一、裂解组织和细胞的方法（论文文献综述）
谢兴琴,聂煜绮,张怡[1]（2022）在《生物材料人血小板裂解液在组织再生修复中的应用与作用》文中研究说明背景:人血小板裂解液富含多种可促进组织损伤修复的物质,是一类可促进组织细胞再生修复的生物材料。目的:总结人血小板裂解液的组成、制备工艺及其近年来在人组织修复中的临床研究与应用进展。方法:第一作者以"human platelet lysate,clinical,trial,regeneration,tissue repair,wound healing,biomaterial"为英文检索词,以"血小板裂解液,临床,临床试验,再生,组织修复,创伤愈合,生物材料"为中文检索词,应用计算机检索Pub Med、clinicaltrials.gov、中国临床试验注册中心、维普、万方及知网数据库中2013年1月至2021年3月已发表的相关文献。结果与结论:人血小板裂解液可以从自体外周血、异体外周血或脐血中制备,富含多种促进细胞生长和创伤修复相关生物活性物质。目前发表的临床研究结果表明,单独使用人血小板裂解液或者人血小板裂解液联合细胞治疗在组织修复中均具有安全性和有效性。22项正在进行的临床研究涉及到包括新冠肺炎造成的呼吸窘迫综合征、下肢血管疾病、糖尿病溃疡、面部美容等新的适应证,未来这些临床研究有效性结果将进一步增加人血小板裂解液在组织再生修复中的作用。将人血小板裂解液与组织工程材料相结合,将为其在更大组织缺损的再生修复奠定基础。
王月[2]（2021）在《促进BCS-Ⅳ类药物依托泊苷口服吸收的纳米晶脂质载体的构建及机制研究》文中研究说明纳米晶（NCs）具有载药量高、粒径小、比表面积大等特点,被认为是提高难溶性药物口服生物利用度的有效手段。许多纳米晶类口服制剂已推向市场,但这些制剂大多局限于生物药剂学分类系统（BCS）中的第II类药物。对于BCS-Ⅳ类药物而言,单纯提高溶出度并不能有效改善其因膜渗透性差、易被P-糖蛋白（P-gp）外排而导致的口服吸收困难的问题。最近,许多报道证实了纳米晶可以以晶体的形式被肠道上皮细胞整体内化。这种吸收形式改善了BCS-Ⅳ类药物分子难以透过细胞膜,易被P-gp外排等问题,为纳米晶的口服吸收提供了新的方向。为此,BCS-Ⅳ类药物纳米晶的制备策略已从增加其饱和溶解度和溶解速率转变为保持制剂的晶体形态。基于这种转变,纳米晶的表面修饰引起了广泛的关注,如聚合物包衣的纳米晶、稳定剂交联的纳米晶等。这种修饰放弃了原本纳米晶快速溶出的特点,通过维持纳米晶的晶体形态,促进其以整体的形式被肠道摄取吸收进入体内循环,从而增强BCS-Ⅳ类药物的口服吸收效能。近年来,人们发现磷脂双层不仅容易制备,而且将其作为外壳可以进一步提高纳米粒的生物相容性、细胞摄取和体内性能;而且磷脂双层的存在还可以隐藏外来颗粒,保持其内核不受胃肠道环境的干扰,从而缓解环境对药物的影响。综上,本课题选用BCS-Ⅳ类药物依托泊苷（ETO）作为模型药物,通过静电吸附作用制备出修饰了TPGS的磷脂双层包裹纳米晶的壳-核结构,构建了口服纳米晶脂质载体（Lipo@NCs）,并研究了其在提高BCS-Ⅳ类药物的口服吸收方面的可行性和有效性。首先,通过反溶剂沉淀-高压均质法制备了带正电荷的依托泊苷纳米晶（Etoposide nanocrystals,ETO-NCs）,以粒径和PDI为指标对制备工艺和处方进行优化和筛选。制得了均匀分散的类球状依托泊苷纳米晶（173.9 nm,34.6 m V）;与依托泊苷原料药（Etoposide coarse crystals,ETO-CCs）相比,ETO-NCs在各介质中的饱和溶解度和溶出度都显着提升。随后,以薄膜水化-均质法将修饰了TPGS的磷脂双层通过静电吸附作用包裹在带有正电的纳米晶表面,制得依托泊苷的纳米晶脂质口服递送载体（ETO-Lipo@NCs）（220.3 nm,-9.95 m V）。将磷脂双层良好的生物相容性和纳米晶的高载药特性相结合,从而实现更好的口服药物递送,提高BCS-Ⅳ类药物纳米晶被肠道吸收的可能性。通过PXRD,TEM、AFM、CLSM、XPS等对ETO-Lipo@NCs的表面性质和结构特征进行了表征,确认了Lipo@NCs中纳米晶表面磷脂双层的成功包裹。随后对ETO-NCs和ETO-Lipo@NCs的药物释放行为进行了对比,结果显示,与ETO-NCs组快的溶出速率以及高的溶出度相比,ETO-Lipo@NCs组中的药物的释放情况明显下降,总释放百分比降至ETO-NCs组的45.17%。这一结果应证了实验设计时的猜想,对于依托泊苷这类膜通透性很差的BCS-Ⅳ类药物,磷脂双层膜的存在可以减缓纳米晶中的药物释放。使得内水相形成药物的饱和或过饱和溶液,由此作为一个缓冲层,从而抑制包裹在磷脂双层膜内的纳米晶的溶出和整体的药物的释放。而后评价了ETO-Lipo@NCs的肠道吸收能力。原位单向肠灌流实验结果表明Lipo@NCs能显着提高ETO在肠内的渗透性和吸收。此外,值得注意的是ETO-Lipo@NCs的主要吸收部位与ETO溶液组（ETO-Sol）的吸收部位不同,这提示了肠道摄取机制的变化。随后对口服给药ETO-Lipo@NCs后肠道内制剂分布及转移的情况进行了分析,结果显示ETO-Lipo@NCs可以加快纳米晶被小肠摄取并吸收入血的可能性,促进药物更大程度的被吸收进入体循环。以Caco-2细胞为体外模型进行细胞水平的研究,结果显示Lipo@NCs可以显着提高纳米晶的细胞摄取。在给药2 h后,ETO-Lipo@NCs组的药物细胞摄取量是ETO-NCs组的1.72倍。Lipo@NCs还改变了纳米晶的细胞摄取的机制,由摄取抑制实验证明ETO-Lipo@NCs主要是通过小窝蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用被细胞摄取的;而ETO-NCs的胞吞作用则涉及网格蛋白、非网格蛋白-非小窝蛋白介导的内吞作用和巨胞饮等多种途径的参与。此外,细胞器共定位及转运抑制实验的结果表明虽然ETO-NCs和ETO-Lipo@NCs的胞内转运均涉及了溶酶体途径和内质网-高尔基体途径,但磷脂双层的包裹赋予了纳米晶更快的溶酶体逃逸速度和更强的胞内转运能力。最后采取Transwell细胞小室的方式构建了Caco-2细胞单层模型,考察了各ETO制剂在跨膜转运能力上的差别。结果显示与ETO-Sol组和ETO-NCs组相比（2.51×106 cm/s和2.30×106 cm/s）,ETO-Lipo@NCs组显着增加了药物的总跨膜转运量（4.59×106 cm/s）。此外,通过对Caco-2细胞单层的跨膜电阻值（Trans-epithellal electric resistance,TEER）的实时监测排除了NCs和Lipo@NCs通过细胞旁路的运输的可能性。最后对ETO-Lipo@NCs的体内行为进行了系统的研究和评价。体内药动学结果显示,包裹了肠溶材料的依托泊苷纳米晶脂质口服递送载体（ETO-EU@Lipo@NCs）可以显着提高ETO的AUC0-t（1688.56±231.10μg*h/L）,分别是ETO原料药组（ETO-CCs）和ETO-NCs组的10.92倍和1.96倍;口服绝对生物利用度由ETO-CCs的1.38%提高至15.11%。Tmax值也较ETO-NCs组有所延长（1.08±0.50 h vs 0.31±0.13 h）,这提示了ETO-EU@Lipo@NCs具有缓释的体内行为。随后,对各ETO制剂的口服体内抗肿瘤效果进行了评价,结果显示在荷Lewis肺癌细胞（Lewis lung carcinoma,LLC）移植瘤的肺癌小鼠体内,ETO-EU@Lipo@NCs表现出良好的抑制肿瘤的效果,且与其他相关制剂相比,ETO-EU@Lipo@NCs表现出较高的生物安全性,几乎没有肠道刺激。小鼠的组织分布实验也表明口服ETO-EU@Lipo@NCs后在肿瘤组织中存在较高的药物分布,为ETO-NCs组和ETO-Sol组的2倍以上。综上,纳米晶脂质口服递送载体的构建是成功的,磷脂双层包裹纳米晶的壳-核结构可以有效地通过口服吸收将ETO运送至体循环中,从而达到预期的抗肿瘤治疗的效果。
陈锐[3]（2021）在《内质网应激蛋白CHOP通路参与动脉粥样硬化发生发展的机制研究》文中研究指明背景:动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种慢性的炎性病变,其特征是粥样斑块在动脉血管壁的沉积,可引起相应动脉的狭窄,是心肌梗死、卒中等缺血性心脑血管病变的基础。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）是血管壁的重要组成成分之一,主要环形分布于血管壁的中膜内负责血管的收缩,与血管的顺应性及弹性回缩密切相关。VSMCs在整个AS的发展过程中发挥不同的作用。近来的研究发现VSMCs还能向诸如巨噬细胞等不同细胞类型转化,参与血管局部炎症反应及血管钙化。同时VSMCs还可以摄取管壁中沉积的脂质成分后形成泡沫细胞,其凋亡后由于清除的不及时可形成斑块坏死核心。内质网是真核细胞参与蛋白质合成、加工与修饰的重要细胞器,对维持细胞内环境的稳态具有重要意义。在动脉粥样硬化的各种病因刺激下,细胞内质网的蛋白折叠能力不能满足细胞的需求,进而导致未折叠蛋白大量错误折叠,引起未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）,进而引发内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）。CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP）基因的启动子同时包含多个重要ERS相关基因的结合位点,是ERS过程中起关键作用的转录因子。当CHOP蛋白激活时又可发挥自己转录因子的作用调节下游一系列基因的表达影响细胞的凋亡、增殖及自噬等生理功能。已有研究发现在AS进展中CHOP表达显着上升,但其在AS中起的作用及具体的机制尚不清楚。微小RNA（Micro RNA,miRNA）是一类长度一般为18-23个核苷酸的单链非编码RNA分子。其主要通过与靶向的信使RNA的3’非翻译区进行特异性结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC）促进其降解来参与细胞的生理活动。已有相当数量的miRNA被发现与AS的进展有关,其中在高脂饮食中显着上调的miR-208被发现与冠心病密切相关,然而其与动脉粥样硬化的关系仍然不清楚。目的:本研究通过构建小鼠动脉粥样硬化模型及体外血管平滑肌细胞模型验证内质网应激蛋白CHOP表达情况及CHOP/TRIB3/miR-208/TIMP3调控通路在动脉粥样硬化中的作用,为动脉粥样硬化的预防及未来的靶向治疗提供数据支持和理论依据。方法:本研究首先通过对载脂蛋白E（Apolipoprotein E,ApoE）基因缺陷的小鼠行12周高脂饮食喂养诱导小鼠出现动脉粥样硬化。通过油红O染色、苏木素伊红（HE）染色、血清学指标测定及大体解剖等方法对建模进行验证,同时通过检测斑块中的VSMCs及Ⅰ型胶原的含量来评估斑块的稳定性。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,q PCR）、荧光原位杂交、免疫荧光染色等方法验证miR-208在动物模型中的高表达。流式细胞筛选技术分选出ACTA2阳性,TAGLN阳性,PECAM阴性的血管平滑肌细胞,生物信息学方法预测miR-208及TIMP3的相互作用后通过双荧光素酶报告实验进行验证。通过构建一系列慢病毒载体、Antagomir、mirmimics、mir-inhibitor等表达调节因子以干预miR-208及CHOP、TRIB3、TIMP3等目标分子在动物模型和细胞中的表达,并通过q PCR、Western blot对干预效果进行验证。处理成功后通过Ed U细胞增殖实验及划痕实验评估VSMCs增殖和迁移的变化。同时通过大体解剖、病理组织切片、血清学指标水平检测评估不同处理下动物模型AS进展情况,同时检测斑块中VSMCs及Ⅰ型胶原的比例以评估斑块的稳定性。结果:ApoE基因缺陷的小鼠在12周的高脂饮食后发生动脉粥样硬化,AS小鼠的颈动脉壁脂质沉积、受损区域占比、主动脉窦受损面积均显着增加（P<0.01）,AS小鼠的血脂指标与对照组比较存在明显差异（P<0.05）,这些结果表明本研究模型构建成功。进一步检测AS小鼠中miR-208后发现其表达出现显着上升（P<0.05）,且定位与VSMCs标志分子α-SMA基本重合,均位于血管壁内膜。下调miR-208的表达后总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇改善,颈动脉脂质沉积及受损区域显着减少,斑块中的VSMCs及Ⅰ型胶原显着增多提示斑块稳定性提高（P<0.05）。通过流式细胞筛选技术选出ACAT2+,TAGLN+,PECAM-的VSMCs以开展后续的细胞实验。通过双荧光素酶报告实验验证miR-208与TIMP3存在相互靶向关系。进一步上调VSMCs中miR-208的表达后TIMP3的表达受到抑制,同时VSMCs的增殖和迁移能力也得到增强,而这一现象可被过表达的TIMP3所逆转（P<0.05）。QPCR及Western blot检测验证TRIB3在动脉粥样硬化的小鼠和VSMCs中表达均显着提高（P<0.05）,下调其表达后VSMCs的增殖和迁移受到抑制,同时miR-208的表达也显着下降（P<0.05）。抑制TRIB3表达后的小鼠血脂指标、颈动脉脂质沉积、受损区域占比、主动脉窦受损面积均显着下降（P<0.05）。此外,CHOP在疾病动物模型及VSMCs中的表达均显着上调,抑制其表达后可见TRIB3及miR-208的表达相应下降,同时TIMP3的表达上升（P<0.05）。VSMCs的增殖和迁移在下调CHOP后均降低（P<0.05）,这一结果表明下调CHOP表达能够抑制粥样斑块的形成。在抑制CHOP表达后的AS小鼠中,也观察到血脂指标、颈动脉脂质沉积、受损区域占比、主动脉窦受损面积均显着下降（P<0.05）。斑块中α-SMA阳性细胞比例、Ⅰ型胶原占比及TIMP3蛋白含量均显着上升（P<0.05）,这提示斑块在抑制CHOP后变得更加稳定。进一步研究发现抑制CHOP表达后在细胞及动物模型中的改变均被TRIB3的过表达所逆转。结论:本研究结果表明下调CHOP的表达可以延缓动脉粥样硬化的进展,增强粥样斑块的稳定性,同时也抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移;进一步验证后发现这一系列的调控作用部分是通过下调TRIB3依赖的miR-208的表达进而解除miR-208对TIMP3表达的抑制作用实现的。本研究首次探讨CHOP/TRIB3/miR-208/TIMP3通路参与动脉粥样硬化发生发展的机制,这一通路在体内外实验均得到证实,其可能成为动脉粥样硬化治疗的新的靶点。
