一、氮代谢研究的30年历程:从铵盐到双肽(论文文献综述)
徐蓉[1](2020)在《组织特异性游离氨与氨基酸的氨代谢途径及机制研究》文中认为目的氨是人体器官代谢氮营养素的中间形式,可分为游离氨与结合氨。游离氨于血液循环中依赖pH值的变化,在氨气和铵根离子间互相转化。正常生理情况下,健康人的体内游离氨浓度均保持在较低水平(<50uM)并不会产生对组织尤其是脑组织的损伤。相比之下,结合氨则主要以氨基酸和核酸等大分子形式参与生命组成。临床上,胃肠外科手术患者常常因患者不同程度的禁食可引起体内组织营养代谢的适应性改变,甚至伴有组织代谢分解的增强,从而引起体内氨代谢产生紊乱,从而会直接影响术后病人的术后恢复,相似的情况在严重创伤及感染的患者也常常可见,严重时由于游离氨代谢紊乱会导致肝性脑病的发生,后者多多见于门-体静脉分流术后的病人,但是具体机制复杂至今尚未明确。因此,多年来组织氨代谢的失衡对术后病人的影响一直备受关注[2],但具体的发生机制及作用环节并不清楚,尤其是研究组织氨代谢的手段和方法不多,这为临床上开发有效的防治策略带来了巨大的挑战。本课题组长期以来研究组织特异性氨代谢的途径及机制,通过借助神经视网膜组织与RPE(Retina Pigment Epithelium cells)/脉络膜组织间存在微环境这一生理特点,在国际上创新性建立起完善的组织氨代谢研究体系,可重点比较微环境中的氨代谢特征和共生关系,从而有利于对肝性脑病及其他氨代谢紊乱疾病的机制进行深入研究。方法 本研究利用气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS,)联用稳定同位素标记法(Stable Isotope-based Metabolic Analysis),用 6-8 周龄 C57 B6/J雄性小鼠为实验对象,进行体内和体外实验研究,追踪游离氨和氨基酸在不同组织中的代谢情况,重点比较了神经视网膜组织和视网膜色素上皮(Retina Pigment Epithelium cell,RPE)/脉络膜组织间微环境中的氨代谢变化。体内实验:稳定同位素15N标记氯化铵(Ammonium Chloride,NH4CL)后腹腔注射,分别在5分钟,15分钟,30分钟,60分钟时收集小鼠肝脏、视网膜神经上皮层、视网膜色素上皮层、大脑等组织以及血浆,用GC-MS进行测定、分析各代谢物的动态变化(每组实验数目N>6)。体外实验:采用神经视网膜组织培养法[3]利用稳定同位素15N标记和未标记的NH4CL、15N标记的氨基酸(包括15N-胺基-谷氨酰胺和15N-酰胺-谷氨酰胺、15N-天冬氨酸、15N-丙氨酸,23C-丙氨酸)离体培养新鲜的神经视网膜组织和RPE/脉络膜组织(每组实验数目N>3)。在37℃ 5%CO2恒温箱孵育2小时后分别收集组织和培养液,用GC-MS测定稳态标记后的各代谢物变化[4]。结果2、游离氨代谢特点:为了解不同组织游离氨代谢特征,我们进行了体内动态标记实验:1)、神经视网膜组织与脑组织氨代谢特点。同位素15N都可以标记以下代谢物:谷氨酰胺、尿素、天冬酰胺、羟脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸和丙氨酸。这说明两种神经组织基本氨代谢通路类似。但是脑组织和神经视网膜组织对氨的清除速率不同:脑组织氨代谢物60分钟时蓄积达到高峰。而神经视网膜组织代谢物多在15分钟时蓄积达到高峰。2)、肝脏组织氨代谢特点。肝脏对氨的代谢和神经和脑组织明显不同:5分钟时有超过70%的谷氨酰胺被标记。尿素、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、羟脯氨酸和γ-氨基丁酸也都在5分钟时被标记。肝脏氨清除速率比脑组织和视网膜都快,氨代谢物在被快速标记后,30分钟时降至正常或接近正常水平。为进一步揭示氨代谢在不同组织的特点,我们利用视网膜组织易培养的优势,进行以下体外氨代谢研究。1)首先,我们检测非标记氨对主要糖和氨基酸代谢物的影响:1mM NH4Cl增加神经视网膜组织中代谢物谷氨酰胺近2倍,但是其它代谢物没有变化。5mMNH4Cl时,视网膜组织中,谷氨酰胺达4倍以上。除此之外,线粒体三羧酸循环代谢中间产物α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate,α-KG)和琥珀酸各下降接近20倍和3倍。2)其次检测了标记氨对主要糖和氨基酸代谢物的影响:1mM同位素标记15N-NH4Cl培养时,神经视网膜组织中谷氨酰胺被标记并增加2倍多;5mM 15N-NH4Cl培养时,组织内98%的谷氨酰胺被标记,浓度增加了 4倍多,这与非标记的NH4C1培养结果一致。这些结果说明视网膜主要通过合成谷氨酰胺代谢氨。3)神经视网膜组织和RPE/脉络膜组织代谢物变化在1mM 15N-NH4C1培养时基本一致。但5mM 15N-NH4Cl培养时,神经视网膜组织天冬氨酸和天冬酰胺被标记浓度增加2倍。在RPE/脉络膜中天冬酰胺没有被标记,浓度也没有变化。但是丙氨酸只在RPE/脉络膜中被标记了。说明神经视网膜组织和RPE/脉络膜组织微环境中的氨代谢互相共生但又具有组织特异性。2、神经视网膜和RPE/脉络膜中主要氨基酸的氨代谢通路特点:因为微环境中谷氨酰胺、天冬氨酸以及丙氨酸的变化显着不同,我们用稳定同位素标记的这些氨基酸中的氨基,进一步探究它们的代谢通路特点。1)探究谷氨酸胺氨代谢通路特点。因谷氨酰胺有两个含氮基团,我们首先对15N-胺基-谷氨酰胺标记追踪。