPB模型上,探讨HTK液和冷含血停搏液对在体未成熟心肌的保护作用差异。方法15只健康乳猪,2周龄,体重4.5-6.8kg,随机分为对照组（Con组,n=5）、HTK液组（HTK组,n=5）、冷含血停搏液组（含1：1氧合血,CBC组,n=5）。所有动物经升主动脉、上、下腔静脉插管建立CPB模型,HTK组和CBC组降温至鼻咽温30℃,阻断升主动脉,降温至鼻咽温25℃,低流量CPB,主动脉阻断2h后开放,复温至直肠温35℃以上停机。术中监测血流动力学指标、体温、血气变化,阻断前、开放后分别取冠状静脉窦血测定血氧、乳酸含量,CPB前、停机后2h分别采颈内静脉血测定血清cTnT、cTnI、CK-MB含量。停机后2h取冠脉血管和左室心肌标本,分别检测组织匀浆eNOS、VEGF和iNOS、TNF-α、IL-1β、ATP含量；TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡情况,HE染色光镜下观察组织病理损伤情况,透射电镜观察心肌细胞超微结构改变和线粒体损伤情况。结果主动脉开放后HTK组正常心律恢复时间较CBC组明显延长（p<0.01）,血钠水平较CBC组明显降低（p<0.05）,但HTK组异体血用量较CBC组明显减少（p<0.01）。开放后动脉和冠状静脉窦血氧、乳酸含量差在HTK组和CBC组间均无显着差异（p>0.05）。停机后2h,血清cTnT、cTnI、 CK-MB含量在三组间比较无显着差异（p>0.05）,冠脉血管eNOS、VEGF和心肌组织iNOS、TNF-α、IL-1β含量在三组间比较也无明显差异（p>0.05）。HTK组心肌组织病理损伤评分与CBC组无显着差异（p>0.05）,但HTK组TUNEL阳性细胞数较CBC组明显增多（p=0.037）,电镜下线粒体损伤评分HTK组明显高于对照组和CBC组（p=0.01和p=0.045）；HTK组心肌组织ATP酶含量较对照组明显降低（p=0.017）。结论1、与1：1冷氧合血停搏液相比,HTK液在心肌代谢、心肌损伤标记物的释放、冠脉内皮激活和早期炎性反应、组织病理学损伤方面均无明显差异,但TUNEL标记的心肌细胞凋亡增多,细胞超微结构的改变显示线粒体损伤更重,心肌ATP酶含量有减少趋势,提示HTK液对阻断时间在2h的未成熟心脏,其心肌保护作用处于临界状态。2、HTK液明显减少体外循环预充血量和异体血使用量,从节约血源和减少异体血输入的意义上而言,对阻断时间在2h以下的未成熟心脏,HTK液可以作为含血停搏液的良好替代品。3、HTK液的使用要注意正常心律恢复延迟和引起低钠血症的问题。第二部分含依布硒啉HTK液对在体未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用背景与目的改良HTK液对未成熟心肌能否有更好的保护作用尚无报道。与含血停搏液相比,HTK液存在抗氧化能力不足,依布硒啉（Ebselen）是目前公认具有模拟谷胱甘肽氧化酶作用最好的药物之一,能在体内发挥线粒体靶向的抗氧化功效,添加Ebselen的HTK液对在体未成熟心肌缺血再灌注损伤是否具有保护作用尚不清楚。本研究利用乳猪深低温低流量CPB模型,探讨含依布硒啉HTK液对在体未成熟心肌的保护效果及可能的作用机制。方法15只健康乳猪,2周龄,体重4.5-6.1kg,随机分为对照组（Con组,n=5）、HTK液组（HTK组,n=5）、HTK+E液组（含lOnMEbselen, HTK+E组,n=5）。全部动物经升主动脉、上、下腔静脉插管建立CPB模型,HTK和HTK+E组降温至鼻咽温30℃,阻断升主动脉,降温至鼻咽温25℃,低流量CPB,主动脉阻断2h后开放,复温至直肠温35℃以上停机。术中监测血流动力学指标、体温、血气变化。停机后2h取左室心肌标本,检测组织匀浆MDA、SOD、Mn-SOD、ATP含量；TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况；透射电镜观察心肌细胞超微结构改变和线粒体损伤情况；WB检测心肌线粒体细胞色素C、Bax、Bcl-2蛋白的表达,并检测心肌组织HSP72蛋白的表达,RT-PCR检测心肌组织HSP72mRNA的表达。结果血流动力学、体温、血气变化在HTK+E组和HTK组间比较无显着差异（p>0.05）,两组的异体血用量也无明显差异（p>0.05）。与对照组比较,停机后2hHTK组心肌组织ATP酶含量明显降低（p=0.011）, MDA含量明显升高（p=0.038）；与HTK组比较,HTK+E组SOD和Mn-SOD含量均明显升高（p=0.021和p=0.020）,TUNEL阳性细胞数明显减少（p=0.045）,心肌线粒体细胞色素C的释放明显减少（p=0.010）。HTK组Bcl-2/Bax比值较对照组明显升高（p=0.028）,但HTK+E组与对照组无显着差异（p>0.05）。HTK+E组HSP72蛋白和mRNA的表达明显高于HTK组（p=0.039和p=0.035）,HSP72蛋白和Mn-SOD的表达量有显着正相关关系（r=O.581,p=0.023）。电镜下HTK+E组线粒体损伤评分明显低于HTK组（p=0.047）。结论1、含依布硒啉的HTK液能较HTK液减轻心肌的氧化应激,更好地保护心肌线粒体结构,减少心肌细胞色素C的释放,防止早期凋亡信号事件发生,并能诱导未成熟心肌HSP72蛋白表达,增强心肌的抗氧化损伤能力,从而减少心肌细胞凋亡。2、含依布硒啉的HTK液心肌保护作用优于HTK液,在预充血量和异体血用量上与HTK液相同,可以较HTK液更好地替代含血停搏液,有潜在的临床应用价值。第三部分HTK液对小儿复杂先心病手术中心律、血钠的影响及其与临床预后的关系研究背景与目的成人心脏手术中应用HTK液后引起开放后心脏传导阻滞并增加室颤发生率,HTK液引起的血钠波动与新生儿心脏手术后癫痫有关也有报道,但HTK液对小儿先心病手术中心律、血钠和血浆渗透压变化的影响尚无文献报道。