一、牛猪轮状病毒血清分型及其抗原性比较（论文文献综述）
崔鑫[1]（2019）在《新疆南疆部分规模奶牛场轮状和冠状病毒流行病学调查》文中指出牛轮状病毒（Bovine Rotavirus,BRV）和牛冠状病毒（Bovine Coronavirus,BCoV）是引起牛消化道疾病中的重要病原之一,这两种病毒所引起的犊牛腹泻临床症状极为相似,难以区分,病牛多表现为精神顿挫,脱水性腹泻,粪便成黄白色或灰白色,严重影响了犊牛的生长发育,对养牛业造成了一定的经济损失。因此,掌握本地区BRV与BCoV的感染情况对其防治有着一定的指导意义。本试验对新疆南疆部分规模奶牛场BRV与BCoV进行了ELISA抗原检测和分子流行病学调查,其结果为:1.在临床诊断、病理组织学检查的基础上,采用荧光定量PCR的方法对新疆南疆某规模奶牛场腹泻犊牛进行检测,其结果表明该规模奶牛场存在BRV感染;2.2018年度对新疆南疆12个规模奶牛场325份粪便样品进行Rota-Corona抗原ELISA检测,其中BRV的抗原阳性率为15.69%,BCoV的抗原阳性率为9.54%,且存在混合感染,两种病毒混合感染抗原阳性率为6.77%;3.2018年,分别从11个经ELISA检测为BRV感染的规模奶牛场中,各选取1份OD值最高的样品进行RT-PCR分型鉴定,结果有10份样品得到1062bp大小的目的条带,7份为715bp大小的目的条带,核苷酸同源性比对确定为G10型BRV;4.2018年,经Rota-Corona抗原ELISA检测为BCoV阳性的样品进行病毒分离培养和RT-PCR鉴定,病毒分离培养出现CPE,在此基础上通过RT-PCR检测,得到730bp大小的目的条带,通过核苷酸同源性比对和遗传进化树构建证实为BCoV,并获得其分离株。本研究采用临床诊断、病理观察、抗原ELISA检测、分子流行病毒调查、病毒分离培养等方法对新疆南疆部分规模奶牛场腹泻犊牛开展了相应研究,掌握了新疆南疆地区BRV与BCoV的感染情况并获得了其流行病学资料,为BRV与BCoV的综合防控提供了参考依据。
陈欣[2]（2018）在《大熊猫轮状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用》文中进行了进一步梳理大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）属于我国独有且濒危珍稀的野生物种,受制于大面积栖息地碎片化和隔离小种群导致无法自然繁殖,大熊猫迁地保护工作因此尤为重要。大熊猫轮状病毒（Giant Panda Rotavirus,GPRV）感染常引起幼兽的腹泻,甚至死亡,是一种严重危害大熊猫迁地保护的疾病。轮状病毒诊断方法多样,各具优缺点,对于发生腹泻性疾病的大熊猫而言,快速且准确的区分是否轮状病毒感染所致,能为临床处置赢得宝贵的时间和提供方向性指导。近年来,实时荧光定量PCR技术（Real-time Fuorescence Quantitative PCR,qPCR）在人类重大公共卫生疫病的诊断中发挥了重大作用,被认为是极其高效的诊断方法。本研究依据GenBank中登录的GPRV VP4基因序列设计1对引物,通过对引物浓度、退火温度和循环数的优化,绘制标准曲线,建立一种能快速准确定量检测样品中的GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法,使本方法敏感度达1.0×100拷贝/μL;同时通过对重组质粒各稀释度核酸样品进行常规RT-PCR检测,其敏感度可达1.0×102拷贝/μL。由此可见,GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度高出至少100倍。利用建立的GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法检测CDV、CPV、CAV-1和CAV-2的核酸,结果均呈阴性,表明该法特异性强,结果可靠。重复性试验显示批内及批间的变异系数（CV）均小于1%,说明该方法的重复性良好,结果稳定。因此本研究建立的GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法可以满足对大熊猫腹泻样本的轮状病毒感染快速、准确、灵敏诊断。应用本研究建立的GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法对227份不同时期、不同个体的大熊猫粪便进行检测,同时进行常规RT-PCR检测方法对比,2015年6月采集的A基地样品常规RT-PCR的检出率为8.1%,而实时荧光定量RT-PCR的检出率为13.5%;2011-2013年采集的B基地样品常规RT-PCR的检出率为14.3%,而实时荧光定量RT-PCR的检出率为19%,同样,2015年6月采集样品常规RT-PCR的检出率为0,而实时荧光定量RT-PCR的检出率为12%,实时荧光定量RT-PCR检测方法均表现出更好的灵敏度。同时在研究应用中发现其对做好大熊猫携带轮状病毒的疫源疫病本底调查和疾病防控都极具指导作用。因此,本研究建立的GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法对做好大熊猫种群健康管理,优化大熊猫对外展示,指导野化放归大熊猫选择,完善野外救护大熊猫疾病监测都具有极其重要的价值。
杨涛涛[3]（2018）在《湖南地区猪捷申病毒和猪萨佩罗病毒的分子流行病学和基因特性研究》文中指出猪捷申病毒（porcine teschovirus,PTV）和猪萨佩罗病毒（porcine sapelovirus,PSV）同属于小RNA病毒科,分别属于捷申病毒属和萨佩罗病毒属,在猪群中存在广泛,感染PTV或PSV能导致猪的腹泻、呼吸道疾病、脑脊髓灰质炎等,甚至死亡。为了解湖南省猪群中PTV和PSV的感染情况以及流行毒株的分子特征,我们建立了分别用于检测PTV和PSV的RT-PCR方法,应用这两种方法对其他常见的猪病毒性病原的DNA或cDNA进行PCR扩增均无特异性条带出现,证明其具有强的特异性;PTV-RT-PCR方法最低能够检测到36.4 copies/μL的含PTV目的片段的质粒DNA,PSV-RT-PCR方法最低能够检测到58.9 copies/μL的含PSV目的片段的质粒DNA,从而证明了这两种RT-PCR方法的敏感性高。2014年2017年,从湖南省的42个猪场共采集了460份粪便样品和118份肠道内容物样品,应用PTV-RT-PCR方法对猪群中PTV的感染情况进行调查后发现猪群感染PTV的总体阳性率达到14.88%,其中在保育阶段（16.44%）和育肥阶段（20.55%）的感染率要明显高于哺乳仔猪阶段（9.18%）,另外健康猪群中PTV的感染率（19.06%）要明显高于腹泻猪群（7.87%）,且在健康猪群中鉴定出的PTV基因型种类（15种基因型）要比在腹泻猪群中（8种基因型）鉴定出的多。目前报道PTV至少包含13种基因型（PTV 1-13）,在对PTV阳性样品的基因型进行鉴定后发现多种PTV基因型（除了PTV 7和PTV 8）在猪群中共同传播,这表明湖南地区流行的PTV毒株存在着广泛的基因多样性,且PTV不同基因型的毒株或同一基因型的不同毒株发生混合感染的情况普遍存在,在感染PTV的猪群中占比26.74%,此外在本研究中还鉴定出4种新的PTV基因型（暂命名为PTV 14–17）,这在全球范围内是首次报道。应用PSV-RT-PCR方法对猪群中PSV的感染情况进行调查后发现猪群感染PSV的总体阳性率达到42.21%,其中在保育阶段和育肥阶段的感染率分别为60.44%和49.32%,要明显地高于在哺乳仔猪阶段的感染率（17.39%）,另外健康猪群中PSV的感染率（48.34%）要明显高于腹泻猪群（31.94%）。除此之外,PTV和PSV在猪群中的共感染率达到9.86%。这些结果表明PTV和PSV在猪群中广泛流行,且存在着共同感染的情况,两种病毒的感染规律相似,感染高峰期均集中在保育阶段和育肥阶段,此外,无论是PTV还是PSV,健康猪群中的感染率均较高,这说明猪群感染PTV和PSV在多数情况下并不表现出临床症状。将PTV阳性样品接种PK-15细胞,经基因型鉴定为PTV 13-17的部分样品接种ST细胞,连续传代3次后经RT-PCR鉴定共分离得到66株PTV,完成了对其中42株PTV的近全基因组序列以及3株PTV的全长VP1基因序列的测序,将完成测序的这些毒株分别命名为PTV HuN1-45,并将序列上传至GenBank数据库。45株PTV-HuNs与其他的参考毒株的基因组序列比对结果显示PTV的多聚蛋白基因包含6609-6651个碱基,编码2202-2217个氨基酸,根据VP1基因和核衣壳蛋白基因序列的进化分析,所有的PTV毒株可以明显地分为17个主要的基因型（PTV 1-17）,本研究共分离到其中的8种基因型（PTV 2-6,9,11,17）,其中PTV 3-6,9,11毒株的分离在国内是首次报道,2株PTV 17的分离在世界范围内是首次报道。重组分析显示PTV-HuNs中存在着9种重组事件（包括15个重组毒株）,其中包括8个基因型间的重组事件和1个基因型内部的重组事件,另外还发现了2个重组断裂热点（多聚蛋白基因的1410位和3500位附近）。PTV-HuNs与现有的PTV参考毒株多聚蛋白基因的核酸突变率和最近共同祖先起源时间的评估结果表明PTV多聚蛋白基因每年每个位点的核酸突变率达到5.00×10-4,PTV的最近共同祖先起源于511年前。另外PTV多聚蛋白基因的压力选择分析结果表明纯化选择在PTV的核苷酸突变选择中起到主导作用,仅发现有少量的阳性选择位点。将PSV阳性样品接种PK-15细胞,连续传代3次后经RT-PCR鉴定共分离得到43株PSV,完成了对其中33株PSV的近全基因组序列测序,将完成测序的这些毒株分别分别命名为PSV HuN1-33,并将序列上传至GenBank数据库。