一、兔出血症病毒结构蛋白及其降解产物的分析（论文文献综述）
秦海斌[1]（2007）在《兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立》文中研究表明兔出血症（ Rabbit haemorrhagic disease,RHD ）是由兔出血症病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV）引起的兔的一种急性、败血性、高度致死性传染病。该病于1984年在中国首次发现,其后在世界其它地区相继发生,给养兔业造成了巨大的经济损失。鉴于RHD病程短、致死率高等特点,临床检测和早期诊断中对检测方法除要求敏感、准确外,还要求其快速化、简单化。现有的血清学检测方法因为商业养殖中对兔的严格免疫导致其无法判定是病毒感染还是疫苗免疫造成了抗体水平的升高而失去了其诊断意义。因此,在RHD的诊断中病原学检测发挥着主导作用。目前,已建立了多种实验室检测方法,其中琼脂扩散、血凝/抑制试验应用较广但灵敏性较低;反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）因仪器、试剂和操作技术要求更适合于实验室操作,相比之下酶标抗体技术操作相对简单又无需太多实验设备,比较适合在临床和检测中推广。然而迄今为止,只有国外少数公司研制成功了抗原检测ELISA试剂盒,其昂贵的成本使其在进行大规模临床检测时难以广泛应用。因此,研制灵敏、快速、操作简便的抗原检测ELISA试剂盒对于RHD的诊断和疫情防治具有重要意义。本试验以分离纯化的地方毒株RHDV-TP株免疫BALB/c小鼠,制备了多株针对RHDV的单克隆抗体,对其生物学特性进行分析鉴定后,筛选出一株效价高、亲和力强的单克隆抗体DE2株,并将其作为诊断试剂,建立了RHDV抗原捕获ELISA检测方法。由于RHDV缺乏体外繁殖系统,本试验将RHDV-TP毒株攻击健康大白兔增殖病毒,发病死亡后采集其肝脏组织匀浆处理,以蔗糖密度梯度离心法纯化RHDV全病毒粒子,并将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠。以真核表达系统表达的RHDV结构蛋白-VP6O作为基础建立间接ELISA检测方法进行单抗筛选。通过融合与克隆过程,筛选出6株针对RHDV的单克隆抗体AD4、AG10、BC9、BE8、BH3、DE2;其腹水效价介于1:40001:3×104之间。竞争相加ELISA及Western-blot试验结果表明,6株单抗分别针对5个RHDV抗原位点,其中DE2株针对线性抗原位点,DE2株效价较高、亲和力强,有作为诊断试剂进行开发利用的前景。将DE2株单抗腹水纯化后作为捕获抗体包被酶标板,建立了抗原捕获ELISA诊断方法检测RHDV,并对各工作条件进行了优化,筛选出最佳工作体系,然后以对已知阳性抗原样品和阴性抗原样品及临床可疑样品进行检测,并与常规血凝/血凝抑制试验检测结果进行比对。结果显示对于已知阳性样品,捕获ELISA阳性检出率为100%;对于临床可疑样品,捕获ELISA阳性检出率为62.7%,常规血凝试验为55.2%,检出率比HA高7.5%,灵敏度为HA试验的3～13倍。最低病毒检出量测定试验表明,抗原捕获ELISA诊断方法对全病毒的最低检出浓度为26ng/mL,具有很高的灵敏度。上述结果表明,基于DE2株单克隆抗体的抗原捕获ELISA诊断方法可特异性地检测出发病兔肝脏组织中的RHDV,该方法快速、灵敏、准确,能够同时进行大规模的样品检测,省时省力且成本较低,是一种理想的RHDV抗原检测方法。另外,本试验制备的其他单克隆抗体分别针对不同的RHDV抗原表位,今后将对RHDV抗原表位筛选、RHDV的鉴别诊断等相关领域的研究中发挥重要作用。
盛蓉[2]（2011）在《携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究》文中研究说明兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（RHDV）引起的兔的传染性疾病,病程短、死亡率高,是家兔烈性传染病。VP60蛋白是RHDV主要的结构蛋白,在动物体内可诱导产生中和抗体,与免疫反应直接相关,是病毒免疫保护性抗原。研究发现在没有其他任何成分存在的条件下,VP60衣壳蛋白在体外可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）。这种病毒样颗粒具有很好的免疫原性,本身就可作为免疫佐剂,可以以胞吞或胞饮途径进入抗原提呈细胞,分别诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。研究表明,这种病毒样颗粒也可嵌合表达外源基因,并作为疫苗载体。口蹄疫（foot-and-mouth disease virus, FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。研究表明O型FMDV至少有5个B细胞表位,其中最重要的一个表位由VP1的141-160位（G-H环）和C端200-213位氨基酸残基线性表位组成,为最重要的B细胞表位,是FMDV最重要的抗原位点。且VP1的第141-160位氨基酸残基中也含有至少一种T细胞表位,能诱导FMDV专一性的T细胞应答。本研究在RHDV衣壳蛋白的C-端（在外）、N-端（在内）和306-307位分别插入单个外源B细胞表位（FMDV VP1B细胞表位200-213aa）和双串联B细胞表位（FMDV VP1141～160aa-GS-（200～213aa））,构建6种重组转移载体并在Sf9细胞中进行表达,通过电镜观察和动物实验,研究加入这些外源片段对VLPs的组装及其免疫原性的影响。