一、巨噬细胞条件培养基对小脑皮质神经元生存的影响（论文文献综述）
徐琳[1]（2021）在《过度训练对小鼠海马中脑特异性microRNAs表达水平的影响》文中研究指明研究目的:运动负荷和恢复时间之间的不平衡可能会导致过度训练。本实验为探究过度训练对小鼠的认知能力的影响,及海马中相关的脑源性micro RNAs（miRNAs）的变化情况。验证miR-34a与脑源性神经营养因子（Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF）,及其受体酪氨酸激酶B（Tyrosine Kinase receptor B,Trk B）和p75神经营养素受体（p75Neurotrophin Receptor,p75）之间的动态表达模式。研究方法:选取90只8周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机分为对照（CON）、有氧训练（NT）和过度训练（OT）组。在训练后用递增负荷测试（ILT）和转棒测试评估其运动性能;Morris水迷宫实验和旷场实验来评价小鼠的认知能力。训练测评结束48h后,取小鼠海马组织,用RT-q PCR检测海马中miR-34a、miR-21、miR-124和miR-132的表达;用Western Blot来检测海马中BDNF、Trk B、p75的蛋白表达以及Trk B磷酸化水平。体外实验中验证BDNF是miR-34a的潜在靶点,探究过表达miR-34a对BDNF及其受体Trk B和p75的影响。研究结果:NT与OT在8周训练后体重均显着下降;ILT测试和转棒实验结果显示,OT运动性能下降,NT明显提高。Morris水迷宫测试表明NT的空间探索与定位记忆能力均显着优于CON和OT;旷场实验显示OT具有明显的焦虑倾向。OT小鼠海马中miR-34a表达明显上升,BDNF蛋白表达下降,且两者呈中度负相关。体外证明miR-34a降低BDNF及其受体Trk B的表达,而p75的蛋白表达上升。NT小鼠海马中BDNF和Trk B蛋白表达显着上升;而OT中p75的蛋白表达、Trk B的磷酸化水平显着高于NT和CON。结论:有氧训练能够提高小鼠的认知能力,过度训练未能提升小鼠认知能力,却表现出明显的焦虑倾向。OT小鼠训练后海马中miR-34a表达升高,BDNF蛋白表达显着降低,统计发现两者呈中度负相关。通过生物信息学预测和体外实验验证,发现miR-34a靶向降低海马区BDNF的表达,降低其受体蛋白Trk B的表达,却促进p75的蛋白表达,从而介导认知功能改变。
赵霞[2]（2021）在《硒蛋白S调控溶酶体稳态在鸡缺硒性小脑神经元凋亡中作用机理的研究》文中提出硒（Selenium,Se）是人和动物所必需的微量元素,广泛参与到机体的众多生物学过程中,发挥多种重要的生物学功能,研究表明缺硒可引起脑组织损伤。硒蛋白S（SELS）作为内质网定位硒蛋白之一,在保护脑损伤中发挥重要作用,高表达SELS可通过减轻内质网应激和炎症损伤来减轻脑损伤,抑制SELS表达则会加重脑损伤。溶酶体作为细胞“消化中心”在维持细胞内稳态发挥关键作用,许多退行性神经疾病都存在溶酶体功能紊乱。研究发现缺硒可引起溶酶体稳定性和SELS表达降低。然而溶酶体稳态失衡是否参与缺硒性脑损伤,SELS是否调控溶酶体功能及稳态尚不清楚。基于此,提出缺硒通过降低SELS表达调控溶酶体稳态失衡引起小脑细胞凋亡的科学假设。为阐明这一假设,本研究在建立鸡缺硒性小脑损伤模型、缺硒鸡胚脑神经元模型、SELS敲低鸡胚脑神经元模型及氧化应激抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、CTSB抑制剂E-64及CTSD抑制剂Pepstatin A处理SELS敲低鸡胚脑神经元模型基础上,应用ICP-MS法、病理组织学观察、免疫荧光、Tunel、转录组学、RT-PCR、Western Blot及流式细胞术等方法,对金属离子稳态、病理形态学、mRNA转录组、抗氧化水平（CAT、GSH-Px、SOD、T-AOC、ROS、H2O2、LPO及MDA）、内质网应激相关指标（GRP78、IRE1、XBP1、PERK、ATF4和ATF6）、溶酶体相关指标（pH、ATP6V1A、ATP6V1B2、ATP6V1D、CTSB、CTSD及MCOLN1）及自噬相关指标（LC3-2、P62）、凋亡、凋亡相关指标（BCL2、BAX、CAS9及CAS3）等进行检测,结果表明:（1）病理组织学观察显示缺硒导致小脑颗粒层变薄,小脑白质增多,浦肯野细胞减少甚至消失、嗜酸性浦肯野细胞增多,浦肯野细胞层中神经纤维堆积缠结,颗粒层神经纤维杂乱稀少,尼氏体数量减少。免疫荧光及Tunel结果显示,缺硒导致小脑α-syn聚集及细胞凋亡。（2）金属离子检测结果显示,缺硒导致鸡小脑组织中K、Fe、Zn、B、Ni、Hg和Sb含量降低,Ca、Cr、Mo、V和Cd含量增加,揭示缺硒影响鸡小脑组织中金属离子稳态。（3）mRNA转录组分析显示,缺硒导致小脑组织中421个基因差异表达,其中171个表达上调,250个表达下调,GO及KEGG富集分析发现差异变化基因与神经功能、抗氧化、金属离子、溶酶体及凋亡等密切相关。（4）缺硒引起小脑及脑神经元SELS mRNA和蛋白表达水平降低,内质网应激相关基因GRP78、XBP1、ATF4和ATF6 mRNA表达水平,GRP78、IRE1、XBP1、PERK、ATF4和ATF6的蛋白表达水平升高,敲低SELS导致鸡胚脑神经元内质网硒蛋白SELN和DIO2的mRNA水平升高,SELT和SEP15的mRNA水平降低,同时升高GRP78、IRE1、XBP1、PERK、ATF4和ATF6的蛋白表达水平,表明SELS表达降低可引起脑神经元内质网应激。（5）缺硒导致小脑及脑神经元抗氧化酶CAT、GSH-Px和T-AOC活性减弱,ROS、H2O2、LPO及MDA含量增加,敲低SELS降低了脑神经元抗氧化酶活性,自由基及脂质过氧化产物含量增加,表明SELS表达降低导致脑神经元氧化应激。（6）缺硒抑制小脑和脑神经元溶酶体V-ATPase、CTSB及CTSD蛋白表达,MCOLN1和胞浆中CTSB及CTSD蛋白表达水平升高,SELS敲低同样引起脑神经元上述指标发生相似变化,NAC有效缓解SELS表达降低引起的溶酶体变化,表明SELS表达降低通过氧化应激引起溶酶体酸化受阻、酶活性降低、钙离子释放及溶酶体膜通透化,导致溶酶体稳态失衡。（7）缺硒引起小脑和脑神经元自噬标记物LC3-2和P62蛋白表达水平升高,SELS敲低同样诱导LC3-2和P62蛋白表达水平升高,NAC有效恢复溶酶体稳态的同时,缓解了SELS敲低引起的LC3-2和P62蛋白表达升高,表明SELS表达降低通过溶酶体功能障碍抑制自噬底物降解,引起自噬小体蓄积,自噬流抑制。（8）缺硒抑制小脑和脑神经元BCL2 mRNA及蛋白表达水平,BAX、CAS9及CAS3mRNA和蛋白表达增加,SELS敲低同样引起上述指标相似变化,流式细胞术结果显示缺硒及SELS敲低引起脑神经元凋亡细胞增多,ROS抑制剂NAC、CTSB抑制剂E-64及CTSD抑制剂Pepstatin A能缓解SELS敲低引起的细胞凋亡,表明SELS表达降低通过自噬流抑制、CTSB和CTSD泄露,引起细胞线粒体途径凋亡。综上所述,缺硒导致鸡小脑金属离子稳态失衡,细胞发生线粒体途径凋亡,诱导171个mRNA表达上调,250个mRNA表达下调,并与神经功能、抗氧化、金属离子、溶酶体及凋亡等相关。缺硒导致SELS表达水平降低,进一步研究表明,SELS表达降低引起内质网应激,促进ROS积累,导致氧化应激,引起溶酶体稳态失衡,引发自噬流抑制,最终导致细胞凋亡。上述结果表明SELS调控溶酶体稳态诱导鸡缺硒性小脑神经元凋亡,这一结果丰富了缺硒性小脑损伤的分子机制,为进一步研究提供参考。
郑玉敏[3]（2021）在《miR-141-3p通过靶基因SIRT1调控帕金森细胞模型线粒体功能的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经系统退行性疾病,其最主要的病理特征是大脑黑质多巴胺能神经元进行性退变以及路易小体形成。PD患者主要表现为进行性加重的静止性震颤,肌强直,运动迟缓以及姿势平衡障碍等。PD发病早期临床症状轻或者不典型,一般患者在多巴胺能神经元减少约50%和（或）纹状体内多巴胺水平减少70%-80%时才会出现典型的运动症状,这导致PD在早期发生误诊和漏诊的概率增加,因此寻找与PD相关的生物学标志物具有重要意义。去乙酰化酶Sirtuin家族蛋白在细胞代谢,抗衰老以及促进DNA修复等多方面发挥重要作用。SIRT1是目前研究最为深入的Sirtuin蛋白,该基因定位于人类染色体10q21.3,它以组蛋白和多种非组蛋白作为底物,通过其去乙酰化作用调节基因转录,染色体稳定性以及靶蛋白活性,进而参与一系列生理病理过程的调节,包括细胞周期,能量代谢,细胞衰老以及神经保护等。SIRT1在胚胎的脑组织中高水平表达,提示SIRT1在神经元或者大脑发育过程中起到重要作用。最近研究表明SIRT1可以抑制帕金森等神经退行疾病的发展。Micro RNA是长度约为20-24个核苷酸的小RNA,通过与靶基因m RNA 3′非编码区的碱基配对调节靶向m RNA的降解或者翻译抑制,对基因进行转录后调控。miRNAs参与调控细胞的生长发育,分化代谢以及增殖凋亡等多个生物学过程。miRNA异常表达与人类疾病相关,其中就包括神经退行性类疾病。部分miRNAs的异常表达已在一些体外/体内PD模型以及受PD影响的人脑组织样本中得到证实。在本文中我们将分析SIRT1在帕金森细胞模型中发挥的潜在作用。同时,还将进一步研究其上游可能的miRNAs,探明miRNAs/SIRT1调控帕金森病细胞模型生物学功能可能的分子机制。研究方法:1.细胞培养:本实验所用细胞为PC12细胞,该细胞来源于一种可移植的鼠嗜铬细胞瘤,它对神经生长因子NGF具有可逆的神经元显形反应。PC12细胞购于中国典型培养物保藏中心。细胞培养所用培养基为包含10%灭活马血清,5%胎牛血清的DMEM培养基。培养条件为37℃,5%CO2及饱和湿度。2.帕金森细胞模型构建:PC12细胞用诱导型DMEM培养基（含1%灭活马血清及10%胎牛血清）进行培养,经过NGF-beta（50ng/ml）连续诱导7天。MPP+（800μM）加入诱导后的PC12细胞中处理24小时,构建帕金森细胞模型。3.细胞转染与干扰:SIRT1质粒及空载质粒购于美国Origene公司,SIRT1 si RNA及non-targeting si RNA购于美国Dharmacon公司。miR-141-3p mimic,miR-141-3p inhibitor及对照购于广州锐博生物技术有限公司。转染试剂Lipofectamine 3000及Dharma FECT购于美国Thermofisher公司,转染试剂按照产品说明的剂量和方法进行使用。4.Western blot:提取样本总蛋白使用RIPA细胞裂解液。本实验所用的抗体为一抗SIRT1,α-syn,Nos1,TNF-α,p-IκB,β-actin以及辣根过氧化物酶标记的二抗。采用ECL发光法。5.流式细胞术:细胞凋亡水平,收集细胞并温和漂洗细胞。细胞混合液中加入Annexin V-FITC以及PI染色试剂,避光孵育,并用流式细胞仪检测细胞凋亡水平变化。线粒体膜电位水平,收集细胞并温和漂洗细胞。细胞混合液中加入JC-1荧光染料,恒温孵育45分钟。