一、禽白血病／肉瘤病毒群特异性抗原P_（27）~（gag）的分离和纯化（论文文献综述）
毛娅卿[1]（2014）在《禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析》文中指出禽白血病（Avian leukosis）是制约养禽业发展的主要禽类传染病,以垂直传播为主,免疫污染禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）的活疫苗也是引发该病的重要原因之一。目前主要通过定期对鸡群进行ALV血清学监测,采取淘汰净化的方法控制该病。我国开展ALV血清学监测通常使用美国IDEXX等公司的检测试剂盒,检测成本高、推广范围窄。因此,研究开发具有自主知识产权的ALV检测试剂盒,降低ALV检测成本,扩大鸡群检测范围,对我国防控本病有重要的实际应用意义。另外,ALV-J在临床上自报道以来一直处于不断的变异中,当前尚无确切证据证明ALV-J在我国鸡群中致病作用有多样性的机制,而病毒准种的多样性很有可能是ALV-J致病作用多样性的机制之一。因此,开展ALV准种研究对于从分子水平上解析ALV-J在我国不同鸡群中致病作用的多样性具有重要的理论意义。本研究通过原核表达ALV p27蛋白,制备抗p27蛋白多克隆抗体,建立了ALV抗原ELISA检测方法和ALV抗体ELISA检测方法。试验结果表明,建立的两种检测方法与禽常见传染病病毒或其阳性血清、大肠杆菌阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性；两种方法的批内、批间重复性试验变异系数均小于10%,具有良好的可重复性；ALV抗原ELISA检测方法与IDEXX公司的ALV抗原检测试剂盒敏感性相当,符合率达到98.9%；ALV抗体ELISA检测方法比IDEXX公司的ALVA/B和J亚群抗体检测试剂盒相对于间接免疫荧光试验（IFA）有更高的符合率。利用本研究建立的抗原ELISA检测方法对918批不同疫苗进行了ALV检测,结果检测出63批外源性ALV污染疫苗。从2006年-2009年间污染的FPV. NDV和IBDV活疫苗中分别分离和鉴定到三株ALV,并对这三株ALV进行全基因组序列测定与分析。结果显示,三株ALV的gp85氨基酸序列与A亚群ALV参考毒株的gp85氨基酸序列同源性最高,为88.3%-97.7%,并且他们的全基因组整体同源性均较高；三株ALV与2009年分离自海兰褐祖代鸡的A亚群ALV中国分离株SDAU09C3同源性最高,显示它们很可能有共同的来源,也说明疫苗ALV污染是导致临床上鸡群发病的原因之一。从山东省某地方品系鸡疑似白血病发病鸡群分离到自然感染的血管瘤型ALV-J,并采用本研究建立的ALV抗原／抗体ELISA检测方法进行了抗原和抗体验证,同时选取LY1201株对其env基因进行了比较分析。结果证明ALV-J单一病毒株中存在差异极大的不同准种,发现gp85在氨基酸位点210-219发生10个连续的氨基酸缺失的准种,该缺失在此前我国ALV-J野毒株中均未发现,该研究说明可通过gp85序列测定进行ALV准种分析研究。在此基础上,将ALV-J LY1201株在DF-1细胞上连传3代后,扩增其gp85基因并对其20个阳性克隆子进行测序和准种分析,结果发现在20个克隆中gp85缺失的突变准种已经完全消失,原来的优势准种比例由33.3%上升为85.0%成为绝对优势准种。这表明ALV-J在适应细胞复制过程中病毒的准种组成是不断变化的,且发生突变的准种只有其复制能力高于原优势准种才可能具备竞争性优势。综上所述,本研究建立的ALV抗原/抗体ELISA检测方法,可用于ALV病毒检测和血清学监测,对于控制我国禽用病毒类活疫苗质量,加强禽白血病防控和净化具有重要的意义。目前本研究建立的ALV抗原ELISA检测方法已作为国家标准用于禽用病毒类活疫茁外源病毒检验。从禽用病毒类活疫苗中分离到污染的ALV,提示加强疫苗中ALV等外源病毒监测的重要性。同时,本研究建立的ALV-J准种分析方法,对于解析ALV-J在我国不同鸡群中致病作用的多样性提供了理论与技术支持。
俞燕[2]（2019）在《地方品种鸡群禽白血病流行病学调查及检测净化技术研究》文中研究指明禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）/肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。根据病毒囊膜蛋白的抗原性,ALV可分为A～J 10个亚群,以及新鉴定的K亚群。其中,对鸡具有致病性的外源性ALV包括A、B、C、D、J和K亚群。自1908年首次报道并分离到ALV以来,世界上许多国家都有该病的发生和流行,我国肉鸡、蛋鸡及地方品种鸡群也普遍存在ALV的感染。除典型的肿瘤性病变外,ALV感染引起的免疫抑制、生长迟缓、产蛋下降等亚临床表现所造成的经济损失更为严重。禽白血病是垂直传播性疫病,至今尚无有效的药物和疫苗可供使用,控制该病最有效的措施是通过病原检测,淘汰阳性鸡,达到净化种群的目的。国际育种公司在20世纪80年代末就实现了对经典外源性ALV的净化,2005年前后又实现了 ALV-J的基本净化。国内一些自繁自养的育种公司从2002年起也开始在种鸡核心群开展禽白血病净化,有些已取得显着效果。但在大多数黄羽肉鸡和众多地方品种鸡群中,禽白血病仍在流行和蔓延,对我国家禽种质资源的安全构成了极大威胁。本研究对某原种场保存的20多个地方品种鸡进行了禽白血病流行病学调查,全面了解地方品种鸡群禽白血病感染动态;并对分离到的一株ALV-K全基因组做了系统分析,解析其来源及分子特性;针对地方品种鸡群流行最广的ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K,建立了多重PCR检测方法;为丰富禽白血病检测净化技术,对种公鸡精液ALV检测方法进行了摸索和可行性分析;在此基础上,对DX、LY、XJ和LH 4个地方品种鸡核心群开展了禽白血病净化示范,验证和完善净化技术方案,为原种场禽白血病净化提供参考依据。1.地方品种鸡群禽白血病流行病学调查为深入了解我国地方品种鸡群禽白血病流行情况,2013～2017年间对某原种场从全国各地收集并保存的26个地方品种鸡开展了禽白血病流行病学调查,包括血清学ALV-J和ALV-A/B抗体检测、蛋清p27抗原检测、血浆和组织病料病毒分离检测等;对部分外源性ALV分离株前病毒DNA的env基因进行克隆和测序,将分离株gp85氨基酸序列与GenBank登录的各亚群ALV参考株进行比对和绘制遗传进化树,鉴定病毒亚群,并进行序列分析。血清学调查结果显示,有22个鸡种ALV-J抗体呈阳性,18个鸡种ALV-J和ALV-A/B抗体呈双阳性,且绝大多数（19/26）鸡种ALV-J抗体阳性率高于ALV-A/B抗体,个别鸡种ALV-J抗体阳性率大于50%。蛋清p27抗原检测结果显示,各品种鸡群均存在排毒状态的母鸡,尤其YJ、WX、BJ、DJ和ZJ鸡种蛋清p27抗原阳性率高于50%。血浆病毒分离检测结果表明,各品种鸡对ALV均易感,感染水平存在显着差异;大部分（15/21）鸡种母鸡病毒血症阳性率高于公鸡,但差异不显着。56个外源性ALV分离株经亚群鉴定,27株为ALV-J,17 株为 ALV-K,8 株为 ALV-B,3 株为 ALV-A,1 株为 ALV-C。其中,有 9 株 ALV-J、3株ALV-K、1株ALV-A分离自组织病料;其余毒株均分离自表观健康鸡群血浆样品。表明,ALV-K已成为除ALV-J外,对地方品种鸡感染最严重的外源性ALV。与参考株相比,ALV分离株gp85氨基酸序列普遍存在点突变、插入或缺失性变异,部分变异呈规律性。研究结果证实了禽白血病在地方品种鸡群感染的普遍性和复杂性,开展禽白血病净化工作势在必行。2.K亚群禽白血病病毒全基因组测序及分析为全面了解ALV-K基因组特性,本研究对在流行病学调查过程中从LY鸡种血浆样品分离鉴定的一株ALV-K（JS13LY19株）前病毒DNA进行了分段克隆和测序,获得全长基因组序列,并将其各基因片段与GenBank登录的ALV参考株进行比对分析。结果显示,JS13LY19株基因组全长7483bp,符合复制完整C型反转录病毒特征,缺乏肿瘤基因。其gp85氨基酸序列与ALV-K参考株一致性90.9%～98.6%,显着高于其它亚群ALV,遗传进化树上与ALV-K参考株划为同一支;其中,与ALV-K原型株JS11C1一致性最高,二者显示出较多位点的规律性变异,但也存在5个位点差异。JS13LY19株gag、pol、gp37、LTR、UTR与内源性ALV显示更高的一致性（92.0%～99.4%）;LTRU3区比大部分外源性ALV LTR少了一个CAAT enhancer盒、PRE盒、CArG盒及Y盒。推测,JS13LY19株极有可能是JS11C1株与内源性ALV重组产生。拥有内源性ALVLTR及U3区转录调控元件的部分缺失,可能使JS13LY19株转录能力下降而致病性降低,其生物学特性有待进一步研究。3.禽白血病病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用流行病学调查结果显示,鸡群中存在的外源性ALV主要包括ALV-J、ALV-K、ALV-A和ALV-B。为快速掌握鸡群感染状态,本研究针对ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K参考株,设计了一条通用上游引物PF和四条特异性下游引物AR、BR、JR和KR,通过构建质粒标准品,对最适引物浓度、退火温度、循环数等反应条件进行优化,建立了一种能同时检测ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的多重PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了验证,将其应用于从地方品种鸡群分离的119份ALV样品的检测中。试验结果显示,使用 0.2 μM PF、0.1 μM AR、0.1 μM BR、0.1 μM JR 和 0.1 μM KR,56.0℃退火温度和30个循环的反应条件,建立的多重PCR方法检测效果最优,能检测出最低10 pg/μL的ALV前病毒DNA样品,特异性高,重复性好。对ALV样品的检测结果与流行病学调查结果基本相符,并能更高效地检测出ALV的多重感染。表明,地方品种鸡群除单一感染外,还存在 ALV-B+J、ALV-J+K 的二重感染,以及 ALV-A+B+J、ALV-A+B+K、ALV-B+J+K的三重感染。本研究为禽白血病流行病学调查及外源性ALV初步鉴定提供了技术支撑。4.种公鸡精液禽白血病病毒检测方法研究与应用选择合适的检测材料与方法对禽白血病净化会起到事半功倍的效果,为探讨种公鸡精液ALV检测的可行性与实用性,本研究对LK品种种公鸡精液经过滤、稀释、离心、冻融等不同处理方法,以及精液不同稀释度对病毒分离效果的影响进行了研究,并将确定的检测方法应用于LK、MQ和LH 3个品种种公鸡的检测净化中,同时与血浆病毒分离或血浆斑点杂交检测结果进行比较。结果,以血浆病毒分离为标准,精液样品经稀释离心后,取上清接种DF-1细胞,确保在培养基中最终稀释度为1:28～1:56时病毒分离效果最佳。初步应用结果显示,不同鸡种精液p27抗原ELISA检测阳性率均最高,但并不能将血浆和精液病毒分离检测为阳性的鸡均检出,存在“假阴性”;同一鸡种血浆和精液病毒分离阳性率高低不同,在LK和MQ种公鸡中,二者阳性符合率均低于50%,两种方法不可互相取代;LH种公鸡精液病毒分离阳性率显着高于血浆病毒分离,亦高于血浆斑点杂交,二者阳性符合率分别为100%和36.4%,精液病毒分离效果优于血浆病毒分离。研究结果提示,对种公鸡精液进行ALV检测具有可行性和必要性,由于不同鸡种净化进程不同、带毒排毒状态不一,检测方法也应灵活运用。本研究为种禽场禽白血病净化材料的选择与方案制定提供了参考依据。5.地方品种鸡群禽白血病示范性净化本研究在2013～2016年间对原种场保存的DX、LY、XJ和LH 4个鸡种核心群开展了禽白血病净化,通过新建净化鸡舍,采用1日龄胎粪p27抗原检测、6周龄血浆病毒分离、25～27周龄血浆/精液病毒分离+蛋清p27抗原检测、36～40周龄血浆/精液病毒分离+蛋清p27抗原检测等净化方案,在强化饲养管理的基础上,经过2～3个世代净化,各品种鸡群取得了显着净化效果。DX鸡种经过3个世代净化,25～27周龄蛋清p27抗原阳性率由26.4%降至0.3%,36～40周龄血浆病毒分离阳性率由36.4%降至0.4%,公鸡病毒分离阳性率连续2个世代均为零;LY鸡种经过3个世代净化,6周龄血浆病毒分离阳性率由33.2%降至1.2%,36～40周龄蛋清p27抗原和血浆病毒分离阳性率均降至零;XJ鸡种经过2个世代净化,留种前血浆病毒分离阳性率由61.8%降至0.9%;LH鸡种经过2个世代净化,留种前蛋清p27抗原阳性率由20.7%降至1.9%,血浆病毒分离阳性率降至0.2%。禽白血病净化对种鸡生产性能的影响,以DX鸡种为例,经过3个世代净化,育雏期、育成期和产蛋期死亡率均逐级下降,净化第一世代效果最为显着;产蛋性能亦明显提高,43周龄总产蛋数平均增加了 13枚/只,66周龄总产蛋数平均增加了 23枚/只。本研究为众多地方品种鸡群及原种场禽白血病净化工作的开展起到了良好的示范作用。
