一、检测牛病毒性腹泻－粘膜病病毒抗原试剂盒的研制及应用（论文文献综述）
马振国[1]（2019）在《新疆地区牛病毒性腹泻—粘膜病流行病学调查》文中认为牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosaldisease,BVD/MD）是一种由RNA病毒—牛病毒性腹泻病病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）所引起的以腹泻、发热、白细胞减少、口腔黏膜溃烂、怀孕母畜流产等一系列临床症状为特征的牛病毒性、接触性的传染病,当前农业部公告已经将BVDV定为三类疫病,世界动物卫生组织（OIE）也将其设为B类传染病。目的:由于国际合作交流贸易的日益频繁以及RNA病毒的高频突变型,使得BVDV出现了许多新的基因型和基因亚型,给BVDV的防控造成一定的难度。本研究通过对新疆某牛场发生的疑似牛病毒性腹泻病诊断分析、对新疆不同地区不同养殖类型牛进行现场流行病学的调查、血清学检测以及分子流行病学检测,了解新疆不同地区BVDV的血清学和分子流行病学的感染情况,鉴定流行株的基因型和基因亚型。方法:1.使用询问、临床观察、以及查阅免疫记录的方法对新疆12个不同地区的16个牛场关于在BVD/MD发病、牛群的健康水平以及疫苗的免疫和流行情况进行调查;2.应用现场解剖、采样送检等方法对新疆某牛场发生的牛群腹泻进行诊断分析;3.应用间接ELISA检测试剂盒对从新疆不同地区采集的5833份血清样品进行BVDV抗体、抗原的检测;4.对临床检测疑似BVDV感染的牛和血清抗原检测阳性率高的北疆地区牛采集样品,分别进行病毒的分离培养以及鉴定,同时把培养的病毒接种MDBK细胞,观察细胞病变,然后把培养的病毒和屠宰场采集的脾脏组织分别进行RNA的提取、RT-PCR的扩增、琼脂糖凝胶电泳分析、阳性样本回收测序,分析测序结果的正确序列,构建进化树等方法进行分析新疆地区BVDV主要的流行基因型和基因亚型。结果:1.新疆不同地区由于饲养管理、养殖环境以及疫苗免疫存在差别而使BVDV的感染也不同,以北部地区最高,西部地区和南疆地区次之,东部地区最低;2.发生腹泻的牛场经临床和实验室诊断,确诊为BVDV的感染;3.血清学检测抗体阳性率为52.03%（3035/5833）,抗原阳性率为3.35%（13/388）,并且是犊牛以及青年牛阳性率高于成年牛;4.从采集的病料样品中成功分离出了新疆地区主要流行的毒株命名为JD001株,病毒接种MDBK细胞未见细胞病变;20份临床疑似组织样品的RT-PCR结果14份是阳性。结论:1.BVDV的感染因地域和饲养管理不同存在差别,疫苗接种地区明显的抗体阳性率高;2.抗体、抗原阳性率水平不因养殖模式不同而存在差别,则说明养殖方式并不影响该病的流行,犊牛以及怀孕母牛的抗原阳性率最高,说明犊牛以及怀孕母牛容易感染BVDV;3.成功分离得到了新疆地区主要流行的毒株JD001株且为不致细胞病变型毒株,进化分析得到新疆地区流行株的基因型是BVDV-1型,基因亚型是1q。BVDV在新疆的感染率高、危害大,并且造成巨大经济负担,应加强对BVDV的防控。
张光辉[2]（2004）在《河南省肉牛规模化养殖场牛病毒性腹泻的诊断与防制技术研究》文中指出牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛、猪等动物的一种重要的传染病，临床主要表现为发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或畸形胎儿。世界每年死于BVDV感染的牛不少于500万头，占牛饲养总数的0.5％～1％。随着我国养牛业的迅速发展，国外品种不断引进，该病在我国发生、流行呈上升趋势。早在20世纪60年代，我国的云南、山东、四川等地就有类似该病发生。目前，该病在河南也普遍存在。为找到一种快速诊断BVD的方法，有效地控制其蔓延，做好防制工作，减少BVD对河南省肉牛业造成的损失，本论文从以下几个方面进行了研究： 1、河南省牛病毒性腹泻流行病学调查 从河南省唐河、内乡等15个县市的不同牛群随即采集血样671份，从养牛业比较发达的南阳、周口、安阳3市部分规模化肉牛场随机采集645份血样，分别用牛病毒性腹泻抗体和抗原ELISA试剂盒检测，结果表明：671份血样中，154份为抗体阳性，阳性率为22.95％；645份血样中100份为BVDV阳性，其检出率为15.50％，从而证实BVD在河南省广泛存在。 2、河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定 从河南省不同地区规模化肉牛场BVD疑似病例中采集病料，将处理好的病料接种MDBK细胞，并盲传四代，分离得到两株可产生细胞病变的病毒，经电镜观察、理化特性鉴定、琼脂扩散试验和中和试验，确定两株病毒均为BVDV，分别将其命名为HN-1株和HN-2株。动物回归试验进一步证实了所分离的两株病毒均为BVDV。 3、分泌抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定 在MDBK细胞上增殖BVDV HN-1株，用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒，然后免疫BALB／c小鼠。应用单克隆抗体技术，制备脾细胞并与NS0骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA筛选，用有限稀释法亚克隆，得到4株能分泌BVDV单克隆抗体的杂交瘤细胞林：3A8、3C7、3C11、3E9。经鉴定，3A8、3C7、3E9株分泌的单克隆抗林为IgG1亚类，3C11，株为IgG2a亚类。杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条。3A8、3C7、3C11株分泌的抗体与CSFV，BDV发生交叉反应，与BCV、BRV无交叉反应，而3C11株河南省肉牛规模化养殖场病毒性腹泻病的诊断与防制技术研究分泌的抗体与以上四种病毒均不发生交叉反应，显示出较好的特异性。这些单克隆杭体的获得为BVD的研究及诊断方法的建立莫定了基础. 4、牛病毒性腹泻病毒单克隆杭体双夹心ELISA的建立及其应用 用3C:l株，按常规方法制备腹水、提纯IgG，与已制备的兔抗BVDV IgG建立了检测BvDv的单克隆杭体双夹心ELISA。该方法与病毒分离试验对比，阳性符合率为86.67%，阴性符合率为100%;与中和试验对比，阳性符合率为93.33%，阴性符合率为100%。该方法最低病毒检出量为20on留ml。用该方法与商品化EusA试剂盒同时对比检测牛全血100份，二者阳性检出符合率为96.巧%。初步应用该方法对河南省南阳、周口、安阳3市肉牛场的562头份牛全血的检测结果表明，牛群BVDV的感染率为1 7.08%。该方法具有良好的特异性、敏感性及稳定性，能够较好地用于BVDV的监测，具有良好的应用前景。 5、牛病毒性腹泻囊素油乳剂灭活疫苗的研制 将BVDV HN一1株在MDBK细胞上增殖、浓缩、灭活，并与免疫增强剂一一囊素共同乳化研制出BVD囊素油乳剂苗。对其物理性状、安全性、保存期等进行检测，初步应用该疫苗进行免疫试验，并和常规灭活苗以及弱毒苗进行免疫效果比较。试验结果表明:该疫苗合格、安全，保存期达到12个月;产生的抗体水平较高且维持时间长，免疫效果和保护率优于常规灭活苗和弱毒苗. 6、肉牛规模化养殖场病毒性腹泻防制措施的制定及实施效果分析 根据BvD流行病学特征，结合本研究成果，从品种选育、饲养管理、饲料营养、环境调控、免疫预防、兽医卫生等方面制定了一套BvD防制措施。并在河南的南阳、周口、安阳3市部分肉牛场进行了实施，实施效果表明:试验牛场BVD感染率、发病率、牛场整体病死率均有所下降，在一定程度上控制了该病的流行和传播，提高了肉牛的生产性能，取得了显着的经济效益和社会效益。关健词:牛病毒性腹泻;牛病毒性腹泻病毒;流行病学;分离鉴定;单克隆杭体;双杭夹心ELISA;囊素油乳剂苗;防制措施
赵洪哲[3]（2019）在《牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA方法的建立》文中认为本研究为建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗体间接ELISA方法,根据GenBank公布的BVDVE2基因序列,利用DNAstar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列,将其进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后送公司合成并连接到原核表达载体pET-32a（+）,构建重组质粒pET-32a-Opti-E2,鉴定正确后,转化至E.coli BL21（DE3）宿主菌,IPTG 诱导表达,经 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析,成功获得大小为43 kDa BVDV E2基因的可溶性蛋白。应用可溶性表达的E2蛋白作为包被抗原,建立并优化了检测BVDV抗体的间接ELISA方法,命名为Opti-E2-ELISA。采用受试者工作特征曲线方法对203份血清的S/P值进行分析,确定Opti-E2-ELISA的阴阳性临界值为0.21。当S/P值为0.21时,此方法的敏感性为96.97%,特异性为97.65%。用Opti-E2-ELISA方法检测牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清、牛口蹄疫病毒阳性血清、布鲁菌阳性血清、牛副结核分支杆菌阳性血清,结果均为阴性,表明此方法特异性良好。批间批内重复性试验结果显示:变异系数均小于10%,表明所建立的Opti-E2-ELISA方法具有良好的敏感性、特异性、重复性。与商品化的BVDV抗体检测试剂盒IDEXX对比,符合率为97.5%。