神经视网膜组织和RPE/脉络膜组织中被标记的谷氨酰胺均接近80%。神经视网膜组织中被标记的谷氨酸和天冬氨酸较对照组,增加了 2倍,其余代谢物未被标记。RPE/脉络膜组织中,增加更明显分别为4倍和8倍。除此之外,被标记的丙氨酸增加了近3倍,被标记的BCAAs(亮氨酸,缬氨酸,异亮氨酸)、丝氨酸和甘氨酸增加了近2倍。以上结果说明了,RPE/脉络膜的15N-胺基-谷氨酰胺的氨代谢途径比神经视网膜组织旺盛和复杂。2)进一步标记15N-酰胺基-谷氨酰胺结果显示:酰胺基在神经视网膜组织中,被标记谷氨酰胺浓度增加了 75倍,标记的天冬酰胺增加约2倍。在RPE/脉络膜中,被标记的谷氨酰胺增加了约60倍,天冬酰胺无变化。以上结果说明了,15N-酰胺基-谷氨酰胺氨代谢途径为再循环合成谷氨酰胺和天冬酰胺。但在RPE/脉络膜不能合成天冬酰胺。3)探究天冬氨酸氨代谢通路特点。15N-天冬氨酸追踪结果显示:神经视网膜中被标记的天冬酰胺增加了 5倍,谷氨酰胺和谷氨酸分别增加了 6倍和3倍。RPE/脉络膜组织中,标记的谷氨酰胺和谷氨酸分别增加了 3倍和3.5倍。此外,被标记的丙氨酸、丝氨酸和15N-甘氨酸增加大于2倍,但是天冬酰胺仍未被标记,浓度也无变化。以上结果说明了,天冬氨酸是神经视网膜组织合成谷氨酸,谷氨酰胺和天冬酰胺的主要原料,但是在RPE/脉络膜组织中天冬氨酸更多的是被用做来合成丙氨酸,丝氨酸和甘氨酸。4)探究丙氨酸氨代谢通路特点。15N-丙氨酸追踪结果显示:视网膜组织中被标记的仅有丙氨酸,增加接近20倍。RPE/脉络膜组织中,被标记的丙氨酸增加近40倍,同时天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸增加大于2倍,亮氨酸和丝氨酸增加近2倍。神经视网膜组织中谷氨酸/a-KG的比例是RPE/脉络膜组织的30倍,谷氨酸/丙氨酸的比例是RPE/脉络膜的4倍。说明RPE/脉络膜可以利用丙氨酸合成其他氨基酸。神经视网膜组织不能利用丙氨酸的含氮基团合成新的氨基酸,很可能是内源性谷氨酸/a-KG的比例过高,导致神经视网膜组织中丙氨酸氨基转移酶的催化是单一方向性。3、丙酮酸转运体(MPC)活性抑制后,主要氨基酸的氨代谢通路特点及机制:丙氨酸可以生成丙酮酸,丙酮酸是糖和氨基酸及脂肪代谢的枢纽。丙酮酸需要通过MPC进入线粒体氧化磷酸化。我们曾报道MPC被阻断后,天冬氨酸大量堆积。为了研究天冬氨酸来源,我们对最可能的两种来源氨基酸——谷氨酰胺和丙氨酸进行标记。1)MPC活性抑制后,谷氨酰胺氨代谢通路变化特点。15N-胺基-谷氨酰胺追踪结果显示:神经视网膜组织中,丙酮酸增加了 2.5倍,α-KG下降了约50倍,未标记天冬氨酸增加了 4.5倍,标记的天冬氨酸增加了 20倍。RPE/脉络膜中丙酮酸增加了 2.5倍,α-KG下降了约30倍,未标记的天冬氨酸增加了 4倍,标记的天冬氨酸增加了 20倍。均说明了谷氨酰胺的胺基是视网膜和RPE/脉络膜天冬氨酸的重要氮来源。2)MPC活性抑制后,丙氨酸氨代谢通路变化特点。15N-丙氨酸追踪结果显示:神经视网膜组织中,丙酮酸增加了接近2倍,α-KG下降了约30倍,未标记天冬氨酸增加近6倍但标记的天冬氨酸微弱增加(<2倍)。RPE/脉络膜中丙酮酸增加了 2.5倍,α-KG下降了约30倍,未标记的天冬氨酸增加了3倍,标记的天冬氨酸却降低了接近2倍。说明丙氨酸不是天冬氨酸的重要氮来源。但当MPC活性被抑制后,神经视网膜组织可能利用丙氨酸合成天冬氨酸。但RPE/脉络膜却没有此通路。为了证实这种假设,我们对丙氨酸碳代谢进行标记研究。3)MPC活性抑制后,丙氨酸碳代谢通路变化特点。13C-丙氨酸追踪结果显示:神经视网膜组织中,被标记的丙氨酸增加3倍。丙酮酸代谢通路上氨基酸的变化特点为,丙酮酸、乳酸、延胡索酸、天冬氨酸和苹果酸增加大于2.5倍,被标记的柠檬酸和α-KG下降了 2倍,琥珀酸下降了约0.2倍。在RPE/脉络膜中,标记的丙氨酸和丙酮酸增加接近2倍这与神经视网膜一致。但是,苹果酸与天冬氨酸的增加均小于神经视网膜组织。说明了在神经视网膜组织中,抑制MPC增加了柠檬酸上游代谢物含量但是降低了柠檬酸以及它下游代谢物含量。神经视网膜组织中未检测到未标记的柠檬酸但是标记的柠檬酸含量增加了 1500。RPE/脉络膜组织中,未标记的柠檬酸含量接近6000,是被标记柠檬酸接近含量的6倍。这些结果说明,当MPC被抑制后,部分丙氨酸可以进入视网膜线粒体以补偿丙酮酸的缺乏,但RPE/脉络膜中并无此通路。结论1、游离氨代谢特点:1)脑组织与神经视网膜组织游离氨代谢通路类似,主要通过谷氨酰胺通路代谢氨,部分通过合成天冬酰胺通路代谢氨。但脑组织氨代谢物更容易蓄积,这可能与脑组织容易氨中毒有关。2)肝脏游离氨代谢通路活跃,主要有尿素循环通路、谷氨酰胺通路以及部分从头合成谷氨酸通路。并且,尿素循环通路和谷氨酰胺通路代谢游离氨的能力大致相等。3)神经视网膜与RPE/脉络膜的游离氨代谢通路主要是合成谷氨酰胺。但是只有视网膜可以通过合成天冬酰胺通路代谢氨。RPE/脉络膜通过合成多种氨基酸代谢氨。2、微环境中视网膜和RPE/脉络膜的氨基酸氨代谢通路特点:1)视网膜和RPE/脉络膜中,谷氨酰胺的胺基和酰胺基代谢通路不同,且有明显的组织特异性。谷氨酰胺中胺基是谷氨酸和天冬氨酸的主要氮来源,酰基经再循环合成的主要是谷氨酰胺和天冬酰胺。RPE/脉络膜的胺基-谷氨酰胺的氨代谢途径比神经视网膜组织旺盛和复杂。且RPE/脉络膜中酰胺基-谷氨酰胺不能合成天冬酰胺。