一、中草药在免疫治疗中的作用（论文文献综述）
张曦文[1]（2020）在《肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究》文中认为肺癌是临床最常见的肿瘤,患病率和死亡率居所有恶性肿瘤的首位。肺癌的主要治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,能够有效激活T淋巴细胞免疫,是肿瘤免疫治疗中的调控关键。在肿瘤微环境中,肿瘤相关树突状细胞（Tumor-associated dendritic cells,TDCs）中脂质过氧化激活内质网应激,引起未折叠蛋白反（Unfolded Protein Response,UPR）,激活下游 IRE1α-XBP1 通路,产生的剪切型XBP1-s通过靶向多个脂质合成基因,诱导TDCs内脂质的异常积累,表现出未成熟表型和功能障碍,抑制了抗肿瘤免疫。有研究表明,PI3K-AKT-mTOR信号途径在脂质代谢中起重要调控作用,能够通过调节脂肪合成相关基因的表达来调控脂质合成,XBP1过表达会导致PI3K/mTOR表达的上调,敲除XBP1后,PI3K/mTOR表达下调,还有研究表明,抑制mTOR2可以下调脂质的生成。“脂浊”既为病理产物也是致病因素,多归属于中医学“痰浊”的病理范畴。肺瘤平膏是由“全国名中医”朴炳奎教授研制的临床治疗肺癌具有确切疗效的中药复方,具有益气养阴、化痰散结、解毒活血的功效,可通过多作用靶点发挥抗肿瘤作用。前期研究表明,肺瘤平膏（FLP）能够明显提高DCs功能,通过调节DCs的抗原递呈功能发挥抗肿瘤效应,并且在调控PI3K/mTOR通路方面具有一定优势。作为肺瘤平膏中化痰类代表药物桔梗的主要有效组分,研究表明,桔梗皂苷D（PlatycodinD,PD）具有明确的抗肿瘤、免疫调节、降脂和抗氧化等功能,并且具有抑制ROS聚集、调节PI3K/mTOR信号的作用。因此,我们推测PD可能是FLP调控脂质代谢逆转TDCs功能的有效组分之一,可能通过抑制TDCs脂质异常堆积逆转TDCs功能,并希望对其效应机制进行初探。目的:（1）构建TDCs共培养体系,探究肺瘤平膏在毒胡萝卜素（TG）诱导ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及作用机制。（2）初探PD对TDCs的免疫调节功能,及探究TG激活ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及可能的效应机制。方法:（1）小鼠骨髓源树突状细胞的分离、培养,建立体外肿瘤相关树突状细胞共培养模型。（2）模拟肿瘤微环境,通过FLP含药血清干预TDCs模型后,流式细胞术观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达;通过混合淋巴细胞反应,CCK8检测混合淋巴细胞增殖、流式检测T淋巴细胞亚群活化,Luminex技术检测TDCs细胞因子分泌。（3）毒胡萝卜素干预TDCs模型,观察TG激活ERS,对IRE1α-XBP1通路的影响,及对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（4）FLP含药血清,作用TG干预后的ERS激活后的TDCs模型,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（5）通过 Western blot、qPCR 技术,检测 FLP 含药血清对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。（6）通过LDH、CCK8检测技术,观察PD对DCs毒性和Lewis肺癌细胞的杀伤能力。（7）模拟肿瘤微环境,通过PD干预TDCs模型后,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（8）通过构建TG激活ERS后的TDCs模型,观察PD对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（9）通过 Western blot、qPCR 技术,检测 PD 对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。结果:（1）流式检测诱导后DCs表面分子CD1 1c+阳性表达比例为76.5%,并与肺癌细胞培养上清共培养,冻融抗原刺激,构建TDCs共培养模型。（2）在模拟的肿瘤微环境中,FLP含药血清干预后,降低TDCs胞内脂质含量（P<0.01）,提高TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86的表达最为明显（P<0.05）,FLP刺激共培养淋巴细胞增殖（P<0.05）,明显提高T细胞中Th、CTL细胞亚群比例（P<0.05）,降低Tregs细胞的表达（P<0.05）,提高细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌（P<0.05）。（3）TG作用后,在TDCs培养模型中,BiP-IRE1α-XBP1（t/u/s）通路mRNA、蛋白表达增加（P<0.05）,脂质含量较模型组增加（P<0.05）,影响TDCs表面分子的表达,MCH-Ⅱ、CD80、CD86的表达均明显降低（P<0.05）;抑制混合淋巴细胞的增殖能力（P<0.05）,降低Th、CTL细胞亚群的表达（P<0.05）,提高Tregs亚群的表达（P<0.05）,同时抑制细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌（P<0.05）。（4）FLP含药血清作用于TG干预后的TDCs,脂质含量明显下降（P<0.05）,恢复TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86表达水平较为明显（P<0.05）,提高TG干预后的混合淋巴细胞增殖能力（P<0.05）,提高Th、CTL细胞亚群比例（P<0.05）、降低Tregs细胞的亚群表达（P<0.05）,促进TG作用后 TDCs 细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌（P<0.05）。（5）qPCR、Western blot 结果显示,对于 TG 激活 ERS 后,BiP-IRE1 α-XBP 1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白表达量增加（P<0.05）;FLP含药血清干预TG作用后的TDCs,FLP+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1通路mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,对重要脂质调节转录因子XBP1-s,具有降低其mRNA和蛋白表达的作用;同时,肺瘤平膏含药血清作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,并且明显降低AKT蛋白的磷酸化水平。（6）LDH结果显示,30uM以下的PD浓度,对DCs无明显损伤,或影响DCs细胞LDH的释放;CCK-8实验结果显示,PD能够有效杀伤Lewis肺癌细胞,其IC50值在13uM左右。（7）在TDCs共培养体系中,PD高中低浓度均能够有效降低TDCs中的脂质含量（P<0.01）,提高TDCs表面MCH-Ⅱ的表达（P<0.05）,提高CD80（PDH、PDM,P<0.05）、CD86（PDM、PDL,P<0.05）的表达;PDH较强混合淋巴细胞的增殖（P<0.05）;PD高中低组均能提高Th、CTL细胞的亚群表达率（P<0.05）,抑制 Tregs 亚群表达（PDH,P<0.05）;提高 IL-12p70（PDH、PDM,P<0.05）IFN-γ（PDH,P<0.05）细胞因子的分泌。（8）TG干预诱导RES后,PD高、中、低剂量组均能降低TG干预后TDCs中脂质含量（P<0.01）;PDH能够提高表面MCH-Ⅱ的表达（P<0.05）,各剂量组均能提高CD80及CD86的表达（P<0.05）,PDH具有提高淋巴混合细胞的增殖能力（P<0.05）,PDH、PDM能够明显提高Th、CTL细胞亚群的表达（P<0.05）,PD各剂量组均能降低Tregs细胞亚群的表达（P<0.05）,并能促进 TDCs 分泌 IL-12p70（PDH,P<0.05）、IFN-γ（PDH、PDM,P<0.05）细胞因子。（9）qPCR、Western blot结果显示,TG激活ERS后,PD+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1（t/u/s）通路mRNA和蛋白的表达（P<0.01）,同时,PD+TG组作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,其中降低p-AKT磷酸化蛋白表达（P<0.05）水平作用较为明显。结论:基于本实验条件下,我们推测:（1）TG诱导ERS,激活IRE1α-XBP1通路,产生XBP1-s剪切形式,可造成TDCs脂质异常堆积和TDCs的功能障碍。（2）FLP含药血清能够逆转TG激活ERS诱导XBP1剪切造成的TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能障碍。（3）PD可能是FLP发挥改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的有效组分之一。（4）FLP含药血清及其有效组分PD调节改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的作用机制可能是通过调控BiP-IRE1α-XBP1 和 PI3K-AKT-mTOR 通路实现的。