33株PSV-HuNs与其他的PSV参考毒株的基因组序列比对结果显示PSV的多聚蛋白基因包含6972-7005个碱基,编码2323-2334个氨基酸,其中多数PSV-HuNs株的多聚蛋白基因由6996个碱基组成,编码2332个氨基酸,PSV毒株之间多聚蛋白氨基酸序列的差异与VP1基因C末端部分氨基酸残基的插入或缺失有关。PSV-HuNs的核衣壳蛋白基因序列的进化及基因遗传距离分析结果表明PSV-HuNs之间存在着高的基因多样性,另外通过构建3CD基因的进化树发现,PSV-HuNs各个毒株在该进化树的位置与在根据衣壳蛋白基因序列构建的进化树上的位置有着明显的不一致,因此我们推测在PSV-HuNs的进化过程中可能发生过重组。重组分析显示PSV-HuNs株中存在着6种重组事件（包括8个重组毒株）,且发现一个潜在的重组热点区（P1区的3’端附近）。PSV多聚蛋白基因的压力选择分析结果表明纯化选择同样在PSV的核苷酸突变选择中起到主导作用,仅发现有少量的阳性选择位点。总的来说,本研究建立了具有特异性强、敏感性高且重复性好等特点的检测PTV和PSV的RT-PCR方法,并采用该方法对湖南地区猪群中PTV和PSV的分子流行情况进行了调查,进而阐明了PTV和PSV在猪群中的流行规律和特点;此外,PTV和PSV流行毒株的基因特性研究表明湖南省内流行的PTV和PSV毒株均存在着广泛的基因多样性,强的纯化选择作用和病毒基因重组对PTV和PSV的进化起到了重要的作用。因此,本研究为PTV和PSV的分子流行病学研究和病原分子基因特性研究打下了坚实的基础,为预防和控制由相关病原可能引起的疾病的发生提供早期的预警和监测,避免对养猪业造成经济损失。
罗国兴[4]（2018）在《人源轮状病毒VP4截短蛋白的原核表达及其与轮状病毒候选基因工程疫苗P2-VP8的比较研究》文中研究指明A组轮状病毒（RV）是引起婴幼儿严重腹泻的主要病原体,严重时导致死亡,疫苗接种是预防轮状病毒感染的有效手段。随着卫生条件的改善以及轮状病毒疫苗的推广,轮状病毒导致的发病率和死亡率均显着降低。但是,目前上市的疫苗均为减毒活疫苗,在轮状病毒导致的死亡率较高的欠发达地区的保护率低于50%,因此,急需发展更加安全有效的轮状病毒疫苗以降低轮状病毒感染导致的死亡率。高滴度的母源抗体是导致轮状病毒疫苗在这些地区保护率降低的主要原因之一。非复制型疫苗,特别是基因工程疫苗,由于安全性高,且通过肠道外免疫可以在一定程度上避免母源抗体的干扰,成为近年来研究的重点。本课题组在前期研究中基于大肠杆菌系统表达了截短羊轮状病毒的VP4*（aa26-476）蛋白,并通过小鼠模型证实该蛋白具有较好的免疫原性和免疫保护性。在前期工作的基础上,我们进一步表达了在婴幼儿中流行最为广泛的P[8]型轮状病毒Wa毒株的VP4*蛋白,并与目前已经进入临床Ⅰ、Ⅱ期的轮状病毒候选基因工程疫苗P2-VP8进行平行比较,研究其成为轮状病毒候选疫苗的可行性。结果发现:重组表达的VP4*和P2-VP8均具有较好的均一性和热稳定性;VP4*蛋白相比P2-VP8具有更强的中和抗体结合能力,并且在豚鼠和家兔中均具有更高的免疫中和和活性;此外,重组表达的VP4*蛋白在小型猪以及灵长类动物食蟹猴中也均具有较高的免疫原性和免疫中和活性;VP4*免疫血清不仅可以中和同型轮状病毒的感染,对异型毒株也具有交叉中和活性。综上所述,原核表达P[8]型人源轮状病毒VP4*蛋白具有较高的均一性、热稳定性,相比临床Ⅰ、Ⅱ期的基因工程疫苗P2-VP8具有更高的抗原性和免疫中和活性,且在小型猪和食蟹猴中也具有较高的免疫原性。因此,VP4*相比P2-VP8更适合成为轮状病毒候选疫苗,为研制新型的轮状病毒基因工程疫苗奠定了良好的基础。
刘鹏娟[5]（2016）在《基于PoRV VP7与PEDV S基因二联DNA疫苗的构建及免疫效力评价》文中研究说明猪轮状病毒病是由猪轮状病毒（Porcine Rotavirus, PoRV）引起的一种腹泻性疾病,主要引起仔猪腹泻、呕吐、脱水等。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种高度接触性肠道传染病,主要引起猪群呕吐、水样腹泻和严重脱水等,尤其对哺乳仔猪有极高致死率。临床上两种病毒常混合感染,极大提高仔猪感染后病死率,给养猪业带来巨大经济损失。目前,针对上述病毒尚无特效药治疗,为了预防和控制这些疾病,安全、高效的疫苗研究是首要解决途径。1 PoRV VP7、PEDV S目的基因的克隆及生物信息学分析本实验根据Genbank收录的PoRV OSU代表株（登录号KJ450849）和PEDV CV777株（AF353511）全基因分别设计1对引物VP7-a/VP7-b和S-a/S-b。经RT-PCR从PoRVSC-R毒株、PEDV SC-P毒株RNA样品中分别扩增出长度986 bp、989 bp的基因片段。经连接、转化等克隆至PMD19-T （Simple）载体,成功构建了PMD-VP7、PMD-S质粒,并经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定证明克隆片段正确。利用MEGA 5.0等软件分别对PoRV SC-R株VP7、PEDV SC-P株S基因与Genbank参考序列进行同源性分析并构建进化树。结果表明,VP7基因同32株世界各地轮状病毒参考株同源性为94.9%-98.7%,S基因同38株世界各地参考株同源性为94.7%-98.8%。利用不同生物学软件分别对PoRV VP7、PEDV S目的基因编码氨基酸进行理化性质、疏水性、跨膜区域、信号肽、抗原决定簇预测等分析,结果表明本实验扩增的PoRV VP7、PEDV S目的基因均具有良好的免疫原性。2联合表达PoRV VP7、PEDV S基因真核表达载体的构建分别对PMD-VP7重组质粒和pPI-2.EGFP真核表达载体进行EcoR I、Kpn I双酶切反应,回收目的片段并经连接、转化,成功构建了pPI-2.EGFP.VP7重组质粒。分别对PMD-S和pPI-2.EGFP.VP7重组质粒进行Kpn I、BamH I双酶切,回收目的片段并经连接、转化,成功构建了pPI-2.EGFP.VP7.S重组质粒,并对其进行酶切鉴定、PCR鉴定和测序鉴定。3 pPI-2.EGFP.VP7.S重组质粒的体外表达检测将pPI-2.EGFP.VP7.S重组质粒转染至BHK-21细胞,24 h后可见有绿色荧光蛋白表达。取转染后48 h细胞抽提总RNA并进行RT-PCR反应,可分别扩增出同VP7、S目的基因及VP7-S融合基因大小相当的片段,表明pPI-2.EGFP.VP7.S转染BHK-21细胞后成功转录。取转染后60 h细胞样品进行Western blotting检测,结果显示pPI-2.EGFP.VP7.S在BHK-21细胞中成功表达,其表达蛋白分子量约为98 KDa,且具有良好的反应原性。4 pPI-2.EGFP.VP7.S在小鼠体内的动态分布及安全性研究将pPI-2.EGFP.VP7.S重组质粒以100μg/只肌肉注射小鼠后,采集不同时期不同组织抽提DNA并进行VP7-S融合基因的PCR检测。结果表明,pPI-2.EGFP.VP7.S核酸疫苗经肌肉注射免疫小鼠后3 h可到达心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、脑和血液等部位,在脑部可存留42 d,在心脏、血液中存留63 d以上,在注射部位肌肉可存留91 d以上。此外,对免疫小鼠不同时期不同组织进行DNA抽提并纯化,结果发现纯化后样品均未扩增出VP7-S条带,表明pPI-2.EGFP.VP7.S不与宿主染色体DNA整合,从而具有较好的安全性。5 pPI-2.EGFP.VP7.S二联核酸疫苗的免疫效果研究将重组质粒以不同剂量、不同途径、不同佐剂免疫小鼠,分别于首免前0 d及首免后7 d,14 d,21 d,28 d,42 d采集血清进行PoRV和PEDV抗体IgG检测；首免后42 d采集血清进行细胞因子IFN-γ、IL-4检测；首免前0 d及首免后14 d,28 d,42 d采集脾脏进行脾淋巴细胞增殖实验。综合比较各指标检测结果表明,相比50μg肌注组和100μg肌注组,200μg肌注组免疫效果较好；相比100μg皮下注射组,100μg肌注组免疫效果较好；相比100 μg肌注组,IFN-a佐剂组免疫效果较好,脾转移因子佐剂组和IL-12佐剂组次之,但均优于100μg肌注组。
江倩倩[6]（2016）在《江苏某猪场2015-2016年猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及基于S蛋白的抗体间接ELISA检测方法的建立》文中提出猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病,是目前世界范围内猪场多发的猪病之一。自2010年10月以来,猪流行性腹泻病的流行强度和流行区域在不断地加强和扩大,尤其对哺乳仔猪致死率较高,可高达100%。在很多接种过PED疫苗的猪场,本病发病率及仔猪死亡率仍居高不下,并出现与其他病原混合感染的现象,大大增强了该病的防控难度,也给养猪业造成了巨大的经济损失。因此,对PED的诊断及其抗体监测具有重要意义。虽然目前,已有多种PED的诊断和抗体监测技术,如全病毒包被的ELISA、间接免疫荧光试验（IFA）等。但全病毒包被ELISA存在大量制备抗原困难、有散毒危险等缺点。IFA则需要昂贵的特殊设备,不适用于临床检测。利用蛋白表达分子生物学技术建立间接ELISA方法成为检测PEDV抗体新的方向。本研究从江苏某猪场进行间断性采样方法以对猪流行性腹泻病毒进行分子流行病学调查,利用表达纯化的S蛋白建立了检测其抗体的间接ELISA检测方法,可进一步了解江苏某猪场PED的流行特点,评价猪群感染或免疫抗体,为猪群PED疫苗选择及免疫疫苗后的抗体检测提供理论指导及检测手段。1.