曹丽华[4]（2021）在《ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达与功能研究》文中认为闭锁小带蛋白（ZO）-1和ZO-2（ZO-1/2）,又称为紧密连接蛋白（TJP）-1和TJP2,属于膜相关鸟苷酸激酶（MAGUKs）家族,参与上皮细胞极性维持、基因转录、细胞增殖和肿瘤细胞转移等生物学过程。小鼠的研究发现,下调ZO-1/2表达对早期胚胎发育不利,表明两者参与胚胎发育调控,但ZO-1/2在家畜的研究较少,特别是在家畜卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达和功能尚不清楚。为此,本研究以猪为研究对象,研究ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达模式,并通过正负调控其表达的方式,探讨它们在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的作用及分子机制。研究结果可丰富对ZO-1/2生物学功能的认识,同时为阐明家畜卵泡发育和卵母细胞成熟的分子机理提供依据。1、ZO-1/2在不同大小猪卵泡中的表达水平及对颗粒细胞增殖的影响实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot（WB）分析ZO-1/2在猪胎儿各组织的表达结果显示,ZO-1/2在猪胰腺、大脑、心、肝、肺、肾、膀胱、小肠、卵巢和睾丸组织均有表达,两者在睾丸组织中的表达均显着高于卵巢组织（P<0.05）。不同直径猪卵泡中ZO-1/2的表达分析结果显示,它们在不同大小卵泡中均有表达,且RNA和蛋白水平表达趋势一致。ZO-1在小卵泡（<2 mm）颗粒细胞中的表达显着高于大卵泡（5～8 mm）（P<0.05）,ZO-2在小卵泡颗粒细胞中的表达显着高于健康中卵泡（3～5 mm）和大卵泡（P<0.05）。ZO-1/2在闭锁卵泡颗粒细胞中的表达均显着高于健康的中卵泡和大卵泡（P<0.05）,与小卵泡无显着差异（P>0.05）。ZO-1/2在卵丘卵母细胞复合体（COCs）中的表达均显着高于同等大小卵泡中颗粒细胞的表达（P<0.05）,它们在小卵泡COCs中的表达显着高于中卵泡和大卵泡,在闭锁卵泡COCs中的表达显着高于健康卵泡（P<0.05）。构建猪ZO-1/2的慢病毒表达载体,探讨过表达ZO-1/2对猪颗粒细胞增殖以及细胞周期和凋亡相关基因表达的影响。结果发现,过表达ZO-1或ZO-2均显着抑制颗粒细胞增殖（P<0.05）。上调ZO-1表达颗粒细胞的Occludin表达增加（P<0.05）,Cyclin A2和Cyclin B的表达降低（P<0.05）,Cyclin D1表达没有显着变化（P>0.05）。上调ZO-2表达颗粒细胞中Cyclin A2和Cyclin D1的表达显着降低（P<0.05）,Cyclin B和Occludin的表达变化不大（P>0.05）。过表达ZO-1/2不影响颗粒细胞中Bcl-2和Bax的表达（P>0.05）,而Caspase3和Caspase9表达显着上调（P<0.05）。2、ZO-1/2在猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育过程中的功能研究qRT-PCR和WB方法分析ZO-1/2在猪卵母细胞体外成熟（IVM）和早期胚胎发育过程中的表达模式,结果显示,ZO-1/2在卵丘细胞、卵母细胞和早期胚胎中均有表达,ZO-1α+仅在卵丘细胞、桑葚胚和囊胚表达。ZO-1/2在生发泡（GV）期卵母细胞中的表达极显着高于卵丘细胞（P<0.01）,它们在GV期COCs中RNA表达水平最高,在体外成熟18 h时蛋白表达水平最高。筛选有效干扰ZO-1/2的sh RNA片段,构建慢病毒表达载体,研究下调ZO-1/2表达对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。QRT-PCR结果显示,成熟液中添加ZO-1/2 sh RNA慢病毒显着降低了MII期卵母细胞、卵丘细胞以及囊胚中内源性ZO-1/2的表达（P<0.05）。与未处理组相比,ZO-1sh RNA1、ZO-2sh RNA2慢病毒单独感染或二者联合感染均不影响卵丘细胞扩展、卵母细胞核成熟以及孤雌胚胎卵裂率（P>0.05）;ZO-2sh RNA2感染显着抑制了卵母细胞皮质颗粒迁移（P<0.05）,ZO-1sh RNA1没有显着影响（P>0.05）。下调ZO-1表达降低了孤雌胚胎的囊胚率（P<0.05）,下调ZO-2表达未产生显着影响（P>0.05）;下调ZO-1/2表达均降低了囊胚总细胞数（P<0.05）。下调ZO-1/2表达抑制了成熟后卵丘细胞中Cx43、Cx45、PTX3和PTGS2,卵母细胞中Cx45、BMP15、ZP3和C-kit的表达,以及囊胚中Nanog的表达（P<0.05）,不影响卵丘细胞中HAS2和囊胚中Oct4的表达（P>0.05）。3、猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中ZO-1/2的调控机制研究首先,通过qRT-PCR或WB方法分析了PMSG/h CG、MG132对ZO-1/2表达的影响。结果显示,成熟培养液中所含的PMSG/h CG不影响ZO-1/2的表达（P>0.05）,添加5μM MG132显着上调体外成熟22 h时ZO-1/2的RNA和蛋白表达水平（P<0.05）。其次,探讨了雌二醇（E2）对猪卵母细胞体外成熟、ZO-1/2及缝隙连接的影响。结果显示,低浓度E2不影响猪卵母细胞核成熟（P>0.05）,当浓度大于100μM时卵母细胞核成熟受到显着抑制（P<0.05）。钙黄绿素红染色结果显示,E2处理促进了体外成熟24 h时的细胞间缝隙连接通讯（GJIC）。QRT-PCR结果显示,E2处理显着上调了体外成熟24 h时COCs中Cx43、Cx45、ZO-1和ZO-2的表达（P<0.05）,但不影响它们在卵母细胞中的表达（P>0.05）。最后,研究了E2对体外培养猪颗粒细胞增殖及ZO-1/2表达的影响。结果显示,当E2处理浓度大于50μM时,颗粒细胞增殖速度显着下降（P<0.05）,而雌激素受体拮抗剂ICI182780处理没有显着影响（P>0.05）。在含10%FBS的培养条件下,E2浓度为10μM时能显着下调颗粒细胞中ZO-1/2的表达,浓度为100μM时显着上调ZO-1/2的表达（P<0.05）;100μM ICI182780和100μM E2联合处理不影响颗粒细胞中ZO-1/2的表达（P>0.05）。以上结果表明:（1）ZO-1和ZO-2在猪卵泡中的表达均呈现随直径增大而降低的趋势,且闭锁卵泡中ZO-1/2表达高于健康卵泡;（2）过表达ZO-1/2抑制颗粒细胞增殖,下调细胞周期相关基因并上调凋亡相关基因的表达;（3）ZO-1和ZO-2在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达模式相似,ZO-1/2表达会降低猪卵母细胞成熟和早期胚胎发育效率;（4）ZO-1/2的表达在猪卵母细胞成熟过程中受泛素-蛋白酶体通路和雌激素的调控。
方佳成[5]（2021）在《泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用》文中认为癌症已经成为危害人类健康的主要疾病,据世卫组织国际癌症研究机构数据显示,2020年,全球男性和女性将合计出现约1930万和1000万的新发病例和癌症死亡病例,其中的1800万例和930万例将来自实体瘤。然而,对肿瘤治疗的系统评估数据显示,欧洲药物管理局在2009-2013年度批准的大多数抗癌药物未能对患者的整体生命质量产生重大改善。因此,需要继续提高抗肿瘤药物的临床疗效。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法是发展迅速的肿瘤靶向治疗技术,它们通过特异性识别在恶性细胞和正常组织细胞之间差异过表达的靶标抗原,达到辨识肿瘤和消融肿瘤的目的。ADC和CAR-T实现安全性与有效性的关键,在于其所识别的靶标抗原是否具备足够的肿瘤特异性。因而,鉴别出理想的靶标抗原至关重要。理想的靶标抗原由恶性细胞特异性表达,然而肿瘤特异性抗原屈指可数。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上表达升高,在正常细胞上限制性表达,这一特性使得它们亦能够作为有效定位恶性肿瘤的靶标分子。目的:以发现理想的肿瘤相关抗原为出发点,着力于打造肿瘤相关抗原发现新平台,构建全面的泛实体瘤肿瘤相关抗原图谱,为癌症研究人员和广泛的科学与医药界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用经统一处理的TCGA和GTEx的RNA序列数据,对19种类型实体瘤中的20242个HUGO基因进行差异分析;通过将阈值设置为Benjamini-Hochberg adjusted p值为0.01,log2Fold Change为1.0,保留那些在肿瘤细胞群中显着差异表达的HUGO基因;结合蛋白质亚细胞定位信息,排除不具备胞外结构域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表达信息和HPA和HPM的蛋白质丰度信息的数据集,获取在正常组织中受限表达的蛋白分子;使用公开的Blood Spot平台,发现那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表达的蛋白分子。2.将RNA测序的读段计数数据转换为TPM格式,并将每个基因在其配对适应症和正常组织中的TPM值作为差异表达分析的输入数据。采用非参数Mann-Whitney U检验分析,计算并绘制每个候选靶标分子在特定适应症中的表达相比其在各个人体正常组织中的表达的差异表达谱。3.提取并整理TCGA中泛癌表型数据中的癌组织学分级,病理分级和TNM分期信息;通过挖掘MC3（“多中心多癌种突变识别”）TCGA MAF（“突变注释格式”）数据,确定靶标基因的非沉默体细胞突变（SNP和INDEL）。结合m RNA表达数据,汇编用于评价靶标基因的异质表达模式的综合数据集。4.从TCGA下载并提取靶标基因组变异数据,从Onco KB收集致癌或功能性基因组变异信息,注释并统计靶标基因的变异类型及发生频率,确定在临床上有应用价值的携带特异性驱动变异的功能性靶标。5.通过杂交瘤技术制备CDH17特异性单克隆抗体,进而运用流式细胞术、过表达共定位分析、结合亲和力检测、抗体测序和可变区序列进化关系分析等,多重表征抗体的各项指标。通过偶联mc-Val Cit PABC-MMAE,制备CDH17靶向型ADC。结合体外杀伤实验与细胞内化评估,完成效应分子的初筛验证。6.通过构建KM12SM和COLO205结肠癌细胞系CDX动物模型,综合评估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的体内抗肿瘤活性。通过制备和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子,并对给药的荷瘤小鼠的心/肺/肝/肾/结肠/直肠/脾脏进行HE染色,评估CDH17靶向型ADC对小鼠的组织毒性。7.通过慢病毒载体感染CD3+T细胞,制备LYPD3靶向型CAR-T细胞。通过对CAR-T细胞进行分化检测,确定其向效应细胞持续分化的能力。通过体外细胞杀伤实验和细胞因子分泌检测,研究LYPD3靶向型CAR-T细胞对肿瘤细胞的的特异性杀伤作用。通过对荷瘤小鼠循环血中的CAR-T细胞进行计数和检测肿瘤组织中的T细胞浸润水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T细胞在小鼠体内发挥持久抗肿瘤作用的机制。结果:1.开发专门的算法和汇编整合有泛实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组信息的综合数据集。2.系统地识别肿瘤相关抗原。通过我们的肿瘤相关抗原发现平台,筛选得到75个潜在的肿瘤相关抗原分子。特别是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做进一步的临床前研究。3.基于CDH17蛋白定向开发的ADC分子可以在体内显着消融KM12SM和COLO205异种移植瘤,并对高表达CDH17蛋白的结肠癌病人来源的异种移植瘤表现出一定的肿瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在体外对高药敏度的COLO205显示高水平的细胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE对COLO205的抑瘤水平相当（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。两次单药静脉注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以剂量依赖性的方式抑制KM12SM在小鼠体内的生长,但无法完全清除肿瘤。