郭坤彬[2]（2019）在《EGFR-TKIs及血根碱在NSCLC中调节MHC-Ⅰ的作用与机制研究》文中研究指明目的:肺癌是我国当前发病率最高的肿瘤,在我国肺癌患者中大约86%为非小细胞肺癌（NSCLC）。驱动基因突变理论和靶向药物的成功研制为非小细胞肺癌治疗提出了精准医疗的新概念。作为我国非小细胞肺癌患者的主要驱动基因突变类型,表皮生长因子受体（EGFR）突变占我国非小细胞肺癌患者的28%（2015年统计数据）。靶向表皮生长因子的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitors,TKIs）是当前携带EGFR突变NSCLC患者的首选治疗药物,但由于TKIs的耐药进展,目前上市的三代TKIs均已出现耐药患者,EGFR-TKIs靶向治疗并未根本的解决EGFR突变的NSCLC的长期生存率。近年来,免疫检查点抗体药物的出现为晚期肿瘤治疗带来曙光,其中程序性死亡蛋白-1及其配体（PD-1/PD-L1）抗体药物在某些种类的肿瘤治疗上取得了里程碑式的重大突破,使这些肿瘤的长期生存率显着升高。但是多项临床研究表明EGFR突变的NSCLC患者对PD-1/PD-L1抗体药物治疗不敏感,反应率极低,这制约了 PD-1/PD-L1抗体药物在EGFR突变的NSCLC患者中的应用。有文献报道在一些EGFR突变的瘤肿中MHC-Ⅰ分子出现下调,并与EGFR突变呈相关性,这可以部分解释EGFR突变NSCLC患者对PD-1/PD-L1抗体不敏感。本课题从临床标本和体外实验中发现EGFR突变激活对MHC-Ⅰ膜表达及抗原提呈系统的影响,而且应用相应的抑制剂可以逆转这些影响。由于TKIs联合PD-1/PD-L1抗体药物的几个临床实验均因严重不良反应而中止,我们的发现或许可以为PD-1/PD-L1抗体药物与EGFR下游的AKT/mTOR通路抑制剂联合用药提高免疫治疗疗效的理论依据,继而探讨联合用药可行性。血根碱（Sanguinarine）是来源于罂粟科紫堇、白屈菜等的中药单体化合物。紫堇与白屈菜全草皆有解毒、止痒之功效,提示他们所含成分可能影响免疫功能。近年来有文献报道血根碱在多种瘤肿细胞株和动物模型中有抗肿瘤作用[1-5],但其抗肿瘤作用机制尚未十分明确。本课题通过计算机分子模拟,免疫学和分子生物学实验证明血根碱可以通过抑制原癌基因EGFR和AKT的活化,继而影响MHC-Ⅰ分子表达,提示其可能提升肺癌免疫治疗疗效。方法:一、选取EGFR突变的病人标本34例,EGFR野生型病人标本20例,进行对CD8和HLA-ABC的免疫组织化学染色。免疫组织化学染色方法如正文所述,染色后,由两名病理医师进行评分结合计算机软件（ImageJ,Image-Pro Plus）计算灰度密度,得出最后评分。二、通过在正常人肺上皮细胞系Beas-2B中转入EGFR突变质粒,构建稳定表达的细胞系,进行蛋白免疫印迹实验（Western Blot）、流式细胞术、免疫荧光等实验方法检测EGFR激活对MHC-Ⅰ、PD-L1相对表达量和膜表达量;在NSCLC细胞系中进行WB、流式细胞术、qRT-PCR等实验方法检测EGFR-TKIs（阿法替尼,奥希替尼）抑制EGFR对肿瘤细胞系MHC-Ⅰ分子胞膜表达及抗原生产和提呈系统的影响。三、通过在NSCLC细胞系中应用EGFR下游信号通路AKT/mTOR抑制剂,运用蛋白免疫印迹实验、流式细胞术、qRT-PCR等实验方法检测下游信号通路抑制剂对MHC-Ⅰ膜表达及抗原生产和提呈系统的影响,进而解释TKI对MHC-Ⅰ胞膜表达及抗原生产和提呈系统影响的机制。四、通过计算机分子模拟,免疫学和分子生物学实验方法验证血根碱对EGFR、AKT磷酸化活化的影响,验证其对MHC-I分子表达和膜转位的影响。结果:一、组织标本免疫组织化学染色结果:CD8染色,统计显示EGFR野生型组与突变组组织浸润的CD8+T淋巴细胞数量未见统计差异;HLA-ABC染色,结果显示EGFR野生型组与突变组的HLA-ABC在抗体染色灰度上未见统计学差异。通过对组织标本的观察,EGFR野生型组与突变组相比,HLA-ABC膜表达明显增加,且差异有统计学意义（P<0.05）。二、将突变的EGFR转入突变的EGFR正常肺上皮细胞系中,相对转入空载体的 Beas-2B-Vector,Beas-2B-CAG-EGFR-19DEL 细胞膜表面 MHC-Ⅰ 减少,PD-L增加,且差异有统计学意义（P<0.05）;在NSCLC细胞系中,应用EGFR-TKIs的细胞相对控制组,细胞膜表面MHC-Ⅰ增加,且差异有统计学意义（P<0.05）。EGFR-TKIs增加了 NSCLC细胞系抗原产生过程中所需的蛋白酶体核心酶蛋白PSMB8/9和抗原肽转运进内质网的蛋白转运体（TAP2）的表达水平。三、NSCLC细胞系应用EGFR下游信号通路中AKT/mTOR信号通路抑制剂后,与控制组相比,细胞膜表面MHC-Ⅰ增加,且差异有统计学意义（P<0.05）。其增加胞膜MHC-Ⅰ的作用在同时应用PSMB8/9抑制剂时解除,且差异有统计学意义（P<0.05）。NSCLC细胞系应用AKT/mTOR抑制剂后,增加了抗原产生过程中所需的蛋白酶体核心酶蛋白PSMB8/9和抗原肽转运进内质网的蛋白转运体（TAP2）的表达水平。四、分子模拟结果表明血根碱对突变的EGFR有较高的亲和力,同时其对AKT的亲和力也比较高,通过与两个原癌基因蛋白的结合抑制此两个激酶的激活,从而上调MHC-Ⅰ分子的表达并增加其膜转运。结论:一、组织标本中,EGFR野生型组与突变组有类似的CD8+T淋巴细胞浸润水平,HLA-ABC表达量无明显差异。EGFR突变组与野生型组相比,HLA-ABC膜表达显着降低。二、正常肺上皮细胞系中EGFR激活可以减少膜表面MHC-Ⅰ,增加PD-L1。NSCLC细胞系中,应用EGFR-TKIs可使膜表面MHC-Ⅰ增加。三、NSCLC细胞系中,应用EGFR下游信号通路中AKT/mTOR信号通路抑制剂可使膜表面MHC-Ⅰ增加,其作用在同时应用PSMB8/9抑制剂时解除。四、血根碱通过抑制EGFR和AKT的活化,增加MHC-Ⅰ分子表达和膜转位。
陈浩[3]（2019）在《黑色素瘤中新鉴定的与免疫检查点抑制剂疗效相关的生物标志物》文中研究说明研究目的:免疫检查点抑制剂（Immune check-point blockade,ICB）疗法（如CTLA-4单抗和PD-1单抗）的应用已经明显的改善了晚期黑色素瘤病人的生存预后。然而,免疫治疗的临床获益受限于较高的无应答率（60%-70%）。在本研究中,我们试图评估与ICB疗效和病人生存相关的基因组特征,以便深入了解免疫应答和临床获益的潜在机制。研究方法:我们收集了来自六个黑色素瘤免疫治疗队列的研究数据,整合了336例样本ICB治疗前肿瘤组织全外显子测序的突变信息。同时收集了这些患者的临床资料,包括性别、年龄、肿瘤分期、免疫应答状态、免疫抑制剂的分类、病人的生存状态以及随访的生存时间等。其中72例样本具有RNA-seq的肿瘤表达谱数据,224例样本具有肿瘤新抗原的HLA分型及突变肽链信息。我们应用Mut Sig CV算法重新寻找黑色素瘤的显着突变基因（SMG）,并探索其与免疫治疗预后的关系。CIBERSORT算法用来评估不同样本的各类免疫细胞亚群的浸润水平;GSEA分析不同亚组差异基因的通路富集情况。此外,我们也对体细胞突变数据利用非负矩阵分解算法提取黑色素瘤的突变特征,鉴定其与免疫应答之间的关联性。最后,我们使用新抗原质量拟合模型分析肿瘤新抗原与IEDB抗原表位之间的同源性,并利用拟合后的新抗原质量鉴定免疫应答者。研究结果:1、在336例黑色素瘤样本中,我们总共检测到222580个体细胞突变,每个病例的肿瘤突变负荷在1到9210之间,中位数为331。免疫应答病人的肿瘤突变负荷显着高于无应答的病人（TML,中位数390 vs.270,P=0.035）。Mut Sig CV算法分析共找到60个显着突变基因。其中,除了黑色素瘤中比较常见的突变驱动基因,如BRAF,NRAS,NF1,PREX2,ARID2,PTEN等,我们还鉴定出8个新的与免疫治疗预后相关的SMGs,包括COL5A1、COL28A1、DGKG、SEMA3E、RAPGEF5、GLDN、NCF2和RCAN2。其中携带COL5A1突变的病人预后更好,对免疫治疗更加敏感（log-rank检验,P=0.031）。为排除混杂因素的影响,我们又进一步将多个临床指标和COL5A1突变纳入Cox生存回归分析,发现COL5A1突变与免疫治疗的预后显着相关（HR,0.57[95%CI,0.35-0.94],P=0.028）。此外,携带有COL5A1基因突变的病人,其肿瘤突变负荷明显高于未携带此突变的病人。在PD-1和CTLA-4单抗治疗的样本分层分析中显示具有COL5A1突变的病人同样表现出更好的预后。2、黑色素瘤原发灶的基因表达谱解析结果（CIBERSORT）显示COL5A1基因突变型样本相对于野生型具有更多的CD8+T细胞、活化的NK细胞等免疫细胞的浸润（P<0.05）;而未活化的CD4+记忆T细胞和中性粒细胞等则更多的富集在COL5A1野生型的样本中（P<0.05）。GSEA结果显示COL5A1的突变影响一系列参与抗原处理提呈,免疫激活相关因子,细胞周期调控等相关的信号通路。3、黑色素瘤的单核苷酸变异主要以C>T为主。我们从黑色素瘤的体细胞突变数据中提取到6个突特征（signature）,与COSMIC体细胞突变数据库比对后,分别为突变signature 7（75.9%）,signature 11（14.8%）,signature 3（4.2%）,signature 1（2.5%）,signature 26（1.5%）和signature 18（1.1%）。在纳入性别、年龄、分期的多因素logistic回归分析中发现signature 3是ICB治疗预后不佳的相关因素,携带突变signature 3病人具有更弱的免疫应答能力（OR,2.79[95%CI,1.18-7.40],P=0.026）。Cox多因素生存回归分析中也发现具有signature 3的病人预后更差（HR,1.53[95%CI,1.00-2.34],P=0.049）。在不同免疫抑制剂的分层分析中,携带有signature 3的病人无论接受抗PD-1还是抗CTLA-4抗体疗法同样表现出对免疫治疗更差的应答能力。4、通过与IEDB数据库中微生物抗原表位比对后重新分析得到每个病人的肿瘤新抗原质量得分,发现高质量组接受ICB治疗后的总生存期明显延长（log-rank test,P=0.009）。在多因素Cox回归分析中也发现较高的新抗原质量是免疫治疗的保护因素（HR,0.56[95%CI,0.38 to 0.82],P=0.003）。研究结论:本研究基于目前最大样本量的黑色素瘤ICB治疗的基因组学研究,新发现了三个与黑色素瘤免疫治疗应答相关的特征,分别是显着突变基因COL5A1,突变signature 3,肿瘤新抗原质量。其中具有COL5A1突变、高质量新抗原的病人与更好的免疫应答相关,具有突变signature 3的病人则对ICB治疗更加不敏感。此外,同时满足这三个特征的病人免疫应答能力好于单独具备任何一个特征的其他病人。