刘昱成[4]（2014）在《牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立》文中进行了进一步梳理牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrh Virus，BVDV）引起牛的以发热、消化道粘膜糜烂、溃疡、脱落、出血性炎症、腹泻、白细胞下降、繁殖障碍为主要特征的一种传染病。该病在养牛国家广泛流行，形成持续性感染，引起免疫抑制，易导致继发感染，给畜牧业生产造成巨大的经济损失。目前，世界各国对于该病的防控主要通过采取动物检疫、淘汰和免疫接种相结合的策略。在欧美发达国家釆取检疫和淘汰为主，免疫接种为辅的方法来防控该病，使得该病得到有效控制。然而，我国由于缺乏理想的商品化疫苗和检测产品，导致该病在我国很多地区广泛流行。因此，研发用于BVD防控的疫苗和检测试剂，制定并完善BVD的防控体系对于保障我国养牛业的持续健康发展具有重要的意义。本研究以BVDV-2SW分离株为研究对象，对该病毒E2基因进行了克隆，运用大肠杆菌和酵母表达体系表达E2基因，通过SDS-PAGE和Western blot分析表达的重组E2蛋白的反应原性，选择表达量高且反应原性强的重组E2蛋白作为ELISA包被抗原，初步建立了检测BVDV抗体的间接ELISA方法，为BVDV检测试剂的研发奠定前期基础。主要研究方法和结果如下：1. BVDV E2基因的克隆及原核表达。从BVDV-2SW株细胞培养液中提取病毒的总RNA，采用RT-PCR方法从总RNA中扩增出BVDV E2部分基因，扩增产物经EcoRI、Not I双酶切后插入原核表达载体pET-28a（+）和pET-32a（+）中，构建E2基因原核表达载体pET-28a-E2和pET-32a-E2；将其转化至工程菌BL21（DE3）中，在37℃、1.0mmol/L IPTG浓度条件下诱导表达。SDS-PAGE分析发现，在分子质量32kDa和44kDa的位置出现与预期大小一致的蛋白条带；Western blot分析表明表达的重组E2蛋白可以与抗BVDV抗体发生免疫学反应，证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。2. BVDV E2基因在毕赤酵母中的表达。通过RT-PCR方法扩增了BVDV E2部分基因，扩增产物经EcoR I、Not I双酶切后插入酵母表达载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPIC9K-E2，经Sal I线性化后电击转化表达宿主毕赤酵母GS115。经PCR、表型及G418抗性筛选，成功获得具有G418抗性（1.0mg/mL）且表型为His+Mut+的阳性重组酵母转化子。阳性转化子经1.5%甲醇诱导，SDS-PAGE分析表明重组酵母可表达相对分子质量为23.2kDa的蛋白，与预期值相符合；Western blot分析表明表达的重组E2蛋白可以与抗BVDV抗体发生免疫学反应，证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。3.重组E2蛋白的纯化及间接ELISA方法的初步建立。从三种重组蛋白中选择了表达量最高，反应原性强的重组E2蛋白，对其进行纯化，用纯化的E2重组蛋白为包被抗原，初步建立了间接ELISA检测方法。通过检测，证实所建立的间接ELISA检测方法具有较好的特异性与敏感性。
钟发刚[5]（2008）在《牛病毒性腹泻病毒抗原检测、流行病学研究及分离株E2基因的克隆表达》文中提出以抗BVDV单克隆抗体作为捕获抗体,与鸡抗BVDV IgY（检测抗体）联合应用,建立BVDV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法.采用方阵滴定法确定单抗、鸡抗BVDV IgY的最适工作浓度,用阴性组织样品确定判定检测结果的OD490临界值。利用该方法,同时采用病毒分离和RT-PCR方法检测临床粪样23份,结果表明:该方法检测结果与病毒分离和RT-PCR方法的符合率达93.75%和83.33%。进一步优化检测体系,使其检测灵敏度达到274ng/mL;与冠状病毒及轮状病毒无交叉反应,但与猪瘟病毒存在弱交叉反应;通过引入质控血清进行质控检验,试剂盒所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求;经稳定性、重复性试验,试剂盒4℃可以保存6个月,批间和批内的变异系数分别为8.37%和4.31%。初步完成了BVDV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）检测试剂盒的标准化,为批量生产奠定了基础。利用该试剂盒,对新疆北疆6个大型集约化牛场进行BVDV感染调查,结果表明:牛场普遍存在着BVDV的感染,呈零星散发状态,看似正常的牛群也存在着一定的感染,发病牛场感染率达到100%。进一步对各牛场感染病毒进行了细胞培养特性和基因型鉴定,发现感染病毒细胞培养特性和基因型一致,均为非致细胞病变型,BVDV-1型病毒。通过系统进化分析,有两株病毒属于BVDV-1b型,1株属于BVDV-1c型,其余不属于已公布的任何亚型,初步确定属于BVDV一个新的亚型类群。应用RT-PCR方法及套式PCR克隆得到3株新疆分离株E2基因片段（shihezi148、manasi和MNS2）GenBank登录号:EU159699、EU159703和EU169937,序列分析结果表明:三株E2基因长度分别为1121bp、1122bp和1122bp,分别编码373、374和374个氨基酸残基的多肽;核酸序列同源性和系统发生分析表明,3株病毒均属于BVDV基因1型（BVDV-1）,shihezi 148株与澳大利亚Bega株亲缘关系最近,同处于BVDV-1c基因亚型群,其E2氨基酸同源性为90.11%;manasi株和MNS2株E2基因核酸序列仅有4个碱基的差别,它们与changchun 184和匈牙利VEDEVAC株亲缘关系最近,位于BVDV-1b基因亚型群,manasi和MNS2株与changchun184株E2氨基酸同源性分别高达98.66%98.93%。通过基因重组技术,将Shihezi 148株的E2基因克隆到pProEX HTa和pVAX1载体,构建得到了去除C端跨膜区的截短E2基因的原核表达载体pProEX HTa-E2和包括信号肽和全长E2蛋白的真核重组质粒pVAXl-E2；经过PCR、酶切及测序表明：pProEX HTa-E2和pVAXl-E2重组表达载体构建成功。将pProEX HTa-E2质粒转化大肠杆菌DH5、JM109和BL21并诱导表达，表达目的蛋白用SDS-PAGE检测，目的蛋白没有表达；用GenEscortTM试剂转染pVAil-E2质粒、pGFP质粒（阳性对照）、空白对照到BHK-21细胞，pGFP质粒表达检测表明，绿色荧光蛋白得到了一定的表达，间接证明目的载体转染后瞬时表达，但在pVAXl-E2质粒细胞转染后的细胞培养上清中用SDS-PAGE检测没有检测到表达的目的蛋白。对E2基因应用软件预测及序列分析，构建了含有不同抗原表位（1-118）-（144-340）-（100-300）-（1-345）的pET28a-ED1、pET28a-ED2、pET28a-ED3、pET28a-ED4四个质粒，转化大肠杆菌并诱导目的蛋白的表达，SDS-PAGE电泳检测结果显示所表达出了E2A、E2B、E2C、E2D融合蛋白相对分子量分别为18．6KDa、28．2KDa、29．2KDa、43．8KD，与预测蛋白分子量大小一致。Western blot分析结果表明，所表达的融合蛋白E2B、E2C、E2D被牛抗BVDV阳性血清识别。选择pET28a-ED4质粒，转化大肠杆菌并诱导目的蛋白的表达，并对表达产物进行了纯化。通过方阵滴定法初步建立了检测BVDV血清抗体的间接EllSA方法，对收集的约43份血清样品进行了检测，检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到93．55％，证明了所表达的重组蛋白作为包被抗原检测牛病毒性腹泻病毒血清抗体是可行的，为试剂盒的标准化奠定基础。
郜玉钢[6]（2005）在《鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究》文中研究表明1 从吉林省长春市双阳区梅花鹿流产胎儿肝脏病料中分离出的病毒,接种于MDBK传代细胞后出现了BVDV典型而规律的细胞病变,其理化特性与BVDV相同,致细胞病变作用可被BVDV国际标准株C24V株的牛阳性血清所阻断,电镜负染观察病料接种MDBK细胞的F1代浓缩病毒液,可见典型的BVDV粒子形态,从F1代浓缩病毒液中分别扩增出402bp(NS2-3)和706bp（E0）的目的片段,证明该毒株是BVDV,命名为CCSYD株。 2 对从吉林不同地区分离的4株（CCSYD株,CCJYD株、CCKCD株、JLCYD株）BVDV的NS2-3基因外源序列插入区进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,并与BVDV其他株进行了同源性分析,CCSYD株属基因Ⅰb亚型,CCJYD株、CCKCD株、JLCYD株属待定基因型。 3 将CCSYD株BVDV的E0基因RT-PCR扩增目的片段进行了克隆和测序,将其与已报道的瘟病毒代表株相应序列做了比较,预测了E0蛋白的抗原表位、亲水性和等电点等。以E0基因为判定依据,CCSYD分离株也为基因Ⅰb亚型,E0基因的核苷酸序列可做为BVDV基因分型的依据。 4 成功构建了原核表达质粒pET28a/E0,重组菌在IPTG诱导下能表达目的蛋白,其含量占菌体总蛋白的9.25%。 5 成功构建了真核表达质粒PAX1/E0,并用脂质体转染BHK-21细胞,RT-PCR法检测到E0目的基因在BHK-21细胞进行了转录,间接ELISA法检测到已表达目的蛋白。 6 用梅花鹿源BVDV基因苗（PVAX1/E0）不同免疫剂量和免疫次数免疫家兔,既可产生体液免疫又可产生细胞免疫应答。基因苗高剂量组比低剂量组体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平高,基因苗免疫次数对体液免疫应答水平和细胞免疫应答均无影响。免疫的第42天基因苗免疫组抗体水平达到高峰,基因苗免疫组（免疫剂量1mg/ml以上）BVDV抗体应答水平高于CCSYD灭活苗和C24V灭活苗免疫组,但免疫家兔的28天以前的结果则相反;免疫家兔产生的细胞免疫应答水平基因苗组均低于CCSYD灭活苗和C24V灭活苗免疫组。 7 采用组织细胞培养方法,测试了利巴韦林、黄芪、鱼腥草、干扰素a2b、莪术油、双黄连粉针剂在MDBK细胞体外培养中的最大安全浓度（最低稀释度）分别为(214)、（25）、（28）、（25）、（27）、（27）。药物抗梅花鹿源BVDV作用由强到弱的顺序:莪术油、鱼腥草、黄芪、干扰素、利巴韦林、双黄连。