主要试验和结果如下：1、本试验根据GenBank数据库RHDV皖阜株衣壳蛋白VP60的基因序列设计针对VP60基因的特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段,将PCR扩增产物克隆入载体pMD19-T,经酶切鉴定正确后,连接至真核表达载体,经酶切鉴定正确后与经退火磷酸化的FMDVB细胞表位连接,进行PCR鉴定、DNA测序。获得的重组质粒转化DH10Bac,蓝白斑筛选后进行PCR鉴定即获得重组转移载体。试验结果显示：本试验成功构建6种重组穿梭载体,分别命名为CF.306F、NF、CFB、306FB和NFB。2、用重组穿梭载体转染Sf9细胞。转染后观察细胞病变,当出现明显的细胞病变时,收获病毒。提取细胞内重组杆状病毒RNA进行RT-PCR鉴定,阳性的作为重组杆状病毒原液进行扩增和表达,并通过间接免疫荧光（IFA）、血凝试验、蛋白质电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-blot）等试验进行鉴定。试验结果显示：RT-PCR结果显示获得6种重组杆状病毒；IFA结果显示6种重组杆状病毒在Sf9细胞内表达；SDS-PAGE电泳分析6种嵌合蛋白均在Sf9细胞内表达,且大小约为65kDa; Western-blot显示6种嵌合蛋白（CF,306F、NF、CFB、306FB和NFB）均能被RHDV单抗A3C和牛O型FMDV多抗血清特异性识别,证明6种嵌合蛋白的载体和表位均具有良好的反应原性；本试验中表达的6种嵌合蛋白,仅NF和NFB有血凝性。3、6种嵌合蛋白经初步纯化后电镜观察。取表达的六种嵌合蛋白分别与弗氏佐剂1：1混合乳化,免疫ICR小鼠,并以RHDV灭活亚单位疫苗和O型FMDV合成肽疫苗作阳性对照,无菌PBS做阴性对照。免疫过程中对免疫小鼠进行尾静脉断尾采血,用间接ELISA测定0d、7d、14d、21d、28d、35d和42d血清内抗载体VP60和抗表位FMDV VP1ELISA抗体水平。结果显示：6种嵌合蛋白均能形成病毒样粒子（VLPs）,大小和形态与天然RHDV相似。6种嵌合蛋白通过皮下免疫的途径可诱导产生强烈抗载体VP60和中等强度抗FMDV VP1B细胞表位的体液免疫应答,其中嵌合蛋白NF针对载体和表位特异性抗体水平均最高；当插入外源片段长达126bp其表位抗体水平也保持较高水平,说明RHDV VLPs至少可以容纳126bp长度的基因；本研究中有无佐剂并不影响抗体水平；同时两种蛋白剂量大小（50ug/只和25ug/只）不影响表位抗体水平。本研究在分析了RHDV VLPs作为展示载体展示B细胞表位的可能性的基础上,在RHDV结构蛋白VP60的C-端、N-端和306～307aa处分别插入两种O型FMDV VP1蛋白的B细胞表位,成功构建6种重组穿梭载体,并在Sf9细胞中得到表达；免疫印迹显示其均具有良好的反应原性；电镜观察6种嵌合蛋白均可形成VLPs;动物实验显示RHDV-VLPs在小鼠体内能诱导强烈抗VP60和中等强度抗表位的体液免疫应答；RHDV-VLPs可以容纳长达126bp的外源片段也不影响其免疫原性。本研究为以RHDV VLPs为载体的多价疫苗研究提供理论基础,为后期评价RHDV VLPs展示系统奠定了基础。
严维巍[3]（2003）在《兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的表达及其免疫原性初探》文中认为兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease virus，RHDV）所致的兔的一种急性、高度传染性、高度致死性的疾病，以全身实质器官水肿、淤血及出血性变化为主要特征。根据RHDV的形态学、生物化学和分子生物学特性，国际病毒分类委员会最近将其归类于嵌杯样病毒科兔病毒属。该病毒为单股正义RNA病毒，基因组由7437个核苷酸组成，拥有两个开放阅读框架，分别编码多个蛋白，其中衣壳蛋白是RHDV的唯一结构蛋白，称为VP60，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。目前广泛使用的RHDV疫苗为组织灭活苗，虽然其长期以来一直具有良好的免疫效果，但具有其自身所不可避免的种种缺点。由于兔出血症病毒在体外组织细胞的培养方法尚未建立，所以，近年来，人们对RHDV疫苗的研究便主要着眼于基因工程苗的研制，其既能起到免疫预防作用，又能很好地解决组织灭活苗所带来的生物安全性问题。基于此，本研究在对RHDV不同分离株的VP60基因同源性进行广泛比较的基础之上，分别以大肠杆菌、昆虫细胞和毕赤酵母表达系统表达了中国株RHDV VP60基因，研究其抗原性和免疫原性，以期探索一条制备RHDV新型疫苗的途径。 本研究首先应用RT—PCR技术，从兔出血症病毒中国分离株WX84株中成功扩增出预期大小为1.7kb的衣壳蛋白基因特异性条带，将扩增产物提纯后克隆入pGEM-T载体，经转化、筛选及酶切鉴定后，获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆pGEM-T-VP60，序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1740bp，共编码580个氨基酸，该序列已被Genebank收录，登录号为AF402614，该序列为11扬州大学博士论文Genebank收录的第一株RHDV中国分离株完整VP6O序列，也是国内外最早克隆测序的RHDV中国分离株VP6O序列，并且该毒株还是世界上最早分离的RHDV毒株。