一、禽流感病毒人工感染鸡抗体的监测及血凝素分型血清的制备（论文文献综述）
田国斌,唐秀英,于康震[1]（1998）在《禽流感病毒人工感染鸡抗体的监测及血凝素分型血清的制备》文中研究说明从英国中心兽医实验室（ＣＶＬ）引进禽流感病毒１４种血凝素亚型（Ｈ１～Ｈ１４）的标准毒株，经９～１１日龄的ＳＰＦ鸡胚增殖、传代后收取感染鸡胚的羊水及尿囊液，经１０００ｘｇ离心１５分钟后，收取上清作为免疫原。取８只１２周龄ＳＰＦ鸡分成Ａ、Ｂ两组，进行人工感染鸡的抗体消长规律试验。选用Ｈ３毒株制备的免疫原，按１ｍｌ／只的剂量翅静脉接种Ａ、Ｂ两组的８只ＳＰＦ鸡，１周后Ｂ组的４只鸡复免一次，分别用ＨＩ和ＡＧＰ试验测定２种方法免疫鸡的抗体水平．监测结果表明：经１次免疫的鸡（Ａ组）于免疫后１５天ＨＩ抗体升至最高，以后抗体逐渐下降，且产生的抗体个体差异不大，ＡＧＰ试验结果只有于免疫后２０～５５天内全部为阴性；经重复免疫的鸡（Ｂ组），于初免后１５～４５天内ＨＩ抗体都维持较高水平，且产生的抗体个体差异不大，ＡＧＰ试验结果在初免疫后１５７５天内全部为阳性。据此，我们根据禽流感病毒株毒力的强弱（参照其ＥＩＤ５０，用纯化后的鸡胚尿囊液制备的免疫原，按０５～２５ｍｌ／只的剂量分别免疫１２周龄ＳＰＦ鸡，１周后加强免疫一次于二免后１０～１５天放血，制备出禽流感病毒１４个血凝素亚型的分型血清，并有霍乱滤液（ＲＤＥ）法对血清进行了处理。
孙志豪[2]（2018）在《H7N9亚型禽流感病毒检测方法的建立及标记疫苗的研制》文中进行了进一步梳理H7N9亚型禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）是一种新出现的人兽共患病原,自从20]3年首次在我国报道以来,在人类已引起5波流行,截止2017年]0月26日,共有1567人发病,其中包括615例死亡病例,病死率接近40%。早期的H7N9亚型AIV对家禽是低致病性的,家禽感染后无明显症状。2017年初开始出现对家禽呈高致病性的H7N9亚型AIV,分布于全国17个省份,并引发多起疫情。2017年下半年,重组AIV（H5+H7）二价灭活疫苗使用后,有效控制了家禽中的H7N9疫情,也显着减少了人的感染病例。但目前仍可在我国个别省份分离到对鸡和鸭均呈高致病性的H7N9和H7N2亚型AIV,使我国H7亚型AIV的防控面临新的挑战。因此迫切需要研制可用于区别自然感染和疫苗免疫动物的标记疫苗以及快速检测方法用于H7亚型AIV的防控和净化。1.鉴别九种禽流感病毒神经氨酸酶基因的—步法多重探针组合rRT-PCR方法的建立目前,已经在家禽和野鸟中鉴定出了 9种不同的禽流感病毒神经氨酸酶（NA）亚型,由于AIV很容易发生重组,同一种血凝素（HA）亚型的AIV可能存在不同的NA组合,在鉴定HA的同时也需要鉴定出NA亚型。我们设计了 9个亚型的NA引物-探针对,根据探针的不同荧光染料（FAM,HEX和TexasRed）将其分成3组,开发了一种基于多重探针组合的一步法rRT-PCR。结果显示,该多重rRT-PCR方法中的每组引物·探针对检测相应的不同亚型的NA特异性良好,无交叉反应;其检测限均小于100copies和100EID50。利用该方法分别检测人工感染H9N2病毒鸡的排毒样品和活禽交易市场的临床样品,结果显示,该方法检测结果的阳性率与病毒分离和基因测序方法的结果相一致,且灵敏度更高。综上所述,我们建立的这种快速、特异且灵敏的多重探针组合rRT-PCR方法,为NA分型提供了新的快速检测方法。2.快速检测H7亚型禽流感病毒的免疫胶体金试纸条的研制以H7N9亚型AIV（A/Chicken/Jiangsu/W1-8/2015,W1-8）作为免疫原制备单克隆抗体,利用抗原逃逸试验和HA基因序列测定及分析确定其针对的抗原表位,选择具有不同抗原表位的单抗研制检测H7亚型AIV的免疫胶体金试纸条。结果显示,共获得了13株具有血凝抑制特性的单抗,鉴定出198、227和235位3个抗原表位。选取了针对227位和235位的单抗制备免疫胶体金试纸条,结果表明,该试纸条具有良好的特异性、稳定性。棉拭和组织样品的检测限均为2.5 1og10 EID50/0.1mL。活禽市场样品的病毒检出率为3%（6/200）,与病毒分离结果（4.5%,9/200）和HA基因PCR测序结果（3.5%,7/200）一致。这为现场快速检测H7亚型AIV提供了新方法。3.H7N9亚型禽流感病毒灭活标记疫苗的研制通过多肽芯片的检测方法成功筛选到针对H7N9亚型AIV HA2上的特异性抗原表位H7-12肽,利用反向遗传技术修饰该抗原表位,并以H7N9毒株A/Chicken/Huadong/JD/17（JD/17）为骨架,研制出H7N9亚型AIV灭活标记疫苗候选株A/Chicken/Huadong/JD-cHA/17（JD-cHA/17）。该疫苗候选株的 HA 效价为 10 Log2,EID50 为 9.67 Log10oEID50/mL;在一次免疫鸡群3周后,HI抗体效价能达到9.2±0.6,表明该疫苗候选株具有良好的抗原性和免疫原性。攻毒保护试验结果表明,该疫苗候选株的免疫保护效果与母本毒株相当,对高致病性（HP）和低致病性（LP）H7N9AIVs均有100%的保护率。利用H7-12多肽芯片技术成功检测出自然感染后第3d血清转阳情况[信噪比（SNR）=2.33±0.15],灵敏度高于HI试验（HI=0）。疫苗候选株DIVA特性验证结果显示,利用H7-12多肽芯片检测疫苗候选株JD-cHA/17免疫血清（HI=9.2±0.6）和野生型毒株JD/17免疫血清（HI=9.1±0.5）,其针对H7-12多肽的SNR值分别为0.44±0.14和6.39±0.13,差异极显着,表明该灭活标记疫苗不能诱导针对H7特异性的H7-12多肽的抗体,具有DIVA特性和广泛的应用前景。4.区分H7N9亚型禽流感标记疫苗免疫血清和野毒株感染血清的竞争抑制ELISA方法的建立利用H7特异性表位H7-12多肽与BSA偶联作为免疫原,成功制备了 6株单克隆抗体。IFA和Western-blot试验结果显示,该6株单抗均能与H7N9亚型AIVJD/17反应,特异性良好。以JD/17自然感染血清和JD-cHA/17免疫血清为测试血清样品,利用竞争抑制ELISA方法,成功筛选出具有高抑制率的单抗3G10。将H7-12多肽作为包被抗原,纯化的3G10单抗腹水以辣根过氧化酶（HRP）进行标记作为检测抗体,建立针对H7-12抗体的竞争抑制ELISA方法。对竞争抑制ELISA方法的反应条件进行优化,确定抗原的最适包被浓度为50μ吨/mL,酶标抗体的最适工作浓度为1:200,待检血清最适稀释度为1:4,封闭液的最佳选择为8%的小牛血清封闭90 min,TMB的最佳反应时间为10min。判断标准为抑制率≥20%为阳性,≤16%为阴性。运用本方法检测JD/17自然感染血清为阳性,检测JD-cHA/17 免疫血清,HI、H3、H4、H5（RE-6、RE-7 和 RE-8）、H6、H9 和 H10 亚型 AIV的阳性血清均为阴性,说明该竞争抑制ELISA方法具有良好的特异性,可有效区分JD/17自然感染血清和JD-cHA/17免疫血清。
刘明[3]（2000）在《H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究》文中提出本文根据禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）核蛋白（NP）基因核苷酸序列，设计合成了NP基因特异的引物NPF/R。不需要经过病毒分离，直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中用Trizol试剂提取病毒核酸，采用RT-PCR技术可以扩增出326bp的NP基因片段。采用引物NPF/R对14个亚型禽流感病毒标准参考株，4个亚型12株国内分离野毒株进行RT-PCR，都能特异的扩增出扩增326bp左右的目的片断，采用地高辛标记的NP基因探针进行斑点杂交，结果证明了PCR产物的特异性。新城疫病毒、法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒RT-PCR扩增结果都呈阴性。禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）和A/African Starling/England/983/79（H7N1）人工实验感染鸡病料的RT-PCR检测结果与鸡胚病毒分离结果分别为34/42、32/42；24/55、24/55符合率在95％以上。RT-PCR最少可以检测到10pg的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行RT-PCR检测，只用6个小时就得出确实的诊断结果。 根据Genbank数据库中发表的H5和H7亚型禽流感病毒血凝素基因（HA）核苷酸序列，分别设计合成了H5和H7亚型HA基因特异的引物H5F/R和H7F/R，建立了RT-PCR鉴别H5和H7亚型的分子分型诊断技术。引物H5F/R经RT-PCR能够扩增出H5亚型247bp的目的片段，引物H7F/R经RT-PCR能够扩增出H7亚型192bp的目的片段，这两对引物对其它亚型流感病毒和新城疫、传染性支气管炎病毒RT-PCR检测结果均呈阴性。采用地高辛标记的HA基因探针进行斑点杂交，结果证明了上述PCR产物的特异性。RT-PCR对H5和H7亚型实验感染鸡病料的检测结果与病毒分离结果分别为H5，32/38、30/38；H7，19/38、21/38的符合率为95％。使用引物H5FS/RS或H7FS/RS，经RT-PCR分别扩增出H5亚型998bp或H7亚型712bp的包含裂解位点在内的HA基因片段，目的片段回收后直接用于测序反应，根据核甘酸序列推出的蛋白质氨基酸序列可以用来判定H5或H7亚型病毒的致病性高低，从而为H5或H7型禽流感的毒力分析预测提供可靠的实验依据。 分别设计了HA基因和NA基因特异的引物，引物5’端分别添加有BamHI位点和HindIII位点，经RT-PCR分别扩增了禽流感病毒A/Goose/Guandong/1/96（H5N1）1.7kb的HA基因和1.4kb的NA基因，BamHI和HindIII酶切，然后分别克隆到pUC19的BamHI位点和HindIII位点，酶切筛选得到阳性重组子pUCH5和pUCN1。经序列测定后，再将HA基因和NA基因分别亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB的BamHI位点和HindIII位点中，随机筛选得刘 明 HS和 H7亚型禽流感病毒分子防制技术的研究 2000年 6月别亚克隆到杆状病毒转移载体PBlueBacHisB的BalnHI位点和Hindlll位点中，随机筛选得到重组转移载体pBacHS和pBacNI，序列分析证实读框正确后用于转染实验。从含有A／African Starling／Ensland／983／79（H7NI）HA基冈的重组质粒pUCH7中用 BamH切下1．