吕骥[4]（2020）在《葛根芩连汤联合PD-1抑制剂通过重塑免疫微环境治疗结肠癌的机制研究》文中研究说明结肠癌（Colon cancer）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。随着我国经济和社会的发展以及生活方式的改变,这种疾病在我国的发病率呈快速上升趋势,成为了严重危害人类健康的“杀手”。结肠癌的常规治疗手段包括手术、化疗、放疗以及靶向治疗,但总体疗效并不令人满意。近年来,免疫检查点抑制剂（如PD-1、PD-L1抗体）的问世为许多恶性肿瘤的治疗带来了新的希望。但遗憾的是,PD-1抑制剂治疗结肠癌的效果是十分有限的。因此,为了解决这一难题,已有许多研究将PD-1抑制剂与其他抗肿瘤治疗（例如化学治疗,靶向治疗,放疗或其他免疫治疗等）联合应用,并取得了一定成效。中医药作为我国的瑰宝,在疾病的治疗中起着重要的作用。中药联合化疗、放疗等手段在肿瘤的治疗中亦取得了较好的治疗效果。中西医联合治疗结肠癌等恶性肿瘤已经得到了广泛认可。但目前对于中药联合PD-1抑制剂治疗结肠癌的研究尚无报道。本研究通过观察葛根芩连汤（Gegen Qinlian Decoction,GQD）联合PD-1抑制剂对治疗结肠癌皮下移植瘤模型有无疗效;随后采用流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光等方法研究联合治疗对肿瘤免疫微环境的影响;最后利用16S rDNA高通量测序及代谢组学技术进一步探讨GQD联合PD-1抑制剂抗肿瘤可能作用的机制,从而为GQD联合PD-1抑制剂治疗结肠癌提供理论依据。第一部分基于网络药理学分析葛根芩连汤对结直肠癌患者免疫状态的影响目的:基于中药网络药理学,寻找GQD对结肠癌治疗的可能作用机制,并探讨GQD对结直肠癌患者外周血T细胞亚群变化的影响。方法:1.基于药理学数据库对GQD活性化合物筛选,构建候选化合物-靶点网络,与结肠癌相关基因数据库（OMIM,GAD和TTD）进行比对、分析和去重,寻找与结肠癌作用的相关靶点蛋白。并且对筛选出的化合物靶点蛋白和结肠癌靶点蛋白进行蛋白互作分析（Protein and protein interac-tion,PPI）。最后对PPI中核心靶点蛋白进行GO和KEGG富集分析,寻找GQD可能在结肠癌中发挥作用的关键通路。2.选取河北医科大学第四医院自2018年7月1日到2019年1月1日组织学确诊为结直肠癌的患者20例。采用流式细胞术,检测GQD用药前后结直肠癌患者外周血CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例。结果:1.从GQD中共获得了126种候选化合物,260个潜在候选靶点蛋白,150个结肠癌相关靶点蛋白,79个潜在的核心靶点蛋白。并且发现这些核心靶点蛋白可能参与肿瘤的发生发展,以及T细胞和B细胞相关信号通路。2.结直肠癌患者应用GQD后与用药前相比外周血淋巴细胞中CD4+T细胞的比例明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）,而CD8+T细胞的比例无明显变化。小结:GQD在结肠癌中作用的靶点蛋白主要参与了肿瘤发生发展以及T细胞、B细胞等免疫相关信号通路;GQD可能改善结直肠癌患者的全身免疫状态。第二部分葛根芩连汤联合PD-1抑制剂治疗结肠癌的疗效观察及其对免疫微环境的影响目的:,探讨GQD联合PD-1抑制剂对结肠癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响,以及联合治疗对荷瘤小鼠免疫状态和肿瘤免疫微环境的影响。方法:1.构建结肠癌细胞系（CT26）诱导的皮下移植瘤模型。共设8组,分别为A组:低剂量GQD（L-GQD:300mg/kg/d）+PD-1抑制剂组;B组:中剂量GQD（M-GQD:1500mg/kg/d）+PD-1抑制剂组;C组:高剂量GQD（H-GQD:7500mg/kg/d）+PD-1抑制剂组;D组:L-GQD组;E组:M-GQD组;F组:H-GQD组;G组:PD-1抑制剂组;H组:对照组。随后我们评估了各组肿瘤体积及肿瘤生长抑制率（tumour growth inhibition rate,TGI）,并收集实验动物的肿瘤样本、外周血以及粪便。2.运用流式细胞术,检测实验分组中的A组、D组、G组以及H组荷瘤小鼠外周血CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例。3.采用免疫组织化学及免疫荧光技术,检测A组、D组、G组以及H组荷瘤小鼠肿瘤组织内CD8+T细胞的表达差异。4.采用酶联免疫吸附技术测定以上4组小鼠肿瘤组织内IFN-、IL-2、IL-6、IL-17,TGF-β以及PD-1的表达量。结果:1.灌胃32d小鼠,A、B、C三组肿瘤体积均小于H组（P<0.01）,且A组vs.H组差异最明显;A组肿瘤体积小于G组,有统计学差异（P<0.05）;G组肿瘤体积小于H组,有统计学差异（P<0.01）;D、E、F单用中药各组肿瘤体积与H组相比无明显差异;A、B、C三组间以及D、E、F三组间比较肿瘤体积无明显差异。2.A组、D组、G组小鼠外周血淋巴细胞中CD8+T细胞的比例均高于H组,差异有统计学意义（P<0.05）,且A组vs.H组的差异最明显（P<0.01）。但以上三组与H组相比,CD4+T细胞比例均无统计学差异。3.免疫组化结果显示:A组小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞的表达明显高于H组,差异有统计学意义（P<0.05）。D组、G组与H组相比,小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞比例均无统计学差异。4.A组小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞的荧光强度明显高于其他各组。5.ELISA结果显示:A组小鼠肿瘤组织内IFN-和IL-2的表达均明显高于H组,差异有统计学意义（P<0.05）。A组PD-1的表达明显低于H组,差异有统计学意义（P<0.01）。而IL-17,IL-6,TGF-β的表达在各组间无统计学差异。小结:GQD联合PD-1抑制剂可增强对荷瘤小鼠的抗肿瘤疗效;GQD联合PD-1抑制剂还可改善荷瘤小鼠外周血免疫状态,并重塑肿瘤免疫微环境。第三部分葛根芩连汤联合PD-1抑制剂对结肠癌肠道菌群的影响及代谢组学分析目的:基于荷瘤小鼠粪便16S rDNA测序和外周血代谢组学分析,筛选联合治疗后的差异菌群以及代谢产物,探讨GQD联合PD-1抑制剂通过重塑免疫微环境治疗结肠癌的机制。方法:1.分别对PD-1抑制剂治疗前的两个组:应用GQD组（GQD组:A组+D组）;未应用GQD组（Non-GQD组:G组+H组）以及治疗后4个组（A组、D组、G组和H组）荷瘤小鼠的粪便进行16S rDNA测序,进行OTU分析、PCA分析,物种多样性分析以及组间物种差异分析,并筛选在门、属、种水平上的差异菌群。2.收集4组（A组、D组、G组和H组）荷瘤小鼠PD-1抑制剂治疗后的血清样本,进行超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）分析,筛选差异代谢物,并于与数据库进行比对,从而获得差异代谢物及可能参与的信号通路。结果:1.PD-1抑制剂治疗前小鼠粪便16S rDNA测序分析本实验共得到2629590个有效序列（序列平均长度252.6091528）,664258502个有效碱基,263个OTU（Operational Taxonomic Units）。在属水平得到9个显着差异物种,在种水平得到14个显着差异物种,其中s＿unclassified＿f＿Erysipelotrichaceae在GQD组中明显富集,而s＿uncultured＿organism＿g＿norank＿f＿Peptococcacea和s＿uncultured＿g＿norank＿f＿Bacteroidales＿S24＿7＿group在Non-GQD组中明显富集。2.PD-1抑制剂治疗后小鼠粪便16S rDNA测序分析本实验共得到了2692871个有效序列（序列的平均长度为252.5071873）,679969282个有效碱基,318个OTU。D组vs.H组在属水平得到17个显着差异物种,在种水平得到29显着性差异物种;G组vs.H组,在属水平得到7个显着性差异物种,在种水平得到17个显着性差异物种;A组vs.H组,在属水平得到13个显着性差异物种,在种水平得到26个显着性差异物种,其中s＿Bacteroides＿acidifaciens和s＿uncultured＿organism＿g＿norank＿f＿Bacteroidales＿S24-7＿group在A组显着富集,而s＿uncultured＿bacterium＿g＿norank＿f＿Bacteroidales＿S24-7＿group和s＿uncultured＿Bacteroidales＿bacterium＿g＿norank＿f＿Bacteroidales＿S24-7＿group在H组显着富集。A组vs.G组,在属水平得到10个显着性差异物种,在种水平得到12个显着性差异物种,其中s＿Bacteroides＿acidifaciens在A组显着富集,cteroidales＿bacterium＿g＿norank＿f＿Bacteroidales＿S24-7＿group在G组显着富集。3.L-GQD联合PD-1抑制剂对小鼠血清代谢组学的影响在本实验共检出负离子模式化合物2554个,正离子模式化合物3504个。D组vs.H组获得391个差异代谢物;G组vs.H组获得308个差异代谢物;A组vs.H组获得322个差异代谢物,且A组vs.H组特有的差异化合物有158个,主要富集通路为甘油磷脂代谢和鞘脂类代谢。对差异代谢物进行分级聚类,A组中丰度较高的代谢物,主要包括Lyso PC（20:3（5Z,8Z,11Z））,vignatic acid B,Lyso PE（0:0/22:4（7Z,10Z,13Z,16Z））,Lyso PE（0:0/20:2（11Z,14Z））和PI（20:4（8Z,11Z,14Z,17Z）/16:0）;A组中丰度较低的代谢物,主要包括（1a S,5R,6R,9a R）-6-[2,6-dideoxy-2-（methylamino）],isopeonidin 3-rutinoside,glycerol 2-（9Z,12Zoctadecadienoate）,tetraethylene glycol和pentadecanoylglycine。小结:GQD联合PD-1抑制剂可能通过改善肠道菌群,以及某些特定代谢产物,增强对结肠癌的治疗疗效。结论:1.GQD在结肠癌中作用的靶点蛋白主要参与了肿瘤发生发展以及T细胞、B细胞等免疫相关信号通路;GQD可能改善结直肠癌患者的全身免疫状态。2.GQD联合PD-1抑制剂可增强对荷瘤小鼠的抗肿瘤疗效;GQD联合PD-1抑制剂还可改善荷瘤小鼠外周血免疫状态,重塑肿瘤免疫微环境。3.GQD联合PD-1抑制剂可能通过改善肠道菌群,以及某些特定代谢产物,增强对结肠癌的治疗疗效。
