一、关于猪水泡病病毒轻度和亚临床感染（论文文献综述）
J.A.Mann,况乾惕[1]（1977）在《关于猪水泡病病毒轻度和亚临床感染》文中提出 有关猪水泡病病毒（SVDV）自然和实验感染的报告中指出,某些猪不表现临床症状,但能产生有意义水平的中和抗体（Nardelli等,1968;Mowat等,1972;Kubin,1973;Dawe等,1973;Burrows、Greig和Goodridge,1973;Burrows、Mann和Goodridge,1974）。这些报告的大多数,认为所涉及的猪是曾与临床病猪,因而与大量病毒有过接触,但有一部分猪只是接触过较少量的病毒。在自然爆发中,本病的发病率波动于25％（Nardelli等,1968）至65％（Anon,1973）之间。虽然在一个感染农场,总的发病率可能低,但对一个单栏来讲,则可达到90％或更高。
钟金栋[2]（2007）在《猪水泡病毒VP1基因克隆、表达及其检测技术的研究》文中认为猪水泡病（SVD）又名猪传染性水泡病，是由猪水泡病毒（SVDV）引起的一种烈性传染病，以口和蹄部产生水泡性损伤为特征，其临床症状与猪口蹄疫（FMD）极为相似，不容易区别，严重阻碍我国畜牧业和动物及其产品国际贸易的发展，引起严重的公共卫生问题，国际兽医局（OIE）将这疫病列为A类传染病。在国际贸易中，多数国家对SVD采取严格的检疫和控制措施已成为一种技术性贸易保护壁垒。猪水泡病和水泡性口炎（VSV）及口蹄疫临床症状相似，需要进行鉴别诊断，因此建立敏感性高、特异性强，快速、安全和可靠的诊断方法对于猪水泡病、水泡性口炎、口蹄疫的控制和出入境检验检疫至关重要。本研究应用基因克隆、基因表达等技术，对猪水泡病病毒外壳蛋白抗原（VP1）编码基因进行了克隆，构建于原核表达载体，高效表达目的蛋白，应用表达产物建立了酶联免疫吸附试验（ELISA），同时建立了猪水泡病RT-PCR、多重RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR核酸检测方法，并进行了相关病毒核酸的鉴别检测，其主要内容和结果为：1．以猪水泡病病毒核酸为模板，反转录聚合酶链式反应，扩增获得849bp的VP1基因，通过T-A克隆，将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中，构建SVDV VP1基因重组质粒，并进行核苷酸序列测定确定其基因的正确性。再将片断插入pBAD／Thio TOPO表达载体，经测序鉴定，筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆，成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达，可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明，以终浓度为0.002％的L—阿拉伯醛糖进行诱导，5h后表达可达到高峰，表达蛋白为融合蛋白，分子量为47.13kDa，表达产量约占菌体总蛋白的16％。Western blotting检测表明，诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。应用该重组抗原建立了检测猪水泡病的间接ELISA方法，以重组的猪水泡病病毒VP1蛋白为包被抗原，建立了以重组VP1蛋白为抗原检测SVDV抗体的酶联免疫吸附试验。2．根据基因库中的猪水泡病病毒高度保守的序列，设计了与SVDV互补的特异性引物，成功地建立了RT-PCR检测方法，扩增出251bp和366bp特异性条带，本试验能稳定、高效、快速地检测出猪水泡病病毒。通过检测FMDV、VSV、BHK21细胞等，对照的扩增结果均为阴性，证明该方法可特异性扩增目的基因。对SVDV RNA进行10倍系列稀释后检测，结果SVDV RNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性，说明该方法具有较好的敏感性。3．应用RT-PCR技术，建立了多重PCR同时检测鉴别口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎病毒的方法。根据基因库中的口蹄疫病毒、猪水泡病病毒和水泡性口炎病毒各基因的序列，设计了与FMDV、SVDV、VSV互补的3对特异性引物，对样品中的cDNA模板进行了多重RT-PCR扩增及反应条件的优化，结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带，分别为189bp、125bp和300bp。用这3对引物对病毒样品cDNA模板进行多次扩增，均能稳定得到与设计相符合的3条特异性条带。本试验能同时特异、敏感、快速地鉴定FMDV、SVDV和VSV。4．建立了实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的方法。根据基因库中的SVDV高度保守的序列，设计合成引物和TaqMan探针，经各反应条件的优化，建立了实时荧光定量PCR技术。对SVDV进行了特异性、敏感性和重复性试验，结果表明，实时荧光TaqMan RT-PCR可检测到每个反应相当于1×102copies病毒RNA；与FMDV、VSV等其它水泡性病毒不发生交叉反应；制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽，相关系数为0.993；与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。可对样品中微量SVDV进行准确检测，是一种SVDV检测的良好方法。综上所述，本研究成功表达了猪水泡病病毒VP1基因，应用表达产物建立了酶联免疫吸附试验；并建立了猪水泡病RT-PCR、多重PCR、实时荧光定量RT-PCR核酸检测方法。该检测体系对于猪水泡病的预防和控制、出入境检验检疫以及社会公共安全显得至关重要，为我国猪水泡病的诊断和动物检疫提供了技术支撑。
王彬,汤德元,李春燕,曾志勇,张晓杰[3]（2010）在《猪水疱病诊断技术的研究进展》文中进行了进一步梳理猪水疱病是猪的一种急性、热性、接触性病毒性传染病,其临床表现主要为蹄部和口、鼻等出现水疱或溃烂为特征。猪水疱病的流行对畜牧业生产和国际经济贸易构成严重威胁,由于在临诊症状方面与口蹄疫难以区别,因而对本病的防制具有非常重要的经济和政治意义,因而对该病的准确诊断极其重要。本文中主要从病原学诊断、血清学诊断、核酸诊断和鉴别诊断方面对猪水泡病诊断进行了较全面的阐述,为猪水泡病的诊断提供参考,以期为科学防制提供参考。
