一、肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因(NS)5区cDNA的序列分析（论文文献综述）
常锦红,魏来,陶其敏,杜绍财,王豪,孙焱[1]（1997）在《逆转录套式聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒》文中提出目的建立敏感、特异的逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）方法，以检测中国人庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）感染。方法根据中国人感染ＨＧＶ者ＮＳ５区部分核苷酸序列分析结果，设计套式ＰＣＲ引物，用于ＨＧＶＲＮＡ的检测，并与用国外报道引物所作的一次ＰＣＲ和套式ＰＣＲ检测结果进行比较。结果共检测标本１３３份。以国外报道引物作一次ＰＣＲ和套式ＰＣＲ检出率分别为８．３％和１１．３％，作者建立的套式ＰＣＲ检出率为１８．０％，对部分ＰＣＲ产物进行序列分析证实为ＨＧＶ特异性基因。结论建立的方法可在中国人群中显着提高ＨＧＶＲＮＡ检出率。
常锦红,王豪,杜绍财,孙焱,陶其敏[2]（1998）在《聚合酶链反应检测HGV RNA方法的建立及应用》文中研究表明目的：了解我国不同人群中庚型肝炎病毒（ＧＢＶＣ／ＨＧＶ）感染的状况。方法：以ＮＳ５区序列分析为基础设计引物，建立聚合酶链反应方法，并对我国几个地区、不同疾病状况的２６８例患者进行庚型肝炎病毒核酸的检测。结果：有输血史的健康人群、ＨＢＶ和ＨＣＶ感染者及慢性非乙非丙型肝炎患者的ＧＢＶＣ／ＨＧＶＲＮＡ阳性率均高于自然人群，分别为１３．３％，１８．４％，１９．８％，８．９％，其中有明确血液暴露史者的检出率达２０．１％。结论：庚型肝炎在我国有广泛的流行，输血等肠道外途径为重要危险因素。
魏来,常锦红,陶其敏[3]（1996）在《肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因（NS）5区cDNA的序列分析》文中进行了进一步梳理通过逆转录-套式-聚合酶链反应,从2例肝癌患者血清中扩增出长994bp的庚型肝炎病毒（HGV）cDNA序列,聚合酶链反应（PCR）产物纯化后以双脱氧末端终止法从双向直接测定其序列。结果,所分离的2株HGV NS5区994bp核苷酸与国外已发表的3株HGV序列比较,同源性为87.21%～93.67%;2株间的同源性为93.92%。根据所测得的cDNA序列推导出其编码的313氨基酸序列,在氨基酸水平上本文报告的2株与国外发表的3株序列相比,同源性在94.25%～97.44%之间,2株之间为96.49%。在此区内发现有16个保守的脯氨酸残基及8个保守的半胱氨酸残基。结论:首次从肝癌患者血清中分离出2株HGV,其NS5区部分序列在核苷酸水平及氨基酸水平均较保守,与非肝癌患者血清中分离的HGV相比,变异不大。
许信刚[4]（2005）在《逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究》文中提出丙型肝炎病毒（HCV）是输血后非甲非乙型肝炎以及社区获得性肝炎的主要病原因子,目前全世界约有2 亿HCV感染者。HCV感染后缺乏有效的保护性免疫。目前对HCV感染尚未找到有效的治疗手段,因此需要提高治疗手段和发展有效的疫苗以控制HCV感染。HCV 为单股正链RNA 病毒,属于黄病毒科的成员。其基因组全长9.4kb,编码约3 000 氨基酸的多聚蛋白前体,在宿主及病毒蛋白酶的作用下,将其切割成3 个结构蛋白和7 个非结构蛋白,其中有2 个糖蛋白E1 和E2 为HCV的包膜蛋白。由于其位于病毒颗粒的最外侧,是宿主免疫系统攻击的主要目标,也是HCV 疫苗研究的首选抗原。近年来各国学者运用基因重组技术对HCV包膜糖蛋白的结构和功能进行了深入研究,以期进一步理解HCV感染后慢性化机制及病毒与宿主相互作用的关系,并寻找有效的保护性疫苗及治疗药物。Chiron公司的研究人员在1994 年首先报道了用哺乳动物细胞表达的E1 和E2 蛋白共免疫大猩猩,可诱生出中和抗体能抵抗同源病毒攻击的。他们认为在大猩猩免疫试验中,E2 区尤其是E2 的高变区之一HVR1（386～411 位氨基酸）对于诱导中和抗体的保护性免疫具有更为重要的作用。但是由于E2 区的高度变异性,针对某种型或株的抗体往往对其他型或株的HCV 无中和作用。而且有的学者认为抗E2 抗体对病毒感染的预防作用仍难以肯定。由于尚未建立HCV 体外复制系统,病人血清中的HCV 病毒粒子又极难纯化,迄今为止的HCV被膜蛋白研究几乎完全以各种系统中表达的重组蛋白为对象。有证据表明,只有哺乳动物细胞中表达的E1、E2 糖蛋白才能较好地反映天然HCV病毒粒子上被膜蛋白的构象和性质。但就目前而言,E1 及E2 糖蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,以及表达蛋白的纯化,仍然是世界范围内都未攻克的难题,严重影响了被膜蛋白相关研究及其临床应用的进展,说明HCV 中和抗体的研究还面临许多困难。本研究由三部分构成,第一部分是用逆转录病毒载体将HCV囊膜蛋白基因整合到SP2/0 细胞基因组中,在SP2/0 细胞的细胞膜上成功表达了HCV 囊膜蛋