在COLO205 CDX模型中,按同样的给药方式静注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg剂量的第一针治疗可以起到平缓异种移植肿瘤增长的效果,且两周后的第二针治疗亦能继续起到溶瘤效果;3 mg/kg的中剂量治疗组有部分小鼠的肿瘤在后期出现反弹;6 mg/kg的高剂量治疗可以根治异种移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠体内具有相对可控的组织毒性。制备了能和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子677-MMAE,观察到在677-MMAE给药组小鼠的结直肠的局部组织中有炎症反应,聚集了大量的淋巴细胞;但在其它组织中没有出现炎症反应。此外,在观察期内,小鼠对chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的体内耐受良好,用药期间未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。5.LYPD3靶向型CAR-T细胞能够在小鼠体内对PC9异种移植肿瘤发挥持久的抗肿瘤作用。且小鼠对LYPD3-CAR-T的耐受良好,在观察期内未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。进一步调查发现,LYPD3-CAR-T细胞不仅在小鼠外周血中大量存在,还在高响应LYPD3-CAR-T治疗的PC9异种移植瘤组织中大量浸润。此外,LYPD3-CAR-T治疗组的小鼠脾脏内出现大量CD3+T细胞,但在对照组中却没有。CAR-T细胞的记忆表型对于激发持久的免疫应答至关重要。数据显示,LYPD3-CAR-T细胞在输注前,其中的Tn/Tscm细胞和Tcm细胞比例分别高达52.4%和21.7%,具有良好的向效应细胞分化的潜能。结论:通过开发肿瘤相关抗原识别算法和整合来自19种实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组数据,完成了泛实体瘤相关抗原的探索。通过考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T细胞在模型小鼠中的抗肿瘤活性,例证了CDH17和LYPD3蛋白分别作为ADC和CAR-T靶标开发的可行性。
高文双[6]（2021）在《DOK3通过与GPR84相互作用参与小胶质细胞介导的神经病理性疼痛》文中指出研究背景神经病理性疼痛（Neuropathic Pain,NP）为一难治的临床问题,也是世界性的公共健康问题。它是由于躯体感觉系统的疾病或异常导致的疼痛,它反映了神经系统的异常兴奋性,并存在多种解剖和功能的改变。不同于只伴随伤害性刺激存在而存在的生理性疼痛,神经病理性疼痛可对正常无害刺激表现为自发性疼痛和痛觉过敏。既往研究表明神经病理性疼痛的机制非常复杂,涉及到整个躯体疼痛感受通路:从周围神经损伤到背根神经节神经元兴奋性增加,再到脊髓和大脑神经通路的改变,可贯穿整个神经系统。神经病理性疼痛的发病机制不仅是神经元结构和功能的改变,还是卫星细胞、雪旺细胞、外周的免疫系统、星形胶质细胞、脊髓小胶质细胞和多种细胞组成部分共同参与形成的结果。在中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）中,小胶质细胞作为脊髓的常驻巨噬细胞,起源于卵黄囊原始巨噬细胞。这些细胞广泛分布于整个中枢神经系统中,时刻监测局部环境的变化,以便对各种有害刺激做出快速的免疫应答,介导炎症反应。既往研究表明在神经病理性疼痛的发展过程中,小胶质细胞中的各种炎症因子受IFN-y/IFN-γ受体系统、Toll 2/ToIl 3/Toll 4样受体、嘌呤P2X4受体以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的调节。此外,在机械痛觉过敏的发展过程中,小胶质细胞在与邻近神经元的信息传递中发挥了关键作用。因此,脊髓小胶质细胞是逆转神经系统功能紊乱的一个潜在的治疗靶点,因此,探究小胶质细胞中分子的功能对揭示神经病理性疼痛及痛觉过敏的潜在机制和寻找治疗神经病理性疼痛的新方法、新思路是至关重要的。适配器分子作为分子支架精确地组织效应器蛋白相互结合形成信号复合体。已知的DOK3（Downstream of Kinase-3）是一个典型的适配器分子,为DOK家族的成员之一,主要表达于免疫细胞中,如巨噬细胞、B细胞以及浆细胞。越来越多的研究表明DOK3主要涉及免疫信号通路的负反馈调控,并参与促进或维持免疫细胞中抑制性因子的激活。既往研究表明,抑制DOK3的表达可增加巨噬细胞中维生素B6的抗炎作用,并且在TLR9信号通路中,DOK3的降解增加了巨噬细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的产生。然而,有趣的是,对于适配器蛋白在细胞内信号通路中扮演的促进或抑制角色仍然存在争议。一个典型的例子为突触相关蛋白（Synapse-Associated Proteins,SAP）,其在不同的信号通路中主要发挥促进或抑制作用主要取决于激活的不同的信号通路及细胞类型。据文献报道,适配器蛋白DOK3在B细胞的演变进化过程中起着重要作用,在DOK3-/-小鼠中,浆细胞的产生明显减弱;流感病毒感染DOK3缺陷的巨噬细胞,IFN-β的合成明显受限;此外,DOK3在巨噬细胞TLR3信号的转导中也起着关键作用。总的来说,尽管这些结果是非常可信的,但其在理论上存在一定的矛盾,因此,需要进一步的研究来阐释适配器蛋白分子DOK3的双向作用机制。既往研究表明G蛋白偶联受体（G-Protein Coupled Receptors,GPCRs）为一种七次跨膜、与G蛋白偶联参与细胞内信号转导的膜受体,研究表明人体中存在近一千余种不同的G蛋白偶联受体,可被炎症介质、神经递质、肽类、细胞因子等配体激活,参与各种信息传递过程,如细胞代谢、神经传递、免疫炎症反应的调控等,其异常激活或抑制与多种疾病的发生密切相关,并且还参与神经病理性疼痛及痛敏的形成。研究表明GPR84作为G蛋白偶联受体,病理条件下,在巨噬细胞和小胶质细胞中的表达显着上调,介导神经病理性疼痛和炎症介质的产生和维持,并且,在内毒素血症或多发性硬化症小鼠模型中,小胶质细胞以强烈、持续的方式表达GPR84。因此,GPR84是介导炎症相关疾病的有效靶点。了解抑制炎症反应及信号传递的机制对治疗神经病理性疼痛及炎症反应非常重要,因为神经损伤与炎症反应可导致严重的神经病理性疼痛及痛觉过敏等问题。尽管DOK3在巨噬细胞、B细胞等的作用已有广泛研究,但DOK3在小胶质细胞中扮演的角色及DOK3与GPR84蛋白之间的相互作用关系目前尚不清楚。基于以上研究背景,本研究对DOK3和GPR84在小胶质细胞介导的神经病理性疼痛和炎症反应及其相互作用机制进行探讨,可为神经性疼痛的临床治疗提供新的靶点及思路。第一部分DOK3通过与GPR84相互结合参与小胶质细胞介导的炎症反应研究目的1.明确DOK3在小胶质细胞介导的炎症反应中的表达变化及其作用。2.探究DOK3是否参与介导GPR84激活诱导的小胶质细胞的炎症反应。3.验证DOK3与GPR84在小胶质细胞中的相互作用关系。研究方法1.用干扰DOK3表达的慢病毒序列转染小胶质细胞,建立稳定的DOK3敲减细胞系。通过免疫印迹和实时荧光定量PCR分析确定转染成功率及敲除效率。2.实时荧光定量PCR检测DOK3下调组较正常对照组小胶质细胞DOK3,TNF-α,IL-1β,IL-6,iNOS,P38,CD68,CD11B,Argl 和 CD206 mRNA 水平的表达变化。3.不同浓度的GPR84激动剂（6-OAU）孵育小胶质细胞120分钟,实时荧光定量PCR检测不同刺激浓度下DOK3 mRNA水平的变化。应用Western Blot免疫印迹检测DOK3,p-p38和Iba-1蛋白水平的变化。4.6-OAU分别孵育DOK3下调组与正常对照组小胶质细胞,实时荧光定量PCR检测TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA水平的变化。5.脂多糖（LPS）刺激小胶质细胞4小时和8小时,荧光共聚焦分析检测GPR84和DOK3蛋白水平的变化。6-OAU刺激小胶质细胞1小时和2小时,荧光共聚焦分析检测GPR84和DOK3蛋白水平的变化。6.LPS孵育小胶质细胞4小时,通过免疫共沉淀分析DOK3与GPR84的蛋白免疫印迹,探究DOK3与GPR84蛋白相互作用关系。7.重组GST和GST-DOK3纯合蛋白分别与小胶质细胞裂解液孵育2小时。应用GST-pulldown实验检测GPR84,确定GPR84的蛋白水平,验证DOK3与GPR84是否存在物理性结合。研究结果1.干扰DOK3表达的慢病毒序列有效下调小胶质细胞内DOK3的水平设计靶向下调DOK3 mRNA的慢病毒序列#1、#2、#3,Western Blot与实时荧光定量PCR分析检测DOK3蛋白与RNA水平的变化。与对照组病毒序列相比较,转染慢病毒序列#3使DOK3蛋白与mRNA水平下调最明显,DOK3 mRNA水平下降约50%。因此,后续实验采用序列#3转染小胶质细胞下调DOK3水平的表达。2.DOK3敲减导致小胶质细胞炎症因子释放减少。干扰DOK3表达的慢病毒序列转染小胶质细胞,实时荧光定量PCR分析检测小胶质细胞内炎症及致痛因子的表达水平。研究表明,DOK3敲减组较对照组小胶质细胞内TNF-α,IL-1β,IL-6,P38,iNOS和CD68等炎症介质的水平明显下调;相反,小胶质细胞抗炎标记物Argl和CD206的水平则明显升高。3.DOK3参与GPR84激活诱导的炎症反应浓度为1μM的GPR84激动剂（6-OAU）孵育小胶质细胞,时间依赖性地增加DOK3 mRNA的表达水平,同时6-OAU以不同浓度孵育小胶质细胞60分钟,DOK3的表达水平呈浓度依赖性地增加。6-OAU孵育小胶质细胞,p-p38和Iba-1的蛋白水平随DOK3蛋白水平的增加而增加,这与炎症因子IL-1β,TNF-α及IL-6的水平增加相对应。6-OAU孵育小胶质细胞诱导GPR84的激活,DOK3敲减组较对照组合成炎症介质TNF-α IL-1β和IL-6的能力显着减弱,TNF-α（对照组,2.3倍;DOK3敲减组,1.25倍）;IL-1β（对照组,1.45倍;DOK3敲减组,1.4倍）;IL-6（对照组,1.65倍;DOK3敲减组,1.2倍）;而且,6-OAU增加了 DOK3 mRNA的水平,但两组GPR84蛋白自身表达无明显变化。4.用LPS或GPR84激动剂孵育小胶质细胞可诱导DOK3和GPR84相互结合LPS刺激小胶质细胞,使DOK3由细胞质转移到细胞膜上发挥作用。LPS刺激使小胶质细胞活力降低,并迅速升高TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA水平,降低 Arg1 的表达。用LPS刺激小胶质细胞0,4或8小时,LPS处理组较对照组GPR84和DOK3的荧光强度在小胶质细胞膜上显着增强。此外,GPR84和DOK3共定位于小胶质细胞膜,且合并荧光强度在LPS刺激下逐渐增强。此外,用6-OAU孵育小胶质细胞1或2小时,荧光共聚焦分析表明6-OAU处理组较对照组中DOK3和GPR84的合并荧光强度在细胞膜上亦明显增强。用LPS刺激小胶质细胞4小时,用抗DOK3的抗体进行免疫共沉淀,用抗GPR84的抗体进行免疫印迹分析。Western Blot分析表明,无论是生理还是LPS刺激条件下,GPR84都与DOK3存在相互结合。应用GST-DOK3融合蛋白进行GST pull-down实验分析,经LPS刺激后的小胶质细胞裂解液中,GST-DOK3组有明显的GPR84免疫印迹,而纯合GST蛋白对照组则未检测到GPR84免疫印迹的存在。研究结论GPR84激动剂和LPS可有效诱导小胶质细胞的炎症反应,导致DOK3水平的增加,并伴随炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6及小胶质细胞炎症标记物Iba-1的表达上调。在DOK3敲减的情况下,小胶质细胞对炎性刺激的反应显着受损。炎症状态下,DOK3从细胞质转移到细胞膜上,通过与GPR84相互结合形成信号复合体,参与GPR84的信号通路传导,从而介导小胶质细胞的免疫反应。第二部分D0K3通过与GPR84相互作用参与脊髓小胶质细胞介导的神经病理性疼痛研究目的1.明确DOK3在CCI诱导的小鼠神经病理性疼痛中的作用。2.探究DOK3对GPR84激活诱导的小鼠脊髓炎症反应的影响。3.探究普瑞巴林是否通过抑制DOK3表达来缓解神经病理性疼痛及炎症反应的发展。研究方法1.慢性压迫野生型和DOK3-/-小鼠坐骨神经以建立CCI模型。通过测量机械缩爪阈值及热痛阈值,检测小鼠CCI术后0,3,7,14,21天的机械痛阈和热痛阈变化。2.通过实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓中DOK3,TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA的水平变化。3.应用免疫荧光染色检测小鼠脊髓组织中Iba-1,p-p38和GPR84蛋白水平的变化。通过Western Blot免疫印迹分析检测DOK3蛋白水平的变化。4.野生型和DOK3-/-小鼠鞘内注射6-OAU以诱导脊髓中GPR84的激活,分别于0,1,2,4小时测量机械缩爪阈值,并检测鞘注2小时后DOK3,TNF-α,IL-1β和IL-6的水平变化。5.野生型小鼠连续3天鞘内注射DOK3 cDNA质粒以增强脊髓中DOK3 水平的表达,与此同时,持续2周普瑞巴林胃内给药,分别于0,3,7,14天测量机械缩爪阈值及炎症因子变化。研究结果1.CCI模型诱导DOK3-/-小鼠产生的神经病理性疼痛及炎症反应较野生型小鼠明显减轻与假手术组相比,CCI术后3-21天,野生型小鼠机械痛阈值显着下降,这表明CCI模型的成功建立。虽然DOK3-/-小鼠表现出与野生型小鼠相同的正常机械疼痛阈值及热痛阈值,但CCI术后,与野生型小鼠相比,DOK3-/-小鼠的机械触摸痛及热痛觉敏感明显减轻。CCI术后野生型小鼠DOK3 mRNA的水平明显增加,DOK3-/-小鼠无DOK3 mRNA的表达。