张敬友[4]（2005）在《进境猪精液风险分析》文中进行了进一步梳理与进口活动物相比,引进国外优良种猪精液最大的好处在于传播疾病的风险小、运输方便、运输成本低;其次通过引进精液进行人工授精还有提高优良品种利用率、加快优良遗传性状传递、扩大传递范围、减少种畜饲养量、节约饲料和管理成本以及不受时间、地域、种畜生命限制等优点。尽管引进种猪精液可能导致疾病传入的风险相对较小,但并非没有风险。一些重要的传染病,如非洲猪瘟、猪繁殖和呼吸综合征等仍然可以通过精液进行传播。因此在引进国外优良种猪精液的同时,如何保证进境精液不携带任何传染病,保护我国畜牧业发展的安全,成为检验检疫部门面临的重要课题,而风险分析是解决这一课题的重要工具。 本研究根据国际上动物疫病的最新流行状况及研究进展,参考国际上已有的通行做法（国际标准、准则和建议等）,结合我国动物疫病的实际情况,主要以OIE定性的方法对进口猪精液过程中的风险因素进行评估。找出了52种与猪精液传播有关的潜在疾病,在此基础上,通过初步分析确定19种疾病作为重点关注疾病,针对19种重点关注疾病展开详细评估,并提出了相应的适合我国风险保护水平的检疫措施。根据评估结果,结合我国相关法律法规,制定了符合WTO、OIE、SPS要求又适合我国风险保护水平的进境猪精液风险管理措施:“向中国申请猪人工授精中心注册兽医问卷”、“进境种猪精液卫生检疫要求”、“向中国申请猪人工授精中心注册的卫生要求”、“进境猪遗传物质备案场兽医卫生要求”。该报告已经成为我国制定进口动物遗传物质检疫措施的重要科学依据,并被WTO主要成员国家所接受。
王秋菊[5]（2012）在《山东省部分地区羊布鲁氏菌病、口蹄疫、戊型肝炎血清学调查》文中研究表明为了解山东地区羊布鲁氏菌病、口蹄疫、戊型肝炎的流行和感染情况，在2011年3月到7月间我们从山东青岛、莱芜和菏泽三个地区采集685份羊血清样品，其中绵羊315份，山羊370份，这些羊均未免疫过布鲁氏菌和戊型肝炎疫苗，但免疫过口蹄疫疫苗，采用血清学方法对羊布鲁氏菌病、口蹄疫、戊型肝炎进行了血清学调查。用RBT、SAT、iELISA以及cELISA四种方法同时对685份血清检测进行布鲁氏菌病的检测，阳性结果分别为19.6%、18.7%、18.7%、18.4%。RBT阳性检出率最高，SAT和iELISA以及cELISA三种方法的阳性检出率相差不大。因地区、年龄、性别、品种不同阳性率之间存在差别，SAT试验结果:青岛地区213份血清中检测出20份阳性，阳性率为9.4%；莱芜地区277份血清中有38份检测为阳性，阳性率为13.7%；菏泽地区最高，195份血清样品中检测出70份阳性阳性率为32.3%。517份成年羊血清中检出110份阳性，阳性率为22.3%；168份幼年羊血清样品中检测出18份为阳性，阳性率10.7%。619份母羊血清中有122份为阳性，阳性率19.7%；66份公羊血清中检测出6份阳性血清，阳性率9.1%。370份山羊血清中检测出41份，阳性率11.1%；315份绵羊血清中检测出阳性87份，阳性率27.6%。结果表明，山东省羊群间布鲁氏菌病仍在流行，有较高的感染率，并且存在明显的地区差异,绵羊的感染率高于山羊的感染率，成年羊的感染率高于幼龄羊的感染率，母羊的感染率高于公羊的感染率。在结合国内外口蹄疫的研究进展的基础上，采用3ABC-i-ELISA试剂盒进行血清学检测，以非结构蛋白3ABC为抗原，检测动物体内的非结构蛋白抗体以明确动物是否曾经感染过FMDV，检测685份羊血清样品，共检出93份阳性血清，平均阳性率为13.6%。青岛地区213份血清中检测出17份阳性血清，阳性率8.0%；莱芜地区277血清中检测出43份为阳性，阳性率15.5%；菏泽地区的195份血清中检测出93份为阳性，阳性率为16.9%。不同品种的羊口蹄疫的感染率也不相同，本次调查的370份山羊血清中有44份为阳性，阳性率为11.9%；315份绵羊血清中检出49份阳性血清，阳性率为15.6%。结果显示山羊和绵羊均有较高的感染率，并且绵羊的感染率略高于山羊的感染率，三个地区的羊均发现有感染过FMDV，并且有较高的阳性率，其中菏泽地区的阳性率高达16.9%。应用双抗原夹心酶联免疫法（DS-ELISA）对685份羊血清样品中抗戊型肝炎病毒（HEV） IgG抗体进行了检测，结果所有样品中抗HEV抗体均为阴性,这表明本次抽查的羊没有感染过戊型肝炎病毒，但是不能说明整个山东地区羊群中没有戊型肝炎病毒的感染。据新疆省调查发现从山东省引进的小尾寒羊中检出戊型肝炎病例，因此在以后的生产中应该对戊型肝炎进行及时的检测并且要采取有效地防控措施，减少戊型肝炎的感染和发病。通过本次调查，了解了山东地区羊布鲁氏菌病、口蹄疫、戊型肝炎的流行和感染状况，为今后的防制工作提供理论依据，有利于减少经济损失，促进养羊业健康快速发展。
于敏[6]（2007）在《猪戊型肝炎病毒全基因组序列分析及感染性克隆的构建》文中进行了进一步梳理戊型肝炎（Hepatitis E）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的急性自限性疾病。其临床特征为发热、全身疲乏、食欲不振、厌油腻、恶心、呕吐、尿色深黄如浓茶、眼睛和皮肤发黄，肝功能检查出现转氨酶迅速升高到几百甚至几千单位，黄疸较常见，并可持续1周。在亚洲、非洲和美洲等发展中国家人群中发生比较普遍，在一些地区可占到急性病毒性肝炎的50％，是导致发病和病死的重要因素，尤其对孕妇可造成有20％的病死率。对人类健康具有严重危害性。HEV过去曾被认为是一种经肠道传播的非甲-非乙型肝炎病毒。Balagan等用免疫电镜技术从一名志愿受试者粪便中观察到直径为27～30nm的病毒样颗粒，从而证实该病毒为新型的非甲非乙型肝炎病毒，1989年东京国际会议正式将这一类型的肝炎及其相关病毒分别命名为戊型肝炎和戊型肝炎病毒。HEV基因组为单股正链RNA，约7.5kb，具有3个开放读码框（ORF）。病毒基因组的5′端到3′端依次为5′端非编码区（5′-NCR）、ORF1、ORF3、ORF2、3′-NCR及polyA尾。不同地区来源的HEV基因序列有一定的差异，但是同一地区来源的HEV的基因序列保持相对稳定。随着HEV不断被分离、克隆和鉴定，根据各毒株核苷酸和氨基酸的同源性的大小以及系统进化树的分析，全球的HEV至少有8个基因型。我国主要为Ⅰ和Ⅳ型，而且散发性戊型肝炎中以Ⅳ型为主。为了确定黑龙江省猪群中流行的HEV的基因型，以便更深入分析猪源HEV与人源HEV的关系，本研究采用RT-PCR方法对从猪粪便样品中分离的HEV大庆株（swOQ）的全基因组进行分片段扩增，并对其两个末端采用末端快速扩增法（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）进行扩增、克隆和测序。测序结果表明swDQ株去除3′端poly（A）尾全长为7234bp，5′-NCR为26bp，3′-NCR为69bp。5′和3′非编码区之间有3个ORF，ORF1从27到5144位核苷酸，全长5118bp，编码1705个氨基酸。ORF2从5141-7165位核苷酸，全长2025bp，编码674个氨基酸。ORF3从5169到5513位核苷酸，全长345bp，编码114个氨基酸，此序列已经登陆GenBank，序列号为DQ279091。通过生物学软件，将swDQ与已报道的4个基因型的29株HEV核苷酸和氨基酸序列比较发现，swDQ HEV全序列与HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ的同源性在74.7～79.1％之间，而与Ⅳ型HEV的同源性最高，其中ORF1区与Ⅳ型HEV核苷酸的同源性为81.9～83.5％，氨基酸同源性为93.5～94％，ORF2区与Ⅳ型HEV核苷酸的同源性为87.1～88.1％，氨基酸同源性为96.4～97.6％，ORF3区与Ⅳ型HEV核苷酸的同源性为94.4～96.5％，氨基酸同源性为90.3～96.5％。系统进化分析可以看出，核苷酸的进化与Ⅳ型HEV在一个分枝上，表明swDQ为Ⅳ型HEV。