曹明媚[5]（2004）在《庚型肝炎病毒作为复制型基因治疗载体及小干扰RNA对病毒表达复制抑制作用的研究》文中研究表明第一部分 HGV作为复制型基因治疗载体的实验研究 庚型肝炎病毒（hepatitis G virus，HGV）是单正链的RNA病毒，长约9.4Kb，含一个开放读码框架，编码2900左右的氨基酸。病毒具有细胞亲嗜性，分别存在着淋巴细胞和肝细胞亲嗜株，本室建立的HGV克隆株经初步实验证实其可能是肝细胞亲嗜性的。HGV与HCV同属于黄病毒家族，其基因组结构和复制机理也非常相似。用外源基因neo代替HCV的结构基因区，并插入ECMV IRES直接翻译HCV的非结构基因区，由此建立的HCV亚基因组复制子能够在体外培养细胞中自主持久复制和表达。因此，我们尝试将HGV基因组进行适当改造，用外源报告基因或治疗基因代替HGV的结构基因，并插入筛选标志抗性基因neo，两者间直接用ECMV IRES连接，保留HGV的非结构基因，由此建立HGV亚基因组复制子，研究其在稳定表达HGV结构蛋白的体外培养细胞中的复制、表达和病毒的包装，探索将病毒构建成能自主复制并且具有肝组织靶向性的一类新型载体，以期用于肝病的基因治疗。 1、建立稳定表达HGV结构蛋白的细胞株 以pHGVqz质粒为模板，用PCR方法扩增出HGV全长结构基因（包括HGV 5’NTR区）约2.3Kb的片断，然后插入到表达载体pVAX1.0中，并在结构基因的下游插入筛选标志潮霉素（hygromycin）基因，构建成重组真核表达载体。用脂质体DOTAP介导法将重组载体转入人肝癌细胞Huh7，转染的Huh7细胞用潮霉素筛选获得抗性克隆HuhEH。RT-PCR证实HGV结构基因在mRNA水平有转录，Western blot检测证实HGV结构蛋白能在Huh7细胞中表达，表达的HGV结构蛋白E2能与HGV E2 MAb发生特异性反应，在45kDa处有一特异性条带，提示表达的HGV结构蛋白是经过剪切的，并且N端有糖基化修饰。用HGV RNA阳性血清行Western blot检测证实在45kDa和大于66kDa处均有不同于对照细胞的条带。 结论：构建的重组载体能在人肝癌细胞Huh7中正确表达和修饰，Huh7细胞能作为HGV复制的合适宿主细胞，且表达的HGV结构蛋白有免疫原性，能与HGV E2 MAb和HGV RNA阳性血清发生反应，并证实HGV结构蛋白在被酶切前有一中间体存在。 2、HGV亚基因组复制子（HGVrepEGFP、HGVrepTNF）在人肝癌细胞Huh7中的复制和表达第二军医大学博士学位论文中文摘要 首先采用重益延伸PCR方法将HGV的5’NTR区与HGV多蛋白N端约10个氨基酸（至475nt）的cDNA片断和报告基因EGFP或者治疗基因TNF一a进行拼接。然后用酶切连接的方法将此片断与抗性选择基因刀eo相连，此两者基因片断用IRES连接。用重益延伸PCR和酶切连接方法将dNSZ一NS3一NS4一NSS一3’NTR区拼接扩增，并用重叠延伸PCR方法在此片断的3.端连上HDv抗基因组核酶（Ribozyme），然后用酶切连接的方法与前两个基因片断相连接。将此片断插入到转录载体PGEM一3zf（+）中。用T7 RNA po lymerase转录出HGVrepEGFP和HGVrepTNF RNA，用脂质体DoTAP将RNA导入到Huh7细胞中，然后用G418进行筛选，获得了G418抗性细胞克隆，初步证实HGVrepEGFP和HGVrepTNF能够在Huh7细胞中表达。 用HGV阳性血清的Western blot检测发现在约为 69kDa处有一特异性的不同于对照细胞的条带，与推算的和文献报道的HGV NS3、NSSB蛋白大小基本一致，证实HGVrepEGFp和HGvrepTNF能够在Huh7中表达毗v非结构蛋白。用链特异性RT一PCR方法在转染细胞中可检测到HGvrepEGFP和HGVrepTNF正、负链RNA的存在。细胞自建株后每3一5天传一次代，可传代20余次，HGVrepEGFP株的细胞仍能存活且传代细胞中仍能检测到正、负链RNA， HGVrepTNF株在传代8代后多数细胞发生死亡，提示细胞表达的TNF一a致使人肝癌细胞Huh7发生了凋亡。Northernblot实验也分别在转染细胞中检测到了HGvrepEGFP和HGVrepTNF正、负链RNA。 转染HGVrepTNF复制子的细胞用TNF一a ELisA检测试剂盒检测到细胞培养上清中有TN下一。的表达，浓度为743P砂ml。用克隆形成实验、细胞生长增殖能力测定实验结果则显示转染了HGvr即TNF复制子的Huh7细胞生长速度减慢。L929细胞生物活性检侧结果显示细胞培养上清中TN卜a的活性单位约为36U/m1。PI染色流式细胞仪检测证实转染的Huh7细胞发生了明显的凋亡。提示HGvrepTNF复制子能够表达有活性的TNF一a. 对挑取的几个克隆株RT一PCR扩增HGV的NS3区，据测序结果推导的氨基酸序列显示HGV亚基因组复制子在NS3区并没有像Hcv一样发生有利于病毒RNA高效复制的特异性突变。 将HGVrepEG即复制子用Lipofeet二ine 2000脂质体转染法转染稳定表达HGV结构蛋白的Huh7细胞株HuhEH。用G418和潮霉素同时筛选获得抗性克隆，细胞克隆扩增，链特异性RT一PCR和RNase敏感实验鉴定后，细胞经胰酶消化，收集、固定、染色后电镜观察，结果显示可检测到病毒样颗粒的存在。 结论:构建的HGV亚基因组复制子HGVrepEGFP和HGVrepTNF能够在体外培养细胞中自主持久复制和表达，能够在表达结构蛋白的细胞中包装出病毒颗粒，提示将HGV改造成基因治疗病毒载体是可行的。第二军医大学博士学位论文中文摘要第二部分小干扰RNA对庚型肝炎病毒表达复制抑制作用的研究 RNA干扰（RNAi）是由小干扰RNA（5 iRNA）引发的生?
