一、衣藻肌动蛋白基因的克隆及核苷酸序列分析（论文文献综述）
宋亚楠[1]（2021）在《亚麻荠WRKY转录因子家族的鉴定及其介导盐胁迫响应的功能研究》文中研究表明特色油料作物亚麻荠（Camelina sativa）不仅种子富含ɑ-亚麻酸（18:ω3）,是制备高端功能性油脂产品的优质资源,而且具有生育期短（80-100天）、水肥消耗低、病虫草害少和易于简化栽培等优良农艺性状,是发展低耗高效可持续农业生产体系的一个理想作物。特别是,与油菜和大豆等作物相比,亚麻荠抵御低温、干旱和盐胁迫等逆境能力强,是挖掘优异抗逆性基因资源的突特种质。植物特有的WRKY转录因子蛋白家族,参与植物生长发育以及抗逆反应等多种生命活动。然而,有关亚麻荠抗逆性机制以及WRKY转录因子种类、进化及功能还鲜见报道。本文聚焦于鉴定介导亚麻荠抗盐胁迫机制WRKY转录因子等关键基因。以亚麻荠品种SC-N1为试材,系统检测亚麻荠盐胁迫响应表征;应用RNA-seq进行亚麻荠盐胁迫响应的转录组学分析,筛选参与亚麻荠盐胁迫响应的转录因子;全基因组鉴定亚麻荠WRKY家族成员和表达谱,解析WRKY家族系统进化和功能变异,确定介导亚麻荠盐胁迫抗性的候选WRKY转录因子;应用单细胞光自养模式植物莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的遗传转化体系检测候选的亚麻荠盐胁迫响应CsWRKY的功能;培育目标CsWRKY过表达以及CRISPR-Cas9敲除的亚麻荠转基因株系,分析转基因株系生理生化表型,鉴定介导亚麻荠盐胁迫响应的CsWRKY及其生物学功能。本研究将为挖掘亚麻荠耐盐的相关基因、解析亚麻荠响应盐胁迫的分子调控机制提供科学依据。主要研究结果如下:1.亚麻荠幼苗盐胁迫响应的表征于水培条件下,选取6片真叶幼苗进行盐胁迫处理,检测幼苗形态和生理生化相关参数。与对照（1/2 Hoagland营养液）相比,盐胁迫3 d的幼苗发生叶片萎蔫和生长减缓等受害症状,且呈现剂量效应。三个不同剂量（100、150和200 m M）Na Cl处理的亚麻荠幼苗株高分别降低了25.26%、37.59%和44.58%,地上部鲜重分别降低了3.22%、13.44%和21.51%,地下部鲜重分别降低了41.18%、47.06%和50.0%,叶绿素a（Chla）含量分别降低了10.29%、27.94%和32.35%,叶绿素b（Chlb）含量分别降低了28.26%、52.17%和56.52%。盐胁迫导致幼苗叶绿素荧光参数（Fm、Fv/Fm、Y（II）、q P和ETR）及光合作用减低。相反,盐胁迫（200 m M）处理的幼苗抗渗物质显着增加,类胡萝卜素、脯氨酸、可溶性糖含量分别比对照提高了40.0%、10.6倍和47.0%。SOD（超氧化物歧化酶）和POD（过氧化物酶）活性和T-AOC（总抗氧化能力）比对照提高了51.86%、156.89%和50.18%。此外,盐胁迫幼苗的过氧化氢酶（CAT）活性高于对照约4倍。显然,亚麻荠能通过提高抗渗物质合成积累和增强抗氧化酶活及清除活性氧（ROS）能力而抵御盐胁迫。2.亚麻荠幼苗转录组分析与盐胁迫响应的转录因子筛选为发掘亚麻荠的耐盐基因和揭示盐胁迫应答调控机制,利用RNA-Seq技术对175 m M Na Cl胁迫处理1 d的亚麻荠幼苗及其对照材料进行转录组分析。结果显示,共获得亚麻荠转录组数据42.47Gb,组装得到功能注释的99402条Unigenes和5902个差异表达基因（DEG）（2917个上调和2985个下调）。GO富集分析发现,较多数量的DEGs主要集中在分子功能（33.60%）、细胞组分（13.60%）和生物过程中（52.79%）。KEGG途径分析将1442个DEGs注释到44条代谢通路,其中,上调DEGs显着富集到抗坏血酸和醛酸代谢、精氨酸脯氨酸代谢,氧化磷酸化以及苯丙烷类合成途径,下调DEGs主要参与光合作用。进一步对差异表达基因综合分析,筛选到较重要的转录因子家族,包括WRKY、MYB、b HLH、AP2/ERF和b ZIP等。其中,WRKY转录因子基因上调表达数目多、水平高,预示着WRKY转录因子在亚麻荠幼苗盐胁迫应答过程中发挥更加重要的作用。3.亚麻荠CsWRKY转录因子全基因组鉴定及系统进化分析应用组学分析工具从亚麻荠基因组共鉴定到242个CsWRKY蛋白成员,由不均匀分布在20条染色体的224个CsWRKY基因编码,其中15个CsWRKY基因产生33个WRKY可变剪接体。依据WRKY和锌指基序,CsWRKY家族成员分为3大类（I、II和III）,其中第II大类含有149个WRKYs,又分为5个亚类（IIa、IIb、IIc、IId和IIe）。CsWRKY蛋白含有的10个保守基序,其中特有的WRKYGQK七肽最为保守。然而,多个IIc亚类的CsWRKYs检测到WRKYGXK、WRKYGKK和WRKYGEK等变异。这些变异可能导致CsWRKY蛋白功能多样化。CsWRKY基因家族进化经历了较强的纯化选择（purifying selection）,未发现随机重复（tandem duplication）,但发生了137个片段重复事件（segmental duplication event）,构成亚麻荠CsWRKY基因家族扩张和功能变异的关键进化驱动力。此外,分别检测到166和173个CsWRKY基因对应于65个At WRKY和111个Br WRKY（Brassica rapa）直向同源基因,预示着亚麻荠WRKY基因家族扩张可能发生在拟南芥与油菜分离之后。4.亚麻荠CsWRKY基因时空表达谱分析与介导盐胁迫应答的CsWRKY筛选应用亚麻荠根、茎、叶、花和种子等12个不同组织器官的转录组数据,分析CsWRKY基因表达谱显示,54%CsWRKY基因至少在一种组织器官表达,在根、茎、成熟叶、花和发育早期种子表达的基因分别占89.11%、80.69%、78.71%、88.61%和76.73%。70个CsWRKYs在12个组织器官均表达,其中高表达基因24个。许多CsWRKY基因具有组织特异性表达模式,例如,在两个组织/器官表达的,CsWRKY25和34在花序和发育晚期种子,CsWRKY174在萌发种子和根,CsWRKY73和203在花和成熟叶。仅在一个组织/器官表达的有,根组织的CsWRKY111、208和226,花组织的CsWRKY182和202,以及早期发育种子的CsWRKY204。这些结果表明CsWRKY在亚麻荠组织/器官发育过程中起重要作用,其中一部分CsWRKYs可能参与调控细胞基础生命活动,而另一部分CsWRKYs则在不同组织/器官行使差异化调控功能。应用盐胁迫亚麻荠幼苗转录组数据和实时荧光定量PCR检测相关CsWRKY基因的表达谱,筛选出CsWRKY8、9、10、43、48、49、50、162和242共9个基因为重要的介导盐胁迫应答CsWRKYs。盐胁迫幼苗地上组织中,这9个基因均上调表达,其中CsWRKY9、CsWRKY43和CsWRKY162表达水平高于对照组织的5倍以上。在盐胁迫根组织中,CsWRKY9、43和162亦上调表达,表达量高于对照组织6倍多。然而,CsWRKY8和10则显着下调表达（p<0.05）,其他4个CsWRKYs表达量上调未达显着水平（p<0.05）。5.应用莱茵衣藻遗传转化体系鉴定亚麻荠CsWRKY9、43和162基因的功能对低等植物和高等植物WRKY转录因子家族分析发现,单细胞光自养模式植物莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的基因组仅有1个WRKY基因。应用莱茵衣藻过表达异源WRKY基因研究其功能,能有效排除宿主内源多个WRKY基因的干扰。同时,我们获得了莱茵衣藻WRKY突变体LMJ605及其野生型株系CC5325。这为鉴定本文筛选到的亚麻荠盐胁迫响应的候选CsWRKY功能提供了独特的测试宿主种质。从上文9个候选CsWRKYs中选择最重要的CsWRKY9、43和162为目的基因,将其分别克隆入适于在莱茵衣藻细胞表达的p HR13载体多克隆位点,构建过表达载体p HR13-CsWRKY9,p HR13-CsWRKY43和p HR13-CsWRKY162。采用玻璃珠法将表达载体分别导入易遗传转化的莱茵衣藻藻株CC849,经过分子检测获得目的基因稳定有效表达的转基因莱茵衣藻株系。检测未转化的对照藻株（CC849）和转基因藻株在正常培养条件和盐胁迫下的生长表型,结果发现,正常培养条件下,转基因藻株生物量和光合作用等性状略高于对照藻株,但未达显着水平（p<0.05）。在150 m M Na Cl盐胁迫条件下培养4 d后,对照藻株CC849以及转化株CsWRKY9、43和162的生物量比正常培养条件的生物量分别降低了33.57%、25.85%、14.47%和8.63%。在175 m M Na Cl盐胁迫条件下培养4 d后,对照藻株CC849以及转化株CsWRKY9、43和162的生物量比正常培养条件的生物量分别降低了59.40%、27.22%、18.79%和16.31%。检测叶绿素含量及叶绿素荧光参数显示,盐胁迫抑制藻细胞光合作用,但转基因藻株受害程度显着低于对照CC849（p<0.05）。进一步比较藻株CC849、藻株CC5325及其WRKY突变体LMJ605和转化藻株CsWRKY162在正常培养条件和盐胁迫下的表型显示,莱茵衣藻内源WRKY基因的功能缺失（LMJ605）未明显抑制正常培养条件下藻细胞的生长和光合作用。然而,在盐胁迫条件下,突变株LMJ605生长严重受阻。在150 m M Na Cl盐胁迫条件下培养,对照藻株CC849、CC5325、LMJ605和转化藻株CsWRKY162的生物量与正常条件下相比,分别减少了33.26%、10.50%、58.04%和11.54%。在175 m M Na Cl盐胁迫条件下培养,藻株CC849、CC5325、LMJ605和转化藻株CsWRKY162的生物量分别比正常培养降低了56.69%、25.68%、67.54%和17.21%。当盐浓度达到200 m M Na Cl时,藻株CC849、CC5325、LMJ605和CsWRKY162随着培养时间延长,藻细胞生长严重阻滞直至完全死亡,其中LMJ605受害最重,转化藻株CsWRKY162则受害相对轻,存活期比对照株（CC849）延长2倍多。这些莱茵衣藻遗传转化试验结果表明,CsWRKY9、CsWRKY43和CsWRKY162均能显着提高宿主细胞的抗/耐盐性,其中CsWRKY162功效最强。6.亚麻荠CsWRKY162过表达及CRISPR/Cas9敲除突变体的构建和表型分析选择CsWRKY162分别构建其过表达和CRISPR/Cas9敲除的亚麻荠突变体,深入解析CsWRKY162介导亚麻荠盐胁迫应答机制。成功构建CsWRKY162基因过表达载体p CAMBIA1303-CsWRKY162以及敲除载体CRISPR-CsWRKY162＿ta/b和CRISPR-CsWRKY162＿tc/d。应用农杆菌介导的浸花法将构建的载体分别导入亚麻荠,获得T0代种子,经筛选和鉴定,获得纯合CsWRKY162转基因植株,以及CsWRKY162基因敲除植株（含敲除载体CRISPR-CsWRKY162＿ta/b）,CsWRKY162基因序列发生了碱基缺失和替换。转基因植株表型分析显示,正常生长条件下,CsWRKY162过表达植株生长发育与对照植株差异不明显。在175 m M Na Cl盐胁迫条件下,对照植株生长受抑制,CsWRKY162过表达植株株高和单株鲜重分别是对照株1.5倍和1.3倍多。CsWRKY162过表达植株未显受害症状。在正常条件下,CsWRKY162基因敲除植株生物量等性状与对照株相比没有明显变化。在175 m M Na Cl盐胁迫条件下,CsWRKY162基因敲除植株矮小,其受害症状显着大于对照植株,其中,株高比对照植株降低了20%左右,单株鲜重比对照植株降低了40%左右。在亚麻荠响应盐胁迫过程中,胁迫相关基因NHX2、HKT和NCED3在CsWRKY162过表达株系和敲除株系中的表达分别上调和下调。亚麻荠遗传转化试验再次证明CsWRKY162是介导亚麻荠盐胁迫应答的一个极为重要的转录因子。有关这些亚麻荠转化体的转录组测序以及相关分析正在进行中,以期进一步阐明CsWRKY162介导的亚麻荠盐胁迫抗性表达机制和调控网络。综上所述,本文论述了亚麻荠盐胁迫响应的表征,全基因组系统鉴定了亚麻荠WRKY转录因子及其表达谱,揭示了CsWRKY家族成员的进化特征。筛选到9个介导亚麻荠盐胁迫响应的CsWRKY转录因子。应用独特的单细胞模式植物莱茵衣藻遗传转化体系评价了CsWRKY9、CsWRKY43和CsWRKY162的功能,成功构建了亚麻荠CsWRKY162过表达和敲除突变体,论证了CsWRKY162是正调控亚麻荠盐胁迫抗/耐性机制的一个重要转录因子。本文为全面解析各CsWRKY家族成员的功能以及抵御盐胁迫等逆境的分子机制和培育抗逆性优良的品种提供了新知识,靶标基因及相关研究基础。