本研究首次报道了在中国黑龙江省猪体内分离到Ⅳ型HEV的全基因组序列。由于缺乏合适的体外培养系统影响HEV分子生物学特性的进一步研究，获得HEV的感染性分子克隆后，就可在DNA水平上通过突变、缺失、插入和互补等手段来研究HEV的基因复制和表达、RNA的自发重组和诱导重组、RNA病毒与宿主的相互作用（如病毒在细胞间的传递机制）等，也可进行抗病毒策略研究，还可用于构建新的病毒载体。在国内对猪HEV病毒的拯救尚属空白。本研究在已知猪HEV swDQ株全基因组序列的基础上，根据基因组和克隆载体的酶切位点，将猪HEV全基因组分为6个片段进行了RT-PCR扩增，将得到的片段经过一系列的克隆和亚克隆后，分别构建了含有基因组全长cDNA克隆的pHE和pCHE重组质粒。在pHE中，cDNA克隆的5′端上游引入了T7启动子序列，并选取一个克隆在3′端引入了分子标志NruI位点。进行全序列测序后，发现了7个核苷酸的缺失和一个核苷酸的插入，运用PCR突变修补了突变的碱基，最终获得了含有分子标志NruI的HEV swDQ株基因组全长cDNA的重组质粒pHEa。体外转录后，转染A549细胞和HepG2细胞，通过间接免疫荧光试验和RT-PCR初步检测为阳性。在pCHE中cDNA克隆的5′端上游引入了T7启动子序列、锤头状核酶；3′端引入了丁型肝炎病毒核酶，利用载体上的CMV、β-actin启动子，将含有HEV swDQ株基因组全长cDNA的pCHE转染A549细胞和HepG2细胞后，通过间接免疫荧光试验和RT-PCR初步检测为阳性。以上结果证明，含有HEV swDQ株基因组全长cDNA的pHEa和pCHE重组质粒是有感染性的。本研究首次在我国构建出了猪HEV感染性克隆。综上所述，本研究在充分普查黑龙江省猪群中戊型肝炎的流行及分布的基础上，对来源于猪粪便中的swDQ HEV进行了全基因组序列分析，确定该地区猪群中流行的HEV的基因型，以便更深入分析猪源HEV与人源HEV的关系。而且在获得全基因组序列的基础上构建了分别利用含有CMV、β-actin启动子和T7启动子的两个感染性克隆，获得有感染性的转录本，拯救出猪HEV，为HEV的分子生物学研究及基因工程疫苗研究打下基础，填补了国内空白。
陈少渠[7]（2006）在《AIV（H9N2）NS1蛋白单抗的研制及单抗介导ELISA对AIV（H9N2）HA抗原表位变异研究》文中认为禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）的非结构蛋白（NS1）可作为一种区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群的鉴别诊断标记，但不能区分AIV亚型，具有A型流感特异性。本文利用本河南农业大学禽病研究所实验室已构建的含有H9N2亚型AIV NS1蛋白基因的重组表达载体阳性菌，在37℃条件下，用终浓度1mmol／L的IPTG诱导表达5h，经15％的SDS-PAGE分析，表明NS1基因在大肠杆菌中得到高效表达。用HisTrap HP Kit进行复性和纯化，获得了纯度较高、生物活性较好的NS1蛋白。以此NS1蛋白作为抗原免疫Balb／c小鼠，应用杂交瘤技术，通过ELISA筛选，建立了2株抗H9N2亚型AIV NS1单克隆抗体（Monoclonal Antibody，McAb，简称单抗）杂交瘤细胞株689和6C2，其分泌单抗抗能力稳定。将2株杂交瘤细胞株分别注射小鼠收获的腹水单抗效价分别为100×212和100×210。制备的单抗有良好的热稳定性和较高的特异性，只与AIVNS1蛋白反应，而与H5N2亚型AIV、H9N2亚型AIV、NDV、IBV、IBDV、ILTV、EDS76V均不发生反应。NS1蛋白单抗的成功研制为利用该单抗开发一种快速、特异、敏感的鉴别野毒感染禽群和疫苗免疫禽群的方法及进一步研制诊断试纸条或组装成试剂盒奠定了基础，也为深入研究NS1蛋白的结构和功能奠定了良好的基础，对AI的早期诊断、适时监控和净化具有重要现实意义。 目前H9亚型AI仍是我国的流行主型，由于AIV抗原性和致病力的易变异性及不同血清型毒株间缺乏交叉保护性，加大了AI防制的难度。本试验将本实验室已建立的4株抗H9N2亚型AIV血凝素（HA）单克隆抗体与保存的1998-2005年间的25株H9N2亚型AIV毒株进行交叉ELISA试验，发现不同H9N2亚型AIV毒株血凝素（HA）抗原表位及毒力有明显差异，可将25株H9N2型AIV毒株分为4类，进一步证实了不同H9N2型AIV毒株HA抗原表位和毒力的变异性和多态性。其中2株毒株（A3和A18）比较特殊，与4株H9N2亚型AIV HA单抗均不发生反应，缺少4株单抗所识别的HA抗原表位，但其毒力很强。对25株H9N2亚型AIV毒株进行深入研究将对H9N2型AIV的防制在理论和实践上均具有一定的指导意义。
李丹丹[8]（2008）在《猪戊型肝炎病毒V1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定》文中研究表明戊型肝炎（Hepatitis E）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）引起的急性自限性疾病。其临床特征为发热、全身疲乏、食欲不振、厌油腻、恶心、呕吐、尿色深黄如浓茶、眼睛和皮肤发黄,肝功能检查出现转氨酶迅速升高到几百甚至几千单位,黄疸较常见,并可持续1周。在亚洲、非洲和美洲等发展中国家人群中发生比较普遍,在一些地区可占到急性病毒性肝炎的50%,是导致发病和病死的重要因素,尤其对孕妇可造成有20%的病死率。由于在灵长类、啮齿类以及各种家禽家畜体内也检测到HEV抗体,提示其可能为一种人畜共患病。HEV过去曾被认为是一种经肠道传播的非甲-非乙型肝炎病毒。Balagan等用免疫电镜技术从一名志愿受试者粪便中观察到直径为2730nm的病毒样颗粒,从而证实该病毒为新型的非甲非乙型肝炎病毒,1989年东京国际会议正式将这一类型的肝炎及其相关病毒分别命名为戊型肝炎和戊型肝炎病毒。HEV基因组为单股正链RNA,约7.5kb,具有3个开放读码框（ORF）。病毒基因组的5′端到3′端依次为5′端非编码区（5′-NCR）、ORF1、ORF3、ORF2、3′-NCR及polyA尾。HEV全球分布,危害严重。虽然HEV诊断方法不断得到改进,但是安全有效疫苗的研制是控制HEV感染、预防HE发生的根本措施。明确HEV抗原表位是开发HEV诊断试剂和研制疫苗的基础。国内外曾就重组蛋白和合成肽对HEV ORF2编码结构蛋白的免疫原性做了大量研究,发现在其羧基端集中了具有较强免疫反应性的主要抗原表位。ORF2编码的衣壳蛋白的上抗原表位数量多,结构复杂,其富含疏水区的C端2/3部分存在多个免疫优势B细胞表位,包括能诱导中和抗体的抗原结合位点。因此本研究使用的免疫原是原核表达的含有swDQ株HEV ORF2 C端220个氨基酸残基的V1蛋白,制备了6株针对V1蛋白的单抗,而通过单克隆抗体技术对HEV抗原表位进行深入研究,不仅有助于了解HEV抗原结构与功能的关系,而且对该病的诊断以及设计安全有效的基因工程表位疫苗等具有重要的意义。本研究首先构建了含swDQ株HEV V1蛋白的原核表达载体pET32a-V1,并在大肠杆菌中进行了表达,利用HEV感染猪血清对表达产物进行Western blot分析,证实表达的融合蛋白都具有较好的反应活性。