7kb的M基因，然后将其插入杆状病毒转座载体pFaslBacDUAL的 BalnHI位点，随机筛选酶切鉴定得到止向重组转座于pFASTll7，经序列分析证明HA基因完整，方向正确，然后转染含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac，经抗生素筛选，PCR鉴定得到阳性穿梭转座子rBacmidH7。 在脂质体转染试剂CeellFECTIN介导下，将杆状病毒转移载体pBacHS和pBacNI与线性化的杆状病毒DNA（Bac－N－Blue DNA）共转染对数生长期的肝 昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经二轮蚀斑纯化，获得重组杆状病毒rBacHS和rBacNI。重组穿梭载体pBacmidH7在脂质体转染试剂介导卜．转染肝 细胞，获得重组杆状病毒rBacll7。提取重组杆状病毒DNA经PCR扩增证明目的基因片段插入到杆状病毒基因组中。间接免疫荧光染色试验、ELISA试验结果表明 HA和 NA基因在重组杆状病毒感染的蚊 细胞获得表达。SDS－PAGE电泳分析显示用组杆状病毒表达HA蛋白分子量为60kDa左右，能够凝集公鸡红细胞，血凝价1280—2560HAU／ml。里组杆状病毒表达M蛋白分子量为 50kDa左右。 页织杆状病毒rBacHS、rBacNI、rBacH7和野生病毒AcMNPV分别感染肚 细胞72小时后收集细胞，免疫6组6周龄肝P鸡。卜4组，m只／组，m‘细胞／只肌肉注射；对照组1fU 2，5只／组 10‘细胞／只肌肉注射。rBacHS和 rBacH7，rBacNI免疫组经二次免疫后，每次间隔时间为2周，rBacHS和rBacNI联合免疫组1＆免疫后4周；分别以10’EID。。的A／Goose，／G。angdong／1／96（HSNI）和A／African Starling／England／983／79（H7N）肌肉接种 10’EIDS。进行攻毒试验，试验结果表明所有亚单位疫苗免疫组都可产生禽流感病毒亚型特异性抗体，rBacHS一次免疫即可诱导产生血撤抑制抗体（HI） 3．slooZ，加强免疫后HI抗体效价明显升高 4．slogZ。rBacHS二次兔疫组和 rBacHS＋rBacNI联合免疫组对强毒攻击的保护率达 90％（9／10），rBdCNI免疫组对强毒攻击保护率为 50％（5／10），而空白对照组对强毒攻击不能提供保护，5只鸡全
张进良[4]（2010）在《鸡的主要病毒性疫病抗体快速检测方法的建立和应用研究》文中提出禽流感（AI）、新城疫（ND）、传染性支气管炎（IB）、传染性法氏囊（IBD）和鸡毒霉形体（MG）感染是目前危害我国养鸡业的几种主要的呼吸道传染病,可导致鸡群不同程度的死亡和生产性能的下降,给我国养禽业造成极大的经济损失。上述疫病虽均有疫苗进行免疫预防,但由于我国地域广阔,养殖模式多样,各种疫病特别是呼吸道疫病仍时有发生,因此,发病后的快速诊断或免疫后的血清抗体效价监测已经成为各地养禽场和诊断室的常规检测项目。目前常用的检测方法有血凝和血凝抑制试验、琼脂扩散试验以及酶联免疫吸附试验等,这些常规方法有的耗时长,有的需要特殊的仪器或技术人员,因而在基层应用受到一定限制。胶体金免疫层析方法是以条状纤维层析材料为固相载体,通过毛细管作用原理,以胶体金为示踪物来显示结果的一种新型的检测方法。这种方法具有操作简单、快捷,分析结果清楚、易于判断,且不需要任何仪器、成本低廉等优点,非常适用于现场检测及自动化检测分析。因此,在医学快速检测领域得到了迅猛发展,目前已逐渐应用于动物医学领域的快速检测方面。本研究针对目前鸡的几种主要病毒性疫病抗体检测方法中存在的问题,运用胶体金免疫层析技术,采用间接法原理,建立了五种鸡的主要病毒性疾病抗体的快速检测方法,一种抗体三联检的检测方法和一种抗体效价测定的检测方法。取得了如下研究成果。1. AIV-HA1、NDV-HN、IBV-N、IBDV-VP2和MG-VlhA1.2重组蛋白的表达纯化用带有GST标签的原核表达载体,实现了AIV-HA1、NDV-HN、IBV-N、IBDV-VP2和MG-VlhA1.2重组蛋白的高效表达,通过亲核层析的方法获得了适合于制备试纸条的重组蛋白,并用Western blot对纯化的蛋白进行了分析,结果证实,这5种融合表达的蛋白均具有较好的免疫活性。2.抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的制备复苏抗鸡IgG Fc段单克隆抗体生产细胞株BDRPDP细胞,经小鼠腹腔接种获得的抗体效价较高的腹水,用辛酸硫酸铵法纯化腹水,并用透析法对纯化的单克隆抗体进行脱盐,获得了高活性、高纯度的单克隆抗体。3.胶体金及胶体金单抗复合物的制备成功确立了柠檬酸三钠还原法制备20 nm胶体金的条件；并利用该胶体金,对抗鸡IgG Fc段单克隆抗体进行了胶体金标记条件的摸索,成功确立了胶体金标记单克隆抗体的条件：每毫升胶体金加入7μL 0.1 mol/L K2CO3时pH最佳,每毫升胶体金加入12μg单克隆抗体为最适蛋白用量,并在该条件下制备了胶体金单抗复合物。4. AIV、NDV、IBV、IBDV和MG血清抗体快速检测试纸条的研制以胶体金标记抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为金标抗体,固定在检测线上的AIV-HA1或NDV-HN或IBV-N或IBDV-VP2或MG-VlhA1.2重组蛋白作为捕获抗原,采用间接法,分别成功地建立了AIV HA1蛋白血清抗体快速检测试纸条、NDV血清抗体快速检测试纸条、IBV血清抗体快速检测试纸条、IBDV血清抗体快速检测试纸条和MG血清抗体快速检测试纸条。用制成的这5种单一血清抗体快速检测试纸条对AIV H5亚型阳性血清、AIV H9亚型阳性血清、NDV阳性血清、IBV阳性血清、IBDV阳性血清、IBDV阳性血清和MG阳性血清分别进行测试。每种试纸条均只与相应的阳性血清发生反应,与其他所有阳性血清均呈阴性反应。在此基础上,本研究又以抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为示踪物,采用三条检测线分别包被IBDV-VP2、IBV-N和AIV-HA1重组蛋白作为捕获抗原,建立了IBDV、IBV和AIV三联血清抗体快速检测试纸条。实验结果证明,本方法特异性强,灵敏度高,且操作简便、结果判定直观,可在一份样品中同时对IBDV、IBV和AIV三种抗体进行快速检测。5.IBV抗体效价快速检测试纸条的研制本研究以胶体金标记抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为示踪物,用固定在三条检测线上的不同浓度的IBV-N蛋白作为捕获抗原,采用间接法,成功地建立了IBV抗体效价快速检测试纸条。用制成的试纸条检测AIV H5亚型阳性血清、AIV H9亚型阳性血清、NDV阳性血清、IBV阳性血清、IBDV阳性血清、IBDV阳性血清和MG阳性血清分别进行测试,未出现与交叉反应。对不同效价的IBV抗体进行测试,确定为血清效价大于8log2出现三条检测线,介于8log2和5log2之间的出现两条检测线,介于5log2和2log2之间的出现一条检测线,小于2log2不出现检测线。实验结果表明,本方法特异性强,且操作简便、结果判定直观,可以用于IBV抗体效价测定。
王诗盈[5]（2019）在《辽宁省H9N2亚型禽流感分离株鉴定及抗原特性初步分析》文中提出H9N2亚型禽流感病毒是一种低致病性禽流感,这类病毒一般不会导致禽类发病或死亡,但H9N2亚型禽流感病毒可以使患病家禽生产性能降低,严重时H9N2亚型禽流感病毒可以混合其他病毒或细菌感染,造成禽类死亡。H9N2亚型禽流感病毒会和H5、H7等其他亚型禽流感毒株之间发生基因重配,是新发流感病毒重要的基因供体病毒,H9N2亚型禽流感染人类的事件也频繁发生,所以对于H9N2亚型禽流感病毒的防控显得尤为重要。由于各类亚型的流感病毒所导致疾病的治疗和防控策略不同,建立快速的分型检测方法,对于流感的早期诊断和防控有重要意义。本论文首先建立H5、H7和H9亚型流感病毒的分型鉴定PCR方法,利用该方法检测在活禽市场采集到的禽类咽拭子、肛拭子样品,鉴定出11份H9N2亚型禽流感病毒阳性样品。对11份阳性样品进行病毒纯化、分离、增殖,将获得的H9N2病毒命名为A/Chicken/Liaoning/01/2017（H9N2）-A/Chic ken/Liaoning/11/2017（H9N2）。比对11株病毒的HA和NA序列,发现2株病毒A/C hicken/Liaoning/05/2017（H9N2）和A/Chicken/Liaoning/06/2017（H9N2）的HA蛋白在100、221、250、315位点处与其他9株病毒不同。利用H9N2亚型禽流感病毒标准血清分析11株病毒的抗原性,发现A/Chicken/Liaoning/05/2017（H9N2）和A/Chicken/Liao ning/06/2017（H9N2）2株病毒的抗原性发生较大变异,与标准血清结合的血凝抑制价低,推测HA100、221、250、315这四个位点影响了病毒的抗原性。将这2株毒株感染SPF鸡,制备高免血清,经血凝抑制实验发现,高免血清与其它9株病毒结合良好,因此这两株H9N2病毒可能成为辽宁省H9N2亚型禽流感病毒的后备疫苗株。
王伟利[6]（2006）在《不同源性禽流感病毒株的分离鉴定及其主要基因信息的研究》文中研究表明经过病毒分离从鸡、鸭、鹅、鸽子和猪等咽喉、泄殖腔棉拭子和体内样品中分离到17株鸡源、鹅源、鸭源、鸽源和猪源禽流感病毒，经负染后用电子显微镜观察，可见球形，外被囊膜的病毒颗粒。经HI和NI试验和荧光RT-PCR技术鉴定为H5亚型或H9亚型禽流感病毒。对各毒株EID50、IVPI、ICPI和致病性试验结果表明，分离到4株鸡源、8株鹅源、1株鸭源、1株鸽源和1株猪源H5N1亚型高致病性禽流感病毒株；1株鸡源H5N2亚型和1株鸡源H9N2亚型低致病性禽流感病毒株。经过理化特性试验可知：AIV分离株均为热不稳定性，56℃30min、60℃10min和65-70℃3min即可被灭活。禽流感病毒分离株对乙醚、氯仿和酸均敏感。根据GeneBank中已知的基因序列，设计合成6对用于扩增H5N1、H5N2、H9N2亚型血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因的特异性引物。提取病毒基因组总RNA，运用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分别扩增6株鸡源、8株鹅源、1株鸭源、1株鸽源和1株猪源病毒分离株的的两个基因片段，并分别连接到载体pMD18-T上，转化到感受态细胞，提取质粒，进行PCR和酶切鉴定及其序列测定。结果表明：分别扩增和克隆出上述各毒株的HA和NA两基因片段，该15株H5N1亚型AI毒株HA基因阅读框基因全长1707bp，编码568个氨基酸。HA1、HA2的裂解位点附近有连续6个碱性氨基酸（RRRKKR）的插入，为高致病性AIV的分子特征。在HA肽链上有6个或7个潜在的糖基化位点。受体结合位点相对应的氨基酸分别为YWIHELY，左侧壁氨基酸为SGVSS，右侧壁氨基酸为NGQSG。决定宿主特异性的受体结合位点226位和228位氨基酸具有与禽类细胞受体结合特异性。