本研究观察应用HTK液后心律（率）恢复情况及其与临床预后的关系,同时对病例进行回顾分析,探讨HTK液引起的术中血钠、血浆渗透压的变化对术后脑并发症是否有影响。方法第一组病例：2012年6月-12月,有169例先心病患儿在CPB下行择期复杂心脏畸形矫治或根治术,采用HTK液作为心脏停搏液,观察主动脉开放后心脏复苏情况,记录心脏传导阻滞发生情况和正常心律（率）恢复时间,与围术期有关因素作相关性分析,并分析术后使用起搏器的影响因素。第二组病例：2012年2月-12月,有322例先心病矫治或根治手术患儿术中采用HTK液作为心脏停搏液,记录围术期血钠、血浆渗透压变化情况,以年龄、性别、体重、手术类型、术中预充量、HTK灌注量、复跳后是否室颤、是否有区域性脑灌注、脑灌注时间、最低鼻咽温、CPB时间、主动脉阻断时间、血钠变化>15mmol/L、最高血钠、最低血钠、最高血Glu、最低血Glu、术后是否带起搏器、24h累积胸液量、呼吸机支持时间、ICU停留时间作为影响因素,分析术后出现脑并发症（烦躁/躁动、抽搐）的危险因素。结果第一组病例：>3岁患儿开放后心脏传导阻滞和室颤的发生率均明显高于≤3岁患儿（57.1%vs.34.7%, p=0.045;78.6%vs.95.1%, p=0.037）;在≤3岁患儿中,正常心律（率）恢复时间与患儿术前心胸比正相关（r=0.274,p=0.010）,与ACC、CPB时间正相关（r=0.183, p=0.045; r=0.205, p=0.025）,与开放时鼻咽温负相关（r=-0.189,p=0.038）,与术后24h米力农用量、ICU停留时间正相关（r=0.187,p=0.041; r=0.214, p=0.019）.二元Logistic回归分析显示,正常心律（率）恢复时间和心脏传导阻滞均不是术后使用起搏器的影响因素。但在某些手术类型（TAPVC矫治、主动脉弓离断矫治、主肺动脉窗修补、肺动脉起源异常矫治、TECD矫治等手术）患儿中,发生心脏传导阻滞者ICU停留时间明显延长（p=0.021）。第二组病例：术中发生低钠血症有220例（71.9%）,其中≤125mmol/L为13例（4.2%）,≤130mmol/L为55例（18%）,<135mmol/L为152例（49.7%）。>3岁患儿严重低钠的发生率明显高于≤3岁患儿（p=0.001）。与转机前比较,主动脉阻断后早期血钠即明显下降（p=0.000）,转流期间血钠呈偏低状态,停机后有215例（70.3%）恢复至正常血钠水平。入PICU和术后12h血钠均显着高于转机前水平（p=0.000）,术后12h血钠>146mmol/L有119例（38.9%）,其中≥150mmol/L有31例（10.1%）。血浆渗透压的变化与血钠基本一致,但转流前、转流期间和停机后血浆渗透压均低于正常值水平,入PICU后逐渐恢复至正常值范围。术后癫痫发作有3例（0.9%）,无明显原因的烦躁/躁动有55例（18%）,二元Logistic回归分析显示,术后12h血钠值是患儿出现脑并发症的危险因素。ROC曲线分析显示,术后12h血钠值在瓣膜成形、TECD矫治、DORV矫治、肺动脉闭锁根治等手术患儿中预测脑并发症的发生有一定价值。结论1、>3岁患儿心脏自动复跳率低于≤3岁患儿；≤3y患儿中,心/胸比大、阻断时间和CPB时间长、开放时鼻咽温低的患儿心律（率）恢复时间易延长,并与术后早期米力农用量增加、ICU停留时间延长有一定相关性,但是否有因果关系还需进一步研究。提示在手术操作允许的情况下,提早复温,提高开放温度,有利于患儿术后早期恢复。2、HTK液引起的心脏传导阻滞和心律（率）恢复时间延长均不是术后使用起搏器的影响因素,但在某些手术类型（如TAPVC矫治、主动脉弓离断矫治、肺动脉起源异常矫治、TECD矫治等手术）的患儿,发生心脏传导阻滞者ICU停留时间明显延长,HTK液是否为这部分患儿ICU时间延长的独立风险因素有待进一步研究。3、HTK液引起不同程度的低钠血症,可加重血浆低渗状态,>3岁患儿严重低钠血症的发生率高于≤3岁患儿,积极预防可以减少严重低钠的发生。术后早期的高钠血症是患儿术后癫痫发作、烦躁/躁动发生的独立风险因素,术后12h血钠值在瓣膜成形、TECD矫治等手术患儿中预测脑并发症的发生有一定价值。
薛国钰[6]（2013）在《二氮嗪对H2O2损伤大鼠L6骨骼肌成肌细胞的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的：在我国缺血性心脏病的发病率逐年提高，并已成为当今人类死亡的主要原因之一。目前干细胞移植入梗死区治疗缺血性心脏病已取得较大进展，但其治疗效果受多种因素的制约。影响其治疗效果的重要因素之一是移植入的干细胞的存活率低，研究表明，大量细胞在移植入受损心肌后约70-80%在3天内死亡。提高移植干细胞的存活率，可以从两方面入手，一是提高移植干细胞本身耐受恶劣环境的能力；二是改善移植的微环境。本实验室前期研究采用过氧化氢体外诱导L6骨骼肌成肌细胞（L6SKM）氧化应激损伤，观察应用二氮嗪预处理对过氧化氢氧化损伤L6SkM的作用，初步观察表明二氮嗪预处理对氧化应激损伤的成肌细胞具有保护作用，但具体机制不清。PI3K/Akt通路的活化对细胞存活非常重要。本实验体外建立成肌细胞氧化应激模型，继续研究二氮嗪对成肌细胞的作用，并探讨其保护作用与PI3K/Akt信号通路的关系。方法：1不同浓度H2O2对L6SkM的作用体外培养L6骨骼肌成肌细胞（L6Skeletal Myoblast，L6SkM），用H2O2诱导L6SkM损伤。实验分正常对照组（normal control），H2O2损伤组（H2O2group）,浓度分别为0.20、0.40、0.60、0.80mmol/L，作用时间为（12小时、24小时）。通过MTT比色法检测各组细胞活力，摸索诱导H2O2氧化损伤的最佳浓度及时间，建立L6SkM H2O2氧化应激损伤模型。