一、用亲和层析法提取大片吸虫谷胱甘肽转移酶（论文文献综述）
杨琪琳[1]（2021）在《黄酒酵母β-苯乙醇合成途径中关键酶的催化特性解析》文中研究说明β-苯乙醇具有典型的玫瑰芬芳,是料酒、香醋中最重要的芳香醇。料酒及香醋中的β-苯乙醇主要来自于黄酒原料,目前关于相关产品中β-苯乙醇合成代谢调控信息缺乏,阻碍了其中β-苯乙醇浓度的调节,限制了产品品质提升,困扰着生产企业。研究发现黄酒酵母是相关产品中β-苯乙醇的主要来源,但目前鲜有关于黄酒酵母β-苯乙醇合成代谢调控机理的报道,由于酿酒酵母亚种间复杂的代谢多样性,现有代谢网络模型也不能够准确反应我国特色菌株——黄酒酵母的代谢特性。本研究以黄酒、料酒、香醋酿造的核心微生物黄酒酵母HJ为研究对象,通过分子生物学手段从酶活水平揭示黄酒发酵过程中β-苯乙醇合成代谢途径酶的调控机理。主要结论如下:1.基于同源建模对关键酶的性质和结构进行预测分析。明确了黄酒酵母HJ（Saccharomyces cerevisiae,HJ）和酿酒酵母模式菌株S288C在β-苯乙醇合成途径关键酶的氨基酸序列信息,利用DNAMAN进行多序列比对,筛选出20个差异基因,进而使用Prot Param、TMHMM 2.0等生物信息学软件对差异蛋白的性质进行预测分析,基于同源建模和已有研究结果,初步选择β-苯乙醇主要合成途径艾利希途径的苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p,苯丙酮酸脱羧酶Aro10p以及醇脱氢酶Adh1p作为下一步研究的重点对象。2.苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的表达和酶学性质研究。成功在大肠杆菌中过表达出重组苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p。对纯酶的酶学性质研究结果表明:苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的最适反应p H为6.0,最适反应温度为30℃;在最适条件下,Aro9pHJ的酶活(17.86 U·g-1)与Aro9pS288C(17.61 U·g-1)大小相当。动力学分析结果表明:Aro9p存在受酮酸抑制的现象,未得到苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的动力学参数,但当底物L-苯丙氨酸的浓度达到2 m M时,Aro9pHJ的反应速率(23.89μmol·（min?g）-1)高出Aro9pS288C(21.3μmol·（min?g）-1)12.16%。外源添加末端代谢产物对酶活影响分析发现:Aro9pHJ随着β-苯乙醇浓度的增加,耐受β-苯乙醇能力比Aro9pS288C强,当β-苯乙醇浓度为200 mg·L-1时,苯丙氨酸氨基转移酶Aro9pHJ的比酶活(18.69 U·g-1)高Aro9pS288C约30.52%。在添加40%vol的乙醇的条件下,Aro9pHJ的相对酶活剩余90.84%,Aro9pS288C的相对酶活剩余78.02%,表现为Aro9pHJ更耐受高浓度的β-苯乙醇和乙醇。3.苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的表达和酶学性质研究。成功在大肠杆菌中过表达出重组苯丙酮酸脱羧酶Aro10p。对纯酶的酶学性质研究结果表明,苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的最适反应p H为7.0,最适反应温度为40℃;且在最适条件下,Aro10pHJ的比酶活(77.81U·g-1)比Aro10pS288C(62.0 U·g-1)高约25.49%。动力学分析结果表明:在同一底物苯丙酮酸的条件下,Aro10pHJ的kcat/Km值(35.7 L·（μmol?min）-1)表现和Aro10pS288C的kcat/Km值(35.8 L·（μmol?min）-1)相当,但Aro10pHJ与底物苯丙酮酸的亲和力相对强于Aro10pS288C。外源添加末端代谢产物对酶活影响分析发现:β-苯乙醇和乙醇会严重抑制苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的催化活性,Aro10pHJ耐受β-苯乙醇和乙醇的能力略高于酿酒酵母Aro10pS288C。4.醇脱氢酶Adh1p的表达和酶学性质研究。成功在大肠杆菌中过表达出重组醇脱氢酶Adh1p。对纯酶的酶学性质研究结果表明,醇脱氢酶Adh1p的最适反应p H为7.5,最适反应温度为40℃;且在最适条件下,Adh1pHJ的比酶活(231.51 U·g-1)比Adh1pS288C(203.48 U·g-1)高约13.79%。动力学分析结果表明:以苯乙醛为底物时,Adh1pHJ与底物苯乙醛的亲和力大于Adh1pS288C,且Adh1pHJ的催化效率也较大。而以乙醛为底物时,Adh1pHJ与底物乙醛的亲和力和催化效率较小。外源添加末端代谢产物对酶活影响分析发现:外源添加0 mg·L-1-300 mg·L-1的β-苯乙醇的情况下,醇脱氢酶对底物乙醛的催化反应会仍旧保持高催化活性,且黄酒酵母菌株的Adh1pHJ耐受β-苯乙醇的能力相对来说高于酵母模式Adh1pS288C,而对底物苯乙醛,乙醇抑制一定的酶活,但黄酒酵母菌株Adh1pHJ耐受乙醇的能力相对高于酵母模式Adh1pS288C。综上所述,本研究通过基于对黄酒酵母HJ的β-苯乙醇合成代谢途径关键酶的功能性质与结构预测,进而对于来自黄酒酵母HJ和酿酒酵母模式菌株S288C的艾利希途径的苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p,苯丙酮酸脱羧酶Aro10p以及醇脱氢酶Adh1p的酶学性质进行比较分析,为调控传统发酵食品中β-苯乙醇含量提供方法学和理论依据,有助于解决料酒及香醋增香的共性关键科学问题,对于改进酿造技艺、提升产品品质和推动料酒及香醋行业的“供给侧”改革具有重要意义。
龚静芝[2]（2021）在《片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立》文中认为片形吸虫病（Fasciolosis）是由大片吸虫（Fasciola gigantica）和肝片吸虫（Fasciola hepatica）引起的一种人畜共患寄生虫病。该病主要感染反刍动物和人,是一种食源性寄生虫病,受到感染的动物或人表现为急性肝炎、慢性肝纤维化、胆管炎等,严重时能造成动物的大量死亡,对人类及畜牧业的危害十分严重。目前对于该病的防控主要依赖于药物治疗,因此,对于该病的诊断、尤其是早期诊断尤为重要,能够做到早诊断、早治疗,就能减少该病对人类及动物健康的危害,降低畜牧业的经济损失。片形吸虫病的诊断研究一直是该领域的研究热点。目前临床上主要采用的经典粪便虫卵镜检法不能应用于片形吸虫病的早期诊断;国际上虽然存在几种较好的免疫学诊断方法,但是其诊断抗原多为虫体纯化的天然混合抗原,成本高,具有一定交叉反应。为解决这一重要难题,本课题在前期的蛋白组学的基础上,通过生物信息学方法筛选到一些候选的诊断靶标,通过原核表达、蛋白纯化、Western bloting对诊断靶标进行筛选及评价,并筛选到一个新组织蛋白酶（命名为CL7）,建立了间接ELISA方法,并用该方法对田间样品进行了检测。随后对筛选的诊断靶标蛋白CL7进行单克隆抗体及多克隆抗体制备,进而建立了双抗夹心ELISA方法,用于检测片形吸虫的循环抗原,以达到片形吸虫病的早期诊断的目的。具体内容概述如下:1.诊断靶标的筛选、表达纯化及间接ELISA方法的建立和优化本研究选取 Annexin（Ann）、Leucine aminopeptidase（LAP）、CUB domain protein（CUB）以及一个命名为CathepsinL7（CL7）新的组织蛋白酶家族成员的蛋白基因进行分子克隆、载体构建、体外原核表达,蛋白纯化,用Western bloting对四个诊断靶标进行筛选及评价,随后以四种蛋白为包被抗原建立相应的间接ELISA（indirect enzyme linked immunoabsordent assay iELISA）方法以筛选最佳诊断靶标。