PBS缓冲液温和漂洗并重悬细胞。采用流式细胞仪分析细胞中线粒体膜电位的变化。ROS含量,收集细胞并温和漂洗细胞。细胞混合液中加入Cell Rox荧光染料,37℃条件下避光孵育30分钟。PBS缓冲液温和漂洗细胞并重悬细胞。采用流式细胞仪分析细胞ROS含量水平。6.荧光素酶报告基因实验:构建荧光素酶报告基因质粒,并与miR-141-3p mimic共转染于PC12细胞中,检测荧光强度分析SIRT1是否为miR-141-3p的直接作用靶基因。7.统计分析:统计分析使用SPSS 22.0软件。处理组与对照组实验结果采用Student′s t检验法。p<0.05表示存在统计学意义。结果:1.PC12帕金森细胞模型构建。PC12细胞通过NGF诱导生成不分裂交感神经样类细胞。诱导后的PC12细胞形成广泛的神经突触网络,同时细胞中TH m RNA表达水平上升。使用MPP+（800u M,24小时）处理NGF诱导后的PC12细胞,构建帕金森细胞模型。2.PC12细胞帕金森细胞模型中SIRT1表达下调,miR-141-3p表达上调。通过Western blot方法检测发现帕金森细胞模型中SIRT1的表达量下调,α-syn,Nos1表达量上调,通过实时荧光定量PCR方法检测发现帕金森细胞模型miR-141-3p的表达量上调。免疫荧光实验验证帕金森细胞模型中α-syn发生聚集,由单体转变为低聚物形式。3.SIRT1及miR-141-3p调控PC12帕金森细胞模型的凋亡水平及线粒体功能。SIRT1表达上调后,PC12细胞凋亡水平降低,ROS含量水平减少,线粒体膜电位上调。相反,SIRT1表达下调后,PC12细胞凋亡水平上升,ROS含量水平增加,线粒体膜电位水平下调。转染miR-141-3p mimic后,PC12细胞凋亡水平上升,ROS含量水平增加,线粒体膜电位水平下调。转染miR-141-3p inhibitor后,PC12细胞凋亡水平降低,ROS含量水平减少,线粒体膜电位上调。4.SIRT1调控PC12细胞中NF-κB信号通路及相关指标表达水平。SIRT1表达上调后,PC12细胞中NF-κB信号通路活性被抑制,p-IκB的表达量下调。α-syn,Nos1,TNF-α,IL-1β,IL-6的表达量下调,bcl-2的表达量上调。ELISA检测细胞上清液中炎性因子的含量,显示SIRT1过表达,TNF-α,IL-1β,IL-6含量降低。细胞经过NF-κB抑制剂处理后,SIRT1对其下游指标TNF-α以及Nos1的调控作用被逆转。5.miR-141-3p通过靶基因SIRT1调控PC12帕金森细胞模型的线粒体功能。荧光素酶报告基因实验结果显示将miR-141-3p mimic与SIRT1野生型质粒共转染于PC12细胞后,细胞的荧光强度降低。转染miR-141-3p mimic后,线粒体膜电位降低。转染miR-141-3p mimic并激活SIRT1后,线粒体膜电位水平回升。相反,转染miR-141-3p inhibitor后,线粒体膜电位增加。转染miR-141-3p inhibitor并抑制SIRT1后,线粒体膜电位水平降低。Western blot检测α-syn以及Nos1的表达水平发现,转染miR-141-3p mimic上调α-syn以及Nos1的表达量,SIRT1过表达可部分消除miR-141-3p的影响,下调α-syn以及Nos1的表达量。结论:在帕金森细胞模型中,SIRT1表达下调,miR-141-3p表达上调。miR-141-3p以SIRT1为直接作用靶基因,激活细胞中NF-κB信号通路,调控细胞的凋亡水平,ROS含量水平以及线粒体膜电位水平,影响帕金森病的发展。
杜欣[4]（2021）在《牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究》文中提出目的:观察牛黄及其有效成分对体外脑神经血管单元的保护作用,阐明牛黄及其有效成分治疗缺血性中风的内在生物学机制。方法:1.体外脑神经血管单元模型的建立以及缺氧/复氧模型的建立（1）利用体外原代细胞培养技术,提取大脑皮质神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞,进行细胞鉴定;（2）利用transwell板将三种细胞共培养,构建体外脑神经血管单元的模型,利用TEER值,判定模型是否成功;（3）采用缺氧1h,复氧24h,构建OGD/R模型,利用TEER值、荧光素钠渗透系数判定模型是否成功。2.牛黄及其有效成分对三种细胞的毒性利用不同浓度的牛黄（Bezoar）、牛磺酸（Taurine）、牛黄熊去氧胆酸（TUDCA）和熊去氧胆酸（UDCA）,作用于神经元、星形胶质细胞和内皮细胞,分别干预24h和48 h,利用CCK8检测细胞活力,检测每种不同浓度的药物对细胞的毒性。3.牛黄及其有效成分对脑神经血管单元的保护作用（1）通过OGD/R模型,检测牛黄、牛磺酸、TUDCA和UDCA的不同剂量对细胞的作用,利用CCK8法检测细胞活力,确定每种药物的最佳剂量;（2）利用药物的最佳剂量进行干预,通过检测血脑屏障的通透性:TEER值、荧光素钠渗透系数和γ-GT;炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β;氧化应激指标SOD、NO、MDA以及神经元凋亡率。（3）牛黄对脑神经血管单元的保护机制研究加入抑制剂LY294002,检测牛黄对细胞的干预是通过PI3K/AKT通路实现的;检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶MMP2、MMP9,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 以及 HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT、p-AKT。4.不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用（1）利用OGD/R模型,筛选牛磺酸+牛磺熊去氧胆酸（T+T）,牛磺酸+熊去氧胆酸（T+U）的最佳剂量;（2）利用药物的最佳剂量进行干预,通过检测血脑屏障的通透性:TEER值、荧光素钠渗透系数和γ-GT;炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β;氧化应激指标SOD、NO、MDA以及神经元凋亡率。5.配伍组分牛磺酸和熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制利用T+U的最佳剂量,进行OGD/R的造模,检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶 MMP2、MMP9,紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 以及 NF-κBp65,p-P65,IKBα,p-IKBα 蛋白表达。6.配伍组分牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制利用T+T的最佳剂量,进行OGD/R的造模,检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶MMP2、MMP9,紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5,CA43、AQP4以及 P38MAPK,P-P38MAPK。结果1.获得了纯度较高的神经元、星形胶质细胞和内皮细胞（1）神经元培养7d后成熟,经MAP2免疫荧光鉴定,纯度大于95%;（2）星形胶质细胞培养7d后成熟,经GFAP免疫荧光鉴定,纯度大于95%;（3）内皮细胞培养7d后成熟,经Ⅷ因子免疫荧光鉴定,纯度大于95%。2.利用transwell,建立了脑神经血管单元的模型（1）该模型的电阻值在3-5天趋于平稳;（2）三细胞共培养,三种细胞的状态和单细胞相比,更佳。3.成功复制OGD/R模型利用缺氧1h,复氧24h,能够成功复制OGD/R模型,和正常组相比,模型组电阻值降低,荧光素钠渗透系数升高,能够进行下一步的实验研究。4.筛选药物毒性利用不用浓度的牛黄、牛磺酸、牛磺熊去氧胆酸和熊去氧胆酸分别干预24h和48h,筛选药物的毒性。5.筛选药物的保护剂量利用无毒性的各种药物浓度,通过OGD/R造模方法,检测细胞活力,筛选出保护作用的最佳剂量。6.牛黄及其有效成分对体外脑神经血管单元的保护作用（1）牛黄及其有效成分降低LDH,升高γ-GT,提高TEER值和降低荧光素钠渗透系数;（2）牛黄及其有效成分减少炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1 β的水平;（3）牛黄及其有效成分降低NO、MDA的水平,升高SOD的水平;（3）牛黄及其有效成分抑制神经元的凋亡;（4）牛黄降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（5）牛黄能升高紧密连接蛋白的表达,提高ZO-1、Occludin、Claudin-5的蛋白表达;（6）牛黄通过HIF-α/VEGF,PI3K/AKT通路,发挥保护NVU的作用,牛黄降低HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平,升高PI3K、AKT的蛋白表达水平。7.不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用（1）筛选了配伍组分的最佳剂量,T+T的最佳剂量1mM Taurine和1μM TUDCA,T+U的最佳剂量1mM Taurine和1μM UDCA;（2）T+T、T+U有效保护血脑屏障,降低TEER值,降低荧光素钠渗透系数,升高γ-GT;（3）T+T、T+U有效减轻细胞损伤,降低LDH的水平;（4）T+T、T+U有效减轻炎症反正,降低TNF-α、IL-6、IL-1β的值;（5）T+T、T+U有效抑制氧化反应,降低NO、MDA的水平,升高SOD的活力;（6）T+T、T+U抑制神经元的凋亡率。8.配伍组分牛磺酸和熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制（1）T+U抑制神经元的凋亡率;（2）T+U 提高 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的蛋白表达;（3）T+U降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（4）T+U降低Bax、Caspase-3蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达;（5）T+U降低MyD88、P-P65、P-IKB α的蛋白表达,通过MyD88/NF-κB信号通路发挥脑保护作用。9.配伍组分牛磺酸和牛黄熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制（1）T+T抑制神经元的凋亡率;（2）T+T 提高 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的蛋白表达;（3）T+T降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（4）T+T降低Bax、Caspase-3蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达;（5）T+U降低AQP4、P38MAPK,升高CX43的蛋白表达。结论（1）牛黄、牛磺酸、TUDCA和UDCA能够减轻炎症反应,降低氧化应激的水平,抑制神经元的凋亡发挥神经保护的作用;（2）牛黄通过HIF-1α/VEGF和PI3K/AKT通路发挥脑保护作用;（3）牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸,牛磺酸和熊去氧胆酸配伍,发挥协同作用,比单独使用牛磺酸药效更好;（4）牛磺酸和熊去氧胆酸1000:1的配伍能够抑制炎症反应,降低氧化应激的水平,保护血脑屏障,抑制神经元的凋亡,能够抑制通路MyD88/NF-κB通路发挥脑保护作用（5）牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸1000:1的配伍能够抑制炎症反应,降低氧化应激,保护血脑屏障,能够抑制P38MAPK通路,发挥脑保护作用;