2)视网膜和RPE/脉络膜中,天冬氨酸氨代谢通路具有组织特异性。神经视网膜组织中天冬氨酸是合成谷氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的主要氮来源。但是在RPE/脉络膜中却是丙氨酸,丝氨酸和甘氨酸的重要氮来源。3)视网膜和RPE/脉络膜中,丙氨酸氨代谢通路具有组织特异性。MPC功能正常时,神经视网膜组织不利用丙氨酸通路代谢氨,但是RPE/脉络膜组织可以利用丙氨酸合成氨基酸。MPC被阻断时,神经视网膜组织中丙氨酸通路激活,部分丙氨酸可直接进入线粒体,补偿丙酮酸不足,但是RPE/脉络膜中无此补充通路。综上所述:氨代谢具有显着组织特异性,神经视网膜和视网膜色素上皮细胞在氨代谢中表现不同。但同时,视网膜色素上皮细胞可能通过激活多种氨基酸的代谢来支持视网膜的代谢,维持神经视网膜组织与RPE/脉络膜组织间的共生平衡。
李益民[2](2020)在《重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽》文中研究指明丙谷二肽(L-Alanyl-L-glutamine,Ala-Gln)具有溶解度高、热稳定性好及分解速率快等优势,已经成为一种替代谷氨酰胺(L-Glutamine,Gln)的新型营养补充剂,被广泛应用于食品、保健品和医药等领域。α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyl transferase,Aet)能以丙氨酸甲酯盐酸盐(L-alanine methyl ester hydrochloride,AlaOMe)和Gln为底物直接合成Ala-Gln,基于表达Aet的微生物合成法因其原料廉价易得、反应步骤少、反应条件温和、环境污染小且副产物少,可以作为工业化生产Ala-Gln的新方法。然而,Aet催化合成Ala-Gln过程存在反应时间长和底物转化率低等问题,限制了其在Ala-Gln工业化生产中的应用。本论文的研究工作构建了异源表达Sphingobacterium siyangensis来源Aet(SsAet)的重组大肠杆菌和重组酿酒酵母,通过菌体的重复利用及絮凝自固定化技术,解决了上述问题,为实现Ala-Gln安全、绿色且高效生产奠定了基础。取得的主要研究结果如下:首先,构建异源表达SsAet的重组大肠杆菌高效合成Ala-Gln。以最常用的表达型宿主 BL21(DE3),构建了重组大肠杆菌 BL21(DE3)-pET29a-SsAET(BPA),发现 BPA表达了大量的包涵体,影响了其催化活性。通过更换有助于蛋白二硫键形成的宿主,提高蛋白的溶解性,其中Origami 2(DE3)-pET29a-SsAET(OPA)的SsAet可溶表达量最高,且催化活性是BPA的1.4倍。进一步优化了 OPA的诱导条件和全细胞催化合成Ala-Gln的反应条件,确定了最佳的诱导条件:温度16℃、诱导OD620=0.25、诱导时间12h及IPTG浓度0.6 mmol/L;最佳的反应条件:温度25℃、pH值8.5、反应溶液硼酸盐缓冲液及底物摩尔配比AlaOMe/Gln=1/2。在最优条件下,以OPA作为合成Ala-Gln的全细胞催化剂,反应过程最短可在5 min内完成,获得最高的底物转化率为94%,而比生产强度可高达1.78 g/L·min-1·OD620-1,是目前国内外文献中报道的最高水平。除此之外,OPA具有良好的重复利用性,经五个循环批次反应仍能维持80%以上的催化活性,实现了循环高效合成Ala-Gln。但是,在相同的细胞浓度和反应时间内,OPA全细胞的催化效率比裂解液降低了 21%,发现了物质扩散阻力的存在。其次,构建表面展示SsAet的重组酿酒酵母。为了克服物质扩散阻力和大肠杆菌表达系统潜在的生物安全问题,以生物安全性的酿酒酵母作为表达宿主,将SsAet以N端和C端锚定两种方式展示在酵母细胞表面,通过免疫荧光实验,证明了 SsAet已成功固定在酵母细胞壁上;综合比较菌株生长情况和催化活性,选择N端锚定作为SsAet在酵母表面展示的方法。在此基础上,通过密码子优化提高了 SsAet表达量,发现经密码子优化的EBY100-pYD1-SsAETs(EPagaAs)在20 min时Ala-Gln合成量是未经密码子优化菌株的1.7倍;反应终点从40 min缩短至30 min,生产效率提高了 33%。但是,EPagaAs合成Ala-Gln的反应时间长,且底物转化率仅为OPA的58%,推测酵母表达系统中蛋白翻译后修饰可能影响了 SsAet的催化活性。然后,针对上述问题,研究了蛋白翻译后修饰对SsAet的影响。以糖基化程度低的毕赤酵母为表达宿主,通过密码子优化,提高蛋白表达量和催化效率,构建了分泌表达SsAet的重组毕赤酵母GS115-pPIC9-SsAETP(GPAP)。以GPAP为研究对象,对重组毕赤酵母的诱导条件和合成Ala-Gln的反应条件进行了优化,确定了最佳的诱导温度为26℃、诱导时间为3d及甲醇补加量(v/v)为1.5%;最佳的反应温度为28℃、反应pH值为8.5、反应底物为AlaOMe及底物摩尔配比AlaOMe/Gln为2/1。在最优条件下,GPAP的底物转化率仅为OPA的71%左右,再次验证了蛋白后修饰作用对SsAet催化活性的影响。