与其它国家报道的多株RHDV序列进行比较发现，其相互间同源性高达98 .2%99.0%，其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%一99.1%，并且都没有碱基的插入和缺失，表明VP60是一个很保守的片段。该核酸序列与欧洲野兔综合征病毒（European br0Wn hare syndrome virus，EBHSV）和无致病性的兔嵌杯样病毒（Rabbit ealieivirus，RCV:）的核酸同源性则分别只有68.8%70.5%和85.8%86.5%之间，氨基酸同源性分别居74.5%75.0%和90.6%91.9%之间。 应用亚克隆技术将编码兔出血症病毒（RHDV）WX84株衣壳蛋白的VP60基因物按相应的阅读框架克隆到表达性载体pGEX一6P一1中谷胧甘肤转移酶（GST）基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，在1 .Olnmol/L IPTG浓度和37℃的条件下诱导，GST一VP60基因融合蛋白获了高效表达，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的20.52%。经聚丙烯酞胺凝胶电泳和Western一blot试验证实所表达的融合蛋白产物分子量与预期的87K Dal相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠，所得抗血清应用间接El.工SA检测，与RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明，大肠杆菌中表达的RHDV VP6O融合蛋白保留着天然衣壳蛋白的部分抗原性。但该表达产物与RHDV的天然高免血清反应强度较弱，提示着该表达产物在抗原性上与天然RHDV的Vp6O蛋白还存在着一定的差异，这可能与其融合有一个29Kd的谷胧甘肤（GST）有关。 为更好的研究重组VP印蛋白的的抗原性和免疫原性，利用亚克隆技术将RHDV的VP6O基因克隆入另一广泛使用的原核表达载体—PETS中进行表达研究。该载体仅融合有一个包括n个氨基酸的表达标签（T7*TAG），并且该表达标签经研究发现对大多数动物的免疫原性都极弱。将重组质粒PET5a--VP6O转化入大肠杆菌BL21（DE3）株，在0.4nunol/L IPTG浓度和37oC的条件下诱导3小时，VP60蛋白获了高效表达，表达的目的蛋白在菌体总蛋白中含量超过17.14%。经聚丙烯酞胺凝胶电泳和Western一blot试验证实所表达的蛋白产物分子量与预期的62K Dal相符。并且，该重组蛋白在Western一blot中与兔抗RHDV高免血清呈强阳性反应，对vP60两种融合蛋白的比较结果表明，融合蛋白中前导多肤的大小确实对被表达蛋白诸如抗原性等的生物学活性具有较大地影响。 昆虫杆状病毒表达系统是一种良好的真核表达体系，以其忠实高效表达而广严维巍:兔出血症病毒中国株衣壳蛋白墓因的表达及其免疫原性初探111泛应用于外源基因的体外表达及结构与功能研究。本研究为了构建表达阳DV VP60蛋白的重组杆状病毒，以心了H对含有RHDV VP60基因的重组克隆载体PG即一T-VP60进行单酶切，经琼脂糖凝胶电泳后回收R圣IDV VP60基因片断，并与抢了H单酶切的杆状病毒转移载体PBLUEBAc4和PBLUEBACHISB连接，以氛化钙法转化大肠杆菌TOP10F’株，获得T重组转移载体pBLUEBAC4一即60和pBLUEBACHISZB一VP60。在脂质体转染试剂介导下，将重组杆状病毒转移载体曲LUEBAc4一vP60和pBLUEBACH工SZB一vP6O与线性化的野生型杆状病毒DNA共转染对数生长期的Sfg昆虫细胞，经过三轮蚀斑纯化后，获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUEBAC4一vP60和PBLUEBAcHISZB一VP60。提取重组杆状病毒DN
刘怀然,关云涛,李昌文,张龄,姜骞,陈洪岩,曲连东[4]（2006）在《兔出血症抗体间接ELISA检测试剂盒的研制与初步应用》文中认为目的建立检测兔病毒性出血症（RHD）血清抗体的间接ELISA方法并组装成试剂盒,进行初步应用。方法通过差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯RHDV病毒粒子作为包被抗原,优化反应条件和筛选试剂,建立间接ELISA检测方法,组装试剂盒并对其总体性能进行评价。结果试剂盒敏感性为血凝抑制试验的432倍,重复性和特异性良好,保质期为4℃3个月。对105份兔血清进行随机检测,与血凝抑制试验的复核率为95%。结论本试剂盒可以在检测和科研中初步应用。
刘怀然,秦海斌,刘家森,单安山,曲连东[5]（2009）在《兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定》文中提出为建立兔出血症病毒（RHDV）的检测方法及为变异株监测做储备,用蔗糖密度梯度离心法纯化的RHDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合,以昆虫细胞-杆状病毒表达的重组VP60蛋白建立的间接ELISA法筛选抗RHDV单克隆抗体杂交瘤细胞,并对其主要生物学特性进行了鉴定。结果表明,筛选出6株单抗,它们分属于IgG1（AD4,AG10,DE2）I、gG2b（BC9,BE8）和IgM（BH3）亚类;这6株单抗杂交瘤细胞的平均染色体数为8789条,将其冻存6个月后复苏,在体外传20代的过程中分泌的抗体效价变化不大,具有很好的稳定性;Western-blot及免疫荧光分析表明,单抗DE2、AG10识别线性表位,其余4株单抗识别构象型表位;竞争ELISA试验表明,这6株单抗可识别5种抗原表位。