2不同浓度LY294002干预对经DZ预处理组L6SkM的作用体外培养L6骨骼肌成肌细胞（L6SkM），实验分正常对照组（normal control），H2O2损伤组（H2O2group,0.40mmol/L，24hours）；DZ预处理组（DZ group）：在培养基中先加入终浓度为200μmol/L的二氮嗪孵育30分钟，再换为含0.40mmo1/LH2O2的培养基作用24小时诱导损伤；抑制剂组（LYgroup）：在培养基加入终浓度为200μmol/L二氮嗪的同时分别加入终浓度为25μmol/L（LY1）、50μmol/L（LY2）的LY294002共同孵育30min，再换为含0.40mmo1/LH2O2的培养基作用24小时诱导损伤。通过MTT比色法检测各组细胞活力，观察不同浓度LY294002干预对DZ预处理后细胞活力的影响，摸索LY294002的适当浓度。3DZ预处理对H2O2损伤L6SkM的作用体外培养L6SkM。实验分正常对照组（normal control），H2O2损伤组（H2O2group,0.40mmo1/LH2O2的培养基作用24小时），DZ预处理组（在培养基中先加入终浓度为200μmol/L的二氮嗪孵育30分钟，再换为含0.40mmo1/LH2O2的培养基作用24小时诱导损伤），LY294002抑制剂组（在培养基加入终浓度为200μmol/L二氮嗪的同时加入终浓度50μmol/L的LY294002共同孵育30min，再换为含0.40mmo1/LH2O2的培养基作用24小时诱导损伤）。MTT比色法检测各组细胞活性; HE染色观察细胞的形态学变化；激光共聚焦显微镜观察各组细胞经JC-1染色的线粒体膜电位的变化。免疫细胞化学染色检测Caspase-3的表达；AnnexinV-FITC&PI检测各组细胞凋亡率;Western-blot法检测P-Akt、Caspase-3、Caspase-9的表达水平。结果：1不同浓度H2O2对L6SkM的作用MTT检测结果显示:随着H2O2浓度及时间的增加细胞活力逐渐下降，我们选择引起细胞活力下降50%左右的H2O2浓度0.40mmol/L作用24小时建立损伤模型。2不同浓度LY294002对L6SkM的作用MTT检测结果显示:与正常组比较，H2O2组的细胞活力明显下降；与H2O2组比较，DZ组的细胞活力明显上升；LY组细胞活力得到抑制，LY1组与H2O2组比较细胞活力有差异，LY2组与H2O2组比较细胞活力无差异，LY1组LY2组比较细胞活力无差异。3流式细胞仪检测细胞凋亡率:与正常组比较，H2O2组的细胞凋亡率明显升高至43.95±1.47%；与H2O2组比较，DZ组的细胞凋亡率明显降低至11.53±0.25%；LY组的细胞凋亡率升高至31.95±2.06%但低于H2O2组。4激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的荧光变化:正常细胞具有较高的膜电位，当细胞发生凋亡时，线粒体膜电位发生去极化。经JC-1染色后，正常细胞发出较强的红色荧光,绿光相对较弱，细胞凋亡时绿色荧光增强，红光减弱，用绿/红荧光强度比的变化说明线粒体膜电位的改变。结果显示与正常组比较，H2O2组绿/红荧光强度比增大，线粒体膜电位降低；DZ预处理，绿/红荧光强度比降低与正常组接近，能很好的维持细胞的膜电位；LY组绿/红荧光强度比升高与H2O2组接近，膜电位降低。5免疫组织化学染色法检测Caspase-3显示: H2O2组caspase-3蛋白表达明显高于正常对照组；DZ组caspase-3蛋白表达明显低于H2O2组，两组存在差异；LY组caspase-3蛋白的表达与DZ组相比上升，但还是低于H2O2组，两组存在差异。6Western-blot法检测结果6.1P-Akt蛋白的表达显示:与正常组比较，H2O2组的P-Akt蛋白表达明显降低;与H2O2组比较，DZ组的P-Akt蛋白表达明显升高；LY组的P-Akt蛋白表达与DZ组相比明显降低,且与H2O2组无差异。6.2Caspase-3,9蛋白的表达显示:与正常组比较，H2O2组的Caspase-3,9蛋白表达明显增加;与H2O2组比较，DZ组的Caspase-3,9蛋白表达明显降低；而LY组的Caspase-3,9蛋白表达与DZ组相比增加但低于H2O2组。结论：1二氮嗪预处理能够改善细胞形态、增加细胞存活率、提高线粒体膜电位水平及抑制凋亡，对氧化应激损伤L6SkM具有保护作用。2二氮嗪预处理的保护作用是通过激活了PI3K/Akt信号通路，下调凋亡蛋白caspase-3,9的从而抑制细胞凋亡，促进细胞存活。
付庆喜,马国诏,车峰远,高乃永,高建新,张镛[7]（2011）在《二氮嗪预处理对Aβ1-42作用神经元KATP各亚基表达的影响》文中研究表明目的探讨ATP敏感的钾离子（KATP）通道开放药物二氮嗪防治A1-42细胞毒性作用的分子机制。方法采用细胞原代培养的方法,培养大鼠皮层神经元并进行鉴定。将原代培养的细胞随机分为对照组、单纯Aβ1-42干预组、二氮嗪预处理1 h后Aβ1-42干预组、单纯二氮嗪预处理组和单纯Aβ42-1干预组（Aβ1-42反序列对照）,各组又分为24、72 h两个亚组。采用免疫荧光双染及免疫印迹法,观察干预后不同培养时间（24、72 h）细胞KATP通道各亚基Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2蛋白表达水平的变化。结果与对照组比较,单纯A1-42处理24 h组Kir6.1、SUR2显着升高（P<0.05）,二氮嗪预处理后Aβ1-42作用细胞24 h组各亚基表达均无明显变化;二氮嗪预处理后Aβ1-42作用细胞72 h组与单纯A1-42处理72 h组KATP通道各亚基表达均明显升高（P<0.05）,而二氮嗪预处理后Aβ1-42作用细胞72 h组与单纯A1-42处理72 h组相比Kir6.1、Kir6.2、SUR2表达显着下调（P<0.05）。结论二氮嗪预处理可完全逆转A1-42作用神经元24 h所引起的Kir6.2及SUR1的表达上调,只能部分逆转A1-42作用神经元72 h所引起的Kir6.1、Kir6.2、SUR2的表达增加,可能会维持神经细胞正常生理功能,起到防治A1-42细胞毒性作用。