许璐[5]（2019）在《芹黄素通过免疫调控抑制黑色素瘤的作用与机制研究》文中指出恶性黑色素瘤（Malignant melanoma,MM）是皮肤肿瘤中侵袭性最强,致死率最高的恶性肿瘤。早期黑色素瘤可以通过手术切除,患者5年生存率可以达到95%,但是晚期或手术不可切除的黑色素瘤仍然是目前黑色素瘤治疗的巨大挑战。2011年以前,化疗和靶向治疗是治疗晚期黑色素瘤的主要手段,由于受到靶点和毒副作用的限制,仍然仅对40%-50%的黑色素瘤患者有效。近年来,随着对免疫治疗研究的不断深入,晚期黑色素瘤治疗进入了一个新的阶段。免疫治疗不受肿瘤突变情况的影响,其治疗效果主要取决于患者自身的免疫状态。并且,黑色素瘤具有较高的免疫原性,肿瘤细胞周围存在着丰富的免疫细胞,免疫治疗能更有效的激活宿主免疫系统,发挥杀伤肿瘤细胞的作用,因此认为免疫治疗可能是治疗晚期黑色素瘤最有前景的治疗手段。目前应用于临床的免疫治疗方法主要包括肿瘤疫苗、细胞因子、溶瘤病毒、过继性细胞免疫治疗和免疫检查点抑制剂,其中免疫检查点抑制剂ipilimumab、nivolumab和pembrolizumab在晚期黑色素瘤免疫治疗中取得了备受瞩目的治疗效果,成为了人类治疗肿瘤的一个里程碑。目前研究结果表明,阻断PD-L1/PD-1途径可以显着增强机体抗肿瘤免疫应答,是治疗晚期恶性黑色素瘤的重要靶点。由于PD-L1同时表达于肿瘤细胞和APC中,以PD-L1为靶点可以在T细胞激活的初始阶段和效应阶段同时发挥抗肿瘤免疫应答,同时临床研究结果也提示抗PD-L1单抗相比于抗PD-1单抗表现出更持久的应答率和更低的毒副作用,认为PD-L1可能是治疗晚期黑色素瘤更有效的免疫治疗靶点。但是,目前应用于临床治疗的免疫抑制剂仍缺乏较高的特异性,药物的毒副作用以及昂贵的治疗费用也限制了他们的应用,所以,寻找和开发天然的、低毒性药物是目前急需解决的问题。一直以来,天然植物及其提取物被作为非常重要的治疗药物在肿瘤治疗中被广泛研究,表现出较低的毒副作用,易于获得且价格低廉。其中,天然可食用的小分子黄酮类化合物表现出显着的生物学活性,具有低毒性和不诱导突变的生物学特征,在抗肿瘤治疗中受到越来越多的关注。芹黄素（Apigenin,APG）,主要存在于蔬菜、水果和饮品中,作为经典的黄酮类化合物在肿瘤治疗中被广泛研究,研究表明其在多种肿瘤类型,包括黑色素瘤中可以发挥抗肿瘤作用。近年来,多项研究表明芹黄素对宿主免疫具有调节作用,可以通过调节宿主免疫应答,发挥抗肿瘤作用。本研究中我们首次发现芹黄素可以通过调节机体免疫来抑制黑色素瘤生长,芹黄素通过同时抑制黑色素瘤细胞和树突状细胞中PD-L1的表达,发挥双重作用恢复和增强机体抗肿瘤免疫应答。因此,本研究阐明了芹黄素抗肿瘤作用的一个新的方向,这可能对治疗恶性黑色素瘤具有潜在的临床意义。实验一程序性死亡配体-1在黑色素瘤细胞中的表达实验目的:研究PD-L1在人黑色素瘤细胞系中的表达水平以及肿瘤微环境中各种细胞因子和生长因子对其表达的影响。实验方法:选取7种经典的人黑色素瘤细胞系,利用Western bolt检测黑色素瘤细胞系PD-L1表达水平,选取PD-L1高表达细胞系用于后续实验;选择在肿瘤微环境中对机体免疫发挥调节作用的细胞因子和生长因子作用于A375细胞系,利用Western bolt检测各种细胞因子和生长因子对PD-L1表达的影响;选取对PD-L1有调节作用的因子,应用Western bolt技术进一步验证其对PD-L1的诱导作用。结果:Western bolt结果表明在黑色素瘤细胞系中PD-L1的表达水平由高至低依次为 RPMI-7951、A2058、A375、MeWo、SK-MEL-3、G361、SK-MEL-28,我 们选取 PD-L1表达水平高的RPMI-7951、A2058和A375细胞系进行后续实验;细胞因子和生长因子诱导实验结果表明IFN-γ在A375细胞系中可以显着上调PD-L1的表达,与空白对照组相比,差异有统计学意义,并且进一步的Western bolt结果显示,IFN-γ同样也可以在其他黑色素瘤细胞系中上调PD-L1的表达。结论:PD-L1在黑色素瘤细胞中广泛表达;IFN-γ诱导的PD-L1上调在黑色素瘤免疫逃逸中起到重要作用;PD-L1在黑色素瘤免疫治疗中起到重要作用。实验二芹黄素通过抑制黑色素瘤PD-L1的表达发挥免疫调节作用实验目的:研究黄酮类化合物在体外和体内对黑色素瘤中PD-L1表达的影响及其作用机制,进而明确其对T细胞免疫应答功能的影响。实验方法:利用细胞增殖实验和流式细胞术检测黄酮类化合物对黑色素瘤细胞增殖和细胞周期的影响;应用免疫荧光和凋亡试剂盒检测黄酮类化合物对黑色素瘤细胞凋亡的影响;芹黄素和姜黄素处理IFN-γ诱导后的黑色素瘤细胞系,通过Western bolt和免疫荧光技术检测其对黑色素瘤细胞PD-L1表达的影响;为了进一步探究芹黄素和姜黄素对黑色素瘤细胞膜表面PD-L1表达的的影响,采用流式细胞术进行检测PD-L1的膜表达水平;应用Western bolt检测STAT1和p-STAT1水平,明确芹黄素和姜黄素影响PD-L1表达的作用机制;应用T细胞杀伤实验,细胞毒性实验和IL-2 ELISA试剂盒检测黄酮类化合物处理黑色素瘤细胞后T细胞对其杀伤的敏感性;应用C57BL/6小鼠建立B16-F10黑色素瘤动物模型,评估黄酮类化合物在体内对黑色素瘤的生长和免疫系统的影响。结果:黄酮类化合物在体外抑制黑色素瘤的生长并且促进黑色素瘤细胞凋亡;黄酮类化合物抑制IFN-γ诱导的PD-L1在细胞内和细胞膜上的表达,并且芹黄素的抑制作用更为显着;芹黄素和姜黄素通过抑制STAT1的磷酸化进而抑制诱导性PD-L1的表达;芹黄素和姜黄素通过抑制A375细胞PD-L1表达增强了 T细胞杀伤肿瘤细胞的能力并且促进T细胞增殖;在体内,芹黄素同样表现出对肿瘤生长的抑制作用并且促进T细胞向肿瘤组织浸润。结论:芹黄素通过抑制黑色素瘤细胞PD-L1表达,恢复和增强T细胞杀伤黑色素瘤细胞的能力,促进淋巴细胞向黑色素瘤组织浸润,通过发挥免疫调节作用进而抑制黑色素瘤的生长。实验三芹黄素通过抑制宿主树突状细胞PD-L1表达发挥抗黑色素瘤免疫调节作用实验目的:研究芹黄素对树突状细胞PD-L1表达的影响及其对宿主免疫的调节作用。实验方法:分离黄酮类化合物治疗后小鼠脾脏中的树突状细胞,应用Western bolt检测PD-L1的表达;分离人外周血单核细胞中的树突状细胞,用黄酮类化合物处理成熟的树突状细胞,Western bolt检测PD-L1的表达;从人外周血单核细胞中分离DC和CIK,体外诱导其成熟,将黄酮类化合物处理后的DC与CIK共培养杀伤黄酮类药物处理的A375细胞,应用克隆形成和细胞毒性实验检测其对肿瘤细胞的杀伤能力。结果:Western bolt结果表明,黄酮类药物可以显着抑制小鼠和人外周血树突状细胞PD-L1表达,芹黄素表现出更显着的抑制作用;克隆形成和细胞毒性实验结果表明DC可以增强CIK杀伤肿瘤细胞的能力;黄酮类化合物处理的DC细胞与CIK共同培养,可以增强DC-CIK杀伤黑色素瘤细胞的能力,芹黄素表现出更强的促进作用。结论:芹黄素抑制小鼠和人外周血树突状细胞PD-L1表达,与CIK共同培养在T细胞激活的初始阶段增强宿主免疫进而增强机体杀伤黑色素瘤细胞的能力。
桂勋[6]（2014）在《鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究》文中认为鼻咽癌是我国南部地区及东南亚常见的恶性肿瘤之一,给人类健康及经济稳定造成了极大的危害。由于鼻咽癌发生部位的解剖结构较复杂,不易于手术治疗,而且对化学药物不敏感,因此,当前鼻咽癌的治疗主要依赖放射治疗。目前的临床放射治疗对早期鼻咽癌治愈效果可达90%以上,但由于缺乏有效的早期诊断方法,大部分鼻咽癌患者被确诊时都接近中、晚期,错过了放射治疗的最佳时机,导致了患者五年生存率的大大降低。因此,寻找适合鼻咽癌早期诊断的血清学诊断标志物已成为目前鼻咽癌临床与基础研究的一个重要研究方向。此外,经初次放射治疗后的鼻咽癌患者,部分容易出现复发,部分容易出现远端转移,且对放射治疗不再敏感,此类复发或转移患者的预后生存率极低,因此,寻找适合易复发或易转移鼻咽癌患者个性化诊断的血清学标志物并探索适合鼻咽癌治疗的生物治疗靶标也日渐成为重要的鼻咽癌研究方向。为此,本研究针对鼻咽癌的早期诊断、个性化诊断以及治疗性抗体药物研发等三部分进行有意义的前期探索。本论文的第一部分旨在寻找高特异性的鼻咽癌诊断标志物,建立鼻咽癌的血清学早期诊断方法及组织学特异性检测工具。鼻咽癌的发生及发展过程与EB病毒的感染密切相关,EB病毒相关标志物已被用于开发鼻咽癌临床诊断试剂,如EBNA1/IgA、VCA/IgA等,此类标志物对鼻咽癌的早期筛查有很好的检测灵敏度,但特异性尚达不到临床检测的要求。鉴于EB病毒主要以II型潜伏态的形式存在于鼻咽癌细胞中,本研究拟以EB病毒II型潜伏态特异性表达蛋白LMP1、LMP2A及BARF1为研究对象,探索此类标志物应用于鼻咽癌早期筛查的可能性。首先,利用原核表达的方式制备了 LMP1、LMP2A不同亲水区基因及BARF1全长基因的重组蛋白,并分别用于检测鼻咽癌患者及健康人血清中针对上述三种抗原的IgA及IgG抗体水平,结果发现,仅鼻咽癌患者血清中抗LMP1第3个胞外区（LMP1-EX3）的IgA抗体和抗LMP2A第5个胞外区（LMP2A-EX5）的IgA抗体水平显着高于健康人,提示LMP1-EX3/IgA和LMP2A-EX5/IgA有望成为鼻咽癌特异诊断的标志物;其次,利用LMP1羧基端重组蛋白（rLMP1-C.ter,aa187-aa386）及LMP2A氨基端重组蛋白（rLMP2A-N.ter,aal-aa119）免疫BALB/c小鼠,分别制备了抗LMP1-C.ter单抗25株和抗LMP2A-N.ter单抗16株,Western blot及免疫荧光的鉴定结果显示,抗LMP1-C.ter单抗14B6和5H8对过表达LMP1的293T细胞有反应,抗LMP2A-N.ter单抗13A12和12A 2对过表达LMP2A的293T细胞有反应,提示这些单抗能识别天然构象的EB病毒表达抗原,有望成为鼻咽癌检测的研究工具;最后,选取抗LMP1-C.ter单抗代表株14B6和抗LMP2A-N.ter单抗代表株13A12,分别测试它们在免疫组化实验中对临床鼻咽癌患者组织切片的检测效果,结果显示,上述两个单抗对鼻咽癌组织切片有良好的免疫组化活性和特异性,有望成为鼻咽癌临床组织学诊断工具。综上,本研究发现EB病毒的潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2A是两个重要的鼻咽癌特异性诊断标志物,其一是证明LMP1-EX3/IgA及LMP2A-EX5/IgA可用于建立适合鼻咽癌血清学特异筛查的免疫诊断试剂,其二是证明LMPI单抗14B6及LMP2A单抗13A12可用于建立适合鼻咽癌组织学特异诊断的免疫组化检测试剂,这些发现为研究EB病毒潜伏期膜蛋白在鼻咽癌发生发展中的作用机制和临床诊断意义奠定良好的工作基础。本研究的第二部分旨在寻找适合鼻咽癌个性化诊断的标志物,探索研制易复发或易转移性鼻咽癌的早期诊断试剂的可能性。尽管当前放射治疗对原发性鼻咽癌已取得很好的治疗效果,但仍有15-58%的患者预后容易复发或转移,并产生放疗抗性,此类病人的再次治疗的预后很差,成为鼻咽癌临床治疗中的一个难点。因此,研究适合复发性鼻咽癌早期诊断用的诊断标志物,有助于高度个性化治疗方案的制定,对提高复发性鼻咽癌的治疗效果具有重要意义。文献报道EB病毒II型潜伏态BARTs区的转录产物与鼻咽癌的发生发展密切相关,可能与鼻咽癌预后发展有关。为此,本研究拟以EB病毒II型潜伏态BARTs区的转录产物A73为研究对象,探索其作为鼻咽癌个性化诊断标志物的可能性。