然后以表达的融合蛋白为抗原,免疫BAL B/c小鼠,最终共获得了6株针对V1蛋白的单抗。利用肽扫描技术对6株V1蛋白的单克隆抗体（αC11、αC12、γH1、γF8、BC4、CH8）的抗原表位进行了研究。将V1蛋白基因分为两个相互重叠的基因片段M1和M2,对6株抗V1蛋白的单抗进行鉴定,结果显示有3株单抗既能特异性识别M1又能识别M2的表达产物,说明这三株单抗所针对的表位位于M1和M2的重叠区,即位于ORF2 492500aa （HEV ORF2编码的病毒结构蛋白的492500aa）;其余3株单抗中有两株单抗仅能识别M1的表达产物,另外一株单抗仅能识别M2的表达产物。将片段M1（386-492aa）和M2（500-606aa）人工合成一套彼此重叠8个氨基酸长度为16个氨基酸的25个短肽,融合表达后与MAbs进行Western blot和ELISA反应性扫描,对3株单抗鉴定结果显示,一株单抗与融合多肽E4和E5反应而不与其他短肽反应,说明这株单抗所针对的表位位于E4与E5的重叠区ORF2 418425aa（HEV ORF2编码的病毒结构蛋白的418425aa）;有一株单抗能特异性识别融合多肽E1而不识别融合多肽E2,说明这株单抗所针对的表位位于E1与E2的不重叠区ORF2 386394aa（HEV ORF2编码的病毒结构蛋白的386394aa）;另外一株单抗与融合多肽E24和E25反应而不与其他短肽反应,说明这株单抗所针对的表位位于E24与E25的重叠区ORF2 588595aa（HEV ORF2编码的病毒结构蛋白的588595aa）。其中,表位418425aa和表位492500aa为首次发现。应用纯化的表位融合蛋白对小鼠进行免疫,结果表明4个融合蛋白均能诱导小鼠产生针对短肽的特异性抗体。将纯化的表位融合蛋白进行SDS-PAGE电泳,与抗swDQ株HEV猪血清进行Western blot分析,结果表明这四个表位融合蛋白具有较好的反应原性。本研究对swDQ株HEV V1蛋白进行抗原表位的鉴定,将有助于进一步阐明HEV的结构与功能,将为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法和基于表位疫苗的设计研究提供重要的研究工作基础。
李娟[9]（2007）在《猪肠道病毒的分离鉴定及其全基因组序列测定与分析》文中研究说明【目的】猪肠道病毒感染（Porcine enterovirus infection）是由猪肠道病毒（Porcine enterovirus,PEV）所引起,有多种不同的临床表现,如猪脑脊髓灰质炎、生殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤及无症状等,是一种危害养猪业的重要传染病。本研究通过接种PK细胞分离鉴定出一株此病毒,参考GenBank已发表猪肠道病毒-9型参考株UKG 410/73（Y14459）的序列设计合成引物,克隆并测定了猪肠道病毒分离株的全基因序列,为进一步对该病的诊断和预防奠定了基础。【方法】本研究将采集的病料,经过PBS悬浮后,在PK细胞中盲传数代,直到出现细胞病变,最后细胞从瓶壁脱落。反复冻融3次后,收集细胞及培养液,电镜观察,发现病毒粒子。根据GenBank已发表的各型猪肠道病毒5’UTR高度保守区的序列设计特异性引物,通过RT-PCR方法扩增得到目的基因,并克隆到pMD-18 T载体上,进行序列测定,用DNAStar软件与NCBI BLAST上相关序列比较分析,根据同源性最高的序列设计特异性引物进行分离株全基因组的序列测定,并与30株参考毒株的核苷酸序列和推导氨基酸序列进行比对。【结果】所采集的病料,在PK细胞中盲传3代便出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。用磷钨酸负染电镜观察,病毒呈圆形、无囊膜,且呈二十面体对称。通过RT-PCR方法得到的5’UTR序列与猪肠道病毒参考株UKG 410/73（Y14459）同源性最高,核苷酸同源性为85.5%,结合免疫电镜检测鉴定该病毒属于猪肠道病毒。根据UKG 410/73（Y14459）基因设计8对引物扩增出了分离株的核苷酸全序列。通过与30株毒株比对分析,该分离株与UKG 410/73（Y14459）同源性最高,核苷酸同源性为85.7%,氨基酸同源性为86.6%,根据核苷酸和氨基酸遗传系统进化树分析表明,该分离株与肠道病毒9型属于同一型病毒,证明我国也存在有猪肠道病毒感染。
朱长康[10]（2012）在《猪瘟病毒人工慢性感染的组织病理学和病毒核酸载量动态分布研究》文中提出猪瘟（Classical Swine Fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV）引起的猪的高度致死性、接触性传染病。本研究通过研究猪瘟慢性感染过程中的组织病理学变化以及CSFV中等致病力毒株的组织嗜性和病毒核酸载量的动态分布,揭示我国CSFV慢性感染的致病性特征,为进一步探讨CSF持续感染的致病机理提供一定的实验依据。本研究以肌肉注射的方式对11头30日龄健康断奶仔猪人工感染CSFV中等致病力毒株HeBHHl/95株（滴度为5×103.5TCID50/ml）,构建猪瘟慢性动物感染模型,同时设2头阴性对照猪,感染后每天测量猪的体温并对临床症状进行打分记录。在第1dpi、3dpi、6dpi每次剖杀2头感染猪,lOdp、15dpi、25dp、35dpi、45dpi每次剖杀1头感染猪,共11头猪,采集每头猪组织器官和体外分泌物共30种,每个组织采集多个备份,一份HE染色和免疫组化实验,一份用FQ-PCR法检测组织内CSFV核酸载量,同时监测整个感染过程中外周血抗体水平的变化趋势。根据临床打分和体温变化的趋势,可以将整个慢性感染病程分成三个阶段,即潜伏期（ldpi～7dpi）、发病期（8-24dpi）、转归期（25dpi～45dpi）。潜伏期内感染猪体温正常,无明显临床症状,此时剖杀的感染猪,各器官眼观无病变；发病期体温逐渐升高至41.5℃,临床表现为精神倦怠,食欲不振,腹泻,腋下皮肤发红,淋巴结肿大。感染猪剖杀后发现全身淋巴结出血,脾脏有轻微梗死,肾脏表面有出血点。19dpi后体温开始慢慢降低,临床症状逐渐消失；转归期体温正常,食欲正常,除偶尔拉稀,未见其他发病症状。此时期感染猪剖杀后除淋巴结有轻微出血、水肿,其他器官未见病变。组织切片HE染色后发现,第3dpi,腹股沟淋巴和颌下淋巴结开始出现炎性细胞浸润,微血栓形成；脾脏小梁周围可见红细胞、炎性细胞浸润；扁桃体黏膜表面可见炎性细胞浸润,淋巴小结中淋巴细胞变性,此时其他组织未见病变。随着病程的发展,其他组织逐渐出现病变,第15dpi,所有组织均表现出不同程度的病变,主要是组织微血管出血、形成血栓以及炎性细胞浸润和组织细胞坏死。在感染后期（第35dpi和45dpi）,大部分器官组织已经转归,未发现明显组织病理变化,只有免疫器官、肾脏、肝脏以及十二指肠仍可见组织病变,但病变程度明显小于发病期。以上结果说明在潜伏期时,感染猪虽然没有明显的临床症状,但部分免疫器官已经出现病变;发病期各组织器官出现典型的猪瘟组织病理变化；转归期时大部分组织都从发病期的病理状态恢复正常,但是免疫器官和部分脏器仍处于轻微病理状态。免疫器官最早出现病变,并且在整个病程中无法恢复。