使用片形吸虫感染的羊阳性血清和健康羊阴性血清用来评价其敏感性,结果表明:Ann、CUB敏感性（SEN）较低;LAP、Ann+LAP、CL7的敏感性较高。使用片形吸虫感染的羊阳性血清（n=16）和其他常见寄生虫阳性血清（n=16）,进行交叉反应,结果显示CL7特异性（SPE）最高,其他二者次之。在四个靶标蛋白中CL7是最有潜力的。2.CL7生物信息学分析、单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立本实验首次对CL7基因进行研究,通过生物信息学分析,证明其属于CL家族一员（组织蛋白酶L）,因此命名为（CL7）,并将其基因序列上传GenB ank,基因号:MN150457。同时本文对CL7还进行结构域分析、建模和可靠性3D建模。为建立适用于早期诊断的夹心ELISA（sandwich ELISA sELISA）方法,以CL7作为免疫原分别免疫小鼠和新西兰兔,成功获得11株CL7单克隆抗体（mAbs）和兔多克隆抗体。选取四株高滴度单抗:2B5、3B10、5A2、9H9进行小鼠腹水的制备、纯化、效价测定,亚型表位鉴定。结果表明:2B5、3B10、5A2、9H9分别属:IgG1、IgG2b、IgG1、IgG3,叠加ELISA结果显示2B5与5A2识别相似或相同表位,3B10与9H9识别相似或相同表位。用2B5和3B10与兔多克隆抗体进行组合,建立多种sELISA方法。对比发现CL7单抗2B5与兔多抗组合建立的sELISA效果最佳。并对该CL7 sELISA建立标准曲线,用于循环抗原CL7的定量分析。经ROC统计分析显示:CL7 sELISA对片形吸虫感染羊血清（n=12）检测下线为1.087ng/mL（Cut-off:0.4115）,并将上述阳性血清用于SEN与SPE的评估,结果表明二者均达到100%,CL7 sELISA检测不同感染期水牛的阳性（3-7感染周）、阴性血清时,检测下线为2.009 ng/mL（Cut-off:0.4845）,SPE达到100%,SEN达到93.75%。因此CL7 sELISA可应用于反刍动物片形吸虫的早期诊断。综上所述,本实验成功表达了四种片形吸虫重组蛋白,发现了一个良好的诊断靶标蛋白CL7,并建立了一种可以用于早期诊断的sELISA方法,对片形吸虫的诊断具有重要的应用价值。
吴丽佳[3]（2020）在《肝片形吸虫不同发育阶段虫体的蛋白质组学比较分析及胶体金试纸条研制》文中认为肝片形吸虫（Fasciola hepatica）主要寄生于牛、羊等反刍动物的肝脏和肝胆管内,引起的一种吸虫病称为肝片形吸虫病,肝片形吸虫病是一种人畜共患寄生虫病,该病在全球内广泛流行,每年因片形吸虫感染造成的经济损失超过30亿美元[1]。所以早期诊断变得尤为重要。本研究对肝片形吸虫囊蚴、童虫、幼虫和成虫四个主要发育阶段运用Label-free定量蛋白质组学进行分析,四个时期共鉴定到107501条肽段,2406个蛋白。采用Max Quant软件对蛋白质组学数据进行非标记定量计算,对定量结果进行显着性差异分析,发现囊蚴与其他三个时期虫体之间存在的差异蛋白数量显着低于其他三组之间存在的差异蛋白数,且童虫与成虫之间的差异蛋白数量最多。经过韦恩图、火山图和聚类分析图分析得到的结果与Label free算法的结果相符。对差异蛋白进行GO和KEGG分析,GO结果显示在生物学进程中参与蛋白质折叠过程的蛋白质最多;在细胞组分中,富集于细胞的蛋白质最多;在分子功能中,蛋白质主要参与蛋白结合功能。KEGG结果显示差异蛋白主要参与新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、组织系统和其他这六个方面。经过对差异蛋白数据的筛选分析,将差异蛋白分为有明显趋势的50组,其中42、49、48、12、45、47组蛋白趋势较好,Profile42组主要为钙结合蛋白、硫氧还蛋白-谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、谷胱甘肽转移酶和甘油-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。Profile 49组主要为热休克蛋白90、热休克蛋白70、肌动蛋白。Profile 48组Ca2+不敏感的EF hand、醛脱氢酶家族蛋白。Profile 12组为Ras家族蛋白、钙调素样蛋白1、肌动蛋白、钙调素样蛋白3。Profile 45为分泌组织蛋白酶L1、脂肪酸结合蛋白III、蛋白质二硫化物异构酶、钙网蛋白家族蛋白、肌球蛋白尾。Profile 47组为肌球蛋白、原肌球调节蛋白、肌球蛋白调节轻链。我选取了Profile 42组的谷胱甘肽转移酶和Profile 45组的脂肪酸结合蛋白III,作为早期诊断抗原,其中谷胱甘肽转移酶为本实验室研制并保存。脂肪酸结合蛋白III经Uni Prot查询基因序列,成功构建原核表达载体PET-30a-FhFABⅢ,片段大小399bp,蛋白大小为16k Da,经Western bloting检测,肝片形吸虫抗体能够特异性识别重组表达蛋白,用重组Fh GST和FhFABⅢ蛋白纯化后作为诊断抗原,建立间接ELISA方法并优化其条件,检测结果显示FhFABⅢ重组抗原包被浓度每孔为9.275ng;血清稀释度为1:12800;FhFABⅢ重组抗原最佳孵育时间为4℃包被过夜;最佳封闭液选5%脱脂乳;最佳二抗孵育时间为60min;最佳底物作用时间为15 min。Fh GST重组抗原包被浓度为每孔为37.5ng;血清稀释度为1:12800;Fh GST重组抗原最佳孵育时间为37℃2h包被;最佳封闭液选10%脱脂乳,最佳二抗孵育时间为30min,最佳底物作用时间为15 min。在敏感性试验中,FhFABⅢ和Fh GST最早检出肝片形吸虫感染天数均为21d;在特异性实验中,肝片形吸虫FhFABⅢ和Fh GST重组抗原与华枝睾吸虫、日本血吸虫和捻转血矛线虫均无交叉反应;对不同生产批号的酶标板进行板间和板内的重复性实验,两种重复性实验结果显示变异系数均小于10%。临床检测样本95份,结果显示FhFABⅢ的阳性检出率为16.84%（16/95）,Fh GST的阳性检出率为12.63%（12/95）。用纯化好的FhFABⅢ和Fh GST重组蛋白免疫新西兰大白兔（1mg/kg）,每间隔两周免疫一次,当抗体效价达到105以上,便可心脏采血,采用Protrin A亲和层析法纯化多抗。采用柠檬酸三钠还原法制备了20nm大小的胶体金颗粒用来标记纯化后的兔多抗。FhFABⅢ最佳多抗标记量为5.07μg/m L,最适p H值为7.5;Fh GST最佳多抗标记量为10.15μg/m L,最适p H值为8.0。差速低温纯化金标抗体,FhFABⅢ多抗标记纯化后的胶体金颗粒作1:1稀释,Fh GST兔多抗标记纯化后的胶体金颗粒作1:4稀释,分别浸泡玻璃纤维。用FhFABⅢ和Fh GST抗原在硝酸纤维素膜上划检测线（T线）,最适划线浓度均为0.8mg/m L。对两种试纸条分别进行了敏感性、重复性、特异性实验。结果显示:两种胶体金试纸条检出最早感染肝片形吸虫的时间均为21d;FhFABⅢ检测最低稀释倍数为1:60,Fh GST检测最低稀释倍数为1:80;不同批次试纸条重复检测,结果无明显差异;两种试纸条均不与华枝睾吸虫、捻转血矛线虫和日本血吸虫发生反应,表明两种试纸条的敏感性、重复性和特异性良好。两种试纸条检测临床样本95份,Fh GST试纸条检测出11份阳性血清,阳性率为11.58%（11/95）,与ELISA方法的符合率为91.67%,FhFABⅢ试纸条检测出14份阳性血清,阳性率为14.71%（14/95）,与ELISA方法的符合率为87.5%。该结果表明,制备的基于FhFABⅢ和Fh GST蛋白多克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条能够初步检测临床样本,可用于肝片形吸虫的诊断。