张坤[7]（2016）在《新疆北疆地区规模化奶牛场犊牛病毒性腹泻相关病原的调查研究》文中提出牛轮状病毒（BRV）、冠状病毒（BCV）、病毒性腹泻/粘膜病毒（BVDV）是引起犊牛传染性腹泻的三种主要病毒,犊牛感染后不仅引起严重腹泻及大批死亡而且导致免疫功能下降,容易继发细菌感染给养牛业带来严重的经济损失。新疆北疆地区是全疆主要的奶牛生产基地,但有关三种犊牛病毒性腹泻病原的系统调查未见报道。为此,本研究自2014年1月至2016年1月,从新疆北疆石河子、沙湾、奎屯、呼图壁、博乐等地区的7个主要规模化奶牛场采集1月龄以内犊牛粪便、肠内容物、血清样品173份,其中腹泻犊牛样品125份,未出现腹泻症状的犊牛样品48份,采用双抗体夹心ELISA、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术调查感染情况并用序列分析方法分析病毒基因型,以查明该地区规模化奶牛场牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻/粘膜病毒的感染情况,为本地区犊牛病毒性腹泻相关疾病的预防与疫苗研发提供一定的理论依据,结果如下:1.致犊牛腹泻轮状病毒病原调查ELISA方法检出病毒抗原阳性29份,除呼图壁某奶牛场未检出阳性抗原外,其余牛场均检出阳性样品,阳性率为030%;RT-PCR方法检出病毒阳性65份,阳性率为24%90.91%,从石河子某一场健康犊牛中检测到牛轮状病毒抗原及核酸。核苷酸序列分析表明:新疆北疆地区致犊牛腹泻轮状病毒的基因型为I2型,各病毒株与标准株的同源性在91.4%以上。结果揭示,新疆北疆部分地区主要规模化奶牛场普遍存在牛轮状病毒的感染情况,且部分牛场感染率较高。2.致犊牛腹泻冠状病毒病原调查ELISA检测出病毒抗原阳性20份,除呼图壁和奎屯某奶牛场未检出病毒抗原外,其余五个牛场均检出阳性样品,各牛场阳性率为040%,健康犊牛样品中未检出牛冠状病毒;RT-PCR检测出阳性样品35份,除呼图壁某奶牛场未检出阳性样品外,其余牛场均检出阳性样品,各牛场的阳性率为060%,健康犊牛样品中未检出牛冠状病毒,与ELISA检测结果相一致。使用DNAMAN、DNAStar、MEGA 5.0软件对N基因与S1基因序列分析表明,新疆地区的牛冠状病毒虽与参考毒株保持了较高的同源性,但仍然存在变异,且具有地域分类的特点,同一地区间的毒株其亲缘关系较近。3.致犊牛腹泻的病毒性腹泻/粘膜病毒病原调查ELISA及RT-PCR的方法在石河子某奶牛二场、石河子某奶牛三场、博乐某牛场的阳性检出率分别为60%、32%、13.3%,100%、48%、13.3%。BVDV阳性毒株序列分析表明,此次试验克隆的12株BVDV阳性株基因型属于BVDV-1b型,与标准株Osloss的同源性最高,在97.698.3%。
阮东[8]（2017）在《某牛场牛BVD-MD的诊断与BVD-MD/IBR二联苗免疫效果评价》文中认为目的:为调查确定新疆某规模化牛场引起成年怀孕母牛及犊牛死亡的病原,确定国内新上市的BVD-MD/IBR二联灭活疫苗的免疫效果,为接下来BVD-MD/IBR二联灭活疫苗的推广提供试验依据。方法:1.采用现场流行病学调查,临床检查,病理剖检,病料细菌学检测及RT-PCR检测,并对PCR扩增产物进行序列分析。2在该规模化牛场选取38头处于干奶期的怀孕母牛,平均分成两组,制定免疫程序,一组注射BVD-MD/IBR二联灭活疫苗,一组注射猪瘟兔化弱毒疫苗,采用间接ELISA方法检测血清和初乳中BVDV抗体水平,比较接种BVD-MD/IBR二联灭活疫苗前后的BVDV抗体水平变化;采用阻断ELISA方法检测接种猪瘟兔化弱毒疫苗后的血清和初乳中HCV抗体水平。3.采用间接ELISA方法检测怀孕母牛接种两种疫苗后所产犊牛7天后血清中的BVDV抗体水平;运用双抗体夹心ELISA方法检测怀孕母牛接种两种疫苗后所产犊牛后血液与粪便中BVDV抗原;并对犊牛3个月的健康状况进行评价。结果:1.现场调查表明,该牛场3月5月内共有67头牛发病,其中成年怀孕牛41头,死亡8头,病死率为19.51%;28周龄犊牛发病26头,死亡6头,病死率为23.07%。成年牛与犊牛均表现出体温升高、口腔溃疡、腹泻,4头怀孕牛表现流产、产死胎、跛行等;剖检可见病死牛其胃与大肠粘膜溃疡、脱落、出血等临床表现为BVD典型特征。无菌采集3头病死牛心血、肠淋巴结及肝组织接种于LB肉汤放入摇床培养12h后镜检未检测到细菌;采用BVDV特异性引物对3头病死牛气管拭子和肠内容物拭子经RT-PCR检测均得到预期286bp的目的条带,与Genbank登录的部分BVDV参考株的同源性为94.2%98.5%。2.运用BVDV间接ELISA方法检测血清和初乳中免疫抗体,结果显示,首免前有4头为BVDV抗体阳性,阳性率为21.05%;首免后有12头出现BVDV抗体阳性,阳性率为63.16%;二免后有19头出现BVDV抗体阳性,阳性率为100%;免疫母牛初乳有19头出现BVDV抗体阳性,阳性率为100%;采用猪瘟阻断ELISA方法检测血清和初乳中HCV抗体,结果显示二免后母牛血清HCV抗体阳性率为94.7%,初乳抗体阳性率为100%。3.免疫母牛所产19头犊牛7天后血清中BVDV抗体均为阳性,阳性率为100%;所产犊牛血清HCV抗体阳性率为84.21%,所产犊牛的健康状况与接种BVD-MD/IBR二联灭活疫苗后所产犊牛的健康状况相比无明显差异。采用BVDV双夹心ELISA检测BVDV抗原,结果显示接种BVD-MD/IBR二联灭活疫苗和猪瘟兔化弱毒疫苗的母牛所产犊牛血清及粪便中BVDV抗原的阳性率均为0,而未接种疫苗母牛所产犊牛的抗原阳性率为21.05%。观察免疫母牛所产犊牛3个月内精神与食欲良好,1月龄内未表现BVD症状。结论:1.该规模化牛场引起成年牛与犊牛死亡主要是由BVDV感染所致。2.证明BVD-MD/IBR二联灭活疫苗显示良好的免疫效果。3.证明猪瘟兔化弱毒疫苗也具有预防BVDV感染的免疫效果。
王聪颖[9]（2018）在《河北省与天津市BVD-MD的流行病学调查》文中研究指明牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起牛的急性传染病称为牛病毒性腹泻,慢性持续性感染称为粘膜病。以发热、粘膜糜烂、溃疡、坏死、腹泻、咳嗽、白细胞减少及怀孕母牛流产、产畸形胎、死胎等作为主要发病特征。牛病毒性腹泻病毒现而今已遍及全世界,阻碍畜牧业的发展,我国多个省市都已检出BVDV,给我国的畜牧企业造成不同程度的经济损失。现在为了解河北省与天津市BVDV流行情况,本文对7个奶牛场通过BTM ELISA检测132份奶样,结果显示,D、E两场发生BVDV急性或近期内BVDV感染;B、C、F、G四场曾经接触过BVDV,A-G场仍以R4为主,即以阴性场为主。2016年～2017年对7个奶牛场通过ELISA抗体、抗原检测4105份血清样品（其中包括4份可疑样品）,结果显示,2016年BVDV抗体阳性率在在9.97%-23.30%之间,抗体平均阳性率为13.96%,抗原阳性率在0.65%-3.83%之间,抗原平均阳性率为1.97%;2017年BVDV抗体阳性率在7.87%-18.50%之间,抗体平均阳性率为11.64%,抗原阳性率在0.31%-3.13%之间,平均阳性率为1.59%;与BTM BVDV抗体检测结果基本一致。不同季节牛血清样品中BVDV抗体检测结果可见,冬春季节阳性率高于夏秋季节,且2017年BVDV抗体阳性率与2016年相比有所降低;不同牛龄的牛血清样品中BVDV抗体检测结果可见,成年牛BVDV抗体阳性率明高于其他牛龄段的牛,犊牛BVDV抗体阳性率最低;从繁殖方式上来说,牛场阳性率从高至低依次为自繁+引种、自繁+活体引入、自繁自养;不同养殖模式下牛血清样品BVDV抗体阳性率由高至低依次为放牧+舍饲种、舍饲、放牧;2016年-2017年不同牛场牛血清样品中BVDV抗体检测结果抗体阳性率在9.53%-20.97%之间,平均阳性率为12.79%,其中A、B、F三个养牛场BVDV抗体阳性率最低,分别为9.53%、9.61%、8.80%,D、E两场BVDV抗体阳性率最高,分别为20.97%、17.67%;不同地区牛场牛血清样品中BVDV抗体检测结果可见,保定地区BVDV抗体阳性率最高,其余从高到低依次为唐山市滦南县、天津市蓟州区、唐山市玉田县、天津市宝坻区、天津市北辰区,由北向南蔓延;之后通过RT-PCR检测结果显示,4个可疑血清样品诊断为BVDV抗原阳性。A、B场抗原抗体阳性率最低,D场最高,因为BVDV隐性感染居多,为避免对牛群及牛血清造成污染,对各场PI牛进行抗原检测,尤其D场,及时淘汰净化。
薛飞,朱远茂,马磊[10]（2016）在《我国牛病毒性腹泻/黏膜病研究进展及防控策略》文中提出本文从病毒分离及基因分型、血清流行病学、诊断方法、免疫研究四个方面介绍了我国牛病毒性腹泻黏膜病的研究进展情况,并提出了防控策略。