纪依依[3]（2016）在《禽白血病标准抗原、标准抗体候选物的研制》文中认为禽白血病（Avian Leukosis,简称AL）是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,简称ALV）感染引起的禽类各组织和脏器肿瘤。ALV现已分至A～K 11个亚群,A、B、C、D、E、J和K亚群分离自鸡。A～D和J、K亚群为外源性病毒,而E亚群是内源性禽白血病病毒,在许多品系鸡体内极普遍存在,低致病性或无致病性。为了建立禽白血病检测和净化规范,本研究开展了禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物和禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗、J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的研究,并以此作为生物学材料,对市场上相关试剂盒进行了检验,获得良好效果,为进一步净化禽白血病奠定了基础。一、禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的研制p27基因是禽白血病病毒A、B、C、D、J亚群和K亚群共同的高度保守的基因。本研究用表达禽白血病群特异性抗原GST-p27蛋白的pGEX-6p-1-p27重组菌进行诱导表达,对表达产物GST-p27进行了纯化,制备了ALV的重组GST-p27融合蛋白；同时扩增了J亚群禽白血病病毒JS09GY07株、A亚群禽白血病病毒AH10株；对这些候选物质进行了ELISA、PCR及IFA鉴定,同时通过一系列纯粹性、蛋白浓度、TCID50等标定,然后经过分装、物理性状检测及装量差异系数分析、细菌及支原体感染情况鉴定、均一性、稳定性以及保存时间的标定,分别制备出了禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物及其对应的弱阳性及阴性抗原,利用这些标准物质对市场上用于检测禽白血病群特异性抗原p27的试剂盒进行检验,发现市场上的试剂盒良莠不齐,提示在进行禽白血病检测及净化工作中选择市场上相应的试剂盒时应予以足够重视。二、禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗、J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的研制本研究分别复苏并扩增了针对禽白血病群特异性抗原p27蛋白的特异性单克隆抗体ALVp27-5D3杂交瘤细胞株及针对J亚群禽白血病特异性抗原gp85蛋白的单克隆抗体细胞株JE9,并分别将状态好的ALVp27-5D3杂交瘤细胞和JE9杂交瘤细胞腹腔注射6～8周龄的Balb/c雌性小鼠,大量制备ALVp27-5D3及JE9单克隆抗体腹水,并进行了纯化,制备了禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗候选物。用ALV-J通过肌肉注射途径对SPF鸡进行攻毒,五免十二天采血分离血清,作为J亚群禽白血病特异性标准血清候选物。用ALV-A通过腹腔注射、滴鼻点眼途径对SPF鸡进行攻毒,二免十二天采血分离血清,作为A亚群禽白血病特异性标准血清候选物。应用IFA、ELISA、Western blot等对制备好的禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗、J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物进行标定,然后进行分装、物理性状检测及装量差异系数分析,细菌及支原体感染、均一性、稳定性以及保存时间等一系列标定,最终获得了抗ALV-J和ALV-A的标准多抗血清和特异性标准单克隆抗体。分别将群特异性标准单抗候选物、J和A亚群禽白血病特异性标准血清的阳性、弱阳性及阴性抗体,对市场上检测禽白血病群特异性抗体、J和A亚群禽白血病特异性血清的试剂盒进行检验,发现市场上的试剂盒良莠不齐,在禽白血病检测及净化工作应予以高度重视。
杭柏林[4]（2014）在《J亚群禽白血病病毒JS09GY3株感染特性及感染鸡法氏囊转录组学分析》文中进行了进一步梳理禽白血病（Avian leukosis）是由反转录病毒科中禽白血病／肉瘤病毒（Avian leukosis sarcoma virus, ALSV）引起的禽类良性和恶性肿瘤性传染性疾病。禽白血病在临床上有多种类型,如淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、髓细胞性白血病、血管瘤、肾瘤、肉瘤和骨石化症等,同时导致鸡只体重增长下降、鸡群产蛋性能降低、免疫抑制。鸡的ALV分为6个亚群,即A、B、C、D、E、J,其中E亚群为内源性ALV,其余亚群为外源性ALV。J亚群ALV（ALV-J）于1988年首次在英国被鉴定,然后迅速传播到世界其它国家,给世界养禽业造成了严重的经济损失。在中国大陆,1999年首次从肉鸡中分离到ALV-J。目前,ALV-J感染在中国鸡群中流行很普遍,肿瘤类型多样,并向中国地方品系鸡群扩散。研究中国ALV-J分离株的感染特性有助于理解ALV-J的致病机制。本研究以ALV-JJS09GY3毒株为研究对象,观察了其感染SPF白来航鸡后抗原抗体的变化、临床症状和组织病理学变化以及肿瘤类型的变化等感染特性,并应用基因芯片分析了感染鸡法氏囊中的差异表达基因,为理解ALV-J的致病机制提供了新的观点。1.不同日龄鸡感染ALV-J的抗原和抗体变化规律为了解鸡感染ALV-J后抗原和血清中抗体的变化规律,本研究经卵黄囊途径或肌肉途径,将ALV-J JS09GY3株分别感染6胚龄SPF鸡胚、31日龄和56日龄SPF鸡,于感染后不同时间采集胎粪或泄殖腔棉拭子,同时采集血液、分离血清,以检测p27抗原、ALV-J特异性抗体（J型抗体）和p27抗体。结果显示,胚胎组在各检测点均可检测到p27抗原（仅1只鸡在1日龄时为阴性）,而31日龄组和56日龄组检测不到p27抗原；胚胎组没有检测到p27抗体,31日龄组中80%（4/5）的鸡在3次重复感染后可检测到p27抗体,56日龄组在首次感染后p27抗体的检出率较高（60%）；各组的J型抗体在各检测点上基本为阴性。结果表明,胚胎期感染ALV-J的鸡在出壳后形成免疫耐受,可通过泄殖腔排毒,但其不产生抗体；而高日龄鸡感染ALV-J后不通过泄殖腔排毒,大多数鸡产生p27抗体,但基本不产生J型抗体。2.不同方法检测J亚群禽白血病的效果比较与分析禽白血病是危害家禽养殖业的一种重要的病毒性肿瘤性传染病。快速准确诊断病毒感染对禽白血病的净化具有重要意义。本研究通过病毒分离方法、PCR方法和组织病理学方法对经卵黄囊途径感染ALV-J JS09GY3株后孵出的鸡在不同时间点进行了J亚群禽白血病的检测分析。结果显示,20份样品中,病毒分离-ELISA阳性率为65%,而病毒分离-IFA阳性率为75%,PCR的阳性率为95%,有2只鸡在肝脏上有大体病变,在肝脏、肾脏、心脏和肺脏上出现组织细胞学的变化,而脾脏上没有观察到组织细胞学的变化。研究表明,不同方法检测J亚群禽白血病的结果存在差异,PCR检测的阳性率最高,其在J亚群禽白血病的早期感染检测具有重要意义。3. ALV-J JS09GY3株对SPF鸡的感染特性研究为了解ALV-J JS09GY3株对SPF鸡的感染特性,本研究将ALV-JJS09GY3株通过卵黄囊途径感染6胚龄鸡胚,孵化后将鸡饲养至20周龄,观察临床症状和病理变化,并采集泄殖腔棉拭子以检测p27抗原,采集血液分离血清以检测p27抗体和J型抗体,采集抗凝血分离病毒。结果显示,ALV-J JS09GY3株可以引起感染鸡的死亡；对鸡的体重增长有一定的抑制作用,在8和12周龄时呈显着抑制（p<0.05）；肿瘤总体发生率为72.22%,在4周龄时可以观察到肿瘤样变化,随着日龄增加,机体许多组织器官出现肿瘤；其中血管瘤发生率达58.33%；经组织切片观察,除了经典的血管瘤现象外,还发现了卵巢腺癌和肌肉纤维瘤等：在20周试验期内,可以检测到泄殖腔中的p27抗原,从血液中分离到ALV-J,但不能检测到J型抗体,而p27抗体仅在16和20周龄的部分鸡只中检出。结果提示,JS09GY3株ALV-J的感染性较强,可以用作为建立ALV-J感染生物模型用的生物材料。4. ALV-J感染SPF鸡法氏囊转录组学分析ALV-J感染鸡只后,可导致肿瘤、免疫抑制和提高对其它病原的易感性,进而导致鸡群的高发病率和高死亡率。然而,鸡感染ALV后的机能反应状况还不清楚。本研究通过基因芯片技术探讨了ALV-J JS09GY3株感染SPF鸡后,其法氏囊产生的一系列反应。结果显示,感染鸡法氏囊组织中出现594个差异表达的转录子（差异倍数≥2,p<0.05）,这些差异表达基因涉及细胞过程、结合、生物学调节、代谢加工、刺激反应和免疫系统等反应。通过信号通路分析发现,差异表达基因主要参与了细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、RIG-I-like受体信号通路等。这些差异表达基因主要集中在chrl、chrUnrandom、chr2、chr4、chr7等染色体中。对这些差异表达基因编码蛋白的相互作用进行String预测分析表明,许多差异表达基因编码的蛋白之间存在着相互作用。本研究获得的ALV-J JS09GY3株感染鸡法氏囊反应谱为更好的理解ALV-J感染的分子机制提供了理论基础。
谢华丽[5]（2013）在《禽白血病抗原和抗体ELISA检测方法的建立》文中认为禽白血病（Avian Leukosis）是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus）引起的一种易传染的肿瘤性疾病。ALV能够引起鸡群患肿瘤性疾病,除了对鸡群造成直接危害外,还可导致鸡群免疫失败,继发感染,产蛋率降低等,给我国养禽业带来了巨大的损失。到目前为止,该病还没有研制出可用的疫苗和有效的治疗药物,只能采取净化措施控制病毒的传播。P27蛋白为ALV的衣壳蛋白、群特异性抗原,目前常运用ELISA方法监测P27抗原达到净化鸡群的目的。本研究中在原核表达技术的基础上制备重组P27蛋白,建立检测P27抗体的间接ELISA方法,并同时将P27蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠和日本大耳白兔,分别制备单克隆抗体和多克隆抗体,建立检测P27抗原的夹心ELISA检测方法,为禽白血病的临床快速诊断提供了有效工具。具体内容包括：1.P27基因的原核表达ALV P27基因克隆至原核表达载体pET28a,构建pET28a-P27重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG16℃过夜诱导获得以可溶形式高效表达的P27蛋白,对P27蛋白进行镍亲和层析纯化,并经SDS-PAGE以及western blot证明,该P27蛋白的纯化效果好,具有与鸡阳性血清反应的免疫原性。2.禽白血病病毒P27蛋白间接ELISA检测方法的建立以P27蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鸡IgY作为二抗,建立禽白血病抗体间接ELISA检测方法。通过方阵滴定实验和各种优化条件的摸索,最终确定P27蛋白的包被浓度为0.183μg/mL,血清稀释度为1：500,HRP标记的羊抗鸡IgY稀释度为1：60000。经试验结果证明,该方法具有特异性好、敏感性高和重复性稳定等特点。该方法可用于ALV所有亚群抗体的检测,与IDEXX AB亚群和IDEXX J亚群抗体检测试剂盒的总符合率为85.7%。3.P27蛋白单克隆抗体的制备及鉴定以纯化的P27蛋白为免疫原,按照常规方法免疫6-8周龄的Balb/C小鼠,取该小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,通过细胞培养和有限稀释法制备单克隆抗体,最终获得6株能够特异性结合原核表达的P27蛋白的杂交瘤细胞株。经生物学特性分析,杂交瘤细胞染色体数均为90条左右。经间接免疫荧光鉴定2F3、5C2和5C7株单抗能与ALV发生特异性结合。4.P27蛋白多克隆抗体的制备及鉴定以纯化的P27蛋白为免疫原,按常规方法免疫日本大耳白兔,免疫效价达到1：64000。采取兔血清,对血清进行纯化,制备多克隆抗体。经试验验证,该多克隆抗体纯化效果较好,能够和ALV P27蛋白特异性结合。5.禽白血病病毒P27蛋白夹心ELISA检测方法的建立将2F3株单抗作为捕获抗体,P27多抗作为检测抗体,HRP标记的羊抗兔IgG为二抗,建立检测禽白血病抗原的夹心ELISA检测方法。通过方阵滴定实验和各种优化条件的摸索,最终确定2F3.株单抗的包被浓度为0.5μg/mL,多克隆抗体的稀释浓度为1.75μg/mL, HRP标记的羊抗兔IgG稀释度为1：7000。经试验验证,该方法具有特异性好、敏感性高和重复性稳定等特点,与IDEXX抗原检测试剂盒的符合率为99.3%。
陈浩[6]（2012）在《致急性纤维肉瘤的缺陷型J亚群禽白血病病毒肿瘤基因的鉴定》文中研究表明根据致瘤机制的不同，禽白血病/肉瘤病毒群各成员病毒被划分慢性转化型病毒和急性转化型病毒两类。慢性转化型病毒通过插入启动机制间接激活细胞原癌基因（c-onc）而引发肿瘤，潜伏期较长，一般超过90天；而急性转化型病毒则是通过直接启动自身基因组中携带的病毒肿瘤基因（v-onc）而导致急性肿瘤的形成，潜伏期一般仅在数周之内（Fadly and Nair，2008）。禽ALV-J的原型毒株HPRS-103是一种复制完整型病毒，其基因组中不含有任何病毒致瘤基因，在机体内不能快速诱发肿瘤的形成，在体外也不能转化鸡骨髓细胞（Payneet al.,1992）。而在1993年，Payne等从该株病毒感染的表现有髓细胞瘤的实验室病鸡中分离到了数株携带有肿瘤基因v-myc的急性转化型病毒，这些病毒大多可以转化体外的骨髓细胞，在鸡体上可导致多种急性肿瘤的发生，如髓细胞瘤、肾胚细胞瘤及肾腺瘤等，而其中的966株则得到了较为详尽的研究（Payne et al.,1993）。2000年，Venugopal等从自然感染J亚群病毒的患有成红细胞性白血病的鸡群中分离到若干株含v-myc的急性病毒，它们不仅可以诱发急性成红细胞增多病，而且还能导致髓细胞瘤和其他肿瘤的形成（Venugopal et al.,2000）。Fujinami肉瘤病毒（FSV）于1914年从日本分离出来（Fujinami and Inamoto,1914），起初曾认为它和带有v-src肿瘤基因的劳斯肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus，RSV）是同一病毒的不同毒株，后来经序列分析发现它是完全不同的另一种带有v-fps肿瘤基因的急性缺陷型病毒（Shibuya and Hanafusa,1982）。此外，PRCII是一株从自然发病鸡中分离的在5′-fps端缺失1020个核苷酸的此类型毒株，它转化细胞能力及致肿瘤能力稍弱（Carlberg et al.,1984; Huang et al.,1984）。近年来，我们发现在国内爆发该病的鸡群中出现了急性肉瘤病例，病例组织切片法检测表明其为典型纤维肉瘤，通过病毒分离试验确定病料中含有ALV-J（刘绍琼等，2011）。肉瘤组织研磨滤过液及其接种过的第一代DF细胞上清，在接种1日龄SPF鸡和817肉杂鸡后，可以在9天内复制出相同的纤维肉瘤（李传龙等，2012）。