李清[8]（2011）在《二氮嗪的心肌保护作用及对ERK1/2和STAT3信号通路的影响》文中研究表明[背景]心肌缺血再灌注损伤是缺血性心脏病以及心脏手术后心功能不全的主要病理基础。寻找有效的心肌保护措施减轻心肌缺血再灌注损伤具有重要意义。各种心肌保护措施,如心脏停搏液、缺血或药物预处理和后处理及热休克处理等成为人们研究的热点。由于心脏停搏液的应用受到体外循环的限制,药物后处理由于用药时机容易把握,同时又可以避免缺血后处理钳夹血管的风险而更具有临床应用价值。ERK1/2和STAT3是人体内非常重要的转录调节因子,在心肌缺血再灌注损伤以及许多心肌保护机制中具有重要作用。二氮嗪为线粒体K+通道开放剂,研究发现它可以减少再灌注后心肌梗死面积及炎症反应,具有保护作用,但其心肌保护的作用机制目前尚不清楚。[目的]本课题通过临床试验、大鼠的心肌缺血再灌注损伤模型,观察二氮嗪对CABG病人术后心脏功能的影响和对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及对ERK1/2和STAT3信号通路的影响,从而探讨二氮嗪的心肌保护作用及机制。本研究包括三部分：（1）比较二氮嗪心脏停搏液和常规心脏停搏液对体外循环下CABG病人心脏功能的影响。（2）通过大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型,观察二氮嗪钾镁停搏液对缺血再灌注后心肌梗死面积和细胞凋亡的影响。（3）观察二氮嗪后处理的心肌保护作用及对ERK1/2和STAT3信号通路的影响,并且观察两个信号通路在二氮嗪后处理心肌保护中的相互关系,探讨二氮嗪心肌保护作用的机制。[方法]第一部分：本试验为随机、对照、双盲研究。40例TnT>0.05 （IU/L）拟行CABG的患者随机分为两组,二氮嗪组（D组）和安慰剂组（C组）。D组：常规的心脏停搏液+50μmol/L二氮嗪,C组：常规的心脏停搏液+0.9%NS。记录术前、停体外循环后1h、术后6h、12h和24h的HR、MAP、CI PAP、PCWP、CVP、SVR、PVR、LVSWI RVSWI等指标,及术前、术后6h和24h时的血清学标记物CK-MB和TnT。第二部分：建立离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。48只成年健康雄性SD大鼠随机分为空白对照组（sham组）、缺血再灌注损伤组（IR组）、停搏液组（P组）、二氮嗪停搏液组（DZX组）。（1） sham组：平衡15min后无处理,续灌95min。（2）IR组：平衡后全心缺血30min,再灌注60min。（3）P组：平衡后予含有0.4%DMSO的钾镁停跳液灌注5min,继而全心缺血30min,再灌注60min。（4）DZX组：平衡后予含有50μmol/L二氮嗪的钾镁停跳液灌注5min,缺血30min,再灌注60min。TTC染色法检测再灌注后心肌梗死面积；TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平。第三部分：大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型：72只SD大鼠随机分为以下几组：（1）空白对照组（sham组）：开胸后穿线并不阻断LAD,150min后处死动物取心肌标本待检测。（2）缺血再灌注损伤组（IR组）：阻断LAD 30分钟后开放血管再灌注120mmin。（3）溶媒组（Ve组）：阻断LAD 30分钟后开放血管,再灌注即刻股静脉注入0.4%DMSO,再灌注120min。（4）二氮嗪后处理组（DZX组）：阻断LAD30分钟后开放血管,再灌注即刻股静脉注射7mg/kg二氮嗪,再灌注120min （5） Stattic组：阻断LAD30分钟,于再灌注前10min股静脉注射Stattic,其余处理同DZX组。（6）U0126组：阻断LAD30分钟,于再灌注前10min股静脉注射U0126,其余处理同DZX组。TTC染色法检测再灌注后心肌梗死面积；TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平；Western-blot和real time RT-PCR法检测ERK1/2和STAT3磷酸化水平及mRNA的表达。[结果]（1）两组患者术后CI都有所增加,但与安慰剂组相比,二氮嗪组CI增加的更多而且更加迅速（p<0.05）。LVSWI和RVSWI虽然停体外循环后1h有所下降,但是与安慰剂组相比,二氮嗪组恢复的明显加快（p<0.05）。其他的血流动力学指标两组没有显着性差异。两组术后CK-MB虽然都有所增加,但是与安慰剂组相比,二氮嗪组CK-MB释放的明显减少（p<0.05）,两组TnT术后有所减低,二氮嗪组与安慰剂组相比降低的更迅速（p<0.05）。（2）虽然钾镁停搏液可以明显减少缺血再灌注后心肌梗死面积和心肌细胞凋亡指数（心肌梗死面积：IR组46.31%±5.21%vs P组19.50%±6.19%；凋亡指数：IR组25.91%±6.38%vs P组11.65%±3.49%,p<0.01）,然而,二氮嗪钾镁停搏液的作用更显着,与单纯的停搏液相比,心肌梗死面积和心肌细胞凋亡指数更少（心肌梗死面积：DZX组8.50%±2.45%vs P组19.50%±6.19%；凋亡指数：DZX组6.20%±1.78%vsP组11.65%±3.49%,p<0.05）。（3）二氮嗪后处理可以明显减少缺血再灌注后心肌梗死面积和心肌细胞凋亡指数,（心肌梗死面积从39.07%减少到9.18%,凋亡指数从46.63%减少到12.43%,p<0.01）,上调ERK1/2和STAT3的磷酸化水平和mRNA的表达,应用ERKI/2抑制剂U0126和STAT3的抑制剂Stattic,二氮嗪后处理减少心肌梗死面积和抗心肌细胞凋亡的作用消失（与DZX组相比,p<0.01）。Stattic可以降低ERK1/2的磷酸化水平和mRNA的表达,但是U0126却对STAT3的磷酸化和mRNA的表达无影响。[结论]（1）与常规心脏停搏液相比,二氮嗪心脏停搏液可以明显提高CABG病人术后心脏收缩功能,减少CK-MB和TnT的释放,具有心脏保护作用。（2）减少心肌细胞的凋亡可能是二氮嗪钾镁停搏液心肌保护作用的机制。（3）二氮嗪后处理可以减少心肌梗死面积和心肌细胞的凋亡,具有心肌保护作用,而且这种保护作用依赖于ERK1/2和STAT3通路的激活。（4）在二氮嗪后处理的心肌保护作用中,STAT3通路可能是ERK1/2通路的上游,二氮嗪激活ERK1/2通路的作用依赖于STAT3通路。