二、检测牛病毒性腹泻－粘膜病病毒抗原试剂盒的研制及应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、检测牛病毒性腹泻－粘膜病病毒抗原试剂盒的研制及应用（论文提纲范文）
（1）新疆地区牛病毒性腹泻—粘膜病流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1 BVDV基因多样性及分型 |
| 1.1 基因多样性 |
| 1.2 基因分型 |
| 1.3 BVDV的培养特性及生物分型 |
| 2 瘟病毒属抗原的相关性 |
| 3 BVD国内外流行情况研究进展 |
| 3.1 国外BVD的流行情况 |
| 3.2 国内BVD的流行情况 |
| 4 BVDV的诊断 |
| 4.1 BVDV的临床诊断 |
| 4.2 BVDV的实验室诊断 |
| 5 BVDV的危害及防控 |
| 5.1 传染源、传播途径和易感动物 |
| 5.2 BVDV的危害 |
| 5.3 BVDV的防控 |
| 5.4 BVDV的治疗 |
| 5.5 牛群的日常管理 |
| 第二章 试验部分 |
| 试验一 新疆地区牛病毒性腹泻—粘膜病现场流行病学调查及腹泻病的诊断分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 调查结果 |
| 2.2 调查结果统计 |
| 2.3 诊断结果 |
| 3 讨论 |
| 试验二 新疆地区牛病毒性腹泻-黏膜病病毒血清流行病学调查 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 试验三 新疆地区牛病毒性腹泻-黏膜病分子生物学检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒分离结果 |
| 2.2 脾脏组织RT-PCR检测结果 |
| 2.3 遗传进化分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 全文总结 |
| 第四章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 1 BVDV抗体检测 |
| 2 BVDV抗原检测 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（2）河南省肉牛规模化养殖场牛病毒性腹泻的诊断与防制技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 本文部分符号及缩略语的说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛病毒性腹泻研究进展 |
| 1 BVD的病原学 |
| 2 BVDV的分子生物学研究进展 |
| 3 BVD的流行病学 |
| 4 BVD的临床类型及其发生机理 |
| 5 BVD免疫机理的研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 牛病毒性腹泻的实验室诊断技术及防制研究进展 |
| 1 BVD实验室诊断技术的研究 |
| 2 BVD的防制研究 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 河南省牛病毒性腹泻的流行病学调查 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第四章 河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第五章 分泌抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第六章 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体双夹心ELISA的建立及其应用 |
| 中文摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第七章 牛病毒性腹泻囊素油乳剂灭活疫苗的研制 |
| 中文摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第八章 肉牛规模化养殖场病毒性腹泻防制措施的制定及实施效果分析 |
| 中文摘要 |
| 1 肉牛规模化养殖场BVD的防制措施 |
| 2 BVD防制措施的实施效果分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 附录 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 牛病毒性腹泻概述 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒概述 |
| 1.2.1 病原特性 |
| 1.2.2 BVDV基因组特征 |
| 1.2.3 BVDV的分型 |
| 1.3 BVDV E2蛋白的研究进展 |
| 1.4 BVD诊断技术研究进展 |
| 1.4.1 病毒学检测技术 |
| 1.4.2 血清学检测 |
| 1.5 鉴定PI牛的诊断策略 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 血清及质粒 |
| 2.1.2 主要试验耗材 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 溶液的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 E2基因生物信息学分析 |
| 2.2.2 E2基因密码子优化合成及重组载体的构建 |
| 2.2.3 E2基因诱导表达 |
| 2.2.4 E2蛋白的纯化 |
| 2.2.5 Western Blot鉴定 |
| 2.2.6 E2蛋白的透析及浓缩 |
| 2.2.7 E2蛋白浓度的测定 |
| 2.2.8 Opti-E2 ELISA方法的建立 |
| 2.2.9 临界值的确定与IDEXX试剂盒的对比 |
| 2.2.10 特异性试验 |
| 2.2.11 重复性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 E2基因基本理化性质分析结果 |
| 3.2 Protean分析结果 |
| 3.3 E2基因密码子优化合成及鉴定结果 |
| 3.4 E2重组菌诱导表达结果 |
| 3.5 E2蛋白的纯化结果 |
| 3.6 Western Blot鉴定结果 |
| 3.7 E2蛋白的透析及浓缩结果 |
| 3.8 E2蛋白浓度的测定结果 |
| 3.9 Opti-E2 ELTSA方法的优化结果 |
| 3.9.1 方阵法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释浓度结果 |
| 3.9.2 最佳抗原包被液、包被条件的优化结果 |
| 3.9.3 最佳封闭液和封闭时间的优化结果 |
| 3.9.4 最佳血清稀释液和作用时间的优化结果 |
| 3.9.5 最佳酶标抗体的稀释液、工作浓度和作用时间的优化结果 |
| 3.9.6 最佳TMB作用时间的优化结果 |
| 3.9.7 ELISA最终反应条件的确定结果 |
| 3.9.8 临界值与IDEXX比较结果 |
| 3.10 特异性试验结果 |
| 3.11 重复性试验结果 |
| 3.11.1 蛋白批间重复试验结果 |
| 3.11.2 批内人员重复性试验结果 |
| 3.11.3 板间板内重复性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立（论文提纲范文）
| 导师评阅表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 BVDV E2蛋白基因的克隆及原核表达研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因的 RT-PCR 扩增 |
| 2.2 目的基因 DNA 测序结果及推导的氨基酸序列分析 |
| 2.3 重组质粒的 PCR 鉴定 |
| 2.4 重组表达载体pET-28a-E2和pET-32a-E2的鉴定 |
| 2.5 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 2.6 E2表达产物Western blot鉴定 |
| 3 讨论 |
| 实验二 BVDV E2 基因在毕赤酵母中的表达 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2 重组质粒的 PCR 鉴定 |
| 2.3 阳性转化子的鉴定 |
| 2.4 目的蛋白的 SDS-PAGE 分析 |
| 2.5 目的蛋白的 Western blot 分析 |
| 3 讨论 |
| 实验三 BVDV E2 重组蛋白的纯化及间接 ELISA 方法的初步建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的纯化 |
| 2.2 抗原最适包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 2.3 最佳封闭液和封闭时间的选择 |
| 2.4 酶标抗体最佳稀释浓度和最佳工作时间的选择 |
| 2.5 阴阳性临界值的确定 |
| 2.6 间接ELISA特异性试验结果 |
| 2.7 间接ELISA敏感性试验结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在学校期间参与的研究课题 |
| 发表论文 |
（5）牛病毒性腹泻病毒抗原检测、流行病学研究及分离株E2基因的克隆表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分:文献综述 |