张欣[2]（2020）在《南极衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L隐花色素基因克隆及表达调控研究》文中进行了进一步梳理光对生物体光合作用和生长发育具有重要作用,藻类的生长和发育与光有密切关系。隐花色素（cryptochrome,CRY）是一种接收蓝光（440～460 nm）与近紫外光UVA（320～400 nm）的光受体,属于隐花色素/光修复酶家族,参与了动物、植物乃至微生物中的光反应及生物钟的调控。目前对隐花色素的研究主要集中在陆生植物,对植物隐花色素结构、生物学功能、光激发及信号转导调控机制研究方面取得长足进展,但对海洋微藻隐花色素研究较少,尤其尚未见极地海洋微藻隐花色素的相关研究。南极衣藻长期在低温、高盐、季节性光照和强紫外辐射等海冰环境中生长和繁殖,对低温、高盐等逆境具有很强的适应能力。本文率先开展南极衣藻隐花色素研究,不仅有助于了解南极衣藻隐花色素的功能和作用机理,阐释海洋藻类光调节过程,还可为研究极地藻类对极端环境的适应性奠定基础。目的:本研究主要开展南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L隐花色素基因克隆及表达调控研究,明确C.sp.ICE-L隐花色素蓝光信号的响应及其在调节节律性光过程中的作用,探讨南极衣藻隐花色素受光诱导的调控功能,探索南极衣藻生物钟的调控机制,为进一步探讨南极冰藻环境适应的分子机理奠定理论基础。方法:1.根据南极衣藻C.sp.ICE-L转录组测序结果,通过分子生物学技术克隆隐花色素基因CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1,并进行生物信息学分析。2.选取温度、盐度、光质、光周期、紫外条件对南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因进行实时荧光定量PCR分析,检测其转录调控水平。3.构建南极衣藻隐花色素基因CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1原核表达体系。4.通过Water-PAM测定南极衣藻在不同条件（紫外UVA和UVB、不同光质和光周期）的叶绿素荧光参数,分析细胞的最大光化学效率（Fv/Fm）和非光化学猝灭（NPQ）。结果:1.克隆获得南极衣藻隐花色素基因Ci CRY-DASH1和CiPlant-CRY1全长,并进行初步生物信息学分析。CiCRY-DASH1有1836个碱基对,编码608个氨基酸,其蛋白分子量为67.35 kDa;CiPlant-CRY1有1452个碱基,编码483个氨基酸,其蛋白分子量为52.32 kDa。系统发育树分析表明CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1与莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii以及绿藻属C.subellipsoidea C-169的进化关系最近。2.完成了南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因的实时荧光定量PCR分析。研究结果表明,CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因在低温处理与最适温度下转录变化都有一定的趋势,即具有温度补偿性,进一步证实其为生物钟的关键组分。CiCRY-DASH1和Ci Plant-CRY1基因在最适盐度32‰时的表达量最高,且呈现一定的规律性。CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因在不同光质（白光、蓝光、绿光、黄光和红光）下的表达量可以发现,它能有效地响应各种不同光质的处理,特别是蓝光、黄光和红光,表明它可能参与了蓝光、黄光甚至是红光下的光信号转导途径。CiCRY-DASH1和Ci Plant-CRY1基因的表达能响应极昼和极夜处理,且响应能力强,并表现出一定的昼夜节律性。在紫外胁迫条件下,CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因对UVB和紫光敏感。3.构建了南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因的原核表达体系。成功构建原核表达载体pEASY?-Blunt E2-Ci CRY-DASH1和pEASY?-Blunt E2-CiPlant-CRY1,并将其转化到Transetta（DE3）表达感受态细胞中,在IPTG（isoproptl-β-D-thiogalactoside）作用下低温16℃诱导12 h。经SDS-PAGE电泳分析得到与预测蛋白分子量相同的目标蛋白CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1,表达后的目的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。4.完成了南极衣藻叶绿素荧光特征分析。研究发现UVB、蓝光和极昼条件是可能影响极地环境中藻类的生理和代谢的胁迫条件;在UVB、蓝光和极昼条件下,南极衣藻C.sp.ICE-L的最大光化学效率Fv/Fm随着胁迫时间的增加而逐渐下降,但非光化学猝灭NPQ却逐渐升高,这说明在UVB、蓝光和极昼条件下南极衣藻的PSⅡ反应中心发生了光抑制。结论:本研究克隆获得南极衣藻C.sp.ICE-L隐花色素基因CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1,并进行初步生物信息学分析。通过在不同胁迫条件下探究南极衣藻C.sp.ICE-L隐花色素基因的表达模式,发现CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1为生物钟的关键组分;参与了蓝光、黄光甚至是红光下的光信号转导途径;能响应极昼和极夜处理,且响应能力强,并表现出一定的昼夜节律性。通过进行原核表达,为后续隐花色素基因的功能表征提供了基础。叶绿素荧光分析发现UVB、蓝光和极昼条件是可能影响极地环境中藻类的生理和代谢的胁迫条件。
李红娇[3]（2020）在《小球藻病毒启动子在莱茵衣藻中的转录活性分析》文中指出小球藻病毒来源的启动子具有在原核生物与真核生物都能启动基因转录的特点,本实验利用来自小球藻病毒且在大肠杆菌中具有强调控活性的启动子序列来构建莱茵衣藻转化载体。将博莱霉素抗性基因sh ble与绿色荧光蛋白基因gfp融合成的ble-gfp筛选标记-报告基因融合基因置于小球藻病毒启动子控制下,同时构建无启动子和由内源rbcS2启动子控制的正负对照转化载体。上述转化载体经电击导入胞壁缺陷型莱茵衣藻藻株Chlamydomonas reinhardtii cc503后分别用7.5μg/mL和4μg/mL博莱霉素进行平板和液体筛选,得到一系列sh ble抗性藻落;而无启动子的对照转化载体没得到任何抗性藻落。经PCR扩增发现小球藻病毒来源的N63、N80、N99、N35启动子控制下的ble-gfp融合基因插入了sh ble抗性藻细胞基因组。用qRT-PCR方法检测了病毒启动子和rbcS2启动子控制的sh ble转录文本丰度,结果表明小球藻病毒启动子和rbcS2启动子一样在莱茵衣藻中具有正常的启动活性。将上述筛选到的启动活性较强的启动子来构建含有gpd1基因的重组质粒,同样用电击转化法转化进莱茵衣藻细胞中,用PCR技术检测插入到莱茵衣藻基因组中的片段,并用尼罗红染色法检测含gpd1基因的莱茵衣藻转化株,结果表明莱茵衣藻转化株的油脂含量确实有所提升,具体实验结果如下所示:1.用小球藻病毒来源的启动子构建pBR11-N35、pBR11-N63、pBR11-N80、pBR11-N83、pBR11-N96和pBR11-N99质粒,构建正、负对照质粒pGO24、pGO25。将这些构建好的质粒用电击转化法转进莱茵衣藻细胞中,用7.5μg/mL的博来霉素抗性筛选阳性藻株,结果发现pBR11-N35、pBR11-N63、pBR11-N80和pBR11-N99这四种转化株均能在有博来霉素抗性的平板上生长。2.通过PCR检测,我们发现在小球藻病毒来源启动子N35、N63、N80、N99控制下的sh ble抗性选择标记基因,GFP报告基因均插入到了莱茵衣藻的基因组里,通过qRT-PCR方法检测病毒启动子和rbcS2启动子控制的sh ble转录文本丰度,发现了N63和N35启动子相对于rbcS2相比,其mRNA的表达量均上调,其中N63的活性最强可以达到rbcS2启动子的1.78倍。说明小球藻病毒启动子和rbcS2启动子一样在莱茵衣藻中具有正常启动活性。3.用N63启动子构建含有gpd1基因的质粒,通过电击转化法转化进莱茵衣藻细胞中,用7.5μg/mL的博来霉素抗性筛选阳性藻株,发现pB-N63-GPD1和pB-RBCS2-GPD1转化株均能在博来霉素抗性的培养基中生长。4.提取转化藻株的基因组,进行PCR检测,pB-N63-GPD1和pB-RBCS2-GPD1转化株均能扩增出目的基因。5.将尼罗红染色法进行优化,发现莱茵衣藻细胞在尼罗红-丙酮的终浓度为0.3mg/mL,室温下避光染色20 min的条件下油脂滴较为清晰。6.通过尼罗红染色法和多功能酶标仪检测发现莱茵衣藻转化株的油脂含量显着高于野生型藻株CC503（p<0.05）,转化藻株的含量比野生型提高了1.23倍。
孙婷[4]（2020）在《基于生物信息学结合荧光技术研究衣藻Dicer-like蛋白在microRNA生成过程的功能》文中提出荧光技术包括荧光光谱、激光共聚焦显微镜技术、荧光定量PCR、和荧光各向异性等,其广泛应用于生物化学及分子生物学研究中,是研究生物大分子的结构和功能,以及分子间相互作用的重要手段之一。microRNA（miRNA）是一类长约20-24 nt的非编码小分子RNA,于转录后水平上负调控靶mRNA从而影响基因的表达,对生物的生长、发育、分化等生命活动起重要调控作用。在动植物中,miRNA的生物合成途径已被广泛研究,miRNA的形成过程较为清晰。其中Dicer/Dicer-like（DCL）蛋白作为核糖核酸酶III家族的成员,在小RNA生物合成途径中起关键作用。莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）属单细胞真核微藻,是研究鞭毛的组装和运动、光合作用以及多种代谢途径的模式生物,具有“光合酵母”之称。莱茵衣藻miRNA相关研究起步较晚,研究表明莱茵衣藻DCL3蛋白参与miRNA的生成,但DCL蛋白在衣藻miRNA生物合成中的作用机制尚不清楚。同时,短串联靶向模型（STTM）技术近年被广泛用于动植物细胞中,可特异性抑制目标miRNA的表达,但STTM能否调控单细胞生物莱茵衣藻miRNA的表达尚不清楚。本文通过生物信息学与荧光技术相结合的方法,研究了莱茵衣藻DCL蛋白在细胞内的分布及其结构域与双链RNA（dsRNA）结合特征;通过小RNA组学结合荧光定量PCR技术,发现衣藻DCL1蛋白参与miRNA的生物合成;利用基因编辑与荧光定量PCR技术,测试了STTM结构对衣藻miRNA表达的作用效果。具体研究结果如下:（1）对多个物种的Dicer同源蛋白进行同源分析及结构域预测,结果表明莱茵衣藻DCL蛋白与红酵母（Rhodotorula toruloides）Dicer蛋白同源度最高,均不含有与dsRNA结合的关键结构域:PAZ和dsRNA结合结构域。初步揭示了在Dicer蛋白进化过程中PAZ和dsRNA结合结构域从无到有的过程。（2）通过激光共聚焦显微镜技术,对衣藻DCL1和DCL3蛋白的5’端序列进行亚细胞定位分析,结果表明2个DCL蛋白主要分布于细胞核,少量分布于细胞质。由此推测:衣藻DCL蛋白主要是在细胞核内对miRNA前体进行剪切加工。（3）对衣藻DCL蛋白的DUF283结构域与pre-miR1162 dsRNA进行多个光谱学实验及等温滴定量热技术检测,结果表明DUF283结构域与pre-miR1162通过疏水作用力相互结合,该过程使DUF283结构域的色氨酸残基暴露于疏水环境中,蛋白肽键发生π→π*电子跃迁,蛋白更多的二级结构转为α-螺旋结构,且该结合过程为吸热反应。（4）通过生物信息学分析,发现衣藻DCL1-3的互作蛋白,及衣藻DCL1与PSRP-1、PRPS16、ABH1、CPL4和MRPS6蛋白的结合位置。（5）通过对照组CC-5325和dcl1突变株进行小RNA组学测序与分析,获得85个已报导的miRNAs（cre-miRNAs）,7个高度保守的miRNAs和822个新预测的miRNAs（novel-miRNAs）,并对miRBase数据库中的19个miRNAs进行校正。比对dcl1突变株和对照组CC-5325的miRNAs表达水平,发现105个表达显着上调的miRNAs和28个显着下调的miRNAs。（6）利用荧光定量PCR技术检测组学数据中12个显着下调miRNAs在CC-5325、dcl1和dcl3突变株中的表达水平,结果显示在dcl1突变株中12个miRNAs均显着下调,而在dcl3突变株中有4个miRNAs显着下调。通过Northern印迹杂交对cre-miR910、novel-miR0128-5p和novel-miR0537-3p的表达水平进行检测,结果显示3个miRNA在dcl1和dcl3突变株中显着下调。上述结果表明DCL1和DCL3均参与miRNA的生物合成,并揭示了衣藻部分miRNA的生物合成途径不同于动植物,其可能由多种DCL蛋白共同参与。（7）对组学数据中28个显着下调的miRNAs进行靶基因预测及靶基因功能分析,获得5个参与脂肪酸代谢途径的miRNAs。对对照组CC-5325、dcl1和dcl3突变株进行油脂含量检测,结果表明dcl1和dcl3突变株的各油脂含量较对照组无显着差异,仅有硬脂肪酸甲酯存在从无到有的变化。初步推测DCL1相关的5个miRNA参与脂肪酸代谢途径,但该miRNA在衣藻中的调控较为微弱,对脂肪酸含量无显着影响。（8）分别构建3个以衣藻miRNA(（miR906-5p、miR1166.1和miR1150.3）为靶标的STTMs转基因藻株,并通过荧光定量PCR技术检测转基因藻株miRNA表达水平,结果显示3种STTM转化子的靶miRNA均显着下调,其中对miR1150.3、miR906-5p和miR1166.1的抑制率分别为84%、79%和73%。值得注意的是,在3种STTM转化子中,多个非靶miRNA的表达水平也显着下降,表明STTM对衣藻miRNA的非特异性抑制,揭示了STTM对衣藻miRNA的作用机制不同于动植物。综上所述,莱茵衣藻DCL1和DCL3蛋白均能参与miRNA生成合成,有些miRNA的生物合成需要两种DCL蛋白共同参与。STTM对莱茵衣藻miRNA具有非特异性抑制作用。这些研究结果为进一步理解单细胞真核微藻miRNA的生物合成及作用机制打下了坚实的基础。