野生型和DOK3-/-小鼠较各自假手术组小鼠脊髓中TNF-α mRNA水平分别增加2.2和1.47倍,IL-1β mRNA水平分别增加1.81和1.37倍,IL-6 mRNA水平分别增加1.65和1.64倍。除IL-6,两基因型间差异均有统计学意义。此外,在DOK3-/-小鼠中,CCI诱导的GPR84和CD11B mRNA水平的上调被显着抑制,而Arg1水平则无明显变化。免疫荧光分析显示,CCI手术后,野生型和DOK3-/-小鼠脊髓中Iba-1、p-p38和GPR84的水平明显升高,但在DOK3-/-小鼠中,CCI术后,Iba-1、p-p38和GPR84水平的升高明显受到抑制。2.GPR84激活诱导的DOK3-/-小鼠的机械痛阈较野生型小鼠明显减轻,炎症反应能力明显受损鞘内注射6-OAU后,野生型与DOK3-/-小鼠机械痛阈值皆明显下降,然而,鞘注后2小时和4小时,两基因型间有明显差异。鞘内注射6-OAU 2小时后,DOK3 mRNA水平显着升高,小鼠脊髓的免疫印迹检测分析进一步证实了这一结果。此外,鞘内注射6-OAU后,野生型与DOK3-/-小鼠脊髓中IL-1β mRNA水平较各自对照组分别升高2.8倍和1.65倍;TNF-α mRNA水平分别升高4.0倍和1.79倍;IL-6 mRNA水平分别升高1.9倍和1.4倍。免疫荧光分析表明,GPR84激活后,野生型与DOK3-/-小鼠中CD11B水平升高,然而,在DOK3-/-小鼠中,GPR84激活前后,CD11B水平增加较野生型小鼠明显减弱,这与其mRNA水平变化相一致。而且,免疫荧光分析表明DOK3主要表达于小鼠脊髓小胶质细胞中,并且DOK3与GPR84在脊髓小胶质细胞中共定位存在。3.应用普瑞巴林可减轻DOK3表达增强诱导的神经病理性疼痛和炎症反应野生型小鼠鞘内注射DOK3 cDNA质粒,以上调DOK3水平的表达。在第3-7天机械痛阈明显下降,于第14天恢复至基础水平。与对照组小鼠相比,普瑞巴林能有效缓解DOK3高表达诱导的痛觉过敏,在第7天时有统计学意义。免疫组织化学和PCR分析显示DOK3在脊髓中表达明显增加,这表明了 DOK3 cDNA质粒的有效性。我们还发现,DOK3高表达可激活脊髓中小胶质细胞,小胶质细胞标记物Iba-1明显上调,但未观察到星形胶质细胞的激活,星形细胞标记物GFAP无明显变化。与升高的DOK3水平相一致,TNF-α（2.72倍）、IL-1β（3.46倍）和IL-6（7.69倍）的水平明显高于对照组小鼠,CD11B亦有同样的变化。与对照组相比,应用普瑞巴林显着降低了 DOK3 mRNA的表达,并伴随IL-1β降低了 41%,TNF-α降低了 33%,IL-6降低了 35%。进一步的实验表明,普瑞巴林能有效抑制脂多糖诱导小胶质细胞中DOK3水平的升高,进一步证实了在小胶质细胞中,普瑞巴林对DOK3表达的影响。然而,普瑞巴林对BV2小胶质细胞中DOK3的基础水平无明显作用。研究结论CCI诱导DOK3-/-小鼠产生的神经病理性疼痛及炎症反应较对照组小鼠明显减轻,GPR84激活诱导的DOK3-/-小鼠的机械触摸痛和炎症因子释放较对照组明显减弱;应用普瑞巴林通过降低DOK3的表达水平,缓解神经病理性疼痛。DOK3在参与GPR84通路介导的小胶质细胞激活诱导的神经病理性疼痛和炎症反应中发挥积极作用。普瑞巴林有效缓解神经病理性疼痛,其潜在机制可能是通过抑制DOK3的水平或GPR84信号通路实现的。
黄泽健[7]（2021）在《针对肿瘤微环境氧化还原异质性构筑刺激响应超分子纳米前药诊疗体系》文中研究表明现如今,与癌症相关的疾病,其死亡率仍然很高。化学疗法是目前临床上用来治疗癌症最重要的方法之一,但是这种治疗手段仍然存在很多缺陷,如非特异性选择、生物利用度差和肿瘤中低积累等。因此,如何提高药物在肿瘤部位的富集是急需解决的问题。目前研究较多的是利用聚合物载体物理包裹的方式来递送药物,但在这种方式中载体几乎没有治疗效果,并且有些载体的载药能力很低。因此,本文将亲水性荧光探针罗丹明和疏水药物喜树碱通过二硫键连接,设计出了一种不需要借助任何载体的超分子纳米前药,可以自行表现出纳米级特性。与游离药物相比,其在血液中具有更长的滞留时间,有助于药物在肿瘤组织中积累并进一步被细胞摄取。荧光探针的引入使前药分子具有诊断治疗一体化的效果,可以对药物在体内的运输进行示踪并对药物的释放进行实时监测。肿瘤微环境具有细胞异质性,其过氧化氢和谷胱甘肽含量显着高于正常细胞。由于二硫键可以通过氧化还原裂解,因此当超分子前药通过被动靶向进入肿瘤部位后,可以迅速释放出抗肿瘤药物,从而对肿瘤细胞造成杀伤,表现出其良好的抗肿瘤效果。
何秋瑞[8]（2021）在《三烯霉素A抗胰腺癌的功能和作用机制研究》文中研究说明胰腺癌是一种诊断和治疗都很困难的恶性程度极高的消化系统肿瘤。胰腺癌发病的早期,没有显着特异性症状表现。大多数胰腺癌患者就诊时,已经发展到中晚期。所以预后极差,发病人数与死亡人数接近。随着生活节奏加快和人口老龄化加剧,我国胰腺癌的发病率和死亡率持续升高,严重损害人民的身心健康。药物治疗是晚期胰腺癌的主要治疗手段。但是,传统化疗药物在晚期胰腺癌治疗中疗效非常有限,且毒副作用较大。靶向药物比传统细胞毒性药物具有更多的优势。因此,寻找新型高效低毒的胰腺癌靶向治疗药物迫在眉睫。信号转导与转录激活因子-3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3）是一种癌基因编码的转录因子,与恶性肿瘤关系非常密切。STAT3在胰腺癌中高度表达并且异常活化。异常活化的STAT3分别存在于胰腺腺泡导管化生、胰腺上皮内瘤变以及各期胰腺癌进展过程中。异常活化的STAT3可以通过调控相关蛋白的过表达,促进胰腺癌细胞的增殖、抗凋亡、侵袭、转移、血管新生以及免疫逃逸等,进一步促进胰腺癌的发生和发展。抑制异常活化的STAT3,上述病理进展过程均被显着抑制。总之,STAT3在胰腺癌起始和转移过程中具有关键性作用,阻断STAT3信号通路可以显着抑制胰腺癌发生和发展。因此,抑制STAT3异常活化是一个治疗胰腺癌有前途的策略。然而,STAT3抑制剂大多效果欠佳且均无上市。因此,发现具有我国自主知识产权的新型STAT3抑制剂具有重要科学意义和应用前景。天然产物是一个抗肿瘤药物研发的巨大宝库。为了筛选能够抑制STAT3转录活性的抗胰腺癌天然化合物,我们通过基于细胞的高通量筛选模型（胰腺癌细胞增殖实验&STAT3双荧光素酶报告基因实验）,对本课题组天然产物化合物库进行高通量筛选,首次发现了一种能够显着抑制STAT3转录活性的抗胰腺癌天然化合物三烯霉素A（Trienomycin A,TA）。该化合物在体外具有显着抗胰腺癌的活性,但具体分子机制不明。主要的研究结果如下:1.通过对天然产物化合物库进行抗胰腺癌细胞增殖和STAT3双荧光素酶报告基因高通量筛选,获得了先导化合物TA。在高通量筛选过程中,我们发现TA既可以有效抑制胰腺癌的细胞增殖,也可以显着抑制STAT3的转录活性。分子对接结果显示,TA与STAT3理论上可以稳定结合。SPR实验结果表明,TA及其类似物可以与STAT3有效结合,亲和力KD值在4.42μM-18.00μM之间。综合考虑,我们选择TA作为先导化合物,进行抗胰腺癌活性和分子机制的研究。2.TA通过STAT3信号通路抑制胰腺癌细胞增殖、生长、迁移及侵袭。细胞增殖和克隆形成实验结果显示,TA显着抑制胰腺癌细胞的增殖和生长。Transwell小室和细胞划痕实验表明,TA显着抑制胰腺癌细胞的迁移和入侵。细胞凋亡和细胞周期结果显示,TA阻滞细胞周期于S期而不诱导细胞凋亡。免疫荧光、核质分离和Western blot结果表明,TA显着抑制STAT3的磷酸化、核转移和下游基因的蛋白表达。3.TA通过STAT3信号通路抑制体内胰腺癌的生长。皮下荷瘤实验结果表明,TA显着抑制体内胰腺癌的生长。免疫组化实验表明,TA显着抑制肿瘤增殖相关因子Ki67和PCNA表达。H&E染色结果发现,TA对小鼠正常组织没有明显的毒性作用。免疫荧光结果显示,TA抑制体内STAT3的磷酸化。QPCR实验表明,TA抑制体内STAT3下游基因的m RNA表达。Western blot结果发现,TA抑制体内STAT3下游基因的蛋白表达。4.TA抗胰腺癌的分子机制阐释及其药代动力学评价。Western blot结果显示,TA显着抑制JAK/STAT信号通路相关蛋白的磷酸化。RNA-seq实验表明,TA显着调控癌症相关基因的差异性表达。生物信息学分析发现,TA显着性调控关键的生物学过程和异常活化的信号通路包括:JAK/STAT信号通路等。此外,药代动力学评价结果发现,TA具备一定的成药潜力,其水溶性有待于进一步改善。综上所述,天然化合物TA作为潜在治疗胰腺癌的新型STAT3信号通路抑制剂,值得进一步研究。
李家国[9]（2021）在《具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的设计、合成及生物活性研究》文中研究指明抗体偶联药物（Antibody-drug conjugate,ADC）现已成为抗肿瘤药物研发的热点方向,为肿瘤治疗开启了新的篇章。此类药物是由抗体,连接子和细胞毒素三个组分组成的有机整体,利用抗体的靶向性将小分子细胞毒素递送至靶组织并释放,从而有效地杀灭肿瘤细胞,实现了抗体和小分子化学药物优势的强强联合。目前,全球已先后批准了6个ADC药物上市。ADC概念虽简单,但理想的ADC设计却十分复杂,各组分的变化均可能对其整体造成影响。ADC的进一步发展依旧存在诸多挑战:（1）当前以一甲基澳瑞他汀E（Monomethyl Auristatin E,MMAE）为毒素的ADC所使用的抗体均为非免疫型抗体,较为单一。其设计理念主要是利用抗体的靶向性将细胞毒素递送至肿瘤部位。但尚未充分考虑如何协同发挥抗体的其他治疗作用;（2）传统的ADC连接子设计策略仅考虑到两点,其一保证连接子结构在血液中的稳定性。其二,连接子在肿瘤组织中依赖酶及其他因素降解释放药物。但这些释药酶及其他因素往往也存在于正常组织中,会使ADC产生非特异性释药问题;（3）ADC对细胞毒素要求较高,往往需要有效浓度在皮摩尔级别,仅有少部分毒素可被应用于ADC中。如微管蛋白抑制剂类细胞毒素MMAE和DM1,但它们只对处于分裂期的肿瘤细胞起作用。因此,需进一步挖掘具有不同作用机制且高活性的新型ADC毒素。本文针对上述ADC三个组分各自存在的问题进行了一系列创新和改进工作,共设计出四类具有抗肿瘤作用的新型ADC,并对其进行了合成、表征及针对性的生物活性评价工作:1.针对MMAE-ADC抗体作用单一的问题,本文将当前免疫治疗抗体的优势与ADC技术结合起来,使毒素MMAE通过酶裂解型二肽连接子与程序性凋亡配体1（Programmed Cell Death Ligand-1,PD-L1）抗体偶联,设计并合成4个基于免疫协同机制的新型MMAE-ADC（Ⅰ类）。这种策略可利用PD-L1抗原在多种肿瘤细胞高表达实现靶向性,同时也可通过阻断PD-1/PD-L1信号通路激活肿瘤浸润T细胞的免疫功能与ADC协同杀伤肿瘤细胞,增强治疗效果。对该类ADC的生物学功能及体内外活性评估结果表明,所制备的ADC 3具有与PD-L1抗体相似的抗原亲和力及内化能力。对多种PD-L1高表达肿瘤细胞系有较好的抑制活性和选择性,最小IC50值可达到9.75 nM。同时,ADC 3可显着增强T细胞活性,保留了PD-L1抗体的免疫激活功能,可起到与ADC协同杀伤肿瘤细胞的作用。在小鼠异种移植模型中,其表现出优于PD-L1抗体的抗肿瘤治疗效果,具有很大的应用潜力。2.针对连接子的非特异性释药问题,本课题尝试通过两种创新性设计策略旨在解决该问题。（1）策略一:设计基于紫外光控释药机制的新型ADC（Ⅱ类）本文设想是否可利用外源性的光条件,在肿瘤部位定点调控毒素释放,而不依赖传统的非特异性释药方式。具体来说,通过将紫外光可激活基团邻硝基苄基（o-Nitrobenzyl,ONB）结构与传统ADC连接子上的对氨基苄基间隔子巧妙替换,首次设计并合成2个目标ADC。进一步对它们的释药情况、体外药效及体内靶向性进行评估。结果表明,在短暂紫外照射后ADC 5和6可快速释放出MMAE有效地杀灭Heceptin耐药的肿瘤细胞,对BT474-Her DR细胞的抑制活性最好,IC50值均为0.04 nM,比未光照时抑制活性提高51倍和54倍。同时,在小鼠体内荧光成像实验中,该类ADC表现出良好的肿瘤靶向能力和器官特异性。（2）策略二:设计基于硝基还原酶释药机制的新型ADC（Ⅲ类）硝基还原酶（Nitroreductase,NTR）在实体瘤的缺氧环境中表达上调而在正常组织中低表达。在课题组前期工作中,利用实体瘤内NTR的缺氧特异性还原机制,首次将NTR敏感基团对硝基苄氧羰基（p-N itrobenzyloxycarbonyl,PNBC）引入到ADC连接子中,得到2个基于NTR释药机制的新型ADC。在酶及细胞释药实验中,缺氧条件下ADC 7和8均能释放出毒素MMAE,呈现出显着的NTR缺氧释药特异性。同时,ADC 7和8对人表皮生长因子受体2高表达的肿瘤细胞表现出与毒素MMAE相近的抑制活性。进一步的体内研究正在进行中。以上研究初步证明上述两种释药机制的新型ADC策略具有可行性。3.针对ADC毒素种类少,作用机制单一的问题,本文首次设计了以Talazoparib作为新机制毒素的ADC（Ⅳ类）,对Talazoparib能否成为ADC的细胞毒素进行了初步探索。Talazoparib是一种聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly（ADP-ribose）polymerase,PARP）抑制剂,IC50值为0.57 nM。该药可抑制DNA修复,通过协同致死效应使BRCA基因缺陷的肿瘤细胞凋亡,具有不同于其他ADC毒素的作用机制。本文利用上述连接子的设计策略,使用ONB基团和PNBC基团封闭Talazoparib的活性位点,合成1个紫外光激活前药47和5个NTR缺氧激活前药59-63。该前药策略可避免高毒性Talazoparib在未到达肿瘤部位前释放对正常组织产生毒性,而在紫外光照或缺氧等特殊条件下又可完成毒素的特异性释放。对前药47进行了针对性的生物活性评价。其具有较好的PBS稳定性。在PARP-1酶实验、PARylation实验中,抑制活性与原药Talazoparib相比分别降低了380倍和658倍,证明活性封闭成功。另一方面,在细胞毒性实验中,短暂紫外照射后,前药47可快速恢复对BRCA基因缺陷的MX-1和Capan-1肿瘤细胞的抑制活性,IC50值分别为0.577μM和0.092μM,具有作为ADC细胞毒素的潜力。针对前药59-63进行的常氧体外药效学实验,意外地发现其对酶及细胞增殖的抑制活性上均与原药类似,预示着可将其作为一种独立的新细胞毒素发展。目前将上述两类前药与不同连接子连接,然后再与抗体偶联制备成ADC的工作正在进行中。综上,本论文共设计出四类新型ADC,合成了6个全新的ADC分子、4个关键连接子,4个连接子-毒素载荷以及6个有潜力成为ADC毒素的前药化合物。针对当前ADC设计策略上存在的一些问题,本文从抗体、连接子和细胞毒素三部分分别进行创新,并将这些设计策略相互结合,进行了初步的探索和验证。这些工作为ADC的进一步研究提供了新思路。