免疫组化结果显示,1dpi,所有组织器官均未发现CSFV阳性细胞；3dpi,脾脏、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、回盲瓣、回肠等组织的淋巴细胞中最先发现CSFV阳性信号；6dpi,肝脏、胃、十二指肠、胰腺、结肠、直肠、肾脏中发现CSFV阳性细胞；10dpi～45dpi,所有样本组织中均发现CSFV阳性细胞。通过免疫组化发现慢性猪瘟感染初期CSFV主要定居在外周免疫器官的淋巴细胞和单核/巨噬细胞内,再通过血液循环扩散到其他组织器官中。随着病程的发展,发病期CSFV感染细胞的类型以及阳性细胞数量明显增加,15dpi,样本组织中均发现大量CSFV阳性细胞,包括各组织细胞和淋巴细胞；转归期,CSFV感染细胞的类型未变,各组织细胞或淋巴细胞中仍可见CSFV阳性物质,但阳性细胞数量有所下降,其中免疫器官、肾脏、肝脏、胰腺等阳性细胞数量略微降低,其他组织器官阳性细胞数量降低明显。FQ-PCR结果显示,在整个慢性感染病程中,各样本组织中CSFV病毒核酸载量经过潜伏期、发病期和转归期等阶段呈现从低到高再降低的变化趋势。即从潜伏期到发病期逐渐增多,从发病期到转归期均降低,但降低幅度不尽相同,病毒核酸检测结果与免疫组化结果大致相同。CSFV中等致病力毒株对各个组织嗜性从大到小依次为脾脏、颌下淋巴结、回肠、腹股沟淋巴结、扁桃体、肠系膜淋巴结、胰腺、肾脏、皮肤、肺脏、回盲瓣、空肠、肝脏、食道、胃、结肠、睾丸、十二指肠、膀胱、直肠、心肌、脊髓、肌肉、大脑。同时从尿液、粪便、唾液中检测出CSFV,反应出慢性猪瘟体外排毒,是重要CSFV传染源。在整个感染过程中,猪瘟病毒的抗体水平均呈阴性。综上所述,由中等致病力毒株建立的猪瘟慢性感染,从潜伏期到发病期,随着各组织病毒载量的提高,临床症状和组织病理学变化逐渐加重；。经过毒株与宿主之间的相互作用,病毒在病程中逐渐适应机体；在转归期,病毒与组织细胞共生,临床症状逐渐消失,除免疫器官和少数组织器官仍有轻微病变,大部分组织恢复正常,但整个感染过程中,猪瘟病毒抗体水平均为阴性。在整个猪瘟慢性病程中,临床表现、病理变化和免疫组化研究及病毒载量监测均表现出一致性,体现了CSFV中等致病力毒株的致病性特征：对淋巴器官具有持续性的、不可恢复性的损伤,对其他组织的损伤具有可恢复性。因而使感染猪变成具有一定程度免疫功能障碍而不表现出临床症状的慢性带毒猪。
二、关于猪水泡病病毒轻度和亚临床感染（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、关于猪水泡病病毒轻度和亚临床感染（论文提纲范文）
（2）猪水泡病毒VP1基因克隆、表达及其检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 猪水泡病研究进展 |
| 1.1 SVDV病原学 |
| 1.1.1 病毒分类与特性 |
| 1.1.2 基因组结构 |
| 1.1.3 病毒蛋白质的结构和功能 |
| 1.1.4 SVDV的抗原结构 |
| 1.2 SVDV流行病学 |
| 1.2.1 流行与危害 |
| 1.2.2 病毒的繁殖与复制 |
| 1.2.3 SVDV的传播 |
| 1.3 SVDV诊断技术及其研究进展 |
| 1.3.1 动物试验 |
| 1.3.2 血清抗体检测方法 |
| 1.3.3 核酸诊断 |
| 1.4 SVD的控制和预防 |
| 1.5 本论文的研究目的和研究策略 |
| 第二章 猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要材料及试剂 |
| 2.2.2 主要试剂配制 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 技术路线 |
| 2.2.5 病毒基因组RNA的提取 |
| 2.2.6 cDNA的反转录 |
| 2.2.7 SVDV-VP1基因的PCR扩增 |
| 2.2.8 PCR产物的小量胶回收 |
| 2.2.9 感受态细胞的制备 |
| 2.2.10 克隆及表达载体的构建 |
| 2.2.11 重组表达质粒在TOPO10E.coli细胞中的诱导表达 |
| 2.2.12 SDS-PAGE分析表达蛋白 |
| 2.2.13 表达产物的Western blotting检测 |
| 2.2.14 重组蛋白的小批量生产和纯化 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 目的片段的克隆与鉴定 |
| 2.3.2 SVDV VP1基因的亚克隆及重组表达质粒的构建 |
| 2.3.3 SVDV核蛋白表达重组质粒的序列分析 |
| 2.3.4 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.3.5 表达产物的Western blotting检测 |
| 2.3.6 重组基因表达产物的纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 VP1基因的选择 |
| 2.4.2 基因表达系统的选择 |
| 2.4.3 VP1基因表达 |
| 2.4.4 表达产物的纯化 |
| 第三章 猪水泡病检测技术的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 病毒株、细胞和主要试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.2.4 猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2.5 多重PCR检测口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎的研究 |
| 3.2.6 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的研究 |
| 3.2.7 应用重组抗原建立检测猪水泡病抗体的间接ELISA方法的研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.3.2 多重PCR检测口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎的研究 |
| 3.3.3 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的研究 |
| 3.3.4 应用重组抗原建立检测猪水泡病抗体的间接ELISA方法的研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.4.2 多重PCR检测口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎的研究 |
| 3.4.3 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的研究 |
| 3.4.4 应用重组抗原建立检测猪水泡病抗体间接ELISA方法的研究 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）进境猪精液风险分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略表 |