首先,利用原核表达方式制备了高纯度的A73重组蛋白rGST-A73-NP9,并用于检测鼻咽癌患者血清中抗A73的IgA及IgG抗体水平,结果发现,A73/IgA的检测值可以将鼻咽癌患者分成两类,提示A73/IgA是一个不同类型鼻咽癌的分类诊断靶标;其次,利用rGST-A73-NP9免疫BALB/c小鼠,制备了抗A73的特异性单抗18株,并采用Western blot及免疫荧光方法证明A73单抗6A2对过表达A73的293T细胞有良好反应,提示A73单抗能识别自然状态下的A73抗原,为利用A73单抗研究A73表达产物提供了有用的研究工具;然后,利用单抗6A2分别对EB病毒感染的淋巴细胞系B95-8及上皮细胞系C666-1进行了 Western blot及免疫荧光的检测,结果显示,在这两种传代细胞系中均未检测到A73蛋白的表达,但在部分鼻咽癌组织中检测到A73蛋白的存在,提示A73蛋白有可能作为一个鼻咽癌分类诊断用的免疫组化检测靶标;最后,通过分离鼻咽癌细胞系C666-1细胞培养上清及鼻咽癌患者血清中的外泌体,用RT-PCR检测方法首次在外泌体中发现了 A73 mRNA的存在,提示鼻咽癌细胞中高表达的A73 mRNA很可能通过外泌体的方式转运至胞外,而此种转运方式和鼻咽癌患者血清中A73 mRNA的水平可能与鼻咽癌的复发和转移有关。综上,可能存在A73高表达和低表达两种鼻咽癌类型,而此两种鼻咽癌的转归结果是否存在差异还需要进一步鉴定。本研究的第三部分是研究LMP1和LMP2A抗体治疗鼻咽癌的效果探索LMP1及LMP2A作为鼻咽癌抗体治疗靶标的可行性。抗体药物由于具有毒副作用小及特异性强等特性,在肿瘤的治疗上表现出了明显的优势。LMP1及LMP2A是EB病毒在鼻咽癌细胞中表达的膜蛋白,具有很强的肿瘤组织表达特异性,而且在肿瘤的发生及发展过程中起重要作用,本研究拟通过实验证明其作为鼻咽癌抗体治疗靶标的潜在可能性。首先,基于鼻咽癌细胞系CNE-2Z构建了同时表达虫荧光素酶的LMP1及LMP2A稳定表达细胞株CNE-2Z-Luc-LMP1及CNE-2Z-Luc-LMP2A;其次,通过以白喉毒素为载体的展示肽免疫BALB/c小鼠,分别制备了抗LMP1-EX3特异性单抗25株及抗LMP2A-EX5特异性单抗6株,并用Western blot及免疫荧光检测方法证明抗LMPI-EX3单抗14H5和12AI与过表达LMP1的293T细胞有反应,抗LMP2A-EX5单抗5E9和7H3与过表达LMP2A的293T细胞有反应,在此基础上鉴定出LMP2A-EX5单抗所识别的线性B细胞表位382SLSSTEFIP390;最后,用肿瘤细胞体外生长抑制实验评估了抗LMP1-EX3单抗及抗LMP2A-EX5单抗对鼻咽癌细胞系CNE-2Z-Luc-LMPI及CNE-2Z-Luc-LMP2A的生长抑制效果,结果显示抗LMP1-EX3单抗2B8、5D4及7G9,抗LMP2A单抗5E9及7H3在体外对鼻咽癌细胞系有很好的生长抑制活性,从而初步证明LMP1-EX3及LMP2A-EX5作为鼻咽癌抗体治疗靶标的可行性。总之,本论文针对EB病毒II型潜伏态的基因转录产物进行鼻咽癌诊断靶标及治疗靶标的的探索研究,发现LMP1-EX3及LMP2A-EX5是很好的鼻咽癌诊断及治疗靶标,还发现A73是一个潜在的鼻咽癌个性化诊断靶标,为研制鼻咽癌特异性早期诊断试剂和鼻咽癌治疗性抗体药物奠定了基础。
谭庆龙[7]（2018）在《巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价》文中研究表明肿瘤微环境是一个复杂结构系统,具有增强或逃避宿主免疫监视和杀伤的作用。组成肿瘤免疫环境的核心免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC细胞和中性粒细胞。肿瘤微环境中的免疫细胞的位置、数量、功能表型和Closstalk影响肿瘤的免疫应答、治疗和预后结果。因此,重塑肿瘤免疫环境中免疫细胞的特征和削弱其在肿瘤免疫治疗中抑制性,对开发针对癌症的新型免疫治疗和化疗抵抗至关重要。由于肿瘤生长通常伴随着髓系细胞在肿瘤中的积累和免疫表型改变,从而抑制T细胞靶向肿瘤的免疫治疗。本研究针对肿瘤微环境中关键的“保安”巨噬细胞和“特种兵”T淋巴细胞入手,分别探寻调节巨噬细胞免疫极化表型的物质及其机制,和构建人源化T细胞免疫的小鼠膀胱癌肿瘤评价模型,希冀为重塑肿瘤免疫环境的治疗关键问题提供启示。1、巨噬细胞具有两种作用相反的表型,经典激活的M1表型和选择激活的M2表型,M1型巨噬细胞抵抗入侵病原体、抑制肿瘤、吞噬微生物、促进炎症反应和增强免疫监视功能。相反,M2型为“休息”表型,抑制免疫反应、促进组织愈合、降低炎症发生和促进肿瘤生长。猪苓多糖具有免疫调节作用已被证实,在本研究中,通过甲醇脱脂、水提醇沉提取猪苓粗多糖,经过滤、Savage法去蛋白、冷冻干燥、DEAE-Cellulose及Sephadex G-100柱层析分离猪苓均一多糖（Polyporus polysaccharide,PPS）;发现纯化的PPS极化M-CSF诱导人M2(CD206 high)型巨噬细胞极化为M1(CD86 high)型,且PPS影响巨噬细胞的粘附和诱变细胞形态;降低PD1表达,升高MHCⅡ分子表达;促进细胞因子白细胞介素（IL）‐1β、IL‐6、IL‐8、IL10及肿瘤坏死因子（TNF）‐α（P<0.01）分泌;增强M2巨噬细胞对肿瘤杀伤的能力（P<0.05）;降低FN、COLⅢ和ICMA-1转录水平（P<0.05）,升高TLR2、TLR4和NF-κB蛋白的表达（P<0.05）;RNA-seq也证实NF-κB信号及细胞生理的基质组成参与了PPS对巨噬细胞的作用。本研究发现PPS抑制M2巨噬细胞的粘附和伪足生成,且具有显着增强巨噬细胞免疫和抗肿瘤功能。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）对非肌层浸润性膀胱癌有效,其激活了免疫系统和加剧炎症反应,其中巨噬细胞为BCG的重要靶细胞之一。实验探讨了BCG在巨噬细胞极化调控中的作用和潜在机制,以及和信号调节蛋白-α（SIRPα）的关系。将单核细胞系THP-1分化为M2巨噬细胞(CD206 high和Th2细胞因子分泌细胞),观察到BCG诱导的M2极化为M1表型(CD86 high、CD197 high和Th1细胞因子分泌细胞);下调SIRPα（CD172α）;促进IL-1β、IL-6、TNF-α、干扰素（IFN）-γ和诱导型一氧化氮合酶（i NOS）等促炎因子的表达（P<0.05）。与BCG处理的M2巨噬细胞共培养的人膀胱癌T24和RT4细胞,显示出CD47高表达的于生长抑制作用的正相关（P<0.05）。此外,BCG以剂量依赖性方式显着增加Janus激酶2（JAK2）和p信号转导物和转录激活物1（STAT1）蛋白的表达。实验结果表明JAK2/STAT1途径介导BCG极化巨噬细胞为M1和抑制SIRPα表达是BCG作用于巨噬细胞为杀伤膀胱癌的重要机制。另外,通过体内研究BCG（0.25、1.25和6.25μg/小鼠,i.v.）在NOD/scid IL2Rg-/-（NSI）小鼠膀胱癌肿瘤模型中的作用和潜在机制。惊讶的是,观察到NSI小鼠T24膀胱癌模型在尾静脉注射BCG后,显示巨噬细胞标志物CD11b+F4/80+高水平浸润以及肿瘤体积的显着减少（P<0.05）。与对照组相比,外周巨噬细胞的M2比例显着下降（P<0.05）,血清和肿瘤上清中巨噬细胞相关炎症和分化细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12P70、RANKL和MCP-1的水平也显着增加（P<0.05）。此外,BCG促进骨髓中促分化基因PU-1、EGR-1、NF-κB和C-Fos m RNA转录的表达（P<0.05）。结合分析,本研究结果表明体内注射BCG可以靶向巨噬细胞来抑制膀胱癌的生长,其机制与巨噬细胞成熟、免疫激活和浸润膀胱肿瘤的巨噬细胞数量增加有关。2、人源化小鼠或小鼠-人类嵌合体已成为研究体内替代活生物体的重要模型。近年来,人源化小鼠模型在人类艾滋病、癌症、传染病、血液疾病和退行性疾病领域研究得到了广泛的认可和应用。患者来源的异种移植肿瘤（PDX）保留了原始的肿瘤特征如组织学异质性、生物分子特征、临床恶性表型、基因型、肿瘤结构和肿瘤脉管系统,可提供相关评估特别是新型癌症疗法和对临床结果的具有预见性,与肿瘤细胞系相比为更可靠的药物研发平台,已成为公认的临床前药物评价模型。Atezolizumab（MPDL3280A）作为化免疫治疗药物为膀胱肿瘤近30年以来的首个重大药物,开启了膀胱癌精准免疫靶向治疗。实验建立PBMC人源化NSI皮下荷瘤T24膀胱癌CDX小鼠模型,Atezolizumab（10mg/kg,i.v）每周尾静脉给药2次,连续治疗4周,对Atezolizumab的免疫治疗效果和机制进行评价。与空白对照组相比,Atezolizumab能明显降低肿瘤大小,其差异具有统计学意义（P<0.05）;外周血检测中,Atezolizumab升高人T淋巴细胞比例（P<0.05）;但对T细胞亚群CD8+/CD4+比例无影响;降低T细胞PD1表达量（P<0.05）。在肿瘤微环境中,Atezolizumab能降低T细胞耗竭分子PD1、TIM3表达量（P<0.05）和肿瘤PD-L1表达量（P<0.01）但对T细胞激活分子CD25、CD69均无影响。实验另进行了人源化NSI膀胱癌PDX小鼠模型构建,观测Atezolizumab（高、中、低:20、10、5 mg/kg,i.v）对患者来源肿瘤样本（PDX）的治疗作用。与空白对照组相比,Atezolizumab能明显降低肿瘤大小,其差异具有统计学意义（P<0.05）;外周血检测中,Atezolizumab升高人T淋巴细胞比例（P<0.05）;能明显增加CD4+亚群细胞数量;降低T细胞PD1表达量（P<0.05）,但对外周T细胞激活CD25、CD69无影响。在肿瘤微环境中,Atezolizumab能降低T细胞耗竭分子PD1和TIM3表达量（P<0.05）和肿瘤PD-L1表达量（P<0.01）,对T细胞激活分子CD25和CD69均无影响。本次建立的人源化膀胱癌PDX小鼠模型能良好评价免疫治疗药物的作用,且具有与CDX某些不同的特征表型,特别是T细胞浸润情况,CDX模型中浸润T细胞远大于PDX模型肿瘤。实验建立的人源化膀胱癌CDX或PDX小鼠模型能良好评价免疫治疗药物的作用,为具有T淋巴细胞特征的肿瘤免疫评价模型。实验表明Atezolizumab不仅对肿瘤PD-L1具有明显抑制作用,还能间接抑制PD1促进NSI小鼠体内人源T细胞的增加,具有重塑肿瘤免疫环境的作用。PDX与CDX模型的差异,能为患者肿瘤的异质性、不同免疫浸润环境和精准治疗提供临床前依据。