| 第一章:牛病毒性腹泻病毒研究进展 |
| 1.BVD的临床表现和致病机理 |
| 1.1 持续性感染与免疫耐受 |
| 1.2.粘膜病与慢性型BVD |
| 1.3 急性BVD |
| 1.4.免疫抑制 |
| 1.5.血小板减少症和出血综合征 |
| 2.流行病学 |
| 3.BVDV的免疫防制 |
| 第二章牛病毒性腹泻病毒检测与防制技术研究进展 |
| 1.牛病毒性腹泻病毒检测技术 |
| 1.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.2 血清学检测技术 |
| 1.2.1 琼脂扩散试验 |
| 1.2.2 血清中和试验(SNT) |
| 1.3 免疫学检测技术 |
| 1.3.1 免疫过氧化物酶(IP)技术 |
| 1.3.2 酶联免疫吸附试验 |
| 1.4 PCR检测方法 |
| 1.5 核酸探针检测 |
| 2.BVDV防制 |
| 第三章 牛病毒性腹泻病毒流行病学研究进展 |
| 第四章 牛病毒性腹泻病毒基因组结构与蛋白功能研究进展 |
| 1.BVDV基因组结构 |
| 2.BVDV的5′-UTR和3′-UTR |
| 3.BVDB的大开放阅读框架 |
| 4.BVDV的结构蛋白 |
| 4.1 核心蛋白P14 |
| 4.2 病毒囊膜结构蛋白 |
| 4.2.1 囊膜蛋白gp48 |
| 4.2.2 囊膜蛋白gp25 |
| 4.2.3 囊膜蛋白gp53 |
| 5.BVDV非结构蛋白 |
| 5.1 P20(N~(?)) |
| 5.2 P7 |
| 5.3 P125(NS2-3)、NS2和NS3 |
| 5.4 P10(NS4A)和P30(NS4B) |
| 5.5 P58(NS5A) |
| 5.6 P75(NS5B) |
| 6.小结与展望 |
| 第二部分:实验研究 |
| 第五章 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA方法的建立 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 病毒、细胞和酶标抗体 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 BVDV抗原制备 |
| 1.4 病毒的纯化-蔗糖密度梯度离心 |
| 1.5 单克隆抗体的制备与纯化 |
| 1.6 鸡抗BVDV IgY的制备 |
| 1.7 待检样品的处理 |
| 1.7.1 病毒细胞培养液的制备 |
| 1.7.2 组织样品的制备 |
| 1.7.3 粪样的制备 |
| 1.8 AC-ELISA方法的建立 |
| 1.9 AC-ELISA中单抗和多抗最佳工作浓度的筛选 |
| 1.10 AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定 |
| 1.11 AC-ELISA重复性试验 |
| 1.12 AC-ELISA在实验感染和临床BVDV样品检验中的应用 |
| 2.结果 |
| 2.1 单抗的制备与特性鉴定 |
| 2.2 AC-ELISA中单抗和多抗最佳浓度的筛选 |
| 2.3 AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定 |
| 2.4 AC-ELISA方法重复性试验 |
| 2.5 AC-ELISA在BVDV抗原检测中的临床应用 |
| 3.讨论 |
| 第六章 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA检测试剂盒的标准化研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 样品 |
| 1.4 引物设计及合成 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 1.6 质控血清的制备 |
| 1.7 酶标板均一性检测 |
| 1.8 酶标抗体工作浓度的确定 |
| 1.9 抗原与单克隆抗体最佳结合浓度的确定 |
| 1.10 抗原与抗体IgY与最佳结合浓度的选择 |
| 1.11 封闭液及封闭时间的选择 |
| 1.12 酶标抗体作用时间的选择 |
| 1.13 底物显色时间的选择 |
| 1.14 试剂盒的组装 |
| 1.15 试剂盒敏感性检验及其对比试验 |
| 1.16 试剂盒特异性检验 |
| 1.16.1 阻断试验 |
| 1.16.2 交叉试验 |
| 1.17 试剂盒质量控制试验—Levey-Jennings质控图的绘制 |
| 1.18 试剂盒的重复性和稳定性试验 |
| 1.18.1 批内试验 |
| 1.18.2 批间试验 |
| 1.18.3 保存期试验 |
| 2.结果 |
| 2.1 酶标板均一性检测 |
| 2.2 酶标抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 抗原与单抗最佳结合浓度的确定 |
| 2.4 抗BVDV IgY与抗原最佳结合浓度的确定 |
| 2.5 封闭液及封闭时间的确定 |
| 2.6 酶标抗体作用时间 |
| 2.7 底物显色时间的选择 |
| 2.8 试剂盒特异性检验 |
| 2.8.1 阻断试验 |
| 2.8.2 交叉试验 |
| 2.9 试剂盒敏感性测定 |
| 2.10 BVDV特异性引物RT-PCR扩增结果 |
| 2.11 质控血清检测结果 |
| 2.12 试剂盒稳定性检测 |
| 2.13 试剂盒保存期试验结果 |
| 2.14 试剂盒操作步骤 |
| 3.讨论 |
| 第七章 新疆北疆集约化奶牛场牛病毒性腹泻病毒病原学调查 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 样品采集、处理 |
| 1.4 引物设计合成 |
| 1.5 主要溶液 |
| 1.5.1 消化液(EDTA-胰酶) |
| 1.5.2 细胞培养液(含20%胎牛血清替代剂的RPMI-1640) |
| 1.5.3 维持液(含5%胎牛血清替代剂的RPMI-1640) |
| 1.6 牛病毒性腹泻病毒抗原检测 |
| 1.7 牛病毒性腹泻病毒阳性样品细胞培养 |
| 1.7.1 MDBK细胞培养 |
| 1.7.2 病毒接种细胞 |
| 1.8 牛病毒性腹泻病毒基因型鉴定 |
| 1.8.1 病毒RNA的提取 |
| 1.8.2 病毒型鉴定RT-PCR |
| 1.9 不同牛场牛病毒性腹泻病毒遗传进化分析 |
| 1.9.1 反转录体系 |
| 1.9.2 PCR反应体系 |
| 1.9.3 PCR产物的回收、连接、转化、克隆和测序 |
| 1.9.4 序列分析比对 |
| 2.结果 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病毒抗原检测 |
| 2.2 牛病毒性腹泻病毒阳性样品基因型鉴定 |
| 2.3 不同牛场牛病毒性腹泻病毒遗传进化分析 |
| 3.分析讨论 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 讨论 |
| 第八章 BVDV新疆分离株E2基因的克隆及序列分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 菌种和质粒 |
| 1.1.3 主要试剂与工具酶 |
| 1.1.4 引物设计与合成 |
| 1.1.5 培养基与抗生素 |
| 1.1.6 主要生化试剂与溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞毒BVDV总RNA的制备 |
| 1.2.2 RT-PCR扩增目的基因 |
| 1.2.3 RT-PCR产物的检测 |
| 1.2.4 DNA目的片段的回收 |
| 1.2.5 连接反应 |
| 1.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.2.7 细菌的转化 |
| 1.2.8 重组质粒的小量制备 |
| 1.2.9 E2基因的鉴定及测序 |
| 1.2.10 E2基因序列分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 RT-PCR的扩增结果 |
| 2.2 目的基因的重组质粒鉴定结果 |
| 2.3 E2基因序列测定及分析 |
| 2.4 E2基因的同源性分析 |
| 2.5 E2基因的进化分析 |
| 3.分析与讨论 |
| 3.1 BVDV新疆分离株E2基因的克隆 |
| 3.2 manasi、MNS分离株E2基因同CC-184株的进化关系 |
| 3.3 新疆分离株E2基因的抗原表位分析 |
| 3.4 新疆分离株E2基因的来源分析 |
| 第九章 BVDV新疆分离株E2基因的克隆表达 |
| 实验一 BVDV石河子株E2表达载体的构建及表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株质粒、菌株和细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物的设计及合成 |
| 1.4 RT-PCR |
| 1.5 基因的克隆和鉴定 |
| 1.6 基因序列分析及潜在抗原表位比较分析 |
| 1.7 原核表达质粒的构建 |
| 1.8 真核表达质粒的构建 |
| 1.9 重组蛋白的诱导表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 E2基因的克隆 |
| 2.2 E2基因核苷酸及氨基酸序列分析 |
| 2.3 潜在抗原表位比较分析 |