张洋[10]（2021）在《罗布麻叶总黄酮及异槲皮苷对吡柔比星致心脏损伤的保护作用和机制》文中研究表明蒽环类药物,包括多柔比星（Doxorubicin,DOX）、表柔比星（Epirubicin,EPI）、吡柔比星（Pirarubicin,THP）等,广泛用于实体恶性肿瘤和血液系统肿瘤的治疗,但是蒽环类药物的心脏毒性在一定程度上限制了其临床应用。右雷佐生（Dexrazoxane,DZR）是目前FDA唯一批准使用的心脏保护药,但有报道发现DZR可能会加重化疗药物引起的骨髓抑制,并诱发第二癌的发生。因此,寻求一种减轻蒽环类药物所致心脏损伤的药物显得尤为重要。罗布麻叶总黄酮（AVLE）为罗布麻叶的主要活性成分,具有抗高血压、抗焦虑、抗抑郁和保护心脏等药理作用,随着对AVLE研究的不断深入,其对心血管系统疾病的防治作用已成为研究热点。异槲皮苷,又称槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Isoquercitrin,IQC）是一种天然黄酮类化合物,是AVLE中有效成份之一,广泛存在于水果、蔬菜、谷物和多种饮品中,具有抗氧化应激、抗肿瘤、保护心血管、降血糖及抗过敏等多种药理作用。非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）在许多重要生命活动中发挥功能,随着微小RNA（microRNA,miRNA）在人类疾病中的作用逐渐被揭示,深化miRNA的研究对于理解疾病发生发展的分子机制具有现实意义。本研究首先通过体内、外实验探讨IQC和AVLE对THP诱导的心脏损伤的保护作用及机制,然后通过生物信息学分析构建miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路,以此信号通路为切入点,利用AKT阻断剂及miRNA过表达/沉默瞬转细胞,从细胞水平加以验证,以期为开发和利用以IQC和AVLE为药效成分的中药资源提供科学依据。研究分为5部分:（1）AVLE对THP诱导大鼠心脏损伤的保护作用及机制首先预防性灌胃给予大鼠不同剂量的AVLE 1w,然后尾静脉注射THP（3mg/kg/w,6w）建立大鼠慢性心脏损伤模型,同时继续灌胃给予大鼠AVLE。观察大鼠心电图和大鼠心脏组织形态变化,并对血液动力学、血清BNP、CK-MB、CTn T和LDH水平、氧化应激相关指标、心肌线粒体膜m RNA水平及AKT/Bcl-2信号通路相关蛋白进行检测,探讨AVLE对THP诱导大鼠心肌损伤的保护作用及其可能的分子机制。结果如下:（1）AVLE中、高剂量组可提高THP所致心脏损伤大鼠的心率,减轻QRS波群改变,降低LVEDP,提高LVSP和±dp/dtmax水平;降低血清BNP、CK-MB、CTn T和LDH水平,提高SOD活性,降低MDA含量;改善THP所致的心肌病理学改变;降低心脏组织内线粒体膜VDAC1、ANT1和CYPD m RNA的表达,改善线粒体膜通透性。AVLE低剂量组对上述指标改善不明显。（2）AVLE抑制Cyt c由线粒体向胞浆的释放;提高pro-caspase-9、pro-caspase-3、p-AKT和Bcl-2蛋白的表达,降低Bax、cleaved-caspase-3的蛋白水平,减轻THP诱导心脏组织细胞凋亡的发生。（2）AVLE的制备及成份分析采用醇提法制备AVL提取物,大孔树脂进行纯化,富集其中黄酮类化合物。利用液相色谱-质谱串联法（HPLC-ESI-MS/MS）和高效液相色谱法（HPLC）分析技术对AVLE进行定性和定量分析。结果如下:AVLE中含有7个黄酮类化合物,随后对其中4个主要单体化合物进行定量分析,确定IQC为AVLE中含量最多的化合物。（3）AKT在AVLE和IQC保护THP诱导H9c2细胞损伤中的作用以THP诱导H9c2细胞损伤,加入IQC/AVLE及AKT inhibitor,应用MTT、DCFH-DA荧光探针、ELISA、Mito-Tracker Red CMXRos探针、JC-1探针、TUNEL、RT-qPCR、Western blot等方法,探讨AKT在AVLE和IQC保护THP诱导H9c2细胞损伤中的作用。结果如下:（1）IQC（5～500μM）和AVLE（5～400μg/ml）在不同时间点（6、12、24及36h）对H9c2细胞无毒性作用;以5μM THP处理H9c2细胞24h,可使细胞发生凋亡,存活率降低;而IQC和AVLE均可抑制THP诱导的H9c2细胞损伤,最佳给药浓度及时间为70μM及70μg/ml,24h。IQC或AVLE均可降低THP处理H9c2细胞内ROS含量,提高SOD活性,降低MDA含量;提高H9c2细胞内线粒体活力,改善细胞线粒体膜电位,降低线粒体膜相关基因的表达。（2）IQC和AVLE提高H9c2细胞内pAKT的蛋白表达,抑制Cyt c由细胞线粒体向胞浆释放,降低细胞凋亡率,同时降低胞浆内cleaved-caspase-3蛋白表达水平,提高pro-caspase-9和procaspase-3的蛋白水平和Bcl-2/Bax的蛋白比值;应用AKT inhibitor可阻断IQC或AVLE对THP诱导细胞损伤的保护作用,说明AKT为IQC或AVLE发挥心脏保护作用的节点分子。（4）THP诱导大鼠心脏损伤miRNA芯片生物信息学分析及miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路的构建和验证对课题组前期构建THP所致大鼠心脏损伤的miRNA表达谱进行分析,最终确定miR-190a-5p作为研究对象。通过对miR-190a-5p靶基因预测和KEGG富集分析,发现在Phlpp1 m RNA的3’UTR处有miR-190a-5p的潜在结合位点,靶向性较好,且Phlpp1位于AKT上游调控分子中;同时搜索AVL靶基因并对其进行KEGG富集分析,结果发现AVL可参与调控AKT及其下游Bcl-2家族蛋白。因此,构建出miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路。采用RT-qPCR和Western blot法对预测得到的miR-190a-5p及其靶基因Phlpp1在THP所致大鼠心脏损伤组织/H9c2细胞中进行初步验证,结果发现IQC和AVLE可提高miR-190a-5p的表达,抑制Phlpp1基因和蛋白表达。采用双荧光素酶报告基因实验证实,miR-190-5p可直接调控Phlpp1,且只有唯一一个结合位点。（5）miR-190a-5p在THP诱导H9c2细胞损伤中的作用及机制通过构建miR-190a-5p过表达/沉默瞬转H9c2细胞,采用DCFH-DA探针、ELISA、Mito-Tracker Red CMXRos探针、JC-1探针、RT-qPCR、TUNEL和Western blot实验方法,探讨miR-190a-5p在THP处理H9c2细胞损伤中的作用及机制。结果如下:（1）miR-190a-5p mimics降低H9c2细胞内ROS的含量,提高SOD活性,降低MDA含量;同时提高H9c2细胞线粒体活力和膜电位,降低线粒体膜基因的表达;而转染miR-190a-5p inhibitor对THP处理H9c2细胞无改善作用。（2）miR-190a-5p mimics升高H9c2细胞内miR-190a-5p的表达,抑制Phlpp1基因及蛋白,升高p-AKT蛋白表达,并抑制Cyt c由线粒体向胞浆释放,降低细胞凋亡率,同时降低胞浆内cleaved-caspase-3蛋白表达,提高procaspase-9和pro-caspase-3的蛋白水平和Bcl-2/Bax蛋白比值;而转染miR-190a-5p inhibitor对THP处理的H9c2细胞中上述基因及蛋白无改善作用。综上所述:本研究分别从整体动物水平和细胞水平探讨IQC和AVLE对THP诱导大鼠心脏组织/H9c2细胞损伤的保护作用及其机制,所得结论如下:1.在体内研究中,AVLE对THP所致大鼠心肌损伤具有保护作用。2.通过对AVLE进行定性和定量分析,推测出7个黄酮类化合物,其中IQC是含量最多的化合物,为16.7%。3.在体外研究中,IQC和AVLE对THP诱导的H9c2细胞的损伤具有保护作用,且二者的保护作用相等。4.IQC和AVLE对THP诱导心脏/心肌细胞损伤的保护作用是通过调控miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路实现的,且AKT为二者发挥心脏保护作用的节点分子。
二、裂解组织和细胞的方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、裂解组织和细胞的方法（论文提纲范文）
（1）生物材料人血小板裂解液在组织再生修复中的应用与作用（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 入选标准 |
| 1.3资料提取与文献质量评价 |
| 2 结果Results |
| 2.1 人血小板裂解液制备方法 |
| 2.1.1 血小板来源 |
| 2.1.2人血小板裂解液制备方法 |
| 2.1.3人血小板裂解液组成成分 |
| 2.2 人血小板裂解液单独用于组织再生修复 |
| 2.2.1 人血小板裂解液单独用于组织再生修复 |
| 2.2.2 人血小板裂解液与细胞联合使用 |
| 2.2.3 国际上正在进行的hPL临床试验 |
| 2.2.4 人血小板裂解液与生物材料联合使用 |
| 3 讨论Discussion |
| 3.1 现有的临床研究结果 |
| 3.2 存在的问题 |
| 3.3 未来的前景分析 |
（2）促进BCS-Ⅳ类药物依托泊苷口服吸收的纳米晶脂质载体的构建及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 BCS-Ⅳ类药物纳米晶在胃肠道的挑战 |
| 1.1.1 不稳定性 |
| 1.1.2 快速溶解 |
| 1.1.3 复杂的肠道内命运 |
| 1.2 表面修饰BCS-Ⅳ类药物纳米晶的研究进展 |
| 1.3 模型药物的选择 |
| 1.4 立题依据 |
| 1.5 研究内容 |
| 第2章 ETO-NCS(载药核心)的制备和表征 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.2 实验方法与结果 |
| 2.2.1 ETO-NCs的制备 |
| 2.2.2 ETO-NCs的固化处理 |
| 2.2.3 ETO-NCs的表征 |
| 2.2.4 水溶性分析 |
| 2.2.5 稳定性研究 |
| 2.3 本章小结 |
| 第3章 ETO-LIPO@NCS的制备与表征 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ETO-Lipo@NCs的制备 |
| 3.2.2 ETO-Lipo@NCs的表征 |
| 3.2.3 稳定性分析 |
| 3.2.4 释药特性分析 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 ETO-Lipo@NCs的处方优化 |
| 3.3.2 ETO-Lipo@NCs的表征 |
| 3.3.3 稳定性分析 |
| 3.3.4 释药特性分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 ETO-LIPO@NCS肠道吸收能力的研究 |
| 4.1 材料、仪器与动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 原位单向肠灌流实验(SPIP) |
| 4.2.2 大鼠肠道吸收研究 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 原位单向肠灌流实验 |
| 4.3.2 肠道吸收研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 ETO-LIPO@NCS细胞摄取及转运机制的研究 |
| 5.1 材料、仪器与细胞 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞的培养 |
| 5.2.2 细胞内依托泊苷含量的测定 |
| 5.2.3 细胞摄取及机制的研究 |
| 5.2.4 细胞内转运及机制研究 |
| 5.2.5 跨膜转运的研究 |
| 5.2.6 细胞旁路转运的评价 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 UPLC-MS/MS方法学验证 |
| 5.3.2 细胞摄取及机制研究 |
| 5.3.3 细胞内转运及机制研究 |
| 5.3.4 跨膜转运的研究 |
| 5.3.5 细胞旁路转运的排除 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 ETO-LIPO@NCS初步药代动力学及药效学研究 |
| 6.1 材料与仪器 |
| 6.2 细胞与动物 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 体内药动学研究 |