谭永贵[6]（2017）在《血红蛋白β亚基对RHDV复制的影响》文中研究说明兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV）是杯状病毒科兔病毒属的一个成员,能够引起成年家兔的兔病毒性出血症,俗称“兔瘟”。兔出血症是由兔出血症病毒引起的一种急性、败血性高度致死性传染病,死亡率高达100%,对养兔业具有毁灭性打击。因为缺少合适的细胞培养系统,目前对RHDV的分子生物学研究很落后,特别是对兔病毒性出血症病毒的分子致病机理的认识仍然较少,所以有必要加强对该病毒的分子生物学基础研究。RHDV基因组长约7.5kb,含有两个开放阅读框（open reading frame,ORF）,ORF1和ORF2,ORF1编码一个大小约为257 kDa多聚蛋白,该多聚蛋白又被裂解为7个非结构蛋白和1个结构蛋白（VP60）,ORF2编码次级结构蛋白（VP10）。本实验室前期工作发现:兔病毒性出血症病毒的VPg蛋白能够与宿主的翻译起始因子帽子结合蛋白eIF4E（eukaryotic initiation factor 4E）互作,这种相互作用是RHDV翻译起始所需要的;VP60是兔瘟病毒的衣壳蛋白,含有579个氨基酸,相对分子质量为60 kDa。VP60在病毒的感染、复制和免疫过程中占有重要地位。由于该病毒一直缺乏有效的体外增殖细胞系,有关RHDV的分子致病机理研究进展十分缓慢,对于其与宿主之间的相互作用研究的更少。鉴于此,本论文拟筛选与病毒衣壳蛋白相互作用的宿主因子,并研究它们之间的互作对病毒复制的影响,以期为研究RHDV的感染及致病机理提供重要线索。本论文开展的研究内容主要包括以下三个方面。（1）利用CRISPR/Cas9技术构建了含血红蛋白β亚基的sgRNA的PX459-sg RNA重组质粒,并转染RK-13细胞,通过嘌呤霉素筛选阳性克隆,并提取细胞基因组DNA,设计引物对sgRNA靶点邻近位点约500bp的基因组DNA片段进行PCR扩增,并通过测序鉴定以及WB验证,结果表明成功建立了稳定敲除HB的RK-13细胞系,并命名为RK-ΔHB细胞。本工作能够为研究HB在病毒生命进程中的作用提供研究平台。（2）为了检测生物样品中的RHDV的含量,我们建立了基于SYBR Green能够实时检测RHDV复制水平的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的RHDV和RHDV2 VP60基因保守区序列设计一对特异性引物进行qPCR扩增;RHDV和RHDV2熔解温度分别为（86.3±0.1）℃和（85.1±0.1）℃,并且只观察到一个特异性峰。这些结果显示该方法不仅能够灵敏、准确特异地检测RHDV的复制,而且结合熔解曲线分析该方法也能够快速地鉴别RHDV和RHDV2。（3）我们利用CO-IP技术筛选出了与VP60相互作用的宿主蛋白,其中包含HB蛋白。我们对HB蛋白进行进一步研究。利用免疫共沉淀、GST pull down、亚细胞定位实验证实了VP60和HB两者存在相互作用,并且存在共定位现象。我们也发现在RK-13细胞中过表达HB基因能够抑制RHDV复制过程,而敲除HB基因的细胞系中RHDV复制水平得到促进。综上所述,本论文首次用实验证明血红蛋白B亚基能够与RHDV VP60蛋白相互作用,这种相互作用对RHDV的复制具有一定的抑制作用,缺失RK-13细胞中HB的表达,RHDV的复制水平得到提高。该研究结果为进一步研究RHDV的致病机制以及病原与宿主的互作提供了线索。
秦海斌,刘怀然,刘家森,姜骞,韩凌霞,司昌德,曲连东[7]（2007）在《兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法》文中研究说明用RHDV单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立兔瘟病毒（RHDV）抗原捕获ELISA检测方法,优化反应条件并对该方法的敏感性、特异性、重复性、稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被浓度为1μg/mL,兔多抗血清最佳浓度为4μg/mL,本方法可特异性地检测出兔肝脏病料中的RHDV,纯化病毒的最低检出量为26ng/mL,对已知阳性样品的检测显示,捕获ELISA检测的病毒滴度是HA实验的313倍,对67份可疑病料,捕获ELISA阳性检出率为62.7%,HA实验阳性检出率为55.2%,用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。本方法敏感性、特异性、稳定性良好,可应用于RHDV的快速、批量、特异检测。
刘长明[8]（1996）在《兔出血症病毒结构蛋白及其降解产物的分析》文中指出采用弗里昂１１３抽提结合蔗糖梯度密度离心法从人工感染兔出血症（ＲＨＤ）病兔肚脏组织中纯化ＲＨＤ病毒，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，ＲＨＤＶ由一种结构蛋白构成，分子量为６０ＫＤ，称为ＶＰ６０。应用抗ＲＨＤＶ单克隆抗体进行免疫印迹试验表明，ＶＰ６０可发生蛋白降解，其产物有３８ＫＤ、２８ＫＤ和２６ＫＤ几种多肽成分．