任美欣,严松彪,陈晖[9]（2009）在《线粒体ATP敏感性钾通道与缺血预处理的研究进展》文中进行了进一步梳理
范勇,林茹[10]（2008）在《关闭线粒体通透性转变孔对未成熟兔缺血心肌的保护作用》文中研究说明目的本实验旨在观察及了解线粒体通透性转变孔（MPTP）抑制剂和钾离子通道（KATP）开放剂对未成熟兔缺血心肌的保护作用及两者间的作用关系。方法未成熟大耳白幼兔45只,体重350450g,年龄34W。随机分为5组,均取离体心脏悬挂于改良Langendorff灌流装置,K-H液平衡20min后,各组灌注含不同成分的停搏液,各组均30min重复灌注一次停搏液,每次20ml,共灌注2次。心脏置于36±1℃恒温器中,缺血60min,再K-H液灌注60min。5组灌注的停搏液分别为St.Thomas（10只）;St.Thomas+30μmol/Ldiazoxide（8只）;St.Thomas+0.2μmol/L cyclosporin A（10只）;St.Thomas+30μmol/L diazoxide+20μmol/Latractyloside（8只）;St.Thomas+30μmol/L diazoxide+100μmol/L 5-hydroxydecanoic acid（9只）。其中St.Thomas+cyclosporin A组和St.Thomas+diazoxide+atractyloside组在缺血60min后先分别给含有0.2μmol/L cyclosporin A或20μmol/L atractyloside的K-H液复灌10min,然后继续给K-H液灌注50min。结果再灌注后经特异性KATP开放剂diazoxide或特异性MPTP抑制剂cyclosporin A强化的St.Thomas停搏液组与St.Thomas组比较,可显着促进未成熟兔缺血心肌的功能恢复,冠脉流量恢复率增加明显（P<0.05）,而特异性MPTP开放剂atractyloside可阻断它们的效应（P<0.05）。特异性KATP阻滞剂5-HD也可阻断diazoxide的效应（P<0.05）。结论ATP钾离子通道开放剂和线粒体通透性转变孔抑制剂均对未成熟缺血心肌有明显的保护作用,且ATP钾离子通道开放剂很可能是通过关闭线粒体通透性转变孔来起到心肌保护作用的。
二、二氮嗪预处理对未成熟兔心脏的保护作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、二氮嗪预处理对未成熟兔心脏的保护作用（论文提纲范文）
（1）LOC339524和UQCRC1介导心/脑保护的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 LOC339524对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 LOC339524抑制脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应的机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 UQCRC1在药物预处理大鼠心肌保护中的作用研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞色素C还原酶核心蛋白1(Ubiquinol-cytochrome-creductasecomplexcore protein1,Uqcrc1)的功能及其参与疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间撰写论文情况 |
| 致谢 |
（2）microRNA在mitoKATP开放抗心肌缺血—再灌注损伤中差异表达的初步研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）异甜菊醇钠对豚鼠心肌细胞sarcKATP和mitoKATP通道的调控作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 K_(ATP)通道概述 |
| 1.1.2 K_(ATP)通道分类 |
| 1.1.3 K_(ATP)通道的心脏保护作用 |
| 1.1.4 K_(ATP)通道的调节及其心肌保护作用机制 |
| 1.1.5 钙通道 |
| 1.1.6 Ikr通道 |
| 1.1.7 STVNa概述 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.3.1 STVNa对豚鼠心室肌细胞sarcK_(ATP)电流的影响 |
| 1.3.2 STVNa对豚鼠心室肌细胞I_(ca)、I_(kr)电流和动作电位的影响 |
| 1.3.3 STVNa对豚鼠心室肌细胞mitoK_(ATP)通道的影响 |
| 1.3.4 STVNa作用于K_(ATP)通道机制研究 |
| 第二章 STVNa对豚鼠心室肌细胞膜K_(ATP)通道的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验药品与试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 溶液的配制 |