因此，我们怀疑其中除了含有完整复制型的ALV-J外，很可能还存在一种可以引发快速致瘤的携有某种病毒肿瘤基因（v-onc）的缺陷型病毒。本研究课题初步探究了缺陷型病毒在体外CEF细胞培养中的生物学活性；提取病料中的病毒RNA和前病毒DNA，使用PCR法筛选到相关v-onc；然后制备针对该基因所编码蛋白的特异性抗血清，建立免疫荧光方法、免疫组化法分别对感染细胞中的病毒抗原、肉瘤组织切片进行检测；构建含有该肿瘤基因的缺陷型病毒的全基因组质粒，拯救分子克隆化病毒，回归动物复制病征，从而在分子和蛋白质两个水平上佐证缺陷型病毒是造成急性纤维肉瘤的主因。为了观察肉瘤病料中缺陷型病毒在体外细胞培养中的增殖能力，分别将肉瘤组织滤过液及其感染后的细胞第1代毒、第2代毒接种相同的三组试验鸡只，结果发现第1代细胞毒同肉瘤研磨液具有相似的致瘤能力，但第3代细胞毒的致瘤速度及诱发鸡只出现肿瘤的比例则明显下降，这表明肉瘤中存在的缺陷型病毒粒子在体外CEF细胞培养过程中，产生的子代病毒粒子会逐渐减少，结合其不能引起CEF出现细胞病变效应的现象，我们推测该类缺陷型病毒很可能不适应在CEF上生长。使用PCR方法，我们扩增到了复制完整型ALV-J病毒粒子的完整基因组（命名为SD1005），同国内外其他12个J亚群毒株比对发现，它与引发慢性髓细胞瘤和血管瘤的毒株JS09GY6（Wu et al.,2010）具有相似的基因组结构，且整体核酸同源性高达97%，与其它毒株相比，亦没有显着的基因缺失或突变。而且，其基因组结构中并不含有任何病毒肿瘤基因，与J亚群病毒原型株HPRS-103同属于完整复制型病毒，再结合禽白血病/肉瘤病毒致瘤机制（Fadly and Nair，2008），可以排除SD1005是导致这种急性肿瘤形成的原因。随后，使用多对扩增不同肿瘤基因嵌合体分子的引物，我们确定了数个含有v-fps肿瘤基因的缺陷型基因组（Fu-J15），其结构特征为：5′-R-U5-△gag-fps-△env-U3-R-3′或5′-R-U5-△gag-fps-△pol-△env-U3-R-3′。在env基因水平上，Fu-Js同SD1005的同源性超过99%，这说明缺陷型Fu-Js很可能起源于作为辅助病毒的SD1005。值得注意的是，尽管Fu-Js中的v-fps基因同Fujinami和PRCII株的v-fps基因具有超过98%的核酸同源性，但不同的是，FSV和PRCII二者在该基因的5′和3′完全一致，而我们所扩增到的所有序列在5′端则相对缺少24碱基（但与gag基因的结合位点稳定），在3′则有200500nt的缺失，长度较多样化，且插入位点也不稳定。使用DNAstar软件分析并筛选两段抗原性较好的截短fps基因，连接到pET32a（+）载体中，经E.coli表达系统获得人工Fps蛋白，免疫后得到鼠抗Fps多克隆血清，建立间接免疫荧光方法并检测肉瘤组织悬液感染的CEF细胞，结果呈现阳性，表明急性肉瘤中确实存在一种可以编码Fps相关蛋白的缺陷病毒。同时，建立免疫组织化学方法检测纤维肉瘤组织切片，发现在细胞质中存在Fps肿瘤蛋白。选取Fu-J1和Fu-J3两个基因组，通过重叠延伸PCR技术（SOE-PCR）和限制性内切酶酶切技术分别获得质粒pTZ57-Fu-J1和pTZ57-Fu-J3。参考Fujinami基因组，合成一段fps序列，将缺少219nt的3′-fps段添补到质粒pTZ57-Fu-J1中，构建了另外两个质粒pTZ57-Fu-J1E和pTZ57-Fu-J1M。将这4种质粒转染到CEF细胞中，使用制备的抗Fps血清，可以检测到阳性细胞的存在，但是以其上清再次接种新的CEF，却不能检测到荧光的存在，这表明尽管质粒的构建是成功的，能够产生瞬时表达，但却不能拯救到有传染性的分子克隆化病毒。正如同体外传代试验所证明的那样，该病毒很可能不适合在体外CEF中培养。而使用质粒DNA直接接种SPF鸡的试验中，有1只鸡在接种后19天后在接种部位出现了肉瘤肿块，并证实是纤维肉瘤。我们推测，反转录病毒ALV-J在与鸡体原癌基因的重组过程中可能会产生多个在基因水平上有差异个体，它们形成一个准种群体（quasispecies），而其中仅有一个或是数个具有生物学活性，而其他的则是无效基因体。我们的试验结果表明，含有v-fps的相关缺陷型J亚群白血病病毒是诱导急性纤维肉瘤的直接原因，这也暗示ALV-J诱导肿瘤形成的机制中，除了是激发已经证明的myc基因外（Chesters et al.,2000），很可能还包括fps基因。
邱玉玉[7]（2011）在《A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备和不同亚群禽白血病病毒共感染相互影响的研究》文中研究指明禽白血病（Avian Leukosis）是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus, ALV）和禽肉瘤病毒（Avian Sarcoma Virus,ASV）群中的病毒感染引起的多种肿瘤性疾病的统称。过去十几年,ALV-J亚群病毒对肉用型鸡、蛋用型鸡和我国地方品系鸡的感染已经给养殖业造成了巨大经济损失。由于中国在过去几十年中从未对ALV采取过有效的净化措施,中国鸡群中存在其它亚型ALV感染的可能性很大,近几年病毒分离鉴定也表明,血管瘤的发生不仅由J亚群禽白血病病毒引起,同时也有由A亚群禽白血病病毒（ALV-A）和B亚群禽白血病病毒（ALV-B）感染引起。为了更好、更快、更准确地进行病毒的分离、鉴定以及临床检测,探讨ALV-A和ALV-J共感染SPF鸡后抗体反应和带毒排毒的规律,本研究克隆与表达ALV-A-SDAU09C1毒株gp85蛋白,用纯化的gp85蛋白研制抗ALV-A单克隆抗体（Monoclonal antibody;McAb）,进而研究了其与ALV-J共感染SPF鸡病毒血症和抗体反应相互影响。1. ALV-A-SDAU09C1 gp85基因的克隆与表达以感染本研究室分离保存的ALV-A-SDAU09C1（GenBank:HM452339）株的细胞基因组DNA为模板,采用PCR扩增技术,扩增出1017bp大小的env-gp85基因片段,并将其克隆到原核表达性载体pET-32a （+）中,构建成重组质粒pET-SDAU09C1-gp85。经测序鉴定结果显示,成功构建了重组质粒pET-SDAU09C1-gp85。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中培养并用IPTG诱导后,其菌体的超声波裂解物用SDS-PAGE电泳分离蛋白质,在经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶中与非重组载体pET-32a （+）的转化菌裂解物相比,重组质粒pET-SDAU09C1-gp85出现了1条相对分子量为53kD左右的条带,结果显示,env基因在大肠杆菌中进行了高效表达。Western-blot分析结果能从重组质粒pET-SDAU09C1-gp85的转化菌中特异性地识别出该53kD的蛋白条带,而与天然非重组载体pET-32a（+）的转化菌不发生反应。结果证明,能被gp85蛋白高免阳性血清识别的相对分子质量为53kD的蛋白质,确实为pET-SDAU09C1-gp85蛋白。2. A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的研制及其部分生物学特性的研究2.1间接ELISA检测方法的建立用纯化的gp85蛋白为包被抗原,建立了检测抗ALV-A抗体的间接ELISA。经对ELISA的最佳工作条件测定结果表明,抗原最佳包被浓度为2μg/ml、血清的最佳稀释度为1:1000,二抗的最佳稀释度为1:2000,最佳包被液为PBS Buffer（pH7.4）,最佳显色时间为15min。经重复性试验、特异性试验结果显示,建立ELISA方法有良好的可重复性;与鸡NDV、REV、IBDV、MDV等病毒阳性抗体均无交叉反应。2.2抗ALV-A单克隆抗体的制备及纯化表达的env-gp85蛋白经纯化复性后免疫8-10周龄Balb/c小白鼠,经2-3次免疫后,取小白鼠血清进行检测,当抗体效价超过105后,取小白鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0在PEG1450作用下进行细胞融合,经建立间接ELISA法进行检测筛选阳性杂交瘤细胞株,经有限稀释法亚克隆2-3次,共获得了3株（A6D1株,A5C1株,A4C8株）分泌抗ALV-A独特型抗体的杂交瘤细胞株,并进行了单抗腹水的大量制备,经过饱和硫酸铵沉淀,经过蛋G亲和纯化后得到的单克隆抗体浓度别为A6D1,1.575mg/ml;A5C1,0.903 mg/ml;A4C8,0.758 mg/ml。2.3抗ALV-A单克隆抗体特性研究2.3.1单抗的效价测定用已经建立的ELISA方法对三株单抗的效价测定结果分别为:A6D1 210; A5C1 28;A4C8 27。2.3.2抗体分泌稳定性将获得的3株单克隆抗体细胞株冻存后,隔3、6、9、12个月后,复苏培养,至少传代3次以上,用建立的间接ELISA方法进行检测。结果表明,获得的单克隆抗体细胞株经冻存复苏后,抗体分泌能力没有任何下降,其具有较高的分泌抗体水平的能力。2.3.3单抗的Western blotting分析取10ul纯化的表达蛋白,用等量的2×上样缓冲液处理后,进行SDS-PAGE,然后转到NC膜上,经封闭,单抗200倍稀释液孵育后,加入酶标羊抗鼠IgG孵育后,加底物显色,于NC膜上出现一条清晰的条带,该带与标准分子量比较,其大小约为53kD,说明这株单抗与所表达的gp85蛋白发生特异性结合。2.3.4间接免疫荧光分析用IFA对试验所获得的A6D1、A5C1、A4C8株单克隆抗体的特异性进行了鉴定。结果证明,单抗A5C1、A4C8是特异性抗ALV-A的单克隆抗体,它们均与试验的所有ALV-A分离株发生反应,而不与试验的ALV-B和ALV-J亚群的毒株发生反应。值得注意的是单抗A6D1,它不仅能与所试验的ALV-A毒株发生反应,而且还能与所试验的ALV-B亚群的毒株发生反应,但不与ALV-J亚群的毒株发生反应,这说明单抗A5C1、A4C8是特异性抗ALV-A的单克隆抗体,而A6D1是特异性抗ALV-AB的单克隆抗体,3株单克隆抗体均能与病毒正常分泌的天然蛋白发生特异反应。3. ALV-A与ALV-J共感染对SPF鸡病毒血症及抗体反应的相互影响1日龄SPF鸡200只随机分成4组,平均每组50只。2日龄时,4个组每只鸡分别腹腔接种:第一组接种0.2ml ALV-A和ALV-J感染细胞培养上清混合液（比例1:1）;第二组接种ALV-A0.2ml感染细胞培养上清;第三组接种ALV-J0.2ml感染细胞培养上清;第四组接种灭菌Hank’s液0.2ml作为阴性对照;常规程序进行免疫;攻毒后在1周龄、2周龄、3周龄、5周龄、7周龄、8周龄时从各组中分别随机取出6只鸡,编号。其中6只无菌采集加抗凝剂的新鲜血液用于病毒血症检测,其余鸡常规采血,分离血清供抗体检测;病毒血症的检测采用IFA法,同时用ELISA检测鸡群的抗体水平。实验结果表明:3.1病毒血症检测结果单独感染ALV-A组的病毒血症水平从2周龄开始检测到,随后一直持续增高,从从第3周到第7周增长较缓慢,到第7周龄时的病毒血症水平达到最高为3.72 PFU/ml,第8周龄病毒血症水平有所下降为3.01 PFU/ml。单独感染ALV-J组的病毒血症水平从1周龄开始检测到,随后一直呈升高趋势,第8周龄时为3.71 PFU/ml;ALV-A+ALV-J共感染组与单独感染ALV-A组相比,也在7周龄时达到最高,为3.74 PFU/ml;8周龄也有所下降,在7周龄以前病毒血症水平始终高于ALV-A组,但两组的病毒血症水平变化趋势大体相同,在整个实验过程中病毒血症水平总体差异不显着（p>0.05）;2周龄时ALV-A +ALV-J共感染组的病毒血症还未出现,与单独感染ALV-J组相比差异显着（P<0.05）,随后病毒血症水平逐渐升高,直到7周龄时达到最高,8周龄时已有所降低;而单独感染ALV-J组在整个检测过程中病毒血症水平一直在升高,但3周龄、5周龄、7周龄及8周龄的病毒血症水平与ALV-A +ALV-J共感染组相比差异不显着（p>0.05）。3.2共感染对特异性抗体反应的影响3.2.1 ALV-J共感染时对ALV-A特异性抗体的影响无论是ALV-A+ALV-J共感染组,还是单独感染ALV-A组在2周龄时血清中ALV-A特异性抗体的阳性率均为0;在3周龄时,ALV-A+ALV-J共感染组和单独感染ALV-A组中均只有部分鸡产生ALV-A特异性抗体,不过ALV-A+ALV-J共感染组ALV-A特异性抗体阳性率明显低于单独感染ALV-A组。而在5周龄、7周龄时,两组鸡中ALV-A特异性抗体阳性率基本相同,表明在本实验中ALV-J共感染对ALV-A感染诱发的抗体反应的影响不明显。3.2.2 ALV-A共感染时对ALV-J特异性抗体的影响在2周龄、3周龄时,ALV-A+ALV-J共感染组和单独感染ALV-J组中均没有出现ALV-J特异性抗体。在5周龄、7周龄时,ALV-A+ALV-J共感染组仍无阳性样品,单独感染ALV-J组的阳性率也仅为20.00%和13.33%。可见ALV-J特异性抗体较ALV-A特异性抗体产生得晚,在2日龄感染ALV-J后鸡群的耐受性感染程度比ALV-A更严重。特别是ALV-A+ALV-J共感染组,在8周龄之前一直未出现阳性样品,显然,ALV-A共感染显着减弱了鸡体对ALV-J感染诱导的特异性抗体反应。3.2.3病毒血症及相应抗体反应的相关性将被检测的不同鸡的病毒血症和抗体反应表现一一对应,ALV-A+ALV-J共感染组及单独感染ALV-A组在2周龄时没有出现病毒血症,抗体反应均为阴性;3周龄时ALV-A+ALV-J共感组1/6（ 6.25%）和单独感染ALV-A组2/6（33.33%）都出现了部分鸡病毒血症和抗体反应均为阳性, ALV-A+ALV-J共感组5周时有4/6（50%）都出现了部分鸡病毒血症和抗体反应均为阳性,直到7周龄这种现象还持续存在;单独感染ALV-A组5周时有4/6（66.67%）都出现了部分鸡病毒血症和抗体反应均为阳性,到7周龄有所下降3/6（50%）;在ALV-A+ALV-J共感染组和单独感染ALV-J组的被检鸡只中病毒血症和抗体反应均为阳性的数量明显较少,仅见于ALV-J组中（5周龄为1/6（6.25%）和7周龄为2/6（33.33% ））,可见ALV-J感染后鸡体血液当中ALV-J和相应抗体共同存在的几率很小,而ALV-A的共感染更降低了这种几率。