李雪[4]（2018）在《大片吸虫两种CD59样蛋白的生物信息分析及体外重组表达》文中研究表明片形吸虫体被的表面富含糖蛋白。这些体被的蛋白与宿主组织和体液直接接触,是寄生虫与宿主发生生化反应,身体的免疫反应和生理反应的位置,对片形吸虫的宿主免疫机制与免疫逃避等有重要作用。研究片形吸虫的体被蛋白对片形吸虫的免疫预防、治疗以及疫苗的研究有着重要的作用。本实验通过PCR扩增与序列测序获得了大片吸虫CD59-1与CD59-2蛋白基因序列。FgCD59-1蛋白大小为122个氨基酸残基,FgCD59-2蛋白大小为127氨基酸残基。两个蛋白皆N端有一个信号肽片段,C端有一个GPI锚定片段,序列内皆有一个LY6/CD59的保守结构域“CCXXXXCN”。通过序列相似性比对分析发现,大片吸虫的FgCD59-1、FgCD59-2蛋白序列与肝片吸虫的FhCD59-1、FhCD59-2蛋白序列的相似性非常高。对大片吸虫CD59-1蛋白6个克隆测序分析和大片吸虫CD59-2蛋白3个克隆测序分析证实了 FgCD59-1和FgCD59-2蛋白多态性不高。将大片吸虫FgCD59-1、FgCD59-2蛋白序列与肝片吸虫的FhCD59-1、FhCD59-2蛋白,以及其他43种蛋白构建系统进化树,发现FgCD59-1与肝片吸虫 CD59 样蛋白 FhCD59-1、FhCD59-4、FhCD59-5、FhCD59-6、FhCD59-7、FhCD59-8属于同一个分群。而FgCD59-2与FhCD59-2属于同一个分群。通过应用SWISS-MODEL、modeller等一系列的生物信息学软件,对FgCD59-1和FgCD59-2蛋白的一级结构、二级结构和三级结构、跨膜区域、亚细胞定位进行了预测和分析,并预测构建了较为准确的FgCD59-1和FgCD59-2蛋白的同源模型。根据FgCD59-1和FgCD59-2基因的序列设计出两对带有酶切位点的特异性引物,从大片吸虫虫体提取大片吸虫的RNA,并通过RT-PCR扩增出目的片段。克隆测序验证后,克隆载体进行重组克隆。鉴定序列正确后双酶切出粘性未端,并将其连接到表达载体pET-32a中,成功构建出带有Trx标签与 6His 标签的表达质粒 pET-32a-FgCD59-1 和 pET-32a-FgCD59-2。将鉴定正确的重组质粒转化到表达细菌BL21中,通过IPTG诱导蛋白表达,优化表达菌、表达温度、诱导表达IPTG浓度等表达条件,之后大量获得融合蛋白包涵体。将包涵体变性复性之后,获得蛋白序列不变的可溶性蛋白,并使用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。结果证明确实得到了FgCD59-1融合蛋白和FgCD59-2融合蛋白。本研究获得并分析了FgCD59-1、FgCD59-2两个蛋白基因,预测分析了蛋白结构并构建了两个同源模型。成功构建了 2个蛋白基因的表达载体,并获得2个目的融合蛋白。为进一步研究两种蛋白的结构性质,以及其在大片吸虫免疫过程中的作用奠定了基础。
岳东梅[5]（2017）在《大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析》文中指出片形吸虫不仅感染牛羊等反刍动物,而且也可感染人体,严重威胁着人和动物的健康。因此,建立高效准确的诊断方法是防控该病的研究重点。片形吸虫包括肝片形吸虫、大片形吸虫及其中间型,目前对于大片形吸虫及其中间型的相关研究相对较少。因此,本研究选择大片形吸虫为研究对象,通过对大片形吸虫排泄分泌（ES）抗原与宿主的互作,旨在筛选、鉴定及分析出具有诊断潜力的蛋白,为建立大片形吸虫的诊断方法奠定基础。本研究分为三部分。第一部分,对大片形吸虫的鉴定。首先,将采自广西南宁的144条片形吸虫虫体进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。形态学鉴定这144条虫体均为片形吸虫。对这144条虫体的核糖体第二内转录间隔区（ITS-2）序列进行了扩增、测序,结果表明144个PCR样品的测序结果区别于肝片形吸虫及中间型,而均与大片形吸虫ITS-2序列（GenBank accession AJ557569）匹配率达99.7%,从而判定分离得到的144条片形吸虫均为大片形吸虫,不含中间型。第二部分,大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选。首先,利用体外培养方法收集大片形吸虫虫卵,对虫卵进行体外培养孵出毛蚴感染淡水螺,使其在淡水螺体内生长发育,直至尾蚴逸出螺体脱尾形成囊蚴,收集形成的囊蚴（感染虫卵后35 d）,并进一步用囊蚴经口感染水牛（约500个囊蚴/头）,在水牛感染后的14 d、42 d、70 d、98 d,分别采血制备血清。其次,利用体外培养方法分别收集大片形吸虫ES抗原,将收集的ES抗原免疫家兔制备阳性血清,用间接ELISA方法检测其抗体效价,结果表明ES抗原制备的阳性血清效价可达到1:1 000,说明大片形吸虫ES抗原的免疫原性较好,可用于后续的试验。然后,将大片形吸虫ES抗原分别与水牛各时间段的血清互作,通过免疫共沉淀和LC-MS/MS（质谱）试验,共获得了465个非冗余蛋白。进一步用BlastP同源性比对、UniProt鉴定,找到57个已知蛋白,分别在42 d、70 d和98 d的蛋白有13（22.8%）个、5（8.8%）个和7（12.3%）个,同时存在于42 d和70 d、70 d和98 d、42 d和98 d的可被鉴定的蛋白分别有8（14%）个、5（8.8%）、1（1.8%）个,同时存在于42 d、70 d和98 d可被鉴定的蛋白有18（31.6%）个。进一步用生物信息学分析,预测α-微管蛋白和亮氨酸氨肽酶等蛋白具有诊断价值。第三部分,对筛选出的具有代表性的α-微管蛋白和亮氨酸氨肽酶进行克隆、原核表达,并探索其作为片形吸虫病诊断抗原的可行性。结果表明,成功克隆了片段长为1 356 bp、能编码452个氨基酸、理论分子量为48.99 kDa的α-微管蛋白基因和片段长为1 572 bp、能编码523个氨基酸、理论分子量为56.38 kDa的亮氨酸氨肽酶基因。这两个蛋白的二级结构预测都以无规卷曲为主,抗原表位在整个序列均有分布。三级结构的主要功能区域都在N端。将α-微管蛋白基因插入载体pGEX-6P-1（+）,亮氨酸氨肽酶基因插入载体pET-30a分别进行原核表达。发现经IPTG诱导表达的重组蛋白pGEX-6P-1（+）-FgAT分子量约为76 kDa（含载体携带的26 kDa的GST标签）,且以融合蛋白形式表达,经Glutathione-Sepharose beads纯化后,获得了较高纯度的重组蛋白pGEX-6P-1（+）-FgAT;经IPTG诱导表达的重组蛋白pET-30a-FgLAP分子量约为56 kDa,以包涵体形式表达,经Ni-NTA His bind Resin纯化后获得较高纯度的重组蛋白pET-30a-FgLAP。这两个重组蛋白分别与大片吸虫ES抗原免疫家兔后制备的阳性血清、水牛感染大片吸虫不同期的阳性血清反应,经Western Blot分析证实均具有免疫反应性。本研究通过以上三个部分的试验,成功鉴定出大片形吸虫ES抗原中与宿主互作的蛋白,包括465个非冗余蛋白。利用生物信息学分析,筛选出57个已知蛋白,并进一步鉴定出具有代表性的α-微管蛋白基因和亮氨酸氨肽酶基因。通过对这两个基因的克隆、表达及免疫反应性分析,推断出它们在大片形吸虫病诊断中具有很大的潜力。