在此基础上,构建了胞内和分泌表达SsAet的重组毕赤酵母,发现胞内表达SsAet重组菌株的催化活性明显高于分泌表达的,其中胞内表达且去掉内源信号肽的菌株KM71-pPIC3.5K-SAETP1800(KP3.5KAP1800)合成Ala-Gln的底物转化率最高为80%,能达到OPA的90%左右,比分泌表达的对比菌株提高了 41%,阐述了胞内表达SsAet和去掉内源信号肽是提高酵母表达系统中SsAet催化活性的有效方法。通过SDS-PAGE和Western blotting发现了分泌型SsAet分子量的增加;通过去糖基化酶的切除,证明了分泌型SsAet中糖基化修饰的存在;通过LC-MS证明了糖基化修饰发生在第442位Asn残基上;通过圆二色光谱仪鉴定了胞内和分泌型SsAet的二级结构,发现了两者的显着性差异,证明了糖基化修饰是影响SsAet结构和催化活性的重要因素。最后,基于上述研究结果,构建了自固定化重组酿酒酵母高效合成Ala-Gln。使用高拷贝数质粒构建了胞内表达SsAet且去掉内源信号肽的EBY100-pRS424-SsAETs1800(EP424AS1800)。通过培养和反应条件的优化,EP424AS1800能在5 min内获得高达74%的底物转化率,是表面展示重组菌EPagaAs的1.44倍,能达到OPA的83%以上;反应时间比EPagaAs缩短了 80%以上,生产效率提高了 5倍;比生产强度高达1.28 g/L·min·1·OD600-1。通过导入絮凝基因FLOI,得到了毫米级絮凝颗粒且催化活性不受影响的EP424As1800-FLOI,实现了其在反应器内的自固定化。EP424AS1800-FLO1经过十次循环催化反应后仍能保持稳定的催化活性,实现了连续高效合成Ala-Gln。本论文的研究为Ala-Gln安全、绿色且高效的工业化生产奠定了基础。
易雪静[3](2010)在《日粮添加限制性氨基酸—蛋氨酸对山羊消化代谢和血液参数的影响研究》文中指出本研究通过开展山羊日粮中不同蛋氨酸添加水平对瘤胃代谢和血液参数的影响研究,旨在为反刍动物限制性氨基酸-蛋氨酸的营养生理调控提供技术支撑。选择3头体况良好、安装永久性瘤胃瘘管、体重20±2.5kg的成年湘东黑山羊为试验动物,配制3种蛋氨酸水平分别为0.10%(LM)、0.20%(MM)和0.30%(HM)的试验日粮,采用3×3拉丁方试验设计,试验共分为3期,每期试验结束后立即转入下期试验的预饲期、。研究日粮蛋氨酸水平对山羊瘤胃代谢和血液参数的影响。结果显示:瘤胃各时间点pH值及其平均值均无显着差异(P>0.05);山羊瘤胃NH3-N浓度日内平均值分别为11.79mg/dl、8.66 mg/dl和9.32 mg/dl (P>0.05),瘤胃内pH值和NH3-N浓度有随着日粮蛋氨酸水平升高而呈现降低的趋势(P>0.05);日粮中蛋氨酸的添加水平对山羊瘤胃的总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、戊酸和丁酸浓度以及乙酸:丙酸比例均无显着影响作用(P>0.05);山羊血液中总蛋白(TP)、淀粉酶(AMY)、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素氮(BUN)和胰岛素(INS)日内平均含量均无显着差异(P>0.05),采食MM日粮的山羊血液胰高血糖素日内平均含量显着高于采食LM和HM日粮的山羊(P<0.05),而采食HM日粮的山羊亦显着高于采食LM日粮的山羊(P<0.05)。以上结果表明:日粮中添加蛋氨酸有利于山羊瘤胃代谢,其中以添加0.20%最为适宜。
王如帆[4](2007)在《L-丙氨酰-L-谷氨酰胺结晶过程研究》文中进行了进一步梳理L-丙氨酰- L-谷氨酰胺作为谷氨酰胺的替代药物,是一种静脉营养注射剂。对严重分解代谢疾病(如烧伤/外伤/大手术、急慢性感染、骨髓移植和多器官功能碍综合症)、肠道功能不全、免疫缺乏综合症等疾病具有良好的治疗效果。目前国内生产的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺结晶存在晶习不好,粒度分布不均匀的现象,且文献对其结晶过程的报道较少,基于以上原因,本文对L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶析结晶过程进行了较系统的研究。本文采用X-射线粉末衍射法对L-丙氨酰-L-谷氨酰胺晶体结构进行了探讨。利用TREOR90计算程序对其X-射线粉末衍射数据进行指标化,确定了晶胞参数及所属晶系和空间群,并应用Cerius2软件利用BFDH模型和AE模型对L-丙氨酰-L-谷氨酰胺晶习进行模拟。采用激光法测定了10℃~40℃下,乙醇体积分数在0-80%范围内L-丙氨酰-L-谷氨酰胺结晶的溶解度和超溶解度曲线,并拟合得到了其相应的数学模型。同时通过DSC和TG的测定,对L-丙氨酰-L-谷氨酰胺晶体的某些热力学性质进行分析。以晶习和粒度分布为目标,对溶析结晶过程的研究。通过考察各种结晶操作条件(溶析剂、结晶温度、初始液浓度、晶种、养晶时间、溶析剂流加速率、搅拌速率等)对L-丙氨酰-L-谷氨酰胺晶习几粒度分布的影响,初步确定了L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在乙醇水溶液中的溶析结晶过程较优的操作条件,为今后进一步的研究提供依据。本文所做的研究工作,国内外目前尚未见报道。