王延树[9]（2007）在《嵌合体杯状病毒的构建及FCV抗原表位的表达研究》文中研究说明兔出血症是1984年最早发生于我国的一种对家兔及野兔危害极大的烈性传染病。目前已遍及世界各地,对养兔业造成了极大的损失。为了制备RHDV的疫苗,本试验用同是杯状病毒科的猫杯状病毒作为载体,插入兔出血症病毒的主要衣壳蛋白编码基因,以期用猫杯状病毒在细胞上可以培养的特性,表达出兔出血热病毒的衣壳蛋白,使它组装成病毒空衣壳。构建了重组质粒pUC-FCVm-VP60,用限制性内切酶将质粒线性化,用体外转录试剂盒将DNA转化成RNA,用脂质体转染试剂盒将其转染到细胞内进行表达。同时为研究猫杯状病毒的保护性抗原位点,本试验还表达了猫杯状病毒的主要保护位点,构建重组表达质粒pET-FCV,在表达菌中获得了表达,利用原核表达的融合蛋白为包被抗原建立了检测抗猫杯状病毒血清抗体的间接ELISA方法。结果表明:（1）获得了兔出血症病毒衣壳编码基因正向插入猫杯状病毒的重组质粒pUC-FCVm-VP60。（2）以猫杯状病毒为载体表达了兔出血症病毒的VP60,为探索杯状病毒载体和兔出血症的免疫打下坚实的基础。（3）构建了原核表达质粒载体pET-FCV,并获得了在E.coli中的表达产物,表达量为20%。经Western blotting检测具有一定的反应原性。（3）初步建立了基于重组蛋白的猫杯状病毒血清抗体的间接ELISA检测方法
孙培姣,周迎春,于雪,李本科,王辉暖,王雅雯,于新友,杨慧,王蓉,李振伟,王玉茂,沈志强,肖跃强[10]（2021）在《基于重组截短RHDV VP60蛋白的间接ELISA抗体检测方法》文中研究说明为了建立一种快速、特异、敏感的RHDV抗体检测方法,对VP60蛋白基因的抗原表位区域进行分析,截取VP60-1、VP60-2、VP60-3、VP60-semi1和VP60-semi2,大肠杆菌表达后纯化获得重组截短蛋白。经抗原、抗体结合反应比较,以VP60-semi1为包被抗原检测效果最好,并建立了基于重组蛋白VP60-semi1的间接ELISA抗体检测方法。经优化,该方法的最佳条件:抗原包被质量浓度为0.1μg/孔,4℃包被过夜;5%脱脂奶粉37℃封闭1 h;血清稀释度为1∶200,37℃孵育1 h;最后37℃作用显色15 min。该方法与血凝抑制（HI）检测相比,敏感性好,阳性血清稀释至1∶6 400仍可检出;批内、批间变异系数分别为0.46%～4.97%和2.68%～8.88%,重复性好;符合率检测显示,与HI法的符合率为89.29%,与免疫保护试验结果符合率为100%。结果表明,建立了一种基于重组蛋白VP60-semi1的间接ELISA抗体检测方法,可用于监测兔群免疫后抗体水平动态并指导疫苗免疫,以及该病的流行病学调查等。
二、兔出血症病毒结构蛋白及其降解产物的分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、兔出血症病毒结构蛋白及其降解产物的分析（论文提纲范文）
（1）兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 兔出血症研究进展 |
| 1.1 病原研究 |
| 1.1.1 病毒的分类 |
| 1.1.2 病毒的形态 |
| 1.1.3 RHDV 的基因组研究 |
| 1.2 RHD 的流行病学 |
| 1.2.1 易感动物 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 流行状况 |
| 1.3 RHD 的诊断 |
| 1.3.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.3.2 实验室诊断 |
| 1.4 RHD 的防控及新型疫苗的研究 |
| 1.4.1 基因工程亚单位疫苗 |
| 1.4.2 重组病毒活载体苗 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 单克隆抗体技术的发展及应用 |
| 2.1 单抗技术的基本原理 |
| 2.2 单克隆抗体的生产过程 |
| 2.3 单克隆抗体技术研究进展 |
| 2.3.1 人源化单克隆抗体 |
| 2.3.2 全人化抗体 |
| 2.4 单克隆抗体生产技术的进展 |
| 2.5 单抗在动物病毒性传染病方面的应用 |
| 2.5.1 单抗对病毒抗原结构与抗原表位的研究 |
| 2.5.2 单抗在免疫学诊断上的应用 |
| 2.5.3 单抗在抗病毒感染方面的应用 |
| 2.6 RHD 单克隆抗体研究及应用 |
| 2.7 小结 |
| 第三章 兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株与细胞 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 抗原制备及纯化 |
| 3.2.2 免疫小鼠 |
| 3.2.3 SP2/0 细胞准备 |
| 3.2.4 饲养层细胞制备 |
| 3.2.5 免疫脾细胞 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 间接ELISA 检测方法建立 |
| 3.2.8 杂交瘤细胞筛选及克隆 |
| 3.2.9 小鼠腹水的制备及纯化 |
| 3.2.10 单克隆抗体特性鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 纯化RHDV 免疫电镜 |
| 3.3.2 小鼠免疫水平 |
| 3.3.3 杂交瘤细胞制备 |
| 3.3.4 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.3.5 单抗效价测定 |
| 3.3.6 腹水中单抗HI 活性测定 |
| 3.3.7 杂交瘤细胞染色体数分析 |
| 3.3.8 杂交瘤细胞稳定性 |
| 3.3.9 McAb 抗原识别位点分析 |