陈颖茜[5]（2020）在《超折叠维纳斯黄色荧光蛋白及其在莱茵衣藻中表达的研究与分析》文中研究说明荧光蛋白（fluorescent proteins,FP）是生物学研究中的一项非常重要的工具。同时,他们逐渐运用到微藻的研究中,例如莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）。几种荧光蛋白,例如mCherry,tdTomato,Venus或者CrYFP,CrGFP,mTagBFP和PtCrCFP都成功地作为报告基因用到了莱茵衣藻诱变株UVM4和UVM11的核基因组转化中。但是,目前仍然很难在野生型藻株中将FP作为报告基因来使用,原因是尽管我们可以将外源基因高效地转化并整合到莱茵衣藻核基因组中,但是外源基因的表达效率却非常低。因此本文的目的是研发一种可以在莱茵衣藻中稳定高效表达的荧光蛋白变体。这个变体是同时基于Venus和超折叠GFP（superfolder GFP）构建的,我们将它命名为sfVenus（superfolder Venus yellow fluorescent protein,超折叠维纳斯黄色荧光蛋白）。实验表明,报告基因sfVenus在莱茵衣藻细胞中的表达更高效,最高表达量约为Venus的1.5倍。另外,本实验还探究了两个以及三个串联sfVenuses在莱茵衣藻中的表达情况,实验证明,它们在莱茵衣藻中的表达仍然具有一定的难度,尤其是,2sfVenuses基因只能表达出一个sfVenus,而且荧光强度并不如基因sfVenus表达的蛋白。
周佳兰[6]（2020）在《莱茵衣藻BBSome组分蛋白BBS4的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备》文中研究说明莱茵衣藻是一种单细胞真核藻类,具有易于培养,且易于获得突变体等优点,具有两根细长的纤毛结构,因此被广泛地应用于纤毛的研究中。纤毛是一种附着在细胞表面微小的毛发状细胞器,各类研究表明,纤毛在维持生物体的生理功能中具有重要作用,能够参与调节细胞运动。纤毛在完成复杂的形成过程中需要各种转运蛋白的协调配合,如参与纤毛组装的微管蛋白被运输到远离细胞体的纤毛尖端位置的过程中,是由一种具有双向运送方式的鞭毛内转运系统（IFT）完成的,通过IFT能够有效的将组装蛋白从细胞体移动到相应的组装位点,同时还能够完成反向运输,IFT通过不断的调节二者之间的平衡,从而维持纤毛的长度。BBS4作为BBSome蛋白复合体的家族成员之一,其缺失会影响BBSome复合体的组装完整性,进而影响其功能的完整性。BBSome以一种八聚体复合物的形式存在,主要存在于纤毛的基底体,参与完成IFT的组装。任意的bbs基因发生突变,都会引起巴德-毕氏综合症（BBS）。由于目前人们对于BBS4蛋白在维持纤毛运动功能机制的认识还存在不足。因此,成功制备莱茵衣藻BBS4多克隆抗体,能够有效的帮助我们进一步研究纤毛及纤毛相关的疾病。本课题首先通过PCR获得莱茵衣藻bbs4目的基因,通过分子克隆分别构建到原核表达载体pET-28a（+）和pMAL-c2X上,转化至感受态细胞BL21（DE3）中,对BBS4蛋白进行诱导表达,从而获得重组蛋白6×His-BBS4和MBP-BBS4,蛋白大小分别为45 kDa和85 kDa,6×His-BBS4重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔,免疫合格后进行抗血清的分离,将得到的抗血清进一步做抗原抗体纯化,从而得到优良的BBS4抗体,经Western印迹法检测发现所制备的BBS4多克隆抗体能够与莱茵衣藻CC-125样品于相对分子质量约45 kDa处发生特异性结合,免疫荧光实验能够确定BBS4蛋白在纤毛中存在的位置,为研究BBS4在纤毛中的作用奠定了基础。
刘明媚[7]（2019）在《假根羽藻PSⅠ捕光天线序列测定及衣藻高光对PSⅠ光合色素影响的研究》文中研究表明假根羽藻（Bryopsis corticulans）是生长在潮间带的大型绿藻,涨潮时藻体处于以蓝绿光和绿光为主的弱光环境中,并能够完成吸能、传能和转能过程以满足自身生长的需要;落潮时,藻体又能够适应高光强的暴露环境并进行光保护。光系统I（PSⅠ）是一种高效的自然光能转换器,由于藻类生存环境和进化地位的特殊性,其光系统I捕光天线（LHCI）结构也具有物种特异性。基于对假根羽藻PSⅠ-LHCI分离纯化与表征研究,我们实验室与中科院植物所、清华大学合作开展结构研究,采用冷冻电镜技术解析了该绿藻PSⅠ-LHCI的结构,但是由于该物种尚没有基因序列信息,以及Lhca天线序列的高度相似性,造成结构解析受阻。因此本研究主要通过分子生物学方法,获取假根羽藻所有Lhca天线蛋白的序列,为假根羽藻PSⅠ-LHCI的结构解析提供序列信息,并在结构研究的基础上,研究高光下衣藻光合色素的变化及其光保护机制。主要研究结果如下:1.通过同源序列扩增与转录组测序相结合的方法,获取了假根羽藻8种Lhca捕光天线蛋白氨基酸序列。序列比对及进化分析结果显示,假根羽藻8种捕光天线蛋白氨基酸序列相似,不同物种之间的捕光天线蛋白氨基酸序列较为保守。2.通获取的8种氨基酸序列与天线蛋白的电子密度进行匹配,对假根羽藻PSⅠ-LHCI超复合物中每个Lhca进行识别,为解析假根羽藻PSⅠ-LHCI分辨率为3.49?的冷冻电镜结构提供了重要信息。3.对莱茵衣藻进行正常光及高光两种不同培养条件的处理,并通过蔗糖密度梯度离心的方法,分离制备两种不同处理条件下莱茵衣藻的类囊体膜。为了研究高光下衣藻PSⅠ-LHCI的光保护机制,我们使用β-DDM增溶类囊体膜,分离纯化了PSⅠ-LHCI复合物。4.研究了高光处理前后衣藻藻体、类囊体膜、PSⅠ-LHCI的色素组成变化,结果显示:高光处理后的莱茵衣藻藻体、类囊体膜以及分离的PSⅠ-LHCI复合物中,均检测到叶黄素循环中间产物Ant和产物Zea这两种色素组分,而未经高光处理的样品中缺少这两种组分;通过对比高光处理前后,藻体中色素的变化趋势及类囊体膜样品中的色素含量,结果表明高光条件下,样品中的紫黄质Vio向玉米黄质Zea发生了转化;通过对高光处理后3种条带复合物样品中Zea转化率的计算,条带1-LHCII复合物玉米黄质的转化率为54%,条带2的转化率为33%,而条带3-PSⅠ-LHCI复合物中也有少量玉米黄质的转化,转化率仅为13%左右。说明高光条件下,PSⅠ-LHCI复合物中产生了叶黄素循环。
安美玲[8]（2019）在《南极衣藻DNA光修复酶家族及其紫外辐射损伤协同修复机制》文中进行了进一步梳理CPD和6-4PPs是紫外辐射造成的DNA损伤产物。光修复酶就是利用光能修复紫外损伤产物CPD和6-4PPs的一类黄素蛋白。根据结合的底物不同,分为CPD光修复酶和6-4光修复酶。我们的实验材料南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L是从南极中山站附近采集分离而来。南极衣藻长期适应极其恶劣的南极环境,尤其能抵抗南极强紫外辐射,我们推测南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶能修复紫外辐射造成的藻细胞DNA损伤,保证了藻细胞DNA的完整性,光修复酶是南极衣藻适应南极强紫外辐射环境的重要物质。本文对南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶家族进行了初步探究。在我们实验室之前的实验中,已经成功的从南极衣藻C.sp.ICE-L中得到了一个CPD光修复酶并验证了其具有修复CPD的活性。在此基础上,本论文对南极衣藻C.sp.ICE-L转录组进行了检索,得到了南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶家族基因,完成了南极衣藻光修复酶家族各基因的克隆表达及生物信息学分析,重点对6-4光修复酶的活性进行了功能研究。并首次实现了南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶双质粒共表达体系的构建,探讨了南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶相互作用机制。目的:建立南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶家族基因的表达体系,进行重组蛋白的诱导表达和纯化,得到南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶的纯化蛋白,完成重组菌的诱导培养优化,进行纯化的南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶的酶活测定,将南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶表达载体转入光修复酶缺陷的大肠杆菌以检测光修复酶的菌体内活性,对6-4光修复酶进行定点突变实验,以探究C.sp.ICE-L 6-4光修复酶相关氨基酸的功能;将两种光修复酶表达载体转入同一菌株,探讨南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶体内外的相互作用机制。方法:1.利用酶联免疫吸附技术,检测紫外辐射下（UVB,波长312 nm）南极衣藻C.sp.ICE-L CPD形成和积累。2.根据已知基因片段,采用RACE-PCR方法扩增南极衣藻C.sp.ICE-L 6-4光修复酶基因全长。TA克隆光修复酶的cDNA全长。3.开展实时荧光定量PCR实验。将藻细胞暴露于不同光照条件:UVB（312nm）,蓝光（450 nm）,红光（630 nm）,黑暗。收集样品后对南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶基因的转录水平进行了检测。4.建立南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶表达体系,优化重组表达菌株的生物量和诱导蛋白浓度条件。生物量采用干重称重法,蛋白浓度采用牛血清标准曲线法测定。5.利用紫外吸收光谱技术,对得到的纯化蛋白进行酶活检测。将南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶转入光修复酶缺陷大肠杆菌,通过紫外辐射计数菌落数来计算存活率,检测南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶的体内活性。6.对南极衣藻C.sp.ICE-L的6-4光修复酶进行定点突变,以探究相关氨基酸的功能。将E193（谷氨酸Glu）突变为天冬氨酸（Asp,D）,标记为E193D;用半胱氨酸（Cys,C）替代W295（色氨酸Trp）,标记为W295C;H367（组氨酸His）突变为谷氨酰胺（Gln,Q）,标记为H367Q。构建突变表达载体,对相关菌株进行诱导表达和纯化,得到纯化的突变后的南极衣藻C.sp.ICE-L 6-4光修复酶,并检测其活性,得到突变后6-4光修复酶的酶活变化。