刘艳丰[5](2007)在《不同包被蛋氨酸对泌乳中期奶牛泌乳性能和血液指标的影响》文中研究指明目的:利用糊化技术对蛋氨酸和羟甲基蛋氨酸钙进行处理,通过饲喂试验(检测奶产量和乳成分、血液指标等),瘤胃降解试验对糊化蛋氨酸和糊化羟甲基蛋氨酸钙在奶牛中的应用及其稳定性进行评价,以确定其对泌乳牛泌乳性能的影响和过瘤胃特性。方法:饲喂试验:选取25头荷斯坦奶牛分为五组,分别采食基础日粮(对照组)、基础日粮+400g糊化蛋氨酸(试验组一)、基础日粮+20g蛋氨酸(试验组二)、基础日粮+400g糊化羟甲基蛋氨酸钙(试验组三)、基础日粮+20g羟甲基蛋氨酸钙(试验组四)。测定不同处理的饲料在全消化道内的消化情况和试验牛产奶量和乳成份及血液指标。瘤胃降解试验:选取3头装有瘤胃瘘管的奶牛,通过瘤胃尼龙袋法测定糊化蛋氨酸和糊化羟甲基蛋氨酸钙的瘤胃稳定性和降解率。结果:1、试验组四的DM、NDF和ADF表观消失率比对照组分别提高1.91%(p<0.5)、20.98%(p<0.1)、11.4%(p<0.5);试验组四的CP表观消失率比试验组二提高3.06%(p<0.5);试验组三的NDF表观消失率与对照组差异显着(p<0.5),提高15.73%。2、各组干物质采食量差异不显着(P>0.05),但试验组均有增加的趋势;试验组四产奶量极显着(P<0.01)高于对照组,试验组三产奶量显着(P<0.05)高于对照组,分别比对照组提高6.93%和4.95%,试验组三乳脂率比对照组提高2.31%(P=0.086);试验组四乳蛋白显着(P<0.05)高于试验组二,提高2.15%。3、试验组三的血浆白蛋白显着(P<0.05)高于对照组,提高6.39%;试验组四和试验组三的血浆总蛋白显着(P<0.05)高于对照组,分别提高8.48%和7.07%;试验四组的血浆尿素氮明显比对照组低(P<0.05),降低6.98%。结果表明包被蛋氨酸能降低血浆尿素氮,提高血浆蛋白含量,促进蛋白质的利用和吸收。4、五种不同处理的精料在瘤胃中培育12h后,糊化羟甲基蛋氨酸钙的DM、CP均低于其他试验组。在瘤胃培育24h后,糊化蛋氨酸和糊化羟甲基蛋氨酸钙的DM消失率分别为52.81和62.85,过瘤胃量为47.19和37.15;在24小时,糊化蛋氨酸和糊化羟甲基蛋氨酸钙CP降解率分别为54.41和69.20,而蛋氨酸和玉米混合物在24h基本降解完(91.44),表明糊化处理对蛋氨酸和羟甲基蛋氨酸钙具有良好的的保护性。结论:包被蛋氨酸能提高饲料的DM、CP、NDF、ADF的表观消失率。糊化羟甲基蛋氨酸钙和羟甲基蛋氨酸钙能提高泌乳中期奶牛的奶产量和乳乳脂率,降低尿素氮的含量,提高血浆蛋白含量,从而提高蛋白质的利用和乳成分中蛋白含量,但糊化蛋氨酸对泌乳牛的影响不显着。在瘤胃培育12h后,糊化蛋氨酸和糊化羟甲基蛋氨酸钙DM、CP降解率均在50%左右,表明糊化处理对蛋氨酸和羟甲基蛋氨酸钙的保护性不是很好,但可以接受。
毛成文[6](2004)在《包被蛋氨酸和赖氨酸对肉羊氮代谢和生产性能影响研究》文中研究说明本研究通过4个试验研究过瘤胃保护氨基酸(包被蛋氨酸和包被赖氨酸)对肉羊氮平衡、血液指标和生产性能的影响。由包被氨基酸产品性能检测和动物试验两部分组成,动物试验选用27只三月龄断奶二元杂交肉羊,采用3×3析因试验设计,包被蛋氨酸和包被赖氨酸添加量为两试验因素,各设三水平。试验结果表明:(1)以pH敏感性高分子材料为包衣制备的包被氨基酸产品在瘤胃中放置12小时氨基酸(蛋氨酸和赖氨酸)的消失率分别为29.1%和55.2%,两级体外消化试验中氨基酸的释放率超过90.0%,具有较好的过瘤胃特性和真胃释放性能。(2)日粮添加包被蛋氨酸和包被赖氨酸能提高肉羊氮沉积和氮表观消化率。(3)日粮添加包被蛋氨酸和包被赖氨酸降低了肉羊血浆尿素氮、血浆总游离氨基酸和必需氨基酸浓度。(4)日粮添加包被蛋氨酸和包被赖氨酸能显着提高肉羊平均日增重,显着降低料重比,日粮中包被蛋氨酸和包被赖氨酸不同水平组合对肉羊日增重和料重比的影响有显着正交互作用。(5)本试验中,在玉米豆粕精料和青贮粗料,粗蛋白含量11.3%的日粮条件下,断奶二元杂交肉羊日粮中包被蛋氨酸和包被赖氨酸的适宜添加量分别为3~6克/天和5~10克/天。
Peter Fürst,李春风,牛玉坚[7](2003)在《氮代谢研究的30年历程:从铵盐到双肽(续)》文中认为
Fürst Peter MD,PhD,牛玉坚,李春风[8](2002)在《氮代谢研究的30年历程:从铵盐到双肽》文中研究指明
二、氮代谢研究的30年历程:从铵盐到双肽(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、氮代谢研究的30年历程:从铵盐到双肽(论文提纲范文)
(1)组织特异性游离氨与氨基酸的氨代谢途径及机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
符号说明 |
前言 |
1. 实验材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 实验试剂 |
1.3 实验仪器 |
2. 实验方法 |
2.1 ~(15)N同位素标记代谢物检测 |
2.2 ~(13)C同位素标记代谢物检测 |
2.3 视网膜和RPE/脉络膜离体培养——无标记NH_4C1 |
2.4 质谱联合气相质谱检测 |
2.5 GC-MS上机检测 |
2.6 GC-MS数据分析 |
2.7 IsoCor丰度矫正 |
2.8 统计学分析 |
3. 实验结果与讨论 |
3.1 探究不同组织间游离氨代谢特征 |
3.1.1 体内实验动态标记结果 |
(1) 神经视网膜组织与脑组织氨代谢特点 |
(2) 肝脏组织氨代谢特特点 |