曾艳丽[6]（2012）在《1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立》文中认为研究背景和目的丙型肝炎病毒（HCV）引起的急、慢性肝病表现为很宽的临床谱,从症状轻微到肝功能衰竭,慢性丙型肝炎患者有20%-30%在10-30年后将进展为肝硬化甚至肝癌。目前全球约有一亿八千万人口感染HCV。HCV的流行率高,慢性化率高,抗HCV筛查不能可靠的避免其经输血途径传播,又无疫苗预防。丙型肝炎治疗的关键是抗病毒治疗,国际上公认的治疗方案为：聚乙二醇化干扰素（PEG-IFN）联合利巴韦林,平均持续病毒学应答率（SVR）为56%左右。研究发现不同的基因型抗病毒治疗方案、疗程不同,且抗病毒治疗的应答率也存在差异。如HCV1b型患者应用PEG-IFNa与利巴韦林（1000mg/d）联合治疗至少需要48周,SVR约为15%-50%；HCV2/3型患者应用PEG-IFNa与利巴韦林（800mg/d）联合治疗仅仅需要24周,SVR约为80%。我国主要的HCV流行基因型为1b型,但值得注意的是,即使均为HCV1b型感染者,对干扰素治疗的结果也可截然不同。部分HCV1b型患者经抗病毒治疗后可达到SVR甚至痊愈,另一部分则疗效极差。虽然近期两个新型的蛋白酶抑制剂Boceprevir和Telaprevir已经被批准用于临床,但其远期疗效还有待评价。因为HCV感染呈现慢性、隐匿的特点,随着病程的进展,丙肝相关性终末期肝病患者的数量在未来二十年内将继续增长,迄今仍是世界性的医学、社会难题和经济负担。为何部分HCV1b型患者对抗病毒治疗反应良好,能够痊愈,另一些则反之?究竟哪些因素与丙型肝炎患者抗病毒治疗疗效预测的关系密不可分?如何更有效、更合理地使用干扰素进行抗病毒治疗、提高丙肝抗病毒治疗的疗效?这是目前慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗研究的热点和难点。HCV是单股正链RNA病毒,属于黄病毒科,全长约9.6kb,包括一个大的开放阅读框及两侧的5,和3’非编码区,可以编码约3000个氨基酸的前体多聚蛋白。翻译后,前体多聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成10个具有独立功能的HCV蛋白,根据功能的不同分为结构蛋白（C、E1、E2、p7）和非结构蛋白（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。因为HCV所依赖的RNA聚合酶缺乏校正功能,其基因组序列呈高度异质性,不同的分离株在全基因序列上差异达30%-35%。一直以来,由于缺乏实用的动物模型和有效的HCV体外细胞培养系统,严重影响了HCV复制机制、疫苗研制及新HCV防控策略的研究。1999年,HCV体外细胞培养研究取得了阶段性进展,Lohmann等构建了带新霉素磷酸转移酶基因作为筛选标志的HCV亚基因组（删除了结构基因,从C到NS2及P7）复制子,这是一个双顺反子结构,第一个顺反子由HCV IRES引导,第二个顺反子（NS2-5B）由插入的脑心肌炎病毒（EMCV） IRES引导。用体外转录的RNA转染Huh7细胞,在硫酸新霉素（G418）的筛选下,获得了少数细胞克隆。复制子刚转染细胞后,其复制子水平较低,随着不断传代,其RNA复制水平明显提高,经序列分析表明高复制的复制子发生了较多的适应性突变。经实验证实,重要的适应性突变有10余处,散布于整个多蛋白编码区,尤其以表达病毒RNA聚合酶的NS5A区较集中,且不同的适应性突变具有协同效应。适应性突变是复制子在特定细胞内培养取得成功的关键之一,它通过增强宿主细胞活化分子与其结合以及去除细胞抑制因子与其相互作用而有利于复制子的复制和表达。随后,一些其他基因型的HCV复制子,如HCV1a （H77）、2a （JFH1）等复制子均被报道。复制子部分揭示了HCV与宿主细胞间复杂的相互关系,对HCV的基础研究和抗病毒药物筛选具有重要意义,特别是在新的抗HCV药物如NS3与NS4蛋白酶抑制剂、NS5B多聚酶抑制剂的研发中的发挥了重要作用。然而由于不含结构基因,非结构基因复制子在细胞培养系统中不能产生完整的HCV颗粒,难以满足深入研究HCV生物学特点、特别是针对结构基因的保护性抗原的鉴定和疫苗研制,以及全方位筛选抗病毒药物的需要。因此,很多研究者致力于建立一个可以产生感染性HCV病毒颗粒的细胞培养系统。2005年,Wakita等、Zhong等和Lindenbach等分别成功地建立了HCV2a型全长基因体外细胞培养系统。而且由此产生的病毒颗粒可在细胞内连续传代而感染性不会减低,获得了稳定的、可产生高效感染性病毒颗粒的体外细胞培养系统。在此基础上,HCV细胞培养技术取得了突飞猛进的发展并广泛的应用于相关研究中。虽然近年来这些方面的研究有很大进展,但是仍然有很多亟待解决的问题。目前已经建立的有效地HCV体外培养系统,基本都是在JFH1（2a型）毒株的基础上发展起来的,而我国丙型肝炎的主要流行毒株是1b型,与国外建立的细胞培养系统所用的HCV基因型不同。HCV1b型全基因细胞培养系统难点较多,研究进展较缓慢,但不少学者也在此方面做了很大努力。2005年Heller T等构建了HCV1b基因型全长cDNA,两端加有核酶后克隆至真核表达载体,转染Huh7.5细胞,可以检测到病毒的复制,蛋白的表达,并能够获得感染性病毒颗粒,但是该系统产生的病毒颗粒感染性很不理想。国内一些学者将含1b型HCV全长cDNA的重组质粒和高效表达T7RNA聚合酶的vTF7-3共转染细胞,通过vTF7-3表达T7RNA聚合酶的辅助作用,可使细胞高效产生HCV RNA,并发现病毒颗粒的产生。但该系统生产的重组HCV颗粒中含有痘病毒的污染,给病毒颗粒的分离纯化带来不便,且vTF7-3也有一定的细胞毒性,在以痘病毒为辅助病毒的体系中,细胞很快死亡,故在每次培养HCV是,都须重复进行细胞培养、转染重组质粒和感染痘病毒等操作,过程繁琐,实验安全性也存在一定的隐患。此外,这两个体系都需要辅助质粒或重组病毒提供凡是启动子激活物和加工因子,HCV核酸的初始复制也非RNA病毒复制的自然状态,而是以质粒DNA为模板的转录,故最为HCV复制机制和抗HCV药物的筛选平台,其作用受到限制。至今,国内尚未见到关于HCV1b型细胞培养系统完全成功的报道。本研究旨在通过HCV完整半基因组扩增测序的方法分析病毒基因变异对PEG-IFN联合利巴韦林治疗1b亚型慢性丙型肝炎疗效的影响,试图阐明病毒基因组变异对干扰素疗效方面发挥的作用；并在此基础上,用已发生适应性突变的HCV1b复制子来插入HCV1b结构基因以建立我国流行株1b型全基因HCV细胞培养系统,为我国丙型肝炎发病机制的研究,HCV结构基因中保护性抗原的鉴定及疫苗的研制、研发抗HCV新药和新疗法、高通量筛选已见临床疗效的药物、药物单体,探索新的联合用药方案以提高疗效,并阐明疗效机制提供良好的平台。第一章HCV5’端半基因组的扩增及其序列变异对PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC疗效的影响研究方法收集慢性丙型病毒性肝炎患者治疗前血清标本,纳入研究的61例患者诊断符合《丙型肝炎防治指南》抗病毒治疗标准,所有患者均为1b型HCV病毒感染,并完成PEG-IFN联合RBV抗病毒治疗48周且随访24周,其中获得持续性病毒学应答（SVR组）的患者35例,未获得持续性病毒学应答（Non-SVR组）的患者26例。采用长片段RT-PCR法扩增包括完整核心蛋白至NS3蛋白的HCV5’端5.2kb半基因组序列,测序后分析病毒基因组序列变异与抗病毒疗效之间的关系。统计学分析：计量资料采用独立样本t检验,计数资料采用X2检验；SVR组和Non-SVR组总氨基酸变异个数和特异性氨基酸变异个数的比较采用Mann-Whitney U检验；而特异性变异占总氨基酸变异的百分比使用X2检验。