魏伟[6]（2009）在《牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及临床血清学调查》文中认为牛病毒性腹泻病（BVD）,是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的一种疾病,又称黏膜病。牛病毒性腹泻病毒可以感染各个年龄段的牛,在全世界广泛分布。其临床症状主要表现为腹泻,急、慢性黏膜病,持续性感染与免疫耐受,免疫抑制,母畜流产、死胎和畸胎等。急性感染可表现为短暂的腹泻或者肺炎,通常呈群组暴发流行。急性型通常有出血综合症,死亡率高。犊牛感染该病毒通常比较温和且不表现临床症状。由于其能引起繁殖系统病变并能形成持续感染,因而对养牛业有着重要的影响。BVDV与猪瘟病毒（CSFV）、羊边界病病毒（DBV）及部分未分类瘟病毒同属于黄病毒科瘟病毒属,均为单股正链RNA病毒。瘟病毒属成员中的病毒过去被认为是宿主特异性的,但后来的研究表明BVDV与DBV可以感染更广泛的宿主,它们不但可以感染牛和羊,并且可以感染包括猪在内的多种偶蹄类动物。BVD具有特征性的临床症状的较少,在实际生产中常常不易被诊断,加之本病的病死率不高,未能引起人们的足够重视而忽视本病的存在,因此各牛场牛群缺乏系统的监测防制措施,这也是导致我国牛群BVDV感染日益扩大的原因之一。由于BVDV对牛能形成持续性感染,并且其对养牛业危害极大,因此对牛群进行普查,检测其感染情况,淘汰感染个体,成为本病防制的重要环节。BVDV的非结构蛋白NS3在瘟病毒属中非常保守,是一种免疫优势蛋白,在自然感染或者弱毒活疫苗免疫后的动物体内均可检出针对该蛋白的抗体。本实验室筛选出BVDV NS3蛋白中有免疫反应性的重组片段（rBVDV-NS3b）作为包被抗原,建立了一个BVDV抗体检测的间接ELISA方法,与进口同类试剂盒的符合率为91.3%。为了解黑龙江省内BVDV的感染情况,用本实验室建立的BVDV NS3蛋白抗体间接ELISA检测方法对黑龙江省内不同地区的4个奶牛养殖场2006年2008年的1 388份血清样本进行BVDV抗体检测。结果显示4个奶牛养殖场该3年平均BVDV血清阳性率分别为54.66%、57.68%、62.90%,表明在黑龙江省奶牛养殖场中牛病毒性腹泻病毒感染率较高,并且呈逐年上升趋势。
周伟芳[7]（2008）在《重组抗原诊断家畜日本血吸虫病的比较分析》文中进行了进一步梳理日本血吸虫病是危害严重的人畜共患寄生虫病,患病家畜是我国血吸虫病最重要的传染源,家畜血防工作对我国控制和消灭血吸虫病流行意义重大。准确的诊断是做好血防工作的前提和基础。现有的血吸虫病病原学诊断方法检出率低、漏检率高、费时费力,不适应血防工作发展的需要,血清学诊断方法操作较简便、方法敏感,但是特异性、重复性和稳定性仍不够理想。不能用于疗效考核,不可区分现症感染和既往感染,寻找更为理想的诊断抗原,建立更加特异敏感,或可区分现症感染和既往感染、可用于疗效考核的血吸虫病检测技术是当前血防工作的迫切需要。寻找新的可同时提高诊断方法的特异性和敏感性的基因重组抗原,是本研究尝试的目的之一。本研究应用基因工程技术,表达和纯化了本实验室研制的5种血吸虫病基因重组抗原或多表位基因重组抗原,同时以目前血吸虫病血清学诊断最常用的抗原——血吸虫虫卵可溶性抗原SEA作为对照抗原,应用间接ELISA法,比较分析不同基因重组抗原或多表位基因重组抗原作为诊断抗原检测牛、兔血吸虫病的应用潜力。首先通过方阵实验,摸索和确定了以上5种血吸虫基因重组抗原和SEA作为诊断抗原,应用间接ELISA法检测日本血吸虫实验感染兔和现场感染牛的优选实验条件,包括抗原、包被浓度、封闭剂及作用时间、血清稀释度及作用时间、酶标二抗稀释度及作用条件、底物作用条件等,在此基础上,开展了以下三方面研究:1.比较分析以不同基因重组抗原作为诊断抗原,检测兔和牛日本血吸虫病的敏感性和特异性。2.分析比较日本血吸虫感染兔药物治疗前后基因重组抗原特异性抗体消长情况。3.血吸虫早期诊断抗原与技术的研究。研究结果表明以二价多表位重组抗原pGEX-SjGCP-Sj23作为诊断抗原,对牛和兔血吸虫病的检出率和对健康动物的阴性符合率都高于SEA和其他几种基因重组抗原。如用于疗效考核或区分现症感染和既往感染目的,在所测试的几种抗原中,以二价多表位重组抗原pGEX-SjGCP-Sj23效果最佳。建立针对pGEX-SjGCP-Sj23的特异性IgM抗体的检测技术有可能用于血吸虫病的早期诊断。二价多表位重组抗原pGEX-SjGCP-Sj23,是一种值得深入研究、有应用前景的、新的血吸虫病诊断抗原。本研究为建立更为敏感、特异的家畜日本血吸虫病血清学诊断技术提供了新思路。
郭敏[8]（2007）在《大片吸虫cDNA文库的构建及组织蛋白酶L1基因的克隆和表达》文中研究说明片形吸虫病（Fasciolasis）是由片形属的肝片吸虫（Fasciola hepitica）和大片吸虫（Fasciola gigantica）寄生于牛、羊等多种动物的胆管和肝脏中引起的一种寄生虫病。该病在我国分布广泛,给畜牧业带来巨大的经济损失。同时片形吸虫的囊蚴也可感染人,严重危害人们的健康,是一种重要的人兽共患寄生虫病。本研究利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了大片吸虫成虫cDNA文库,文库库容量为2.08×106 pfu/mL,重组率为98%。扩增后的文库滴度为6.23×109 pfu/mL,插入片段平均大小约为1000 bp。采用PCR从已构建的DNA文库中克隆了组织蛋白酶L1（Fasciola gigantica Cathepsin L1,FgCL1）编码序列,提交GenBank,登录号为EF536899。FgCL1编码序列亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,重组质粒pGEX/FgCL1在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导以包涵体形式表达,其分子量为61KD左右,利用High-Affinity GST Resin亲和层析法进行目的蛋白的纯化,纯度为77.8%。Western-blotting结果表明纯化蛋白可以识别自然感染大片吸虫的牛血清。用纯化的FgCL1作为包被抗原,建立了一种检测片形吸虫病的ELISA诊断方法,并对ELISA反应条件进行了优化。确定抗原的最适包被浓度为4ug/ml;血清的稀释度为1:200,37℃作用0.5h;最佳封闭条件为5%脱脂奶粉,37℃封闭3h;酶标二抗的最佳稀释度是1:16 000,37℃作用0.5h;底物显色时间为20min。根据已经建立的ELISA方法及反应条件,确定阴阳性临界值为0.143。重组抗原与血吸虫、华支睾吸虫、弓形虫无交叉性感染,但与东毕吸虫有轻微交叉反应,说明建立的ELISA方法特异性较好。为我国片形吸虫病的免疫诊断和血清学调查提供了行之有效的技术手段。
马丽[9]（2002）在《片形吸虫囊蚴培养及感染家兔后特异性抗体的动力学研究》文中研究指明片形吸虫病是由大片吸虫和肝片吸虫引起的一种危害反刍动物的严重的寄生虫病，成虫寄生在胆管中，导致肝硬化、贫血，引起宿主生长发育受阻、使役能力、泌乳量及生殖能力下降，带来极大的经济损失。尽管大片吸虫和肝片吸虫在生活史上是相似的，但从流行病学上的特点来看，这两个种是有差异的。为在细胞和分子水平上弄清宿主-片形吸虫的相互作用机制，寻找宿主抗寄生虫的免疫效应机制和抑制寄生虫抗宿主的逃避机制，从而研制出高效的疫苗，本实验室开展了“片形吸虫病免疫机制研究”的工作，本研究为其前期工作，包括建立一个实验室内培养大片吸虫囊蚴的方法、建立一套实验感染、检测免疫反应的方法，探讨大片吸虫感染终末宿主的机制，比较大片吸虫和肝片吸虫的不同，为下一步的工作打下良好的基础。 本实验共感染500个螺，成活233个，成活率为46％，共产囊蚴16000余尾，平均产70尾。培养螺蛳关键在于温度、密度、感染毛蚴的个数和通氧情况。实验发现，虫卵发育为毛蚴的时间随温度升高而缩短，随温度降低而延长，吸虫在螺内的发育也与温度有关。用空调和加热器调节室内温度保持在25-28℃时，15-17天虫卵可发育至毛蚴，38-42天尾蚴逸出、囊蚴形成。密度以1个螺／20cm2为宜。感染比例以每个螺感染1-2个毛蚴为最佳。在湿润并保持低温（4-10℃）的条件下，囊蚴可保持活力达半年 马 丽 家兔实验感染片形吸虫的免疫学研究 上 以上。饲料以生莱为主，辅以奶扭和杨树叶。培养羹蝴成功的关键在于保 证螺间的成活率和毛黝感染螺蛹的感染率。本实验进一步证实了在广西大 片吸虫的中间宿主为小土蜗螺。 用大片吸虫分涎排泄抗原的酶联免疫吸附试验检测人工感染肝片吸 虫和大片吸虫的兔血清中特异性抗体的动态变化，ES抗原用量为0．25 p g／孔，血清和二抗的稀释倍数分别为400倍和4000倍。检测结果表明， 感染肝片吸虫和大片吸虫的兔均在 2刁周出现抗体且 lgG逐渐升高，但感 染大片吸虫的兔的抗体升高缓慢，感染肝片吸虫的兔的抗体升高迅速，且 长时间锥持高幢期。对比吸虫量、囊蜘感染成活率和病理变化证实两种片 形吸虫免疫机制不同。本实验不仅对抗体变化进行了动态测定，同时也提 供了一个 EL SA诊断片形吸虫病的方洁。