NA基因阅读框基因全长为1350bp（G7 1410bp），编码450（G7 469）个氨基酸。有3个或4个（G7）糖基化位点。H5N1亚型毒株（除G7外）在NA基因第48位氨基酸后缺失了20个氨基酸，具有当地流行株的特征。H5N2和H9N2 AIV毒株血凝素（HA）阅读框基因全长分别为1695 bp、1683bp，分别编码564个氨基酸和560个氨基酸。HA1、HA2的裂解位点附近无连续碱性氨基酸的插入，为非高致病性AIV的特征。H5N2亚型AIV株的NA基因全长1401bp，编码467个氨基酸；H9N2亚型AIV株NA基因全长1410bp，编码470个氨基酸，其受体结合位点的氨基酸分别为YWTNVLY，左侧壁氨基酸为NGQQG，右侧壁为GTSKA。利用分析软件对分离株之间的HA、NA基因，对分离株与参考毒株的之间的HA、NA基因进行同源性比较分析。分离株之间同源性比较结果表明：分离株之间的HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.4％～99.6％和95.2％～99.5％；NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.9％～100％和95.3％～100％。分离株与参考毒株株之间的HA基因和NA基因的同源性比较结果表明：分离株与参考株之间HA基因的核苷酸、氨基酸同源性分别为94.2％～99.9％和94.2％～99.6％；分离株与参考株之间的NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为86.0％～100％和86.6％～100％。本地区分离到的17个毒株遗传演化关系发现：同一亚型毒株同源性比较高，没有明显宿主差异。分离株的基因来源不同，因此导致毒株基因多样性。根据GeneBank中已知的AIV8个基因序列设计合成11对特异性引物，从尿囊液中提取病毒基因组总RNA，运用RT-PCR技术分别扩增2株鹅源和1株鸽源分离株的8个基因片段的cDNA，克隆、序列测定。结果表明，所克隆到的8个片段即HA、NA、NP、M、PB1、PB2、PA和NS，各基因均包含相应的病毒基因完整开放阅读框架。8个基因片段的长度分别为1730bp、1371 bp（1410bp）、1542 bp、2322 bp、2330 bp、2233 bp、1020 bp和884 bp核苷酸，并分别编码568、449（G7为469）、499、757、759、716、351和230个氨基酸。通过3株H5N1亚型禽流感病毒株全基因遗传演化分析表明：本区域内毒株分两组，G7组：其NA基因、NS基因均无氨基酸缺失，与A／GS／HK／ww28／00各基因同源性为98.1％～99.6％，其中与HA、NA、NP和PB14个基因的核苷酸均高于99.1％、因此G7的4个基因可能由A／GS／HK／ww28／00提供，两毒株均来源于A／GS／GD／1／96，一同处于等位基因内；G8、P组：在NA基因第48位氨基酸后缺失了20个氨基酸，在NS基因第79-84位缺失5个氨基酸；与其它参考毒株处于同一等位基因内。用1株鹅源H5N1亚型AIV对非免疫鸡进行滴鼻点眼、肌肉注射、静脉注射三种途径攻毒，攻毒后18-196h可以从咽喉、泄殖腔拭子分离到病毒。攻毒后24-240h可以从心、肝、脾脏、肺脏、肾脏、脑和肌肉等脏器利用荧光RT-PCR及免疫荧光检测到病原，结果表明该毒株对鸡有较强的致病性，病毒抗原在各部位定植时间不同。
徐一鸣[7]（2009）在《流感病毒多亚型检测方法的研制和应用》文中提出本研究利用分子生物学、病毒学和免疫学等技术和手段,旨在探索H3、H5、H7及H9血凝素亚型流感病毒抗原检测方法。本研究设计了4对针对流感病毒H3、H5、H7及H9血凝素亚型核酸序列的特异性引物,优化多元RT-PCR反应体系,并通过H3、H5、H7及H9亚型血凝素基因在PBV220载体中的原核表达获得同步阳性对照,建立了四种亚型一步法RT-PCR分型检测方法;制备并纯化了流感病毒H3、H5、H7及H9血凝素亚型单克隆抗体,加之阳性标准血清,通过反应条件的优化,建立了抗原捕获ELISA方法,完成了检测试剂盒的组装。本研究有以下创新点:实现了流感病毒H3、H5、H7及H9血凝素亚型在一个反应体系中、经一次操作进行检测;将检测对象由禽扩大到人和其它哺乳动物;将PBV220原核表达产物中的RNA用作RT-PCR方法中的实时阳性对照;利用亲和层析法获得了四种亚型高纯度的单克隆抗体;首次建立了H3和H7亚型抗原捕获ELISA方法。研究证明,建立的方法对H3、H5、H7及H9血凝素亚型流感病毒的检测具有高度的特异性、敏感性和安全性,对流感病毒血凝素亚型抗原的检测和区分具有一定的指导意义,为早期发现流感病毒对人、禽的感染提供了实际应用基础。
马静[8]（2020）在《华东地区H9N2亚型禽流感病毒抗原性分析及疫苗候选株免疫效力评价》文中认为H9N2亚型禽流感病毒为低致病性,最早于1966年美国的火鸡中分离到,1992年首次出现于我国,随后在中国大部分省份传播流行,目前已经成为中国家禽中流行范围最广泛的禽流感亚型之一。感染H9N2亚型禽流感的家禽生产性能降低,还容易混合感染其他病原,加重发病率和死亡率,给家禽养殖业带来经济损失。研究表明该病毒还能跨种间传播给人,给具有大流行潜力的人畜共患流感病毒提供内部基因,对人类健康具有重大威胁。为了预防和控制H9N2亚型禽流感,自1998年我国就大规模使用疫苗进行免疫,但是该病毒还是在大部分省份散发或地方流行。原因在于病毒RNA聚合酶缺乏校正机制和持续的免疫压力作用下,病毒处于持续抗原变异中,而疫苗的更新速度有限,使疫苗对当前的流行株不能提供有效的保护。本研究选取了 57株2008-2019年实验室分离的H9N2亚型禽流感病毒,利用血清学实验技术对这些毒株进行了抗原性分析;同时,根据抗原性分析结果选择病毒株作为疫苗候选株进行攻毒免疫保护试验,评价疫苗免疫效力。1.H9N2亚型禽流感病毒的抗原性分析为了分析H9N2亚型禽流感病毒的抗原差异性,根据分离时间、地点以及HA基因遗传进化等因素,从2008-2019年间分离的H9N2亚型禽流感病毒中挑选了 57株毒株（每年度毒株至少选择2株）进行研究。其中29株H9N2亚型禽流感病毒作为抗原制备了鸡多抗血清,并与57株病毒进行了交叉血凝抑制实验,发现这些毒株之间存在明显抗原差异。早期疫苗株F98及现用疫苗株WJ57的多抗血清与选取的毒株反应存在较大HI效价差,特别是与2017-2019毒株的反应,产生了 2-32倍的差异。利用交叉血凝抑制实验数据绘制了抗原图谱,可以看出2008-2019年的毒株主要聚集在两个抗原群（Ⅰ、Ⅱ）。抗原群Ⅰ含有2008-2019年的大部分毒株（35/57）;抗原群Ⅱ中的毒株主要是2014-2019年的部分毒株（18/57）,其抗原距离与抗原群Ⅰ的毒株较大,形成一个新的抗原距离离散程度高的抗原群Ⅱ。HA蛋白氨基酸位点分析表明,与抗原群Ⅰ相比,抗原群Ⅱ群毒株HA发生了抗原相关氨基酸位点的替换.:G72E,D135G,T182R,Q146H,G149D/K,I217L/M/Q等,这可能是抗原群Ⅱ的毒株与抗原群Ⅰ毒株抗原距离大的原因。从两个抗原群中选择毒株进行中和实验,结果显示同一抗原群内毒株的中和效价要比不同抗原群的中和效价高,这与交叉血凝抑制实验结果相一致;抗原群Ⅰ中毒株抗血清与抗原Ⅰ群（PD50:447-14125）、抗原Ⅱ群（PD50:447-3548）中毒株反应性都较高。我们从两个抗原群中选出3个毒株:AH463株（抗原Ⅰ群）以及FJ1802和292HI株（抗原Ⅱ群）,在交叉血凝抑制实验和中和实验中反应性良好,可以考虑采用这些毒株作为H9N2亚型禽流感的疫苗候选株。2.H9N2亚型禽流感疫苗候选株的免疫效力评价根据上一章抗原性分析中交叉血凝抑制试验和中和实验的结果,选择了 4株病毒:WJ57、AH463、292HI和FJ1802进行免疫,其中WJ57毒株是之前的疫苗株;WJ57和AH463属于抗原群Ⅰ,而毒株292HI和FJ1802属于抗原群Ⅱ。将这4株毒株进行灭活处理制成灭活疫苗进行免疫。用这4种灭活疫苗免疫后,均在SPF鸡体内检测到抗体,平均抗体效价≥8log2,达到能够提供保护效果的水平。每个免疫组分别用毒株AH463和292HI进行攻毒后,每天对SPF鸡进行观察,没有观察到临床症状。各免疫组在在攻毒后第3,5,7天均能检测到排毒,喉头的排毒率高且排毒时间长,攻毒组第7天的排毒率较第3,5天的排毒率降低。同时直接接触组和间接接触组的鸡喉头和泄殖腔在攻毒后也能检测到病毒,说明攻毒后病毒可能发生了免疫逃避。对免疫逃避株进行二代测序结果表明,HA蛋白有17个氨基酸位点发生了变换,其中88、172和196位替换比例最高,对抗原性影响较大。HA氨基酸位点变异对毒株抗原性和免疫识别的影响机制还有待我们进一步深入研究。
彭伏虎[9]（2008）在《禽流感与新城疫胶体金免疫层析快速检测技术及初步应用研究》文中指出禽流感（AI）与新城疫（ND）是世界公认的最重要的两大禽类传染病,可导致禽类的大量死亡或生产性能的急剧下降,给世界养禽业造成巨大的经济损失,同时由于禽流感病毒（AIV）可以感染人,引起人发病甚至死亡,给人类的公共卫生安全造成了极大的威胁。目前,对于AI和ND的诊断主要有病毒分离、血凝和血凝抑制、ELISA、RT-PCR等,但由于耗时冗长或需要特殊的仪器设备及技术人员,难以满足现场、适时快速诊断的要求。胶体金免疫层析方法是以条状纤维层析材料为固相载体,通过毛细管作用原理,以胶体金为示踪物来显示结果的一种新型的检测方法。这种方法具有操作简单、快捷,分析结果清楚、易于判断,且不需要任何仪器、成本低廉等优点,非常适用于现场检测及自动化检测分析。因此,在医学快速检测领域得到了迅猛发展,目前已逐渐应用于动物医学领域的快速检测。本研究针对目前禽类呼吸道疾病病原检测方法中存在的问题,运用胶体金免疫层析技术,采用双抗体夹心法原理,建立了两种禽类主要呼吸道病原的快速检测技术,取得了如下研究成果。1.鸡抗AIV、鸡抗NDV和山羊抗鼠多克隆抗体的制备及纯化用通过鸡胚传代,经超离浓缩后的AIV（H9N2）和NDV免疫健康鸡,同时,以纯化的小鼠IgG免疫山羊,制备了鸡抗AIV、鸡抗NDV、羊抗鼠高免血清。对所得高免血清分别采用饱和硫酸铵粗提和G-200过柱纯化,最后得到了纯化的鸡抗AIV、鸡抗NDV和羊抗鼠抗体。2.单克隆抗体的制备与纯化利用纯化的AIV融合表达蛋白GST-NP和NDV免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,经过细胞融合、筛选和多次克隆分别获得5株针对AIV-NP,5株针对NDV-HN的能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。同时对实验室制备和保存的禽流感H55E8和H94C4单克隆细胞株成功进行了复苏。经小鼠腹腔接种获得的单抗效价均较高,5株针对AIV-NP的ELISA效价均在1:3.2×104以上;5株针对NDV-HN的ELISA效价均在1:1.6×104以上,HI效价均在1:210以上;禽流感H55E8和H94C4的腹水HI效价分别为1:214和1:216。对其中效价高的几株进行了纯化,获得了高纯度的单克隆抗体。