江苏某猪场PEDV分子流行病学调查为了解江苏某猪场PEDV的流行情况,应用RT-PCR方法对2015年3月至2016年3月间从江苏某猪场采集的106份疑似猪流行性腹泻样品进行PEDV检测,检测结果显示PEDV阳性率为30.19%（32/106）,猪场内各年龄段的猪均有出现PEDV感染的现象。设计了针对M、N和ORF3基因的特异性引物,对其中2个阳性样品进行全长扩增,并将扩增的产物进行测序。测序结果与国内外相应的基因序列进行比对并构建遗传进化树,发现目前分离PEDV参考株主要分为G1、G2两大支,而该猪场的流行毒株位于G1支上,基于ORF3基因的遗传进化树分析可推测,猪场流行毒为PEDV野毒,与国内流行毒相近。2. PEDV部分S基因的原核表达PEDV的S蛋白在免疫介导中起着重要作用,因此本研究对猪场流行毒株的部分S基因（编码蛋白可产生中和抗体,标记为Sp）进行扩增,长度为711 bp,进一步克隆至pET-32a,构建了pET-Sp原核表达质粒。重组表达质粒转化BL21感受态细胞后,在28℃、200 rpm条件下,经0.2 mM浓度的IPTG诱导获得可溶性重组S蛋白。Western-blot试验证明表达的重组蛋白可与PEDV阳性血清发生特异性反应,说明该重组蛋白有较好的抗原性。3. PEDV抗体间接ELISA检测方法的初步建立为监测猪场猪群PEDV抗体水平,初步建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法。纯化的S蛋白作为包被抗原,最优的包被浓度为0.5 μg/ml,4℃包被过夜,10%的小牛血清37℃封闭2 h,最优的待检血清稀释度为1：200,37℃作用1 h, HRP标记的兔抗猪IgG 1：8000稀释,37℃作用1 h,加入TMB显色液10 min后终止反应。当待检血清OD450≥0.273时判为阳性,待检血清OD450<0.273时判为阴性。用建立的间接ELISA方法对商品化试剂盒中PRRSV、CSFV、PRV、PCV、FMDV等常见猪病的抗体阳性对照进行检测均呈阴性,说明该方法具有良好的特异性。分别用不同批次纯化的蛋白及同一批次纯化蛋白包被的酶标板对血清样品进行检测,结果表明该方法具有较好的重复性。用建立的间接ELISA方法对临床47份猪血清进行检测,阳性率为72.34%,与进口某公司PEDV抗体ELISA检测试剂盒结果进行比较,其符合率为95.74%。说明该方法适用于临床猪群PEDV抗体水平检测,同时也为以后诊断试剂盒的研制奠定基础。
王振玲[7]（2014）在《北京地区仔猪腹泻相关病原调查及大肠杆菌和轮状病毒特性的研究》文中认为仔猪腹泻是养猪生产的一类常见疾病,严重阻碍养猪业发展。引起仔猪腹泻的病因复杂多样,如非传染性病因和传染性病原感染等,其中以细菌和病毒感染较为常见,而且病原种类多,病情复杂,发病率高。为深入了解北京地区规模化猪场仔猪腹泻病原流行状况,本研究对2010年8月至2013年12月期间采集的400份腹泻样本进行病毒和细菌检测,并进一步对本实验分离的大肠杆菌和轮状病毒的生物学特性进行研究：从采集的400份仔猪腹泻样本中成功分离到132株细菌,经生化特性检测和16S rRNA基因序列分析,分属于16个细菌种。相关病毒抗原PCR检测结果显示：猪流行性腹泻病毒（PEDV）阳性样本23份,猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）6份,猪轮状病毒（RV）58份,总计87份。其中,RV阳性率最高,为66.7%。采用胶体金法对部分时段的轮状病毒抗原调查结果显示,仔猪RV感染阳性率为17.7%,且每年的12月和次年1月份感染率最高,可达40%。0～7日龄仔猪易感,感染率为30.6%。用轮状病毒抗原阳性病料接种Marc-145细胞,成功分离到一株轮状病毒。在细胞培养中可引起细胞病变。采用抗轮状病毒特异性血清进行间接免疫荧光染色,显示感染细胞质中存在特异性荧光。感染细胞超薄切片电镜观察可见有典型的轮状病毒粒子。利用RT-PCR扩增病毒部分基因和测序,结果显示分离株为A群G亚型轮状病毒。对初生仔猪进行致病性试验结果显示,仔猪感染后表现为典型轮状病毒感染临床症状及病理组织学变化。对分离到的64株大肠杆菌进行O抗原血清型分型,结果定型42株菌,22株未定型。定型菌株主要为8种血清型,分别为O101（18.8%）、O8（11.0%）、O20（11.0%）、O64（12.5%）、O45（4.6%）、 O149（4.6%）、O2（1.5%）、O89（1.5%）、对64株大肠杆菌携带的毒力因子进行PCR鉴定,研究结果显示主要携带的毒力因子为sta, stx2e, astA和eaeA等,50%菌株携带astA和eaeA因子,而30%以上的菌株携带sta和stx2e因子。选取携带多个毒力因子的两株大肠杆菌进行全基因组测序分析,结果显示菌株A基因组约为5.5Mb,菌株B基因组约为5.6Mb,两株菌分别含有5743和5829个开放阅读框（Open reading frame）。对其进行蛋白注释发现两株菌膜转运蛋白的基因差异较大,菌种A为241个,菌种B为342个。进一步分析发现两株细菌膜蛋白基因差异主要体现在Ⅳ型结合转运系统（1ncl1型）。在Ⅳ型转运系统中,菌株B携带的VirB3蛋白编码基因,可参与细菌纤毛侵袭宿主细胞膜的过程,与菌种A存在一定差异。综上所述,本研究通过对北京地区仔猪腹泻的病原学及流行病学调查,较全面的了解了北京地区仔猪腹泻性疾病的流行情况及相关致病病原,并通过对主要病原体的分离和鉴定,进一步明确了主要病原体的生物学特性。本研究的结果将为北京地区仔猪腹泻性疾病的预防和控制提供数据参考,同时为进一步的仔猪腹泻性疾病疫苗的研发提供数据支持。
杨文宇[8]（2014）在《猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒和猪星状病毒多重RT-PCR检测方法的建立与初步应用》文中进行了进一步梳理2011年至今全国范围内爆发的由病毒感染而导致的仔猪腹泻,给养猪业造成了巨大的经济损失,其中包括猪A群轮状病毒（group A porcine rotavirus,GARV）、猪 C 群轮状病毒（group C porcine rotavirus,GCRV）和猪星状病毒（porcine Astroviridae,PAstV）。为了调查A、C群轮状病毒和星状病毒在四川地区猪群中的感染率和分子遗传特征,掌握猪GARV、GCRV和PAstV的流行状况,为进一步研究这三种肠道疾病预防控制技术提供依据。本研究建立了三种病毒的多重RT-PCR检测方法,对四川爆发仔猪腹泻的猪群进行了 GARV、GCRV和PAstV的检测并对其进行了分子流行病学研究,取得了以下进展:1 GARV、GCRV和PAstV的多重RT-PCR检测方法的建立参考GenBank中收录的相关序列对这三种病毒基因区进行同源性分析,选取GARV、GCRV的VP6基因和PAstV的ORF2基因为目标基因。然后使用Primer 5.0分别针对三个目标基因设计特异性引物,预计扩增片段大小分别为229bp、166bp和410bp。先分别建立针对各病毒的单项RT-PCR方法。在此基础上优化反应条件和反应程序,建立了 GARV、GCRV和PAstV的多重RT-PCR检测方法。建立的多重RT-PCR方法,能从GARV、GCRV、PAstV阳性模板中同时扩增出与目的片段大小相符的3条特异性条带,而以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌均不能扩增得到特异性条带;能扩增出GARV、GCRV和PAstV cDNA最低模版浓度分别为5.47×10-4μg/μL、3.8×10-3μg/μL和4.8×10-4μg/μL;对同一阳性模版随机进行三次检测,能够得到一致的结果。表明本方法的具有很好的特异性、敏感性和重复性。与单项RT-PCR检测结果符合率分别为100%、100%、96.7%,整体符合率达98.9%。结果表明,本实验建立的多重RT-PCR检测方法具有快速、准确的特点,可用于GARV、GCRV和PAstV的检测。2多重RT-PCR检测方法的临床应用运用建立的多重RT-PCR方法对覆盖四川主要生猪产区,来自不同猪场有腹泻症状的115份腹泻粪样进行检测,统计分析结果发现其中23份检出GARV,4份检出GCRV、14份检出PAstV,感染的阳性率分别为20%、3.47%、12.17%;8份检出GARV和PAstV混合感染,2份GARV和GCRV混合感染,仅1份样品同时检出三种病毒;冬季为三种病毒主要流行的季节,2月龄以下为主要感染猪群,遂宁德阳地区的感染情况较为严重。3 GARV、GCRV和PAstV的分子流行病学分析根据115份病料中阳性样品的克隆测序结果,进行四川地区GARV、GCRV和PAstV的分子遗传多样性分析。结果显示,四川地区的流行的GARV毒株之间同源性在88.5%～95.4%,与猪源参考株AF317123的同源性最高,达到88.7%～92%。遗传进化分析表明中国猪A群轮状病毒GD株和猪A群轮状病毒ZZ-12只同一分支,亲缘关系接近。GCRV毒株的同源性达到88.7%～95.5%,与猪源参考株EU002785的同源性在89%～93%之间,与南韩猪C群轮状病毒CUK-5分离的毒株位于同一分支;PastV流行株主要是2型和5型,PAstV2型的组内同源性达到97.7%～99.5%,PastV5型的组内同源性达到87.2%～98.8%,2型毒株与PoAstV/Krv7/cro同源性在87.9%～89.2%之间。5型毒株与其他5型毒株同源性达到77%～92%,与克罗地亚分离株亲缘关系较为接近。这些研究结果将丰富四川地区ARV、GCRV和PastV分子流行病学资料及相关疫病的防控策略制定的科学依据。