胡盼[8]（2020）在《EP4受体拮抗剂BY001和PD-1抗体联合治疗前列腺癌的功能和机制研究》文中指出前列腺癌（prostate cancer,PCa）是中老年男性常见的泌尿系统恶性肿瘤,是全球男性癌症相关死亡的第二大原因。近年来,我国前列腺癌的发病率和死亡率日益上升,严重危害国民健康。由于前列腺癌发病比较隐匿,我国绝大多数前列腺癌患者在初诊时已处于中晚期,丧失根治性治疗机会。内分泌治疗是中晚期前列腺癌患者的最主要治疗方法,但绝大多数患者会在治疗后发展为难治的去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant prostate cancer,CRPC）。目前,FDA批准的可用于CRPC治疗的药物为卡巴他赛、阿比特龙、阿帕他胺、恩杂鲁胺和镭-223等,但是这些药物延长CRPC患者的中位总生存期不超过2年。免疫治疗是近年新兴的肿瘤治疗策略,作为FDA批准的首个肿瘤疫苗制剂,Sipuleucel-T用于治疗无症状或者轻微症状的转移性CRPC,但患者的生存获益仍然有限。后续兴起的免疫检查点抑制剂在黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌等肿瘤中显示出较好疗效,但在前列腺癌中疗效欠佳。联合治疗不仅是前列腺癌免疫治疗的热点,也是改善治疗效果的重要策略。因此,本论文致力于通过联合治疗提高免疫检查点抑制剂在前列腺癌中的效果。已有研究表明,COX-2/PGE2/EP4（PTGER4）信号通路在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用。在结肠癌和乳腺癌中,EP4受体拮抗剂有免疫治疗效果。COX-2/PGE2/EP4信号通路在前列腺癌中高度活化,但尚无针对前列腺癌的免疫治疗研究。为探索前列腺癌肿瘤微环境中EP4受体的分布和功能,本论文对前列腺癌患者的肿瘤组织样本进行单细胞测序和分析,并结合差异表达基因富集分析和既有数据库生物信息学分析,鉴定到EP4受体是前列腺癌免疫治疗的特异性靶点。随后,我们选择实验室合成和筛选到的新型EP4受体小分子拮抗剂BY001,研究单药治疗以及与PD-1抗体联合治疗在前列腺癌中的功能和机制。在体外,BY001一方面直接靶向EP4受体阻止骨髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cell,MDSC）的形成以及MDSC细胞分泌免疫抑制性因子ARG1和i NOS。BY001也可以促进T细胞的增殖、存活和效应功能;另一方面通过靶向肿瘤细胞分泌的趋化因子间接地逆转肿瘤微环境中MDSC细胞和T细胞的比例,从而发挥免疫调节功能。接下来,我们评估BY001与免疫检查点抑制剂PD-1抗体在前列腺癌同系异种动物模型中的抗肿瘤活性。PD-1抗体或者BY001单药治疗只能抑制40%左右的肿瘤生长。尽管治疗效果不显着,但是BY001可以促进肿瘤内部CD8+T细胞的浸润,抑制MDSC细胞的浸润,具有改善前列腺癌免疫抑制性微环境的能力。鉴于BY001治疗后,CD8+T细胞依然处于耗竭状态以及临床上联合治疗策略的探索,我们采用BY001和PD-1抗体进行联合治疗。联合治疗显着抑制前列腺肿瘤生长,促进肿瘤内部CD8+T细胞的增加和NK细胞群的富集,抑制MDSC细胞的浸润。联合治疗增强与T细胞招募有关的趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达,与此同时,抑制与MDSC细胞招募有关的趋化因子CCL2、CCL4、CCL5、CXCL5、CXCL12和CXCL16的表达。此外,联合治疗也促进IFN-γ和TNF-α的表达,抑制ARG1的表达。在前列腺癌原位动物模型和再挑战动物模型中,联合治疗诱导更为有效的肿瘤免疫应答,抑制肿瘤的生长、转移或复发,并延长小鼠的生存期。初步探索联合治疗的作用机制,我们发现,联合治疗后,肿瘤内部存在更多的CD8+TCF1+T细胞和MHC-Ⅱ+抗原递呈细胞共定位,这表示CD8+TCF1+T细胞与MHC-Ⅱ+抗原递呈细胞联合抱团,组成独立的抗肿瘤基地,维持免疫应答。此外,联合治疗主要通过CD8+T细胞发挥抗肿瘤作用。综上所述,本研究表明BY001与PD-1抗体具有强烈的协同作用,可以将免疫治疗反应较差的前列腺肿瘤转化为敏感的肿瘤,抑制肿瘤生长,延长生存期,并维持免疫应答,这为CRPC的临床治疗提供了可供参考的新策略。
李昌[9]（2008）在《新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究》文中提出本研究针对当前AIDS/HIV治疗中面临的病毒变异快、病毒感染细胞贮存池难以清除、病毒感染造成机体免疫功能损伤等关键问题,以构建具特异杀伤和免疫治疗双重功能的基因工程制剂为目标,筛选能够与HIV-1膜蛋白特异结合的抗病毒蛋白西诺维恩（CVN）、格瑞弗森（GRFT）以及免疫诱导因子金黄色葡萄球菌外毒素A（SEA）为研究对象,利用细菌和酵母表达系统,获得了重组抗病毒蛋白CVN、GRFT及其偶联SEA的重组导向制剂CS、GS,对其进行初步活性分析。同时制备了稳定表达中国流行株HIV-1膜蛋白的靶细胞模型,利用该模型,通过免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光测定（IFA）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤试验等,对CVN、GRFT及其重组导向制剂CS、GS的体外结合活性、细胞结合活性及细胞杀伤活性进行研究。结果表明,成功获得了抗病毒蛋白和重组导向制剂,并且都具有良好的细胞结合活性。重组导向制剂可非特异性活化PBMCs、特异性介导CTLs杀伤表达HIV-1膜蛋白的靶细胞,为该制剂进一步推向临床奠定了基础。
刘昌孝[10]（1976）在《中草药在免疫治疗中的作用》文中提出作者收集了有关中草药在免疫治疗中作用的资料,并谈了自己的看法。全文分扶正培本与提高机体免疫力、免疫疾病与中草药治疗、研究中草药与免疫关系促进中西医药结合三部分。
二、中草药在免疫治疗中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中草药在免疫治疗中的作用（论文提纲范文）
（1）肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分: 文献综述 |
| 综述一: 中医药调节肿瘤免疫应答防治肿瘤的研究进展 |
| 1 先天性免疫调节 |
| 2 适应性免疫调节 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二: 树突状细胞在肿瘤免疫和免疫治疗中的作用 |
| 1 树突状细胞亚群分类 |
| 2 肿瘤免疫中树突状细胞功能 |
| 3 肿瘤对树突状细胞功能的调节作用 |
| 4 肿瘤治疗中的树突状细胞功能 |
| 5 基于树突状细胞的肿瘤免疫疗法 |
| 6 抗肿瘤树突状细胞疫苗 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三: 桔梗皂苷D的抗肿瘤作用机制研究进展 |
| 1 调控肿瘤细胞凋亡途径 |
| 2 调控肿瘤细胞自噬 |
| 3 调控肿瘤细胞增殖 |
| 4 抑制血管生成 |
| 5 抑制肿瘤的侵袭和转移 |
| 6 体内抗肿瘤调控 |
| 7 免疫调节及降脂活性 |
| 8 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一: 肿瘤相关树突状细胞的诱导培养 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状脂质及功能的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三: 毒胡萝卜素激活内质网应激对肿瘤相关树突状细胞中脂质含量和功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四: 肺瘤平膏含药血清逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质及功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六: 桔梗皂苷D对树突状细胞毒性和肿瘤细胞杀伤能力的研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞脂质含量及功能的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验八: 桔梗皂苷D逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质含量和功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验九: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（2）EGFR-TKIs及血根碱在NSCLC中调节MHC-Ⅰ的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 EGFR突变的NSCLC的药物治疗现状 |
| 一、EGFR信号通路与EGFR-TKIs作用机制 |
| 二、EGFR突变受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的分子靶向治疗 |
| 三、NSCLC的抗PD-1/PD-L1免疫治疗 |
| 第二节 MHC-Ⅰ分子在细胞免疫中的重要作用和EGFR下游的PI3K/AKT/MTOR信号通路及其对抗原处理和提呈系统的影响 |
| 一、MHC-Ⅰ及抗原加工与提呈系统 |
| 二、PI3K/AKT/mTOR信号通路及其在癌生物学中的功能 |
| 三、EGFR-TKIs耐药机制和现状 |
| 四、肿瘤微环境对免疫治疗的影响 |
| 五、抗PD-1/PD-L1免疫治疗的作用机制及耐药机制 |
| 六、PI3K/AKT/mTOR信号通路对抗原加工提呈系统的影响 |
| 第三节 中医对肿瘤的认识及血根碱抗肿瘤作用研究现状 |
| 一、中医对肿瘤的认识 |
| 二、血根碱抗肿瘤作用研究现状 |
| 第四节 本课题研究的科学假说 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 NSCLC组织标本免疫组化实验 |
| 一、实验目的、材料与方法 |
| 二、标本来源与实验步骤 |
| 三、统计方法与图形处理 |
| 四、实验结果 |
| 五、小结 |
| 第二节 细胞系与分子模拟实验(材料与方法) |
| 一、细胞培养 |
| 二、蛋白免疫印迹实验 |
| 三、流式细胞仪检测细胞表面HLA-ABC、PD-L1蛋白表达 |
| 四、免疫荧光(直接法和间接法结合应用) |
| 五、实时荧光定量聚合酶链式反应实验Quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR) |
| 六、AutoDock软件分子模拟实验 |
| 第三节 EGFR-TKIs调节MHC-Ⅰ的作用与机制 |
| 一、EGFR配体激活或者突变激活都降低细胞膜上MHC-Ⅰ分子表达 |
| 二、EGFR-TKIs抑制EGFR激活增加细胞膜表面MHC-Ⅰ分子表达 |
| 三、EGFR-TKIs和AKT/mTOR抑制剂均增加肿瘤细胞系细胞膜表面MHC-Ⅰ |