| 6.3.2 组织分布学研究 |
| 6.3.3 药效学研究 |
| 6.3.4 肠道刺激性研究 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 体内药动学研究 |
| 6.4.2 组织分布学研究 |
| 6.4.3 药效学研究 |
| 6.4.4 肠道刺激性研究 |
| 6.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 创新点与不足 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）内质网应激蛋白CHOP通路参与动脉粥样硬化发生发展的机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 动脉粥样硬化的研究背景 |
| 1.2 动脉粥样硬化的研究进展 |
| 1.3 血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化中的研究进展 |
| 1.4 血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化不同分期中的变化 |
| 1.5 内质网应激的研究现状 |
| 1.6 内质网应激在血管平滑肌细胞中的研究进展 |
| 1.7 微小RNA与内质网应激在动脉粥样硬化中相互作用的研究进展 |
| 1.8 展望 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物和细胞 |
| 2.1.2 主要实验器材与仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物模型 |
| 2.2.2 血管平滑肌细胞的分离及培养 |
| 2.2.3 慢病毒载体构建 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin stain, HE stain)染色 |
| 2.2.6 油红O染色 |
| 2.2.7 小鼠血脂测定 |
| 2.2.8 斑块稳定性检测 |
| 2.2.9 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH) |
| 2.2.10 RNA提取及定量 |
| 2.2.11 蛋白质提取及定量检测 |
| 2.2.12 双荧光素酶报告实验 |
| 2.2.13 免疫组织化学染色 |
| 2.2.14 EdU细胞增殖实验 |
| 2.2.15 划痕实验 |
| 2.2.16 统计分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 动脉粥样硬化小鼠模型的构建 |
| 3.2 MiR-208 在动脉粥样硬化中的表达及作用情况 |
| 3.2.1 MiR-208 在动脉粥样硬化中的表达情况 |
| 3.2.2 干扰miR-208 的表达对动脉粥样硬化的调控作用情况 |
| 3.3 TIMP3作为miR-208 的靶基因参与动脉粥样硬化的进展 |
| 3.4 miR-208 通过抑制TIMP3的表达抑制血管平滑肌细胞的增殖与迁移 |
| 3.5 TRIB3促进miR-208 的表达进而抑制TIMP3影响动脉粥样硬化进展及血管平滑肌细胞功能 |
| 3.6 CHOP通过上调TRIB3的表达来促进动脉粥样硬化模型中血管平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 3.7 CHOP/TRIB3/miR-208/TIMP3通路影响动脉粥样硬化的进展 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(中英文对照表) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 卵泡发育和卵母细胞成熟 |
| 1.1 卵泡发育过程 |
| 1.2 颗粒细胞在卵泡发育和卵子发生过程中的作用 |
| 1.3 雌激素对卵泡发育的影响 |
| 1.4 卵母细胞体外成熟 |
| 1.5 雌激素对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2 ZO-1/2基因研究进展 |
| 2.1 紧密连接 |
| 2.2 ZOs基因的发现 |
| 2.3 ZOs的结构 |
| 2.4 ZOs的分布 |
| 2.5 ZOs的功能及其作用机制 |
| 2.6 ZOs的调控因素 |
| 研究目的和意义 |
| 第二章 ZO-1/2在猪卵泡发育过程中的表达模式及作用初步研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 ZO-1/2基因在猪组织中的表达情况 |
| 2.2 ZO-1/2在猪卵泡发育过程中的表达模式 |
| 2.3 猪ZO-1/2ORF的扩增与序列分析 |
| 2.4 pGC-ZsGreen1-ZO-1/2慢病毒表达载体验证 |
| 2.5 过表达ZO-1/2对颗粒细胞增殖的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 ZO-1/2在猪组织及卵泡发育过程中的表达规律 |
| 3.2 过表达ZO-1/2对猪颗粒细胞增殖的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 ZO-1/2在猪卵母细胞成熟过程中的表达规律及功能研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 ZO-1/2在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达模式 |
| 2.2 ZO-1/2在猪早期胚胎发育过程中的表达模式 |
| 2.3 ZO-1/2sh RNA表达载体构建及筛选 |
| 2.4 下调ZO-1/2表达对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 ZO-1/2基因在猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育过程的表达模式 |
| 3.2 下调ZO-1/2基因表达对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 4 小结 |
| 第四章 ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的调控机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪卵母细胞体外成熟过程中ZO-1/2表达的调控因素 |
| 2.2 E_2对猪卵母细胞体外成熟和ZO-1/2表达的影响 |
| 2.3 ZO-1/2及Cx43 基因间的相互作用分析 |
| 2.4 E_2对颗粒细胞增殖的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 体外成熟过程中ZO-1/2表达的调控方式 |
| 3.2 E_2对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3 E_2对颗粒细胞中ZO-1/2表达的影响 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
（5）泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗体偶联药物的知识现状 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC发展简史 |
| 1.1.2 获得监管批准的上市ADC |
| 1.1.3 临床试验中的在研ADC及其靶标图谱 |
| 1.1.4 抗体骨架和靶标的选择 |
| 1.1.5 连接子类型和偶联技术 |
| 1.1.6 有效载荷 |
| 1.1.7 ADC在体内的工作原理 |
| 1.1.8 ADC对难治性癌症的治疗 |
| 1.1.9 ADC的毒性问题 |
| 1.1.10 ADC耐药机制 |
| 1.1.11 未来展望 |
| 1.2 嵌合抗原受体T细胞的知识现状 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T发展简史 |
| 1.2.2 CAR-T细胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T细胞受体的结构 |
| 1.2.4 获得监管批准的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T细胞疗法的毒性 |
| 1.2.6 未来挑战、机会和应用 |
| 1.3 本课题的研究目标 |
| 第二章 基于多组学构建泛实体瘤相关抗原图谱 |
| 引言 |
| 2.1 数据采集与分析方法 |
| 2.1.1 正常组织转录组和蛋白组的数据采集 |
| 2.1.2 蛋白质亚细胞定位数据的采集与编译 |
| 2.1.3 人体组织器官的重排与映射 |
| 2.1.4 正常组织的表达及其分级 |
| 2.1.5 基因在肿瘤及其癌旁组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.6 基因在肿瘤与其他正常组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.7 肿瘤组织转录组、基因组和表型数据的编译 |
| 2.1.8 功能相关突变的注释 |
| 2.1.9 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.1.10 肿瘤相关抗原与癌细胞功能状态的相关性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 临床试验的检索策略 |
| 2.1.13 统计分析 |
| 2.2 分析结果 |
| 2.2.1 组装综合数据集并通过算法识别肿瘤相关抗原 |
| 2.2.2 肿瘤相关抗原的表达谱与差异表达谱 |
| 2.2.3 肿瘤相关抗原的异质表达谱 |
| 2.2.4 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.2.5 癌症驱动基因变异全景 |
| 2.2.6 候选肿瘤相关抗原的组合评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制备及抗结直肠癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 TCGA与 GTEx中 CDH17的m RNA数据的获取与分析 |
| 3.3.2 免疫原的设计与制备 |
| 3.3.3 制备靶向CDH17 的单克隆抗体的免疫方案 |
| 3.3.4 抗体可变区基因测序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 3.3.6 抗体结合亲和力的测定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗体偶联vc MMAE |
| 3.3.8 细胞内吞实验 |
| 3.3.9 细胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀产物的银染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.13 免疫组化 |
| 3.3.14 免疫荧光 |
| 3.3.15 流式细胞实验 |
| 3.3.16 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.17 体内抑瘤活性实验 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道肿瘤和正常组织中的表达 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗体的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制备与表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在体外的抗肿瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠对CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T细胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 试剂耗材及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TCGA与 GTEx中 LYPD3 m RNA数据的获取与分析 |
| 4.3.2 抗体人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 CD3+T细胞的复苏与激活 |
| 4.3.5 CD3+T细胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T细胞分化与耗竭的检测 |
| 4.3.7 CAR-T体外细胞杀伤 |
| 4.3.8 CAR-T体内活性实验 |