两组熵值的比较采用Mann-Whitney U检验；平均基因组距离采用独立样本t检验。P值小于0.05时有统计学差异,所有统计学分析使用SPSS13.0软件。结果中国患者治疗前HCV的氨基酸变异情况可以影响PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC的疗效。我们分别比较了两组患者1b型HCV半基因组氨基酸变异总数和特异性氨基酸变异情况,中国CHC患者治疗前体内病毒氨基酸的变异性与抗病毒疗效相关,且氨基酸变异主要集中在p7,NS2和NS3蛋白。SVR组患者P7、NS2和NS3蛋白的特异性氨基酸变异个数（P=0.036,P<0.001和P=0.006）、特异性氨基酸变异的比例（P<0.001,P<0.001和P<0.001）、熵值(（P=0.019,P=0.023和P=0.046）以及基因组距离(（P<0.001,P<0.001和P=0.011）均显着高于Non-SVR组。第二章HCV1b replicon细胞培养系统的建立研究方法我们以两个获赠的1b复制子质粒为基础,构建在Huh7.5.1细胞内能够长期、稳定、高拷贝复制的亚基因组复制子细胞培养系统。其一是1b-G复制子质粒,该复制子含有HCV Conl分离株NS3-NS5B非结构基因的cDNA序列,在NS5A区含S2204I适应性突变。其二是lb-H复制子质粒,该复制子与1b-G相比,在新霉素抗性基因的上游插入了一个荧光素酶报告基因以方便检测,且其适应性突变位于NS3区的E1202G和T1280I,以及NS4B区的K1846T。具体方法是,将Scal酶切的线性化1b-H复制子和1b-G复制子质粒为模板,在T7RNA聚合酶的作用下,体外转录出复制子RNA,然后将此RNA转染至Huh7.5.1细胞,以含800μg/ml G418的培养基进行筛选,根据克隆形成情况对克隆进行分离培养,然后用RT-PCR、间接免疫荧光、Western Blot和荧光素酶检测等方法对克隆细胞中的HCV核酸和蛋白进行检测。结果用1b-H和1b-G复制子转染Huh7.5.1细胞后,都获得了G418抗性克隆,并在最终分离出的细胞克隆中,检出HCV复制子特异性的RNA和NS5A蛋白。由于lb-H复制子中含有荧光素酶报告基因,我们通过检测报告基因的表达活性来分析病毒的复制水平,代替繁琐的RT-PCR和Western Blot检测方法,较好地方便了实验研究。第三章我国N型肝炎流行株1b型全基因HCV细胞培养系统的建立研究方法选取两例“难治性丙肝”患者血清,扩增HCV5’端半基因组序列并构建克隆,选取15-20个克隆进行测序分析病毒准种的优势株；选取优势克隆株质粒,通过重叠延伸PCR的方法引入合适的酶切位点,再通过酶切连接的方法,以完整的Core-NS2区基因替换复制子中的外源性基因序列,从而构建HCV1b全长cDNA重组质粒；然后将全长cDNA克隆经Scal酶切线性化,在T7RNA聚合酶作用下体外转录制备全长HCV RNA,并转染Huh7.5.1细胞,荧光定量RT-PCR检测细胞上清和细胞内HCV RNA, Western Blot方法检测病毒蛋白的表达,间接免疫荧光法检测病毒蛋白的表达以及含病毒细胞上清的感染性。结果本研究在lb replicon的基础上,将来源于中国患者血清病毒的完整结构基因（core-p7）和部分非结构基因（NS2及NS3）插入复制子,成功构建了四个不同的1b型HCV全长cDNA克隆。将这些1b型HCV RNA转染Huh7.5.1细胞后,虽然未能成功建立感染性细胞培养系统,却能检测到低水平的病毒RNA的复制。经比较后发现,我们构建的1b-H-P2、1b-H-80和1b-G-P2、1b-G-80在非结构基因区适应性突变的不同导致它们RNA复制水平有所不同,在一定程度上也说明不同的适应性突变位点之间存在协同作用。结论本研究表明中国患者治疗前HCV的氨基酸变异情况可以影响PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC的疗效,氨基酸变异主要集中在p7,NS2和NS3蛋白。完整扩增HCV5’端半基因组为构建HCV全长细胞培养系统打下了基础,并且序列分析的结果为HCV蛋白与干扰素抵抗的体外研究实验提供了线索。同时我们成功建立了针对我国人群易感染的HCV lb亚型体外复制子的细胞模型,不仅为本实验室HCV致病机制的研究及对抗病毒药物的评价提供了一个新的途径,也为下一步建立1b型HCV全长细胞培养系统提供了一个良好的技术平台。在1b-H和1b-G复制子的基础上,我们成功构建了4个1b型HCV全长cDNA质粒,虽然未能成功建立感染性细胞培养系统,却能检测到低水平的病毒RNA的复制。分析原因,可能是由于病毒在装配和释放的过程中,某些环节存在未能阐明的问题,导致产生的病毒颗粒感染活性低下；也可能是因为所构建的cDNA还存在某些缺陷,不能产生完整的病毒颗粒。为了排除后一种原因,我们使用已经明确在痘病毒辅助系统辅助下能有效复制并产生感染性病毒颗粒的1bHCV cDNA为模板,重新构建1b型HCV全长cDNA,转染细胞后仍然未能获得感染性病毒颗粒。此结果表明,我们构建的1b型全长cDNA不具有感染性与基因序列缺陷无关。病毒在细胞中能否成功复制与装配,是病毒与细胞相互选择的结果,但细胞环境复杂,蛋白与细胞因子众多,因此影响1b型HCV感染性细胞培养系统成功建立的因素有待进一步研究。
潘修成,魏来,吴文漪[7]（1999）在《庚型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增》文中提出分别在庚型肝炎病毒 （ＨＧＶ） 基因５′端非编码区 （５′ＵＴＲ）、非结构 （ＮＳ） ３ 区及非结构 （ＮＳ） ５ 区设计套式引物，建立逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ） 检测血清ＨＧＶ ＲＮＡ。在２９９份不同血清标本中ＨＧＶＲＮＡ 阳性者４１ 例，基于５′ＵＴＲ、ＮＳ３ 区及ＮＳ５ 区引物ＰＣＲ的阳性率分别为８７８％ 、８０５％ 和９７６％ 。本研究结果表明根据中国株ＨＧＶ基因ＮＳ５区部分序列设计引物建立的ＲＴｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ更灵敏、实用。可用于对ＨＧＶ 感染流行病学及临床的研究。
任浩[8]（2001）在《新型肝炎相关病毒（HGV和TTV）的实验研究》文中研究指明庚型肝炎病毒（HGV）和输血传播性病毒（TTV）是分别于 1995和 1997年鉴定的新型肝炎相关病毒。HGV为黄病毒家族中的单正链RNA病毒，全长约9．4Kb，从5′到3′依次编码5′－NCR、C、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B和3′-NCR。C区和 E区编码核心蛋白和包膜蛋白，NS3区编码病毒超 Ⅱ组解旋酶、锌蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，NS5B编码RNA依赖的RNA聚合酶。几年来，对于HGV的基因组结构与传播途径研究的比较清楚，但仍存在如下问题亟待解决：1．HGV的致病性：由于HGV是在非甲-戊型肝炎患者中发现的，便认为是一个新的肝炎病毒，但随后的研究对其致病性提出了争议，因此，HGV的致病性及致病机制尚未完全明确。2．HGV的组织亲嗜性：对HGV的复制部位持有两种意见，一种认为HGV具有嗜肝性，另一种认为有嗜淋巴性，多数学者倾向后一种看法。3．HGV的细胞感染模型；有研究表明HGV能够在PBMCs、有干扰素抗性的Daudi细胞（B细胞淋巴瘤细胞）、PH5CH、MT-2C中复制和表达，但仍未建立稳定传代感染的细胞模型。