3.胶体金及金标抗体的制备采用柠檬酸三钠还原法,成功确立了20nm胶体金的制备条件;并利用制备好的胶体金,对前述制备的抗禽流感核蛋白单克隆抗体（AIV-NP5F4）、抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体（H94C4）、抗禽流感H5亚型血凝素单克隆抗体（H55E8）、抗新城疫病毒血凝素神经氨酸酶单克隆抗体（NDV-HN2I3）进行了胶体金标记条件的摸索,成功确立了单克隆抗体的胶体金标记条件:最适pH值为8.0,最适标记量为12μg/mL胶体金,并制备了相应的金标抗体。4.H5、H9亚型禽流感病毒免疫层析快速检测及鉴别诊断试纸条的研制以胶体金标记禽流感H5、H9亚型血凝素单克隆抗体作为示踪物,用固定在检测线上的鸡抗AIV IgG作为捕获抗体,采用双抗体夹心法,分别成功地建立了H5、H9亚型AIV免疫层析快速检测试纸条。用制成的H9亚型AIV试纸条检测已知H9N2亚型AIV尿囊液和禽流感H9亚型标准血凝抗原时,检测线出现明显的紫红色条带,而阴性对照、其它AIV标准血凝抗原以及多种禽类病毒包括EDS-76V、NDV、IBV、ILTV,IBDV等均呈阴性反应;用制成的H5亚型AIV试纸条检测已知禽流感H5亚型标准血凝抗原时,检测线出现明显的紫红色条带,而阴性对照、其它AIV标准血凝抗原以及多种禽类病毒包括EDS-76V、NDV、IBV、ILTV,IBDV等均呈阴性反应。效价测定的结果表明,H9亚型AIV检测试纸条的灵敏度可以达到0.25个血凝单位,比血凝试验高4倍以上,H5亚型AIV检测试纸条的灵敏度与HA试验相当。在此基础上,本研究用金标记抗禽流感病毒核蛋白单克隆抗体作为示踪物,在两条检测线上分别包被禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体H94C4、禽流感H5亚型血凝素单克隆抗体H55E8作为捕获抗体,建立了H5、H9亚型AIV快速鉴别诊断试纸条。实验结果证明,本方法特异性强,灵敏度高,且操作简便、结果判定直观,可以用于H5、H9亚型AIV的快速检测及鉴别诊断。5.禽流感和新城疫病毒免疫层析快速检测及鉴别诊断试纸条的研制本研究以胶体金标记抗AIV-NP单克隆抗体作为示踪物,用固定在检测线上的鸡抗AIV IgG作为捕获抗体,采用双抗体夹心法,成功地建立了AIV胶体金快速检测试纸条。用制成的试纸条检测已知H5、H7、H9亚型禽流感病毒标准血凝抗原时,检测线出现明显的紫红色条带,而阴性对照、其它禽类病毒包括EDS-76V、NDV、IBV、ILTV,IBDV等均呈阴性反应;效价测定的结果表明,试纸条法的灵敏度比血凝试验高4倍以上。以胶体金标记抗NDV-HN单克隆抗体作为示踪物,用固定在检测线上的鸡抗NDV IgG捕获抗体,采用双抗体夹心法,成功地建立了NDV胶体金快速检测试纸条。用制成的试纸条检测已知NDV时,检测线出现明显的紫红色条带,而阴性对照,H5、H7、H9亚型禽流感病毒标准血凝抗原以及其它禽类病毒包括EDS-76V、IBV、ILTV,IBDV等均呈阴性反应;效价测定的结果表明,试纸条法的灵敏度比血凝实验至少高4倍。在此基础上,采用一膜包被多个抗体的方法,用混合后的金标记抗AIV-NP单克隆抗体和胶体金标记抗NDV-HN单克隆抗体作为示踪物,建立了AIV和NDV快速鉴别诊断试纸条。实验结果证明,本方法特异性强,灵敏度高,且操作简便、结果判定直观,可以用于AIV和NDV的检测与鉴别诊断。6.禽流感病毒通用型及H9亚型快速检测试剂盒的研制与应用用建立的快速检测方法成功研制出禽流感病毒快速检测试剂盒和H9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒。分别对两种试剂盒进行了特异性、敏感性、重复性及保存期的测定。结果表明,在4℃能保存12个月,室温能保存6个月而特异性和敏感性没有任何变化,而且特异性强、敏感性高、重复性好,操作简单、方便,能快速、准确地检测出样品中是否带有禽流感病毒或H9亚型禽流感病毒抗原。对试剂盒的验证结果表明,两种试剂盒均能在感染三天之内检出禽流感病毒,真正达到了早期检测的要求。临床采集311份样品,用H9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒及禽流感病毒快速检测试剂盒进行检测,检出率分别为35%和39.2%,与本室早期研制的禽流感病原ELISA诊断试剂盒的符合率分别为92%和100%,对试剂盒检测样品的病毒分离鉴定证明无一漏检。
何颖[10]（2020）在《鸽Ⅰ型副粘病毒的全基因组测序及病原学特性分析》文中指出鸽Ⅰ型副粘病毒（Pigeon paramyxoviruses-1,PPMV-1）是新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）中的基因VI型NDV,广泛分布于世界各地,引起鸟类和家禽感染,并主要引起鸽科鸟类感染发病。目前,针对对此类病原的监测报告和有关疫病的研究尚不充分,导致PPMV-1遗传进化信息和控制措施的缺乏,本文将从PPMV-1的致病机理、诊断方法、遗传多样性和病原学特性等方面进行研究。为了解PPMV-1在野鸽组织中的分布情况,阐明PPMV-1对野鸽的致病机理,本研究采用免疫组化IHC方法,针对2010～2016年间美国自然感染死亡的14只欧亚领鸽和3只岩鸽的48份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本,进行PPMV-1病原检测和病理组织学研究。结果表明,PPMV-1在17只发病鸽子的多器官组织中均有分布,其中以肾脏、肝脏和脾脏组织阳性率最高,在欧亚领鸽和岩鸽3种脏器中病原阳性率分别为92.9%、92.9%、83.3%和66.7%、33.3%、66.7%。急性至亚急性间质性肾炎和坏死性胰腺炎是野鸽感染PPMV-1后最常见的组织学病变,在欧亚领鸽和岩鸽中样本阳性率分别为50.0%、66.7%和100%、100%;病原在宿主体内广泛分布,并造成多器官的组织学损伤,这些结果证明了PPMV-1对野鸽的潜在致病力和致死原因。为研发适用于FFPE和体液组织样本中PPMV-1诊断的NGS检测技术,对美国野鸽和中国广西养鸽场中PPMV-1流行毒株的遗传多样性进行监测,并为建立最新国际统一的NDV命名分类系统提供数据支持,本文采用第二代测序技术（Next Generation Sequencing,NGS）,对48份美国野鸽FFPE样本和18份广西肉鸽分离株尿囊液样本开展了PPMV-1的全基因组测序,同时比较NGS与和IHC、RT-PCR法的检测结果,研究NGS方法应用于部分核酸降解FFPE样本和体液组织样本的可行性。结果显示,NGS与IHC法阳性样本检测符合率为79.3%,与RT-PCR法的阳性样本检测符合率为100%;FFPE和尿囊液样本中分别测得2,624,877和60,883,067个NDV读数,分别获得美国源23株和中国源18株基因VI型NDV的全基因组序列,覆盖了99-100%的NDV表征。这些毒株的F融合蛋白的氨基酸裂解位点均具有113RKKR↓F117 NDV强毒株的特征。经遗传进化分析,23个美国野鸽FFPE样本中的NDV分类命名为VI.2.1.1.1亚型NDV,分别位于VI.2.1.1.1（VI＿a）和VI.2.1.1.1（VI＿n）两个分支上,遗传距离为4.2%,并且这两个亚型的NDV在遗传进化树上的分支位置与欧亚领鸽和岩鸽这两个野鸽物种在美国的地理分布是一致的。另外,18株广西肉鸽分离NDV分类命名为VI.2.1.1.2.1（VI＿k）和VI.2.1.1.2.2（VI＿j）两个亚型,遗传进化距离为5.3%,是在国内独立维持和持续进化了20多年的两个NDV亚型,与1980～2018年间在世界范围内引起疫情的其他型别的NDV有显着的不同。同时,这些NDV的宿主贮存库仍未知,病毒有可能同时在广西的鸽场和野鸟种群中流行。以上研究所获的41条NDV的F融合基因序列信息纳入了2019年国际统一NDV新分类命名系统的试点数据集和遗传进化树构建指南中。最后,为进一步解析PPMV-1的遗传多样性造成的对不同宿主的致病性和与现有疫苗之间的差异,本研究比较了广西肉鸽PPMV-1和NDV强毒株在鸡和鸽子体内的复制水平、病理组织学变化以及传播方式,并通过分析PPMV-1与Class II NDV疫苗的F融合基因和HN血凝素-神经氨酸酶基因之间抗原性、疏水性和氨基酸位点的变异特征来研究PPMV-1的病原学特性。结果显示,广西肉鸽PPMV-1分离株的平均致死时间MDT在62～114h之间;对1日龄SPF鸡的致病指数ICPI在0.00～0.63之间,说明均为中等或低毒力的NDV毒株。病毒感染鸽子后引起肾脏、胰脏和脑等组织损伤导致死亡;同时研究观察到,PPMV-1虽然引起鸡的脑、心脏、肾脏和肺等组织的部分细胞变性坏死,但不表现临床症状;鸽子和鸡分别感染PPMV-1后,前者体内的病毒滴度和阳性抗体水平均显着高于后者（P<0.01）。PPMV-1和La Sota的血清交叉抑制试验的R系数均小于0.8。另外,分离毒株与La Sota疫苗株相比,F和HN基因的部分氨基酸位点和抗原性、疏水性发生变异。这些结果表明,广西肉鸽PPMV-1分离株与La Sota疫苗株之间存在轻微的抗原差异,这可能是近年来养鸽场使用其他基因型NDV疫苗而得不到完全保护的原因。同时,病毒可在鸡体内复制分泌而不引起临床症状,也意味着PPMV-1的循环对家禽业构成潜在的威胁风险。综上所述,本研究建立了适用于FFPE组织和体液样本中PPMV-1的NGS检测诊断方法,并且采用该方法获得了美国野鸟和广西肉鸽来源的PPMV-1的全基因组测序,为最新国际NDV分类命名系统的建立提供了数据支持,同时本研究对PPMV-1的遗传多样性和病原学特性进行了分析,这些数据将有助于PPMV-1流行病学研究、疫苗开发以及对鸽子和家禽新城疫的有效防控。
二、禽流感病毒人工感染鸡抗体的监测及血凝素分型血清的制备（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、禽流感病毒人工感染鸡抗体的监测及血凝素分型血清的制备（论文提纲范文）
（2）H7N9亚型禽流感病毒检测方法的建立及标记疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 鉴别九种禽流感病毒神经氨酸酶基因的一步法多重探针组合rRT-PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 快速检测H7亚型禽流感病毒的免疫胶体金试纸条的研制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H7N9亚型禽流感病毒灭活标记疫苗的研制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 区分H7N9亚型禽流感标记疫苗免疫血清和野毒株感染血清的竞争抑制ELISA方法的建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献综述： 流感病毒及禽流感研究进展 |
| 一 流感病毒及其特性 |