| 1 引言 |
| 1.1 背景 |
| 1.2 国内外相关法律法规 |
| 1.2.1 国际框架 |
| 1.2.2 国内相关法律法规 |
| 1.3 风险分析的方法 |
| 2 风险因素的确定 |
| 2.1 潜在致病因素的范围 |
| 2.2 风险因素确定的原则和标准 |
| 2.3 潜在致病因素的评估 |
| 2.4 风险因素(即重点关注疾病)名单 |
| 3 风险评估 |
| 3.1 口蹄疫 |
| 3.2 猪繁殖呼吸综合征 |
| 3.3 日本脑炎 |
| 3.4 马脑脊髓炎 |
| 3.5 猪细小病毒病 |
| 3.6 尼帕病毒病 |
| 3.7 断乳猪多系统衰竭综合征／PMWS |
| 3.8 猪水疱疹病毒病 |
| 3.9 猪腮腺炎 |
| 3.10 猪水泡病 |
| 3.11 非洲猪瘟 |
| 3.12 猪瘟 |
| 3.13 水泡性口炎 |
| 3.14 牛瘟 |
| 3.15 伪狂犬病 |
| 3.16 捷申病 |
| 3.17 猪布氏杆菌病 |
| 3.18 猪结核杆菌病 |
| 3.19 钩端螺旋体 |
| 4 风险管理 |
| 4.1 向中国申请猪人工授精中心注册的要求 |
| 4.2 进境种猪精液卫生检疫要求 |
| 4.3 进境猪精液备案企业兽医卫生要求 |
| 4.4 向中国申请猪人工授精中心注册的兽医问卷 |
| 参考文献 |
| 附录1 重点关注疾病推荐检疫管理措施总结 |
| 附录2 表1-1：列入OIE《法典》疾病名单按以下标准 |
| 附录3 表2-1：进口猪精液过程中的潜在风险因素评估 |
| 附录4 进境动物遗传物质检疫管理办法 |
| 附录5 世界动物卫生组织(OIE)对动物精液的卫生检疫要求 |
| 附录6 世界动物卫生组织(OIE)关于种猪精液的国际动物健康检疫证书模式 |
| 致谢 |
（5）山东省部分地区羊布鲁氏菌病、口蹄疫、戊型肝炎血清学调查（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 布鲁氏菌病概述 |
| 1.1.1 病原学特征 |
| 1.1.2 流行病学特征 |
| 1.1.3 发病机理 |
| 1.1.4 临床表现 |
| 1.1.5 病理变化 |
| 1.1.6 疫情及发展趋势 |
| 1.1.7 诊断方法概述 |
| 1.2. 口蹄疫概述 |
| 1.2.1 病原学特征 |
| 1.2.2 流行病学特征 |
| 1.2.3 发病机理 |
| 1.2.4 临床症状和病理变化 |
| 1.2.5 疫情及流行状况 |
| 1.2.6 诊断方法概述 |
| 1.3 戊型肝炎概述 |
| 1.3.1 病原学特征 |
| 1.3.2 流行病学特征 |
| 1.3.3 发病机理和临床症状 |
| 1.3.4 流行状况 |
| 1.3.5 诊断方法概述 |
| 1.4. 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 布鲁氏菌病检测结果 |
| 3.2 口蹄疫检测结果 |
| 3.3 戊型肝炎检测结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（6）猪戊型肝炎病毒全基因组序列分析及感染性克隆的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 戊型肝炎的研究进展 |
| 1.1.1 戊型肝炎的病原学 |
| 1.1.2 戊型肝炎的流行病学 |
| 1.1.3 戊型肝炎临床症状和病理变化 |
| 1.1.4 戊型肝炎的诊断 |
| 1.1.5 戊型肝炎疫苗的研究 |
| 1.1.6 戊型肝炎的预防 |
| 1.2 RNA病毒的反向遗传操作研究 |
| 1.2.1 感染性克隆的构建 |
| 1.2.2 感染性克隆的产生 |
| 1.2.3 感染性克隆的应用 |
| 1.2.4 RNA病毒感染性克隆构建的国内外研究进展 |
| 1.2.5 戊型肝炎病毒反向遗传操作的研究 |
| 1.3 戊型肝炎病毒研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 粪便样品及血清 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.1.5 细胞菌株质粒与载体 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 猪戊型肝炎病毒全基因组克隆及序列分析 |
| 2.2.2 重组质粒pHEa的构建 |
| 2.2.3 重组质粒pCHE的构建 |
| 2.2.4 重组质粒pHEa、pCHE的大量制备 |
| 2.2.5 重组质粒pHEa的体外转录 |
| 2.2.6 A549和HepG2细胞的培养 |
| 2.2.7 重组质粒pHEa体外转录本及pCHE质粒的转染 |
| 2.2.8 全基因组感染性克隆cDNA的感染性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪戊型肝炎病毒全基因组克隆及序列分析 |
| 3.1.1 猪戊型肝炎病毒阳性样品的选择 |
| 3.1.2 全基因组扩增结果 |
| 3.1.3 基因组序列测定结果 |
| 3.2 猪HEV重组质粒pHEa构建 |
| 3.2.1 EcoRV酶切位点及T7启动子的引入 |
| 3.2.2 分子标志NruI的引入 |
| 3.2.3 pHE重组质粒构建 |
| 3.2.4 重组质粒pEH的修正 |
| 3.3 重组质粒pCHE的构建 |
| 3.3.1 T7启动子及核酶的引入 |
| 3.3.2 重组质粒pCHE构建 |
| 3.4 基因组全长cDNA感染性的检测 |
| 3.4.1 细胞病变的观察 |
| 3.4.2 间接免疫荧光试验(IFA)检测培养细胞 |
| 3.4.3 RT-PCR检测 |
| 3.4.4 电镜检测病毒粒子 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HEV阳性样品的选择 |
| 4.2 猪戊型肝炎病毒全基因组克隆及序列分析 |
| 4.3 感染性克隆cDNA的完整性与真实性 |
| 4.4 重组质粒感染性较低的可能原因及未来的解决方法 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（7）AIV（H9N2）NS1蛋白单抗的研制及单抗介导ELISA对AIV（H9N2）HA抗原表位变异研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 试验一 H9N2 亚型禽流感病毒NS1蛋白单克隆抗体的研制 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 结论与讨论 |
| 试验二 单抗介导的ELISA 对H9N2亚型禽流感病毒HA抗原表位变异的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 附录 |
（8）猪戊型肝炎病毒V1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 戊型肝炎的研究进展 |
| 1.1.1 戊型肝炎的病原学 |