| 四、EGFR激活突变减少抗原加工提呈系统基因表达 |
| 五、阿法替尼/MK2206/MG-132增加抗原加工提呈系统基因表达 |
| 六、EGFR通过下游AKT/mTOR调控STAT1/STAT3活化并影响PSMB8/9表达 |
| 七、小结 |
| 第四节 血根碱调节MHC-Ⅰ的作用与机制 |
| 一、分子模拟表明血根碱与T790M突变的EGFR有较高的亲和力 |
| 二、Autodock分子模拟显示血根碱与AKT有较高的亲和力 |
| 三、血根碱抑制NCI-H1975中T790M突变的EGFR和AKT的磷酸化活化并上调MHC-Ⅰ分子 |
| 四、血根碱增加EGFR突变的NSCLC细胞株的MHC-Ⅰ膜表达 |
| 五、血根碱通过抑制EGFR-AKT-mTOR信号通路调控MHC-Ⅰ表达 |
| 六、小结 |
| 第三章 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（3）黑色素瘤中新鉴定的与免疫检查点抑制剂疗效相关的生物标志物（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、黑色素瘤中显着突变基因与免疫应答 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 基因突变信息及临床数据的获取 |
| 1.1.2 Oncotator进行突变注释 |
| 1.1.3 利用Mut Sig CV算法寻找显着突变基因 |
| 1.1.4 CIBERSORT和TIMER算法计算肿瘤淋巴细胞浸润情况 |
| 1.1.5 筛选差异表达基因并进行基因集富集分析 |
| 1.1.6 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 接受免疫治疗病人的临床特征 |
| 1.2.2 黑色素瘤的显着突变基因 |
| 1.2.3 COL5A1的突变与免疫治疗的预后及应答有关 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、黑色素瘤突变特征与免疫治疗 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象的临床特征与体细胞突变数据 |
| 2.1.2 提取突变特征并与COSMIC比对 |
| 2.1.3 基因富集分析 |
| 2.1.4 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SNV分析结果 |
| 2.2.2 提取的突变特征 |
| 2.2.3 Signature 3 与免疫应答 |
| 2.2.4 Signature 3 影响的基因通路 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、新抗原质量在免疫治疗中的意义 |
| 3.1. 对象和方法 |
| 3.1.1 病例的临床特征和新抗原多肽信息 |
| 3.1.2 新抗原质量的计算 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 新抗原负荷与免疫应答 |
| 3.2.2 新抗原质量与免疫应答 |
| 3.2.3 三种标志物联合预测免疫治疗预后 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 黑色素瘤免疫检查点疗法应答的生物标志物 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）葛根芩连汤联合PD-1抑制剂通过重塑免疫微环境治疗结肠癌的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 基于网络药理学分析葛根芩连汤对结直肠癌患者免疫状态的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 葛根芩连汤联合PD-1抑制剂治疗结肠癌的疗效观察及其对免疫微环境的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 葛根芩连汤联合PD-1抑制剂对结肠癌肠道菌群的影响及代谢组学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 肠道菌群与肿瘤免疫治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）芹黄素通过免疫调控抑制黑色素瘤的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 程序性死亡配体-1在黑色素瘤细胞中的表达 |
| (一) 前言 |
| (二) 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要仪器和设备 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 2. 实验溶液配制 |
| 3. 实验方法 |
| (三) 实验结果 |
| 1. 人黑色素瘤细胞系中PD-L1的表达 |
| 2. 肿瘤微环境中各种细胞因子和生长因子对PD-L1表达的影响 |
| 3. 干扰素-γ可以诱导黑色素瘤细胞表达PD-L1 |
| (四) 讨论 |
| (五) 结论 |
| (六) 参考文献 |
| 第二部分 芹黄素通过抑制黑色素瘤PD-L1的表达发挥免疫调节作用 |
| (一) 前言 |
| (二) 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器和器材 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| (三) 实验结果 |
| 1. 黄酮类化合物抑制黑色素瘤细胞生长 |
| 2. 黄酮类化合物促进黑色素瘤细胞凋亡 |
| 3. 芹黄素和姜黄素抑制IFN-γ诱导的PD-L1表达 |
| 4. 在黑色素瘤中,芹黄素和姜黄素抑制IFN-γ诱导的STAT1磷酸化 |
| 5. 芹黄素和姜黄素增强T细胞杀伤黑色素瘤细胞的能力 |
| 6. 在黑色素瘤小鼠模型中,芹黄素介导的肿瘤生长抑制与肿瘤免疫细胞浸润增加有关 |
| (四) 讨论 |
| (五) 结论 |
| (六) 参考文献 |
| 第三部分 芹黄素通过抑制宿主树突状细胞PD-L1表达发挥抗黑色素瘤免疫调节作用 |
| (一) 前言 |
| (二) 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 标本采集 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| (三) 实验结果 |
| 1. 芹黄素和姜黄素可以抑制DC中PD-L1的表达 |
| 2. DC可以增强CIK杀伤黑色素瘤细胞的能力 |
| 3. 芹黄素通过抑制DC细胞PD-L1表达增强DC-CIK杀伤黑色素瘤细胞的能力 |
| (四) 讨论 |
| (五) 结论 |
| (六) 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 鼻咽癌概述 |
| 1.1.1 鼻咽癌的流行病学 |
| 1.1.2 鼻咽癌的致病因子 |
| 1.1.3 鼻咽癌的临床特征 |
| 1.1.4 鼻咽癌的诊断 |
| 1.1.5 鼻咽癌的治疗 |
| 1.2 EB病毒概述 |
| 1.2.1 EB病毒的发现 |
| 1.2.2 EB病毒的分类 |
| 1.2.3 EB病毒的形态学和生物学特征 |
| 1.2.4 EB病毒的生活周期 |
| 1.2.5 EB病毒的流行病学 |
| 1.2.6 EB病毒的治疗 |
| 1.2.7 EB病毒潜伏态的主要转录产物 |
| 1.2.8 EB病毒相关肿瘤 |
| 1.3 本研究的目的、意义及思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要耗材 |
| 2.3 主要试剂及实验动物 |
| 2.3.1 E.coli菌株 |
| 2.3.2 质粒 |
| 2.3.3 细胞株 |
| 2.3.4 实验动物 |
| 2.3.5 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.3.6 其他常规试剂 |
| 2.3.7 临床标本 |
| 2.4 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.4.1 常规分子生物学实验溶液的配制 |
| 2.4.2 细胞培养/转染用溶液的配制 |
| 2.4.3 病毒抗原及抗体检测用溶液的配置 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.5.2 常规细胞生物学实验方法 |
| 2.5.3 稳定细胞株的构建 |
| 2.5.4 单克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.5.5 肿瘤细胞的生长抑制实验 |
| 2.5.6 免疫学相关实验方法 |
| 2.5.7 本研究中用到的其他实验方法 |
| 2.6 数据处理及统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分: 鼻咽癌特异性诊断试剂的研发探索 |
| 3.1 三种鼻咽癌血清诊断试剂的研发探索 |
| 3.1.1 鼻咽癌LMP1/IgA检测试剂雏形的初步建立 |
| 3.1.2 鼻咽癌LMP2A/IgA检测试剂雏形的初步建立 |
| 3.1.3 鼻咽癌BARFI/IgA及BARF1/IgG检测试剂的研发探索 |
| 3.2 鼻咽癌免疫组化检测试剂的建立 |
| 3.2.1 LMP1免疫组化检测试剂的初步建立 |
| 3.2.2 LMP2A免疫组化检测试剂的初步建立 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分: 鼻咽癌个性化诊断靶标的探索 |
| 3.4 A73蛋白的鉴定及其作为鼻咽癌个性化诊断靶标的探索 |
| 3.4.1 血清中抗A73的抗体作为鼻咽癌个性诊断靶标的评估 |
| 3.4.2 细胞或组织中A73蛋白作为鼻咽癌个性诊断靶标的评估 |
| 3.4.3 血清中A73 mRNA作为鼻咽癌个性诊断靶标的探索 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第三部分: 鼻咽癌免疫治疗靶标的探索 |
| 3.6 基于EB病毒蛋白靶标的治疗性抗体探索 |
| 3.6.1 以LMPI为靶标的鼻咽癌治疗性抗体研发探索 |
| 3.6.2 以LMP2A为靶标的鼻咽癌治疗性抗体研发探索 |
| 3.7 第三部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼻咽癌的血清学早期诊断极为重要 |