| 二 流感病毒的分子生物学 |
| 三 流感病毒的分子进化 |
| 四 禽流感病毒的生态学 |
| 五 禽流感病毒的致病性分子基础 |
| 六 禽流感的诊断 |
| 七 禽流感疫苗 |
| 研究报告 |
| 实验一 RT—PCR快速诊断禽流感的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 H5和H7亚型禽流感病毒的分子分型技术研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 表达禽流感病毒HA和NA基因转移载体的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 禽流感病毒HA和NA基因在杆状病毒表达系统中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验五 重组亚单位疫苗对SPF鸡的免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（4）鸡的主要病毒性疫病抗体快速检测方法的建立和应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1 禽流感的研究进展 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.2.1 宿主范围 |
| 1.2.2 禽流感的流行病学特点 |
| 1.3 AIV凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白 |
| 1.4 禽流感检测方法的研究进展 |
| 1.4.1 病原学的诊断方法 |
| 1.4.2 血清学诊断方法 |
| 1.4.3 分子生物学诊断技术 |
| 2 新城疫的研究进展 |
| 2.1 病原 |
| 2.1.1 病原的分类 |
| 2.1.2 血清型 |
| 2.2 血凝素神经氨酸酶蛋白结构与功能 |
| 2.3 新城疫的传播与危害 |
| 2.4 新城疫检测方法的研究进展 |
| 2.4.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.4.2 清学诊断技术 |
| 2.4.3 分子生物学诊断技术 |
| 3 鸡传染性支气管炎的研究进展 |
| 3.1 病原 |
| 3.1.1 病原的分类 |
| 3.1.2 清型 |
| 3.2 IBV的N蛋白研究 |
| 3.3 流行病学 |
| 3.4 鸡传染性支气管炎检测方法 |
| 3.4.1 病毒的分离与鉴定 |
| 3.4.2 IBV血清学检测技术 |
| 3.4.3 分子生物学检测技术 |
| 4 鸡传染性法氏囊的研究进展 |
| 4.1 病原 |
| 4.1.1 病毒学分类、形态及理化特性 |
| 4.1.2 病毒培养特性 |
| 4.1.3 病毒血清型 |
| 4.1.4 IBDV的基因组结构和编码的蛋白 |
| 4.2 流行病学 |
| 4.2.1 自然宿主与传播媒介 |
| 4.2.2 流行特点 |
| 4.3 鸡传染性法氏囊检测方法的研究进展 |
| 4.3.1 病毒分离 |
| 4.3.2 清学方法 |
| 4.3.3 分子生物学方法 |
| 5 鸡毒霉形体的研究进展 |
| 5.1 病原 |
| 5.1.1 病原及发病特点 |
| 5.1.2 MG的基因组结构和结构蛋白的研究 |
| 5.2 流行病学 |
| 5.3 鸡毒霉形体的检测方法 |
| 5.3.1 病原的分离鉴定 |
| 5.3.2 清学方法 |
| 5.3.3 分子生物学方法 |
| 6 胶体金免疫层析技术的研究进展 |
| 6.1 胶体金的特性及其制备 |
| 6.1.1 胶体金的特性 |
| 6.1.2 胶体金的制备方法 |
| 6.2 免疫胶体金的制备及其应用 |
| 6.2.1 免疫胶体金的制备原理 |
| 6.2.2 免疫胶体金的应用 |
| 6.4 胶体金免疫层析技术的原理及其优势 |
| 6.4.1 胶体金免疫层析技术的原理 |
| 6.4.2 胶体金免疫层析技术的优势 |
| 6.5 胶体金免疫层析技术的研究趋势 |
| 6.5.1 提高胶体金免疫层析产品的性能 |
| 6.5.2 实现多元检测 |
| 6.5.3 实现半定量或定量测定 |
| 7 研究目的与意义 |
| 第2章 AIV-HA1 NDV-HN IBV-N IBDV-VP2 MG-V1hA1.2重组蛋白的表达与纯化 |
| 1 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株及试剂 |
| 2.1.2 相关溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 重组表达质粒的转化 |
| 2.2.3 诱导表达 |
| 2.2.4 包涵体的纯化与复性 |
| 2.2.5 蛋白浓度的测定 |
| 2.2.6 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.7 Western blot |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组菌诱导条件及目标蛋白纯化的SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.2 Western blot分析 |
| 3.3 纯化蛋白浓度测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 表达载体与表达菌的选择 |
| 4.2 诱导条件和纯化方法 |
| 4.3 对HN、N蛋白表达形式的分析 |
| 4.4 对HN、VP2、VlhA1.2蛋白表达量和表达状态的分析 |
| 5 结论 |
| 第3章 AIV、NDV、IBV、IBDV、MG血清抗体快速检测试纸条的研制 |
| 1 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 生物材料、化学试剂及其它 |
| 2.1.3 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.2.2 胶体金的制备 |
| 2.2.3 胶体金颗粒的鉴定 |
| 2.2.4 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记胶体金pH值的确定 |
| 2.2.5 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记量的确定 |
| 2.2.6 金标单抗复合物的制备与纯化 |
| 2.2.7 封闭液的选择 |
| 2.2.8 样品垫、金标垫的制备 |
| 2.2.9 质控线与检测线的包被 |
| 2.2.10 试纸条的组装及结果判定标准 |
| 2.2.11 样品稀释液与样品稀释倍数的确定 |
| 2.2.12 试纸条交叉反应试验 |
| 2.2.13 试纸条检测下限的确定 |
| 2.2.14 快速检测血清抗体试剂盒组装及初步应用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的纯化 |
| 3.2 胶体金的制备 |
| 3.3 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记胶体金pH值的确定 |
| 3.4 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记量的确定 |
| 3.5 金标单抗复合物的鉴定 |
| 3.6 封闭液的选择 |
| 3.7 检测线和质控线的包被条件 |
| 3.8 样品稀释液与样品稀释倍数的确定 |
| 3.9 试纸条交叉反应试验 |
| 3.10 试纸条检测下限的确定 |
| 3.11 试剂盒的重复性试验和保存期试验 |
| 3.12 几种试剂盒的临床应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 胶体金颗粒制备及鉴定 |
| 4.2 胶体金标记的单克隆抗体的制备 |
| 4.3 胶体金标记物抗鸡IgG Fc段单克隆抗体 |
| 4.4 封闭液的选择 |
| 4.5 检测线和质控线包被条件 |
| 4.6 样品稀释液与稀释倍数的确定 |
| 4.7 试纸条检测下限的确定 |
| 4.8 几种试剂盒的临床应用 |
| 5 结论 |
| 第4章 AIV、IBV、IBDV抗体快速联检试纸条的研制 |
| 1 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 生物材料、化学试剂及其它 |
| 2.1.3 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试纸条的构建 |
| 2.2.2 最佳反应条件的选择 |
| 2.2.3 试纸条的特异性试验 |
| 2.2.4 试纸条的敏感性试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 最佳反应条件的选择 |
| 3.2 试纸条的特异性试验 |
| 3.3 试纸条的敏感性试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 最佳反应条件的选择 |
| 5 结论 |
| 第5章 IBV抗体效价快速检测试纸条的研制 |
| 1 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 生物材料、化学试剂及其它 |
| 2.1.3 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试纸条的构建 |
| 2.2.2 最佳反应条件的选择 |
| 2.2.3 试纸条的特异性试验 |
| 2.2.4 试纸条的敏感性试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 最佳反应条件的选择 |
| 3.2 试纸条的特异性试验 |
| 3.3 试纸条的敏感性试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 最佳反应条件的选择 |
| 4.2 试纸条测定界限的选择 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的主要论文和专利申请 |
| 致谢 |
（5）辽宁省H9N2亚型禽流感分离株鉴定及抗原特性初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.1.1 禽流感病毒结构特点 |
| 1.2 禽流感病毒蛋白及功能 |
| 1.2.1 血凝素(HA) |
| 1.2.2 神经氨酸酶(NA) |
| 1.2.3 核蛋白(NP) |
| 1.2.4 基质蛋白(M) |
| 1.2.5 非结构蛋白(NS) |
| 1.2.6 聚合酶蛋白 |
| 1.3 流感病毒的变异 |
| 1.3.1 抗原漂移 |