| 1.1.2 戊型肝炎流行病学 |
| 1.1.3 戊型肝炎的临床症状和病理变化 |
| 1.1.4 戊型肝炎诊断 |
| 1.1.5 戊型肝炎疫苗的研究 |
| 1.1.6 戊型肝炎的预防 |
| 1.2 HEV 抗原表位的研究 |
| 1.3 HEV 抗原位点的研究方法 |
| 1.3.1 多肽合成技术 |
| 1.3.2 噬菌体展示技术 |
| 1.3.3 生物传感器技术 |
| 1.3.4 蛋白质结构预测技术 |
| 1.3.5 利用抗原抗体反应方法 |
| 1.4 HEV 抗原位点研究进展 |
| 1.4.1 ORF2 编码的蛋白 |
| 1.4.2 ORF3 编码的蛋白 |
| 1.5 本研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、菌种、细胞、血清 |
| 2.1.2 表达载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HEV V1 蛋白基因的表达与鉴定 |
| 2.2.1.1 引物设计 |
| 2.2.1.2 粪便样品的处理与核酸提取 |
| 2.2.1.3 V1 基因的 RT-PCR 扩增 |
| 2.2.1.4 PCR 产物的纯化和克隆 |
| 2.2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.1.6 连接产物的转化 |
| 2.2.1.7 质粒 DNA 的提取 |
| 2.2.1.8 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 2.2.1.9 重组质粒的酶切 |
| 2.2.1.10 pET-32a 的酶切 |
| 2.2.1.11 表达载体与目的片段的连接 |
| 2.2.1.12 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.1.13 融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2.1.14 Western blot 分析 |
| 2.2.2 HEV V1 蛋白的单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 细胞融合 |
| 2.2.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.2.2.4 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.2.2.5 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 2.2.3 HEV V1 蛋白抗原表位鉴定 |
| 2.2.3.1 V1 蛋白基因的分段克隆与表达 |
| 2.2.3.2 单克隆抗体识别的表位的初步鉴定 |
| 2.2.3.3 短肽融合蛋白的设计 |
| 2.2.3.4 短肽融合蛋白表达质粒的构建及表达纯化 |
| 2.2.3.5 HEV V1 蛋白抗原表位的定位与分析 |
| 2.2.4 检测鼠抗融合蛋白抗体 |
| 2.2.4.1 鼠抗表位融合蛋白血清的制备 |
| 2.2.4.2 ELISA 检测鼠抗融合蛋白免疫血清 |
| 2.2.5 表位反应原性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 HEV V1 蛋白基因的表达与鉴定 |
| 3.1.1 V1 蛋白基因表达载体的构建 |
| 3.1.2 V1 蛋白基因的表达及 Western-blot 分析 |
| 3.2 V1 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.2.1 阳性细胞克隆株的筛选 |
| 3.2.2 间接免疫荧光试验 |
| 3.2.3 ELISA 检测六株单抗与ORF2 其它部分片段的蛋白的反应性 |
| 3.2.4 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 3.3 HEV V1 蛋白抗原表位鉴定 |
| 3.3.1 M1、M2 基因表达载体的构建 |
| 3.3.2 M1、M2 蛋白基因的表达及 Western-blot 分析 |
| 3.3.3 V1 蛋白单克隆抗体抗原表位的初步鉴定 |
| 3.3.4 短肽融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.5 V1 蛋白抗原表位鉴定 |
| 3.4 鼠抗表位融合蛋白血清的制备 |
| 3.4.1 免疫用抗原的纯化 |
| 3.4.2 抗原表位的免疫原性 |
| 3.5 抗原表位反应原性的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 swDQ 株 HEV V1 蛋白的表达 |
| 4.2 swDQ 株 HEV V1 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4.3 swDQ 株 HEV V1 蛋白表位的鉴定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（9）猪肠道病毒的分离鉴定及其全基因组序列测定与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩写词英汉对照表 |
| 第一篇 文献综述 猪肠道病毒的流行病学、致病机制及分子生物学特征 |
| 1 猪肠道病毒的概述 |
| 2 猪肠道病毒的分类、血清学及理化特性 |
| 2.1 猪肠道病毒的分类 |
| 2.2 猪肠道病毒的血清分型 |
| 2.3 猪肠道病毒的理化特性 |
| 3 猪肠道病的流行病学、临床表现、发病机制及病理变化 |
| 3.1 猪肠道病的流行病学 |
| 3.2 发病机制 |
| 3.3 临床症状 |
| 3.4 病理变化 |
| 4 猪肠道病毒的诊断 |
| 4.1 病毒的分离 |
| 4.2 血清学诊断方法 |
| 4.3 分子生物学诊断技术 |
| 5 猪肠道病毒病毒粒子的结构特征 |
| 6 猪肠道病毒的基因组结构特征 |
| 7 病毒基因组的复制，蛋白的合成和病毒粒子装配 |
| 8 肠道病毒的结构蛋白和非结构蛋白及其功能 |
| 8.1 猪肠道病毒结构蛋白 |
| 8.2 猪肠道毒非结构蛋白 |
| 9 猪肠道病毒的抗原性 |
| 10 疫苗的研究及防制 |
| 第二篇 研究报告 猪肠道病毒的分离鉴定及其全基因组序列测定与分析 |
| 1 猪肠道病毒的分离与鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 病料 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 PK 细胞的制备、培养 |
| 1.2.2 PK 细胞的换液 |
| 1.2.3 病毒的分离 |
| 1.2.4 猪肠道病毒的分离 |
| 1.2.5 猪肠道病毒的培养 |
| 1.2.6 磷钨酸负染电镜观察 |
| 1.2.7 猪肠道病毒特异引物的设计 |
| 1.2.8 RT-PCR 反应 |