吴洋[9]（2014）在《猪腹泻相关病毒多重和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用》文中指出猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PoRV）是引发猪病毒性腹泻的主要病原,且三种病原常常混合感染,建立同时检测三种病原的特异性检测方法,在临床诊断上具有重要意义。本研究根据GenBank登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PoRV VP6基因序列保守区设计合成引物,建立了RT-PCR多重快速检测方法。利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PoRV核酸模板析进行多重RT-PCR扩增,结果显示：该方法可以同时扩增PEDV S基因（682bp）, TGEV S基因（480bp）和PoRV VP6基因（297bp）的特异性DNA片段,其三对扩增引物对除白身病毒以外的其他两种腹泻病毒及猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性：敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR方法检测灵敏性分别达到PEDV模板3.3×103copies/μL、TGEV模板3.2×103copies/μL和PoRV模板2.8×103copies/μL。用20份临床病料对本研究建立的多重RT-PCR和单-RT-PCR方法进行对比验证,结果显示：两者的总符合率为100%。该PCR反应体系为总体积25μL,Taq酶（5U/μL）0.5μL,引物量（PEDV0.8pmol/μL、TGEV1.0pmol/μL、PoRV1.0pmol//uL）0.5,uL,35个循环,总反应时间94min,结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。根据PEDV、TGEV及PoRV的ORF3基因和S基因以及VP7基因,设计的三对特异性引物进行的PCR反应,扩增出的目的片段分别为103bp、115bp和153bp,目的基因和载体pMD18-T连接产物转化到感受态细胞JM-109,提取重组质粒,进行PCR鉴定并测序。重组质粒测OD-,60并计算其浓度,根据公式进行拷贝数计算。梯度稀释重组质粒制备标准品,分别建立了检测3种病毒的SYBR green I实时荧光定量PCR方法。建立的PEDV、TGEV及PoRV标准曲线且线性关系良好,相关系数分别为0.992902、0.987219和0.999045,扩增效率分别为0.93、0.99、1.15。特异性试验结果表明,PEDV特异性试验中TGEV、PoRV、 PRV、HCV均为阴性；TGEV特异性试验中PRV、PoRV、PEDV、HCV均为阴性；PoRV特异性试验中PRV、PEDV、TGEV、HCV均为阴性;敏感性试验表明,3种病毒SYBR Green I荧光定量PCR方法的最低检测下限分别为33copies/μL、32copies/μL、28copies/μL;重复性试验结果显示三种检测方法的批内变异系数和批间变异系数均小于5%。说明本实验建立的3种病毒的SYBR Green I荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性良好。应用建立的检测方法分别对黑龙江、内蒙等地的20份临床粪便样品进行检测,结果可见PEDV、TGEV及PoRV荧光定量PCR方法检测阳性率分别为70%、50%、35%,单一RT-PCR方法检测阳性率分别为60%、45%、20%。本研究建立的猪腹泻病毒多重和SYBR Green I荧光定量PCR检测方法为猪病毒性腹泻的流行病学调查及诊断与防制提供了基础。
魏晓曼,闻晓波,冉旭华,崔玉东[10]（2013）在《猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株截短VP8基因的原核表达、蛋白纯化及免疫原性分析》文中研究表明目的原核表达猪轮状病毒（porcine rotavirus,PRV）Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化重组蛋白,并检测其免疫原性。方法经PCR从含有全长VP4基因片段的重组质粒pCR4-Gottfried VP4和pCR4-SB-1A VP4中分别扩增截短的VP8*基因（△VP8*,64～223位氨基酸）,分别插入原核表达载体pET-28a（+）中,构建重组表达质粒pET-28a-Gottfried-△VP8*和pET-28a-SB-1A-△VP8*,分别转化大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。应用ProBondTMResin纯化两种重组蛋白,重组蛋白与A（lOH）3佐剂混合后,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果两种重组表达质粒经双酶切和测序证实构建正确;表达的两种目的蛋白相对分子质量约25 000,均以包涵体和可溶性两种形式存在,均可与鼠源抗Histag单克隆抗体特异性结合;纯化的两种重组蛋白纯度均在95%以上,免疫BALB/c小鼠可产生较高的血清抗体水平。结论成功在大肠埃希菌中表达了PRV Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化的两种蛋白免疫原性较好,为进一步研制安全、高效的PRV亚单位疫苗奠定了基础。
二、牛猪轮状病毒血清分型及其抗原性比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、牛猪轮状病毒血清分型及其抗原性比较（论文提纲范文）
（1）新疆南疆部分规模奶牛场轮状和冠状病毒流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 概述 |
| 1.1 牛轮状病毒（BRV）研究概况 |
| 1.1.1 BRV简介 |
| 1.1.2 临床表现 |
| 1.1.3 流行情况 |
| 1.1.4 生物学分类及特性 |
| 1.1.5 诊断方法 |
| 1.1.6 防控措施 |
| 1.2 牛冠状病毒（BCo V）研究概况 |
| 1.2.1 BCo V简介 |
| 1.2.2 临床表现 |
| 1.2.3 流行情况 |
| 1.2.4 生物学分类及特性 |
| 1.2.5 诊断方法 |
| 1.2.6 防控措施 |
| 第2章 新疆南疆某规模奶牛场BRV荧光定量PCR检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料来源及样品采集 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验器材 |
| 2.1.4 样本处理 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 组织病理切片的制作 |
| 2.2.2 样本RNA的提取 |
| 2.2.3 荧光定量PCR |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 临床症状 |
| 2.3.2 病理解剖 |
| 2.3.3 组织病理变化 |
| 2.3.4 荧光定量PCR扩增结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 新疆南疆部分规模奶牛场BRV与BCoV抗原ELISA检测 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验样品来源 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验器材 |
| 3.1.4 样品处理 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 试验步骤 |
| 3.2.2 计算方法 |
| 3.2.3 结果判定 |
| 3.3 试验结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 新疆南疆部分规模奶牛场BRV分子流行病学调查 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 样品来源 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验器材 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.1.5 参考毒株 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 样本RNA的提取 |
| 4.2.2 RT-PCR |
| 4.2.3 PCR产物回收 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 RT-PCR扩增结果 |
| 4.3.2 RT-PCR检测结果 |
| 4.3.3 BRV-VP7基因核苷酸同源性分析 |
| 4.3.4 遗传进化树的构建 |
| 4.3.5 BRV-10T基因分型分析 |
| 4.3.6 BRV-10T与疫苗参考株KC-1xUK VP7基因核苷酸及推导氨基酸序列同源性比较 |
| 4.3.7 BRV-10T与疫苗参考株KC-1xUK 52-337 位肽段VP7基因的氨基酸比较 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 新疆南疆BCo V分离及基因型鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 样本来源 |
| 5.1.2 试验试剂 |
| 5.1.3 试验器材 |
| 5.1.4 引物 |
| 5.1.5 参考毒株 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 样品处理 |