| 1.3.2 抗原转变 |
| 1.4 禽流感在世界流行情况 |
| 1.5 检测方法 |
| 1.6 防治措施 |
| 1.7 疫苗的研究现状 |
| 1.8 H9N2 禽流感病毒传播途径 |
| 1.8.1 H9N2 禽流感病毒在野禽中的分布 |
| 1.8.2 H9N2 禽流感病毒在活禽市场的分布 |
| 1.9 研究目的与意义 |
| 第二章 H5、H7、H9亚型禽流感病毒分型检测方法建立及流行病学样品检测 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品的来源 |
| 2.1.2 SPF鸡胚 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 引物的设计与合成 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 H5、H7、H9 阳性质粒的扩增与检测 |
| 2.2.2 H5、H7、H9 分型引物检测11 份样品 |
| 2.3 11 株分离株全基因扩增 |
| 2.3.1 引物的合成与设计 |
| 2.3.2 病毒RNA的提取 |
| 2.3.3 RNA的反转录 |
| 2.3.4 分离株HA和 NA扩增 |
| 2.3.5 目的片段的纯化 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 分型引物检测电泳图 |
| 2.4.2 分型引物扩增电泳图 |
| 2.4.3 分离株HA和 NA琼脂电泳图 |
| 2.4.4 分离毒株命名 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 H5、H7和H9 亚型感染人事件 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 辽宁省H9N2亚型禽流感分离株的抗原特性初步分析 |
| 3.1 病毒 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 试剂配制 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 测定标准抗原效价 |
| 3.2.2 计算并配置8 倍抗原 |
| 3.2.3 血凝抑制试验(HI) |
| 3.2.4 HI抗体水平测定 |
| 3.2.5 PCR产物的克隆与序列分析 |
| 3.2.6 病毒的纯化与扩增 |
| 3.2.7 鸡胚半数感染量(EID50)测定 |
| 3.2.8 SPF雏鸡的感染 |
| 3.2.9 阳性血清制备 |
| 3.2.10 HI抗体水平测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 病毒EID_(50) 的测定 |
| 3.3.2 H9 标准血清抗体检测病毒抗原性 |
| 3.3.3 序列分析 |
| 3.3.4 二免血清检测病毒抗体效价 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 SPF雏鸡攻毒实验 |
| 3.4.2 HA对 AlV的毒力影响 |
| 3.4.3 NA对 AlV的毒力影响 |
| 3.4.4 分离株序列进化分析 |
| 3.4.5 H9 亚型禽流感分离株的基本生物学特性 |
| 3.4.6 疫苗的选择 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）不同源性禽流感病毒株的分离鉴定及其主要基因信息的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 禽流感病原学研究进展 |
| 1 禽流感的流行状况 |
| 1.1 禽流感的世界流行状况 |
| 1.2 禽流感的国内流行状况 |
| 1.3 禽流感流行病学特点 |
| 2 禽流感的危害 |
| 2.1 禽流感对养禽业的危害 |
| 2.2 禽流感对畜牧业的危害 |
| 2.3 禽流感病毒对野生哺乳动物的危害 |
| 2.4 禽流感病毒对人的危害 |
| 3 禽流感病原 |
| 3.1 禽流感概况 |
| 3.2 禽流感病毒结构 |
| 3.3 禽流感病毒的化学组成 |
| 3.4 禽流感病毒的抵抗力 |
| 3.5 禽流感病毒基因组、编码的蛋白质及其功能 |
| 4 禽流感病毒的复制 |
| 5 禽流感病毒的致病力 |
| 6 禽流感病毒的抗原性变异 |
| 7 禽流感病毒的传播 |
| 8 禽流感的主要临床症状和主要病理组织学变化 |
| 8.1 禽流感的主要临床症状 |
| 8.2 禽流感主要病理解剖学变化 |
| 8.3 禽流感病理组织学变化 |
| 9 水禽在禽流感中的作用 |
| 10 候鸟在禽流感中的作用 |
| 11 禽流感诊断进展 |
| 12 禽流感病毒疫苗的研制 |
| 12.1 灭活疫苗 |
| 12.2 基因工程疫苗 |
| 综述二 禽流感病毒基因组、编码蛋白、功能及分子致病性研究进展 |
| 1 禽流感病毒基因组 |
| 2 病毒的主要蛋白及功能 |
| 2.1 血凝素 |
| 2.2 神经氨酸酶 |
| 2.3 核蛋白 |
| 2.4 基质蛋白 |
| 2.5 非结构蛋白 |
| 2.6 聚合酶 |
| 3 禽流感病毒的抗原性变异及其进化 |
| 3.1 抗原漂移 |
| 3.2 抗原转变 |
| 3.3 缺损干扰颗粒和RNA重组 |
| 3.4 禽流感病毒的进化 |
| 4 禽流感病毒致病性的分子基础 |
| 4.1 HA与细胞表面特异性病毒受体的结合是导致病毒感染的先决条件 |
| 4.2 宿主细胞蛋白酶种类及活性对HA裂解性具有重要影响 |
| 4.3 禽流感病毒毒力高低与HA裂解位点氨基酸的性质及组成序列有关 |
| 4.4 裂解位点插入细胞的多肽序列会使病毒对裂解的敏感性增加 |
| 4.5 裂解位点附近的糖链对HA的裂解有影响 |
| 4.6 NA对禽流感病毒的致病性有一定影响 |
| 4.7 NS基因对毒力的影响 |
| 4.8 NP对禽流感病毒复制及感染能力的影响 |
| 综述三 禽流感及其公共卫生意义 |
| 1 人禽流感流行病学现状 |
| 2 决定宿主特异性的因素 |
| 2.1 HA的细胞受体结合位点 |
| 2.2 HA上的受体结合位点与宿主细胞的HA受体的关系 |
| 2.3 NA的氨基酸组成及其糖基化对流感病毒宿主特异性的影响 |
| 2.4 NP对禽流感病毒的宿主特异性的影响 |
| 2.5 其他基因对流感病毒宿主特异性的影响 |
| 3 禽流感病毒跨种属感染人的机制 |
| 4 禽流感病毒对人呼吸道的感染机制 |
| 4.1 禽流感病毒基因高变异率是决定其对人致病的主要因素 |
| 4.2 禽流感病毒通过进化具备侵入人体并在人体内有效复制的能力 |
| 5 从人流感的起源看禽流感与人流感的关系 |
| 6 禽流感与公共卫生意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 实验一 不同原性禽流感病毒株的分离鉴定与生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离结果 |
| 2.2 血清学鉴定结果 |
| 2.3 血凝素亚型鉴定结果 |
| 2.4 荧光RT-PCR检测结果 |
| 2.5 电镜观察结果 |
| 2.6 血凝素热稳定性实验结果 |
| 2.7 化学特性实验结果 |
| 2.8 EID_(50)的测定结果 |
| 2.9 鸡静脉指数(IVPI)实验结果 |
| 2.10 鸡脑内致病指数(ICPI)实验结果 |
| 2.11 致病性实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 不同原性禽流感病毒株血凝素基因和神经氨酸酶基因的扩增、克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR结果 |
| 2.2 重组质粒的PCR鉴定结果 |
| 2.3 重组质粒的限制性内切鉴定结果 |
| 2.4 17株不同亚型禽流感病毒毒株HA基因、NA基因的核苷酸和氨基酸序列测定与特征性分析 |
| 2.5 AI病毒分离株HA基因和NA基因的比较分析及其遗传演化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 两株鹅源和1株鸽源H5N1亚型AIV分离株全基因克隆及序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增结果 |
| 2.2 PCR产物纯化、克隆及PCR鉴定结果 |
| 2.3 测序结果与基因序列同源性分析 |
| 2.4 8个基因的遗传进化分析结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验四 试验鸡感染鹅源H5N1亚型禽流感病毒后排毒规律以及鸡体内病毒抗原定位动态的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 试验组的临床症状 |
| 2.2 ELD_(50)和LD_(50)的测定结果 |
| 2.3 病毒分离结果 |
| 2.4 病毒鉴定结果 |
| 2.5 荧光RT-PCR检测结果 |
| 2.6 免疫荧光检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）流感病毒多亚型检测方法的研制和应用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 禽流感与禽流感病毒研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 AI的流行及危害 |
| 1.3 AIV概述 |
| 1.4 AIV的生物学特性 |
| 1.5 AI的临床表现与病理变化 |
| 1.6 AI的流行病学 |
| 1.7 AIV的致病性及毒力 |
| 1.8 AIV的分子生物学特性 |
| 1.9 AIV的免疫性 |
| 1.10 AI的防治 |
| 第2章 禽流感病毒检测技术及方法的研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 主要检测方法及研究进展 |
| 2.3 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 流感病毒H3、H5、H7、H9亚型分型RT-PCR检测方法的建立 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 流感病毒H3、H5、H7、H9亚型血凝素基因在pBV220中的表达及产物分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 流感病毒H3、H5、H7、H9亚型一步法分型RT-PCR检测试剂盒的组装及应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 流感病毒H3亚型血凝素基因单克隆抗体的制备及纯化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 流感病毒H3、H7亚型ELISA诊断试剂盒的组装 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 后记和致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