7.构建南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶双质粒共表达体系,探究CPD光修复酶和6-4光修复酶的相互作用机制。分别构建带有不同抗生素筛选标记的南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶表达载体,将其同时转入同一株菌种,使用两种抗生素进行筛选。结果:1.南极衣藻C.sp.ICE-L能适应UV-B,但生长速度低于UV0组（无紫外线辐射）。南极衣藻C.sp.ICE-L藻细胞的生长在较强的UV-B暴露中受到了抑制。在无紫外线辐射条件下,南极衣藻C.sp.ICE-L细胞中的CPD没有积累;在UV-B辐射下,在较短时间内南极衣藻C.sp.ICE-L细胞中的CPD不断积累,说明紫外线辐射对南极衣藻C.sp.ICE-L的DNA造成了损伤。2.通过基因克隆,从南极衣藻C.sp.ICE-L中获得了光修复酶基因序列的cDNA全长,分别标记为6-4CiPhr,CiPhr1,CiPhr2,CiPhr3,完成了各光修复酶基因的生物信息学分析。3.实时荧光定量PCR结果显示:光修复酶基因6-4CiPhr能够被紫外光和蓝光诱导,并在一定时间大量积累;CiPhr2和CiPhr3在蓝光胁迫条件下表达量也升高,推测这3个蛋白可能是蓝光受体。而CiPhr1在红光下被激活。4.构建了4条光修复酶序列的表达载体,经过蛋白的诱导表达和纯化,成功的得到了南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶蛋白6-4CiPhr和CiPhr1。对重组菌株的干重和蛋白浓度进行了优化培养,得到了获得其最佳干重和蛋白浓度的培养条件。5.体内体外活性检测验证了光修复酶6-4CiPhr和CiPhr1的光修复活性,实验表明南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶6-4CiPhr具有修复6-4PPs的活性。南极衣藻C.sp.ICE-L的CiPhr1可以修复CPD。6.对南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶6-4CiPhr进行了定点突变。构建了3个突变位点的重组菌株,分别对其进行了蛋白诱导表达和纯化,将纯化的突变光修复酶分别命名为:TB-E193D,TB-W295C和TB-H367Q。对纯化的突变6-4光修复酶蛋白（TB-E193D,TB-W295C和TB-H367Q）进行了酶活检测。突变光修复酶酶活检测结果显示:突变光修复酶TB-E193D修复6-4PPs的活性降低,突变光修复酶TB-W295C活性变化很小,TB-H367Q基本失去修复6-4PPs的活性。7.菌体内活性实验表明:南极衣藻C.sp.ICE-L 6-4光修复酶和CPD光修复酶双质粒共表达菌株的存活率都高于单独转入一种光修复酶的菌株。体外实验结果可知,纯化的混合蛋白既具有修复CPD的活性,同时又具有修复6-4PPs的活性,并且比起单一的光修复酶,其更有利于DNA损伤的修复。结论:南极衣藻C.sp.ICE-L在紫外辐射下会产生DNA损伤,形成了CPD。在持续的紫外辐射下,南极衣藻C.sp.ICE-L细胞中的CPD不断积累。CPD的积累对C.sp.ICE-L的DNA造成了损伤,并有可能造成了南极衣藻C.sp.ICE-L的生长缓慢。对南极衣藻C.sp.ICE-L转录组分析发现了四条预测为光修复酶的序列,分别标记为6-4CiPhr,CiPhr1,CiPhr2,CiPhr3。构建了南极衣藻C.sp.ICE-L光修复酶表达载体,分别对相关表达菌株进行蛋白诱导表达和分离纯化,得到了纯化蛋白6-4CiPhr和CiPhr1。功能验证结果显示6-4CiPhr具有修复6-4PPs的活性,并且可能是蓝光受体;CiPhr1具有修复CPD的功能。对6-4CiPhr进行定点突变,发现H367是一个关键氨基酸位点,对其进行突变,突变后的6-4CiPhr基本失去修复6-4PPs的活性。构建了南极衣藻C.sp.ICE-L 6-4光修复酶和CPD光修复酶双质粒共表达体系。实验表明南极衣藻C.sp.ICE-L 6-4光修复酶和CPD光修复酶双质粒共表达菌株的诱导蛋白更有利于修复UVB造成的DNA损伤,双质粒共表达菌株的存活率更高。
土志涵[9]（2019）在《草鱼MAPKAPK2、Hsp27、ACTA1基因克隆及投饲蚕豆对p38MAPK-Hsp27-Actin信号通路的影响》文中进行了进一步梳理实验一:草鱼MAP激酶活化蛋白激酶2（MAPKAPK2）基因的片段克隆、生物信息分析及组织差异表达MAPKAPK2基因编码丝裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶2,是p38MAPK重要的磷酸化底物。本文克隆得到草鱼MAPKAPK2基因片段序列,通过生物信息学方法分析MAPKAPK2基因片段所编码的蛋白质及构建系统进化树,并利用实时荧光定量PCR检测草鱼各个组织中MAPKAPK2基因m RNA表达量的差异表达。结果表明:草鱼MAPKAPK2基因片段长968bp,起始密码子为ATG。草鱼MAPKAPK2氨基酸序列与鲫鱼、斑马鱼、大黄鱼、小家鼠、人的氨基酸序列同源性分别达99%、99%、94%、78%、78%。通过实时荧光定量PCR检测发现MAPKAPK2基因在草鱼肝脏、脾脏、脑、肾脏、鳃、肌肉、心脏、皮肤、前肠、血液中均有表达,其中在心脏、血液和脑组织中高表达,在脾脏、肌肉、肾脏组织中表达量相对较高,在肝脏、皮肤、前肠和鳃组织中低表达（P<0.05）。实验二:草鱼热休克蛋白27（Hsp27）基因的全长克隆、生物信息分析和组织差异表达热休克蛋白27（Hsp27）是一种小分子热休克蛋白,具有分子伴侣性质,能够与肌动蛋白结合,从而调节肌动蛋白细胞骨架重组。本试验通过c DNA末端快速扩增法（RACE）得到草鱼Hsp27基因全长序列,对所得序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学方法分析和蛋白质特征分析,并对草鱼各组织进行Hsp27基因m RNA的组织差异表达。结果表明:草鱼Hsp27基因全长1271bp,含417bp的5’端非编码区、317bp的3’端非编码区和537bp编码178个氨基酸的开放阅读框。草鱼Hsp27基因编码的氨基酸序列与鲫鱼、斑马鱼、斑点叉尾鮰和墨西哥脂鲤的同源性分别达83%、76%、75%、70%。Hsp27基因在草鱼肝脏、脾脏、脑、肾脏、鳃、肌肉、心脏、皮肤、前肠、血液中均有表达,在心脏和肌肉组织中高表达（P<0.05）,在肝脏等其余组织中低表达。实验三:草鱼骨骼肌肌动蛋白（ACTA1）基因的全长克隆、生物信息分析和组织差异表达ACTA1基因编码α-骨骼肌肌动蛋白,是已鉴定的六种肌动蛋白亚型之一,肌动蛋白是参与细胞运动、结构和完整性的高度保守的蛋白质,α-肌动蛋白是肌肉收缩器的主要组成部分。本文通过c DNA末端快速扩增法（RACE）得到草鱼ACTA1基因全长序列,并通过生物信息学方法分析和预测ACTA1基因所编码的蛋白质特征,并利用实时荧光定量PCR检测草鱼各个组织中ACTA1基因m RNA表达量的差异表达。结果表明:草鱼ACTA1基因全长1553bp,序列含443bp的5’端非编码区、111bp的3’端非编码区和长999bp编码332个氨基酸的开放阅读框。草鱼ACTA1氨基酸序列与鲤鱼、斑马鱼、虹鳟、乌干达红疣猴、家鼠的氨基酸序列同源性均是99%。通过实时荧光定量PCR检测发现ACTA1基因在草鱼肝脏、脾脏、脑、肾脏、鳃、肌肉、心脏、皮肤、前肠、血液中均有表达,其中在心脏、肌肉和皮肤组织中高表达,在肝脏等组织中低表达（P<0.05）。实验四:投饲蚕豆对草鱼肌肉和心脏组织p38MAPK-Actin信号通路及肌原纤维装配基因表达的影响本实验设置两组,每组三个平行,每组15条草鱼。蚕豆组饲喂浸泡24h的干蚕豆,对照组饲喂普通配合饲料,养殖周期12周,分别在0、4、8、12周进行肌肉组织和心脏组织的样品采集,并运用实时荧光定量测定肌肉组织和心脏组织中p38MAPK、MAPKAPK2、Hsp27和ACTA1基因的m RNA相对表达量。结果显示:蚕豆组中各基因的m RNA相对表达量高于对照组。肌肉组织中,8周时,p38MAPK、MAPKAPK2基因的m RNA相对表达量达到峰值,在12周时都出现下降的趋势;而基因Hsp27和ACTA1在投喂时期内相对表达量呈上升趋势。心脏组织中,p38MAPK、MAPKAPK2和Hsp27、ACTA1的m RNA相对表达量达到峰值的时间点不同,p38MAPK与MAPKAPK2在4周时出现峰值,而Hsp27和ACTA1在12周时出现峰值。以上结果说明对草鱼投喂蚕豆可以不同程度的增强p38MAPK-Hsp27-Actin信号通路在肌肉组织和心脏组织中的m RNA相对表达量,使得肌动蛋白合成增多,进而增强了肌原纤维的装配。
郭德权[10]（2019）在《转NNVCP基因衣藻预防石斑鱼病毒性神经坏死病》文中提出石斑鱼是一种含有高蛋白、低脂肪的上等食用鱼,是我国人工养殖的重要经济鱼类。其中,石斑鱼的主要养殖品种是珍珠龙胆石斑鱼。珍珠龙胆石斑鱼常因感染鱼类病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis,VNN）而损失惨重。VNN是养殖鱼类的常发病,其危害大,死亡率高达65-100%。隶属于罗达病毒科（Nodaviridae）,目前认为其有四种基因型。通过病毒血清型研究表明,4种基因型外壳蛋白的254～256位氨基酸为主要抗原决定簇,说明外壳蛋白基因可以用作抗原基因。目前,由于没有特效疫苗和特异药物防治石斑鱼病毒性神经坏死病,所以石斑鱼苗养殖受到VNN的严重制约。而微藻能进行光合作用,是最原始的初级生产者成员,也在水产养殖中有巨大作用,特别在水产动物的小苗阶段。衣藻（Chlamydomonas）生长周期短、是水体中常见优势藻类,适生性强,是幼鱼的天然饵料。而外壳蛋白含抗原决定簇,可以作为抗原在饵料微藻中表达,得到抗原蛋白,使得饲喂了转病毒性神经坏死病病毒外壳蛋白（NNVCP）基因衣藻的石斑鱼持续获得抗原免疫。因此,采用转NNVCP基因衣藻来预防VNN具有广阔的应用前景。本论文从以下方面进行研究:经济藻株的保种、分离纯化和扩培;构建pCAMBIA1302-NNVCP重组载体;将重组载体采用玻璃珠转化法转入莱茵衣藻;并进行不同种类,不同浓度的抗性筛选;随后对筛选的藻株进行DNA、RNA水平验证;收集海南省乐东县某石斑鱼养殖基地培育的珍珠龙胆石斑鱼发病鱼苗,对其初步确诊断为VNN;采用转基因微藻混合饲料进行预防石斑鱼VNN实验,其研究结果如下:1、经济藻株的保种、分离、纯化和扩培对六种经济藻株的液态不纯藻株采用稀释分离法进行分离,成功分离纯化出六种经济藻株液态纯种;采用10、20、40、60、80、100 μg/ml浓度的氨苄青霉素,对其采用平板划线法,成功在固体培养基上纯化出盐藻、海水小球藻、扁藻。并将纯化的藻种分别用对应的培养基进行保种。采用逐步放大培养法,对3种经济藻株进行液态扩培,每次扩培终体积为100 L,期间总共扩培5次,总共扩培经济藻株体积500L。本实验不仅增加了实验室藻株资源库的种类,扩培的藻株用于苗种企业生产实践,实现了产研学的价值。2、重组载体的构建、转化衣藻及筛选通过NCBI查找NNVCP基因与pCAMBIA1302载体重组,成功构建表达载体pCAMBIA1302-NNVCP。并将pCAMBIA1302-NNVCP真核表达载体转入衣藻。对pCAMBIA1302-NNVCP转基因藻株进行抗性筛选。结果显示:pCAMBIA1302-NNVCP转基因藻株分别通过含有潮霉素2、5、10、15 μg/ml TAP固体培养基进行筛选,筛选成功的藻株有42株,最终接种在含有10μg/ml潮霉素的固体TAP培养基。3、转基因藻株的鉴定、保种、扩培和采收对抗性筛选后的转基因藻株进行鉴定,对其进行DNA、RNA提取,并进行PCR验证。结果显示:在pCAMBIA1302-NNVCP藻株中,有26株呈阳性。将得到的26株转基因藻株保种在含有对应抗生素的平板培养基,并进行转基因藻液态扩培,扩培出pCAMBIA1302-NNVCP-14/15/16藻液质量分别为60.2g、66.7g、69.2g、65.7g,为转基因微藻预防石斑鱼VNN提供实验材料。4、海南珍珠龙胆石斑鱼苗VNN的初步诊断收集海南省乐东县某石斑鱼养殖基地培育的珍珠龙胆石斑鱼发病鱼苗。通过诊断,结果显示:出现了典型VNN症状,对患病鱼体进行了寄生虫学检查,结果为阴性;采用RT-PCR方法、采用OIE推荐引物,VNN的PCR产物特异性片段大小为421 bp;采用细胞肿大病毒、虹彩病毒检测引物,采用RT-PCR方法排除混合感染,以此初步诊断为VNN。在此之前,很少有报道VNN在冬季发生,因此本研究对深入探索VNN具有重要意义,并且为攻毒实验提供材料。5、转基因微藻预防珍珠龙胆石斑鱼VNN实验探究出两种简易自制转基因工程微藻混合饲料的制作方法。连续十天喂食转基因混合饲料后,进行攻毒实验。从分子水平、细胞学水平、生物学水平结果显示:攻毒24小时后实验组脑组织中VNN病毒外壳蛋白mRNA含量比饲料对照组分别下降了67.25%、36.61%、77.17%;攻毒24小时实验组脑组织空泡化数量比对照组少,空泡化病变比对照组轻微;实验组平均存活率比饲料对照组高出33.33%,表明转NNVCP基因衣藻对预防石斑鱼病毒性神经坏死病有一定的作用。