TTV为单负链DNA病毒，目前的研究表明TTV在感染者体内可能存在两种形状的基因组，一种是线状，一种是环状，多数研究表明为后一种。TTV虽为DNA病毒，但其基因组结构具有显着的遗传学多样性，可导致不同的变异株，不同变异株导致疾病产生的能力也不同。本研究分别对HGV和TTV进行了一些基础研究。 第一部分庚型肝炎病毒（HGV）的研究 本教研室曾经构建了HGV全基因组cDNA克隆pHGVqz，并在GenBank注册 （注册号为AF081782）。为了进一步阐明HGV的致病性和复制部位，本研究在获得HGV全基因组 cDNA克隆的基础上，体外转录获得了全长 HGVRNA基因组，研究了该RNA转录体对恒河猴的致病性，并初步建立了HGV感染的细胞模型，主要工作如下。1、HGVRNA转录体感染恒河猴的研究 以HGV全长cDNA基因组克隆为模板，体外转录制备了全长HGV RNA转录体，肝内注射感染BK15和BY1两只恒河猴，取其感染后阳性血清分别感染BS1和BM1恒河猴，然后取BM1阳性血清再感染BB1恒河猴。 感染后每周或隔周抽血检测血清 ALT水平、HGV RNA和抗-HGV。除 BS1外，其它实验猴血清ALT均出现不同程度的升高，但存在个体差异。BK15和BY1分别于感染后第1周和第 8周血清 HGV RNA阳转，且持续存在达 27周之久，其余 3只传代感染的恒河猴血清 HGV RNA也均阳转。在五只实验猴血清中均检测到了抗-HGV。定期手术取肝组织检测组织病理变化及 HGV E2蛋白在肝细胞中的表达，所第二军医大学博士学位论文 中文摘要有实验猴肝组织病理检查均呈现轻度肝炎样变。以MAb做免疫组化检测的结果表明，HGV EZ蛋白主要在肝细胞浆中表达，在心脏和脾脏细胞中亦有不同程度的表达，但存在个体差异。在BK15、BYI和 BMI肝组织中检测到了 InRNA的表达。透射电镜观察BK15实验猴肝细胞，发现两种病毒样颗粒，一种呈晶格状排列，直径约25－30urn；一种呈圆团状存在，直径约67urn。 以 HGV特异性的荧光标记探针定量检测 BKIS血清 HGV ILNA的动态变化，验证了血清HGV定性分析结果。定量检测了BK15和BSI的心、肝、胰、肾及BYI、BMI、BBI活检肝组织中HGV正、负链RNA，在除BSI之外的其它实验猴肝组织内均检测到了HGV正、负链RNA的存在，表明HGV能够在肝组织中复制。在BK15猴的心、肝和脾脏细胞中均检测到了HGV的复制，说明在该实验猴体内可能存在嗜肝性和嗜淋巴性双重亲嗜性HGV。而在BSI肝组织末检测到HGV的复制，却在脾脏中检测到高水平的HGV复制，在此猴体可能仅有淋巴亲嗜性HGV株。 结论：恒河猴对HGV敏感，可作为实验动物模型。HGV可在恒河猴中传代感染并引起轻度的肝炎样病变。HGV可以在恒河猴肝组织复制，亦可在心脏和脾脏中复制。2、RGV细胞模型的初步建立 利用LipofeCtamin将HGV RNA转录体转染HepGZ细胞，RTICR检测培养细胞和上清中HGV正、负链NA，在转染后24h便可在培养上清中检测到HGV负链RNA。以此上清感染新鲜HepGZ细胞，每36天传代一次，共传代20余次，细胞至少能够存活90天。传代细胞及培养上清中均可检测到HGV正、负链NA。制备细胞爬片，免疫组化检测到 HGV EZ蛋白在细胞中的表达。SDS．PAG和 Westemblot亦检测到 HGV EZ蛋白在感染细胞中的表达。 取HGV RNA阳性培养上清感染新鲜HepGZ细胞，上清中检测到负链RNA时再感染新鲜细胞，共传代感染一次，传代感染的细胞中均可检测到HGV的复制。 HGV感染的HePGZ细胞经冻存后再复苏，在培养上清和细胞内仍能检测到HGVRNA。 结论：＊印GZ细胞不仅对HGV易感，而且可以支持HGV的复制增殖。3、HGV NSS基因在昆虫细胞中的表达与鉴定 以 pHGVIwh6重组质粒为模板，PCR扩增 HGV NSS部分基因片段，BalnHI和Kpn酶切后定向克隆至pPROEX HTa载体进行序列测定。将正确的基因片段克隆至转座载体 pFastBac HTa，获得重组转座质粒 pFHTNSS。转化含有 bacmid和辅助质粒的D
杨晓钰[9]（2016）在《庚型肝炎病毒与HIV、HCV相互作蛋白的筛选及E2与LTα蛋白互作验证》文中提出庚型肝炎病毒（GB Virus C,GBV-C）属于黄病毒科、Pegivirus病毒属,是一种单股正链RNA病毒,其基因组特征与丙型肝炎病毒较为相似,全长约9.4kb主要编码七种蛋白（E1/E2/NS1/NS2/NS3/NS4/NS5）。GBV-C的传播途径与艾滋病病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）极为相似,主要通过血液传播、性传播和母婴传播,因此GBV-C与HIV和HCV的双重感染以及三重感染普遍存在。临床数据表明,GBV-C本身不致病,但与HIV-1共感染可以延缓HIV患者的疾病进程,其表现为降低了艾滋病患者的病毒载量,提高了其CD4＋细胞数,改善了 HIV患者的生活质量。此外,近期研究表明在丙型肝炎病毒导致的肝硬化患者中,GBV-C的共感染可以延缓肝硬化的疾病进程,同时我们前期的研究也发现在慢性HCV患者中,GBV-C共感染可以改善丙型肝炎患者的肝功能。因此,阐明GBV-C与HIV-1,GBVC与HCV之间的作用机制是该领域的研究热点,其中明确GBV-C与HIV-1和HCV之间相互作用的蛋白又是揭示其相互作用机制的关键。基于此,本论文利用第四代Gold酵母双杂交系统,就GBV-C对HIV-1和HCV相互作用的蛋白进行了初步研究。首先,我们选择云南主要7型GBV-C、CRF08BC型HIV-1和2a型HCV毒株和文库质粒pGAD-T7,利用RT-PCR、产物纯化、酶切、连接、转化等实验技术分别构建了 GBV-C编码的7种蛋白、HIV-1编码的16种蛋白和HCV编码的8种蛋白对应的文库重组质粒。该重组质粒分别经双酶切和测序验证均无移码突变和缺失突变,表明各质粒构建成功。其次,利用酵母毒性和自激活实验对构建成功的上述重组质粒进行了验证,结果表明,除HIV-1的Vpu、gp41存在自激活外,其余质粒均适合利用该酵母双杂交体系进行筛选。再次,利用酵母双杂交体系筛选结果表明,GBV-C与HIV-1互作蛋白为GBV-C E2与LT-α、GBV-C**与 HIV**、GBV-C**与 HIV**、GBV-C**与 HIV**和 GBV-C**与 HIV**;GBV-C与HCV互作蛋白为GBV-C**与**和**与HCV**;GBV-C自身互作蛋白为**与**、**与**、**与**和**与**。最后,分别利用免疫共沉淀技术（Co-JP）和双色荧光免疫法证实了 GBV-C E2蛋白与LT-α蛋白互作,进而利用荧光定量PCR技术证明E2与LT-α的表达呈正相关。综上所述,本研究针对我国主要流行的GBV-C、HIV-1和HCV毒株,利用酵母双杂交系统对GBV-C与HIV-1,GBV-C与HCV和GBV-C自身互作蛋白进行了筛选和初步研究,该结果首次发现GBV-C与HIV-1和HCV直接相互作用的蛋白,为今后深入展开GBV-C与HIV-1和GBV-C与HCV相互作用机制的研究提供了重要依据。
何忠平[10]（2001）在《庚型肝炎病毒E区部分基因克隆及序列分析》文中研究指明目的 建立适合我国国情的ＨＧＶ诊断方法及进一步研制预防ＨＧ的疫苗。方法 通过逆转录－套式－聚合酶链反应，从 １例输血后丙肝患者血清中扩增出 ７６８ ｂｐ的庚型肝炎病毒ｃＤＮＡ序列，反应产物克隆进 Ｍ１３ｍｐ１８噬菌体，阳性克隆抽提单链以双脱氧终止法双向测定其序列。结果 所分离的 ＨＧＶ Ｅ区 ７６８ ｂｐ的核苷酸与国内外已发表的 ４株ＨＧＶ序列比较，同源性分别为：Ｕ４４４０２ ８１．５％，Ｕ４５９６６ ８２．８％，Ｕ３６３８０ ８４．５％，Ｕ７５３５６ ９５．８％；根据所测得的 ｃＤＮＡ序列推导出其编码的氨基酸序列，在氨基酸水平上较４株ＨＧＶ序列同源性分别为：Ｕ４４４０２ ８７．７％，Ｕ４５９６６ ９１．５％，Ｕ３６３８０ ９４．１％，Ｕ７５３５６ ９５．８％。结论 证实国内存在丙型肝炎与庚型肝炎病毒合并感染；此序列与中国株 ＨＧＶ同源性较高，与美国株ＨＧＶ及西非株（ＧＢＶ－Ｃ）同源性相对较低；推导出的氨基酸水平的同源性高于核苷酸水平．ＨＧＶ Ｅ区较非结构区 ＮＳ３、ＮＳ５及 ５’非编码区（５’ＵＴＲ）的变异为大．