（8）华东地区H9N2亚型禽流感病毒抗原性分析及疫苗候选株免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 1. H9N2亚型禽流感流行情况 |
| 2. 流感病毒抗原变异研究 |
| 3. 表面蛋白HA |
| 3.1 HA蛋白结构 |
| 3.2 HA蛋白功能 |
| 4. 禽流感疫苗现状 |
| 5. 研究目的及意义 |
| 第1章 H9N2亚型禽流感病毒抗原性分析 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 病毒、血清与细胞 |
| 1.2 SPF鸡胚 |
| 1.3 SPF鸡红细胞 |
| 1.4 主要试剂及试剂配制 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 血凝实验(Hemagglutinination, HA) |
| 2.2 血凝抑制试验(Hemagglutinin Inhibition, HI) |
| 2.3 毒株的纯化 |
| 2.4 病毒增殖 |
| 2.5 H9N2毒株鸡多抗血清制备 |
| 2.6 微量中和实验(Microneutralization assays) |
| 2.7 抗原图谱(Antigenic cartography) |
| 2.8 基因序列比对 |
| 3. 结果 |
| 3.1 H9N2毒株鸡多抗血清制备 |
| 3.2 系统进化树绘制 |
| 3.3 交叉血凝抑制实验 |
| 3.4 抗原图谱 |
| 3.5 关键氨基酸位点分析 |
| 3.6 中和实验 |
| 4. 讨论 |
| 第2章 H9N2亚型禽流感疫苗候选株的免疫效力评价 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 SPF鸡胚 |
| 1.4 SPF鸡红细胞 |
| 1.5 实验试剂 |
| 1.6 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 鸡胚半数感染量(Egg infectious dose, EID_(50))测定 |
| 2.2 交叉免疫保护试验 |
| 2.3 基因组测序 |
| 3. 结果 |
| 3.1 鸡胚半数感染量(Egg infectious dose, EID_(50))测定结果 |
| 3.2 SPF鸡免疫后抗体水平测定 |
| 3.3 排毒测定 |
| 3.4 免疫逃避株序列分析 |
| 4. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）禽流感与新城疫胶体金免疫层析快速检测技术及初步应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(ABBREVIATION) |
| 第1章 文献综述 |
| 1 禽流感研究进展 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.2.1 宿主范围 |
| 1.2.2 病毒的传播 |
| 1.2.3 流行及危害 |
| 1.3 禽流感检测方法研究进展 |
| 1.3.1 病原学检测 |
| 1.3.2 血清学检测 |
| 1.3.3 分子生物学诊断技术 |
| 2 新城疫研究进展 |
| 2.1 新城疫病毒(NDV) |
| 2.2 新城疫的传播与危害 |
| 2.3 新城疫检测方法 |
| 2.3.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.3.2 凝(HA)和血凝抑制(HI)试验 |
| 2.3.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.3.4 分子生物学诊断方法 |
| 3.胶体金免疫层析技术 |
| 3.1 胶体金的特性及其制备 |
| 3.1.1 胶体金的特性 |
| 3.1.2 胶体金的制备 |
| 3.2 免疫胶体金的制备及其应用 |
| 3.2.1 免疫胶体金的制备 |
| 3.2.2 免疫胶体金的应用 |
| 3.3 胶体金免疫层析试纸条的构成 |
| 3.4 胶体金免疫层析技术的原理及其优势 |
| 3.4.1 胶体金免疫层析技术的原理 |
| 3.4.2 胶体金免疫层析技术的优势 |
| 3.5 胶体金免疫层析技术的应用 |
| 3.5.1 病原体抗原或抗体的检测 |
| 3.5.2 激素或疾病相关蛋白的检测 |
| 3.5.3 药物残留及毒品的检测 |
| 3.5.4 寄生虫抗原抗体的检测 |
| 第2章 鸡抗AIV、鸡抗NDV和山羊抗鼠多克隆抗体的制备及纯化 |
| 1 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 标准抗原和抗体 |
| 2.1.3 健康Balb/c小鼠腹水IgG |
| 2.1.4 SPF鸡胚及实验动物 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的增殖与纯化 |
| 2.2.2 免疫原的乳化 |
| 2.2.3 动物免疫 |
| 2.2.4 鸡抗AIVIgG、鸡抗NDVIgG、羊抗鼠IgG的提取及纯化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒的增殖与纯化(浓缩) |
| 3.1.1 AIV的增殖与纯化(浓缩) |
| 3.1.2 NDV的增殖与纯化(浓缩) |
| 3.2 免疫血清IGG的提取及纯化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 抗原 |
| 4.2 免疫程序 |
| 5 结论 |
| 第3章 单克隆抗体的制备与纯化 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、抗原 |
| 2.1.2 细胞、实验动物 |
| 2.1.3 试剂和培养基 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2 SP2/0骨髓瘤细胞的活化 |
| 2.2.3 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.4 单克隆抗体的鉴定 |
| 2.2.5 单克隆抗体的纯化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 细胞融合 |
| 3.2 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.1 AIVGST-NP免疫脾细胞与瘤细胞融合后的筛选 |
| 3.2.2 NDV免疫脾细胞与瘤细胞融合后的筛选 |
| 3.3 单克隆抗体效价测定及特异性鉴定 |
| 3.3.1 AIV-NP单克隆抗体效价测定及特异性鉴定 |
| 3.3.2 NDV-HN单克隆抗体效价测定及特异性鉴定 |
| 3.4 单克隆抗体的亚类鉴定 |
| 3.5 杂交瘤细胞染色体数的检测 |
| 3.6 禽流感H55E8、H94C4单克隆细胞株的复苏、生产与效价测定 |
| 3.7 单克隆抗体的纯化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 动物免疫 |
| 4.2 细胞融合 |
| 4.3 杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.4 杂交瘤细胞的克隆 |
| 4.5 关于饲养细胞 |
| 4.6 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 4.7 单克隆抗体的纯化 |
| 5 结论 |
| 第4章 胶体金及金标抗体的制备 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 抗体及化学试剂 |
| 2.1.3 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 胶体金的制备 |
| 2.2.2 胶体金的鉴定 |
| 2.2.3 禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体(H94C4)的标记条件 |
| 2.2.4 禽流感病毒核蛋白、H5亚型血凝素及新城疫病毒血凝素神经氨酸酶单克隆抗体的标记条件 |
| 2.2.5 金标单抗复合物的制备与纯化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 胶体金的制备 |
| 3.2 禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体(H94C4)的标记条件 |
| 3.2.1 最适标记胶体金pH值 |
| 3.2.2 最适标记量 |
| 3.3 单克隆抗体H55E8、AIV-NP单克隆抗体及NDV血凝素神经氨酸酶单克隆抗体的标记条件 |
| 3.4 金标单抗复合物的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 胶体金的制备 |
| 4.1.1 胶体金制备方法 |
| 4.1.2 胶体金制备的条件 |
| 4.1.3 胶体金的质量鉴定 |
| 4.2 标记用蛋白的准备 |
| 4.3 胶体金的标记 |
| 4.3.1 最佳标记pH值 |
| 4.3.2 最适蛋白标记量 |
| 4.4 免疫胶体金的保存 |
| 5 结论 |
| 第5章 H5、H9亚型禽流感病毒免疫层析快速检测及鉴别诊断试纸条的研制 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、抗原、抗体 |
| 2.1.2 层析材料、仪器 |
| 2.1.3 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 H9亚型禽流感病毒免疫层析快速检测试纸条的建立 |
| 2.2.2 H5亚型禽流感病毒免疫层析快速检测试纸条的建立 |
| 2.2.3 H5、H9亚型禽流感病毒鉴别诊断试纸条的建立 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 H9亚型AIV免疫层析快速检测试纸条的研制 |
| 3.1.1 最适反应条件的确定 |
| 3.1.2 试纸条特异性试验 |
| 3.1.3 试纸条敏感性试验 |
| 3.1.4 试纸条稳定性试验 |
| 3.2 H5亚型AIV免疫层析快速检测试纸条的研制 |