| 2.2.5 豚鼠心肌细胞的分离 |
| 2.2.6 膜片钳技术 |
| 2.2.7 全细胞膜片钳记录K_(ATP)电流 |
| 2.2.8 STVNa孵育不同时间对K_(ATP)电流的影响 |
| 2.2.9 不同STVNa浓度对K_(ATP)电流的影响 |
| 2.2.10 STVNa对K_(ATP)电流I –V曲线的影响 |
| 2.2.11 全细胞膜片钳记录I_(ca)电流 |
| 2.2.12 全细胞膜片钳记录I_(kr) |
| 2.2.13 全细胞膜片钳记录动作电位 |
| 2.2.14 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 细胞形态学观察 |
| 2.3.2 细胞膜K_(ATP)电流（sarcK_(ATP)）的记录及确认 |
| 2.3.3 STVNa增加sarcK_(ATP)的电流密度 |
| 2.3.4 STVNa增大sarcK_(ATP)通道I-V曲线斜率 |
| 2.3.5 STVNa增大sarcK_(ATP)通道的开放速度 |
| 2.3.6 STVNa孵育不同时间对Pinancidil诱发出的sarcK_(ATP)电流的影响 |
| 2.3.7 不同浓度STVNa孵育对Pinancidil诱发出的sarcK_(ATP)电流的影响 |
| 2.3.8 STVNa对豚鼠心室肌细胞Ikr尾电流没有影响 |
| 2.3.9 STVNa对豚鼠心室肌细胞L-型钙电流没有影响 |
| 2.3.10 STVNa对豚鼠心室肌细胞动作电位没有影响 |
| 2.3.11 Pinacidil缩短豚鼠心室肌细胞动作电位时长、降低静息电位 |
| 2.4 本章讨论 |
| 2.5 本章小节 |
| 第三章 STVNa对豚鼠心室肌细胞线粒体K_(ATP)通道的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.0 实验动物和细胞 |
| 3.2.1 实验药品与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 溶液的配制 |
| 3.2.4 激光扫描共聚焦显微镜技术 |
| 3.2.5 线粒体黄素荧光蛋白荧光强度的测量 |
| 3.2.6 STVNa对急性分离豚鼠心室肌细胞mitoK_(ATP)通道的直接作用 |
| 3.2.7 STVNa孵育对急性分离豚鼠心室肌细胞mitoK_(ATP)的影响 |
| 3.2.8 STVNa对开放状态的mitoK_(ATP)通道的影响 |
| 3.2.9 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 STVNa对急性分离的豚鼠心室肌细胞mitoK_(ATP)通道的影响 |
| 3.3.2 STVNa对开放状态的mitoK_(ATP)通道没有影响 |
| 3.4 本章讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 ROS参与STVNa对sarcK_(ATP)和mitoK_(ATP)通道的增敏作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物和细胞 |
| 4.2.2 实验药品与试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 溶液的配制 |
| 4.2.5 ROS对STVNa对sarcK_(ATP)电流的增敏作用的影响 |
| 4.2.6 ROS对STVNa对mitoK_(ATP)电流的增敏作用的影响 |
| 4.2.7 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 ROS参与STVNa对sracK_(ATP)的增敏作用 |
| 4.3.2 ROS参与STVNa对mitoK_(ATP)的增敏作用 |
| 4.3.3 NAC对sarcK_(ATP)和mitoK_(ATP)通道没有影响 |
| 4.4 本章讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 川芎嗪预处理BMSCs移植提高脑缺血的治疗作用 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 实验仪器 |
| (四) 实验方法 |
| 1. 骨髓间充质干细胞分离培养 |
| 2. 骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定 |
| 3. 骨髓间充质干细胞预处理 |
| 4. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
| 5. 动物分组及BMSCs移植 |
| 6. 行为学评价 |
| 7. 梗死体积检测 |
| 8. 统计学分析 |
| 二、结果 |
| (一) 骨髓间充质干细胞的形态学观察 |
| (二) BMSCs表面标记物鉴定 |
| (三) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠mNSS评分的影响 |
| (四) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠粘胶揭除试验评分的影响 |
| (五) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠角试验的影响 |
| (六) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠脑梗死体积的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) 骨髓间充质干细胞的分离与鉴定 |