王一新[8]（2016）在《两株携带v-fps和v-src肿瘤基因的复制缺陷型急性致瘤病毒的鉴定及其感染性克隆的致肿瘤作用》文中提出近几年来,我国鸡群中J亚群禽白血病病毒（Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J）诱发的髓样细胞瘤/血管瘤广泛流行的同时,在一些蛋鸡鸡群及“817”肉杂鸡鸡群中,出现了一定比例的体表纤维肉瘤。人工造病试验表明,接种了肉瘤研磨液的鸡在10-14d可发生相同类型的肉瘤,证明这些肉瘤为急性肿瘤（王鑫等,2012;刘绍琼等,2012;李传龙等,2012;李德庆等,2013）。本实验室前期工作中,以“817”肉杂鸡肉瘤组织DNA为模板,扩增到五种携带不完整v-fps肿瘤基因的缺陷型病毒基因组（Chen et al.,2012）。在此基础上,本研究将“817”肉杂鸡颈部皮下肉瘤和海兰褐蛋鸡肠系膜纤维肉瘤的研磨液接种鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast,CEF）,鉴定了两株急性致瘤性ALV所携带的v-fps和v-src肿瘤基因;构建了辅助ALV和分别带有v-fps和v-src肿瘤基因的缺陷型病毒感染性克隆质粒,通过动物实验分析拯救病毒的致瘤性;将“817”肉杂鸡肉瘤研磨液接种SPF鸡,研究了该病毒的致病性和致瘤性;通过鸡急性肿瘤的动物模型,研究了核苷类抗HIV药物拉米夫定对ALV-J复制的抑制作用。本研究利用反向遗传学技术首次证明了携带完整v-fps肿瘤基因的缺陷性ALV可在ALV-J辅助病毒存在的条件下在鸡体内复制并诱发急性纤维肉瘤。同时,该研究也是急性纤维肉瘤天然病例中,携带v-src肿瘤基因的ALV-J相关复制缺陷型病毒的首次分离报道。1.“817”肉杂鸡急性肉瘤中急性致瘤性病毒的分离及其v-fps肿瘤基因的鉴定将“817”肉杂鸡肉瘤研磨液接种1日龄SPF鸡,在鸡体上传代。以第五代肿瘤组织DNA和感染了肿瘤研磨液的CEF DNA为模板,通过PCR扩增,拼接获得了缺陷型病毒Fu-J株的前病毒基因组序列。序列分析表明,Fu-J是一株携带完整v-fps肿瘤基因的复制缺陷型病毒,它以复制型ALV-J SDAU1005为辅助病毒完成自我复制,故将该病毒悬液命名为Fu-J（SDAU1005）。Fu-J编码137 kDa的P137gag-fps融合蛋白。使用大肠杆菌表达系统获得Fps原核蛋白和p19gag原核蛋白,以其制备鼠抗Fps单因子血清和鼠抗p19gag单因子血清。对感染了Fu-J（SDAU1005）病毒悬液的CEF做IFA和Western blot检测,结果表明,感染了Fu-J（SDAU1005）病毒悬液的CEF可以同时对ALV-J单克隆抗体、鸡抗ALV-J单因子血清和鼠抗Fps单因子血清呈现阳性反应。本研究完成了Fu-J株病毒的全基因组序列测定,为研究该病毒致瘤的分子机制奠定了基础。2.rfu-js感染性克隆的构建、病毒拯救和拯救病毒的致瘤性分析通过pcr扩增、酶切连接等方法,构建了辅助alv感染性克隆质粒pmd-sdau1005和六种携带不同长度v-fps肿瘤基因的缺陷型病毒感染性克隆质粒pmd-fu-j,pmd-fu-j1,pmd-fu-j2,pmd-fu-j3,pmd-fu-j4和pmd-fu-j5。将pmd-sdau1005和六种pmd-fu-js质粒分别按一定比例共转染cef,获得拯救病毒rfu-j（rsdau1005）、rfu-j1（rsdau1005）、rfu-j2（rsdau1005）、rfu-j3（rsdau1005）、rfu-j4（rsdau1005）和rfu-j5（rsdau1005）。将6种拯救病毒分别翅下接种1日龄spf鸡,发现仅接种rfu-j（rsdau1005）的鸡出现了肿瘤（2/10）。将2只鸡的肿瘤在1日龄spf鸡上持续传代。在传代过程中,肿瘤的生长速度逐渐加快。当传至第4代时,肿瘤生长速度与野毒诱发肿瘤生长速度基本一致。ifa和免疫组织化学方法证实该肿瘤组织对alv-j及fps抗体呈阳性反应。该研究表明,携带完整v-fps肿瘤基因的缺陷型alv确实可诱发急性肿瘤。3.海兰褐蛋鸡腹腔急性肉瘤中急性致瘤性病毒的分离及其v-src肿瘤基因的鉴定以海兰褐蛋鸡原代肿瘤组织dna和感染了肿瘤研磨液的cefdna为模板,pcr扩增获得了复制缺陷型病毒sj-1、sj-2、sj-3、sj-4、sj-5及辅助病毒sdau1102的前病毒全基因组序列。该毒株被命名为sj-1（sdau1102）、sj-2（sdau1102）、sj-3（sdau1102）、sj-4（sdau1102）和sj-5（sdau1102）。序列分析表明,辅助病毒sdau1102为j亚群alv,其gp85基因与中国蛋鸡分离株js09gy6同源性最高。sj-15均携带v-src肿瘤基因,它们具有相同的3’端src-env衔接位点,但5’端衔接位点差异很大。使用大肠杆菌表达系统获得p60v-src原核蛋白,以其制备鼠抗p60v-src单因子血清。以该血清为一抗,westernblot和免疫组化实验显示,感染了病毒悬液的cef及肿瘤组织中,均存在p60v-src蛋白过表达。构建了五种缺陷型病毒的感染性克隆质粒。将其转染cef,发现仅sj-1和sj-2感染性克隆质粒可表达p60v-src蛋白。sj-15（sdau1005）的分离及鉴定为为进一步研究alv与原癌基因重组和v-src基因致瘤机制奠定了基础。4.fu-j（sdau1005）病毒悬液对spf鸡的致病性和致瘤性研究本研究首先建立了分别针对alv-jgp85基因和v-fps基因的sybrgreeni实时荧光定量pcr方法,两个方法特异性好、灵敏度高,为研究fu-j（sdau1005）的复制动态及其致病性提供了可靠的检测方法。分别采用颈部皮下、腹腔和静脉注射三种方式,将fu-j（sdau1005）病毒悬液接种1日龄spf鸡,观察病毒的致病性和致瘤性。结果表明,三种接种方式均可诱发鸡的急性肿瘤,且所有肿瘤均为纤维肉瘤;颈部皮下接种组的鸡体内没有肿瘤生长,表明该急性肿瘤的转移性不强;所有接触传播组的鸡均未发现肿瘤生长,表明该急性致瘤性ALV不容易通过横向接触方式传播。从上述结果,可以推测疫苗免疫时重复使用污染的针头,可能是某些鸡场内病毒从一只患病鸡传给其他个体并发生急性肿瘤的原因。病毒的抗原定位实验表明:在发病鸡体内肿瘤组织中辅助病毒和缺陷型病毒拷贝数最高;缺陷型病毒的拷贝数与辅助病毒拷贝数存在相关关系。5.感染了Fu-J（SDAU1005）病毒悬液的CEF转录组研究为探讨Fu-J株病毒诱发细胞转化的机制,本研究采用基因芯片技术对感染了Fu-J（SDAU1005）病毒悬液的CEF转录组进行了分析。与单独感染SDAU1005的CEF相比,感染Fu-J（SDAU1005）病毒悬液的CEF中有1253个转录子发生了4倍及以上的差异表达。这些差异基因主要涉及细胞过程、代谢加工、生物学调节、定位和发育过程等反应。细胞信号通路分析法发现,这些差异基因主要参与了神经活性因子-受体相互作用、紧密连接、代谢信号通路、GnRH信号通路、VEGF信号通路、Wnt信号通路等。本研究获得的差异转录组数据为深入研究v-fps肿瘤基因的急性致瘤机制奠定了基础。6.拉米夫定抑制ALV-J复制和肿瘤生长的研究为研究核苷类抗HIV药物拉米夫定对ALV-J复制的抑制作用,首先将Fu-J（SDAU1005）病毒悬液接种体外培养的CEF,研究其对ALV-J复制的影响。结果表明,在1-4μg/ml的浓度范围内,拉米夫定可有效抑制辅助ALV和缺陷型病毒的复制。荧光定量PCR结果表明,拉米夫定可以抑制ALV反转录酶的活性。通过鸡颈部皮下肿瘤和腹腔肿瘤两种动物模型,研究了拉米夫定在鸡体内对ALV-J复制的抑制作用。结果表明,拉米夫定可以抑制辅助ALV和缺陷型病毒在鸡体内的复制、降低病毒载量,从而减缓鸡颈部皮下肿瘤的生长,延长腹腔攻毒鸡的生存时间并降低其死亡率。本研究为ALV的防控提供了新思路,但拉米夫定能否在鸡群中推广使用尚需进一步研究和论证。
乔彩霞[9]（2004）在《禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白p27基因的克隆、表达及免疫学诊断方法的建立》文中研究指明禽白血病（Avian Leukosis，AL）是由禽白血病／肉瘤病毒群病毒（Avian Leukosis／sarcoma virus，AL／SV）引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。本病在世界各地均有发生，感染率高，发病率低，是危害养禽业的主要疾病之一。流行病学调查研究表明，本病在我国也广泛的发生和流行。由于目前尚没有有效的疫苗和药物用于防治本病，世界各国控制禽白血病的主要措施是通过病原检测，淘汰阳性鸡，从而净化种群达到消灭本病的目的，因此建立一种快速准确的诊断方法就显得尤为重要。 迄今为止，国内外相继建立了多种禽白血病诊断方法，但其试剂制备利诊断过程均有不足之处。ALV衣壳蛋白p27是一种高度保守的非糖基化蛋白，在外源性ALV（A、B、C、D、J）各亚群间同源性高达90％，是ALV主要的群特异性抗原，且在病毒蛋白中含量最高，是禽白血病抗原检测的理想靶蛋白。本研究的目的是利用分子生物学技术克隆禽白血病衣壳蛋白p27基因，对p27基因进行原核和真核表达，为进一步研制快速准确、灵敏特异的抗原和抗体检测方法奠定基础。 从人工感染禽白血病劳斯肉瘤病毒（SR-RSV-E）的SPF鸡胚成纤维细胞（CEF）培养物中提取RNA，利用p27基因的特异性引物，通过RT-PCR方法扩增出720 bp的gag p27基因片段：将该片断克隆至pMD18-T载体，酶切鉴定后进行序列测定和分析，表明该片段的核苷酸序列与国外RSV分离株（J02342）的同源性达97.3％：将p27基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1，转化受体菌BL-21，经IPTG诱导表达，获得大小为56kD的可溶性融合蛋白，薄层扫描分析重组蛋白占菌体总蛋白的23％；纯化获得的重组p27蛋白具有良好的抗原反应活性，可代替全病毒用于间接ELISA诊断方法的建立。相比于通过提纯病毒，去污剂裂解，电泳纯化p27蛋白的传统方法，利用原核表达系统制备重组p27蛋白成本低，纯度高，周期短。对原核表达的重组p27蛋白用亲和层析法纯化后，免疫实验兔制备了抗血清。进而建立了琼脂扩散诊断方法，该方法简便、特异，可以满足现地使用的需要。 在原核表达的基础上，利用BAC-TO-BACTM杆状病毒表达系统对p27蛋白进行真核表达，所表达的产物能与全病毒制备的抗血清发生特异性反应。相比于原核表达系统，杆状病毒表达系统表达的蛋白具有与天然蛋白更相似的结构和功能，为下一步利用重组蛋白直接制备单克隆抗体创造了条件。单克隆抗体的研制为结合上述制备的p27蛋白多克隆抗体，建立一种简便快捷、适用于大面积推广的禽白血病／肉瘤病毒群抗原检测的双抗夹心ELISA创造了条件，必将为我国禽白血病的种群净化提供技术支持。 此外，表达ALV p27基因重组杆状病毒的获得，进一步结合表达ALV囊膜基因重组杆状病毒的构建，共感染昆虫细胞有望形成ALV病毒样颗粒，为疫苗的研制开创新的思路。
梁雄燕[10]（2018）在《髓细胞瘤相关A和K亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性》文中研究表明禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）是一种重要的致瘤性反转录病毒,可以引起鸡的多种肿瘤,严重威胁养殖业健康发展。鸡源禽白血病病毒包括AE,J和K 7个亚群。不同亚群的禽白血病病毒常常具有不同的致病性和致瘤谱,A、B亚群病毒主要诱发经典的鸡淋巴细胞瘤,J亚群病毒主要诱发鸡髓细胞瘤,尽管有时它们也诱发其他类型的肿瘤。近20年来,我国报道和研究了大量的ALV-J引起的髓细胞瘤和血管瘤型禽白血病。然而,对其他亚群的禽白血病的相关报道则相对较少,目前尚未见关于ALV-K诱发的肿瘤病变报道和ALV-A诱发髓细胞瘤的自然病例报道。本研究对湖北某蛋鸡群和某地方品种鸡群的肿瘤病鸡进行了病理学观察、病原分离鉴定和病毒全基因特征分析。在此基础上,通过反向遗传操作技术,拯救出基因背景清楚的病毒并研究病毒的致病性和致瘤特征,通过转录组测序分析,了解ALV-A诱发鸡髓细胞瘤的机制,结果如下:1.自然病例病理学观察及病原检测对病鸡进行了组织学观察和病原学检测。ELISA结果显示,商品蛋鸡场和地方品种鸡自然病例的泄殖腔拭子均呈ALV P27阳性;病理组织学观察显示,来自商品蛋鸡场和来自地方品种鸡养殖场的病鸡均为髓细胞瘤混发淋巴细胞瘤。用ALV-A/B/J的特异性引物进行Multi-PCR检测,蛋鸡病料中扩增出与ALV-A对应的核酸片段,但地方品种鸡病料未扩增出片段。以ALV-env的通用引物进行PCR,从地方品种鸡病料扩增出了相应的片段,测序显示扩增出的env与ALV-K原型株JS11C1高度同源。2.病毒分离鉴定与分离株培养特性取两个鸡群中病变典型的病鸡肝脏组织,制备组织悬液接种DF-1细胞进行病毒分离培养,分别以抗ALV-A的单抗AF3、抗ALV-J的单抗JE9和抗ALV-K SU的单因子血清为一抗进行间接免疫荧光试验。结果,以AF3为一抗,用蛋鸡肝脏组织悬液处理的DF-1细胞和以抗ALV-K SU单因子血清为一抗,用地方品种鸡肝组织悬液处理的DF-1细胞呈亮绿荧光,表明从蛋鸡中分离的病毒为ALV-A,命名为HB2015012;从地方品种鸡中分离的病毒为ALV-K,命名为HB2015032。体外培养试验表明,HB2015012和HB2015032与ALV-J参考毒株HB2010001和HB2015029复制特性相似,且HB2015032可以感染荆江麻鸭鸭胚原代成纤维细胞（DEF）。3.病毒分离株基因组特征测序结果显示,HB2015012和HB2015032的前病毒基因组全长分别为7735bp和7703bp,二者均具有典型的C型反转录病毒结构。