| 3.2.1 各种生物材料最佳浓度的选择 |
| 3.2.2 试纸条的特异性实验 |
| 3.2.3 试纸条敏感性试验 |
| 3.3 H5、H9亚型AIV鉴别诊断试纸条的研制 |
| 3.3.1 各种生物材料最佳浓度的选择 |
| 3.3.2 试纸条的特异性实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 最适反应条件的确定 |
| 4.1.1 硝酸纤维素(NC)膜的选择 |
| 4.1.2 抗体包被液的选择 |
| 4.1.3 封闭液的选择 |
| 4.1.4 反应体系的确定 |
| 4.2 关于鉴别诊断 |
| 5 结论 |
| 第6章 禽流感和新城疫病毒免疫层析快速检测及鉴别诊断试纸条的研制 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、抗原、抗体及层析材料 |
| 2.1.2 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫层析快速检测试纸条的构建 |
| 2.2.2 各种生物材料最佳浓度的选择 |
| 2.2.3 试纸条的特异性实验 |
| 2.2.4 试纸条的敏感性实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 各种生物材料最佳浓度的选择 |
| 3.1.1 AIV快速检测试纸条最佳生物材料浓度的选择 |
| 3.1.2 NDV快速检测试纸条最佳生物材料浓度的选择 |
| 3.1.3 AIV和NDV快速鉴别诊断试纸条最佳生物材料浓度的选择 |
| 3.2 试纸条的特异性实验 |
| 3.2.1 AIV快速检测试纸条的特异性实验 |
| 3.2.2 NDV快速检测试纸条的特异性实验 |
| 3.2.3 AIV和NDV快速鉴别诊断试纸条的特异性实验 |
| 3.3 试纸条的敏感性实验 |
| 3.3.1 AIV快速检测试纸条的敏感性实验 |
| 3.3.2 NDV快速检测试纸条的敏感性实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 金标结合垫的制备 |
| 4.2 鉴别诊断试纸条的构建 |
| 5 结论 |
| 第7章 禽流感病毒通用型及H9亚型快速检测试剂盒的研制与应用 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 快速检测试剂盒的组成 |
| 2.2.2 快速检测试剂盒的使用方法 |
| 2.2.3 试剂盒的保存期、特异性、重复性和敏感性试验 |
| 2.2.4 快速检测试剂盒的应用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 试剂盒的特异性和敏感性试验 |
| 3.2 试剂盒的保存期试验 |
| 3.3 试剂盒的重复性试验 |
| 3.4 试剂盒的样品检测结果 |
| 3.4.1 动物实验样品检测结果 |
| 3.4.2 临床样品检测结果 |
| 3.4.3 检测样品病毒分离验证结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 试剂盒的特性 |
| 4.2 关于亚型鉴定 |
| 4.3 检测样品范围 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的主要论文 |
| 致谢 |
（10）鸽Ⅰ型副粘病毒的全基因组测序及病原学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩写词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽副粘病毒和新城疫病毒简介 |
| 1.2 NDV的分类命名 |
| 1.2.1 基于毒力和宿主病理特征的NDV分类 |
| 1.2.2 基于基因组序列的早期NDV命名分类系统 |
| 1.2.3 基于基因组序列最新的NDV命名分类系统 |
| 1.3 NDV的检测诊断方法 |
| 1.3.1 NDV的临床诊断 |
| 1.3.2 基于病毒生物学特性的早期检测诊断方法 |
| 1.3.3 传统的分子生物学检测诊断方法 |
| 1.3.4 基于第二代基因组测序技术的检测诊断方法 |
| 1.4 鸽I型副粘病毒(PPMV-1) |
| 1.5 NDV疫苗 |
| 1.5.1 NDV活疫苗 |
| 1.5.2 NDV灭活苗 |
| 1.5.3 NDV重组疫苗 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 感染PPMV-1野鸽的IHC病理诊断分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 野鸽FFPE组织样本来源 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 野鸽FFPE组织样本的制备 |
| 2.2.2 IHC法检测PPMV-1抗原和判定标准 |
| 2.2.3 RT-PCR方法复核检测野鸽FFPE组织样本中的PPMV-1抗原 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PPMV-1感染野鸽的体内各组织中病原分布情况 |
| 2.3.2 PPMV-1感染野鸽的病理组织学变化结果 |
| 2.3.3 PPMV-1感染野鸽的病理组织学变化和组织器官病原阳性率统计结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 基于NSG的 PPMV-1全基因组测序及遗传多样性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 野鸽PPMV-1的FFPE组织样本 |
| 3.1.2 肉鸽PPMV-1尿囊液样本 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.5 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 野鸽PPMV-1 FFPE样本的IHC诊断检测 |
| 3.2.2 肉鸽PPMV-1尿囊液样本的RT-PCR检测 |
| 3.2.3 FFPE蜡块组织中总RNA的抽提 |
| 3.2.4 尿囊液中总RNA的抽提 |
| 3.2.5 RNA质量分析 |
| 3.2.6 DNA文库的建立和质量分析 |
| 3.2.7 DNA文库的测序上样 |
| 3.2.8 NGS测序及数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 野鸽FFPE组织样本中PPMV-1的IHC检测结果 |
| 3.3.2 肉鸽分离株尿囊液样本中PPMV-1的RT-PCR检测结果 |
| 3.3.3 样本总RNA抽提及构建DNA文库的质量分析 |
| 3.3.4 不同方法对FFPE和尿囊液组织样本中PPMV-1的检测结果与比较 |
| 3.3.5 美国野鸽FFPE样本PPMV-1的遗传多样性分析结果 |
| 3.3.6 中国广西肉鸽PPMV-1分离株的遗传多样性分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 美国野鸽PPMV-1流行株的遗传进化分析 |
| 3.4.2 NGS和 IHC应用于FFPE样本中NDV病原的检测 |
| 3.4.3 中国广西鸽场PPMV-1流行株的遗传进化分析 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 广西肉鸽PPMV-1分离毒株的病原学特性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 标准毒株和疫苗株 |
| 4.1.2 细胞和鸡胚 |
| 4.1.3 实验动物和地点 |
| 4.1.4 HA和HI抗原和阳性血清 |
| 4.1.5 试剂 |
| 4.1.6 仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PPMV-1病毒的分离和鉴定 |
| 4.2.2 PPMV-1 平均鸡胚致死时间 MDT 的测定 |
| 4.2.3 PPMV-1 雏鸡脑内致病指数 ICPI 的测定 |
| 4.2.4 PPMV-1 分离株与La Sota疫苗株的血清交叉中和抑制实验 |
| 4.2.5 NDV攻毒试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 广西肉鸽PPMV-1分离株的噬斑纯化结果 |
| 4.3.2 广西肉鸽PPMV-1分离株的毒力判定 |
| 4.3.3 PPMV-1分离株和La Sota疫苗株的血清交叉中和抑制实验结果 |
| 4.3.4 PPMV-1对不同宿主的致病性研究 |
| 4.3.5 PPMV-1在不同宿主体内的复制水平和传播方式研究 |
| 4.3.6 F基因和HN基因的变异对PPMV-1致病性的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 PPMV-1的致病机理和传播方式研究 |
| 4.4.2 广西肉鸽PPMV-1分离株的致病性分析 |
| 4.4.3 广西肉鸽PPMV-1分离株的抗原性和疏水性分析 |
| 4.5 结论 |
| 4.6 下一步工作计划及展望 |
| 全文总结 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
四、禽流感病毒人工感染鸡抗体的监测及血凝素分型血清的制备（论文参考文献）
- [1]禽流感病毒人工感染鸡抗体的监测及血凝素分型血清的制备[J]. 田国斌,唐秀英,于康震. 中国畜禽传染病, 1998(01)
- [2]H7N9亚型禽流感病毒检测方法的建立及标记疫苗的研制[D]. 孙志豪. 扬州大学, 2018(05)
- [3]H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究[D]. 刘明. 中国农业科学院, 2000(01)
- [4]鸡的主要病毒性疫病抗体快速检测方法的建立和应用研究[D]. 张进良. 华中农业大学, 2010(05)
- [5]辽宁省H9N2亚型禽流感分离株鉴定及抗原特性初步分析[D]. 王诗盈. 沈阳农业大学, 2019(02)
- [6]不同源性禽流感病毒株的分离鉴定及其主要基因信息的研究[D]. 王伟利. 吉林农业大学, 2006(01)
- [7]流感病毒多亚型检测方法的研制和应用[D]. 徐一鸣. 吉林大学, 2009(08)
- [8]华东地区H9N2亚型禽流感病毒抗原性分析及疫苗候选株免疫效力评价[D]. 马静. 扬州大学, 2020(01)
- [9]禽流感与新城疫胶体金免疫层析快速检测技术及初步应用研究[D]. 彭伏虎. 华中农业大学, 2008(01)
- [10]鸽Ⅰ型副粘病毒的全基因组测序及病原学特性分析[D]. 何颖. 广西大学, 2020(02)