沈涛,沈永林,何国声,徐梅倩,顾越星[10]（2001）在《抗大片吸虫ES抗原单克隆抗体的制备及特异性鉴定》文中提出用大片吸虫分泌排泄 （ES）抗原免疫BALB/c小鼠 ,取其脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经筛选和 3次克隆化培养后获得 2株分泌抗大片吸虫ES抗原单抗的杂交瘤细胞 （F5,F9）。经传代、冻存、复苏培养检测和染色体检查 ,证实其分泌单抗的性质稳定。通过间接ELISA试验证明 ,F5和F9单抗能与大片吸虫、肝片吸虫的ES抗原发生特异性反应 ,而不与它们的虫体抗原反应。SDS PAGE电泳和Western blot显示 ,F5McAb能与ES抗原的相对分子质量为 2 6 0 0 0～ 2 80 0 0的蛋白条带反应 ,而不与其可溶性虫体抗原反应。表明F5McAb有ES抗原特异性 ,是一株具有潜在诊断价值的McAb。
二、用亲和层析法提取大片吸虫谷胱甘肽转移酶（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用亲和层析法提取大片吸虫谷胱甘肽转移酶（论文提纲范文）
（1）黄酒酵母β-苯乙醇合成途径中关键酶的催化特性解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 黄酒酵母的研究概况 |
| 1.2 酿酒酵母β-苯乙醇的合成途径的研究概况 |
| 1.2.1 β-苯乙醇的简介 |
| 1.2.2 酿酒酵母中β-苯乙醇合成途径的研究 |
| 1.2.3 酿酒酵母中β-苯乙醇合成途径关键酶基因的研究 |
| 1.2.4 β-苯乙醇合成途径中关键酶的结构特性研究进展 |
| 1.3 黄酒酵母β-苯乙醇的合成调控研究进展 |
| 1.4 同源建模理论 |
| 1.5 研究思路与主要内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株、质粒和工具酶 |
| 2.1.2 试剂、溶液和培养基 |
| 2.1.3 数据分析网站以及软件 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 关键基因的挖掘比对与结构预测分析 |
| 2.3.2 关键基因的克隆 |
| 2.3.3 重组工程菌的表达与纯化方法 |
| 2.3.4 酶活测定方法 |
| 2.3.5 酶学特性研究方法 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 基于同源建模对关键酶的性质和结构预测分析 |
| 3.1.1 DAHP合酶的的性质和结构预测分析 |
| 3.1.2 五功能酶的的性质和结构预测分析 |
| 3.1.3 分支酸变位酶的性质和结构预测分析 |
| 3.1.4 苯丙氨酸转运酶的的性质和结构预测分析 |
| 3.1.5 苯丙氨酸氨基转移酶的的性质和结构预测分析 |
| 3.1.6 苯丙酮酸脱羧酶和丙酮酸脱羧酶的性质和结构预测分析 |
| 3.1.7 醇脱氢酶的的性质和结构预测分析 |
| 3.1.8 小结 |
| 3.2 苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的表达和酶学性质研究 |
| 3.2.1 基因ARO9的扩增与克隆 |
| 3.2.2 表达载体pET-28a(+)-ARO9的构建 |
| 3.2.3 重组苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的表达与纯化 |
| 3.2.4 重组苯丙氨酸氨基转移酶Aro9p的酶学性质研究 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的表达和酶学性质研究 |
| 3.3.1 基因ARO10的扩增与克隆 |
| 3.3.2 表达载体pET-28a(+)-ARO10的构建 |
| 3.3.3 重组苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的表达与纯化 |
| 3.3.4 重组苯丙酮酸脱羧酶Aro10p的酶学性质研究 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 醇脱氢酶Adh1p的分离纯化和酶学性质研究与对比 |
| 3.4.1 基因ADH1的扩增与克隆 |
| 3.4.2 表达载体pET-28a(+)-ADH1的构建 |
| 3.4.3 重组醇脱氢酶Adh1p的表达与纯化 |
| 3.4.4 重组醇脱氢酶Adh1p的酶学性质研究 |
| 3.4.5 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录2:各基因片段序列信息 |
（2）片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫的生物学特征和生活史 |
| 1.1.1 片形吸虫的主要生物学特性 |
| 1.1.2 片形吸虫的生活史 |
| 1.2 片形吸虫病的临床表现和流行趋势及危害 |
| 1.2.1 片形吸虫病的临床表现 |
| 1.2.2 片形吸虫病的流行趋势及危害 |
| 1.3 片形吸虫病的治疗和预防 |
| 1.4 片形吸虫病诊断研究进展 |
| 1.4.1 经典方法 |
| 1.4.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.4.3 免疫学诊断 |
| 1.5 片形吸虫诊断抗原研究进展 |
| 1.5.1 排泄分泌物抗原ESP |
| 1.5.2 脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding proteins FABP) |
| 1.5.3 谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase GST) |
| 1.5.4 鞘脂激活蛋白样蛋白(Saposin-like protein SAP) |
| 1.5.5 亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase LAP) |
| 1.5.6 组织蛋白酶(Cathepsin proteases CAT) |
| 1.5.7 其他抗原 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 诊断靶标的筛选、表达纯化及间接ELISA方法的建立和优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 肝片吸虫总RNA的提取 |
| 2.2.2 反转录步骤 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.4 Ann CUB目的基因的合成 |
| 2.2.5 Ann CUB克隆载体的构建 |
| 2.2.6 Ann CUB表达载体的构建 |
| 2.2.7 Ann、CUB、CL7、LAP原核表达和纯化 |
| 2.2.8 Ann、CUB、LAP、CL7 Western blotting免疫反应性分析 |
| 2.2.9 筛选最佳抗原靶标 |
| 2.2.10 计算统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Ann、CUB目的基因的合成和Ann、CUB、CL7双酶切鉴定 |
| 2.3.2 Ann、CUB、LAP、CL7表达载体测序结果 |
| 2.3.3 Ann、CUB、LAP、CL7重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.3.4 Ann、CUB、LAP、CL7重组蛋白的免疫反应性 |