序列分析显示,HB2015012和HB2015032的gag和pol基因核苷酸序列均相对保守,但HB2015032的pol基因区域（前病毒基因组第5345位碱基）发生了一个C-T突变,提前形成了一个TAA终止密码子,使得其pol基因编码的蛋白与J亚群禽白血病病毒一样,相对于其他亚群的毒株短22aa;HB2015012和HB2015032的UTR+LTR区核苷酸序列与ALV-J相应区域高度相似,二者的3’UTR+LTR区均包含有完整的DR1,E原件,U3,R和U5区,且U3区均具有2个CAAT boxes、2个Y boxes、2个CArG boxes和2个PRE boxes及1个NFAP-1和TATA box,几乎含有ALV-J原型株HPRS-103 U3区所有的调控序列,另外HB2015032的E原件中（前病毒基因组7250位与7251位碱基间）相对与HPRS-103基因组的7388位碱基处具有1个碱基缺失,形成了一个仅在蛋鸡血管瘤型ALV-J毒株中存在的与血管内皮细胞分化相关的c-Ets-1位点。这些结果表明,HB2015012是由ALV-A与ALV-J重组产生的具有ALV-J3’UTR+LTR的自然重组病毒;HB2015032是ALV-K与ALV-J重组产生的以ALV-J为骨架的K亚群禽白血病病毒,且其E原件可能源自致血管瘤型ALV-J。4.病毒反向遗传体系的建立及病毒拯救将HB2015012和HB2015032前病毒基因全长DNA插入pTopo-Blunt simple载体,构建感染性克隆,转化DF-1细胞,进行病毒拯救。结果成功拯救出了具有感染性的病毒rHB2015012和rHB2015032。体外培养试验显示rHB2015012和rHB2015032均与母本病毒具有相似的体外复制能力。5.rHB2015012和rHB2015032的致病性将rHB2015012和rHB2015032以2×103TCID50接种SPF鸡进行病毒致病性试验。rHB2015012接种的试验鸡,肿瘤发生率为65%,其中髓细胞瘤发生率为40%;rHB2015032接种的试验鸡,肿瘤发生率为75%,其中髓细胞瘤发生率为50%。水平传播感染rHB2015012的对照组鸡的肿瘤总体发生率为35%,髓细胞瘤发生率为15%,水平传播感染rHB2015032的对照组鸡的肿瘤总体发生率为55%,髓细胞瘤发生率为20%。表明rHB2015012和rHB2015032均可诱发鸡的髓细胞瘤,且rHB2015032的水平传播及致瘤能力强于rHB2015012。6.ALV-A/J/K及ALV-A、ALV-K自然重组病毒Multi-PCR检测方法建立ALV-K是近年从中国地方鸡群中分离鉴定的一个新亚群,可能由于常常不引起临床症状或仅引起鸡的亚临床症状而被长期忽视。目前尚未见关于其PCR检测方法的报道,本研究建立了针对ALV-A/J/K的Multi-PCR检测方法和针对具有J亚群LTR的重组ALV-A/K毒株的Multi-PCR检测方法。特异性试验和灵敏性试验结果表明,所建立的Multi-PCR检测方法特异性和灵敏性良好,灵敏性均可达102copies/μL,可用于临床样本检验。7.rHB 2015012感染及肝脏转录组学分析rHB2015012感染鸡肝脏组织RNA-Seq高通量测序转录组分析,共筛选到1825个差异表达基因（DEG）,其中1288个为上调表达基因,537个为下调表达基因。GO和KEGG Pathway注释和富集结果显示,部分差异基因与细胞过程、生物调节、代谢过程及免疫应答反应等重要功能相关。进一步分析显示这些基因主要参与的信号通路有癌症相关通路、破骨细胞分化通路、JAK-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路等。具体而言,癌症相关通路富集到85个DEG,PI3K-Akt信号通路富集到76个DEG,破骨细胞分化通路富集到72个相关的DEG,与造血细胞系相关（Hematopoietic cell lineage）DEG有30个,细胞粘附分子相关（Cell adhesion molecules（CAMs））DEG有36个。其中,破骨细胞分化通路富集的72个DEG使与髓细胞瘤密切相关的JAK-STAT信号通路被激活,Acute myeloid leukemia通路里富集了17个DEG,大多数与阻碍造血细胞分化（block of differentiation）相关,也可能与髓细胞瘤的形成有关。MAPK signaling pathway中P53 signaling pathway处于抑制状态,而PI3K-Akt signaling pathway呈激活状态,可促进细胞原癌基因myc（c-myc）的增殖,促进髓细胞瘤形成。
二、禽白血病／肉瘤病毒群特异性抗原P_（27）~（gag）的分离和纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、禽白血病／肉瘤病毒群特异性抗原P_（27）~（gag）的分离和纯化（论文提纲范文）
（1）禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图与附表清单 |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1 禽白血病概况 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床特征和病理变化 |
| 1.4 禽白血病的检测和诊断 |
| 1.5 预防和控制 |
| 2. 病毒的准种及其演变 |
| 2.1 准种的特性 |
| 2.2 准种的作用 |
| 2.3 准种的研究方法 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 禽白血病病毒P27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 重组克隆载体的构建与鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒的双酶切鉴定 |
| 2.4 P27蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.5 表达蛋白的纯化 |
| 2.6 表达蛋白的WESTERN-BLOTTING鉴定 |
| 2.7 兔抗P27蛋白抗体的效价测定 |
| 2.8 兔抗P27蛋白抗体的纯化 |
| 2.9 兔抗P27抗体的酶标化结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 禽白血病病毒抗原ELISA检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 双抗体夹心ELISA相关试验条件的确定 |
| 2.2 阴阳性临界值的确定 |
| 2.3 特异性试验 |
| 2.4 敏感性试验 |
| 2.5 重复性试验 |
| 2.6 符合率试验 |
| 2.7 保存期试验 |
| 2.8 临床试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 间接ELISA相关试验条件的确定 |
| 2.2 阴阳性临界值的确定 |
| 2.3 特异性试验结果 |
| 2.4 敏感性试验结果 |
| 2.5 重复性试验结果 |
| 2.6 符合率试验结果 |
| 2.7 保存期实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 禽弱毒疫苗中ALV的分离鉴定及其全基因组序列分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 三种活疫苗中ALV的分离鉴定 |
| 2.2 三株ALV全基因组的克隆测序 |
| 2.3 分离毒株GP85基因的序列分析与亚群鉴定 |
| 2.4 分离毒株与不同亚群参考毒株主要基因区域的同源性比较 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 血管瘤病鸡中AIV-J的分离鉴定及其准种分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒分离鉴定 |
| 2.2 血清抗体检测 |
| 2.3 ALV-J的准种多样性 |
| 2.4 氨基酸序列同源性比较 |
| 2.5 细胞传代前后准种比较 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第七章 结论 |
| 第八章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）地方品种鸡群禽白血病流行病学调查及检测净化技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 禽白血病研究进展 |
| 1 禽白血病病原学 |
| 2 禽白血病流行病学 |
| 3 禽白血病检测技术 |
| 4 禽白血病防控措施 |
| 5 本研究目的和意义 |
| 第二章 地方品种鸡群禽白血病流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 K亚群禽白血病病毒全基因组测序及序列分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 禽白血病病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 种公鸡精液禽白血病病毒检测方法研究与应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第六章 地方品种鸡群禽白血病示范性净化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文、获得成果及奖励 |
（3）禽白血病标准抗原、标准抗体候选物的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 研究一 禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的制备 |
| 2.2 禽白血病标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的标定 |
| 2.3 标准抗原候选物在检验商品试剂盒中的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的制备 |
| 3.2 禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物的标定 |
| 3.3 禽白血病群标准抗原、J和A亚群禽白血病标准抗原候选物检验商品化试剂盒的结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 研究二 禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病群特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病标准血清候选物的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的制备 |
| 2.2 禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的标定 |
| 2.3 禽白血病群特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物在检验商品试剂盒中的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的制备 |
| 3.2 禽白血病群特异性标准单抗、J亚群禽白血病特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物的标定 |
| 3.3 禽白血病群特异性标准单抗及J和A亚群禽白血病特异性标准血清候选物检验商品试剂盒的结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）J亚群禽白血病病毒JS09GY3株感染特性及感染鸡法氏囊转录组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第1章 禽白血病研究进展 |
| 1 禽白血病研究简史 |
| 2 禽白血病的公共卫生意义 |
| 3 禽白血病病毒 |
| 4 禽白血病的流行病学 |
| 5 禽白血病的临床表现 |
| 6 禽白血病的致病机制 |
| 7 禽白血病的诊断 |
| 8 禽白血病的防制 |
| 第2章 转录组学技术在动物病原研究中的应用 |
| 1 转录组学技术在动物性细菌研究中的应用 |
| 2 转录组学技术在动物性病毒研究中的应用 |
| 3 转录组学技术在动物性寄生虫研究中的应用 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第3章 不同日龄鸡感染ALV-J的抗原和抗体变化规律 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第4章 不同方法检测J亚群禽白血病的效果比较与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第5章 ALV-J JS09GY3株对SPF鸡的感染特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第6章 ALV-J感染SPF鸡法氏囊转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的文章及出版的着作 |
（5）禽白血病抗原和抗体ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禽白血病病毒病原特性 |
| 1.1 禽白血病病毒形态特征 |
| 1.2 禽白血病病毒的理化性质 |
| 1.3 禽白血病病毒的分类 |
| 1.4 禽白血病病毒基因组结构 |
| 1.5 P27蛋白 |
| 1.6 禽白血病内、外源性病毒 |
| 2. 禽白血病病毒致病机理 |
| 3. 禽白血病病理学 |
| 4. 禽白血病流行病学 |
| 5. 禽白血病的检测方法及种群净化 |
| 5.1 禽白血病病毒的分离与鉴定 |
| 5.2 间接生物实验 |
| 5.3 PCR和RT-PCR |
| 5.4 ELISA |
| 5.5 种群净化 |