| 4.2 EB病毒II型潜伏态的基因转录产物为鼻咽癌提供了很好的早期诊断靶标 |
| 4.3 鼻咽癌个性化诊断试剂研发的必要性 |
| 4.4 抗体药物治疗是鼻咽癌治疗的一个重要发展方向 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（7）巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 巨噬细胞与肿瘤免疫治疗相关进展 |
| 一、巨噬细胞来源和功能分型 |
| 二、目前的肿瘤相关的巨噬细胞 |
| 三、TAM在肿瘤治疗中的作用与治疗策略 |
| 第二节 人源化PDX小鼠肿瘤模型研究进展 |
| 一、国内外研究现状发展趋势评述 |
| 二、人源化鼠的模型建立方法 |
| 三、人源化PDX小鼠模型研究与应用 |
| 第三节 中药猪苓研究进展 |
| 一、化学成分研究 |
| 二、现代药理作用研究 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究 |
| 第一部分 猪苓多糖对人巨噬细胞的形态及抗肿瘤作用的影响 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果分析 |
| 四、小结 |
| 第二部分 卡介苗增强THP-1 源巨噬细胞的抗膀胱癌作用及其机制 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第三部分 卡介苗(BCG)在膀胱癌NOD /scid~(IL2Rg -/-) (NSI)小鼠模型中通过靶向巨噬细胞的免疫治疗研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第二节 人源化肿瘤小鼠模型的建立与Atezolizumab免疫治疗评价 |
| 第一部分 人源化膀胱癌CDX小鼠模型的免疫表型与Atezolizumab的免疫治疗评价 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、小结 |
| 第二部分 人源化膀胱癌PDX小鼠模型的免疫表型与Atezolizumab的免疫治疗评价 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校发表论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）EP4受体拮抗剂BY001和PD-1抗体联合治疗前列腺癌的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前列腺癌概述 |
| 1.1.1 前列腺癌的流行病学 |
| 1.1.2 前列腺癌的致病因素 |
| 1.1.3 前列腺癌的发展进程 |
| 1.2 前列腺癌的诊断和治疗 |
| 1.2.1 前列腺癌的临床表现 |
| 1.2.2 前列腺癌的诊断 |
| 1.2.3 前列腺癌的恶性程度评估 |
| 1.2.4 前列腺癌的临床治疗 |
| 1.3 前列腺癌的免疫治疗现状 |
| 1.3.1 肿瘤疫苗疗法 |
| 1.3.2 双特异性抗体疗法 |
| 1.3.3 嵌合抗原受体T细胞疗法 |
| 1.3.4 免疫检查点抑制剂疗法 |
| 1.4 前列腺癌的免疫抑制性微环境 |
| 1.4.1 肿瘤突变负荷 |
| 1.4.2 肿瘤浸润淋巴细胞 |
| 1.4.3 MDSC细胞 |
| 1.5 前列腺癌与COX-2/PGE2/EP4 信号通路 |
| 1.5.1 COX-2/PGE2/EP4 通路与肿瘤免疫 |
| 1.5.2 EP4受体拮抗剂的免疫治疗现状 |
| 1.5.3 前列腺癌中COX-2/PGE2/EP4 通路高度活化 |
| 第二章 EP4受体是前列腺肿瘤免疫治疗的特异性靶点 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验试剂及仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 EP4受体与前列腺癌的恶性程度呈正相关 |
| 2.3.2 差异表达基因富集分析结果 |
| 2.3.3 EP4受体损害机体的适应性免疫应答 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PGE2调控肿瘤细胞和免疫细胞 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验试剂及仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 PGE_2影响肿瘤细胞分泌趋化因子 |
| 3.3.2 PGE_2损害T细胞的功能 |
| 3.3.3 PGE_2 促进MDSC细胞的形成和免疫抑制因子的分泌 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 EP4受体拮抗剂BY001调控肿瘤细胞和免疫细胞 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验试剂及仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 BY001的结构和功能 |
| 4.3.2 BY001抑制前列腺癌细胞的迁移 |
| 4.3.3 BY001逆转肿瘤细胞分泌趋化因子 |
| 4.3.4 BY001增强T细胞的功能 |
| 4.3.5 BY001 抑制MDSC细胞的形成 |
| 4.3.6 BY001 抑制MDSC细胞的功能 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 BY001抑制前列腺肿瘤的体内生长 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要实验试剂及仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 免疫治疗动物模型的建立 |
| 5.3.2 PD-1抗体治疗前列腺癌的效果评价 |
| 5.3.3 BY001抑制前列腺癌的体内生长 |
| 5.3.4 BY001改善前列腺癌的免疫抑制性微环境 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 BY001联合PD-1抗体抑制前列腺肿瘤的体内生长 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要实验试剂及仪器 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 BY001和PD-1抗体联合治疗显着抑制前列腺肿瘤生长 |
| 6.3.2 联合治疗改善免疫抑制性肿瘤微环境 |
| 6.3.3 肿瘤微环境中免疫细胞亚群的变化 |
| 6.3.4 联合治疗促进抗肿瘤基地的形成 |
| 6.3.5 初步探索联合治疗的作用机制 |
| 6.3.6 多种动物模型验证联合治疗的效果 |
| 6.4 小结 |
| 总结展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略词及中英文对照表 |
| 附录2 表格索引 |
| 附录3 图片索引 |
| 附录4 动物实验伦理审查表 |
| 博士期间科研成果及参与项目 |
| 致谢 |
（9）新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 HIV 感染分子机制及其防治研究现状 |
| 1 AIDS/HIV 的流行情况 |
| 2 HIV 病原学 |
| 3 HIV 感染与致病分子机制 |
| 4 HIV 的进化与变异 |
| 5 AIDS/HIV 防治研究现状 |
| 6 问题与展望 |
| 第二章 抗HIV 重组导向制剂与免疫治疗研究进展 |
| 1 AIDS 靶向治疗的历史、原理及研究现状 |
| 2 AIDS 靶向治疗运载工具研究 |
| 3 AIDS 靶向治疗生物弹头研究 |
| 4 AIDS 新的免疫治疗策略研究 |
| 5 问题与展望 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 新型抗病毒基因西诺维恩、格瑞弗森的合成构建、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗HIV 重组导向制剂CS、GS 的构建及原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 重组抗病毒蛋白及其导向制剂的纯化与复性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 HIV-1 感染靶细胞模型的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂活性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂在酵母中表达探索研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
四、中草药在免疫治疗中的作用（论文参考文献）
- [1]肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究[D]. 张曦文. 中国中医科学院, 2020(01)
- [2]EGFR-TKIs及血根碱在NSCLC中调节MHC-Ⅰ的作用与机制研究[D]. 郭坤彬. 广州中医药大学, 2019(08)
- [3]黑色素瘤中新鉴定的与免疫检查点抑制剂疗效相关的生物标志物[D]. 陈浩. 天津医科大学, 2019(02)
- [4]葛根芩连汤联合PD-1抑制剂通过重塑免疫微环境治疗结肠癌的机制研究[D]. 吕骥. 河北医科大学, 2020(01)
- [5]芹黄素通过免疫调控抑制黑色素瘤的作用与机制研究[D]. 许璐. 大连医科大学, 2019(04)
- [6]鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究[D]. 桂勋. 厦门大学, 2014(04)
- [7]巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价[D]. 谭庆龙. 广州中医药大学, 2018(01)
- [8]EP4受体拮抗剂BY001和PD-1抗体联合治疗前列腺癌的功能和机制研究[D]. 胡盼. 华东师范大学, 2020(02)
- [9]新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究[D]. 李昌. 吉林大学, 2008(11)
- [10]中草药在免疫治疗中的作用[J]. 刘昌孝. 中草药通讯, 1976(12)