| 5.2.2 病毒分离培养 |
| 5.2.3 RNA的提取 |
| 5.2.4 RT-PCR |
| 5.2.5 PCR产物回收 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 病毒分离结果 |
| 5.3.2 RT-PCR扩增结果 |
| 5.3.3 BCoV-5T株N基因核苷酸同源性分析 |
| 5.3.4 遗传进化树的构建 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）大熊猫轮状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 轮状病毒病原学 |
| 3 大熊猫轮状病毒的基因组结构 |
| 4 大熊猫轮状病毒致病性 |
| 5 轮状病毒流行病学 |
| 5.1 家畜轮状病毒流行病学 |
| 5.2 乳鼠、兔、禽类轮状病毒流行病学 |
| 5.3 人类轮状病毒流行病学 |
| 5.4 大熊猫轮状病毒流行病学 |
| 6 轮状病毒鉴别诊断 |
| 6.1 病原体检测技术 |
| 6.2 免疫学诊断技术 |
| 6.2.1 酶联免疫吸附法(ELISA) |
| 6.2.2 乳胶凝集反应(LAT) |
| 6.3 分子生物学诊断技术 |
| 6.3.1 RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) |
| 6.3.2 基于核酸序列的扩增技术(NASBA) |
| 6.3.3 聚合酶链式反应(PCR) |
| 6.3.4 实时荧光定量PCR技术(qPCR) |
| 7 研究目的和意义 |
| 第二章 GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、质粒和菌种 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 标准阳性模板的制备 |
| 1.4.1 病毒RNA抽提和细菌DNA提取 |
| 1.4.2 反转录 |
| 1.4.3 目的基因的扩增 |
| 1.4.4 PCR产物的克隆和鉴定 |
| 1.5 实时荧光定量RT-PCR反应条件的优化 |
| 1.6 标准曲线的绘制 |
| 1.7 特异性和重复性检测 |
| 1.8 与常规RT-PCR敏感性比较 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的片断扩增及重组质粒标准品的制备 |
| 2.2 实时荧光定量RT-PCR的反应条件的优化 |
| 2.3 标准曲线的建立 |
| 2.3.1 动力学曲线 |
| 2.3.2 标准曲线 |
| 2.4 特异性、重复性检测结果 |
| 2.5 与常规RT-PCR灵敏性的比较结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 实时荧光定量RT-PCR检测大熊猫轮状病毒携带情况的初步应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 样本的采集和分组 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 粪便RNA的提取和反转录 |
| 2.2 大熊猫轮状病毒RT-PCR检测 |
| 2.3 大熊猫轮状病毒实时荧光定量RT-PCR检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 提取粪便RNA的质检 |
| 3.2 RT-PCR检测 |
| 3.3 实时荧光定量RT-PCR检测 |
| 3.4 常规RT-PCR检测和实时荧光定量RT-PCR检测结果分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）湖南地区猪捷申病毒和猪萨佩罗病毒的分子流行病学和基因特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 PTV,PSV简介 |
| 1.1.1 PTV和 PSV的分类 |
| 1.1.2 PTV和 PSV基因组结构 |
| 1.2 PTV,PSV的流行病学 |
| 1.2.1 PTV和 PSV的感染 |
| 1.2.2 PTV流行病学调查 |
| 1.2.3 PSV流行病学调查 |
| 1.3 猪肠道内病毒的共感染 |
| 1.4 病毒的进化 |
| 1.4.1 病毒的起源 |
| 1.4.2 病毒进化研究方法 |
| 1.4.3 病毒进化的进程 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 检测PTV,PSV的 RT-PCR方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒及疫苗 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 病毒的复苏 |
| 2.2.3 病毒样品DNA/RNA提取 |
| 2.2.4 cDNA合成及RT-PCR |
| 2.2.5 含PTV,PSV目的片段的重组质粒构建 |
| 2.2.6 RT-PCR方法反应条件的优化 |
| 2.2.7 RT-PCR方法特异性试验 |
| 2.2.8 RT-PCR方法敏感性试验 |
| 2.2.9 RT-PCR方法重复性试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PTV和 PSV单重RT-PCR最佳退火温度的确定 |
| 2.3.2 PTV和 PSV单重RT-PCR特异性试验 |
| 2.3.3 PTV和 PSV单重RT-PCR敏感性试验 |
| 2.3.4 PTV和 PSV单重RT-PCR重复性试验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 湖南地区猪群PTV,PSV的分子流行病学调查 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 样本、细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 样品的采集与处理 |
| 3.2.2 临床样品RNA提取 |
| 3.2.3 cDNA合成及RT-PCR检测 |
| 3.2.4 数据统计学分析 |
| 3.2.5 套式PCR方法扩增PTV VP1 基因 |
| 3.2.6 PTV VP1 基因序列比对及进化分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 不同生长阶段猪群PTV和 PSV的流行情况 |
| 3.3.2 不同健康状况猪群PTV和 PSV的流行情况 |
| 3.3.3 规模猪场各周龄段猪群PTV和 PSV的流行情况 |
| 3.3.4 猪群中PTV和 PSV混合感染的流行情况 |
| 3.3.5 PTV阳性样品基因型的鉴定 |
| 3.3.6 不同生长阶段猪群PTV各基因型的流行情况 |
| 3.3.7 不同健康状况猪群PTV各基因型的流行情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PTV的分离鉴定及其基因特性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 PTV阳性样品、细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 样本的处理 |
| 4.2.2 PK-15 细胞和ST细胞的复苏和培养 |
| 4.2.3 细胞的培养 |
| 4.2.4 样品滤液的接种 |
| 4.2.5 病毒的RT-PCR鉴定 |
| 4.2.6 扩增PTV基因组序列的引物设计、合成 |
| 4.2.7 PTV基因组序列的RT-PCR扩增、测序和拼接 |
| 4.2.8 PTV参考毒株基因序列信息 |
| 4.2.9 PTV多序列比对分析 |
| 4.2.10 进化分析 |
| 4.2.11 基因遗传距离分析 |
| 4.2.12 重组分析 |
| 4.2.13 核酸替换率和最近共同祖先估计 |
| 4.2.14 选择压力分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 病毒分离与鉴定 |
| 4.3.2 PTV基因组序列的扩增、测序和拼接 |
| 4.3.3 进化分析和PTV分离株基因型的鉴定 |
| 4.3.4 PTV毒株间的遗传距离 |
| 4.3.5 重组分析 |
| 4.3.6 核酸替换率和最近共同祖先估计 |
| 4.3.7 选择压力分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 PSV的分离鉴定及其基因特性分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 PSV阳性样品、细胞 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 样本的处理 |
| 5.2.2 PK-15 细胞的复苏和培养 |
| 5.2.3 细胞的培养 |
| 5.2.4 样品滤液的接种 |
| 5.2.5 病毒的RT-PCR鉴定 |
| 5.2.6 扩增PSV基因组序列的引物设计、合成 |
| 5.2.7 PSV基因组序列的RT-PCR扩增、测序和拼接 |
| 5.2.8 PSV参考毒株基因序列信息 |
| 5.2.9 PSV多序列比对分析 |
| 5.2.10 进化分析 |
| 5.2.11 基因遗传距离分析 |
| 5.2.12 重组分析 |