二、衣藻肌动蛋白基因的克隆及核苷酸序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、衣藻肌动蛋白基因的克隆及核苷酸序列分析（论文提纲范文）
（1）亚麻荠WRKY转录因子家族的鉴定及其介导盐胁迫响应的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 特色油料作物亚麻荠 |
| 1.1.1 亚麻荠抗逆性及优异农艺性状 |
| 1.1.2 亚麻荠的广泛应用 |
| 1.2 盐胁迫对植物生长发育的影响及植物对盐胁迫的应答 |
| 1.3 参与植物胁迫响应的转录因子 |
| 1.4 WRKY转录因子与植物生长发育及胁迫响应的调控 |
| 1.4.1 WRKY转录因子的特征 |
| 1.4.2 参与植物胁迫响应的WRKY转录因子研究进展 |
| 1.5 本研究的目的、意义及主要内容 |
| 1.6 本研究的技术路线 |
| 第二章 亚麻荠对盐胁迫响应的生理生化表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 营养液配方 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 亚麻荠幼苗的处理 |
| 2.3.2 植株形态指标测定 |
| 2.3.3 植株生理指标测定 |
| 2.3.4 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 盐胁迫对亚麻荠幼苗生长的影响 |
| 2.4.2 盐胁迫对亚麻荠幼苗叶片光合作用的影响 |
| 2.4.3 盐胁迫对亚麻荠幼苗叶片渗透调节物质的影响 |
| 2.4.4 盐胁迫对亚麻荠幼苗叶片丙二醛含量和相对电导率的影响 |
| 2.4.5 盐胁迫对亚麻荠幼苗叶片抗坏血酸和H_2O_2的影响 |
| 2.4.6 盐胁迫对亚麻荠幼苗叶片抗氧化体系的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 亚麻荠幼苗转录组分析与盐胁迫响应转录因子的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 亚麻荠转录组测序 |
| 3.3.2 亚麻荠测序数据分析 |
| 3.3.3 差异表达基因筛选与及功能富集分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 测序数据质量分析 |
| 3.4.2 亚麻荠差异表达基因的分析 |
| 3.4.3 差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.4.4 差异表达基因的KEGG富集分析 |
| 3.4.5 介导亚麻荠盐胁迫响应的候选转录因子分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 参与盐胁迫响应的基因及代谢通路 |
| 3.5.2 转录因子介导植物盐胁迫响应 |
| 3.5.3 WRKY转录因子是调控植物盐胁迫应答的重要成员 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 亚麻荠WRKY转录因子的全基因组鉴定与盐胁迫响应CsWRKY的筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 亚麻荠WRKY转录因子的筛选 |
| 4.3.2 亚麻荠WRKY转录因子的理化性质分析 |
| 4.3.3 亚麻荠WRKY转录因子保守结构域和基因结构及进化分析 |
| 4.3.4 亚麻荠WRKY基因在不同组织器官表达谱和盐胁迫表达分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 全基因组鉴定获得242 个亚麻荠CsWRKY家族成员 |
| 4.4.2 15个CsWRKY基因位点可变剪接产生33 个不同的ORF剪接体 |
| 4.4.3 亚麻荠CsWRKY蛋白多序列比对和进化树分析 |
| 4.4.4 CsWRKY蛋白检测到10 个保守基序 |
| 4.4.5 亚麻荠CsWRKY基因不均匀地分布于各染色体 |
| 4.4.6 亚麻荠CsWRKY基因家族扩增的进化驱动力及CsWRKY和拟南芥、油菜WRKY的共线性分析 |
| 4.4.7 CsWRKY基因在不同组织中的表达 |
| 4.4.8 CsWRKY基因在盐胁迫下亚麻荠幼苗的表达谱 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 亚麻荠WRKY成员的保守性和差异性 |
| 4.5.2 基因片段复制构成亚麻荠WRKY家族急剧扩增的关键进化动力 |
| 4.5.3 部分CsWRKYs可能是介导亚麻荠盐胁迫响应的核心转录因子 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 应用莱茵衣藻遗传转化体系鉴定亚麻荠CsWRKY9、43和162 基因的功能 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 试验试剂 |
| 5.2.3 菌株与载体 |
| 5.2.4 培养基的配制 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 亚麻荠CsWRKY9、43和162 基因的克隆和分析 |
| 5.3.2 构建CsWRKY9、43和162 基因的表达载体 |
| 5.3.3 CsWRKY9、43和162 基因的莱茵衣藻遗传转化 |
| 5.3.4 CsWRKY9、43和162 转基因藻株的筛选与鉴定 |
| 5.3.5 CsWRKY9、43和162 转化藻株的生理指标测定 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 亚麻荠CsWRKY9、43和162 基因的克隆及编码蛋白特性分析 |
| 5.4.2 CsWRKY9、43和162 基因表达载体的鉴定 |
| 5.4.3 阳性转化藻株的筛选及基因组DNA PCR鉴定 |
| 5.4.4 转化藻株目的基因CsWRKY9、43和162 表达分析 |
| 5.4.5 转化藻株CsWRKY9、43和162 对盐胁迫响应的表征 |
| 5.4.6 莱茵衣藻内源 CrWRKY敲除株系与过表达外源 CsWRKY藻株盐胁迫响应的表型比较 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 亚麻荠CsWRKY162 过表达及CRISPR/Cas9 敲除突变体的构建和表型分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 植物材料 |
| 6.2.2 试验试剂 |
| 6.2.3 菌种与载体 |
| 6.2.4 培养基的配制 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 构建CsWRKY162 基因的过表达载体 |
| 6.3.2 构建CRISPR/Cas9 敲除载体 |
| 6.3.3 亚麻荠的遗传转化 |
| 6.3.4 转基因亚麻荠的鉴定及盐胁迫处理 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 CsWRKY162 植物过表达载体的鉴定 |
| 6.4.2 CsWRKY162 CRISPR/Cas9 敲除载体的鉴定 |
| 6.4.3 亚麻荠最适Hyg筛选浓度的确定 |
| 6.4.4 亚麻荠CsWRKY162 基因过表达株系的筛选及PCR鉴定 |
| 6.4.5 亚麻荠CsWRKY162 基因过表达株系对盐胁迫响应的表征 |
| 6.4.6 过表达株系中胁迫相关基因的表达 |
| 6.4.7 亚麻荠CsWRKY162 基因敲除株系的筛选及基因组DNA PCR鉴定 |
| 6.4.8 亚麻荠CsWRKY162 基因敲除株系响应盐胁迫的表征 |
| 6.4.9 CsWRKY162 敲除株系中胁迫相关基因的表达 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 全文总结及展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录 |
| 附表 |
| 附图 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）南极衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L隐花色素基因克隆及表达调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 的克隆及生物信息学分析 |
| 材料与方法 |
| 1 藻种及培养条件 |
| 2 南极衣藻总RNA的提取 |
| 3 南极衣藻cDNA第一链的反转录合成 |
| 4 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 基因全长的扩增 |
| 5 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 ORF的回收与纯化 |
| 6 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 ORF与质粒的连接、转化 |
| 7 挑取单菌落进行阳性检测 |
| 8 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 基因的生物信息学分析 |
| 结果 |
| 1 南极衣藻总RNA的提取鉴定 |
| 2 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 基因的克隆 |
| 3 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 基因的序列信息 |
| 4 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 序列的同源性分析 |
| 5 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 系统发育树分析 |
| 讨论 |
| 第二部分 极端环境下Chlamydomonas sp.ICE-L CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY的表达调控 |
| 材料与方法 |
| 1 藻种及培养条件 |
| 2 胁迫诱导 |
| 3 南极衣藻总RNA的提取 |
| 4 qRT-PCR反转录合成cDNA |
| 5 实时荧光定量PCR反应体系 |
| 结果 |
| 1 不同温度胁迫条件下CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 的表达调控 |
| 2 不同盐度胁迫条件下CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 的表达调控 |
| 3 不同光质胁迫条件下CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 的表达调控 |
| 4 不同光周期胁迫条件下CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 的表达调控 |
| 5 不同紫外胁迫条件下CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 的表达调控 |
| 讨论 |
| 第三部分 南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 蛋白的异源表达 |
| 材料与方法 |
| 1 藻种及培养条件 |
| 2 南极衣藻总RNA的提取 |
| 3 南极衣藻cDNA第一链的反转录合成 |
| 4 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1的ORF基因调取 |
| 5 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 表达载体的构建 |