尹赛格[5]（2021）在《活性肽OM-LV20通过色氨酸羟化酶1介导的促脑缺血损伤修复作用和机制研究》文中研究说明[目 的]中风导致严重的神经损伤并造成严峻的社会、经济负担,由于损伤后修复机制的高度复杂性与目前被批准使用的药物极度稀缺,使得新型抗中风药物的发现、新的机制解析及新药物靶标发现具有重要意义。目前,肽类分子已经成为发现与确认新药靶点的有力工具,并且是新药创制先导化合物的重要来源。在基础科学研究、新型生物产业和创新药物研发中具有独特、不可替代的作用。色氨酸羟化酶1（Tryptophan hydroxylase 1,TPH1）参与多种精神、神经等相关疾病进程,但其对中风的作用却未见报道。本研究旨在细胞和动物水平上明确外源性应用OM-LV20对大鼠脑缺血再灌注模型及在对氧化应激下大鼠星形胶质细胞损伤的神经保护作用与机制,并以OM-LV20为分子探针探索内源性TPH1作为抗中风药物靶标的可能性。为后续神经系统疾病,特别是脑缺血再灌注的治疗与预防提供分子生物学依据。[方 法]1)利用HPLC系统检测活性肽OM-LV20在4℃、37℃及血浆中的半衰期。2)以Sprague-Dawley大鼠为研究对象,以腹腔注射的方法连续给药（OM-LV20）7天后建立大鼠脑缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion,I/R）模型,即大脑中动脉栓塞2 h/再灌注24 h。通过利用mNSS行为学评分、TTC染色与脑梗死面积量化,初步评估OM-LV20的神经保护作用;利用H&E染色和Nissl染色评估OM-LV20对脑内细胞和神经元形态及存活状态的保护作用。3)OM-LV20对I/R大鼠神经保护机制研究（动物水平）:利用分子对接模拟、高通量胰高血糖素样肽受体1（Glucagon like peptide-1 receptor,GLP-1R）激动实验和转录组学测序分析研究OM-LV20对I/R大鼠的神经保护机制;利用Western蛋白印迹、实时定量聚合酶链反应（Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）和环磷酸腺苷（cyclic Adenosine monophosphate,cAMP）检测研究OM-LV20是否通过直接激动GLP-1R、激活有丝分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPKs）信号通路与 BDNF/AKT 信号通路和调节垂体腺苷酸环化酶激活肽受体（Type 1 Pityitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Receptor,PAC1R）、cAMP 及 TPH1 水平对 I/R 大鼠进行神经保护。4)利用大鼠海马区星形胶质细胞的原代培养、大鼠脑组织冰冻切片、免疫荧光三标、qRT-PCR、序列比对与Western免疫印迹研究TPH1在大鼠星形胶质细胞上的表达情况。5)OM-LV20对氧化应激下大鼠星形胶质细胞的神经保护作用（细胞水平）:以大鼠星形胶质细胞株CTX-TNA2为研究对象,通过利用不同时间点（2h,4h,6h,12 h和24h）过氧化氢（Hydrogenperoxide,H2O2）（300 μM）刺激制造氧化应激模型以研究TPH1水平的变化;以活性肽OM-LV20为分子探针,利用Western免疫印迹方法和qRT-PCR探索活性肽对H2O2刺激下CTX-TNA2细胞的神经保护机制是否通过“PAC1R-MAPKs-TPH1”分子轴。6)通过慢病毒转染CTX-TNA2细胞构建与筛选稳定过表达细胞株;利用H2O2刺激2 h制造氧化应激模型和检测细胞活力、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和乳酸脱氢酶（Lctate dehydrogenase,LDH）水平变化以探索TPH1的神经保护作用。[结 果]（1）活性肽OM-LV20在4℃与37℃条件下均展示出良好的稳定性,并且在血浆中的半衰期为2.834 h。（2）OM-LV20有效逆转由I/R导致的神经功能损伤、改善大鼠神经行为异常、显着挽救脑梗死体积、有效提高大鼠海马区（p<0.05）和皮质区（p<0.0001）神经元存活率（20 ng/kg）,并改善由I/R所致的细胞胞质染色加深、胞体皱缩、细胞间隙增大并有空泡形成及海马CA1区结构紊乱等一系列神经细胞和组织状态的改变。（3）分子对接模拟实验提示OM-LV20可能与GLP-1R通过Ile-19、Asp-12、Lys-7、Lys-4和Leu-1位点结合;GLP-1R激动实验提示OM-LV20并不是GLP-1R的直接激动剂。（4）I/R组和OM-LV20组大鼠梗死区域脑组织转录组测序提示:OM-LV20与I/R组共有3089个显着差异基因,并主要富集于MAPKs信号通路、cAMP信号通路和内质网蛋白加工等信号通路。通过实验验证发现,OM-LV20对大鼠脑I/R损伤的神经保护机制可能通过抑制MAPK信号通路磷酸化、激活BDNF/AKT信号通路、促进TPH1和PAC1R水平、及调节cAMP水平相关。（5）TPH1明显分布于海马区域、丘脑区域和中缝区域,特别是海马CA1区有明显表达,并在大鼠海马CA1区星形胶质细胞及DI-TNC1和CTX-TNA2两种大鼠星形胶质细胞株中均有表达。（6）TPH1在不同时间H2O2刺激下的变化:TPH1的mRNA和蛋白水平均呈先下降（2h降低）后上升（12h达到高峰）的趋势。（7）OM-LV20 以浓度依赖（10pM、100 pM、1nM）升高 CTX-TNA2 细胞中TPH1的mRNA和蛋白水平。（8）OM-LV20对H2O2刺激下大鼠CTX-TNA2细胞的神经保护作用:OM-LV20可能通过保护细胞活力（p<0.01）、抑制MAPK信号通路磷酸化（p<0.05）、升高PAC1R（p<0.001）、TPH1（p<0.05）和 CAT水平（p<0.05）,与减少LDH释放（p<0.0001）改善氧化应激下的细胞损伤。（9）OM-LV20通过抑制JNK磷酸化水平升高TPH1水平:OM-LV20的应用降低JNK磷酸化水平并升高TPH1水平（p<0.05）。同时应用OM-LV20和Anisomycin后,TPH1水平有所下降（p<0.01）;SP600125的单独应用会升高TPH1水平（p<0.05）。说明OM-LV20通过调控JNK信号通路磷酸化对TPH1水平进行调控、p-JNK水平与TPH1水平呈负相关趋势。（10）OM-LV20可能通过结合PAC1R对TPH1水平进行调控:分子对接模式实验提示,OM-LV20与PAC1R有结合的潜能。单独应用OM-LV20能提高CTX-TNA2细胞的TPH1水平（p<0.01）,联合应用PACAP6-38后,升高的TPH1水平有所下降（p<0.05）。（11）过表达TPH1对H2O2刺激下的CTX-TNA2细胞活力损伤无保护作用,但有抗氧化应激损伤作用:过表达TPH1逆转了异常的CAT水平降低（升高25.01%±12.62%）与 LDH 水平升高（313.53%±65.39%）。[结 论]体内实验结果提示,对脑缺血再灌注模型大鼠腹腔注射活性肽OM-LV20可显着减少大鼠脑梗死体积、改善大鼠神经行为异常,并对I/R造成的梗死区域皮层和海马神经元的存活有保护作用。OM-LV20介导的潜在分子机制涉及MAPKs和BDNF/AKT信号通路的激活,与TPH1、cAMP和PAC1R的水平变化。体外实验结果提示,OM-LV20对氧化应激下大鼠星形胶质细胞的神经保护机制可能通过“PAC1R-MAPKs-TPH1”分子轴进行。此外,本研究首次报道了 TPH1在大鼠星型胶质细胞上的表达、探索了在不同时间点H2O2刺激下CTX-TNA2细胞中TPH1水平的表达,并发现TPH1可能通过提高CAT水平和减少LDH的释放以保护星形胶质细胞抵抗氧化应激损伤。本研究首次报道了两栖类动物皮肤分泌源性肽OM-LV20对I/R大鼠的神经保护作用。为新型抗卒中药物先导分子提供候选模版;为靶向TPH1及抗氧化应激途径提供了一种可能的减轻脑I/R损伤的相关机制,也为脑I/R的神经保护药物研发提供了潜在靶点。
董健健[6]（2021）在《应用CRISPR/Cas9技术构建Wilson病小鼠模型及其基因治疗研究》文中研究表明Wilson病（Wilson’s disease,WD）是ATP7B基因突变引起的常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾病。ATP7B基因突变及其功能的失活影响胆汁中的铜排泄,从而诱发体内铜稳态失调,导致肝脑等脏器的病理性损伤。WD中国人群患者中广泛存在8号外显子Arg778Leu和13号外显子Pro992Leu的高频突变,针对这些突变构建动物模型,研究这些动物模型的表型十分必要。CRISPR/Cas9技术是能够高效地同时编辑多个基因的DNA序列,在转基因动物模型构建这一领域已被广泛使用。WD目前的常规疗法是患者终生服用铜螯合剂和锌盐,大部分患者经治疗后可获得较好的效果,但常规治疗方案并不能恢复患者的正常铜代谢,且部分患者会出现严重不良反应。本研究应用CRISPR/Cas9技术,靶向中国WD患者ATP7B基因的常见突变位点Arg778Leu和Pro992Leu以显微注射技术向小鼠单细胞期胚胎注射Cas9 mRNA,最终成功构建了模拟ATP7B基因R778L和P992L点突变的小鼠模型。进一步,我们从生理和病理角度观察了这两种突变小鼠临床表型,验证了它们的表型与WD患者临床症状的契合程度。我们发现:R778L点突变小鼠血清中全铜蓝蛋白水平显着低于野生型小鼠,R778L和P992L小鼠血清中非铜蓝蛋白结合铜,及肝脑组织中铜的含量则显着高于野生型小鼠;同时,这些小鼠呈现肝脏病理性损伤,而R778L小鼠则伴有行为学异常。NLRP3炎性小体在WD小鼠的病理进程中发挥重要作用,抑制NLRP3炎性小体的激活可显着降低WD小鼠中枢神经系统（central nervous system,CNS）中炎症因子的表达水平,并显着减少神经元的病理性损伤,从而有效地改善了该小鼠的行为学异常。我们将编码ATP7B cDNA的腺相关载体注射至已构建的WD小鼠中,评估其铜代谢及疾病进展相关参数。我们发现,AAV9-ATP7B治疗后,WD小鼠的肝功能相关指标基本恢复正常,血清全铜蓝蛋白水平也恢复正常,尿铜排泄减少,且在铜超载情况下的生理性胆汁铜排泄也得以恢复。同时,AAV9-ATP7B治疗可逆转WD小鼠肝、脑组织内的铜沉积,抑制WD小鼠脑内NLRP3炎性小体激活,并显着减少炎症导致的神经元病理性损伤。综上所述,我们利用CRISPR/Cas9技术,精确构建了针对中国人群WD的点突变小鼠动物模型,为WD发病机制及基因治疗研究提供了理想的工具。同时,我们也证实了 NLRP3炎性小体激活诱导的神经炎症反应是WD神经损伤的重要机制。最后,我们也确认了通过腺相关病毒技术过表达ATP7B基因以治疗WD的治疗效果,为针对WD的基因治疗提供了有力的证据和重要的理论基础。