| 2.3.5 Ann、CUB、LAP、CL7多种间接ELISA方法建立 |
| 2.3.6 LAP、Ann+LAP、CL7三种ELISA方法特异性实验 |
| 2.3.7 CL7 iELISA方法的评价 |
| 2.3.8 CL7 iELISA方法田间样本检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CL7单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与细胞 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CL7抗原的序列上传和生物学分析 |
| 3.2.2 BALB/c小鼠免疫 |
| 3.2.3 鼠单克隆抗体制备 |
| 3.2.4 单抗腹水制备和纯化 |
| 3.2.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.2.6 兔多克隆抗体制备 |
| 3.2.7 夹心ELISA方法的建立 |
| 3.2.8 夹心ELISA方法的评价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CL7生物学分析 |
| 3.3.2 CL7单克隆抗体的制备 |
| 3.3.3 CL7兔多克隆抗体制备 |
| 3.3.4 CL7夹心ELISA方法的建立和评价 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（3）肝片形吸虫不同发育阶段虫体的蛋白质组学比较分析及胶体金试纸条研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 肝片形吸虫概述 |
| 1.2 蛋白质组学研究进展 |
| 1.2.1 蛋白质组学的概念 |
| 1.2.2 蛋白质组学技术的发展 |
| 1.2.3 蛋白质组学在寄生虫研究中的应用 |
| 1.3 胶体金试纸条研究进展 |
| 1.3.1 免疫胶体金技术原理 |
| 1.3.2 免疫胶体金技术在寄生虫病诊断的应用 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 实验动物和血清 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要试剂的配置 |
| 2.1.6 主要应用软件和数据分析 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品制备 |
| 2.2.2 SDS-PAGE |
| 2.2.3 蛋白质消化 |
| 2.2.4 LC-MS/MS分析 |
| 2.2.5 蛋白质鉴定与定量分析 |
| 2.2.6 生物信息学和多元性分析 |
| 2.2.7 引物的设计与合成 |
| 2.2.8 肝片形吸虫总RNA的提取 |
| 2.2.9 目的基因反转录 |
| 2.2.10 目的基因克隆 |
| 2.2.11 FhFABⅢ克隆载体的构建 |
| 2.2.12 FhFABⅢ基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.13 重组蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.2.14 重组蛋白的Western blotting分析 |
| 2.2.15 兔抗FhFABⅢ和 FhGST蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.2.16 亲和层析法纯化多抗 |
| 2.2.17 间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.18 重组FhGST和 FhFABⅢ蛋白间接ELISA条件的优化 |
| 2.2.19 间接ELISA临界值的确定 |
| 2.2.20 重复性实验 |
| 2.2.21 敏感性实验 |
| 2.2.22 特异性实验 |
| 2.2.23 临床样本检测 |
| 2.2.24 免疫胶体金颗粒的制备与纯化 |
| 2.2.25 金标抗体的制备及鉴定 |
| 2.2.26 胶体金免疫层析试纸条的制备 |
| 2.2.27 试纸条质量的评估 |
| 3 结果 |
| 3.1 蛋白质组学结果 |
| 3.1.1 蛋白质鉴定结果统计分析 |
| 3.1.2 蛋白质聚类分析 |
| 3.1.3 蛋白主要成分分析 |
| 3.1.4 蛋白质相互作用分析 |
| 3.1.5 生物信息学结果 |
| 3.2 重组蛋白FhFABⅢ构建结果 |
| 3.2.1 肝片形吸虫FhFABⅢ基因的扩增 |
| 3.2.2 重组克隆载体的双酶切鉴定 |
| 3.2.3 重组克隆载体的序列测序结果 |
| 3.2.4 重组表达载体的双酶切鉴定 |
| 3.2.5 重组蛋白表达诱导时间的优化 |
| 3.2.6 重组蛋白表达IPTG诱导浓度优化 |
| 3.2.7 重组蛋白诱导温度的优化 |
| 3.2.8 重组蛋白的纯化结果 |
| 3.2.9 重组蛋白的Western blotting分析 |
| 3.2.10 肝片形吸虫FhGST和 FhFABⅢ多克隆抗体纯化 |
| 3.3 间接ELISE结果 |
| 3.3.1 抗原浓度和血清稀释度优化 |
| 3.3.2 抗原最佳孵育时间的优化 |
| 3.3.3 最佳封闭液的优化 |
| 3.3.4 二抗孵育时间的优化 |
| 3.3.5 显色时间的优化 |
| 3.3.6 临界值确定 |
| 3.3.7 敏感性实验 |
| 3.3.8 特异性实验 |
| 3.3.9 重复性实验 |
| 3.3.10 样本检测 |
| 3.4 试纸条制备结果 |
| 3.4.1 胶体金溶液的制备 |
| 3.4.2 胶体金稳定性 |
| 3.4.3 胶体金标记抗体的制备 |
| 3.4.4 胶体金诊断试纸条优化 |
| 3.4.5 敏感性检测 |
| 3.4.6 试纸条特异性检测 |
| 3.4.7 试纸条重复性检测 |
| 3.4.8 临床样本检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 蛋白质组学数据分析 |
| 4.2 间接ELISA方法检测效果的评估 |
| 4.3 胶体金试纸条检测效果的影响因素分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）大片吸虫两种CD59样蛋白的生物信息分析及体外重组表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫病的概述 |
| 1.2 片形吸虫病的诊断研究 |
| 1.2.1 血清学检测 |
| 1.2.2 粪抗原检测 |
| 1.2.3 牛奶抗原/抗体检测 |
| 1.3 片形吸虫的疫苗研究 |
| 1.4 片形吸虫体被蛋白的研究 |
| 1.5 CD59样蛋白的研究 |
| 1.6 生物信息学研究 |
| 1.7 本课题的目的和意义 |
| 第二章 大片吸虫两种CD59样蛋白编码区扩增、测序和分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫种及菌种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂的配制 |
| 2.1.5 FgCD59样蛋白质编码区扩增引物和M13引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 大片吸虫成虫总RNA的提取 |
| 2.2.2 FgCD59样蛋白序列反转录扩增和PCR扩增 |
| 2.2.3 序列测序 |
| 2.2.4 FgCD59样蛋白质编码区序列的克隆 |
| 2.2.5 阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.6 蛋白序列的测序分析与对比分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 克隆测序结果 |