| 4.3.9 细胞因子的检测 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T细胞在PC9 肺腺癌异种移植模型中抗肿瘤活性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）DOK3通过与GPR84相互作用参与小胶质细胞介导的神经病理性疼痛（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 DOK3通过与GPR84相互结合参与小胶质细胞介导的炎症反应 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 溶液配制 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 附图 |
| 第二部分 DOK3通过与GPR84相互作用参与脊髓小胶质细胞介导的神经病理性疼痛 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 溶液配制 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脊髓小胶质细胞参与神经病理性疼痛的机制研究 |
| 神经病理性疼痛的研究现状 |
| 小胶质细胞的特征与活化的机制 |
| 与小胶质细胞激活相关的信号分子及受体 |
| 神经元与小胶质细胞相互作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
（7）针对肿瘤微环境氧化还原异质性构筑刺激响应超分子纳米前药诊疗体系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 荧光探针在肿瘤诊断中的应用 |
| 1.3 常见纳米载体类型 |
| 1.3.1 胶束 |
| 1.3.2 脂质体 |
| 1.3.2.1 固体脂质体纳米粒子 |
| 1.3.2.2 纳米结构的脂质体载体 |
| 1.3.3 聚合物纳米粒子 |
| 1.3.4 树枝状聚合物 |
| 1.3.5 无机纳米载体 |
| 1.3.5.1 量子点 |
| 1.3.5.2 金纳米粒子 |
| 1.3.5.3 碳纳米管 |
| 1.3.5.4 氧化铁磁性纳米粒子 |
| 1.4 刺激响应型纳米前药 |
| 1.4.1 ROS响应 |
| 1.4.2 GSH响应 |
| 1.4.3 酶响应 |
| 1.4.4 pH响应 |
| 1.4.5 光响应 |
| 1.4.6 温度响应 |
| 1.5 本章总结 |
| 第二章 氧化还原刺激响应型超分子纳米前药的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 目标分子的合成及结构 |
| 2.3 Pluronic F-127物理包裹RhB-SS-CPT的制备 |
| 第三章 氧化还原刺激响应型纳米前药的性能表征 |
| 3.1 氧化还原刺激响应型纳米前药的光谱性质 |
| 3.1.1 氧化还原刺激响应型纳米前药在水溶液中的紫外光谱性质 |
| 3.1.2 氧化还原刺激响应型纳米前药在水和有机溶剂中的荧光光谱性质 |
| 3.1.3 氧化还原刺激响应型纳米前药在不同有机溶剂中的紫外光谱性质 |
| 3.2 氧化还原刺激响应型纳米前药与GSH和H_2O_2的响应性 |
| 3.2.1 氧化还原刺激响应型纳米前药与GSH和H_2O_2响应后的荧光变化 |
| 3.2.2 氧化还原刺激响应型纳米前药经GSH响应后的机理验证 |
| 3.2.3 氧化还原刺激响应型纳米前药经H_2O_2响应后的机理验证 |
| 3.3 药物释放实验 |
| 3.4 氧化还原刺激响应型纳米前药体外细胞摄取实验 |
| 3.5 氧化还原刺激响应型纳米前药体外细胞毒性实验 |
| 3.5.1 游离的CPT对HeLa细胞的体外细胞毒性实验 |
| 3.5.2 RhB-SS-CPT对HeLa细胞的体外细胞毒性实验 |
| 3.5.3 游离的CPT对L929细胞的体外细胞毒性实验 |
| 3.5.4 RhB-SS-CPT对L929细胞的体外细胞毒性实验 |
| 3.6 氧化还原刺激响应型纳米前药小鼠体内实验 |
| 3.6.1 氧化还原刺激响应型纳米前药小鼠体内荧光成像 |
| 3.6.2 氧化还原刺激响应型纳米前药体内治疗实验 |
| 3.6.3 氧化还原刺激响应型纳米前药体内药代动力学研究 |
| 3.7 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）三烯霉素A抗胰腺癌的功能和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 胰腺癌的研究进展 |
| 1.1.1 胰腺癌的概念与风险因素 |
| 1.1.2 胰腺癌的发病率及死亡率 |
| 1.1.3 胰腺癌的分类与临床分期 |
| 1.1.4 胰腺癌的病理过程和症状 |
| 1.1.5 胰腺癌的诊断与治疗手段 |
| 1.2 STAT3信号通路的概论 |
| 1.2.1 STAT3经典信号通路的表述 |
| 1.2.2 STAT3信号通路与肿瘤发展 |
| 1.2.3 STAT3信号通路与肿瘤治疗 |
| 1.3 STAT3 蛋白的简介 |
| 1.3.1 STAT3蛋白结构与功能概述 |
| 1.3.2 STAT3是抗胰腺癌潜在靶标 |
| 1.3.3 STAT3抗肿瘤抑制剂的简介 |
| 1.4 Trienomycin A的研究背景 |
| 1.4.1 Trienomycin A发现与富集 |
| 1.4.2 Trienomycin A的研究现状 |
| 1.5 论文设计思路 |
| 1.5.1 研究目的与研究意义 |
| 1.5.2 研究策略与技术路线 |
| 第二章 靶向STAT3信号通路高通量筛选及先导化合物的获得 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验耗材 |
| 2.2.4 溶液配方 |
| 2.2.5 实验方法 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 抗胰腺癌细胞增殖高通量筛选及结果 |
| 2.3.2 双荧光素酶报告基因高通量筛选及结果 |
| 2.3.3 TA与STAT3的分子对接 |
| 2.3.4 TA与STAT3相互作用验证 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Trienomycin A通过STAT3信号通路抑制胰腺癌细胞增殖及迁移 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验耗材 |
| 3.2.4 溶液配方 |
| 3.2.5 实验方法 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 STAT3蛋白在各细胞系中的表达与磷酸化水平 |
| 3.3.2 TA显着抑制胰腺癌细胞的增殖 |
| 3.3.3 TA显着抑制胰腺癌细胞的迁移 |
| 3.3.4 TA显着抑制胰腺癌细胞的侵袭 |
| 3.3.5 TA阻滞胰腺癌细胞周期而不诱导细胞凋亡 |
| 3.3.6 TA抑制STAT3的磷酸化与核转移 |
| 3.3.7 TA抑制STAT3下游基因的蛋白表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Trienomycin A通过STAT3信号通路抑制体内胰腺癌的生长 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验耗材 |
| 4.2.4 溶液配方 |
| 4.2.5 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 TA显着抑制体内胰腺癌的生长 |
| 4.3.2 TA抑制肿瘤增殖相关因子的表达 |
| 4.3.3 TA对小鼠正常组织没有明显的毒性 |
| 4.3.4 TA抑制体内STAT3的磷酸化 |
| 4.3.5 TA抑制体内STAT3下游基因的mRNA表达 |
| 4.3.6 TA抑制体内STAT3下游基因的蛋白表达 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 Trienomycin A抗胰腺癌分子机制及其药代动力学评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验耗材 |
| 5.2.4 溶液配方 |
| 5.2.5 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 JAK/STAT信号通路相关蛋白在各细胞系中的表达与磷酸化水平 |
| 5.3.2 TA抑制体外JAK/STAT信号通路相关蛋白的磷酸化 |
| 5.3.3 TA引起胰腺癌细胞的基因差异性表达 |
| 5.3.4 TA调控基因的GO功能分析 |
| 5.3.5 TA调控基因的KEGG通路分析 |
| 5.3.6 TA在大鼠体内的药代动力学研究 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 论文的创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 图片与表格索引 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的设计、合成及生物活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 癌症的概述 |
| 1.2 癌症的治疗手段 |
| 1.3 抗体偶联药物的概述 |
| 1.4 抗体偶联药物的作用机制 |
| 1.5 抗体偶联药物三大组成元件的选择 |
| 1.5.1 抗体偶联药物抗体的选择 |
| 1.5.2 抗体偶联药物连接子的选择 |
| 1.5.3 抗体偶联药物毒素的选择 |
| 1.6 抗体偶联药物的研究进展 |
| 1.6.1 已上市的抗体偶联药物 |
| 1.6.2 我国抗体偶联药物研发现状 |
| 1.7 课题设计思路 |
| 第2章 具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的设计 |
| 2.1 基于免疫协同机制的新型MMAE-ADC(Ⅰ类)的设计 |
| 2.1.1 MMAE-ADC抗体部分的不足及免疫疗法的优势 |
| 2.1.2 基于免疫协同机制的新型MMAE-ADC(Ⅰ类)的构建 |
| 2.2 基于紫外光控释药机制的新型ADC(Ⅱ类)的设计 |
| 2.2.1 当前ADC连接子释药机制的不足 |
| 2.2.2 基于紫外光控释药机制的新型ADC(Ⅱ类)的构建 |
| 2.3 基于硝基还原酶释药机制的新型ADC(Ⅲ类)的设计 |
| 2.3.1 酶可裂解型连接子释药机制的不足 |
| 2.3.2 实体瘤特异的硝基还原酶 |
| 2.3.3 基于硝基还原酶释药机制的新型ADC(Ⅲ类)的构建 |
| 2.4 以Talazoparib作为新机制毒素的ADC(IV类)的设计 |
| 2.4.1 当前ADC细胞毒素存在的不足 |
| 2.4.2 PARP抑制剂Talazoparib及其作用机制 |
| 2.4.3 Talazoparib前药及相应ADC的构建 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的合成及表征 |
| 3.1 具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的合成 |
| 3.1.1 基于免疫协同机制的新型MMAE-ADC(Ⅰ类)的合成 |
| 3.1.2 基于紫外光控释药机制的新型ADC(Ⅱ类)的合成 |
| 3.1.3 基于硝基还原酶释药机制的新型ADC(Ⅲ类)的合成 |
| 3.1.4 以Talazoparib作为新机制毒素的ADC(IV类)的合成 |
| 3.2 具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的表征 |
| 3.2.1 二喹啉甲酸法测ADC浓度 |
| 3.2.2 ADC DAR值的测量 |
| 3.2.3 ADC聚合度检测 |
| 3.2.4 ADC内毒素检测 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的生物活性评价 |
| 4.1 基于免疫协同机制的新型MMAE-ADC(Ⅰ类)的生物评价 |
| 4.1.1 细胞抗原表达检测 |
| 4.1.2 PD-L1 抗体内化检测 |
| 4.1.3 ADC蛋白亲和力实验 |
| 4.1.4 激光共聚焦荧光实验 |
| 4.1.5 体外细胞毒性评估 |
| 4.1.6 外周血T细胞激活实验 |
| 4.1.7 小鼠体内药效学实验 |
| 4.2 基于紫外光控释药机制的新型ADC(Ⅱ类)的生物评价 |
| 4.2.1 连接子-毒素载荷的稳定性实验 |
| 4.2.2 连接子-毒素载荷的紫外光解实验 |
| 4.2.3 连接子-毒素载荷的微管蛋白抑制实验 |
| 4.2.4 连接子-毒素载荷的细胞毒性实验 |
| 4.2.5 ADC抗原亲和力实验 |
| 4.2.6 ADC与细胞表面HER2 抗原结合实验 |
| 4.2.7 激光共聚焦荧光实验 |
| 4.2.8 ADC光照前后的细胞毒性评价 |
| 4.2.9 小鼠荧光成像实验 |
| 4.3 基于硝基还原酶释药机制的新型ADC(Ⅲ类)的生物评价 |
| 4.3.1 连接子-毒素载荷的酶解释药实验 |
| 4.3.2 ADC体外细胞水平释药实验 |
| 4.3.3 ADC体外细胞毒性实验 |
| 4.4 以Talazoparib作为新机制毒素的ADC(IV类)的生物评价 |
| 4.4.1 Talazoparib紫外光激活前药的生物评价 |
| 4.4.2 Talazoparib NTR缺氧激活前药的生物评价 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 实验部分 |
| 5.1 化学实验部分 |
| 5.1.1 材料与仪器 |
| 5.1.2 化合物的合成 |
| 5.2 偶联实验部分 |
| 5.2.1 材料与仪器 |
| 5.2.2 抗体与药物的偶联 |
| 5.3 表征实验部分 |