邢其郡[7]（2021）在《天麻中的有效成分靶向MT1发挥镇静安神作用的研究》文中进行了进一步梳理睡眠已经是整个现代人类日常生活过程中必不可少的阶段,我们的一生中身体大约有三分之一的时间是处于睡眠的状态中,睡眠阶段具有恢复体力、消除一天的疲劳、促进身体发育和生长、增进学习记忆的作用,因此睡眠对于我们而言具有重要意义。而随着科学技术的快速发展,受到自身内源性的压力和外源性的环境因素影响,表现为难以入睡、睡眠质量下降以及睡眠过程中易惊醒的失眠病症已经在社会中越来越普遍的出现。短期的失眠会导致疲惫、发力、注意力不集中等状态,而长期的失眠会导致抑郁、免疫力下降和代谢类疾病。因此失眠的问题不容忽视,目前已经得到越来越多的关注。对于失眠治疗的常见的有苯二氮卓类药物,但其副作用多且危害大。而中国自古以来就有使用中药治疗疾病的传统,天麻更是自古以来就被证实具有镇静安神、息风止痉,治疗头晕、癫痫、失眠等疾病,而天麻中的化合物复杂多样且生理学效应众多,阻碍了新药的研发。因此,本文的研究方向选择天麻中的活性成分包括天麻素、巴利森苷A和巴利森苷B以及本实验室已经构建好的睡眠系统相关受体如多巴胺受体D2、D3,食欲素受体OX2、褪黑素受体MT1、MT2高表达细胞株为平台筛选可能发挥镇静安神作用机制的潜在靶点。根据本研究实验研究结果表明天麻素和巴利森苷A能够通过MT1受体而上调p-ERK水平,并且提高程度呈现浓度依赖性。接着通过热稳定性、蛋白酶切实验以及受体探针FRET基线实验进一步验证了巴利森苷A与MT1受体的结合能力,并对MT1受体结合口袋的关键氨基酸位点突变后巴利森苷A无法通过其激活ERK1/2,表明巴利森苷A与MT1受体特异性结合激活下游的信号通路。通过鼻腔注射的方式将天麻素、巴利森苷A和巴利森苷B给药小鼠诱导小鼠的睡眠实验发现天麻素、巴利森苷A能够有效延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间,缩短小鼠入睡潜伏期,降低小鼠的自发活动能力,同时用ELISA法检测DA和5-HT表明天麻素、巴利森苷A可以明显增加小鼠大脑DA和5-HT的含量,通过q-PCR实验发现天麻素、巴利森苷A能降低肝脏和肾脏中的炎症因子的表达,但可以上调fos基因的表达,提示这两种化合物可以活化小鼠中的神经元而降低炎症因子间接促进睡眠而同时起到神经保护的作用。而对血常规生化检测发现三种化合物均对小鼠血液生化指标无影响。
姬康祁[8]（2021）在《蛛网膜下腔出血细胞模型应用P38抑制剂后的蛋白组学分析》文中研究表明背景蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage,SAH）是一种病死率和致残率极高的疾病。研究认为,早期脑损伤（Early Brain Injury,EBI）引发线粒体的功能障碍,可造成神经功能的损害。P38/MAPK通路是SAH后早期参与调控的重要途径,应用P38抑制可有效改善线粒体功能障碍。而在蛋白组学层面上,线粒体蛋白在SAH中的变化却少有研究。目的探讨SAH的早期阶段,P38抑制剂对神经细胞线粒体差异蛋白基因表达的影响,为SAH的分子机制研究提供理论基础。方法利用氧合血红蛋白（Oxy Hb）诱导Neuro-2a细胞（mouse neuroblastoma N2a cells,小鼠来源神经瘤母细胞,购买自中国科学院上海细胞库）,模拟蛛网膜下腔出血后,氧合血红蛋白对于神经细胞的刺激状态,建立体外SAH模型,设立对照组（Con）、蛛网膜下腔出血组（SAH）及P38抑制剂治疗组（P38+SAH组）,P38抑制剂的终浓度为0.02mmol/L,在细胞完成贴壁后,加入Oxy Hb,使其终浓度为0.01mmol/L,以Oxy Hb作用48h作为观察时间点。1.通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）为基础的非标记定量蛋白质组学分析3组线粒体蛋白的表达,应用DAVID在线工具（Annotation,Visualization,Integrated Discovery数据库）对于差异表达的线粒体蛋白进行基因本体论（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路的富集分析;应用Me V（Multiple Experiment Viewer）软件进行分层聚类热图分析;用STRING在线工具构建出PPI网络,以此来发现差异蛋白及信号通路的表达。2.Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-II、和p62的表达,观察P38抑制剂对SAH后自噬的影响。3.通过Western blot和RT-q PCR验证筛选出的差异蛋白Rab7a的表达。结果1.3组中共筛出239个差异蛋白,上调差异蛋白105个,下调差异蛋白134个（符合差异倍数（FC）>1.5or<0.667,P<0.05）。GO富集分析表明:差异蛋白富集在调节MAPK的级联正调控、内吞作用、凋亡过程负调控等细胞生物学功能。在KEGG中:差异蛋白主要在P53信号通路、PI3K-AKT信号通路、轴突导向信号等通路富集。通过PPI分析:以Rab7a、Cox5a、Cacybp等蛋白为核心的9个蛋白互作网络。2.P38抑制剂可调节SAH后神经细胞的异常自噬:与Con组相比,SAH后Beclin-1、P62、LC3-Ⅱ表达均增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与SAH组相比,P38+SAH组的Beclin-1、P62、LC3-Ⅱ表达均有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）,表明通过P38抑制剂的应用逆转了异常自噬地发生。3.对于Rab7a线粒体蛋白及m RNA表达的验证:与CON组比较,SAH组Rab7a的表达下降（P<0.05）;与SAH组比较,P38+SAH组中Rab7a的表达上升（P<0.05）,与蛋白组学结果一致。结论P38抑制剂并不是通过单一途径改善SAH后神经细胞线粒体功能障碍,而与多种蛋白及信号通路的调控有关,Rab7a蛋白可能是早期异常自噬的重要靶点。
杨业明[9]（2020）在《磷脂内翻酶β亚基TMEM30A及其相关基因的功能研究》文中认为真核生物细胞膜结构两侧的磷脂分布是不对称的,这种不对称分布需要膜上磷脂内翻酶（Flippase）的动态调节。P型ATP酶第四类亚型（P4-ATP酶）被证明有磷脂内翻酶活性,能够依赖ATP供能将磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）特异地向细胞膜内侧面翻转。P4-ATP酶突变或缺失已与众多疾病相联系,在体内承担重要功能。P4-ATP酶的功能发挥需要依靠TMEM30蛋白家族的帮助。其中,TMEM30A对于大多数P4-ATP酶的正确亚细胞定位和功能发挥是必需的。鉴于哺乳动物中的14种P4-ATP酶组织分布冗杂,研究其致病机制较为困难,而TMEM30A作为大多数P4-ATP酶的β亚基,功能更加重要。因此,研究P4-ATP酶β亚基TMEM30A的功能也就更有意义。而目前,对于TMEM30A及其互作蛋白的细胞生理功能还知之甚少,缺乏相关动物模型和体内研究。为了能够了解磷脂内翻酶及其β亚基TMEM30A在体内的重要性以及参与的细胞生理途径,本研究构建了多种Tmem30a条件性基因敲除小鼠,探究TMEM30A缺失在视网膜细胞、小脑浦肯野细胞以及胰岛β细胞中所导致的疾病表型,并针对表型进行更深入的分子机制探究,从不同角度研究了 TMEM30A协同P4-ATP酶在这些组织细胞中的功能,从而为揭示P4-ATP酶相关疾病的发病机制奠定基础。1.TMEM30A在视网膜中的功能研究磷脂内翻酶Atp8a2突变在小鼠中导致视网膜退行性病变,但其具体致病机制尚不清楚。我们验证了 ATP8A2的β亚基TMEM30A在小鼠视网膜中广泛表达。鉴于此,我们分别构建了 Tmem30a此在视网膜感光细胞以及双极细胞中特异敲除的小鼠模型,用来研究其在视网膜功能和细胞生存中的作用,从而揭示P4-ATP酶相关的视网膜病变的致病机制。首先,小鼠视锥细胞敲除Tmem30a导致明适应视网膜电图（ERG）反应丧失,视蛋白错误定位在胞体,并最终引发视锥细胞的死亡。其次,在成年小鼠中全身敲除Tmem30a引起暗适应ERG反应降低以及ATP8A2的错误定位,最终导致视杆细胞功能障碍和凋亡。细胞水平上,我们将敲除小鼠胚胎成纤维细胞分离进行PS内翻活性检测,结果显示TMEM30A缺失导致PS暴露于细胞膜表面,提示磷脂内翻活性丧失。这些数据证明了 TMEM30A在视网膜感光细胞磷脂内翻、蛋白转运以及视功能维持中的重要作用。为了进一步探究TMEM30A在视觉信号传递中的功能,我们构建了视网膜双极细胞特异敲除Tmem30a的小鼠模型,该敲除鼠表现为双极细胞功能丧失以及细胞死亡。视网膜PKCα染色表明,在病变初期双极细胞出现突触异常伸长表型,而PSD95以及mGluR6染色提示该突触伸长表型主要由于突触传递受损,这证明TMEM30A参与视觉信号传递过程。此外,TMEM30A缺失引发了视网膜过度的炎症反应,加速了双极细胞的凋亡。这些数据揭示了 Tmem30a在视网膜感光细胞和双极细胞中的功能,以及对于视细胞蛋白转运、视觉信号传递的重要性。2.TMEM30A在小脑浦肯野细胞中的功能研究磷脂内翻酶ATP8A2突变在人群中导致共济失调表型,这主要由于小脑平衡系统受损,但其致病机制尚不明了。为了探究其致病机制,并研究TMEM30A在小脑中的功能,我们将Tmem30a在小脑浦肯野细胞中特异敲除来揭示ATP8A2突变引发共济失调的致病机制。结果表明,敲除小鼠在早期即出现了严重的共济失调表型,并伴随浦肯野细胞突触减少、轴突退化等神经退行性病变表征,最终引起浦肯野细胞死亡。与此同时,细胞病变导致GFAP表达增高,在浦肯野细胞退化区域出现胶质增生,加速了病变细胞的死亡。机制上,我们发现TMEM30A在细胞中主要定位于囊泡转运相关的细胞器,例如内质网、高尔基体和内体,提示TMEM30A可能参与到细胞囊泡转运过程中。对内质网应激的相关分子进行免疫组化和蛋白印记结果均表明,在敲除鼠小脑中内质网应激标志分子BiP和CHOP的表达量显着上调,表明浦肯野细胞出现内质网应激。内质网应激进一步激活下游的细胞程序性死亡Caspase级联通路,蛋白检测结果表明Cleaved caspase-12以及Cleaved caspase-3分子在敲除鼠小脑中表达量均上调,TUNEL染色显示浦肯野细胞出现细胞凋亡。