3.1.2 体外神经视网膜和RPE/脉络膜间游离氨代谢特征 |
(1) 不同浓度非同位素标记NH4Cl对主要糖和氨基酸代谢物的影响 |
(2) 不同浓度同位素标记NH4Cl对主要糖和氨基酸代谢物的影响 |
(3) 神经视网膜与RPE/视网膜游离氨代谢特征比较 |
(4) 神经视网膜组织中不能产生尿素 |
3.1.3 讨论 |
(1) 实验方法选取—气相色谱-质谱平台联合同位素稳态记法 |
(2) 实验对象选择—体外实验选择培养视网膜器官的原因 |
(3) 生理状况时氨代谢的组织特异性 |
(4) 氨中毒时氨代谢的组织特异性 |
3.1.4 小结 |
3.2 神经视网膜和RPE/脉络膜中主要氨基酸的氨代谢通路特点 |
3.2.1 结果与分析 |
(1) 探究谷氨酰胺氨代谢通路的特点 |
(2) 探究天冬氨酸氨代谢通路特点 |
(3) 探究丙氨酸氨代谢通路特点 |
3.2.2 讨论 |
(1) 神经视网膜组织依赖于天冬氨酸转移酶重新合成谷氨酸和谷氨酸衍生胺基酸 |
(2) RPE/脉络膜合成多种氨基酸——与它执行复杂的功能相适应 |
(3) 神经视网膜组织与RPE/脉络膜特组织代谢差异研究 |
3.2.3 小结 |
3.3 探究MPC活性抑制后,主要氨基酸的氨代谢通路变化特点及机制 |
3.3.1 结果与分析 |
(1) MPC活性抑制后,谷氨酰胺氨代谢通路变化特点 |
(2) MPC活性抑制后,丙氨酸氨代谢通路变化特点 |
(3) MPC活性抑制后,丙氨酸碳代谢通路变化特点 |
3.3.2 讨论 |
(1) 丙酮酸代谢,线粒体丙酮酸转运MPC |
(2) MPC活性抑制后神经视网膜和RPE/脉络膜天冬氨酸氨来源不同 |
(3) 神经视网膜组织和RPE/脉络膜组织氨代谢共生关系 |
3.3.3 小结 |
4.结论 |
4.1 游离氨代谢特点 |
4.2 视网膜和RPE/脉络膜的氨基酸氨代谢通路特点 |
4.3 创新点 |
4.4 不足与展望 |
参考文献 |
附录 |
综述 |
参考文献 |
攻读学位期间取得的研究成果 |
致谢 |
(2)重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
主要符号表 |
引言 |
1 文献综述 |
1.1 L-谷氨酰胺 |
1.1.1 理化性质 |
1.1.2 代谢及生理功能 |
1.1.3 局限性及替代物 |
1.2 丙谷二肽 |
1.2.1 理化性质及应用优势 |
1.2.2 合成方法及研究进展 |
1.2.3 检测方法 |
1.3 异源表达系统介绍 |
1.3.1 大肠杆菌原核表达系统 |
1.3.2 酿酒酵母真核表达系统 |
1.3.3 毕赤酵母真核表达系统 |
1.4 糖基化修饰 |
1.4.1 N-糖基化修饰 |
1.4.2 O-糖基化修饰 |
1.5 本文主要研究思路 |
1.5.1 选题背景及存在问题 |
1.5.2 研究内容及技术路线 |
2 异源表达SsAet重组大肠杆菌高效合成Ala-Gln |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 菌株和质粒 |
2.2.2 试剂和仪器 |
2.2.3 培养基和溶液 |
2.2.4 引物 |
2.2.5 分子操作技术 |
2.2.6 分析验证方法 |
2.2.7 异源表达SsAet重组大肠杆菌的构建 |
2.2.8 异源表达SsAet重组大肠杆菌诱导条件的优化 |
2.2.9 全细胞催化合成Ala-Gln反应条件的优化 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 Ala-Gln定性定量方法的确立 |
2.3.2 异源表达SsAet重组大肠杆菌的表征 |
2.3.3 可溶性表达SsAet重组大肠杆菌的构建及筛选 |
2.3.4 OPA催化方式及催化活性差异性的分析 |
2.3.5 OPA诱导条件和全细胞催化反应条件的优化 |
2.3.6 循环利用OPA全细胞合成Ala-Gln |
2.4 本章小结 |
3 表面展示SsAet重组酿酒酵母合成Ala-Gln |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 菌株和质粒 |
3.2.2 试剂和仪器 |
3.2.3 培养基和溶液 |
3.2.4 引物 |
3.2.5 分子操作技术 |
3.2.6 分析验证方法 |
3.2.7 表面展示SsAet重组酿酒酵母的构建 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 表面展示方式对SsAet催化活性的影响 |
3.3.2 密码子优化对SsAet催化活性的影响 |
3.3.3 表面展示SsAet重组酿酒酵母的絮凝化 |
3.4 本章小结 |
4 糖基化修饰对SsAet结构和催化活性的影响 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 菌株和质粒 |
4.2.2 试剂和仪器 |
4.2.3 培养基和溶液 |
4.2.4 引物 |
4.2.5 分子操作技术 |
4.2.6 分析验证方法 |
4.2.7 异源表达SsAet重组毕赤酵母的构建 |
4.2.8 产酶条件和催化反应条件的优化 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 异源表达SsAet重组毕赤酵母的表征 |
4.3.2 糖基化修饰对SsAet催化活性的影响 |