| 5.3.1 材料与仪器 |
| 5.3.2 表征实验方法 |
| 5.4 生物实验部分 |
| 5.4.1 材料与仪器 |
| 5.4.2 生物实验方法 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 作者简介及博士期间学术成果 |
| 致谢 |
（10）罗布麻叶总黄酮及异槲皮苷对吡柔比星致心脏损伤的保护作用和机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词对照表 |
| 第1篇 前言 |
| 第2篇 文献综述 |
| 第1章 蒽环类药物心脏毒性概述 |
| 1.1 蒽环类药物引起心脏损伤的类型 |
| 1.2 蒽环类药物引起心脏损伤的分子机制 |
| 1.2.1 拓扑异构酶抑制 |
| 1.2.2 铁离子代谢紊乱 |
| 1.2.3 线粒体功能障碍 |
| 1.2.4 肌纤维降解和肌浆网钙稳态失衡 |
| 1.2.5 氧化应激 |
| 1.2.6 细胞凋亡 |
| 第2章 罗布麻叶和异槲皮苷研究概述 |
| 2.1 罗布麻叶研究概述 |
| 2.1.1 罗布麻植物学特征和传统医学应用 |
| 2.1.2 罗布麻叶提取物药理学作用 |
| 2.1.3 罗布麻叶提取物安全性 |
| 2.2 异槲皮苷研究概述 |
| 2.2.1 异槲皮苷的制备 |
| 2.2.2 异槲皮苷药理作用 |
| 2.2.3 异槲皮苷的体内吸收过程 |
| 第3章 蒽环类药物所致心脏损伤与miRNAs概述 |
| 3.1 miRNAs简介 |
| 3.2 蒽环类药物心脏损伤心肌组织中miRNAs表达变化 |
| 3.3 蒽环类药物心脏损伤血液miRNAs表达的变化 |
| 3.4 miRNAs在蒽环类药物心脏损伤中预防和治疗的作用 |
| 第3篇 实验研究 |
| 第1章 罗布麻叶总黄酮对THP诱导大鼠心脏损伤的保护作用及机制研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 药品及试剂 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物分组及处理 |
| 1.2.2 各组大鼠心电图和心脏血流动力学参数 |
| 1.2.3 各组大鼠血清心肌酶水平 |
| 1.2.4 各组大鼠SOD和 MDA含量测定 |
| 1.2.5 各组大鼠心脏取材 |
| 1.2.6 各组大鼠心脏组织HE染色 |
| 1.2.7 各组大鼠心脏组织中线粒体膜基因的表达 |
| 1.2.8 各组大鼠心脏线粒体蛋白制备 |
| 1.2.9 各组大鼠心脏组织中相关蛋白的表达 |
| 1.2.10 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 大鼠一般状态观察 |
| 1.3.2 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心电图的影响 |
| 1.3.3 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠血流动力学的影响 |
| 1.3.4 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心肌酶的影响 |
| 1.3.5 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠组织形态学的影响 |
| 1.3.6 AVLE对 THP诱导的心脏损伤大鼠血清SOD和 MDA的影响 |
| 1.3.7 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心脏组织线粒体膜m RNA表达的影响 |
| 1.3.8 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心脏组织AKT和 p-AKT表达的影响 |
| 1.3.9 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心脏组织Cyt c表达的影响 |
| 1.3.10 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心脏组织胞浆Caspase家族蛋白表达的影响 |
| 1.3.11 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心脏组织Bcl-2和Bax表达的影响 |
| 1.4 本章小结 |
| 第2章 罗布麻叶总黄酮的制备及成份分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 药品及试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 AVL生药学鉴定 |
| 2.2.2 AVLE提取和纯化 |
| 2.2.3 仪器分析条件 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 AVL性状鉴定 |
| 2.3.2 AVL横切面显微鉴定 |
| 2.3.3 HPLC-ESI-MS/MS法对AVLE进行定性分析 |
| 2.3.4 HPLC法对AVLE部分化合物进行定量分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 AKT在罗布麻叶总黄酮和异槲皮苷保护THP诱导H9c2 细胞损伤中的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 药品及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 细胞传代 |
| 3.2.3 细胞冻存 |
| 3.2.4 MTT检测细胞毒性和存活率 |
| 3.2.5 DCFH-DA探针检测H9c2 细胞ROS水平 |
| 3.2.6 ELISA法检测H9c2 细胞SOD和 MDA的含量 |
| 3.2.7 Mito-Tracker Red CMXRos探针检测H9c2 细胞线粒体活性 |
| 3.2.8 JC-1 探针检测H9c2 细胞线粒体膜电位 |
| 3.2.9 RT-qPCR检测H9c2 细胞线粒体膜基因的表达 |
| 3.2.10 TUNEL检测H9c2 细胞凋亡率 |
| 3.2.11 H9c2 细胞线粒体提取 |
| 3.2.12 Western blot检测H9c2 细胞相关蛋白的表达 |
| 3.2.13 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 IQC、AVLE和 THP对 H9c2 细胞作用的最佳浓度和时间确定 |
| 3.3.2 IQC和 AVLE对 THP处理H9c2 细胞的保护作用 |
| 3.3.3 AKT在 IQC和 AVLE改善THP处理H9c2 细胞凋亡中的作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 THP诱导大鼠心脏损伤miRNA芯片生物信息学分析及miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2 信号通路的构建和验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 药品及试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 差异miRNA筛选 |
| 4.2.2 miR-190a-5p和 AVL靶基因预测及通路富集 |
| 4.2.3 大鼠心脏组织miR-190a-5p、Phlpp1 基因及蛋白的表达 |
| 4.2.4 H9c2 细胞miR-190a-5p、Phlpp1 基因及蛋白的表达 |
| 4.2.5 双荧光素酶报告基因实验 |
| 4.2.6 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 差异miRNA筛选结果 |
| 4.3.2 miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2 信号通路的构建 |
| 4.3.3 AVLE对 THP诱导的心脏损伤大鼠心脏组织miR-190a-5p和 Phlpp1 基因及蛋白表达的影响 |
| 4.3.4 IQC和 AVLE对 THP处理H9c2 细胞miR-190a-5p和Phlpp1 基因及蛋白表达的影响 |
| 4.3.5 双荧光素酶报告基因实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 miR-190a-5p在 THP诱导H9c2 细胞损伤中的作用及机制 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 药品及试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 荧光显微镜检测miR-190a-5p转染H9c2 细胞效率 |
| 5.2.2 RT-qPCR检测H9c2 细胞miR-190a-5p和 Phlpp1 m RNA的表达 |
| 5.2.3 DCFH-DA探针检测H9c2 细胞ROS含量 |
| 5.2.4 ELISA法检测H9c2 细胞SOD和 MDA含量 |
| 5.2.5 Mito-Tracker Red CMXRos探针检测H9c2 细胞线粒体活性 |
| 5.2.6 JC-1 探针检测H9c2 细胞线粒体膜电位 |
| 5.2.7 RT-qPCR检测H9c2 细胞线粒体膜基因的表达 |
| 5.2.8 TUNEL检测H9c2 细胞凋亡率 |
| 5.2.9 H9c2 细胞线粒体提取 |
| 5.2.10 Western blot检测H9c2 细胞相关蛋白的表达 |
| 5.2.11 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 转染miR-190a-5p对 miR-190a-5p和 Phlpp1 m RNA表达的影响 |
| 5.3.2 miR-190a-5p对 THP处理H9c2 细胞的保护作用 |
| 5.3.3 miR-190a-5p对 THP处理H9c2 细胞miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2 信号通路的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第4篇 讨论 |
| 1.1 THP所致大鼠心脏组织/H9c2 细胞损伤模型复制 |
| 1.1.1 动物模型 |
| 1.1.2 细胞模型 |
| 1.2 AVLE制备及成份分析 |
| 1.3 IQC和 AVLE改善THP处理大鼠心脏组织/H9c2 细胞的作用 |
| 1.3.1 AVLE改善THP处理大鼠心脏组织心电图、血流动力学、心肌酶及组织形态学的变化 |
| 1.3.2 IQC和 AVLE改善THP处理大鼠心脏组织/H9c2 细胞氧化应激和线粒体功能的作用 |
| 1.4 IQC和 AVLE对 THP所致大鼠心脏组织/H9c2 细胞损伤的保护作用机制 |
| 1.4.1 THP诱导大鼠心脏损伤miRNA芯片生物信息学分析及miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2 信号通路的构建 |
| 1.4.2 miR-190a-5p/Phlpp1 生物学作用及IQC、AVLE和 DZR对miR-190a-5p/Phlpp1 调控作用的验证 |
| 1.4.3 AKT作为IQC和 AVLE保护THP诱导大鼠心脏组织/H9c2 细胞损伤作用节点的探讨 |
| 1.4.4 miR-190a-5p减轻THP处理H9c2 细胞氧化应激及对线粒体功能的保护作用 |
| 1.4.5 miR-190a-5p在 IQC和 AVLE保护THP诱导H9c2 细胞损伤机制中的探讨 |
| 1.5 IQC与 AVLE药效对比分析 |
| 第5篇 结论 |
| 创新点 |
| 今后工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、裂解组织和细胞的方法（论文参考文献）
- [1]生物材料人血小板裂解液在组织再生修复中的应用与作用[J]. 谢兴琴,聂煜绮,张怡. 中国组织工程研究, 2022(28)
- [2]促进BCS-Ⅳ类药物依托泊苷口服吸收的纳米晶脂质载体的构建及机制研究[D]. 王月. 吉林大学, 2021(01)
- [3]内质网应激蛋白CHOP通路参与动脉粥样硬化发生发展的机制研究[D]. 陈锐. 吉林大学, 2021(01)
- [4]ZO-1/2在猪卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达与功能研究[D]. 曹丽华. 广西大学, 2021(01)
- [5]泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用[D]. 方佳成. 西北大学, 2021(12)
- [6]DOK3通过与GPR84相互作用参与小胶质细胞介导的神经病理性疼痛[D]. 高文双. 山东大学, 2021(10)
- [7]针对肿瘤微环境氧化还原异质性构筑刺激响应超分子纳米前药诊疗体系[D]. 黄泽健. 青岛科技大学, 2021(01)
- [8]三烯霉素A抗胰腺癌的功能和作用机制研究[D]. 何秋瑞. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [9]具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的设计、合成及生物活性研究[D]. 李家国. 吉林大学, 2021(01)
- [10]罗布麻叶总黄酮及异槲皮苷对吡柔比星致心脏损伤的保护作用和机制[D]. 张洋. 吉林大学, 2021(01)