| 5.2.13 选择压力分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 病毒分离与鉴定 |
| 5.3.2 PSV基因组序列的扩增、测序和拼接 |
| 5.3.3 基因特征 |
| 5.3.4 进化分析 |
| 5.3.5 重组分析 |
| 5.3.6 选择压力分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 符号表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）人源轮状病毒VP4截短蛋白的原核表达及其与轮状病毒候选基因工程疫苗P2-VP8的比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 轮状病毒及其结构 |
| 1.1 轮状病毒的基因组 |
| 1.2 轮状病毒的蛋白与结构 |
| 2 轮状病毒的分类及其流行病学 |
| 2.1 轮状病毒的分类 |
| 2.2 轮状病毒的流行病学 |
| 3 轮状病毒感染与致病 |
| 3.1 轮状病毒的感染 |
| 3.2 轮状病毒的致病机理 |
| 4 轮状病毒感染的诊断与治疗 |
| 4.1 轮状病毒感染的诊断 |
| 4.2 轮状病毒感染的治疗 |
| 5 轮状病毒疫苗研究进展 |
| 5.1 轮状病毒疫苗概况 |
| 5.2 轮状病毒疫苗的影响及不足 |
| 5.3 轮状病毒的基因工程疫苗研究进展 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 病毒细胞及实验动物 |
| 1.4 常用试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 常用溶液及培养基配制 |
| 2.2 常规分子生物学实验 |
| 2.3 常规细胞生物学实验 |
| 2.4 轮状病毒感染滴度检测 |
| 2.5 重组蛋白纯化及性质鉴定实验 |
| 2.6 动物实验方法 |
| 2.7 动物血清抗体及中和抗体滴度检测 |
| 2.8 统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 轮状病毒Wa毒株VP4~*和P2-VP8蛋白的克隆、表达和纯化 |
| 1.1 Wa-VP4~*与Wa-P2-VP8蛋白的克隆表达载体构建 |
| 1.2 Wa-VP4~*与Wa-P2-VP8蛋白的表达纯化 |
| 2 Wa-VP4~*与Wa-P2-VP8蛋白理化性质的研究 |
| 2.1 高效液相色谱法(HPLC)分析鉴定Wa-VP4~*与Wa-P2-VP8蛋白 |
| 2.2 Wa-VP4~*与Wa-P2-VP8蛋白热稳定性比较 |
| 3 Wa-VP4~*与Wa-P2-VP8蛋白蛋白抗原性比较 |
| 4 Wa-VP4~*与Wa-P2-VP8蛋白免疫原性及免疫中和活性比较 |
| 4 1 Wa-VP4~*与Wa-P2-VP8蛋白在豚鼠和家兔上免疫原性比较 |
| 4.2 Wa-VP4~*与Wa-P2-VP8蛋白在豚鼠和家兔上免疫应答速率比较 |
| 4.3 Wa-VP4~*与Wa-P2-VP8蛋白在豚鼠和家兔上免疫交叉中和活性比较 |
| 5. Wa-VP4~*蛋白在小型猪中和食蟹猴中免疫原性的研究 |
| 第四章 讨论 |
| 1 人源轮状病毒感染机制及疫苗设计 |
| 2 重组表达的Wa-VP4~*作为轮状病毒基因工程疫苗的优势 |
| 3 轮状病毒多价苗研究的必要性 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 总结 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）基于PoRV VP7与PEDV S基因二联DNA疫苗的构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪轮状病毒研究进展 |
| 1.1 猪轮状病毒简介 |
| 1.2 PoRV的病原学特征 |
| 1.3 PoRV的流行病学 |
| 1.4 PoRV分子生物学 |
| 1.5 PoRV疫苗研究进展 |
| 2 猪流行性腹泻病毒研究进展 |
| 2.1 猪流行性腹泻病毒简介 |
| 2.2 PEDV的流行病学 |
| 2.3 PEDV的分子生物学 |
| 2.4 PEDV疫苗研究进展 |
| 3 脾转移因子研究进展 |
| 3.1 理化性质 |
| 3.2 生物学特性 |
| 3.3 作用机制 |
| 3.4 在猪病防治方面的应用 |
| 4 细胞因子佐剂研究进展 |
| 4.1 IFN-α相关研究进展 |
| 4.2 IL-12相关研究进展 |
| 5 目的意义 |
| 第二章 PoRV VP7与PEDV S基因的克隆与生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 毒株、菌株与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PoRV VP7与PEDV S基因的克隆 |
| 2.2 目的基因的序列测定与分析 |
| 2.3 PoRV VP7与PEDV S基因生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR结果 |
| 3.2 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒的PCR鉴定结果 |
| 3.4 目的基因测序结果 |
| 3.5 目的基因序列分析 |
| 3.6 生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 pPI-2.EGFP.VP7.S真核表达载体的构建与体外表达检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 pPI-2.EGFP.VP7真核表达载体的构建 |
| 2.2 pPI-2.EGFP.VP7.S真核表达载体的构建 |
| 2.3 真核表达质粒pPI-2.EGFP.VP7.S的体外表达检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 pPI-2.EGFP.VP7真核表达载体的构建 |
| 3.2 pPI-2.EGFP.VP7.S真核表达载体的构建 |
| 3.3 真核表达质粒pPI-2.EGFP.VP7.S的体外表达检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 柔性基因Linker的设计 |
| 4.2 重组蛋白的表达 |
| 5 小结 |
| 第四章 联合表达PoRV VP7/PEDV S基因DNA疫苗免疫效果研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、毒株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 质粒DNA的大量抽提 |
| 2.2 小鼠的分组与免疫 |
| 2.3 样品采集 |
| 2.4 针对VP7-S融合基因PCR方法的灵敏性研究 |
| 2.5 pPI-2.EGFP.VP7.S质粒在小鼠体内的动态分布检测 |
| 2.6 pPI-2.EGFP.VP7.S质粒在小鼠体内的安全性研究 |
| 2.7 小鼠血清中PoRV特异性抗体IgG的检测 |
| 2.8 小鼠血清中PEDV特异性抗体IgG的检测 |
| 2.9 细胞因子检测 |
| 2.10 脾细胞增殖实验 |
| 2.11 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 针对VP7-S融合基因PCR方法的灵敏性研究 |
| 3.2 pPI-2.EGFP.VP7.S质粒在小鼠体内的动态分布检测 |
| 3.3 pPI-2.EGFP.VP7.S质粒在小鼠体内的安全性研究 |
| 3.4 小鼠血清中PoRV特异性抗体IgG的检测 |
| 3.5 小鼠血清中PEDV特异性抗体IgG的检测 |
| 3.6 细胞因子检测 |
| 3.7 小鼠脾淋巴细胞增殖实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同免疫途径对免疫效果影响 |
| 4.2 不同免疫剂量对免疫效果影响 |
| 4.3 不同佐剂对免疫效果影响 |
| 4.4 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
（6）江苏某猪场2015-2016年猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及基于S蛋白的抗体间接ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 江苏某猪场PEDV分子流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒部分S基因的原核表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 PEDV抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
（7）北京地区仔猪腹泻相关病原调查及大肠杆菌和轮状病毒特性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 图表清单 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 规模化猪场仔猪腹泻的病原概述 |
| 1.1.2 仔猪源大肠杆菌 |
| 1.1.3 猪轮状病毒 |
| 1.2 本课题的研究内容及技术路线 |
| 1.2.1 研究内容 |
| 1.2.2 技术路线 |