| 2.4 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.5 真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.6 E2基因的表达及检测 |
| 2.6.1 E2蛋白在原核系统中的表达及检测 |
| 2.6.2 E2蛋白在真核系统中的表达及检测 |
| 3 讨论 |
| 实验二 BVDV玛纳斯株E2基因主要抗原表位区域的分段表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株与BVDV阳性和阴性血清 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物的设计及合成 |
| 1.4 RT-PCR及基因的克隆和鉴定 |
| 1.5 序列分析及二级结构预测 |
| 1.6 分段表达质粒的构建 |
| 1.7 目的蛋白的诱导表达 |
| 1.8 表达产物的SDS-PAGE电泳 |
| 1.9 重组蛋白的Western blot检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR的扩增结果与鉴定 |
| 2.2 序列分析 |
| 2.3 二级结构及抗原表位预测 |
| 2.4 表达重组载体的构建与鉴定 |
| 2.5 诱导表达SDS-PAGE电泳结果 |
| 2.6 Western blotting分析 |
| 3 讨论与结论 |
| 第十章:BVDV -E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 目的蛋白的诱导表达 |
| 1.4 重组蛋白的特异性检测 |
| 1.5 重组蛋白的纯化及纯化蛋白活性检 |
| 1.6 重组蛋白质的包被及定量 |
| 1.7 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.结果 |
| 2.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2 重组蛋白的特异性检测 |
| 2.3 纯化后重组蛋白的SDS-PAGE及Western-blot检测 |
| 2.4 方阵滴定试验 |
| 2.5 样品检测结果 |
| 3.分析讨论 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文、获奖情况 |
| 论文 |
| 获奖 |
| 资助项目 |
（6）鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 牛病毒性腹泻病的研究概况 |
| 1 牛病毒性腹泻病病原学 |
| 1.1 牛病毒性腹泻病毒分类位置 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒的形态和理化特性 |
| 1.3 牛病毒性腹泻病毒基因组结构及功能 |
| 1.3.1 5′端非编码区 |
| 1.3.2 开放阅读框架区 |
| 1.3.3 3′端非翻译区 |
| 1.4 牛病毒性腹泻病毒基因组编码蛋白的结构及功能 |
| 1.4.1 N~(pro) |
| 1.4.2 E_0 |
| 1.4.3 E_0 |
| 1.4.4 E_1 |
| 1.4.5 E_2 |
| 1.4.6 P_7 |
| 1.4.7 NS_(2-3) |
| 1.4.8 NS_(4A)(P_(10))、NS_(4B)(P_(32))、NS_(5A)(P_(58))、NS_(5B)(P_(75)) |
| 2 牛病毒性腹泻病流行病学 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病流行趋势和特点 |
| 2.2 牛病毒性腹泻病传染源、易感动物和传播途径 |
| 2.2.1 牛病毒性腹泻病传染源 |
| 2.2.2 牛病毒性腹泻病易感动物 |
| 2.2.3 牛病毒性腹泻病传播途径 |
| 2.3 牛病毒性腹泻病毒流行株的基因型分析 |
| 2.3.1 牛病毒性腹泻病毒国外流行株基因型 |
| 2.3.2 牛病毒性腹泻病毒我国流行株基因型 |
| 2.4 牛病毒性腹泻病流行原因 |
| 2.4.1 牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒交叉感染 |
| 2.4.2 牛病毒性腹泻病毒基因型的多样性 |
| 2.4.3 牛病毒性腹泻病毒持续性感染 |
| 3 牛病毒性腹泻病临床类型 |
| 3.1 病毒性腹泻 |
| 3.2 持续性感染与免疫耐受 |
| 3.3 粘膜病 |
| 3.4 繁殖力下降 |
| 3.5 血小板减少和出血性综合症 |
| 4 牛病毒性腹泻病诊断技术 |
| 4.1 血清学中和实验 |
| 4.2 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 4.3 分子生物学诊断技术 |
| 4.3.1 分子生物学诊断的基因区域 |
| 4.3.2 核酸杂交(NAH)技术 |
| 4.3.3 反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)技术 |
| 4.3.4 复合PCR诊断BVDV和HCV技术 |
| 5 牛病毒性腹泻病毒NCP型向CP型转化机制 |
| 5.1 外源序列的插入 |
| 5.2 自身的基因发生了重排和拷贝 |
| 5.3 外源细胞序列插入的同时伴有病毒基因的复制 |
| 5.4 缺陷干扰粒子(defectiveinterference，DI) |
| 5.5 点突变 |
| 6 牛病毒性腹泻病的综合防制 |
| 6.1 疫苗防制 |
| 6.1.1 灭活苗 |
| 6.1.2 弱毒苗 |
| 6.1.3 基因工程苗 |
| 6.2 药物防制 |
| 6.2.1 利巴韦林 |
| 6.2.2 芳香族阳离子化合物 |
| 6.2.3 复合物1453 |
| 6.2.4 干扰素 |
| 6.2.5 中药 |
| 综述二 基因免疫的研究概况 |
| 1 基因疫苗免疫机制 |
| 2 基因疫苗的组成 |
| 3 基因疫苗的特点 |
| 4 影响基因免疫效果的因素 |
| 4.1 载体质粒的影响 |
| 4.2 基因疫苗的免疫方法及途径影响 |
| 4.3 接种剂量、次数、容积及质粒质量的影响 |
| 4.4 保护性抗原基因及其所编码抗原结构的影响 |
| 4.5 基因疫苗质粒的高效导入的影响 |
| 4.6 基因疫苗免疫佐剂的影响 |
| 4.6.1 核酸质粒的免疫佐剂影响 |
| 4.6.2 细胞因子基因的影响 |
| 4.6.3 趋化因子和共刺激分子基因的影响 |
| 4.6.4 基因佐剂联合应用的影响 |
| 4.6.5 抗原靶向作用的影响 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 梅花鹿源牛病毒性腹泻病毒分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料与仪器 |
| 1.2 病毒的分离培养和浓缩 |
| 1.3 病毒理化特性测定和病毒中和试验 |
| 1.3.1 病毒的毒力测定 |
| 1.3.2 病毒的理化学鉴定 |
| 1.3.3 中和试验鉴定 |
| 1.4 电镜负染观察 |
| 1.5 特异性引物设计与合成 |
| 1.6 病毒细胞培养物总RNA提取 |
| 1.7 反转录 |
| 1.8 PCR扩增 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒的分离培养法鉴定结果 |
| 2.2 病毒理化特性测定结果 |
| 2.2.1 病毒的毒力测定结果 |
| 2.2.2 病毒的理化学鉴定结果 |
| 2.3 病毒中和试验结果 |
| 2.4 电镜负染观察鉴定结果 |
| 2.5 RT-PCR扩增鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于梅花鹿感染BVDV的来源 |
| 4 小结 |
| 实验二 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区的克隆与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 病毒培养和浓缩 |
| 1.3 RNA的提取及鉴定 |
| 1.4 引物的设计 |
| 1.5 反转录 |
| 1.6 PCR扩增 |
| 1.7 CDNA片段的克隆与鉴定 |
| 1.8 序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 梅花鹿源BVDV分离株RT-PCR扩增鉴定结果 |
| 2.2 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区重组pMD18-T／NS_(2-3)克隆质粒PCR鉴定结果 |
| 2.3 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区重组pMD18-T／NS_(2-3)克隆质粒酶切鉴定结果 |
| 2.4 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区测序结果 |
| 2.5 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区核苷酸序列分析结果 |
| 2.6 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区氨基酸序列分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于梅花鹿源BVDV分离株致细胞病变机制 |
| 3.2 关于梅花鹿感染BVDV原因 |