该研究揭示了 TMEM30A在小脑浦肯野细胞中的重要作用,并表明TMEM30A参与细胞囊泡转运过程。3.TMEM30A在胰岛β细胞中的功能研究磷脂内翻酶ATP10A和ATP1OD突变已被证实与糖尿病相关,但具体致病机制尚不明了。糖尿病与胰岛β细胞功能损害相关,为了探究其致病机制,并探究TMEM30A及其互作蛋白在胰岛素分泌中的功能,我们将Tmem30a在胰岛β细胞中特异敲除。我们首先证明了 TMEM30A在小鼠胰腺β细胞敲除可导致Ⅱ型糖尿病表征:胰岛素分泌不足、葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗、胰岛增生、肥胖以及肝脏损伤。离体胰岛以及MIN6细胞系的蛋白印迹结果表明TMEM30A缺失的胰岛β细胞内胰岛素含量显着下调,而胰岛素原与胰岛素比值升高,表明胰岛素的剪切成熟过程受损。电镜结果显示在敲除β细胞中胰岛素囊泡数量显着降低,并伴随高尔基体肿胀;细胞免疫染色结果显示胰岛素颗粒异常聚集于高尔基体,表明胰岛素分泌囊泡在高尔基体出芽释放失败。另一方面,我们发现葡萄糖转运蛋白2（Glut2）异常聚集于细胞质,并伴随成熟糖基化Glut2表达下调,表明其成熟和膜向转运受阻,并导致后续β细胞的钙离子内流减少以及细胞膜电位去极化消失,提示高糖感应的级联反应丧失。机制上,我们发现TMEM30A对于网格蛋白（Clathrin）介导的囊泡转运至关重要,TMEM30A缺失导致Clathrin表达下调,并在高尔基体异常聚集,其介导的细胞内吞过程也受到影响,证明Tmem30a参与该囊泡转运途径,并由于该途径受阻进而影响到胰岛素囊泡分泌以及GLUT2的膜向转运,最终导致胰岛素释放减少以及后续的糖尿病表型。我们随后对小鼠胰岛β细胞以及MIN6细胞系中的P4-ATP酶表达量进行了检测,结果显示绝大多数P4-ATP酶表达下调。此外,我们对胰岛β细胞高表达的P4-ATP酶（ATP8A1,ATP8B2,ATP11A）进行细胞定位分析,结果表明TMEM30A能够帮助它们正确定位于高尔基体和细胞膜上。最后,磷脂内翻活性检测表明Tmem30a敲减MIN6细胞的PS暴露于细胞膜表面,提示磷脂内翻活性丧失。我们本研究证明了 TMEM30A在胰岛素成熟分泌和糖代谢稳态中的新作用,探明了 TMEM30A及其互作P4-ATP酶参与的蛋白囊泡转运途径,并揭示了 P4-ATP酶相关的糖尿病的致病机制。
万然,史旭,刘京松,王岩松[10]（2021）在《间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展》文中研究指明背景:由于中枢神经系统的固有再生能力有限,脊髓损伤常导致患者出现永久性的感觉、运动及自主神经功能障碍,严重影响其生活质量,目前临床上尚无有效改善神经功能恢复的方法。现研究认为间充质干细胞分泌组由于介导了细胞移植的主要治疗作用且避免了细胞排异等问题,因此将成为治疗脊髓损伤的有力工具。目的:总结间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展,并分析目前面临的问题及其未来发展方向。方法:以"spinal cord injury,secretome"为关键词检索PubMed数据库,以"脊髓损伤,分泌组"为关键词检索CNKI、万方数据库,检索时限为2013年1月至2020年1月,排除与文章研究目的无关及重复性文章,纳入符合标准的71篇文献进行综述。结果与结论:间充质干细胞分泌组中富含各种生长因子、神经营养因子等可溶性分子及细胞外囊泡,在减少细胞凋亡、调节免疫应答、抑制瘢痕形成、促进神经再生及血管形成方面都起到了显着作用。大量的研究表明,间充质干细胞分泌组可以促进脊髓损伤后的神经再生及功能恢复,且避免了细胞移植的种种弊端,未来将成为治疗脊髓损伤的可靠方法。
二、巨噬细胞条件培养基对小脑皮质神经元生存的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、巨噬细胞条件培养基对小脑皮质神经元生存的影响（论文提纲范文）
（1）过度训练对小鼠海马中脑特异性microRNAs表达水平的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 运动与脑健康 |
| 1.1.1 运动对脑容量的影响 |
| 1.1.2 运动对神经发生和突触发生的影响 |
| 1.1.3 运动对营养因子的影响 |
| 1.1.4 不同运动量对认知功能的影响 |
| 1.2 micro RNAs |
| 1.2.1 microRNAs的发现与起源 |
| 1.2.2 microRNAs的生物学合成机制 |
| 1.2.3 microRNAs的主要作用机制 |
| 1.2.4 microRNA在大脑中的表达和功能调控 |
| 1.2.5 运动与microRNAs |
| 1.3 过度训练 |
| 1.3.1 过度训练的定义 |
| 1.3.2 过度训练的生物化学表现 |
| 1.3.3 过度训练对生理的影响 |
| 1.3.4 过度训练对神经心理的影响 |
| 1.4 研究目及意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 2 研究对象、材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞株 |
| 2.1.3 运动方案设计 |
| 2.1.4 动物取样 |
| 2.2 研究材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.2.3 所用核苷酸序列 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞转染 |
| 2.3.3 RNA提取方法 |
| 2.3.4 质粒抽提 |
| 2.3.5 RNA逆转录 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR |
| 2.3.7 生物信息学预测 |
| 2.3.8 荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.9 蛋白免疫印迹检测 |
| 2.3.10 统计分析 |
| 3 研究结果与分析 |
| 3.1 跑步机训练后小鼠身体参数与运动性能评价 |
| 3.1.1 训练后小鼠体重变化情况 |
| 3.1.2 实验组小鼠运动性能评估情况 |
| 3.2 动物行为学实验测试结果 |
| 3.2.1 Morris水迷宫测试结果 |
| 3.2.2 旷场实验测试结果 |
| 3.3 过度训练后小鼠海马组织中miRNAs的表达水平 |
| 3.4 过度训练后小鼠海马组织中BDNF的表达情况 |
| 3.5 BDNF是 miR-34a作用的直接靶点 |
| 3.5.1 miR-34a对 BDNF蛋白表达水平的影响 |
| 3.5.2 生物信息学预测结果 |
| 3.5.3 荧光素酶报告基因检测结果 |
| 3.6 miR-34a影响TrkB蛋白和p75 蛋白的表达情况 |
| 3.7 过度训练后小鼠海马中的蛋白表达情况及磷酸化水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）硒蛋白S调控溶酶体稳态在鸡缺硒性小脑神经元凋亡中作用机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 硒与神经系统的研究进展 |
| 1.1.1 脑中硒分布 |
| 1.1.2 硒及硒蛋白研究进展 |
| 1.1.3 硒对神经系统的保护作用 |
| 1.1.4 缺硒对神经系统的影响 |
| 1.2 硒蛋白S(SELS)与神经系统损伤研究进展 |
| 1.2.1 SELS的结构和组织分布 |
| 1.2.2 SELS的功能 |
| 1.2.3 SELS在神经系统中的作用 |
| 1.3 溶酶体与神经系统疾病关系的研究进展 |
| 1.3.1 溶酶体功能障碍与自噬流抑制 |
| 1.3.2 溶酶体膜通透化与细胞凋亡 |
| 1.3.3 硒与溶酶体稳态研究进展 |
| 1.3.4 溶酶体稳态与神经系统疾病 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 动物模型的建立及样本采集 |
| 2.2.2 鸡胚脑神经元的分离纯化及鉴定 |
| 2.2.3 鸡胚脑神经元缺硒模型的建立 |
| 2.2.4 鸡胚脑神经元SELS敲低模型的建立及处理 |
| 2.2.5 鸡小脑组织病理组织学观察 |
| 2.2.6 鸡小脑组织凋亡的TUNEL法检测 |
| 2.2.7 鸡胚脑神经元凋亡的流式细胞术检测 |
| 2.2.8 鸡小脑组织中金属离子水平检测 |
| 2.2.9 鸡小脑组织mRNA转录组的检测 |
| 2.2.10 鸡胚脑神经元ROS水平的检测 |
| 2.2.11 鸡胚小脑组织及脑神经元抗氧化水平的检测 |
| 2.2.12 鸡胚脑神经元溶酶体pH检测 |
| 2.2.13 鸡小脑组织及鸡胚脑神经元中溶酶体的提取 |
| 2.2.14 鸡小脑组织中溶酶体标志酶活性的检测 |
| 2.2.15 鸡小脑组织及脑神经元免疫荧光检测 |
| 2.2.16 鸡小脑组织及鸡胚脑神经元中RNA提取及RT-PCR检测 |
| 2.2.17 鸡小脑组织及鸡胚脑神经元总蛋白提取及Western Blot检测 |
| 2.2.18 鸡小脑组织及鸡胚脑神经元硒蛋白S(SELS)及内质网应激的检测 |
| 2.2.19 鸡小脑组织及鸡胚脑神经元中溶酶体相关基因的检测 |
| 2.2.20 鸡小脑组织及鸡胚脑神经元中自噬流基因检测 |
| 2.2.21 鸡小脑组织及鸡脑神经元中凋亡基因检测 |
| 2.3 试验数据的统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 缺硒鸡小脑组织相关指标检测结果 |
| 3.1.1 缺硒鸡小脑组织病理结构观察结果 |
| 3.1.2 缺硒鸡小脑组织凋亡 TUNEL 法检测结果 |
| 3.1.3 缺硒鸡小脑组织金属离子水平检测结果 |
| 3.1.4 缺硒鸡小脑组织mRNA转录组检测结果 |
| 3.1.5 缺硒鸡小脑组织SELS表达及内质网应激指标检测结果 |
| 3.1.6 缺硒鸡小脑组织抗氧化水平检测结果 |
| 3.1.7 缺硒鸡小脑组织溶酶体稳态检测结果 |
| 3.1.8 缺硒鸡小脑组织自噬流检测结果 |
| 3.1.9 缺硒鸡小脑组织凋亡检测结果 |
| 3.2 缺硒鸡胚神经元相关指标检测结果 |
| 3.2.1 鸡胚脑神经元形态学观察结果 |
| 3.2.2 鸡胚脑神经元的鉴定 |
| 3.2.3 缺硒鸡胚脑神经元细胞形态观察结果 |
| 3.2.4 缺硒鸡胚脑神经元硒蛋白表达检测结果 |
| 3.2.5 缺硒鸡胚脑神经元SELS及内质网应激检测结果 |
| 3.2.6 缺硒鸡胚脑神经元ROS水平及抗氧化能力检测结果 |
| 3.2.7 缺硒鸡胚脑神经元溶酶体稳态检测结果 |
| 3.2.8 缺硒鸡胚脑神经元自噬流检测结果 |
| 3.2.9 缺硒鸡胚脑神经元凋亡检测结果 |
| 3.3 SELS敲低鸡胚脑神经元相关指标检测结果 |
| 3.3.1 鸡胚脑神经元SELS敲低模型的建立 |
| 3.3.2 SELS敲低鸡胚脑神经元细胞形态观察结果 |
| 3.3.3 SELS敲低鸡胚脑神经元内质网定位硒蛋白及内质网应激检测结果 |