| 2.3.2 FgCD59-1与FgCD59-2的碱基序列分析 |
| 2.3.3 FgCD59-1与FgCD59-2的蛋白序列分析 |
| 2.3.4 FgCD59-1、FgCD59-2与FhCD59-1、FhCD59-2序列比对 |
| 2.3.5 序列系统进化树的构建和分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 大片吸虫CD59-1, CD59-2的蛋白质结构预测和分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 FgCD59样蛋白初级结构性质预测 |
| 3.2.2 FgCD59样蛋白跨膜结构预测 |
| 3.2.3 FgCD59样蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.4 FgCD59样蛋白二级结构分析 |
| 3.2.5 FgCD59样蛋白三级结构预测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 FgCD59样蛋白初级结构分析 |
| 3.3.2 FgCD59样蛋白跨膜区域预测 |
| 3.3.3 FgCD59样蛋白二级结构预测 |
| 3.3.4 FgCD59样蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3.5 FgCD59样蛋白三级结构预测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 大片吸虫两种CD59样蛋白的体外重组表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 试剂的配制 |
| 4.1.4 FgCD59样蛋白质编码区扩增引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 大片吸虫成虫总RNA的提取 |
| 4.2.2 目的蛋白序列反转录扩增和PCR扩增 |
| 4.2.3 PCR产物纯化和测序 |
| 4.2.4 FgCD59样蛋白质编码区序列的克隆 |
| 4.2.5 阳性克隆的鉴定 |
| 4.2.6 表达载体的构建及鉴定 |
| 4.2.7 重组蛋白的表达与诱导表达条件的检测和优化 |
| 4.2.8 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.9 Western blot检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 目的序列的扩增 |
| 4.3.2 构建载体鉴定 |
| 4.3.3 表达载体的构建及鉴定 |
| 4.3.4 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.3 流行情况 |
| 1.1.4 防控 |
| 1.2 大片形吸虫病诊断的研究进展 |
| 1.2.1 经典方法 |
| 1.2.2 免疫诊断方法 |
| 1.2.3 吸虫抗原的检测 |
| 1.2.4 分子生物学方法 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 大片吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 3.1.1 大片形吸虫形态学鉴定结果 |
| 3.1.2 大片形吸虫ITS |
| 3.1.3 大片形吸虫ITS |
| 3.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 3.2.1 大片形吸虫ES抗原免疫家兔后制备多抗的间接ELISA结果 |
| 3.2.2 免疫共沉淀SDS |
| 3.2.3 质谱数据分析 |
| 3.3 大片形吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 3.3.1 大片形吸虫FgAT和FgLAP基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 FgAT和FgLAP的理化特性、结构功能域和三级结构预测 |
| 3.3.3 重组质粒pGEX-6P-1(+)-FgAT和pET-30a-FgLAP的双酶切结果 |
| 3.3.4 重组蛋白的诱导表达结果 |
| 3.3.5 重组蛋白pGEX-6P-1(+)-FgAT和pET-30a-FgLAP的纯化结果 |
| 3.3.6 目的蛋白的Western Blot分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 4.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 4.3 大片形吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及临床血清学调查（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 引言 |
| 1.1 病毒的生物学特性 |
| 1.1.1 形态特征 |
| 1.1.2 病毒的生物多样性 |
| 1.2 BVDV 基因组结构和功能 |
| 1.2.1 BVDV 的5’-UTR 和3’-UTR |
| 1.2.2 BVDV 的大开放阅读框架 |
| 1.3 牛病毒性腹-泻黏膜病的类型与临床诊断 |
| 1.3.1 急性感染 |
| 1.3.2 先天性感染 |
| 1.3.3 持续型感染 |
| 1.3.4 黏膜病 |
| 1.4 牛病毒性腹泻病原学检测方法进展 |
| 1.4.1 病毒分离 |
| 1.4.2 酶联免疫吸附试验检测病毒 |
| 1.4.3 免疫组织化学 |
| 1.4.4 免疫过氧化物酶（IP）技术 |
| 1.4.5 电镜检查 |
| 1.4.6 反转录-多聚酶链式反应（RT–PCR） |
| 1.4.7 核酸杂交试验（NAH）技术 |
| 1.5 牛病毒性腹泻病血清学检测方法进展 |
| 1.5.1 病毒中和试验 |
| 1.5.2 酶联免疫吸附试验 |
| 1.6 牛病毒性腹泻-黏膜病在我国的流行状况 |
| 1.7 牛病毒性腹泻-黏膜病在我国的防制状况 |
| 1.8 研究的目的与意义 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 标准血清及血清样本 |
| 2.1.4 常用生物学试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白 NS3 分节段原核表达载体构建 |
| 2.2.2 NS3a、NS3b 和 NS3c 蛋白的原核表达和鉴定 |
| 2.2.3 NS3a、NS3b 和 NS3c 基因片段表达产物的 Western Blot 分析 |
| 2.2.4 NS3b 基因片段原核表达蛋白的纯化 |
| 2.2.5 牛BVDV 抗体间接ELISA 检测方法的标准化 |
| 2.2.6 BVDV 抗体间接ELISA 特异性试验 |
| 2.2.7 BVDV 抗体间接ELISA 重复性试验 |
| 2.2.8 BVDV 抗体间接ELISA 与血清中和试验结果的对比 |
| 2.2.9 BVDV 抗体间接ELISA 与同类商品化试剂盒的对比 |
| 2.2.10 黑龙江省部分奶牛场牛病毒性腹泻病毒感染血清学调查 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 BVDV NS3a、NS3b 和 NS3c 基因片段重组表达载体的鉴定 |
| 3.1.1 重组质粒pET-30a-BVDV-NS3a 的鉴定 |
| 3.1.2 重组质粒 pET-30a- BVDV-NS3b 的鉴定 |
| 3.1.3 重组质粒pET-30a-BVDV-NS3c 的鉴定 |