| 3.3.10 单抗的SDS-PAGE 分析 |
| 3.3.11 单抗特异性Western-blot 鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 抗原捕获ELISA 检测兔出血症病毒的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 病毒和抗体 |
| 4.1.3 材料与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 RHDV 多克隆抗体制备 |
| 4.2.2 RHDV 单克隆抗体制备 |
| 4.2.3 单抗及多克隆抗体纯化 |
| 4.2.4 RHDV 抗原样品 |
| 4.2.5 抗原捕获ELISA 方法的建立 |
| 4.2.6 抗原捕获ELISA 工作条件的优化 |
| 4.2.7 判定标准 |
| 4.2.8 兔出血症抗原捕获ELISA 检测方法性能评价 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 抗体与抗原对照样品的制备 |
| 4.3.2 抗原捕获ELISA 方法的建立 |
| 4.3.3 抗原捕获ELISA 工作条件的优化 |
| 4.3.4 兔出血症抗原捕获ELISA 检测方法性能评价 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 兔病毒性出血症病毒(RHDV)研究进展 |
| 1 RHDV的分类 |
| 2 RHDV的生物学特性 |
| 2.1 RHDV的形态特征 |
| 2.2 RHDV的理化特性 |
| 2.3 RHDV的血凝特性 |
| 2.4 RHDV血清型及进化特点 |
| 2.5 RHDV的抗原性 |
| 2.6 RHDV的致病性 |
| 2.7 RHDV的培养 |
| 2.8 RHDV的诊断 |
| 3 RHDV的分子生物学研究进展 |
| 3.1 RHDV的结构 |
| 3.2 RHDV的结构蛋白 |
| 3.3 RHDV的非结构蛋白 |
| 3.4 亚基因组 |
| 4 病毒样颗粒(VLPs)的研究进展 |
| 4.1 VLPs的形成 |
| 4.2 VLPs的来源 |
| 4.3 VLPs的免疫原性 |
| 5 RHDV VP60研究新进展 |
| 6 FMDV表位研究动态 |
| 参考文献 |
| 第一章 6种携带口蹄疫病毒B细胞表位的重组转移载体的构建 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第二章 6种嵌合蛋白的表达及鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 6种嵌合蛋白的空间构象和免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的表达及其免疫原性初探（论文提纲范文）
| 1 文献综述 兔出血症病毒(RHDV)研究进展 |
| 1.1 RHDV的概况 |
| 1.2 RHDV的分子生物学 |
| 1.2.1 病毒的形态 |
| 1.2.2 病毒的基因组 |
| 1.2.3 病毒的RNA |
| 1.2.4 病毒的非结构蛋白 |
| 1.2.5 病毒的结构蛋白 |
| 1.2.6 病毒的3′端ORF |
| 1.3 RHDV的诊断与检测 |
| 1.4 RHDV的疫苗 |
| 1.5 参考文献 |
| 2 研究内容 |
| 2.1 研究一 兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 2.1.4 参考文献 |
| 2.2 研究二 中国株兔出血症病毒衣壳蛋白基因在大肠杆菌中与谷胱苷肽的融合表达及其鉴定 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.2.4 参考文献 |
| 2.3 研究三 利用PET载体在大肠杆菌中表达兔出血症病毒衣壳蛋白基因 |
| 2.3.1 材料与方法 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.3.3 讨论 |
| 2.3.4 参考文献 |
| 2.4 研究四 在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋白 |
| 2.4.1 材料与方法 |
| 2.4.2 结果 |
| 2.4.3 讨论 |
| 2.4.4 参考文献 |
| 2.5 研究五 兔出血症病毒衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的胞内表达和分泌表达 |
| 2.5.1 材料与方法 |
| 2.5.2 结果 |
| 2.5.3 讨论 |
| 2.5.4 参考文献 |
| 2.6 研究六 兔出血症病毒衣壳蛋白基因表达产物的制备及其免疫原性初探 |
| 2.6.1 材料与方法 |
| 2.6.2 结果 |
| 2.6.3 讨论 |
| 2.6.4 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的主要论文 |
（4）兔出血症抗体间接ELISA检测试剂盒的研制与初步应用（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 种毒与病料 |
| 1.2 对照血清 |
| 1. 3 其他 |
| 2 方法 |
| 2.1 间接ELISA方法建立 |
| 2.1.1 病毒提纯[2、3]: |
| 2.1.2 对照抗原制备: |
| 2.1.3 包被抗原最适稀释度确定: |