二、肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因(NS)5区cDNA的序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因(NS)5区cDNA的序列分析（论文提纲范文）
（4）逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 |
| 第一章 丙型肝炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 丙型肝炎的流行现状、致病性与危害 |
| 1.3 病毒的颗粒特征 |
| 1.4 丙型肝炎病毒各区段基因组的结构和功能 |
| 1.4.1 5’非编码区(5’UTR) |
| 1.4.2 核心蛋白区 |
| 1.4.3 包膜蛋白区 |
| 1.4.4 p7 蛋白 |
| 1.4.5 非结构蛋白 |
| 1.4.6 3'非编码区(3'UTR) |
| 1.5 丙型肝炎病毒囊膜蛋白的研究进展 |
| 1.5.1 包膜蛋白的结构 |
| 1.5.2 E2 蛋白在HCV入胞过程中的作用 |
| 1.5.3 E2 与机体免疫反应 |
| 1.6 丙型肝炎病毒基因的变异及分型 |
| 1.6.1 HCV 的变异机制 |
| 1.6.2 HCV 各基因的变异情况 |
| 1.6.3 HCV 基因分型研究 |
| 1.6.4 HCV 基因型的地理分布特点 |
| 1.6.5 HCV 基因分型的方法 |
| 1.7 HCV 的体外复制模型及感染动物模型研究 |
| 1.7.1 HCV 体外复制模型 |
| 1.7.2 黑猩猩 |
| 1.7.3 猴 |
| 1.7.4 树鼩 |
| 1.7.5 转基因和免疫耐受人鼠嵌合肝模型 |
| 1.8 丙型肝炎病毒感染的免疫反应 |
| 1.8.1 体液免疫应答 |
| 1.8.2 细胞免疫应答 |
| 1.9 丙型肝炎预防和治疗 |
| 1.9.1 干扰素(IFN) |
| 1.9.2 病毒唑 |
| 1.9.3 LAK 细胞治疗 |
| 1.9.4 熊去氧胆酸治疗 |
| 1.9.5 免疫调节剂 |
| 1.9.6 联合用药 |
| 1.9.7 中医中药 |
| 1.9.8 丙型肝炎预防 |
| 1.10 丙型肝炎疫苗研究 |
| 1.10.1 重组HCV 蛋白质疫苗 |
| 1.10.2 HCV 基因疫苗 |
| 1.10.3 HCV 融合基因疫苗 |
| 1.10.4 丙肝肝炎口服活菌苗 |
| 1.10.5 丙肝疫苗研制面临的问题 |
| 1.11 丙型肝炎病毒单克隆抗体(HCV-McAb)的研究 |
| 1.11.1 鼠源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.2 人源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.3 HCV单克隆抗体的意义及其发展前景 |
| 1.12 丙型肝炎病毒的实验室诊断研究进展 |
| 1.12.1 血清抗-HCV 抗体检测 |
| 1.12.2 HCV RNA检测用于HCV 感染的诊断 |
| 1.12.3 HCV 抗原的检测 |
| 1.13 丙型肝炎的研究展望 |
| 1.13.1 规范分型 |
| 1.13.2 细胞与动物模型 |
| 1.13.3 大容量噬菌体抗体库与肽库的构建 |
| 1.13.4 基因的表达调控 |
| 1.13.5 发病机制 |
| 1.13.6 HCV 受体 |
| 1.13.7 治疗 |
| 1.13.8 疫苗 |
| 试验研究 |
| 第二章 HCV 囊膜蛋白基因E1E2 的亚克隆及序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 含有HCV 囊膜蛋白基因组的质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 载体和菌种 |
| 2.1.4 PCR 引物 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收 |
| 2.2.3 纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接 |
| 2.2.4 新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法) |
| 2.2.5 连接产物的转化 |
| 2.2.6 重组质粒的提取 |
| 2.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.8 序列的计算机分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 2.3.2 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 2.3.3 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.3.4 测序结果 |
| 2.3.5 氨基酸序列分析结果 |
| 2.3.6 HCV E1E2 基因编码蛋白质的理化性质分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 细胞系 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 质粒 |
| 3.1.5 载体核菌株 |
| 3.1.6 培养基 |
| 3.1.7 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 逆转录病毒表达质粒的构建 |
| 3.2.2 逆转录病毒假病毒制备 |
| 3.2.3 逆转录病毒假病毒侵染SP 2/0 细胞及抗性筛选表达细胞 |
| 3.2.4 FACS 分析筛选膜表面表达E1E2 蛋白的SP 2/0 细胞 |
| 3.2.5 表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞免疫Balb/c 小鼠 |
| 3.2.6 小鼠采血及血清分离 |
| 3.2.7 血清抗体的检测 |
| 3.2.8 血清中和抗体检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 3.3.2 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.3.3 HCV E1E2 基因的核苷酸和相应的氨基酸序列 |
| 3.3.4 FACS 分析检测表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞 |
| 3.3.5 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 3.3.6 中和抗体检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 HCV 囊膜蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 细胞系 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫原的制备 |