| 3.3.4 SELS敲低鸡胚脑神经元ROS水平及抗氧化能力检测结果 |
| 3.3.5 SELS敲低鸡胚脑神经元溶酶体稳态检测结果 |
| 3.3.6 SELS敲低鸡胚脑神经元自噬流检测结果 |
| 3.3.7 SELS敲低鸡胚脑神经元凋亡检测结果 |
| 3.4 NAC处理SELS敲低鸡胚脑神经元相关指标检测结果 |
| 3.4.1 NAC处理SELS敲低鸡胚脑神经元ROS检测结果 |
| 3.4.2 NAC处理SELS敲低鸡胚脑神经元溶酶体稳检测结果 |
| 3.4.3 NAC处理SELS敲低鸡胚脑神经元自噬流检测结果 |
| 3.4.4 NAC处理SELS敲低鸡胚脑神经元凋亡检测结果 |
| 3.5 E-64处理SELS敲低鸡胚脑神经元相关指标检测结果 |
| 3.5.1 E-64处理SELS敲低鸡胚脑神经元胞浆CTSB检测结果 |
| 3.5.2 E-64处理SELS敲低鸡胚脑神经元凋亡检测结果 |
| 3.6 Pepstatin A处理SELS敲低鸡胚脑神经元相关指标检测结果 |
| 3.6.1 Pepstatin A处理SELS敲低鸡胚脑神经元胞浆CTSD检测结果 |
| 3.6.2 Pepstatin A处理SELS敲低鸡胚脑神经元凋亡检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸡缺硒性小脑损伤、鸡胚脑神经元缺硒及SELS敲低模型的建立 |
| 4.1.1 鸡缺硒性小脑损伤模型的建立 |
| 4.1.2 鸡胚脑神经元培养条件优化及缺硒模型建立 |
| 4.1.3 硒对SELS表达的影响及SELS敲低鸡胚脑神经元模型的建立 |
| 4.2 缺硒对鸡小脑金属离子稳态的影响 |
| 4.3 缺硒对鸡小脑mRNA转录组学的影响 |
| 4.4 SELS对脑神经元内质网应激的影响 |
| 4.5 SELS对脑神经元抗氧化能力的影响 |
| 4.6 SELS对脑神经元溶酶体稳态的影响 |
| 4.7 SELS对脑神经元自噬流的影响 |
| 4.8 SELS对脑神经元细胞凋亡的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）miR-141-3p通过靶基因SIRT1调控帕金森细胞模型线粒体功能的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:SIRT1 在帕金森病及帕金森细胞模型中的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 PC12 细胞复苏 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验步骤 |
| 2.2 PC12 细胞培养 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要实验步骤 |
| 2.3 NGF-beta对 PC12 细胞进行诱导分化 |
| 2.3.1 主要仪器 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要实验步骤 |
| 2.4 帕金森细胞模型构建 |
| 2.4.1 主要仪器 |
| 2.4.2 主要试剂 |
| 2.4.3 主要实验步骤 |
| 2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.5.1 主要仪器 |
| 2.5.2 主要试剂 |
| 2.5.3 主要实验步骤 |
| 2.6 Western blot检测帕金森病相关指标(SIRT1, α-syn)的表达情况 |
| 2.6.1 主要仪器 |
| 2.6.2 主要试剂 |
| 2.6.3 主要实验步骤 |
| 2.7 MTT检测MPP+处理NGF诱导后的PC12 细胞活力 |
| 2.7.1 主要仪器 |
| 2.7.2 主要试剂 |
| 2.7.3 主要实验步骤 |
| 2.8 细胞免疫荧光分析PC12 细胞中α-synuclein的存在形式 |
| 2.8.1 主要仪器 |
| 2.8.2 主要试剂 |
| 2.8.3 主要实验步骤 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NGF诱导PC12 细胞向神经细胞分化 |
| 3.2 MPP+诱导PC12 细胞形成帕金森细胞模型 |
| 3.3 SIRT1在PC12 帕金森细胞模型中表达量下调 |
| 3.4 SIRT1 在帕金森患者神经元细胞中表达降低 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:SIRT1 调控帕金森细胞模型线粒体功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 PC12 细胞培养 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验步骤 |
| 2.2 NGF-beta对 PC12 细胞进行诱导分化 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要实验步骤 |
| 2.3 帕金森细胞模型构建 |
| 2.3.1 主要仪器 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要实验步骤 |
| 2.4 PC12 帕金森细胞模型转染SIRT1 |
| 2.4.1 主要仪器 |
| 2.4.2 主要试剂 |
| 2.4.3 主要实验步骤 |
| 2.5 NF-κB信号通路抑制剂处理 |
| 2.5.1 主要仪器 |
| 2.5.2 主要试剂 |
| 2.5.3 主要实验步骤 |
| 2.6 流式细胞术分析PC12 帕金森细胞模型中凋亡水平,ROS含量以及线粒体膜电位的变化 |
| 2.6.1 主要仪器 |
| 2.6.2 主要试剂 |
| 2.6.3 主要实验步骤 |
| 2.7 Western blot检测相关信号通路及效应蛋白的表达情况 |
| 2.7.1 主要仪器 |
| 2.7.2 主要试剂 |
| 2.7.3 主要实验步骤 |
| 2.8 ELISA |
| 2.8.1 主要仪器 |
| 2.8.2 主要试剂 |
| 2.8.3 主要实验步骤 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SIRT1 抑制MPP+诱导的PC12 细胞凋亡 |
| 3.2 SIRT1 上调PC12 细胞的线粒体膜电位 |
| 3.3 SIRT1 抑制PC12 细胞产生ROS |
| 3.4 SIRT1 调控PC12 帕金森细胞模型中相关蛋白的表达 |
| 3.5 SIRT1 调控PC12 帕金森细胞模型中炎性因子的释放 |
| 3.6 SIRT1 抑制PC12 细胞中的NF-κB信号通路 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:miR-141-3p通过靶基因SIRT1 调控帕金森细胞模型线粒体功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 PC12 细胞培养 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验步骤 |
| 2.2 NGF-beta对 PC12 细胞进行诱导分化 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要实验步骤 |
| 2.3 帕金森细胞模型构建 |
| 2.3.1 主要仪器 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要实验步骤 |
| 2.4 细胞转染 |
| 2.4.1 主要仪器 |
| 2.4.2 主要试剂 |
| 2.4.3 主要实验步骤 |
| 2.5 SIRT1 激活剂以及抑制剂处理 |
| 2.5.1 主要仪器 |
| 2.5.2 主要试剂 |
| 2.5.3 主要实验步骤 |
| 2.6 Western blot检测相关蛋白的表达情况 |
| 2.6.1 主要仪器 |
| 2.6.2 主要试剂 |
| 2.6.3 主要实验步骤 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.7.1 主要仪器 |
| 2.7.2 主要试剂 |
| 2.7.3 主要实验步骤 |
| 2.8 荧光素酶报告基因实验 |
| 2.8.1 主要仪器 |
| 2.8.2 主要试剂 |
| 2.8.3 主要实验步骤 |
| 2.9 流式细胞术检测细胞凋亡,ROS含量以及线粒体膜电位变化 |
| 2.9.1 主要仪器 |
| 2.9.2 主要试剂 |
| 2.9.3 主要实验步骤 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-141-3p在帕金森细胞模型中表达上调 |
| 3.2 miR-141-3p加速MPP+诱导的PC12 细胞凋亡 |
| 3.3 miR-141-3p调控PC12 细胞的线粒体膜电位 |
| 3.4 miR-141-3p促进帕金森细胞模型中ROS的产生 |
| 3.5 SIRT1为miR-141-3p直接作用靶基因 |
| 3.6 miR-141-3p通过SIRT1 调控PC12 细胞线粒体膜电位 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 microRNA与帕金森病研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 上篇文献综述 |
| 综述一 缺血性中风背景下的神经血管单元 |
| 1. 缺血性中风的研究现状 |
| 2. 神经血管单元的组成 |
| 3. 在正常和低氧条件下的生理学 |
| 4. 缺血性脑卒中的实验模型 |
| 5. 基于神经血管单元的治疗策略 |
| 6. 参考文献 |
| 综述二 中药抗缺血性脑卒中的研究进展 |
| 一. 植物药 |
| 1.1 人参 |
| 1.2 栀子 |
| 1.3 姜黄 |
| 1.4 丹参 |
| 1.5 黄芪 |
| 1.6 川芎 |
| 1.7 地黄 |
| 1.8 黄连 |
| 二. 动物药 |
| 2.1 牛黄 |
| 2.2 麝香 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 下篇 实验研究 |
| 实验一 “神经血管单元”体外模型的建立以及缺氧/复氧模型的建立 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 实验二 牛黄及其有效成分对单独培养的神经元、星形胶质细胞、内皮细胞的细胞毒性 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 牛黄及其有效成分对脑神经血管单元的保护作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验五 牛磺酸和熊去氧胆酸对神经血管单元的作用机制 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验六 牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）活性肽OM-LV20通过色氨酸羟化酶1介导的促脑缺血损伤修复作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| OM-LV20对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| OM-LV20通过调控色氨酸羟化酶1对氧化应激下大鼠星形胶质细胞的神经保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 主要创新点与展望 |