| 3.3 关于梅花鹿BVDV分离株基因型 |
| 4 小结 |
| 实验三 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒培养和浓缩 |
| 1.2.2 RNA的提取 |
| 1.2.3 引物的设计 |
| 1.2.4 反转录 |
| 1.2.5 PCR扩增 |
| 1.2.6 cDNA片段的克隆与鉴定 |
| 1.2.7 序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 梅花鹿源BVDV分离株RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因重组pMD18-T／E_0克隆质粒PCR鉴定结果 |
| 2.3 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因重组pMD18-T／E_0克隆质粒酶切鉴定结果 |
| 2.4 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因测序结果 |
| 2.5 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因序列同源性及系统进化树分析结果 |
| 2.6 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因推导的氨基酸序列及同源性分析结果 |
| 2.7 梅花鹿源BVDV分离株E_0蛋白特性的预测及与其他瘟病毒毒株比较分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于梅花鹿源BVDV分离株基因型 |
| 3.2 关于梅花鹿和牛之问BVDV传播 |
| 3.3 关于用E_0基因核苷酸序列做BVDV基因分型依据 |
| 3.4 关于BVDV和猪瘟疫苗 |
| 3.5 关于E_0蛋白 |
| 4 小结 |
| 实验四 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 酶、抗体及Marker |
| 1.1.2 质粒和表达菌种 |
| 1.1.3 质粒的小量提取试剂 |
| 1.1.4 诱导表达试剂 |
| 1.1.5 SDS-PAGE试剂 |
| 1.1.6 Western-blotting试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒pET-28a／E_0的构建 |
| 1.2.2 重组质粒pET-28a／E_0鉴定 |
| 1.2.3 诱导表达 |
| 1.2.4 蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.5 westernb1otting分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 回收E_0基因片段结果 |
| 2.2 原核表达pET28a空载体电泳结果 |
| 2.3 原核表达载体与外源片段的定量比较结果 |
| 2.4 梅花鹿分离株E_0基因重组pET28a／E_0质粒的初选结 |
| 2.5 重组原核表达质粒PCR鉴定结果 |
| 2.6 重组原核表达质粒酶切鉴定结果 |
| 2.7 E_0基因表达产物SDS-PAGE的检测结果 |
| 2.8 E_0基因表达产物Western-blotting的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于基因在大肠杆菌中的高效表达 |
| 4 小结 |
| 实验五 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因的真核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 DNA酶切、连接、反转录、PCR及回收试剂 |
| 1.1.2 质粒大量提取的试剂 |
| 1.1.3 真核表达质粒pVAX1／E_0转染BHK-21细胞材料及病毒株 |
| 1.1.4 ELISA法检测试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组真核表达质粒pVAX1／E_0的构建 |
| 1.2.2 真核表达工程菌pVAX1／E_0重组质粒的鉴定 |
| 1.2.3 真核表达质粒pVAX1／E_0转染BHK-21细胞 |
| 1.2.4 真核表达质粒pVAX1／E_0在真核细胞中表达的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 真核表达质粒pVAX1转化工程菌的结果 |
| 2.2 pVAX1／E_0真核表达重组质粒PCR鉴定结果 |
| 2.3 pVAX1／E_0真核表达载体酶切鉴定结果 |
| 2.4 pVAX1／E_0大提质粒结果 |
| 2.5 RT-PCR法检测pVAX1／E_0在真核细胞中转录结果 |
| 2.6 间接ELISA法检测pVAX1／E_0在真核细胞中表达的结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于真核表达载体 |
| 3.2 关于基因疫苗质粒的高效导入 |
| 4 小结 |
| 实验六 梅花鹿源BVDV分离株基因苗的动物免疫试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体质粒 |
| 1.1.2 免疫学试剂 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 质粒的大量提取试剂 |
| 1.1.5 ELISA法检测试剂 |
| 1.1.6 兔的淋巴细胞转化实验试剂与材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 基因苗、灭活苗的制备 |
| 1.2.2 兔的分组及各种疫苗的免疫剂量和次数 |
| 1.2.3 各种疫苗免疫家兔的抗体检测 |
| 1.2.4 T淋巴细胞转化实验 |
| 1.2.5 B淋巴细胞转化实验 |
| 1.2.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 梅花鹿源BVDV基因苗与灭活苗免疫家兔的抗体检测比较结果 |
| 2.2 梅花鹿源BVDV基因苗与灭活苗对家兔淋巴细胞增殖(A_(570))影响的结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于基因苗的优点 |
| 4 小结 |
| 实验七 梅花鹿源BVDV分离株敏感药物筛选的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验药物 |
| 1.1.2 MDBK细胞和BVDV病毒 |
| 1.1.3 主要化学试剂 |
| 1.1.4 试剂 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 药物安全浓度测试试验 |
| 1.2.2 敏感药物筛选试验和MDBK单层细胞制备 |
| 2 结果 |
| 2.1 试验药物对MDBK细胞贴壁影响的结果 |
| 2.2 试验药物对MDBK细胞单层影响的结果 |
| 2.3 试验药物在MDBK细胞上最大安全浓度确定结果 |
| 2.4 先加药后加病毒方式药物抗BVDV效果比较结果 |
| 2.5 先加病毒后加药方式药物抗BVDV效果比较结果 |
| 2.6 药和病毒同时加方式药物抗BVDV效果比较结果 |
| 2.7 药物抗BVDV抑制率比较结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于中性红染料吸收法 |
| 3.2 关于药物对组织细胞的毒性 |
| 3.3 关于药物抗病毒作用量效关系 |
| 3.4 关于抗病毒的药物 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（7）新疆北疆地区规模化奶牛场犊牛病毒性腹泻相关病原的调查研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 轮状病毒研究进展 |
| 2.冠状病毒研究进展 |
| 3. 牛病毒性腹泻/粘膜病毒研究进展 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 新疆北疆部分地区轮状病毒病原学调查 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ELISA检测结果 |
| 2.2 RT-PCR检测结果 |
| 2.3 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 2.4 测序结果及序列分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 LEISA及RT-PCR检测牛轮状病毒状病毒 |
| 3.2 牛轮状病毒VP6基因序列分析 |
| 试验二 新疆北疆部分地区牛冠状病毒病原学调查 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ELISA检测结果 |
| 2.2 RT-PCR检测结果 |
| 2.3 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 2.4 测序结果及序列分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 LEISA及RT-PCR检测牛冠状病毒 |
| 3.2 牛冠状病毒N基因序列分析 |
| 3.3 牛冠状病毒S1基因序列分析 |