| 4.2.2 动物免疫 |
| 4.2.3 骨髓瘤细胞的准备 |
| 4.2.4 脾淋巴细胞的准备 |
| 4.2.5 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 |
| 4.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.2.7 阳性杂交瘤细胞的克隆 |
| 4.2.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 4.2.9 小鼠腹水的制备 |
| 4.2.10 单抗中和活性的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 分泌特异单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 |
| 4.3.2 中和抗体检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小节 |
| 第五章 丙型肝炎病毒核酸疫苗的构建及动物免疫试验 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 细胞系 |
| 5.1.3 试验动物 |
| 5.1.4 基因组质粒 |
| 5.1.5 载体和菌株 |
| 5.1.6 培养基 |
| 5.1.7 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物的设计 |
| 5.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取 |
| 5.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 5.2.4 真核表达质粒的构建 |
| 5.2.5 重组真核表达质粒转染293T 细胞 |
| 5.2.6 FACS 分析表达E1E2 蛋白的293T 细胞 |
| 5.2.7 重组真核表达质粒的大量提 |
| 5.2.8 重组真核表达质粒免疫Balb/c 小鼠取 |
| 5.2.9 免疫小鼠采血及血清分离 |
| 5.2.10 免疫小鼠血清抗体的检测 |
| 5.2.11 小鼠血清中和抗体的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 5.3.2 重组pGEM-T Easy载体质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.3 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.4 重组质粒的测序结果 |
| 5.3.5 FACS 分析重组真核表达质粒转染293T 细胞瞬时表达 |
| 5.3.6 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 5.3.7 中和抗体检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小节 |
| 第六章 HCV 囊膜蛋白基因E1 和E2 原核表达载体的构建及表达 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 酶和试剂 |
| 6.1.3 阳性血清及酶标抗体 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 引物的设计与合成 |
| 6.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的鉴定 |
| 6.2.3 原核重组表达载体的构建与鉴定 |
| 6.2.4 E2 基因在大肠杆菌中的表达 |
| 6.2.5 表达蛋白的鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的PCR鉴定 |
| 6.3.2 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的酶切鉴定 |
| 6.3.3 重组原核表达载体序列测定 |
| 6.3.4 表达蛋白的SDS-PAGE 检测 |
| 6.3.5 表达蛋白的Western blot 检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词英汉对照表 |
| 致 谢 |
| 作者简介 |
（5）庚型肝炎病毒作为复制型基因治疗载体及小干扰RNA对病毒表达复制抑制作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 |
| 第一节 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 |
| 第一节 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 0.1 HCV的分子生物学特征 |
| 0.2 丙型肝炎病毒感染周期与病毒RNA的复制 |
| 0.3 HCV复制子系统 |
| 0.4 HCV全长细胞培养系统 |
| 0.5 支持HCV复制子及HCV全长基因组复制的细胞系 |
| 0.6 1b型HCV全基因细胞培养系统的研究现状 |
| 0.7 本研究的目的和意义 |
| 0.8 总结与展望 |
| 第一章 HCV 5’端半基因组的扩增及其序列对PEG-IFN/RBV治疗1 b亚型CHC疗效的影响 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 HCV 1b replicon细胞培养系统的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 我国丙型肝炎流行株1b型全基因HCV细胞培养系统的建立 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕/博士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）庚型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 血清标本 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物合成 |
| 1.4 逆转录套式PCR扩增HGV RNA |
| 2 结果 |
| 2.1 HGV基因不同区PCR的电泳结果 |
| 2.2 HGV基因不同区PCR扩增结果 |
| 2.3 随机挑取1份5′-UTR、NS |
| 3 讨论 |
（8）新型肝炎相关病毒（HGV和TTV）的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 庚型肝炎病毒（HGV）的基础研究 |
| 第一节 HGV RNA转录体感染恒河猴的研究 |
| 第二节 HGV细胞模型的初步建立 |
| 第三节 HGV NS5基因在昆虫细胞中的表达与鉴定 |
| 第二部分 输血传播性病毒（TTV）的研究 |
| 第一节 高危人群中TTV的感染率 |
| 第二节 TTV的克隆及进化分析 |
| 总结 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）庚型肝炎病毒与HIV、HCV相互作蛋白的筛选及E2与LTα蛋白互作验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 庚型肝炎病毒 |