4.3.3 糖基化修饰的鉴定及对SsAet结构的影响 |
4.4 本章小结 |
5 胞内表达SsAet重组酿酒酵母的自固定化及高效合成Ala-Gln |
5.1 引言 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 菌株和质粒 |
5.2.2 试剂和仪器 |
5.2.3 培养基和溶液 |
5.2.4 引物 |
5.2.5 分子操作技术 |
5.2.6 分析验证方法 |
5.2.7 胞内表达SsAet重组酵母的构建 |
5.2.8 胞内表达SsAet重组酵母培养条件的优化 |
5.2.9 胞内表达SsAet重组酵母全细胞催化反应条件的优化 |
5.3 结果与讨论 |
5.3.1 胞内表达SsAet重组酵母的催化活性 |
5.3.2 胞内表达SsAet重组酵母的条件优化 |
5.3.3 胞内表达SsAet重组酵母的自固定化及重复利用 |
5.4 本章小结 |
6 结论与展望 |
6.1 结论 |
6.2 创新点 |
6.3 展望 |
参考文献 |
附录 |
作者简介 |
攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
致谢 |
(3)日粮添加限制性氨基酸—蛋氨酸对山羊消化代谢和血液参数的影响研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
1 蛋氨酸生物学功能 |
1.1 营养作用 |
1.2 调节能量代谢 |
1.3 提高免疫力 |
1.4 抗霉菌毒素 |
2 蛋氨酸代谢 |
3 蛋氨酸在动物生产中的应用 |
3.1 反刍动物 |
3.2 猪 |
3.3 家禽 |
4 本论文研究目的意义、内容方法、技术路线和特色创新 |
4.1 研究目的意义 |
4.2 内容方法 |
4.3 技术路线 |
4.4 特色和创新 |
试验研究 日粮蛋氨酸水平对山羊瘤胃代谢和血液参数的影响 |
1 材料与方法 |
1.1 试验动物及其饲养管理 |
1.2 试验日粮 |
1.3 样品采集及预处理 |
1.4 样品的分析测定 |
1.5 数据分析 |
2 结果分析 |
2.1 日粮蛋氨酸水平对山羊瘤胃pH值的影响 |
2.2 日粮蛋氨酸水平对山羊瘤胃NH_3-N浓度的影响 |
2.3 日粮蛋氨酸水平对山羊瘤胃VFA组成及其含量的影响 |
2.4 日粮蛋氨酸水平对山羊血液生化指标的影响 |
2.5 日粮蛋氨酸水平对山羊血液激素含量的影响 |
3 讨论 |
3.1 日粮蛋氨酸水平对山羊瘤胃pH值的影响 |
3.2 日粮蛋氨酸水平对山羊瘤胃NH_3-N浓度的影响 |
3.3 日粮蛋氨酸水平对山羊瘤胃VFA组成及其含量的影响 |
3.4 日粮蛋氨酸水平对山羊血液生化指标的影响 |
3.5 日粮蛋氨酸水平对山羊血液激素含量的影响 |
4 小结 |
全文结论 |
研究展望 |
参考文献 |
附录 |
符号表 |
致谢 |
作者简历 |
(4)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺结晶过程研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
第一章 前言 |
第二章 丙谷二肽晶体结构分析 |
2.1 文献综述 |
2.1.1 晶体结构 晶系 |
2.1.2 晶体的晶习 |
2.1.3 晶体结构的测定方法 |
2.1.4 晶体模拟模型 |
2.2 晶体结构测定与晶习模拟 |
2.2.1 实验样品与条件 |
2.2.2 结果分析与讨论 |
2.3 小结 |
第三章 丙谷二肽结晶热力学研究 |
3.1 综述 |
3.1.1 溶解度 |
3.1.2 超溶解度及介稳区 |
3.1.3 热分析 |
3.2 实验部分 |
3.2.1 原料和实验装置 |
3.2.2 溶解度和超溶解度的测定 |
3.2.3 结果分析与讨论 |
3.3 熔点的测定 |
3.4 热重分析 |
3.5 小结 |
第四章 丙谷二肽结晶工艺研究 |
4.1 实验部分 |
4.1.1 实验原料及装置 |
4.1.2 实验方法 |
4.2 实验结果与讨论 |
4.2.1 溶剂的影响 |
4.2.2 晶种对结晶粒度分布的影响 |
4.2.3 养晶时间的影响 |
4.2.4 干燥条件对结晶形态的影响 |
4.2.5 溶析结晶温度对结晶产品的影响 |
4.2.6 初始液浓度对结晶产品的影响 |
4.2.7 搅拌速率的控制 |
4.2.8 溶析剂的流加速率的控制 |
4.3 小结 |
第五章 结论与建议 |
5.1 结论 |
5.2 存在问题 |
5.3 建议 |
符号说明 |
参考文献 |
附录 |
附录一 溶解度的实验测定数据 |
附录二 溶解度数据处理:经验方程数据处理 |
附录三 溶解度数据处理:λ h 方程数据处理 |
附录四 丙谷二肽超溶解度试验测定数据 |
附录五 纯度测定方法 |
致谢 |
(5)不同包被蛋氨酸对泌乳中期奶牛泌乳性能和血液指标的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一部分 绪论 |
1 国内外研究进展 |
1.1 反刍动物蛋白质营养研究进展 |
1.1.1 反刍动物蛋白质营养的实质和核心 |
1.2 反刍动物氨基酸营养 |
1.2.1 反刍家畜限制性必需氨基酸的提出 |
1.2.2 反刍家畜的限制性必需氨基酸 |
1.2.3 反刍家畜限制性必需氨基酸的影响因素 |