| 试验三 新疆北疆部分地区牛病毒性腹泻/粘膜病毒病原学调 查 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ELISA检测结果 |
| 2.2 RT-PCR检测结果 |
| 2.3 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 2.4 测序结果及序列分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 ELISA和RT-PCR检测牛病毒性腹泻/粘膜病毒 |
| 3.2 5′-UTR基因序列分析 |
| 全文总结及创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在校期间参与研究课题 |
| 发表论文 |
| 获奖情况 |
| 附件 |
（8）某牛场牛BVD-MD的诊断与BVD-MD/IBR二联苗免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 牛病毒性腹泻-粘膜病研究进展 |
| 1.病原特征 |
| 2.牛病毒性腹泻粘膜病毒的分型 |
| 2.1 基因分型 |
| 2.2 生物分型 |
| 3.BVDV与HCV抗原相关性 |
| 4.BVD国内外流行病学研究概况 |
| 4.1 国外BVD流行现况 |
| 4.2 国内BVD流行现况 |
| 5.BVDV对牛群健康的危害 |
| 6.临床诊断 |
| 7.实验室诊断 |
| 7.1 病原鉴定 |
| 7.2 血清学、分子生物学 |
| 8.防治措施 |
| 8.1 检疫 |
| 8.2 免疫接种 |
| 8.3 治疗 |
| 8.4 日常管理 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 新疆某规模化牛场暴发牛病毒性腹泻（BVD）的诊断与BVDV序列分析 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验试剂与相关仪器设备 |
| 1.2 实验用培养基的配制 |
| 1.3 实验用染色液的配制 |
| 1.3 病料采集 |
| 2.方法 |
| 2.1 现场流行病学调查及临床检查 |
| 2.2 细菌学检测 |
| 2.2.1 肺脏、肝脏及肠壁组织处理 |
| 2.2.2 染色、镜检 |
| 2.3 RT-PCR检测 |
| 2.3.1 粪便及肠内容物样品处理 |
| 2.3.2 总RNA的提取 |
| 2.3.3 引物设计 |
| 2.3.4 RT-PCR反应 |
| 2.4 扩增产物的序列分析 |
| 2.4.1 琼脂糖凝胶电泳与目的条带的回收 |
| 2.4.2 目的片段的克隆 |
| 2.4.3 质粒提取 |
| 2.4.4 阳性株测序与序列分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 现场流行病学调查及临床检查结果 |
| 3.2 细菌学检测 |
| 3.3 RT-PCR检测结果 |
| 3.4 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 3.5 测序结果及遗传进化分析 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 试验二 BVD-MD/IBR二联灭活疫苗疫苗免疫效果评价及猪瘟兔化弱毒疫苗免疫的对比试验 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 主要试剂与仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 BVDV疫苗免疫程序 |
| 2.2 猪瘟兔化弱毒疫苗免疫程序 |
| 2.3 BVDV抗体ELISA检测 |
| 2.4 猪瘟抗体ELISA抗体检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 BVDV抗体检测结果 |
| 3.2 牛猪瘟抗体检测结果 |
| 3.3 BVD-MD/IBR二联苗与猪瘟兔化弱毒疫苗二免后抗体检测结果比较 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 试验三 免疫母牛所产犊牛抗原抗体检测及健康状况观察 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 粪便拭子处理 |
| 2.2 血清采集 |
| 2.3 牛病毒性腹泻粘膜病毒抗体ELISA检测 |
| 2.4 猪瘟抗体ELISA抗体检测 |
| 2.5 牛病毒性腹泻粘膜病毒抗原ELISA检测 |
| 2.6 犊牛健康状况观察 |
| 3.结果 |
| 3.1 犊牛牛病毒性腹泻粘膜病毒抗体与猪瘟抗体检测结果比较 |
| 3.2 犊牛牛病毒性腹泻粘膜病毒抗原ELISA检测结果 |
| 3.3 犊牛健康状况 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 全文总结、创新点 |
| 1.全文总结 |
| 2.创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（9）河北省与天津市BVD-MD的流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 国外研究现状 |
| 1.2 国内研究现状 |
| 1.3 BVDV的病原学 |
| 1.3.1 BVDV的抗原特性 |
| 1.3.2 BVDV的形态和理化特性 |
| 1.3.3 BVDV的生物型及毒力 |
| 1.3.4 BVDV的细胞培养 |
| 1.3.5 BVDV的基因组结构 |
| 1.4 BVDV的流行病学 |
| 1.5 临诊症状 |
| 1.5.1 持续感染 |
| 1.5.2 粘膜病(MD)和慢性BVD |
| 1.5.3 急性BVD |
| 1.5.4 繁殖障碍 |
| 1.5.5 血小板减少和出血综合征 |
| 1.5.6 免疫抑制 |
| 1.6 诊断技术 |
| 1.6.1 病毒分离鉴定 |
| 1.6.2 电镜检查 |
| 1.6.3 血清学检测 |
| 1.6.4 免疫学检测 |
| 1.6.5 分子生物学检测 |
| 1.7 防治措施 |
| 1.8 研究的目的与意义 |
| 第二章 河北省与天津市奶牛养殖场BVDV的大缸奶检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 待检奶样 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 样品处理 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 ELISA检测结果 |
| 2.3.2 风险评价 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 河北省与天津市奶牛场BVD-MD的血清流行病学调查 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 待检血清 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试验仪器与设备 |
| 3.2 检测方法 |
| 3.2.1 牛病毒性腹泻-粘膜病ELISA抗体检测 |
| 3.2.2 牛病毒性腹泻-粘膜病ELISA抗原检测 |
| 3.2.3 分子生物学诊断方法RT-PCR |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 血清学检测结果 |
| 3.3.2 RT-PCR检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）我国牛病毒性腹泻/黏膜病研究进展及防控策略（论文提纲范文）
| 1 病毒分离及基因分型的研究 |
| 2 血清流行病学调查 |
| 3 诊断方法的研究 |
| 4 免疫研究 |
| 5 防制措施 |
| 6 结论 |
四、检测牛病毒性腹泻－粘膜病病毒抗原试剂盒的研制及应用（论文参考文献）
- [1]新疆地区牛病毒性腹泻—粘膜病流行病学调查[D]. 马振国. 石河子大学, 2019(01)
- [2]河南省肉牛规模化养殖场牛病毒性腹泻的诊断与防制技术研究[D]. 张光辉. 南京农业大学, 2004(02)
- [3]牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA方法的建立[D]. 赵洪哲. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [4]牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立[D]. 刘昱成. 石河子大学, 2014(03)
- [5]牛病毒性腹泻病毒抗原检测、流行病学研究及分离株E2基因的克隆表达[D]. 钟发刚. 四川农业大学, 2008(02)
- [6]鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究[D]. 郜玉钢. 吉林农业大学, 2005(04)
- [7]新疆北疆地区规模化奶牛场犊牛病毒性腹泻相关病原的调查研究[D]. 张坤. 石河子大学, 2016(02)
- [8]某牛场牛BVD-MD的诊断与BVD-MD/IBR二联苗免疫效果评价[D]. 阮东. 石河子大学, 2017(01)
- [9]河北省与天津市BVD-MD的流行病学调查[D]. 王聪颖. 沈阳农业大学, 2018(03)
- [10]我国牛病毒性腹泻/黏膜病研究进展及防控策略[J]. 薛飞,朱远茂,马磊. 中国奶牛, 2016(11)