| 综述 外源性应用多肽分子防治缺血性脑卒中损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）应用CRISPR/Cas9技术构建Wilson病小鼠模型及其基因治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 Wilson病 |
| 1.1.1 遗传学 |
| 1.1.2 铜稳态 |
| 1.1.3 发病机制和病理生理 |
| 1.1.4 临床症状和体征 |
| 1.1.5 治疗策略 |
| 1.2 结构性影像学在Wilson病诊断中的应用 |
| 1.3 Wilson病的动物模型 |
| 1.4 CRISPR/Cas9技术在疾病模型构建中的应用 |
| 1.5 本课题的研究思路 |
| 第2章 利用CRISPR/Cas9技术构建ATP7B点突变Wilson病小鼠模型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ATP7B基因R778L、P992L质粒的构建与验证 |
| 2.3.2 ATP7B基因R778L、P992L基因编辑胚胎定点整合效率 |
| 2.3.3 R778L、P992L基因编辑F0、F1和F2小鼠鉴定 |
| 2.3.4 R778L、P992L小鼠存在铜转运蛋白表达异常 |
| 2.3.5 R778L、P992L小鼠存在铜代谢异常 |
| 2.3.6 R778L、P992L小鼠存在肝脏铜沉积并伴肝组织病理性损伤 |
| 2.3.7 R778L、P992L小鼠CNS存在铜蓄积并伴行为学异常 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章结论 |
| 第3章 NLRP3炎症小体在WD小鼠神经病理损伤中的作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 NLRP3炎症小体激活与WD |
| 3.3.2 铜诱导小胶质细胞NLRP3炎症小体活化和ASC胞外的释放 |
| 3.3.3 抑制NLRP3的激活可改善铜诱导的神经炎症 |
| 3.3.4 MCC950可抑制铜诱导的小胶质细胞内NLRP3炎症小体的激活 |
| 3.3.5 MCC950可逆转WD小鼠脑内神经元损伤 |
| 3.3.6 MCC950抑制WD小鼠脑内NLRP3炎症小体的活化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章结论 |
| 第4章 使用腺相关病毒系统基因治疗WD模型小鼠 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 AAV9载体可在WD小鼠肝脏内有效转录 |
| 4.3.2 AAV9-ATP7B基因治疗可纠正WD小鼠铜代谢异常 |
| 4.3.3 AAV9-ATP7B基因治疗可抑制WD小鼠肝脏铜蓄积和肝损伤 |
| 4.3.4 AAV9-ATP7B基因治疗可逆转WD小鼠脑铜蓄积和行为学异常 |
| 4.3.5 AAV9-ATP7B治疗抑制WD小鼠脑内NLRP3炎症小体激活并改善神经元损伤 |
| 4.3.6 AAV9-ATP7B基因治疗可恢复WD小鼠的生理性铜排泄 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章结论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（7）天麻中的有效成分靶向MT1发挥镇静安神作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 睡眠 |
| 1.1.1 睡眠的生理功能及其意义 |
| 1.1.2 睡眠的监测及其判断 |
| 1.1.3 睡眠时相的划分及其特点 |
| 1.1.4 睡眠障碍概述 |
| 1.1.5 睡眠剥夺与记忆 |
| 1.1.6 睡眠障碍的治疗 |
| 1.1.7 失眠动物模型的构建 |
| 1.2 G蛋白偶联受体 |
| 1.2.1 G蛋白偶联受体的结构及分类 |
| 1.2.2 与睡眠相关的G蛋白偶联受体 |
| 1.3 褪黑素受体在哺乳动物中参与的睡眠调节 |
| 1.3.1 褪黑素受体 |
| 1.3.2 褪黑素受体结构与分类 |
| 1.3.3 褪黑素受体参与睡眠相关的功能 |
| 1.4 天麻 |
| 1.4.1 植物学 |
| 1.4.2 天麻的成分 |
| 1.4.3 天麻中活性成分的药理作用 |
| 1.5 天然产物作用靶标的鉴定 |
| 1.5.1 小分子探针技术 |
| 1.5.2 细胞热转变分析技术(CETSA) |
| 1.5.3 药物亲和靶标稳定系技术(DARTS) |
| 1.5.4 荧光共振能量转移技术(FRET) |
| 1.6 鼻腔滴注的给药方式 |
| 1.7 本论文研究意义 |
| 第二章 以MT_1、MT_2、OX_1、D_2、D_3为靶点的药物筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种及质粒 |
| 2.1.2 实验用细胞 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.2.6 化合物对受体高表达细胞系刺激实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 以多巴胺受体D_2为靶点的药物筛选 |
| 2.3.2 以多巴胺受体D_3为靶点的药物筛选 |
| 2.3.3 以食欲素受体OX_2为靶点的药物筛选 |
| 2.3.4 以褪黑素受体MT_2为靶点的药物筛选 |
| 2.3.5 以褪黑素受体MT_1为靶点的药物筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 在MT_1受体水平上对天麻活性成分的验证和鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种及质粒 |
| 3.1.2 主要仪器及设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 酶切法验证天麻活性成分与褪黑素受体的结合 |
| 3.2.2 热稳定(CETSA)法验证天麻活性成分与褪黑素受体的结合 |
| 3.2.3 点突变方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 巴利森苷A浓度梯度处理MT_1受体细胞验证相互作用 |
| 3.3.2 热稳定法验证巴利森苷A与 MT_1受体细胞的相互作用 |
| 3.3.3 酶切法(DARTS)验证巴利森苷A与 MT_1受体细胞的相互作用 |
| 3.3.4 荧光共振能链转移技术(FRET)验证巴利森苷A与 MT_1受体的相互作用 |
| 3.3.5 点突变关键结合位点区域氨基酸的褪黑素受体MT_1受体与巴利森苷A的相互作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 天麻中的活性成分改善小鼠睡眠实验的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验分组 |
| 4.2.2 鼻腔给药 |
| 4.2.3 睡眠各指标指标判定 |
| 4.2.4 自发运动能力测试 |
| 4.2.5 q-PCR实验 |
| 4.2.6 多巴胺(DA)和五羟色胺(5-HT)检测 |
| 4.2.7 血常规检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 天麻的三种入血成分给药小鼠可以发挥安神作用 |
| 4.3.2 天麻的三种入血成分给药小鼠可以发挥镇静作用 |
| 4.3.3 天麻的三种入血成分可以不同程度增加小鼠脑内神经递质多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的含量 |
| 4.3.4 天麻对小鼠脑肝肾脾炎症因子表达的影响 |
| 4.3.5 天麻对小鼠血常规生化指标的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A(攻读学位期间发表论文目录) |
（8）蛛网膜下腔出血细胞模型应用P38抑制剂后的蛋白组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述:自噬在蛛网膜下腔出血后作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）磷脂内翻酶β亚基TMEM30A及其相关基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物膜两侧磷脂的不对称分布 |
| 1.2 磷脂内翻酶 |
| 1.2.1 磷脂内翻酶将磷脂向胞质面翻转 |
| 1.2.2 介导囊泡转运是磷脂内翻酶的重要细胞功能 |
| 1.2.3 磷脂内翻酶在体内承担重要功能 |
| 1.3 TMEM30家族 |
| 1.4 选题依据和研究思路 |
| 第二章 TMEM30A在视网膜中的功能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器设备 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验抗体 |
| 2.2.4 实验动物 |
| 2.2.5 主要试剂配方 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠基因鉴定 |
| 2.3.1.1 鼠尾样本处理 |
| 2.3.1.2 PCR扩增 |
| 2.3.1.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.2 他莫昔芬注射诱导 |
| 2.3.3 小鼠胚胎成纤维细胞分离与培养 |
| 2.3.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞分离 |
| 2.3.3.2 细胞传代 |
| 2.3.3.3 细胞冻存 |
| 2.3.3.4 细胞复苏 |
| 2.3.4 视网膜电图 |
| 2.3.5 石蜡切片及H&E染色 |
| 2.3.6 细胞免疫荧光染色 |
| 2.3.7 视网膜组织冰冻切片和免疫荧光染色 |
| 2.3.7.1 眼球包埋切片 |
| 2.3.7.2 免疫荧光染色 |
| 2.3.8 视网膜铺片及染色 |