| 2.1.4 血清最适稀释度确定: |
| 2.1.5 酶标抗体最适稀释度确定: |
| 2.1.6 各个步骤作用时间选择: |
| 2.1.7 结果判定: |
| 2.2 试剂盒总体性能评价 |
| 2.2.1 敏感性试验: |
| 2.2.2 特异性试验: |
| 2.2.3 重复性试验: |
| 2.2.4 与进口试剂盒做比对实验: |
| 2.2.5 保存期试验: |
| 2.2.6 试剂盒的初步应用: |
| 3 结果与结论 |
| 3.1 病毒提纯 |
| 3.2 间接ELISA检测方法条件优化 |
| 3.3 试剂盒总体性能评价结果 |
| 4 讨论 |
（6）血红蛋白β亚基对RHDV复制的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 兔出血症及兔出血症病毒概述 |
| 1.1.1 兔出血症 |
| 1.1.2 兔出血症病毒 |
| 1.2 兔出血症病毒的蛋白及其功能 |
| 1.2.1 结构蛋白 |
| 1.2.2 非结构蛋白 |
| 1.2.3 RHDV的细胞受体 |
| 1.3 血红蛋白概述 |
| 1.4 蛋白相互作用研究技术 |
| 1.4.1 双杂交系统 |
| 1.4.2 免疫共沉淀 |
| 1.4.3 pull down实验 |
| 1.4.4 蛋白质共定位 |
| 1.4.5 其他蛋白质互作技术 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 第二章 利用CRISPR/CAS9基因编辑技术构建缺失HB基因的RK-13 细胞系 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sgRNA设计和寡核苷酸链合成 |
| 2.2.2 pX459-HB重组质粒的构建 |
| 2.2.3 细胞转染及阳性细胞筛选 |
| 2.2.4 HB基因敲除细胞株鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组质粒构建鉴定 |
| 2.3.2 HB基因敲除株的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 RHDV荧光定量PCR（qPCR）检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒与毒株 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PCR引物设计与合成 |
| 3.2.2 模板制备 |
| 3.2.3 荧光定量PCR最佳条件选择 |
| 3.2.4 标准曲线建立 |
| 3.2.5 熔解曲线建立 |
| 3.2.6 特异性实验 |
| 3.2.7 敏感性实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 目的基因片段的扩增 |
| 3.3.2 荧光定量PCR反应条件优化 |
| 3.3.3 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.3.4 熔解曲线分析 |
| 3.3.5 特异性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 血红蛋白 Β 亚基对RHDV复制的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞系、抗体与载体 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要缓冲液的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 质粒构建 |
| 4.2.2 CO-IP钓取宿主蛋白 |
| 4.2.3 GST-HB的原核表达 |
| 4.2.4 免疫共沉淀（Co-IP）实验 |
| 4.2.5 GST-Pull Down实验 |
| 4.2.6 蛋白共定位 |
| 4.2.7 qRT-PCR分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CO-IP钓取宿主蛋白结果 |
| 4.3.2 GST-HB的原核表达 |
| 4.3.3 免疫共沉淀（Co-IP）实验结果 |
| 4.3.4 GST pull down验证VP60与HB的相互作用 |
| 4.3.5 激光共聚焦蛋白共定位 |
| 4.3.6 HB蛋白对RHDV复制的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 种毒与病料 |
| 1.2 RHDV单抗 |
| 1.3 主要试剂和器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗原捕获ELISA方法建立 |
| 2.1.1 RHDV多克隆抗体制备: |
| 2.1.2 单抗及多克隆抗体纯化: |
| 2.1.3 RHDV阴、阳性抗原样品及被检样品处理: |
| 2.1.4 酶标板均一性测定[5-6]: |
| 2.1.5 单抗最适包被浓度及多抗最适工作浓度的测定: |
| 2.1.6 酶标抗体最适工作浓度测定: |
| 2.2 抗原捕获ELISA检测条件的优化 |
| 2.3 阳性、阴性抗原对照 |
| 2.4 判定标准[7] |
| 2.5 抗原捕获ELISA方法性能评价 |
| 2.5.1 特异性阻断试验[8]: |
| 2.5.2 灵敏度测定: |
| 2.5.3 现地样品检测: |
| 2.5.4 重复性实验: |