| 1.2.3 论文选题的意义和目的 |
| 第二章 北京地区规模化猪场仔猪腹泻相关病原调查 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 调查范围 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 相关溶液的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病例来源及检测 |
| 2.2.2 细菌学检测 |
| 2.2.3 病毒学检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 细菌学检测 |
| 2.3.2 病毒学检测 |
| 2.3.3 混合感染检测 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.4.1 细菌性仔猪腹泻 |
| 2.4.2 病毒性仔猪腹泻 |
| 第三章 北京地区仔猪大肠杆菌生物学特性及其毒力因子检测 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 分离毒株及参考毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 相关溶液的配制 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 细菌分离及纯化 |
| 3.2.2 待检菌株的生化鉴定 |
| 3.2.3 大肠杆菌O血清型鉴定 |
| 3.2.4 大肠杆菌主要毒力因子检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 大肠杆菌的培养特性与形态特征 |
| 3.3.2 大肠杆菌生化特性 |
| 3.3.3 血清型鉴定 |
| 3.3.4 毒力因子检测 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 3.4.1 仔猪致病性大肠杆菌的血清型 |
| 3.4.2 仔猪致病性大肠杆菌的毒力因子 |
| 第四章 仔猪腹泻大肠杆菌全基因组测序及分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 分离毒株及参考毒株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 相关溶液的配制 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 细菌分离及纯化 |
| 4.2.2 细菌基因组提取 |
| 4.2.3 细菌测序方法 |
| 4.2.4 基因组序列拼接及质检标准 |
| 4.2.5 基因预测和注释 |
| 4.2.6 基因组多序列比对 |
| 4.2.7 两株细菌膜蛋白功能相关基因比较 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 基因组拼接结果统计 |
| 4.3.2 两株细菌比较特异基因分析 |
| 4.3.3 两株细菌ORF注释及基因功能分析 |
| 4.3.4 两株细菌SNP和InDel分析 |
| 4.3.5 基因组多序列比对分析 |
| 4.3.6 两株细菌膜蛋白基因分析 |
| 4.4 讨论与分析 |
| 第五章 北京地区猪轮状病毒感染的流行病学调查 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 调查范围 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 相关溶液的配制 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 病例来源及检测 |
| 5.2.2 病猪的临床症状 |
| 5.2.3 病猪的病理变化观察 |
| 5.2.4 病猪的病理组织学观察 |
| 5.3 猪轮状病毒感染的流行病学调查结果 |
| 5.3.1 猪轮状病毒感染的发病季节及发病日龄调查 |
| 5.3.2 猪轮状病毒感染的临床症状 |
| 5.3.3 猪轮状病毒感染的病理变化 |
| 5.3.4 猪轮状病毒感染的病理组织学观察 |
| 5.4 讨论与分析 |
| 第六章 北京地区猪轮状病毒的分离、鉴定及致病性研究 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 细胞及病料来源 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 相关溶液的配制 |
| 6.1.4 主要仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 病料的采集 |
| 6.2.2 病毒的分离培养 |
| 6.2.3 病毒的鉴定 |
| 6.2.4 对仔猪致病性试验 |
| 6.3 试验结果 |
| 6.3.1 轮状病毒的分离 |
| 6.3.2 轮状病毒的鉴定 |
| 6.3.3 轮状病毒感染仔猪试验 |
| 6.4 讨论与分析 |
| 6.4.1 病料的采集时间 |
| 6.4.2 胰酶浓度摸索 |
| 6.4.3 细胞超薄切片电镜观察 |
| 6.4.4 猪轮状病毒基因序列测定与比对 |
| 第七章 总结 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录：菌株B中69个特有参与膜转运相关基因序列 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒和猪星状病毒多重RT-PCR检测方法的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词一览表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 |
| 1.1 猪轮状病毒病概述 |
| 1.2 病原 |
| 1.2.1 轮状病毒粒子的分类和形态 |
| 1.2.2 轮状病毒分子基因组结构 |
| 1.2.3 病毒蛋白结构 |
| 1.3 轮状病毒的分型 |
| 1.3.1 电泳分型 |
| 1.3.2 血清型分型 |
| 1.4 轮状培养特性 |
| 1.5 猪轮状病毒流行病学研究 |
| 1.6 猪轮状病毒临床症状 |
| 1.7 轮状病毒诊断方法 |
| 1.7.1 电镜法(Electron Microscopy) |
| 1.7.2 病毒分离鉴定 |
| 1.7.3 血清学诊断方法 |
| 1.7.4 基因检测技术 |
| 1.7.5 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术 |
| 2 猪星状病毒病 |
| 2.1 猪星状病概述 |
| 2.2 病原 |
| 2.2.1 星状病毒分类及形态 |
| 2.2.2 星病毒分子基因组结构 |
| 2.2.3 病毒蛋白结构 |
| 2.3 星状病毒病毒的分型 |
| 2.4 星状病毒的培养 |
| 2.5 星状病毒流行病学研究 |
| 2.6 猪星状病毒的临床症状 |
| 2.7 猪星状病毒检测技术研究进展 |
| 2.7.1 电镜法(Electron Microscopy) |
| 2.7.2 细胞分离培养 |
| 2.7.3 血清学诊断技术 |
| 2.7.4 基因检测技术 |
| 5 本研究的目的意义及主要内容 |
| 第二章 猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒和猪星状病毒多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒株、菌株、病料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 引物设计和合成 |
| 1.5 病料处理 |
| 1.6 病毒增殖 |
| 1.7 病毒核酸的提取[112,113] |
| 1.8 反转录合成cDNA |
| 1.9 单项检测GARV、GCRV和PAstVRT-PCR方法的建立 |
| 1.9.1 单项RT-PCR扩增 |
| 1.9.2 单项RT-PCR产物克隆和序列测定 |
| 1.9.3 单项GARV、GCRV和PAstVRT-PCR的优化 |
| 1.9.4 单项GARV、GCRV和PAstVRT-PCR的特异性检验 |
| 1.9.5 单项GARV、GCRV和PAstVRT-PCR的敏感性检验 |
| 1.9.6 单项GARV、GCRV和PAstVRT-PCR的重复性试验 |
| 1.10 GARV、GCRV和PAstV多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 1.10.1 多重RT-PCR反应缓冲液的优化 |
| 1.10.2 多重RT-PCR反应酶浓度的优化 |
| 1.10.3 多重RT-PCR反应Mg~(2+)浓度的优化 |
| 1.10.4 多重RT-PCR反应DNTP浓度的优化 |
| 1.10.5 多重RT-PCR退火温度的优化 |
| 1.10.6 多重RT-PCR延伸时间的优化 |
| 1.10.7 多重RT-PCR引物浓度优化 |
| 1.10.8 多重RT-PCR方法敏感性试验 |
| 1.10.9 多重RT-PCR方法的特异性试验 |
| 1.10.10 多重RT-PCR方法的重复性试验 |
| 1.11 多重RT-PCR产物测序及序列比对分析 |
| 1.12 多重RT-PCR方法的临床应用及与单项RT-PCR效果比较 |
| 2 结果 |
| 2.1 单项RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.1.1 单项RT-PCR扩增 |