| 1. 骨髓间充质干细胞的分离、培养 |
| 2. 骨髓间充质干细胞的的鉴定 |
| 3. 骨髓间充质干细胞预处理 |
| (二) 川芎嗪预处理BMSCs移植改善脑缺血大鼠的神经功能 |
| 1. 川芎嗪预处理BMSCs移植改善了大鼠的行为学功能 |
| 2. 川芎嗪预处理BMSCs移植减少大鼠的梗死体积 |
| 四、小结 |
| 第二部分 川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 实验仪器 |
| (四) 实验方法 |
| 1. BrdU标记骨髓间充质干细胞 |
| 2. BMSCs预处理 |
| 3. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
| 4. 动物分组及BMSCs移植 |
| 5. BMSCs向脑缺血损伤区归巢的检测 |
| 6. SDF-1免疫荧光检测 |
| 7. BrdU和SDF-1免疫阳性细胞计数 |
| 8. 统计学分析 |
| 二、结果 |
| (一) BrdU标记骨髓间充质干细胞的阳性标记率 |
| (二) 川芎嗪预处理对BMSCs向脑缺血损伤周边区迁移的影响 |
| (三) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区SDF-1表达的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) BMSCs体外BrdU标记的最佳时间和浓度的筛选 |
| (二) 川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移 |
| 1. 川芎嗪预处理促进BMSCs归巢 |
| 2. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后SDF-1的表达 |
| 四、小结 |
| 第三部分 川芎嗪预处理BMSCs移植治疗脑缺血的机制研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 实验仪器 |
| (四) 实验方法 |
| 1. BMSCs预处理 |
| 2. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
| 3. 动物分组及BMSCs移植 |
| 4. 脑缺血损伤周边区血管生成检测 |
| 5. VEGF和BDNF免疫荧光检测 |
| 6. vWF、VEGF和BDNF免疫阳性细胞计数 |
| 7. 统计学分析 |
| 二、结果 |
| (一) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠血管生成的影响 |
| (二) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区VEGF表达的影响 |
| (三) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区BDNF表达的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) 川芎嗪预处理BMSCs移植提高脑缺血治疗作用的机制探讨 |
| 1. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后的血管生成 |
| 2. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后的神经营养因子分泌 |
| 四、小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（5）HTK液对在体未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用及应用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 HTK液和含血停搏液对在体缺血再灌注未成熟心肌保护作用的对比研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 含依布硒啉HTK液对在体未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HTK液对小儿复杂先心病手术中心律、血钠的影响及其与临床预后的关系研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 研究总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（6）二氮嗪对H2O2损伤大鼠L6骨骼肌成肌细胞的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 PI3K/Akt 信号通路的促生存机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）二氮嗪预处理对Aβ1-42作用神经元KATP各亚基表达的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 2 结 果 |
| 3 讨 论 |
（8）二氮嗪的心肌保护作用及对ERK1/2和STAT3信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、二氮嗪心脏停搏液对CABG病人心肌保护作用的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 试验仪器和药品 |
| 1.1.3 试验方法 |
| 1.1.4 统计学处理 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 患者的一般情况 |