| 1.2.9 PCR 扩增产物电泳 |
| 1.2.10 5’UTR 序列测定 |
| 1.2.11 5’UTR 序列分析 |
| 2 猪肠道病毒全基因的序列测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试剂及配制 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.1.5 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪肠道病毒的分离与鉴定 |
| 3.1.1 病毒的细胞分离 |
| 3.1.2 磷钨酸负染电镜观察 |
| 3.1.3 5’端PCR 结果 |
| 3.1.4 5’UTR 核苷酸序列分析 |
| 3.2 猪肠道病毒全基因组序列分析 |
| 3.2.1 PCR 扩增结果 |
| 3.2.2 序列测定的结果及推导的氨基酸序列 |
| 3.2.3 序列测定的结果及其推导的氨基酸序列 |
| 3.2.4 猪肠道病毒毒株同源性比对结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪肠道病毒的分离与鉴定 |
| 4.2 猪肠道病毒与其它30 个毒株同源性的比较与分析 |
| 4.3 猪肠道病毒9 型的基因组特征 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 附录 |
（10）猪瘟病毒人工慢性感染的组织病理学和病毒核酸载量动态分布研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 CSFV病原学特征 |
| 1.1 结构蛋白 |
| 1.2 非结构蛋白 |
| 2 CSF的流行情况 |
| 2.1 CSFV分子流行病学 |
| 2.2 CSF全球流行趋势 |
| 2.3 CSF中国流行趋势 |
| 3 CSFV致病机理 |
| 3.1 CSF感染类型 |
| 3.2 CSFV持续性感染的致病特征 |
| 3.3 CSFV在宿主细胞的复制过程 |
| 3.4 CSFV强毒感染后在宿主体内的分布 |
| 3.5 CSFV免疫逃避机制 |
| 4 CSFV的检测技术 |
| 4.1 标记免疫抗体技术 |
| 4.2 分子生物学诊断技术 |
| 5 本研究目的意义 |
| 6 研究内容 |
| 6.1 CSF慢性感染的临床征候研究 |
| 6.2 CSF慢性感染的组织病理学研究 |
| 6.3 CSF慢性感染的组织嗜性、病毒核酸载量的动态分布以及抗体水平的变化研究 |
| 7 技术路线 |
| 第二章 猪瘟慢性感染后的组织病理学研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验用猪 |
| 1.2 实验用毒株 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CSFV慢性感染实验用猪的选择 |
| 2.2 CSFV慢性感染实验用猪的分组和攻毒 |
| 2.3 CSFV慢性感染实验用猪体温测定和临床打分 |
| 2.4 CSFV慢性感染实验用猪组织样本采集与固定 |
| 2.5 CSFV慢性感染实验用猪组织样本石蜡切片的制备 |
| 2.6 CSFV慢性感染实验用猪组织样本HE染色 |
| 3 结果 |
| 3.1 CSFV慢性感染实验用猪相关病原及抗体检测结果 |
| 3.2 CSFV慢性感染后临床症状、解剖症状观察结果 |
| 3.3 CSFV慢性感染后组织切片HE染色结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 从临床症状和解剖症状表明成功构建猪瘟慢性感染的动物模型 |
| 4.2 CSFV慢性感染的组织病理学研究 |
| 5 小结 |
| 第三章 猪瘟慢性感染后病毒核酸载量的动态分布研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 样品采集 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CSFV慢性感染实验用猪组织切片的制作 |
| 2.2 CSFV慢性感染实验用猪免疫组化操作步骤 |
| 2.3 CSFV慢性感染实验用猪样品RNA的提取 |
| 2.4 CSFV慢性感染实验用猪不同时期采集的外周血和体外分泌物FQ-PCR检测 |
| 2.5 CSFV慢性感染实验用猪外周血猪瘟抗体水平的监测 |
| 2.6 CSFV慢性感染实验用猪组织样本的病毒载量测定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CSFV慢性感染后免疫组化实验结果 |
| 3.2 CSFV慢性感染后外周血和体外分泌物的核酸检测结果 |
| 3.3 CSFV慢性感染后外周血抗体水平的监测 |
| 3.4 CSFV慢性感染后各组织中CSFV核酸载量检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CSFV慢性感染后病毒在体内的分布 |
| 4.2 CSFV慢性感染后病毒体外排毒情况 |
| 4.3 CSFV慢性感染后病毒核酸载量的动态分布 |
| 4.4 CSFV慢性感染引起的免疫抑制 |
| 4.5 CSFV慢性感染后病毒与宿主细胞的相互作用 |
| 5 小结 |
| 第四章 结论与创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 附录 |
| 组织病理切片图 |
| 样品组织免疫组化图 |
| 各组织核酸载量检测结果表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、关于猪水泡病病毒轻度和亚临床感染（论文参考文献）
- [1]关于猪水泡病病毒轻度和亚临床感染[J]. J.A.Mann,况乾惕. 兽医科技资料, 1977(S2)
- [2]猪水泡病毒VP1基因克隆、表达及其检测技术的研究[D]. 钟金栋. 昆明理工大学, 2007(02)
- [3]猪水疱病诊断技术的研究进展[J]. 王彬,汤德元,李春燕,曾志勇,张晓杰. 猪业科学, 2010(04)
- [4]进境猪精液风险分析[D]. 张敬友. 南京农业大学, 2005(05)
- [5]山东省部分地区羊布鲁氏菌病、口蹄疫、戊型肝炎血清学调查[D]. 王秋菊. 山东农业大学, 2012(02)
- [6]猪戊型肝炎病毒全基因组序列分析及感染性克隆的构建[D]. 于敏. 东北农业大学, 2007(01)
- [7]AIV（H9N2）NS1蛋白单抗的研制及单抗介导ELISA对AIV（H9N2）HA抗原表位变异研究[D]. 陈少渠. 河南农业大学, 2006(04)
- [8]猪戊型肝炎病毒V1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 李丹丹. 东北农业大学, 2008(03)
- [9]猪肠道病毒的分离鉴定及其全基因组序列测定与分析[D]. 李娟. 甘肃农业大学, 2007(01)
- [10]猪瘟病毒人工慢性感染的组织病理学和病毒核酸载量动态分布研究[D]. 朱长康. 四川农业大学, 2012(06)