| 2.3.9 RNA水平表达检测 |
| 2.3.9.1 总RNA提取 |
| 2.3.9.2 逆转录PCR |
| 2.3.9.3 实时荧光定量PCR |
| 2.3.9.4 PCR扩增及琼脂糖凝胶检测 |
| 2.3.10 Western Blot |
| 2.3.10.1 蛋白样品制备 |
| 2.3.10.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3.10.3 转膜 |
| 2.3.10.4 抗体孵育及检测 |
| 2.3.11 翻转酶活性检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 Tmem30a在小鼠视网膜中表达 |
| 2.4.2 TMEM30A维持感光细胞功能和生存 |
| 2.4.2.1 Tmem30a视锥细胞敲除小鼠的构建与验证 |
| 2.4.2.2 HKO小鼠视功能减退 |
| 2.4.2.3 Tmem30a敲除导致视锥细胞中视蛋白错误定位 |
| 2.4.2.4 HKO小鼠视锥细胞丢失 |
| 2.4.2.5 Tmem30a全身敲除小鼠的构建与验证 |
| 2.4.2.6 GKO小鼠视功能减退 |
| 2.4.2.7 TMEM30A缺失导致视网膜感光细胞快速死亡 |
| 2.4.2.8 TMEM30A决定Atp8a2细胞定位 |
| 2.4.2.9 TMEM30A决定细胞膜表面的PS内翻 |
| 2.4.2.10 GKO小鼠视网膜细胞凋亡通路激活 |
| 2.4.3 TMEM30A缺失引起视网膜双极细胞病变 |
| 2.4.3.1 Tmem30a双极细胞敲除小鼠构建与验证 |
| 2.4.3.2 PKO小鼠视觉传递功能减退 |
| 2.4.3.3 PKO小鼠双极细胞丢失 |
| 2.4.3.4 TMEM30A影响双极细胞视觉传递功能 |
| 2.4.3.5 TMEM30A缺失引发视网膜神经胶质细胞增生 |
| 2.4.3.6 TMEM30A缺失导致双极细胞凋亡 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 第三章 TMEM30A在小脑浦肯野细胞中的功能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器设备 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验抗体 |
| 3.2.4 实验动物 |
| 3.2.5 质粒和细胞系 |
| 3.2.6 主要试剂配方 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 质粒转化与提取 |
| 3.3.1.1 质粒转化 |
| 3.3.1.2 质粒提取 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细胞转染 |
| 3.3.4 小鼠基因鉴定 |
| 3.3.5 石蜡切片及H&E染色 |
| 3.3.6 细胞免疫荧光染色 |
| 3.3.7 小脑组织冰冻切片和免疫荧光染色 |
| 3.3.7.1 小鼠全身灌注 |
| 3.3.7.2 小脑包埋切片 |
| 3.3.7.3 免疫荧光染色 |
| 3.3.8 RNA水平表达分析 |
| 3.3.8.1 总RNA提取 |
| 3.3.8.2 逆转录PCR |
| 3.3.8.3 实时荧光定量PCR |
| 3.3.9 Western Blot |
| 3.3.10 透射电子显微镜检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 敲除鼠的构建与验证 |
| 3.4.1.1 Tmem30a浦肯野细胞敲除鼠的构建与鉴定 |
| 3.4.1.2 Tmem30a敲除效率验证 |
| 3.4.2 PKO小鼠出现共济失调 |
| 3.4.3 Tmem30a敲除导致小脑萎缩 |
| 3.4.4 Tmem30a敲除导致浦肯野细胞退化死亡 |
| 3.4.5 PKO敲除鼠小脑星形胶质细胞增生 |
| 3.4.6 TMEM30A参与蛋白囊泡转运并维持内质网稳态 |
| 3.4.7 内质网应激引发凋亡级联反应 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第四章 TMEM30A在胰岛β细胞中的功能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器设备 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验抗体 |
| 4.2.4 实验动物 |
| 4.2.5 质粒病毒和细胞系 |
| 4.2.6 主要试剂配方 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 质粒转化与提取 |
| 4.3.2 细胞培养 |
| 4.3.3 细胞转染 |
| 4.3.4 干扰慢病毒转染 |
| 4.3.5 小鼠基因鉴定 |
| 4.3.6 小鼠胰岛分离与培养 |
| 4.3.7 石蜡切片H&E染色和马松染色 |
| 4.3.8 肝脏冰冻切片和油红O染色 |
| 4.3.8.1 肝脏冰冻切片 |
| 4.3.8.2 油红O染色 |
| 4.3.9 胰岛组织冰冻切片和免疫荧光染色 |
| 4.3.9.1 胰岛冰冻切片 |
| 4.3.9.2 免疫荧光染色 |
| 4.3.10 细胞免疫荧光染色 |
| 4.3.11 RNA水平表达检测 |
| 4.3.11.1 总RNA提取 |
| 4.3.11.2 逆转录PCR |
| 4.3.11.3 实时荧光定量PCR |
| 4.3.12 Western Blot |
| 4.3.13 钙离子内流检测 |
| 4.3.14 膜片钳实验 |
| 4.3.15 透射电子显微镜检测 |
| 4.3.16 酶联免疫吸附 |
| 4.3.17 糖代谢检测 |
| 4.3.17.1 血糖检测 |
| 4.3.17.2 腹腔注射葡萄糖耐受实验 |
| 4.3.17.3 腹腔注射胰岛素耐受实验 |
| 4.3.17.4 葡萄糖刺激胰岛素释放实验 |
| 4.3.18 翻转酶活性检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 敲除小鼠的构建与验证 |
| 4.4.1.1 Tmem30a胰岛β细胞敲除鼠的构建与鉴定 |
| 4.4.1.2 Tmem30a敲除效率验证 |
| 4.4.2 IKO敲除鼠的肥胖表型 |
| 4.4.3 IKO敲除鼠糖代谢异常 |
| 4.4.4 IKO敲除鼠出现Ⅱ型糖尿病表征和肝脏病变 |
| 4.4.4.1 IKO敲除鼠出现胰岛增生和胰岛素抵抗等表型 |
| 4.4.4.2 老年IKO敲除鼠出现肝脏病变 |
| 4.4.5 TMEM30A缺失导致胰岛素成熟分泌受阻 |
| 4.4.5.1 高糖刺激胰岛素分泌减少导致高血糖 |
| 4.4.5.2 IKO敲除鼠β细胞胰岛素含量降低 |
| 4.4.5.3 TMEM30A缺失导致胰岛素剪切成熟和分泌减少 |
| 4.4.6 TMEM30A决定胰岛素囊泡在高尔基体释放 |
| 4.4.6.1 Tmem30a敲减MIN6细胞中胰岛素成熟分泌受阻 |
| 4.4.6.2 敲减MIN6细胞中胰岛素异常聚集于高尔基体 |
| 4.4.6.3 sh RNA对抗质粒过表达挽救胰岛素成熟分泌缺陷 |
| 4.4.7 TMEM30A参与Clathrin介导的囊泡转运 |
| 4.4.7.1 敲减MIN6细胞中Clathrin表达定位异常 |
| 4.4.7.2 Tmem30a敲减导致Clathrin介导的内吞途径受阻 |
| 4.4.8 GLUT2膜向转运失败导致高糖级联反应丧失 |
| 4.4.8.1 IKO敲除鼠胰岛β细胞中GLUT2表达定位异常 |
| 4.4.8.2 敲减MIN6细胞中高糖级联反应消失 |
| 4.4.9 TMEM30A决定P4-ATP酶的细胞定位和功能发挥 |
| 4.4.9.1 TMEM30A缺失导致P4-ATP酶表达量下调 |
| 4.4.9.2 TMEM30A决定互作P4-ATP酶的亚细胞定位 |
| 4.4.9.3 TMEM30A缺失导致细胞膜上PS内翻减弱 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（10）间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 筛选方法 |
| 1.2.1 文献入选标准 |
| 1.2.2 文献的排除标准 |
| 1.3 文献质量评估方法 |
| 2 结果Results |
| 2.1 脊髓损伤 |
| 2.2 间充质干细胞治疗脊髓损伤 |
| 2.3 无细胞治疗的衍生 |
| 2.4 间充质干细胞分泌组 |
| 2.4.1 间充质干细胞分泌组的定义及成分 |
| 2.4.2 间充质干细胞外泌体 |
| 2.4.3 间充质干细胞分泌组的获取与应用策略 |
| 2.4.4 间充质干细胞分泌组治疗的研究现状 |
| 2.5间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤 |
| 2.5.1 间充质干细胞分泌组的神经保护作用 |
| 2.5.2 间充质干细胞分泌组的免疫调节作用 |
| 2.5.3 间充质干细胞分泌组促进神经再生的作用 |
| 2.5.4 间充质干细胞分泌组对抗瘢痕的作用 |
| 2.5.5 间充质干细胞分泌组促进血管形成的作用 |
| 2.6 问题与展望 |
| 3 总结Conclusions |
四、巨噬细胞条件培养基对小脑皮质神经元生存的影响（论文参考文献）
- [1]过度训练对小鼠海马中脑特异性microRNAs表达水平的影响[D]. 徐琳. 南京体育学院, 2021
- [2]硒蛋白S调控溶酶体稳态在鸡缺硒性小脑神经元凋亡中作用机理的研究[D]. 赵霞. 东北农业大学, 2021
- [3]miR-141-3p通过靶基因SIRT1调控帕金森细胞模型线粒体功能的机制研究[D]. 郑玉敏. 中国医科大学, 2021
- [4]牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究[D]. 杜欣. 北京中医药大学, 2021
- [5]活性肽OM-LV20通过色氨酸羟化酶1介导的促脑缺血损伤修复作用和机制研究[D]. 尹赛格. 昆明医科大学, 2021
- [6]应用CRISPR/Cas9技术构建Wilson病小鼠模型及其基因治疗研究[D]. 董健健. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [7]天麻中的有效成分靶向MT1发挥镇静安神作用的研究[D]. 邢其郡. 昆明理工大学, 2021
- [8]蛛网膜下腔出血细胞模型应用P38抑制剂后的蛋白组学分析[D]. 姬康祁. 新乡医学院, 2021(01)
- [9]磷脂内翻酶β亚基TMEM30A及其相关基因的功能研究[D]. 杨业明. 电子科技大学, 2020(01)
- [10]间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 万然,史旭,刘京松,王岩松. 中国组织工程研究, 2021(07)