| 1.2 庚型肝炎病毒的分子生物学 |
| 1.2.1 庚型肝炎病毒结构 |
| 1.2.2 庚型肝炎病毒基因结构 |
| 1.3 人类免疫缺陷病毒的分子生物学 |
| 1.3.1 人类免疫缺陷病毒的结构 |
| 1.4 丙型肝炎病毒的分子生物学 |
| 1.4.1 丙型肝炎病毒的结构 |
| 1.5 GBV-C、HIV与HCV的传播 |
| 1.5.1 GBV-C、HIV与HCV的传播途径 |
| 1.5.2 GBV-C、HIV与HCV的血液传播 |
| 1.5.3 GBV-C、HIV与HCV的性传播 |
| 1.5.4 GBV-C、HIV与HCV的母婴传播 |
| 1.6 GBV-C研究意义 |
| 1.6.1 GBV-C研究现状 |
| 1.6.2 GBV-C对HIV-1相互作用机制研究现状 |
| 1.6.3 GBV-C对HCV的临床意义 |
| 1.7 蛋白质相互作用研究方法 |
| 1.7.1 验证蛋白质之间相互作用实验的方法 |
| 1.7.2 数据库比对以及计算机分析预测蛋白质的相互作用 |
| 1.8 本研究的主要目的 |
| 1.9 技术路线图 |
| 第二章 HIV-1、HCV (J6/JFH-1-6u)及GBV-C-7文库质粒的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和毒株 |
| 2.1.2 主要设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 培养基及其他缓冲液的配制 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血清中HIV病毒总RNA提取 |
| 2.2.2 目的片段的克隆 |
| 2.2.3 目的基因与载体的双酶切 |
| 2.2.4 目的片段与载体连接 |
| 2.2.5 目的片段的连接与转化 |
| 2.2.6 重组质粒的提取及双酶切验证 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组质粒的双酶切验证及测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 构建文库所用毒株选择 |
| 2.4.2 文库片段划分 |
| 2.4.3 酵母双杂交文库构建方法选择 |
| 2.4.4 展望 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 酵母双杂交筛选与GBV-C诱饵相互作用的HIV-1、HCV及GBV-C 蛋白 |
| 3.1 试剂与材料 |
| 3.1.1 菌株及载体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 酵母的复苏及感受态的制备 |
| 3.2.2 质粒转化酵母感受态细胞、自激活及毒性检测 |
| 3.2.3 诱饵质粒与HIV、HCV及GBV-C文库的杂交实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 文库质粒的自激活毒性检测 |
| 3.3.2 相互作用蛋白的筛选 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 酵母双杂交体系选择 |
| 3.4.2 文库质粒自激活及毒性验证 |
| 3.4.3 阳性对照与阴性对照的设置 |
| 3.4.4 假阴性与假阳性的排除 |
| 3.4.5 酵母转化方法选择 |
| 3.4.6 互作蛋白分析 |
| 3.4.7 展望 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 GBV-C包膜糖蛋白E2与肿瘤坏死因子LTα相互作用验证以及E2对LTα mRNA量化关系研究 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 载体与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 缓冲液的配制 |
| 4.2.2 动物细胞表达质粒的构建 |
| 4.2.3 动物细胞内蛋白质相互作用的验证 |
| 4.2.4 GBV-C E2对LTαmRNA量化关系研究 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 重组质粒双酶切验证 |
| 4.3.2 蛋白定量结果 |
| 4.3.3 转染效率的优化 |
| 4.3.4 免疫共沉淀结果 |
| 4.3.5 激光共聚焦实验结果 |
| 4.3.6 细胞内总RNA提取结果 |
| 4.3.7 Jurkat细胞内LTα基因的PCR检测以及定量引物检测 |
| 4.3.8 相对定量结果 |
| 4.3.9 GBV-C E2对Jurkat细胞中LTα mRNA表达量的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 实验细胞的选择 |
| 4.4.2 蛋白定量的方法选择 |
| 4.4.3 转染的方法选择 |
| 4.4.4 免疫共沉淀抗体的选择以及抗体轻重链的去除 |
| 4.4.5 定量方法选择 |
| 4.4.6 定量实验结果分析 |
| 4.4.7 展望 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表论文目录 |
四、肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因(NS)5区cDNA的序列分析（论文参考文献）
- [1]逆转录套式聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒[J]. 常锦红,魏来,陶其敏,杜绍财,王豪,孙焱. 中华医学检验杂志, 1997(03)
- [2]聚合酶链反应检测HGV RNA方法的建立及应用[J]. 常锦红,王豪,杜绍财,孙焱,陶其敏. 北京医科大学学报, 1998(01)
- [3]肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因（NS）5区cDNA的序列分析[J]. 魏来,常锦红,陶其敏. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996(04)
- [4]逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究[D]. 许信刚. 西北农林科技大学, 2005(02)
- [5]庚型肝炎病毒作为复制型基因治疗载体及小干扰RNA对病毒表达复制抑制作用的研究[D]. 曹明媚. 第二军医大学, 2004(01)
- [6]1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立[D]. 曾艳丽. 南方医科大学, 2012(04)
- [7]庚型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增[J]. 潘修成,魏来,吴文漪. 临床检验杂志, 1999(05)
- [8]新型肝炎相关病毒（HGV和TTV）的实验研究[D]. 任浩. 第二军医大学, 2001(01)
- [9]庚型肝炎病毒与HIV、HCV相互作蛋白的筛选及E2与LTα蛋白互作验证[D]. 杨晓钰. 昆明理工大学, 2016(01)
- [10]庚型肝炎病毒E区部分基因克隆及序列分析[J]. 何忠平. 临床输血与检验, 2001(02)