| 6 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 蛋白的诱导表达 |
| 结果 |
| 1 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1的ORF基因调取 |
| 2 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 表达载体的构建 |
| 3 南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1 蛋白的诱导表达 |
| 讨论 |
| 第四部分 南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L叶绿素荧光参数测定 |
| 材料与方法 |
| 1 藻种及培养条件 |
| 2 处理条件 |
| 3 叶绿素荧光参数的测定 |
| 4 数据统计分析 |
| 结果 |
| 1 不同光质(蓝光、绿光、黄光和红光)对PSII光化学效率的影响 |
| 2 不同光周期(极昼和极夜)对PSII光化学效率的影响 |
| 3 不同紫外条件(UVA和 UVB)对PSII光化学效率的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 隐花色素家族研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（3）小球藻病毒启动子在莱茵衣藻中的转录活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 生物能源的发展 |
| 1.1.2 微藻培育与应用现状 |
| 1.2 莱茵衣藻 |
| 1.2.1 简介 |
| 1.2.2 莱茵衣藻的油脂代谢途径及gpd1 与油脂积累的关系 |
| 1.2.3 莱茵衣藻的生物技术及应用进展 |
| 1.2.4 莱茵衣藻的基因编辑研究进展 |
| 1.2.5 FMDV-2A序列的应用 |
| 1.2.6 外源启动子在莱茵衣藻遗传转化中的应用 |
| 1.3 研究内容 |
| 第2章 莱茵衣藻转化质粒的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 试剂和仪器 |
| 2.1.3 LB培养基的配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备 |
| 2.2.2 质粒的构建 |
| 2.2.3 感受态细胞DH5α的转化 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 正对照pGO24 和负对照pGO25 的酶切检测 |
| 2.3.2 病毒来源启动子构建的质粒检测 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 病毒来源的启动子在莱茵衣藻中的启动活性 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 藻株 |
| 3.1.2 培养基的配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 莱茵衣藻的培养 |
| 3.2.2 莱茵衣藻的转化 |
| 3.2.3 莱茵衣藻转化藻株在液体培养基中博来霉素筛选浓度的确定 |
| 3.2.4 莱茵衣藻转化株的筛选 |
| 3.2.5 莱茵衣藻转化株的验证 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 莱茵衣藻转化株的获得 |
| 3.3.2 莱茵衣藻转化藻株在Zeocin抗性的TAP液体培养基中的生长 |
| 3.3.3 莱茵衣藻转化藻株的PCR检测 |
| 3.3.4 莱茵衣藻转化藻株的qRT-PCR检测结果 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 含gpd1 基因的重组质粒的构建 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 目的基因的获得 |
| 4.2.2 含gpd1 基因重组质粒的构建 |
| 4.2.3 含gpd1 基因重组质粒的获得及验证 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 含gpd1 基因重组质粒的鉴定 |
| 4.3.2 含gpd1 基因重组质粒的莱茵衣藻转化结果 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 含gpd1 基因莱茵衣藻转化株的油脂检测 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 藻株 |
| 5.1.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 含gpd1 基因莱茵衣藻转化株的PCR验证 |
| 5.2.2 尼罗红染色剂的配置 |
| 5.2.3 尼罗红染色的条件优化 |
| 5.2.4 转gpd1 基因莱茵衣藻的油脂检测 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 含gpd1 基因转化藻株的PCR验证 |
| 5.3.2 尼罗红染色法染色条件的确定 |
| 5.3.3 转化藻株的油脂检测结果 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）基于生物信息学结合荧光技术研究衣藻Dicer-like蛋白在microRNA生成过程的功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 荧光技术 |
| 1.1.1 荧光光谱 |
| 1.1.2 同步荧光光谱 |
| 1.1.3 荧光各向异性法 |
| 1.1.4 荧光共振转移 |
| 1.1.5 荧光显微镜技术 |
| 1.1.6 双分子荧光互补(BiFC) |
| 1.1.7 荧光定量PCR |
| 1.2 光合生物-莱茵衣藻 |
| 1.3 miRNA的发现 |
| 1.4 miRNA合成途径 |
| 1.4.1 MIR基因转录和转录调控 |
| 1.4.2 miRNA前体的加工 |
| 1.4.3 miRNA稳定和RISC形成 |
| 1.4.4 miRNA生物合成过程的定位 |
| 1.5 miRNA作用方式 |
| 1.5.1 不同物种间miRNA作用特征 |
| 1.5.2 miRNA介导的mRNA降解 |
| 1.5.3 miRNA介导的翻译抑制 |
| 1.6 Dicer/Dice-like(DCL)蛋白结构与功能 |
| 1.6.1 Dicer蛋白结构 |
| 1.6.2 Dicer同源物的进化 |
| 1.6.3 Dicer/DCL蛋白在s RNA生成途径的功能 |
| 1.6.4 Dicer/DCL蛋白的其它功能 |
| 1.7 研究目的、内容及创新点 |
| 第2章 莱茵衣藻DCL蛋白结构的光谱特性与功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 试剂的配制 |
| 2.3.2 DCL蛋白结构分析 |
| 2.3.3 pCambia1301-GFP-DCL载体的构建 |
| 2.3.4 亚细胞定位 |
| 2.3.5 CrDCL蛋白结构域的克隆及表达载体的构建 |
| 2.3.6 CrDCL蛋白结构域蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.7 pre-miR1162的体外克隆与转录 |
| 2.3.8 核酸5’端荧光素标记 |
| 2.3.9 荧光各向异性实验 |
| 2.3.10 荧光光谱检测 |
| 2.3.11 同步荧光光谱检测 |
| 2.3.12 圆二色谱 |
| 2.3.13 等温滴定量热法(ITC) |
| 2.3.14 CrDCL互作蛋白的预测 |
| 2.3.15 数据处理与分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 DCL蛋白结构分析 |
| 2.4.2 应用激光共聚焦显微镜分析CrDCL蛋白的作用场所 |
| 2.4.3 CrDCL蛋白结构域及miRNA前体的克隆与纯化 |
| 2.4.4 pre-miR1162与DUF283结合后的偏振特性 |
| 2.4.5 DUF283结构域与dsRNA的荧光淬灭机制 |
| 2.4.6 应用光谱法分析DUF283结构域的构象变化 |
| 2.4.7 DUF283结构域与dsRNA的结合作用力 |
| 2.4.8 CrDCL互作蛋白的预测分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 DCL1和DCL3参与miRNA合成途径 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 藻种和培养条件 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 试剂的配制 |
| 3.3.2 藻株基因组提取 |
| 3.3.3 藻种的筛选 |
| 3.3.4 RNA的提取 |
| 3.3.5 cDNA的合成 |
| 3.3.6 荧光定量PCR实验 |
| 3.3.7 Northern blot实验 |
| 3.3.8 小RNA组学测序分析 |
| 3.3.9 油脂含量检测 |
| 3.3.10 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.0 dcl1和dcl3突变株的DNA水平验证 |
| 3.4.1 应用荧光定量PCR技术筛选dcl1和dcl3 突变株 |
| 3.4.2 DCL3参与miRNA合成途径的验证 |
| 3.4.3 CC-5325与dcl1 突变株小RNA组学数据分析 |
| 3.4.4 DCL1介导miRNA的合成 |
| 3.4.5 DCL1相关miRNA的预测靶基因功能分析 |
| 3.4.6 突变株油脂含量的检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 DCL1 介导部分miRNA的合成途径 |
| 3.5.2 衣藻miRAN的生物合成途径不同于动植物 |
| 3.5.3 DCL1 相关的5个miRNA可能介导脂肪酸代谢途径 |
| 3.5.4 miRBase数据库中19个cre-miRNA的校正 |
| 3.6 结论 |
| 第4章 短串联靶向模型(STTM)对衣藻micro RNA的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验藻株 |
| 4.2.2 主要试剂与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 试剂的配制 |
| 4.3.2 STTM载体构建 |
| 4.3.3 衣藻转化与筛选 |
| 4.3.4 荧光定量PCR检测 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 STTM转化藻株的构建 |
| 4.4.2 STTM转化子的靶miRNA表达水平检测 |
| 4.4.3 STTM对非靶向miRNA的抑制 |
| 4.4.4 相关miRNA序列的比对 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 指导教师对研究生学位论文的学术评语 |
| 答辩委员会决议书 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
（5）超折叠维纳斯黄色荧光蛋白及其在莱茵衣藻中表达的研究与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 实验室常用的一种模式生物——莱茵衣藻 |
| 1.2 莱茵衣藻的叶绿体基因组转化 |
| 1.3 莱茵衣藻的核基因组转化 |
| 1.3.1 核基因组转化方法 |
| 1.3.2 启动子的挑选 |
| 1.3.3 筛选标记的挑选 |
| 1.3.4 报告基因的挑选 |
| 1.4 本课题研究的目的与意义 |
| 2 报告基因超折叠维纳斯黄色荧光蛋白sfVenus氨基酸与核苷酸序列的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌菌株的选取与培养环境 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 质粒载体构建 |
| 2.2.4 莱茵衣藻藻株的选取与培养环境 |