1.2.4 高产奶牛限制性氨基酸 |
1.3 蛋氨酸在动物营养上的研究进展 |
1.3.1 蛋氨酸的质量特性与标准 |
1.3.2 蛋氨酸的代谢途径 |
1.3.3 蛋氨酸的营养功能 |
1.4 瘤胃保护性氨基酸和过瘤胃技术 |
1.4.1 瘤胃保护性氨基酸的概念 |
1.4.2 氨基酸的过瘤胃保护原理 |
1.4.3 过瘤胃技术 |
1.4.4 过瘤胃氨基酸保护效果的测定 |
1.5 影响瘤胃保护性氨基酸添加效果的因素 |
1.5.1 RPAA 的加工处理方法 |
1.5.2 饲粮配合 |
1.5.3 添加 RPAA 的种类 |
1.5.4 家畜的生理阶段与生产水平(添加时期) |
1.5.5 添加量 |
1.6 RPAA 对反刍动物生产性能的影响 |
1.6.1 补饲过瘤胃蛋氨酸对泌乳奶牛的影响 |
1.6.2 RPAA 对奶产量、乳蛋白含量及乳脂产量的影响 |
1.6.3 对瘤胃发酵和微生物活性的影响 |
1.6.4 可减少氮排泄造成的环境污染 |
1.6.5 促进肥育肉牛和羊毛生长 |
1.7 研究的目的和意义 |
第二部分 试验部分 |
试验一 不同包被蛋氨酸对营养物质消失率的影响 |
1 材料和方法 |
1.1 试验时间和地点和试验动物 |
1.2 日粮组成和试验材料处理 |
1.3 饲养管理及测定指标 |
1.4 样本的采集和试验方法 |
1.5 统计分析 |
2 试验结果与分析 |
3 讨论 |
4 小结 |
试验二 包被蛋氨酸对泌乳中期奶牛泌乳性能的影响 |
1 材料和方法 |
1.1 试验时间和地点和试验动物 |
1.2 日粮组成和试验材料处理 |
1.3 产奶量的记录和奶样的采集 |
1.4 统计分析 |
2 试验结果和分析 |
3 讨论 |
4 小结 |
试验三 包被蛋氨酸对泌乳中期奶牛血液指标的影响 |
1 材料和方法 |
1.1 试验时间和地点和试验动物 |
1.2 日粮组成和试验材料处理 |
1.3 饲养管理及测定指标 |
1.4 血样的采集 |
1.5 血液样本各项指标测定方法 |
1.6 统计分析 |
2 结果和分析 |
3 讨论 |
4 小结 |
试验四 包被蛋氨酸瘤胃降解试验 |
1 材料和方法 |
1.1 试验材料和试验时间和地点 |
1.2 试验设计 |
1.3 统计分析 |
2 结果和分析 |
3 讨论 |
4 小结 |
第三部分 论文总体结论、创新点和研究展望 |
3.1 论文总体结论 |
3.2 创新点 |
3.3 研究展望和需进一步解决的问题 |
参考文献 |
附录 |
作者简介 |
致谢 |
石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
(6)包被蛋氨酸和赖氨酸对肉羊氮代谢和生产性能影响研究(论文提纲范文)
第一章 绪论 |
1 反刍动物蛋白质消化代谢和氨基酸营养特点 |
2 反刍动物氨基酸平衡模式的发展 |
3 反刍动物限制性氨基酸理论的发展 |
4 过瘤胃保护氨基酸(RPAA)的研究 |
5 论文构思与设计 |
第二章 试验研究 |
试验一 包被蛋氨酸和赖氨酸制备与性能检验 |
摘要 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
3 结果与讨论 |
4 小结 |
试验二 包被蛋氨酸和赖氨酸对肉羊氮平衡的影响 |
摘要 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
3 结果与讨论 |
4 小结 |
试验三 包被蛋氨酸和赖氨酸对肉羊血浆尿素和血浆游离氨基酸的影响 |
摘要 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
3 结果与讨论 |
4 小结 |
试验四 包被蛋氨酸和赖氨酸对肉羊生长性能的影响 |
摘要 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
3 结果与讨论 |
4 小结 |
第三章 结论与建议 |
参考文献 |
致谢 |
(8)氮代谢研究的30年历程:从铵盐到双肽(论文提纲范文)
铵 |
尿毒症时蛋白质、氨基酸和酮酸的代谢 |
细胞内氨基酸的研究 |
氨基酸失衡:拮抗作用 |
四、氮代谢研究的30年历程:从铵盐到双肽(论文参考文献)
- [1]组织特异性游离氨与氨基酸的氨代谢途径及机制研究[D]. 徐蓉. 扬州大学, 2020
- [2]重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽[D]. 李益民. 大连理工大学, 2020(07)
- [3]日粮添加限制性氨基酸—蛋氨酸对山羊消化代谢和血液参数的影响研究[D]. 易雪静. 湖南农业大学, 2010(03)
- [4]L-丙氨酰-L-谷氨酰胺结晶过程研究[D]. 王如帆. 天津大学, 2007(04)
- [5]不同包被蛋氨酸对泌乳中期奶牛泌乳性能和血液指标的影响[D]. 刘艳丰. 石河子大学, 2007(06)
- [6]包被蛋氨酸和赖氨酸对肉羊氮代谢和生产性能影响研究[D]. 毛成文. 中国农业大学, 2004(03)
- [7]氮代谢研究的30年历程:从铵盐到双肽(续)[J]. Peter Fürst,李春风,牛玉坚. 中国临床营养杂志, 2003(01)
- [8]氮代谢研究的30年历程:从铵盐到双肽[J]. Fürst Peter MD,PhD,牛玉坚,李春风. 中国临床营养杂志, 2002(04)