| 3.2 BVDV NS3a、NS3b 和NS3c 基因片段在大肠杆菌中的表达 |
| 3.2.1 重组质粒pET-30a-BVDV-NS3a 在E.coli 内表达的SDS-PAGE 检测 |
| 3.2.2 重组质粒 pET-30a-BVDV-NS3b 在 E.coli 内表达的 SDS-PAGE 检测 |
| 3.2.3 重组质粒pET-30a-BVDV-NS3c 在E.coli 内表达的SDS-PAGE 检测 |
| 3.3 表达蛋白的Western-blotting 分析 |
| 3.4 NS3b 基因片段原核表达蛋白的可溶性分析 |
| 3.5 NS3b 基因片段表达产物的纯化分析 |
| 3.6 牛BVDV 抗体间接ELISA 方法的建立 |
| 3.6.1 抗原和被检血清最佳稀释度的测定 |
| 3.6.2 包被缓冲液的选择 |
| 3.6.3 最佳封闭液的选择 |
| 3.6.4 最佳酶标抗体工作浓度的选择 |
| 3.6.5 最佳被检血清和酶标抗体作用时间的选择 |
| 3.6.6 最佳显色时间的确定 |
| 3.6.7 最佳终止条件的选择 |
| 3.6.8 BVDV 间接ELISA 临界值的确定及阳性结果的判定 |
| 3.7 BVDV 抗体间接ELISA 特异性检测 |
| 3.8 BVDV 抗体间接ELISA 重复性试验 |
| 3.9 BVDV 抗体间接ELISA 与血清中和试验结果的对比 |
| 3.10 BVDV 抗体间接ELISA 与同类商品化试剂盒的对比 |
| 3.11 黑龙江省部分奶牛场牛病毒性腹泻病毒感染血清学调查 |
| 3.11.1 4 个奶牛养殖场2006 年~2008 年BVDV 感染情况 |
| 3.11.2 各奶牛养殖场BVDV 感染态势 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 NS3 蛋白的原核表达 |
| 4.2 BVDV 抗体间接ELISA 检测方法反应条件的优化及性能探讨 |
| 4.2.1 ELISA 反应条件的选择 |
| 4.2.2 BVDV 抗体间接ELISA 检测方法性能的探讨 |
| 4.3 黑龙江省部分奶牛场BVDV 感染情况 |
| 5. 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（7）重组抗原诊断家畜日本血吸虫病的比较分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫病 |
| 1.2 日本血吸虫病 |
| 1.3 日本血吸虫病诊断研究进展 |
| 1.4 基因重组抗原作为血吸虫病诊断抗原的研究进展与应用前景 |
| 第二章 不同基因重组抗原检测兔和牛日本血吸虫病的敏感性和特异性比较分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 吡喹酮治疗前后感染日本血吸虫兔特异性抗体消长分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 血吸虫病早期诊断抗原与技术的初步研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）大片吸虫cDNA文库的构建及组织蛋白酶L1基因的克隆和表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要缩写符号表 |
| 前言 |
| 1.1 片形吸虫病的概述 |
| 1.2 关于片形吸虫病的研究展望 |
| 1.3 cDNA 文库在寄生虫研究中的应用 |
| 1.4 半胱氨酸蛋白酶的研究进展 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 第一章 大片吸虫成虫 cDNA 文库的构建 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要工具酶 |
| 1.1.5 主要溶液的配制 |
| 1.1.6 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 总RNA 的提取 |
| 1.2.2 双链cDNA 鉴定结果 |
| 1.2.3 酶切后双链cDNA 的过柱 |
| 1.2.4 PCR 鉴定文库中所插入片段的 cDNA 长度 |
| 1.2.5 文库全长性检测 |
| 第二章 大片吸虫组织蛋白酶 L1 基因在大肠杆菌中的表达及重组 蛋白分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 血清来源 |
| 2.1.3 主要试剂及酶类 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 重组菌的诱导和纯化 |
| 2.2.3 用自然感染大片吸虫的阳性血清进行Western-blotting 检测 |
| 2.2.4 间接酶联免疫吸附实验（ELISA）方法的研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 FgCL1 基因的扩增 |
| 2.3.2 重组质粒 pMD18-CL1 和 pGEX-CL1 的双酶切鉴定 |
| 2.3.3 信号肽预测 |
| 2.3.4 序列比对 |
| 2.3.5 重组菌pGEX-CL1/BL21 的诱导表达和纯化 |
| 2.3.6 Western-blotting 检测 |
| 2.3.7 ELISA 诊断方法的研究 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 关于cDNA 文库构建 |
| 3.2 关于组织蛋白酶L1 全长基因的克隆和表达 |
| 3.3 间接ELISA 方法的敏感性和特异性 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）片形吸虫囊蚴培养及感染家兔后特异性抗体的动力学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 片形吸虫病的免疫学研究进展 |
| 实验研究 |
| 之一 大片吸虫囊蚴培养的研究 |
| 之二 家兔实验感染片形吸虫后特异性抗体的动力学研究 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文和所获的奖励 |
四、用亲和层析法提取大片吸虫谷胱甘肽转移酶（论文参考文献）
- [1]黄酒酵母β-苯乙醇合成途径中关键酶的催化特性解析[D]. 杨琪琳. 江南大学, 2021
- [2]片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立[D]. 龚静芝. 扬州大学, 2021
- [3]肝片形吸虫不同发育阶段虫体的蛋白质组学比较分析及胶体金试纸条研制[D]. 吴丽佳. 东北农业大学, 2020(04)
- [4]大片吸虫两种CD59样蛋白的生物信息分析及体外重组表达[D]. 李雪. 广西大学, 2018(12)
- [5]大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析[D]. 岳东梅. 黑龙江八一农垦大学, 2017(08)
- [6]牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及临床血清学调查[D]. 魏伟. 东北农业大学, 2009(03)
- [7]重组抗原诊断家畜日本血吸虫病的比较分析[D]. 周伟芳. 中国农业科学院, 2008(10)
- [8]大片吸虫cDNA文库的构建及组织蛋白酶L1基因的克隆和表达[D]. 郭敏. 新疆农业大学, 2007(02)
- [9]片形吸虫囊蚴培养及感染家兔后特异性抗体的动力学研究[D]. 马丽. 广西大学, 2002(02)
- [10]抗大片吸虫ES抗原单克隆抗体的制备及特异性鉴定[J]. 沈涛,沈永林,何国声,徐梅倩,顾越星. 南京农业大学学报, 2001(03)