| 3 结果 |
| 3.1 抗原捕获ELISA方法的建立 |
| 3.1.1 兔抗RHDV多克隆抗体及单克隆抗体的制备: |
| 3.1.2 RHDV阳性、阴性抗原样品: |
| 3.1.3 酶标板均一性和结合率测定: |
| 3.1.4 单抗最适包被浓度及多抗最适工作浓度测定结果: |
| 3.1.5 酶标抗体最适工作浓度测定: |
| 3.2 双抗体夹心ELISA条件优化 |
| 3.3 阳性、阴性抗原对照 |
| 3.4 抗原捕获ELISA方法性能评价 |
| 3.4.1 特异性阻断试验: |
| 3.4.2 灵敏度测定: |
| 3.4.3 现地样品检测: |
| 3.4.4 重复性实验: |
| 4 讨论 |
（9）嵌合体杯状病毒的构建及FCV抗原表位的表达研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 兔出血症病毒研究概况 |
| 第二章 猫杯状病毒的分子生物学研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 重组杯状病毒转移载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 嵌合体杯状病毒在F81 细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 FCV 主要保护性抗原基因在大肠杆菌中的表达以及间接ELISA检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（10）基于重组截短RHDV VP60蛋白的间接ELISA抗体检测方法（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、菌株、血清及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 重组蛋白的表达、纯化 |
| 1.4 重组蛋白包被抗原筛选 |
| 1.5 重组蛋白ELISA反应参数的优化 |
| 1.5.1 包被浓度与包被条件优化 |
| 1.5.2 封闭介质优化 |
| 1.5.3 抗体作用时间优化 |
| 1.5.4 显色条件优化 |
| 1.6 重组蛋白ELISA判断标准 |
| 1.7 重组蛋白ELISA敏感性试验 |
| 1.8 重复性试验 |
| 1.8.1 批内重复试验 |
| 1.8.2 批间重复试验 |
| 1.9 比较性试验 |
| 1.9.1 与HI方法的比较试验 |
| 1.9.2 与免疫保护试验的比较试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的表达纯化与活性鉴定 |
| 2.2 重组蛋白抗原敏感性的ELISA检测结果 |
| 2.3 VP60-semi1 ELISA最佳反应条件的确定 |
| 2.3.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 2.3.2 蛋白最佳包被温度和时间的确定 |
| 2.3.3 最佳封闭液的确定 |
| 2.3.4 血清最佳作用时间的确定 |
| 2.3.5 底物最佳显色时间的确定 |
| 2.4 VP60-semi1 ELISA判定标准 |
| 2.5 敏感性试验 |
| 2.6 重复性试验 |
| 2.6.1 批内重复结果 |
| 2.6.2 批间重复结果 |
| 2.7 符合性试验结果 |
| 2.7.1 与HI法的符合率 |
| 2.7.2 与免疫保护试验的符合率 |
| 3 讨论 |
四、兔出血症病毒结构蛋白及其降解产物的分析（论文参考文献）
- [1]兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立[D]. 秦海斌. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [2]携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究[D]. 盛蓉. 南京农业大学, 2011(04)
- [3]兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的表达及其免疫原性初探[D]. 严维巍. 扬州大学, 2003(04)
- [4]兔出血症抗体间接ELISA检测试剂盒的研制与初步应用[J]. 刘怀然,关云涛,李昌文,张龄,姜骞,陈洪岩,曲连东. 中国实验动物学报, 2006(01)
- [5]兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 刘怀然,秦海斌,刘家森,单安山,曲连东. 中国兽医科学, 2009(02)
- [6]血红蛋白β亚基对RHDV复制的影响[D]. 谭永贵. 中国农业科学院, 2017(05)
- [7]兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法[J]. 秦海斌,刘怀然,刘家森,姜骞,韩凌霞,司昌德,曲连东. 中国比较医学杂志, 2007(08)
- [8]兔出血症病毒结构蛋白及其降解产物的分析[J]. 刘长明. 中国畜禽传染病, 1996(01)
- [9]嵌合体杯状病毒的构建及FCV抗原表位的表达研究[D]. 王延树. 吉林大学, 2007(05)
- [10]基于重组截短RHDV VP60蛋白的间接ELISA抗体检测方法[J]. 孙培姣,周迎春,于雪,李本科,王辉暖,王雅雯,于新友,杨慧,王蓉,李振伟,王玉茂,沈志强,肖跃强. 中国兽医学报, 2021(07)