| 2.2.5 莱茵衣藻珠磨法转化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 GFP的突变体,报告基因sfVenus氨基酸序列的构成 |
| 2.3.2 分子克隆构建载体pCYX003(sfVenus) |
| 2.4 实验讨论 |
| 3 报告基因sfVenus在莱茵衣藻过表达诱变株UVM4中的表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 质粒载体构建 |
| 3.2.2 莱茵衣藻核基因组DNA提取与PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)筛选 |
| 3.2.3 mRNA提取与qRT-PCR(quantitative reverse transcription PCR,定量反转录PCR) |
| 3.2.4 莱茵衣藻蛋白质免疫印迹(Western Blot)筛选 |
| 3.2.5 全蛋白提取与In-gel fluorescence |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 载体pCYX003(sfVenus)和p JR39(Venus)转入莱茵衣藻UVM4 |
| 3.3.2 分子克隆构建载体pCYX005(sfVenus) |
| 3.3.3 载体pCYX005(sfVenus)转入莱茵衣藻UVM4 |
| 3.4 实验讨论 |
| 4 报告基因串联sfVenuses在莱茵衣藻过表达诱变株UVM4中的表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 质粒载体构建 |
| 4.2.2 荧光显微镜 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 分子克隆构建载体pCYX004(2sfVenuses)和pCYX006(3sfVenuses) |
| 4.3.2 载体pCYX004(2sfVenuses)和pCYX006(3sfVenuses)转入莱茵衣藻UVM4 |
| 4.3.3 分子克隆构建载体pCYX012(2sfVenuses) |
| 4.3.4 载体pCYX012(2sfVenuses)转入莱茵衣藻UVM4 |
| 4.4 实验讨论 |
| 5 报告基因sfVenus与其他蛋白在莱茵衣藻过表达诱变株UVM4中的融合表达 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 质粒载体构建 |
| 5.2.2 莱茵衣藻蛋白质免疫印迹(Western Blot)筛选 |
| 5.2.3 斑点杂交(Dot blot) |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 分子克隆构建载体pCYX008(LOV1)和pCYX009(LOV1-sfVenus) |
| 5.3.2 载体pCYX008(LOV1)和pCYX009(LOV1-sfVenus)转入莱茵衣藻UVM4 |
| 5.4 实验讨论 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（6）莱茵衣藻BBSome组分蛋白BBS4的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 莱茵衣藻 |
| 1.1.1 简介 |
| 1.1.2 作为模式生物的优势 |
| 1.2 纤毛 |
| 1.2.1 简介 |
| 1.2.2 纤毛的结构 |
| 1.2.3 纤毛的功能 |
| 1.3 纤毛内运输系统(IFT) |
| 1.3.1 IFT蛋白 |
| 1.3.2 BBS蛋白 |
| 1.4 纤毛病 |
| 1.5 BBS4的研究进展 |
| 1.6 大肠杆菌原核表达系统 |
| 1.7 免疫荧光技术 |
| 1.8 本课题研究的意义 |
| 1.9 本课题研究主要内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 仪器和设备 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种与质粒 |
| 2.2.2 免疫动物 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.3 培养基及溶液的配制 |
| 2.3.1 培养基的配制 |
| 2.3.2 实验溶液的配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 莱茵衣藻bbs4的生物信息学分析 |
| 2.4.2 莱茵衣藻bbs4目的基因的获得 |
| 2.4.3 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.4.4 6×His-BBS4和MBP-BBS4融合蛋白的诱导表达 |
| 2.4.5 大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)的制备 |
| 2.4.6 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.4.7 融合蛋白6×His-BBS4和MBP-BBS4的纯化 |
| 2.4.8 免疫与抗血清效价检测 |
| 2.4.9 抗体的鉴定与纯化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 莱茵衣藻bbs4的生物信息学分析 |
| 3.1.1 BBS4的核苷酸与氨基酸序列 |
| 3.1.2 BBS4的理化性质 |
| 3.2 莱茵衣藻bbs4目的基因的获得 |
| 3.3 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.3.1 空载体回收 |
| 3.3.2 重组质粒pMAL-c2X-bbs4和pET-28a(+)-bbs4的双酶切验证 |
| 3.4 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析 |
| 3.4.1 融合蛋白6×His-BBS4的诱导表达及鉴定 |
| 3.4.2 融合蛋白MBP-BBS4的诱导表达及鉴定 |
| 3.5 融合蛋白的纯化 |
| 3.5.1 融合蛋白6×His-BBS4的纯化 |
| 3.5.2 融合蛋白MBP-BBS4的亲和纯化 |
| 3.5.3 纯化效果分析 |
| 3.6 免疫学实验 |
| 3.7 抗体纯化结果 |
| 3.8 Western印迹实验对抗体的特异性分析 |
| 3.9 免疫荧光实验结果 |
| 4 结论 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.1.1 表达载体的构建 |
| 4.1.2 融合蛋白的表达及纯化 |
| 4.1.3 动物免疫及抗血清效价的测定 |
| 4.1.4 多克隆抗体的纯化及其特异性检测 |
| 4.2 论文的创新点 |
| 4.3 论文的不足之处 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读学位论文期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
| 9 附录 |
（7）假根羽藻PSⅠ捕光天线序列测定及衣藻高光对PSⅠ光合色素影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 光合植物进化过程中PSI结构的演化 |
| 1.2 绿藻PSI复合物的捕光天线结构与功能研究 |
| 1.3 LHC的光保护机制与类胡萝卜素组成 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 实验方案设计与研究方法 |
| 2.1 研究内容 |
| 2.1.1 假根羽藻PSI天线序列基因克隆与分析 |
| 2.1.2 高光对衣藻PSI光合色素的影响 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 假根羽藻PSI天线序列基因克隆与分析研究方法 |
| 2.2.2 高光对衣藻PSI光合色素影响的研究方法 |
| 第三章 假根羽藻PSI天线序列获取结果与分析 |
| 3.1 假根羽藻总RNA的提取 |
| 3.2 同源序列法获取假根羽藻LHCA序列 |
| 3.3 转录组测序法获取假根羽藻LHCA序列 |
| 3.4 假根羽藻LHCA5、LHCA6 序列获取 |
| 3.5 假根羽藻LHCA序列比对及进化分析 |
| 3.6 根据假根羽藻PSI-LHCI结构分析Lhca结构与功能的关系 |
| 3.6.1 假根羽藻PSI-LHCI中 Lhca的组装与结构 |
| 3.6.2 假根羽藻PSI-LHCI中 Lhca的色素结构 |
| 第四章 高光对衣藻PSI光合色素影响实验结果与分析 |
| 4.1 不同光照条件下莱茵衣藻色素组成分析 |
| 4.2 莱茵衣藻色素含量随高光处理时间的变化 |
| 4.3 不同光照条件下莱茵衣藻类囊体膜色素组成分析 |
| 4.4 莱茵衣藻PSI-LHCI复合物的分离纯化分析 |
| 4.5 莱茵衣藻PSI-LHCI复合物的色素组成分析 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 讨论与展望 |
| 6.1 讨论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 成果 |
| 一、在校期间发表的学术论文 |
| 二、发明专利申请 |
| 三、在校期间获奖情况 |
（8）南极衣藻DNA光修复酶家族及其紫外辐射损伤协同修复机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 紫外辐射下南极衣藻嘧啶二聚体的形成与转录组测序 |
| 材料与方法 |
| 1 藻种与培养基 |
| 2 南极衣藻的紫外辐射胁迫 |
| 3 DNA提取与嘧啶二聚体形成的测定 |
| 4 南极衣藻转录组测序 |
| 结果 |
| 1 南极衣藻的DNA提取 |
| 2 紫外辐射下南极衣藻的生长 |
| 3 紫外辐射下南极衣藻CPD的积累 |
| 4 南极衣藻转录组测序结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 南极衣藻光修复酶家族基因克隆及生物信息学分析 |
| 材料与方法 |
| 1 藻种与培养基 |
| 2 南极衣藻总RNA的提取 |
| 3 南极衣藻cDNA第一链的反转录合成 |
| 4 南极衣藻光修复酶基因的RACE-PCR扩增 |
| 5 南极衣藻光修复酶基因全长的扩增 |
| 6 南极衣藻光修复酶基因的TA克隆 |
| 7 南极衣藻光修复酶的生物信息学分析 |
| 结果 |
| 1 南极衣藻总RNA的提取及光修复酶基因的克隆 |
| 2 南极衣藻光修复酶的序列信息 |
| 3 南极衣藻光修复酶基因的系统发育树分析 |
| 讨论 |
| 第三部分 南极衣藻光修复酶基因在不同光照下的表达 |
| 材料与方法 |
| 1 藻种与培养基 |
| 2 南极衣藻在不同光照条件下胁迫培养 |
| 3 南极衣藻总RNA提取及光修复酶基因定量引物设计 |
| 4 qRT-PCR模版的反转录 |
| 5 实时荧光定量PCR |
| 结果 |
| 1 紫外辐射胁迫下南极衣藻光修复酶基因的表达 |
| 2 蓝光胁迫下南极衣藻光修复酶基因的表达 |
| 3 红光胁迫下南极衣藻光修复酶基因的表达 |
| 4 黑暗胁迫下南极衣藻光修复酶基因的表达 |
| 讨论 |
| 第四部分 南极衣藻光修复酶蛋白的表达与分离纯化 |
| 材料与方法 |
| 1 藻种与培养基 |
| 2 南极衣藻光修复酶表达载体的构建 |
| 3 南极衣藻重组光修复酶蛋白的诱导表达 |
| 4 南极衣藻重组光修复酶蛋白的检测 |
| 5 南极衣藻重组光修复酶蛋白N端测序 |
| 6 南极衣藻重组光修复酶蛋白诱导表达条件的优化培养 |
| 7 南极衣藻重组光修复酶蛋白的纯化 |
| 8 南极衣藻重组光修复酶蛋白浓度测定 |
| 结果 |
| 1 南极衣藻光修复酶表达载体的构建 |
| 2 南极衣藻光修复酶重组蛋白的诱导表达 |
| 3 南极衣藻光修复酶重组蛋白的N端测序 |
| 4 不同条件下南极衣藻光修复酶重组菌的生物量 |
| 5 不同条件下南极衣藻光修复酶重组菌的诱导蛋白浓度 |
| 讨论 |
| 第五部分 南极衣藻光修复酶酶活检测 |
| 材料与方法 |
| 1 菌种与质粒 |
| 2 在光修复酶缺陷的大肠杆菌内的酶活测定 |
| 3 南极衣藻光修复酶对CPD的修复实验 |
| 4 南极衣藻6-4 光修复酶对6-4PPs的修复实验 |