| 6. 研究的目的和意义 |
| 第二章 禽白血病病毒P27蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 质粒和血清 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要培养基和溶液的配置 |
| 1.5.1 抗生素 |
| 1.5.2 培养基类 |
| 1.5.3 琼脂糖凝胶电泳相关溶液 |
| 1.5.4 Western blot相关溶液 |
| 1.5.5 蛋白表达与检测的相关溶液 |
| 1.5.6 纯化蛋白相关溶液的配置 |
| 1.5.7 ELISA相关溶液 |
| 2 方法 |
| 2.1 P27基因的克隆 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 P27基因的扩增 |
| 2.1.3 P27基因与克隆载体的连接 |
| 2.1.4 重组质粒的转化 |
| 2.1.5 对重组质粒进行鉴定 |
| 2.2 重组表达质粒pET28a-P27的构建及其鉴定 |
| 2.3 P27蛋白的诱导表达及蛋白的纯化 |
| 2.3.1 重组质粒的转化 |
| 2.3.2 P27蛋白诱导表达最佳条件的摸索 |
| 2.3.3 P27蛋白表达形式的鉴定 |
| 2.3.4 P27蛋白的纯化 |
| 2.3.5 P27蛋白的鉴定 |
| 2.4 间接ELISA检测方法的建立及其鉴定 |
| 2.4.1 间接ELISA检测方法的操作步骤 |
| 2.4.2 P27蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 2.4.3 P27蛋白最佳包被条件的确定 |
| 2.4.4 最佳封闭剂和封闭时间的确定 |
| 2.4.5 检测血清最佳作用时间的确定 |
| 2.4.6 酶标二抗最佳稀释度和最佳作用时间的确定 |
| 2.4.7 最佳显色时间的确定 |
| 2.4.8 阴阳性临界值的确定 |
| 2.4.9 特异性实验 |
| 2.4.10 敏感性实验 |
| 2.4.11 重复性实验 |
| 2.4.12 符合性实验 |
| 2.4.13 包被抗原保存期实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 P27基因PCR扩增结果 |
| 3.2 pMD18-P27亚克隆重组质粒的鉴定 |
| 3.3 pET28a-P27重组表达质粒的鉴定 |
| 3.4 P27蛋白最佳诱导条件的摸索 |
| 3.5 P27蛋白表达形式的鉴定 |
| 3.6 P27蛋白的纯化及蛋白浓度 |
| 3.7 P27蛋白的western blot结果 |
| 3.8 禽白血病病毒P27蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.8.1 P27蛋白最佳包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 3.8.2 最佳包被条件的确定 |
| 3.8.3 最佳封闭剂和封闭时间的确定 |
| 3.8.4 被检血清最佳作用时间的确定 |
| 3.8.5 酶标二抗最佳稀释度和作用时间的确定 |
| 3.8.6 最佳显色时间的确定 |
| 3.8.7 间接ELISA方法临界值的确定 |
| 3.8.8 间接ELISA特异性 |
| 3.8.9 间接ELISA敏感性 |
| 3.8.10 间接ELISA重复性 |
| 3.8.11 间接ELISA符合性 |
| 3.8.12 间接ELISA包被抗原保存期时间的确定 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 关于重组表达质粒pET28a-P27 |
| 4.2 关于P27蛋白的分析 |
| 4.3 间接ELISA影响因素分析 |
| 4.4 关于临界值的判定 |
| 4.5 间接ELISA检测方法的评价 |
| 5. 结论 |
| 第三章 禽白血病病毒P27蛋白夹心ELISA检测方法的建立 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 蛋白与细胞 |
| 1.3 主要试剂与材料 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 1.5.1 制备单克隆抗体相关溶液 |
| 1.5.2 杂交瘤细胞染色体计数相关溶液 |
| 1.5.3 纯化抗体相关溶液 |
| 1.5.4 抗体检测相关溶液 |
| 1.5.5 ELISA相关溶液 |
| 2 方法 |
| 2.1 P27单克隆抗体的制备 |
| 2.1.1 小鼠免疫 |
| 2.1.2 细胞融合 |
| 2.1.3 阳性杂交瘤的筛选和克隆 |
| 2.1.4 单克隆抗体的生产和纯化 |
| 2.1.5 单抗生物学特性鉴定 |
| 2.2 P27蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.2.1 日本大耳白兔的免疫 |
| 2.2.2 多克隆抗体的纯化 |
| 2.2.3 多克隆抗体的鉴定 |
| 2.3 夹心ELISA检测方法的建立及其鉴定 |
| 2.3.1 标准检测样品的选择 |
| 2.3.2 夹心ELISA方法的操作程序 |
| 2.3.3 捕获抗体的选择 |
| 2.3.4 捕获抗体和检测抗体最佳浓度的确定 |
| 2.3.5 酶标二抗最佳稀释度的确定 |
| 2.3.6 最佳显色时间的确定 |
| 2.3.7 标准阳性样品和标准阴性样品的确定 |
| 2.3.8 最佳封闭剂和封闭时间的确定 |
| 2.3.9 检测样品、多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定 |
| 2.3.10 阴阳性临界值的确定 |
| 2.3.11 标准曲线的确定 |
| 2.3.12 敏感性试验 |
| 2.3.13 特异性试验 |
| 2.3.14 重复性实验 |
| 2.3.15 符合性实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1.1 免疫Balb/C小鼠血清效价的测定 |
| 3.1.2 杂交瘤细胞的建立 |
| 3.1.3 单抗的生物学性质鉴定 |
| 3.2 抗禽白血病病毒P27蛋白多克隆抗体的制备 |
| 3.2.1 免疫日本大耳白兔血清效价的测定 |
| 3.2.2 纯化后兔多抗SDS-PAGE分析及蛋白浓度的测定 |
| 3.2.3 兔多抗的western blot鉴定 |
| 3.3 禽白血病病毒P27蛋白夹心ELISA检测方法的建立 |
| 3.3.1 标准样品的选择 |
| 3.3.2 捕获抗体的选择 |
| 3.3.3 捕获抗体最佳包被浓度和检测抗体最佳稀释浓度的确定 |
| 3.3.4 最佳酶标二抗稀释度的确定 |
| 3.3.5 最佳显色时间的确定 |
| 3.3.6 标准阳性对照和标准阴性对照的确定 |
| 3.3.7 最佳封闭剂和封闭时间的确定 |
| 3.3.8 最佳抗原、兔多抗和酶标二抗工作时间的确定 |
| 3.3.9 夹心ELISA临界值的确定 |
| 3.3.10 夹心ELISA标准曲线的确定 |
| 3.3.11 夹心ELISA敏感性试验 |
| 3.3.12 夹心ELISA特异性试验 |
| 3.3.13 夹心ELISA重复性试验 |
| 3.3.14 夹心ELISA符合性试验 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 单抗有关的影响因素 |
| 4.2 多抗制备的影响因素 |
| 4.3 夹心ELISA影响因素的分析 |
| 4.4 夹心ELISA方法的评价 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）致急性纤维肉瘤的缺陷型J亚群禽白血病病毒肿瘤基因的鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 致瘤性反转录病毒 |
| 1.2 禽白血病/肉瘤病毒群 |
| 1.2.1 病毒粒子的形态结构 |
| 1.2.2 病毒粒子的理化特性 |
| 1.2.3 核酸和基因组结构 |
| 1.2.3.1 基因组基本结构 |
| 1.2.3.2 完整型和缺陷型病毒基因结构 |
| 1.2.4 病毒蛋白 |
| 1.2.5 病毒生活周期 |
| 1.2.6 病毒亚群分类 |
| 1.2.7 J 亚群禽白血病病毒 |
| 1.3 禽白血病/肉瘤病毒的致病型 |
| 1.4 急慢性转化型病毒与致肿瘤机制 |
| 1.4.1 慢性转化型病毒 |
| 1.4.1.1 淋巴细胞性白血病病毒 |
| 1.4.1.2 慢性髓细胞瘤病毒 |
| 1.4.2 急性转化型病毒 |
| 1.4.2.1 劳斯肉瘤病毒 |
| 1.4.2.2 骨髓细胞瘤病毒 |
| 1.4.2.3 Fujinami 肉瘤病毒 |
| 1.4.2.4 成髓细胞性白血病病毒 |
| 1.4.2.5 UR2 肉瘤病毒 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 载体和菌种 |
| 2.1.5 主要配制试剂 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 肉瘤研磨液及其细胞传代毒的致病性试验比较 |
| 2.2.1.1 肉瘤组织滤过液的制备 |
| 2.2.1.2 CEF 细胞的制备 |
| 2.2.1.3 CEF 细胞传代毒的制备 |
| 2.2.1.4 ALV-p27 抗原检测试剂盒的使用 |
| 2.2.1.5 病毒的定量 |
| 2.2.1.6 接种动物 |
| 2.2.1.7 病理组织切片的制备 |
| 2.2.2 完整复制型病毒与缺陷型病毒 Fu-Js 前病毒基因组序列的扩增及测序 |
| 2.2.2.1 病毒 RNA 的提取 |
| 2.2.2.2 前病毒 DNA 的提取 |
| 2.2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.2.4 聚合酶链式反应 |
| 2.2.2.5 RT-PCR |
| 2.2.2.6 PCR 产物的回收 |
| 2.2.2.7 回收产物的连接 |
| 2.2.2.8 感受态细胞的制备 |
| 2.2.2.9 连接产物的转化 |
| 2.2.2.10 阳性克隆细菌的筛选 |
| 2.2.2.11 质粒 DNA 的提取 |
| 2.2.2.12 重组质粒 DNA 的 PCR 鉴定 |
| 2.2.2.13 序列测定与分析 |
| 2.2.3 v-fps 蛋白表达、抗体制备及间接免疫荧光法、免疫组化法检测病毒抗原 |
| 2.2.3.1 v-fps 蛋白的设计 |
| 2.2.3.2 v-fps 蛋白表达引物设计 |
| 2.2.3.3 v-fps 基因表达区段的扩增及克隆鉴定 |
| 2.2.3.4 原核表达重组质粒 pET-32a(+)-fpsq，pET-32a(+)-fpsh 的构建 |
| 2.2.3.5 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.3.6 重组质粒的序列分析鉴定 |
| 2.2.3.7 重组质粒的诱导表达 |
| 2.2.3.8 SDS-PAGE 蛋白质电泳分析 |
| 2.2.3.9 重组蛋白的大量表达 |
| 2.2.3.10 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.3.11 重组蛋白的复性 |
| 2.2.3.12 蛋白浓度的测定 |
| 2.2.3.13 免疫 Balb/c 小鼠 |
| 2.2.3.14 间接 ELISA 检测方法的建立及判定标准 |
| 2.2.3.15 间接 ELISA 检测小鼠免疫后的抗体水平 |
| 2.2.3.16 感染 CEF 细胞的培养 |
| 2.2.3.17 间接免疫荧光试验 |
| 2.2.3.18 石蜡切片的制备 |
| 2.2.3.19 免疫组织化学染色方法的建立 |
| 2.2.4 Fu-J1 与 Fu-J3 前病毒 cDNA 克隆的构建及分子克隆化病毒的拯救 |
| 2.2.4.1 前病毒 cDNA 克隆的构建策略 |
| 2.2.4.2 前病毒 cDNA 克隆的构建步骤 |
| 2.2.4.3 pTZ57-Fu-J1 的改造策略 |
| 2.2.4.4 质粒 pTZ57-Fu-J1 改造的鉴定 |
| 2.2.4.5 质粒的转染 |
| 2.2.4.6 分子克隆化病毒的拯救 |
| 2.2.4.7 质粒 DNA 接种 SPF 鸡 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 肉瘤研磨液及其细胞传代毒的致病性试验比较 |
| 3.1.1 各组病毒的定量 |
| 3.1.2 细胞病变效应的观察 |
| 3.1.3 致病性试验 |
| 3.1.4 剖检及病理组织切片观察 |
| 3.2 完整复制型病毒 SD1005 与缺陷型病毒 Fu-Js 前病毒基因组序列的分析 |
| 3.2.1 SD1005 前病毒 cDNA 全基因组核苷酸序列及分析 |
| 3.2.2 缺陷型 J 亚群病毒（Fu-Js）基因组核苷酸的扩增及序列分析 |
| 3.2.2.1 携带有肿瘤基因的病毒嵌合体分子核酸片段的扩增 |
| 3.2.2.2 缺陷型 J 亚群病毒（Fu-Js）基因组结构的解析 |
| 3.2.2.3 Fu-Js 与 Fujinami 病毒、PRCII 病毒的序列比对 |
| 3.2.2.4 Fu-Js 与 SD1005 的序列比对 |
| 3.3 v-fps 蛋白的表达、抗体的制备及间接免疫荧光法、免疫组化法检测病毒抗原 |
| 3.3.1 原核表达重组质粒 pET-32a(+)-fpsq，pET-32a(+)-fpsh 的鉴定 |
| 3.3.2 v-fpsq 及 v-fpsh 蛋白的诱导表达及 SDS-PAGE 检测 |
| 3.3.3 间接 ELISA 方法检测小鼠抗体水平及其效价 |
| 3.3.4 抗 v-fps 血清对急性致瘤病毒感染的 CEF 的鉴定 |
| 3.3.5 免疫组化法检测纤维肉瘤组织中病毒抗原 |
| 3.4 Fu-J1 与 Fu-J3 前病毒 cDNA 克隆的构建及分子克隆化病毒的拯救 |