| 2.1.2 单项RT-PCR阳性样品目的片段的克隆测序与序列分析 |
| 2.1.3 单项RT-PCR扩增最佳退火温度的确定 |
| 2.1.4 单项RT-PCR特异性检测结果 |
| 2.1.5 单项RT-PCR敏感性检测结果 |
| 2.1.6 单项RT-PCR重复性检测结果 |
| 2.2 多重RT-PCR应条件优化结果 |
| 2.2.1 多重RT-PCR反应缓冲液的选择的结果 |
| 2.2.2 多重RT-PCR反应酶浓度的优化的结果 |
| 2.2.3 多重RT-PCR反应Mg~(2+)浓度的优化的结果 |
| 2.2.4 多重RT-PCR反应dNTP浓度的优化的结果 |
| 2.2.5 多重RT-PCR退火温度的优化的结果 |
| 2.2.6 多重RT-PCR延伸时间的优化的结果 |
| 2.2.7 多重RT-PCR引物浓度优化的结果 |
| 2.3 多重RT-PCR的敏感性试验 |
| 2.4 多重RT-PCR的特异性试验 |
| 2.5 多重RT-PCR的重复性试验 |
| 2.6 多重RT-PCR产物测序及序列比对分析 |
| 2.7 多重RT-PCR临床检测及与单项RT-PCR效果比较 |
| 3 分析讨论 |
| 3.1 多重RT-PCR方法 |
| 3.2 靶基因的选择 |
| 3.3 引物设计 |
| 3.4 反应条件的优化 |
| 4 结论 |
| 第三章 猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒和猪星状病毒多重RT-PCR检测方法的临床应用及分子流行病学调查 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病料处理 |
| 2.2 病毒核酸的提取 |
| 2.3 反转录合成cDNA |
| 2.4 GARV、GCRV和AstV多重RT-PCR检测 |
| 2.5 目的基因的克隆和鉴定 |
| 2.6 序列测定与分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 临床样品中GARV、GCRV和PAstV感染情况 |
| 3.1.1 不同地区感染情况调查 |
| 3.1.2 混合感染类型的调查 |
| 3.1.3 不同季节感染调查 |
| 3.1.4 仔猪不同日龄感染调查 |
| 3.2 同源性分析 |
| 3.2.1 GARV同源性和进化分析 |
| 3.2.2 GCRV同源性和进化分析 |
| 3.2.3 PAstV同源性和进化分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 地区分布 |
| 4.2 混合感染 |
| 4.3 季节分布 |
| 4.5 仔猪日龄 |
| 4.6 GARV、GCRV和PastV核苷酸同源性及序列分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 附录 |
（9）猪腹泻相关病毒多重和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| CONTENTS |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原概述 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1.2 猪传染性胃肠炎病毒 |
| 1.1.3 猪轮状病毒 |
| 1.2 PEDV、TGEV、PoRV的诊断方法 |
| 1.2.1 临床诊断 |
| 1.2.2 实验室诊断 |
| 1.3 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.3.1 原理 |
| 1.3.2 分类 |
| 1.3.3 应用 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒及临床样品 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 引物设计与合成 |
| 2.1.4 病料样品的处理 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 单一病原体基因PCR扩增及测序 |
| 2.2.2 多重RT-PCR扩增 |
| 2.2.3 PCR产物的回收 |
| 2.2.4 目的基因片段与pMD18-T载体的连接 |
| 2.2.5 大肠杆菌JM-109感受态的制备 |
| 2.2.6 连接产物的转化 |
| 2.2.7 pMD18-T基因重组质粒的鉴定 |
| 2.2.8 测序及结果分析 |
| 2.2.9 多重PCR扩增条件的优化 |
| 2.2.10 特异性试验 |
| 2.2.11 敏感性试验 |
| 2.2.12 重复性试验 |
| 2.2.13 临床感染病料的检测 |
| 2.2.14 荧光定量PCR标准品的制备及标准曲线的建立 |
| 2.2.15 荧光定量PCR的特异性 |
| 2.2.16 荧光定量PCR的重复性 |
| 2.2.17 荧光定量PCR的敏感性 |
| 2.2.18 荧光定量PCR临床样品检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 多重PCR扩增条件的优化结果 |
| 3.1.1 单一RT-PCR扩增及退火温度的优化结果 |
| 3.1.2 多重RT-PCR引物浓度的优化结果 |
| 3.1.3 多重RT-PCR循环数的优化结果 |
| 3.2 特异性试验结果 |
| 3.3 敏感性试验结果 |
| 3.4 重复性试验结果 |
| 3.5 临床样品的检测 |
| 3.6 荧光定量PCR扩增目的片段电泳结果 |
| 3.7 重组质粒测序结果 |
| 3.8 荧光定量PCR标准曲线 |
| 3.9 荧光定量PCR重复性试验结果 |
| 3.10 荧光定量PCR溶解曲线分析结果 |
| 3.11 荧光定量PCR特异性试验结果 |
| 3.12 荧光定量PCR临床样品检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多重RT-PCR方法检测猪腹泻病毒 |
| 4.2 检测猪腹泻病毒的荧光定量PCR方法分析 |
| 5 结论 |
| 5.1 建立了检测PEDV、TGEV、PoRV的多重PCR方法 |
| 5.2 建立了检测PEDV、TGEV、PoRV荧光定量PCR方法 |
| 5.3 临床样品的检测 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株截短VP8基因的原核表达、蛋白纯化及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 引物设计及合成 |
| 1.5△VP8*基因的扩增 |
| 1.6 重组原核表达质粒的构建 |
| 1.7 目的基因的诱导表达 |
| 1.8 表达产物的Western blot鉴定 |
| 1.9 重组蛋白的纯化及定量 |
| 1.10 纯化重组蛋白免疫原性的检测 |
| 1.10. 1 动物分组及免疫 |
| 1.10. 2 小鼠血清抗体水平的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1△VP8*基因扩增产物的鉴定 |
| 2.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.3 表达产物的鉴定 |
| 2.3.1 SDS-PAGE分析 |
| 2.3.2 Western blot分析 |
| 2.4 纯化产物的鉴定 |
| 2.5 纯化重组蛋白的免疫原性 |
| 3 讨论 |
四、牛猪轮状病毒血清分型及其抗原性比较（论文参考文献）
- [1]新疆南疆部分规模奶牛场轮状和冠状病毒流行病学调查[D]. 崔鑫. 塔里木大学, 2019(07)
- [2]大熊猫轮状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用[D]. 陈欣. 四川农业大学, 2018(03)
- [3]湖南地区猪捷申病毒和猪萨佩罗病毒的分子流行病学和基因特性研究[D]. 杨涛涛. 湖南农业大学, 2018(09)
- [4]人源轮状病毒VP4截短蛋白的原核表达及其与轮状病毒候选基因工程疫苗P2-VP8的比较研究[D]. 罗国兴. 厦门大学, 2018(07)
- [5]基于PoRV VP7与PEDV S基因二联DNA疫苗的构建及免疫效力评价[D]. 刘鹏娟. 四川农业大学, 2016(04)
- [6]江苏某猪场2015-2016年猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及基于S蛋白的抗体间接ELISA检测方法的建立[D]. 江倩倩. 扬州大学, 2016(02)
- [7]北京地区仔猪腹泻相关病原调查及大肠杆菌和轮状病毒特性的研究[D]. 王振玲. 中国农业大学, 2014(03)
- [8]猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒和猪星状病毒多重RT-PCR检测方法的建立与初步应用[D]. 杨文宇. 四川农业大学, 2014(04)
- [9]猪腹泻相关病毒多重和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 吴洋. 东北农业大学, 2014(01)
- [10]猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株截短VP8基因的原核表达、蛋白纯化及免疫原性分析[J]. 魏晓曼,闻晓波,冉旭华,崔玉东. 中国生物制品学杂志, 2013(08)