| 结果 |
| 1 在光修复酶缺陷的大肠杆菌内的酶活测定 |
| 2 南极衣藻重组光修复酶对CPD的修复活性 |
| 3 南极衣藻6-4 光修复酶对6-4PPs的修复活性 |
| 讨论 |
| 第六部分 南极衣藻6-4光修复酶关键氨基酸定点突变 |
| 材料与方法 |
| 1 菌株和质粒 |
| 2 定点突变(PCR反应) |
| 3 南极衣藻6-4光修复酶突变重组菌的构建 |
| 4 突变重组菌的诱导表达与蛋白纯化 |
| 5 突变重组蛋白的酶活检测 |
| 结果 |
| 1 南极衣藻6-4光修复酶基因突变位点的选择 |
| 2 光修复酶基因突变株的获得 |
| 3 光修复酶突变株的诱导表达与酶活检测 |
| 讨论 |
| 第七部分 南极衣藻CPD光修复酶和6-4 光修复酶相互作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 1 菌种与质粒 |
| 2 南极衣藻CPD光修复酶及6-4 光修复酶双质粒共表达载体的构建 |
| 3 南极衣藻CPD光修复酶与6-4 光修复酶双质粒重组菌的蛋白诱导 |
| 4 南极衣藻重组光修复酶蛋白活性检测 |
| 5 光修复酶缺陷菌株的活性检测 |
| 结果 |
| 1 南极衣藻CPD光修复酶与6-4 光修复酶双质粒重组菌的构建 |
| 2 南极衣藻CPD光修复酶与6-4 光修复酶双质粒重组蛋白的诱导表达 |
| 3 南极衣藻CPD光修复酶与6-4 光修复酶双质粒重组蛋白的活性检测 |
| 4 在光修复缺陷型的大肠杆菌中的功能验证 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）草鱼MAPKAPK2、Hsp27、ACTA1基因克隆及投饲蚕豆对p38MAPK-Hsp27-Actin信号通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 肌节组成 |
| 2 肌节装配过程 |
| 3 肌节装配相关信号通路 |
| 3.1 相关信号通路 |
| 3.2 p38 MAPK-Hsp27-Actin信号通路与肌节装配 |
| 4 小结 |
| 第二章 草鱼MAP激酶活化蛋白激酶2(MAPKAPK2)基因的全长克隆、生物信息分析和组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料、主要仪器与试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 MAPKAPK2 序列分析 |
| 1.4 组织差异表达分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MAPKAPK2 基因片段克隆及序列分析 |
| 2.2 MAPKAPK2 氨基酸序列同源性比对和系统进化树构建 |
| 2.3 草鱼MAPKAPK2 基因的组织差异表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 草鱼MAPKAPK2 基因序列、氨基酸同源性及蛋白结构 |
| 3.2 草鱼MAPKAPK2 基因的组织差异表达 |
| 4 小结 |
| 第三章 草鱼热休克蛋白27(Hsp27)基因的全长克隆、生物信息分析和组织差异表 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料、主要仪器与试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 Hsp27 氨基酸序列分析、系统进化树构建及蛋白质生物信息学分析 |
| 1.4 组织差异表达分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hsp27 基因片段克隆及序列分析 |
| 2.2 Hsp27 氨基酸序列同源性比对和系统进化树构建 |
| 2.3 Hsp27 蛋白质结构分析 |
| 2.4 草鱼Hsp27 基因的组织差异表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 草鱼Hsp27 序列、氨基酸同源性及蛋白结构 |
| 3.2 草鱼Hsp27 基因的组织差异表达 |
| 4 小结 |
| 第四章 草鱼骨骼肌肌动蛋白(ACTA1)基因的片段克隆、生物信息分析和组织差异表 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料、主要仪器与试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 ACTA1 氨基酸序列分析、系统进化树构建及蛋白质生物信息学分析 |
| 1.4 组织差异表达分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 ACTA1 基因全长克隆及序列分析 |
| 2.2 ACTA1 氨基酸序列同源性比对和系统进化树构建 |
| 2.3 ACTA1 蛋白结构分析 |
| 2.4 草鱼ACTA1 基因的组织差异表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 草鱼ACTA1 基因序列、氨基酸同源性及蛋白结构 |
| 3.2 草鱼ACTA1 基因的组织差异表达 |
| 4 小结 |
| 第五章 投饲蚕豆对草鱼肌肉和心脏组织p38MAPK-Actin信号通路及肌原纤维装配基因表达的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 养殖期间鱼体重变化 |
| 2.2 草鱼肌肉组织p38MAPK、MAPKAPK2、Hsp27及ACTA1 的时空表达分析 |
| 2.3 草鱼心脏组织p38MAPK、MAPKAPK2、Hsp27及ACTA1 的时空表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录:论文发表情况 |
| 致谢 |
（10）转NNVCP基因衣藻预防石斑鱼病毒性神经坏死病（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 鱼类病毒性神经坏死病(VNN)的研究进展 |
| 1.1.1 鱼类病毒性神经坏死病(VNN)的发现、命名及分类 |
| 1.1.2 VNN的地理分布、结构、理化性质 |
| 1.1.3 VNN的传播途径及危害 |
| 1.1.4 VNN的检测方法及防治 |
| 1.2 微藻的应用前景 |
| 1.3 研究的意义及技术路线 |
| 1.3.1 研究的目的意义 |
| 1.3.2 研究的技术路线 |
| 2. 经济藻株的保种、分离纯化和扩培 |
| 2.1 实验材料、仪器和试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器、试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 藻类的保种 |
| 2.2.2 藻类的分离 |
| 2.2.3 藻类的纯化 |
| 2.2.4 藻类的扩培 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 小结 |
| 3. 重组载体的构建 |
| 3.1 实验材料、仪器和试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器、试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 NNVCP基因的引物设计 |
| 3.2.2 构建pCAMBIA1302-NNVCP重组载体 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 小结 |
| 4. 细胞核表达载体转化莱茵衣藻CC425及鉴定 |
| 4.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器、试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 pCAMBIA1302-NNVCP载体转化莱茵衣藻CC425 |
| 4.2.2 转基因藻株的DNA的鉴定（李亚军等,2014;高寒等,2016) |
| 4.2.3 转基因藻株的RNA的鉴定 |
| 4.2.4 转基因藻株的RT-PCR |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 小结 |
| 5. 转基因藻株的保种、扩培和采收 |
| 5.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器、试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 转基因藻株的保种 |
| 5.2.2 转基因藻株的液态扩大培养 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 小结 |
| 6.海南石斑鱼苗病毒性神经坏死病的诊断 |
| 6.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器、试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 发病情况的调查 |
| 6.2.2 实验室检查 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 小结 |
| 7. 转NNVCP基因衣藻预防珍珠龙胆石斑鱼VNN实验 |
| 7.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器、试剂 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 转基因微藻混合饲料的制作 |
| 7.2.2 微藻混合饲喂石斑鱼 |
| 7.2.3 最佳麻醉浓的确定 |
| 7.2.4 NNV攻毒石斑鱼 |
| 7.2.5 转基因微藻防治VNN效果评价 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.4 小结 |
| 8. 讨论与结论 |
| 8.1 讨论 |
| 8.1.1 藻株的分离方法和培养方式 |
| 8.1.2 莱茵衣藻 |
| 8.1.3 转NNVCP基因衣藻预防珍珠龙胆石斑鱼的成效 |
| 8.2 展望 |
| 8.3 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 缩略词 |
| 2 部分实验操作步骤 |
| 2.1 从大肠杆菌中抽提质粒（上海生工） |
| 2.2 组织病理切片制作的主要步骤（徕创生物） |
| 2.3 E.coli DH5a感受态细胞的制备 |
| 2.4 病毒DNA提取步骤 |
| 2.5 病毒RNA提取步骤 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、衣藻肌动蛋白基因的克隆及核苷酸序列分析（论文参考文献）
- [1]亚麻荠WRKY转录因子家族的鉴定及其介导盐胁迫响应的功能研究[D]. 宋亚楠. 山西农业大学, 2021
- [2]南极衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L隐花色素基因克隆及表达调控研究[D]. 张欣. 青岛大学, 2020
- [3]小球藻病毒启动子在莱茵衣藻中的转录活性分析[D]. 李红娇. 河北大学, 2020(08)
- [4]基于生物信息学结合荧光技术研究衣藻Dicer-like蛋白在microRNA生成过程的功能[D]. 孙婷. 深圳大学, 2020(10)
- [5]超折叠维纳斯黄色荧光蛋白及其在莱茵衣藻中表达的研究与分析[D]. 陈颖茜. 南京理工大学, 2020
- [6]莱茵衣藻BBSome组分蛋白BBS4的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备[D]. 周佳兰. 天津科技大学, 2020(08)
- [7]假根羽藻PSⅠ捕光天线序列测定及衣藻高光对PSⅠ光合色素影响的研究[D]. 刘明媚. 济南大学, 2019(06)
- [8]南极衣藻DNA光修复酶家族及其紫外辐射损伤协同修复机制[D]. 安美玲. 青岛大学, 2019(07)
- [9]草鱼MAPKAPK2、Hsp27、ACTA1基因克隆及投饲蚕豆对p38MAPK-Hsp27-Actin信号通路的影响[D]. 土志涵. 上海海洋大学, 2019(03)
- [10]转NNVCP基因衣藻预防石斑鱼病毒性神经坏死病[D]. 郭德权. 海南大学, 2019(03)