| 3.4.1 Fu-J1 与 Fu-J3 前病毒 cDNA 克隆的获得 |
| 3.4.2 pTZ57-Fu-J1 的改造及鉴定 |
| 3.4.3 质粒的转染效果 |
| 3.4.4 分子克隆化病毒的拯救 |
| 3.4.5 DNA 接种试验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 7.1 SD1005 前病毒全基因组 cDNA 的核苷酸序列 |
| 7.2 缺陷型病毒 Fu-J1 前病毒全基因组 cDNA 的核苷酸序列 |
| 7.3 缺陷型病毒 Fu-J3 前病毒全基因组 cDNA 的核苷酸序列 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备和不同亚群禽白血病病毒共感染相互影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 禽白血病病毒（ALV）病原特性 |
| 1.1.1 ALV 的形态学、理化特性等常规生物学特性 |
| 1.1.2 ALV 的分子生物学特性 |
| 1.2 ALV 的致病性及致病机制 |
| 1.2.1 ALV 的致病性 |
| 1.2.2 禽白血病的临床症状 |
| 1.2.3 禽白血病病毒的致肿瘤机制 |
| 1.2.4 禽白血病病毒引起的免疫抑制 |
| 1.3 禽白血病的检测和诊断 |
| 1.3.1 病毒分离和鉴定 |
| 1.3.2 血清学检测 |
| 1.3.2.1 ELISA 法 |
| 1.3.2.2 荧光抗体检测方法 |
| 1.3.2.3 血清中和试验 |
| 1.3.2.4 其他血清学检测方法 |
| 1.3.3 生物学试验 |
| 1.3.4 分子生物学方法 |
| 1.3.5 检测抗体 |
| 1.4 禽白血病在我国的流行现状及发展趋势 |
| 1.5 禽白血病的预防和控制 |
| 1.6 单克隆抗体在畜禽疫病诊断及防治中的应用 |
| 1.6.1 检测病原微生物 |
| 1.6.2 检测肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原 |
| 1.6.3 检测机体内的微量成分 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 ALV-A-SDAU09C1 ENV-GP85 基因的克隆与表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 病毒与细胞来源 |
| 2.1.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.1.4 主要仪器 |
| 2.1.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 病毒增殖与定量 |
| 2.1.2.2 细胞基因组DNA 的提取 |
| 2.1.2.3 ALV ENV-GP85 基因扩增引物的设计与合成 |
| 2.1.2.4 聚合酶链式反应（PCR） |
| 2.1.2.5 目的条带的回收 |
| 2.1.2.6 感受态大肠杆菌DH5Α的制备 |
| 2.1.2.7 PCR 回收产物的连接 |
| 2.1.2.8 连接产物的转化 |
| 2.1.2.9 阳性克隆细菌的筛选 |
| 2.1.2.10 质粒DNA 的提取 |
| 2.1.2.11 重组质粒DNA 的PCR 鉴定 |
| 2.1.2.12 序列测定与分析 |
| 2.1.2.13 重组表达载体PET-SDAU09C1-GP85 的构建与鉴定 |
| 2.1.2.14 诱导表达条件的筛选及优化 |
| 2.1.2.15 重组成熟蛋白ENV-GP85 的大量表达 |
| 2.1.2.16 菌体的超声波裂解及纯化 |
| 2.1.2.17 重组菌菌体裂解物SDS-PAGE 分析 |
| 2.1.2.18 重组蛋白特异性WESTERN-BLOT分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 PCR 扩增SDAU09C1 株ENV-GP85 基因的效果 |
| 2.2.2 重组质粒PET32A-SDAU09C1-GP85 的筛选和鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒PET-SDAU09C1-GP85 转化菌裂解物的SDS-PAGE |
| 2.2.4 WESTERN-BLOT |
| 2.3 讨论 |
| 3 A 亚群禽白血病病毒单克隆抗体的研制及其特性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 实验动物 |
| 3.1.1.2 细胞系及病毒毒株 |
| 3.1.1.3 主要试剂及耗材 |
| 3.1.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.1.1.5 间接ELISA 方法试剂配制 |
| 3.1.1.6 主要仪器 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 间接ELISA 检测方法的建立 |
| 3.1.2.1.1 间接ELISA 检测方法的基本操作 |
| 3.1.2.1.2 ELISA 最佳反应条件的确定 |
| 3.1.2.1.3 特异性实验 |
| 3.1.2.1.4 重复性试验 |
| 3.1.2.2 免疫抗原的制备 |
| 3.1.2.3 免疫动物 |
| 3.1.2.4 SP2/0 骨髓瘤细胞的制备 |
| 3.1.2.5 饲养层细胞的制备 |
| 3.1.2.6 脾细胞悬液的制备 |
| 3.1.2.7 细胞混合 |
| 3.1.2.8 细胞培养与观察 |
| 3.1.2.9 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.1.2.10 阳性杂交瘤细胞的克隆化 |
| 3.1.2.11 杂交瘤细胞的冻存 |
| 3.1.2.12 杂交瘤细胞的复苏 |
| 3.1.2.13 单克隆抗体腹水的制备 |
| 3.1.2.14 单克隆抗体的纯化 |
| 3.1.2.14.1 单抗的粗提 |
| 3.1.2.14.2 单抗的亲和层析纯化 |
| 3.1.2.15 单克隆抗体特性的鉴定 |
| 3.1.2.15.1 间接ELISA 法测定单抗效价 |
| 3.1.2.15.2 抗体分泌稳定性的测定 |
| 3.1.2.15.3 WESTERN BLOTTING分析单克隆抗体生物活性 |
| 3.1.2.15.4 间接免疫荧光(IFA) 检测单抗的特异性 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 间接ELISA 检测方法的建立 |
| 3.2.1.1 ELISA 最佳反应条件的确定 |
| 3.2.1.2 重复性及特异性 |
| 3.2.2 杂交瘤融合和筛选效果 |
| 3.2.3 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.2.3.1 腹水单抗的纯化 |
| 3.2.3.2 单抗的效价测定 |
| 3.2.3.3 抗体分泌稳定性 |
| 3.2.3.4 单抗的WESTERN BLOTTING分析 |
| 3.2.3.5 间接免疫荧光分析 |
| 3.3 讨论 |
| 4 A LV-A 与ALV-J 共感染对病毒血症及抗体反应的相互影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 病毒及细胞系 |
| 4.1.1.2 试验动物 |
| 4.1.1.3 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠二抗 |
| 4.1.1.4 单克隆抗体 |
| 4.1.1.5 ELISA 检测试剂盒 |
| 4.1.1.6 主要试剂及耗材 |
| 4.1.1.7 主要试剂配制 |
| 4.1.1.8 主要仪器设备 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 病毒的扩增 |
| 4.1.2.2 病毒TCID50的测定 |
| 4.1.2.3 实验动物的感染 |
| 4.1.2.4 实验动物的免疫 |
| 4.1.2.5 病毒血症的检测 |
| 4.1.2.5.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备 |
| 4.1.2.5.2 病毒蚀斑的培养 |
| 4.1.2.5.3 间接免疫荧光试验（IFA） |
| 4.1.2.6 血清中特异性抗体的检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 病毒TCID50的测定结果 |
| 4.2.2 病毒血症检测结果 |
| 4.2.2.1 ALV-A 单独感染病毒血症 |
| 4.2.2.2 ALV-J 单独感染病毒血症 |
| 4.2.2.3 ALV-J 共感染时对ALV-A 病毒血症的影响 |
| 4.2.2.4 ALV-A 共感染时对ALV-J 病毒血症的影响 |
| 4.2.3 共感染对特异性抗体反应的影响 |
| 4.2.3.1 ALV-J 共感染时对ALV-A 特异性抗体的影响 |
| 4.2.3.2 ALV-A 共感染时对ALV-J 特异性抗体的影响 |
| 4.2.3.3 病毒血症及相应抗体反应的相关性 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表、录用的论文 |
| 博士学位论文内容简介及自评 |
（8）两株携带v-fps和v-src肿瘤基因的复制缺陷型急性致瘤病毒的鉴定及其感染性克隆的致肿瘤作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽白血病病毒（ALV）的研究进展 |
| 1.1.1 ALV的形态大小和抵抗力 |
| 1.1.2 ALV的抗原分型 |
| 1.1.3 ALV的生长特征 |
| 1.1.4 ALV的病毒基因组和蛋白 |
| 1.1.5 ALV的遗传变异和重组 |
| 1.1.6 ALV的复制和生活史 |
| 1.1.7 ALV的致病性 |
| 1.1.8 ALV的致病和致瘤机制 |
| 1.1.9 ALV的流行病学和流行特点 |
| 1.1.10 ALV的检测和诊断 |
| 1.1.11 ALV的防控措施 |
| 1.2 反向遗传学在病毒学研究中的应用 |
| 1.2.1 反向遗传学的原理 |
| 1.2.2 ALV的反向遗传学 |
| 1.3 基因芯片技术在动物病毒学研究中的应用 |
| 1.4 核苷类药物在抗HIV治疗中的应用 |
| 1.4.1 核苷类药物的应用概况 |
| 1.4.2 HIV耐药性的产生及其检测 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要分子生物学试剂 |
| 2.1.4 主要配制试剂 |
| 2.1.5 抗体 |
| 2.1.6 菌种和载体 |
| 2.1.7 主要仪器 |
| 2.2 常规试验操作方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备 |
| 2.2.2 ELISA检测ALV抗原 |
| 2.2.3 间接免疫荧光（IFA） |
| 2.2.4 组织/细胞DNA的提取 |
| 2.2.5 细胞上清/血清中病毒RNA的提取 |
| 2.2.6 常规PCR扩增 |
| 2.2.7 RT-PCR扩增 |
| 2.2.8 扩增产物的回收 |
| 2.2.9 回收产物的连接 |
| 2.2.10 感受态细胞制备 |
| 2.2.11 连接产物的转化 |
| 2.2.12 质粒的提取 |
| 2.2.13 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.14 SDS-PAGE蛋白质电泳 |
| 2.2.15 免疫印迹（Western blot） |
| 2.2.16 免疫组织化学染色 |
| 2.3 Fu-J (SDAU1005) 株急性致瘤性ALV的分离鉴定 |
| 2.3.1 Fu-J (SDAU1005) 病毒悬液的传代和扩增 |
| 2.3.2 肉瘤组织DNA和病毒RNA的提取 |
| 2.3.3 PCR/RT-PCR扩增和克隆测序 |
| 2.3.4 Fps蛋白和p19gag蛋白的原核表达 |
| 2.3.5 鼠抗Fps和p19gag蛋白单因子血清的制备 |
| 2.3.6 IFA检测感染Fu-J (SDAU1005) 的CEF |
| 2.3.7 Western blot检测感染Fu-J (SDAU1005) 的CEF蛋白 |
| 2.4 复制缺陷型Fu-Js感染性克隆的构建和病毒拯救 |
| 2.4.1 SDAU1005感染性克隆质粒的构建 |
| 2.4.2 SDAU1005感染性克隆质粒的转染和病毒拯救 |
| 2.4.3 Fu-Js感染性克隆质粒的构建 |
| 2.4.4 Fu-Js质粒的转染和病毒拯救 |
| 2.4.5 动物实验研究拯救毒rFu-Js的致瘤性 |
| 2.4.6 免疫组化和IFA检测拯救毒rFu-J诱发的肿瘤 |
| 2.5 SJ (SDAU1102) 株急性致瘤性ALV的分离鉴定 |
| 2.5.1 SJ (SDAU1102) 病毒悬液的传代和扩增 |
| 2.5.2 肉瘤组织DNA提取和病毒RNA提取 |
| 2.5.3 PCR/RT-PCR扩增和克隆测序 |
| 2.5.4 p60~（v-src）蛋白的原核表达 |
| 2.5.5 鼠抗p60~（v-src）蛋白单因子血清的制备 |
| 2.5.6 Western blot检测感染SJ (SDAU1102) 的CEF蛋白 |
| 2.5.7 免疫组化检测原代肉瘤中的p60~（v-src）蛋白 |
| 2.5.8 复制缺陷型SJs感染性克隆的构建 |
| 2.5.9 复制缺陷型SJs感染性克隆的转染和检测 |
| 2.6 Fu-J (SDAU1005) 病毒生物学特性和致病性的研究 |