| 1.2.2 患者术中、术后情况 |
| 1.2.3 患者心脏功能和血流动力学情况 |
| 1.2.4 生化标记物 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 二氮嗪对CABG病人心脏功能的影响 |
| 1.3.2 二氮嗪对CABG病人生化标记物的影响 |
| 1.3.3 影响本试验结果的因素 |
| 1.4 小结 |
| 二、二氮嗪心脏停搏液对缺血再灌注心肌梗死面积和细胞凋亡的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 大鼠离体心脏缺血再灌注Langendorff模型的建立 |
| 2.1.3 实验动物分组 |
| 2.1.4 标本采集及检测 |
| 2.1.5 统计学处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 TTC染色测定心肌梗死面积 |
| 2.2.2 心肌细胞凋亡 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型的建立 |
| 2.3.2 心肌缺血再灌注损伤 |
| 2.3.3 二氮嗪心脏停搏液的心肌保护作用 |
| 2.3.4 心脏停搏液临床应用的局限性 |
| 2.4 小结 |
| 三、二氮嗪后处理对缺血再灌注损伤心肌的保护作用及ERK1/2和STAT3信号通路的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型的建立 |
| 3.1.3 实验动物分组 |
| 3.1.4 标本采集及检测 |
| 3.1.5 统计学处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 TTC染色测定心肌梗死面积 |
| 3.2.2 心肌细胞凋亡 |
| 3.2.3 Western-blot测定心肌组织ERK1/2和STAT3磷酸化蛋白表达情况 |
| 3.2.4 Real time RT-PCR测定心肌组织ERK1/2和STAT3mRNA表达情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 二氮嗪后处理的心肌保护作用 |
| 3.3.2 二氮嗪后处理对ERK1/2信号通路的影响 |
| 3.3.3 二氮嗪后处理对STAT3信号通路的影响 |
| 3.3.4 ERK1/2和STAT3信号通路在二氮嗪后处理的心肌保护作用中的关系 |
| 3.3.5 二氮嗪钾镁停搏液和二氮嗪后处理 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 本课题的局限性 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 ATP敏感性钾通道在心肌缺血再灌注损伤中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（9）线粒体ATP敏感性钾通道与缺血预处理的研究进展（论文提纲范文）
| 1 mitoKATP的发现 |
| 2 KATP通道结构 |
| 3 mitoKATP的开放剂和阻滞剂 |
| 4 mitoKATP在IPC中的作用 |
| 5 mitoKATP参与预处理心肌的保护作用机制 |
| 5.1 mitoKATP和钙超载 |
| 5.2 mitoKATP和自由基损伤 |
| 5.3 mitoKATP与心肌凋亡 |
| 5.4 mitoKATP与心室重构 |
| 6 说明与展望 |
（10）关闭线粒体通透性转变孔对未成熟兔缺血心肌的保护作用（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 试剂 |
| 2 动物模型 |
| 3 检测指标和方法 |
| 4 统计学分析 |
| 结 果 |
| 1 心肌细胞收缩功能的变化 |
| 2 冠状动脉流量的变化 |
| 讨 论 |
四、二氮嗪预处理对未成熟兔心脏的保护作用（论文参考文献）
- [1]LOC339524和UQCRC1介导心/脑保护的作用和机制研究[D]. 龙宗泓. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019
- [2]microRNA在mitoKATP开放抗心肌缺血—再灌注损伤中差异表达的初步研究[D]. 聂佳. 遵义医学院, 2018(01)
- [3]异甜菊醇钠对豚鼠心肌细胞sarcKATP和mitoKATP通道的调控作用及机制[D]. 文婷. 华南理工大学, 2016(05)
- [4]川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用[D]. 李琳. 浙江中医药大学, 2015(01)
- [5]HTK液对在体未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用及应用研究[D]. 陈燕. 北京协和医学院, 2013(11)
- [6]二氮嗪对H2O2损伤大鼠L6骨骼肌成肌细胞的作用及机制研究[D]. 薛国钰. 河北医科大学, 2013(12)
- [7]二氮嗪预处理对Aβ1-42作用神经元KATP各亚基表达的影响[J]. 付庆喜,马国诏,车峰远,高乃永,高建新,张镛. 山东大学学报(医学版), 2011(09)
- [8]二氮嗪的心肌保护作用及对ERK1/2和STAT3信号通路的影响[D]. 李清. 天津医科大学, 2011(12)
- [9]线粒体ATP敏感性钾通道与缺血预处理的研究进展[J]. 任美欣,严松彪,陈晖. 中华老年多器官疾病杂志, 2009(05)
- [10]关闭线粒体通透性转变孔对未成熟兔缺血心肌的保护作用[J]. 范勇,林茹. 浙江预防医学, 2008(10)