| 2.6.1 辅助病毒和缺陷型病毒荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.6.2 不同代次Fu-J (SDAU1005) 细胞传代毒Fu-J含量的研究 |
| 2.6.3 不同方式接种Fu-J (SDAU1005) 毒株对SPF鸡的致病性 |
| 2.6.4 不同方式接种Fu-J (SDAU1005) 毒株的抗原分布 |
| 2.6.5 免疫Fps蛋白对鸡体肿瘤的抑制作用 |
| 2.7 Fu-J (SDAU1005) 感染CEF的转录组学分析 |
| 2.7.1 样品制备、RNA抽提和纯化 |
| 2.7.2 样品RNA的放大和标记 |
| 2.7.3 芯片杂交和扫描 |
| 2.7.4 芯片数据分析 |
| 2.7.5 荧光定量RT-PCR |
| 2.7.6 差异表达基因编码蛋白的互作分析 |
| 2.8 拉米夫定抑制Fu-J (SDAU1005)复制和肿瘤生长的研究 |
| 2.8.1 拉米夫定在培养细胞上对Fu-J (SDAU1005)复制的抑制 |
| 2.8.2 拉米夫定影响反转录酶活性的研究 |
| 2.8.3 拉米夫定对CEF ALV-J受体表达影响的研究 |
| 2.8.4 拉米夫定对病毒入侵和释放影响的研究 |
| 2.8.5 拉米夫定对鸡体Fu-J (SDAU1005)复制和肿瘤生长的抑制 |
| 2.8.6 给药组鸡肿瘤中病毒耐药性的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Fu-J前病毒全基因组序列的扩增和分析 |
| 3.1.1 病毒悬液的传代和辅助病毒的纯化 |
| 3.1.2 Fu-J前病毒全基因组结构和序列的分析 |
| 3.1.3 Fu-J编码蛋白质的分析 |
| 3.1.4 Fu-J基因组结构与Fu-J1~5 及FSV、PRCII基因组结构的比较 |
| 3.1.5 Fps蛋白和p19gag蛋白的原核表达 |
| 3.1.6 鼠抗Fps和鼠抗p19gag单因子血清的获得 |
| 3.1.7 IFA检测感染Fu-J (SDAU1005) 的CEF |
| 3.1.8 Western blot检测感染Fu-J (SDAU1005) 的CEF蛋白 |
| 3.2 Fu-J (SDAU1005)感染性克隆的构建和缺陷型病毒的病毒拯救 |
| 3.2.1 SDAU1005感染性克隆的构建和病毒拯救 |
| 3.2.2 Fu-Js感染性克隆的构建 |
| 3.2.3 Fu-Js缺陷型病毒的拯救 |
| 3.2.4 拯救病毒的致瘤性研究 |
| 3.3 SJ (SDAU1102) 的分离鉴定和基因组分析 |
| 3.3.1 SDAU1102的纯化和病毒的定量 |
| 3.3.2 SDAU1102前病毒全基因组核苷酸序列的扩增和分析 |
| 3.3.3 SJ前病毒全基因组核苷酸序列的扩增和分析 |
| 3.3.4 p60~（v-src）蛋白的原核表达 |
| 3.3.5 鼠抗p60~（v-src）单因子血清的获得 |
| 3.3.6 Western blot检测感染SJ (SDAU1102) 的CEF蛋白 |
| 3.3.7 免疫组化检测SJ (SDAU1102) 诱发的急性肿瘤组织 |
| 3.3.8 SJ-1~5 在不同代次肿瘤组织中的数量相对变化 |
| 3.3.9 SJs感染性克隆的构建 |
| 3.3.10 SJs感染性克隆瞬时转染的检测 |
| 3.4 Fu-J (SDAU1005) 病毒生物学特性和致病性的研究 |
| 3.4.1 辅助病毒和缺陷型病毒荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.4.2 不同代次Fu-J (SDAU1005) 细胞传代毒Fu-J含量的比较 |
| 3.4.3 不同方式接种Fu-J (SDAU1005) 毒株对SPF鸡的致病性 |
| 3.4.4 急性肿瘤传播方式的模拟实验 |
| 3.4.5 免疫Fps蛋白对鸡体肿瘤的抑制作用 |
| 3.5 Fu-J (SDAU1005)感染CEF的转录组学分析 |
| 3.5.1 样品制备 |
| 3.5.2 差异基因分析 |
| 3.5.3 GO分析结果 |
| 3.5.4 KEGG通路注释 |
| 3.5.5 差异表达基因在染色体中的分布 |
| 3.5.6 荧光定量RT-PCR验证芯片数据 |
| 3.5.7 差异表达基因编码蛋白的互作分析 |
| 3.6 拉米夫定抑制Fu-J (SDAU1005)复制和肿瘤发生的研究 |
| 3.6.1 拉米夫定对体外培养CEF的影响 |
| 3.6.2 拉米夫定对Fu-J (SDAU1005) 在CEF上复制的影响 |
| 3.6.3 拉米夫定对AMV反转录酶的活性的影响 |
| 3.6.4 拉米夫定对CEF病毒受体表达和病毒入侵及释放的影响 |
| 3.6.5 拉米夫定对Fu-J (SDAU1005)在鸡体的复制和肿瘤生长的影响 |
| 3.6.6 给药组鸡肿瘤中病毒分离株耐药性的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Fu-J (SDAU1005) 的分离鉴定和基因组序列分析 |
| 4.2 rFu-Js感染性克隆的构建、病毒拯救和致瘤性分析 |
| 4.3 SJ (SDAU1102) 的分离鉴定和基因组序列分析 |
| 4.4 Fu-J (SDAU1005) 的病毒复制及其致瘤性的研究 |
| 4.4.1 Fu-J (SDAU1005) 病毒复制特性的研究 |
| 4.4.2 Fu-J (SDAU1005) 对SPF鸡的致病性、致瘤性的研究 |
| 4.4.3 Fps抗体对Fu-J (SDAU1005) 诱发肿瘤抑制作用的研究 |
| 4.5 感染Fu-J (SDAU1005) 的CEF转录组分析 |
| 4.5.1 细胞凋亡相关基因 |
| 4.5.2 细胞增殖相关基因 |
| 4.5.3 血管形成相关的基因 |
| 4.5.4 肿瘤细胞迁移相关的基因 |
| 4.6 拉米夫定抑制Fu-J (SDAU1005) 复制的研究 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读学位期间发表论文情况 |
（9）禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白p27基因的克隆、表达及免疫学诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 引言 |
| 一、 禽白血病病毒概述 |
| 1 ALV的分类地位及其亚群 |
| 2 ALV的形态及其基因组结构 |
| 3 ALV gag基因和p27蛋白质 |
| 4 ALV病毒囊膜基因及受体 |
| 5 外源性病毒和内源性病毒 |
| 6 ALV抗原漂移 |
| 7 ALV的流行病学特点 |
| 8 ALV的致病性及其致瘤机制 |
| 9 ALV与免疫抑制 |
| 二、 禽白血病的诊断及种群净化 |
| 1 ALV的诊断方法及比较 |
| 2 内源性病毒和外源性病毒的鉴别诊断 |
| 3 禽白血病的种群净化 |
| 三、 本实验的目的和意义 |
| 研究报告 |
| 实验一 禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白p27基因的克隆、序列分析及原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 p27重组蛋白的纯化、多克隆抗体的制备及在诊断中的初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 利用BAC-TO-BAC~(TM)杆状病毒表达系统快速生成p27重组杆状病毒及p27基因的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）髓细胞瘤相关A和K亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 禽白血病研究进展 |
| 1.1.1 禽白血病及病原研究的历史回顾 |
| 1.1.2 禽白血病病原学 |
| 1.1.3 禽白血病流行病学 |
| 1.1.4 禽白血病危害及临床病理学 |
| 1.1.5 禽白血病致病机制 |
| 1.1.6 禽白血病检测与防控 |
| 1.1.7 我国鸡群禽白血病研究历史与现状 |
| 1.2 本研究的目的和意义 |
| 第2章 病毒分离鉴定及分离株分子生物学特征研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病料及来源 |
| 2.1.2 细胞及主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 临床检测 |
| 2.1.5 病毒分离鉴定 |
| 2.1.6 病毒分离株的体外培养特性 |
| 2.1.7 前病毒全基因克隆与测序 |
| 2.1.8 前病毒基因序列拼接与分析 |
| 2.1.9 ALV-A/J/KMulti-PCR检测方法的建立 |
| 2.1.10 具有ALV-J3′LTR的A、K亚群重组ALVMulti-PCR检测方法的建立 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 病鸡临床症状及病理变化 |
| 2.2.2 ELISA和PCR结果 |
| 2.2.3 地方品种鸡病例中ALV-env的定序 |
| 2.2.4 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.5 分离病毒的体外培养特性 |
| 2.2.6 病毒分离株全基因克隆与测序结果 |
| 2.2.7 病毒分离株基因特性分析 |
| 2.2.8 ALV-A/J/KMulti-PCR建立 |
| 2.2.9 具有ALV-JLTR的A、K亚群禽白血病病毒检测方法的建立 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第3章 致髓细胞瘤型ALV-A、ALV-K分离株反向遗传体系的建立及拯救病毒的致病性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂与材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 病毒基因酶切位点分析与感染性克隆构建策略 |
| 3.1.4 感染性克隆构建 |
| 3.1.5 细胞转染与病毒拯救 |
| 3.1.6 拯救病毒的检测与鉴定 |
| 3.1.7 拯救病毒的体外培养特性 |
| 3.1.8 拯救病毒的致病性研究 |
| 3.1.9 感染鸡组织带毒检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 PCR扩增结果 |
| 3.2.2 感染性克隆质粒构建与鉴定 |
| 3.2.3 细胞转染与拯救病毒的鉴定 |
| 3.2.4 拯救病毒的体外培养特性 |
| 3.2.5 鸡只带毒与排毒监测 |
| 3.2.6 鸡只病变监测 |
| 3.2.7 感染鸡组织带毒检测 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第4章 致髓细胞瘤性型ALV-A感染鸡的肝脏组织转录组学分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 肝脏组织 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.1.4 RNA提取与质控 |
| 4.1.5 文库构建与测序 |
| 4.1.6 数据处理与分析 |
| 4.1.7 差异表达验证 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RNA提取及质量 |
| 4.2.2 数据产出及质量 |
| 4.2.3 CleanReads与参考基因组比对 |
| 4.2.4 转录本预测 |
| 4.2.5 差异剪切基因检测 |
| 4.2.6 基因表达量分析 |
| 4.2.7 样本间基因表达量相关分析 |
| 4.2.8 差异表达基因分析 |
| 4.2.9 差异表达验证 |
| 4.2.10 差异表达基因GO分析 |
| 4.2.11 差异表达基因pathway分析 |
| 4.2.12 差异表达基因TF编码能力预测 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
四、禽白血病／肉瘤病毒群特异性抗原P_（27）~（gag）的分离和纯化（论文参考文献）
- [1]禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析[D]. 毛娅卿. 中国农业大学, 2014(08)
- [2]地方品种鸡群禽白血病流行病学调查及检测净化技术研究[D]. 俞燕. 扬州大学, 2019
- [3]禽白血病标准抗原、标准抗体候选物的研制[D]. 纪依依. 扬州大学, 2016(02)
- [4]J亚群禽白血病病毒JS09GY3株感染特性及感染鸡法氏囊转录组学分析[D]. 杭柏林. 扬州大学, 2014(01)
- [5]禽白血病抗原和抗体ELISA检测方法的建立[D]. 谢华丽. 华中农业大学, 2013(03)
- [6]致急性纤维肉瘤的缺陷型J亚群禽白血病病毒肿瘤基因的鉴定[D]. 陈浩. 山东农业大学, 2012(12)
- [7]A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备和不同亚群禽白血病病毒共感染相互影响的研究[D]. 邱玉玉. 山东农业大学, 2011(08)
- [8]两株携带v-fps和v-src肿瘤基因的复制缺陷型急性致瘤病毒的鉴定及其感染性克隆的致肿瘤作用[D]. 王一新. 山东农业大学, 2016(08)
- [9]禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白p27基因的克隆、表达及免疫学诊断方法的建立[D]. 乔彩霞. 中国农业科学院, 2004(04)
- [10]髓细胞瘤相关A和K亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性[D]. 梁雄燕. 长江大学, 2018(12)