一、中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定（论文文献综述）
万政伟[1]（2021）在《人持续性G病毒二型在中国人群中的检出及其感染性克隆初步探索》文中指出研究背景人持续性G病毒二型（Human Pegivirus Type2,HPgV-2）于2015年英国和美国研究团队首次报道。进化分析发现该病毒属于黄病毒科病毒,与人感染的HPgV（GBV-C）同属于黄病毒科Pegivirus属病毒。目前关于HPgV-2的研究主要是通过观察性研究描述该病毒在人群中的感染特点而HPgV-2病毒的细胞嗜性和致病性尚无任何研究报道。研究发现,HPgV-2主要经血传播,尤其是静脉注射感染。该病毒大多与丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）共感染,HCV人群中HPgV-2核酸阳性率为0.29%-2.4%。健康献血员人群、HBV单独感染者、HIV-1单独感染者中很少报道有HPgV-2核酸阳性者。Pegivirus属病毒除了人感染的HPgV（GBV-C）和HPgV-2外,也有陆续报道其他动物感染的相关病毒。和其他种属感染的Pegivirus病毒一样,HPgV-2很难在体外进行分离培养,这直接影响该病毒感染机制及生物学特性研究。研究目的和意义（1）建立HPgV-2的血清学和核酸检测方法,筛查相关人群,探索HPgV-2在不同人群中的感染情况等流行病学特征。（2）扩增国内HPgV-2病毒株全序,分析该病毒基因组特点和分子进化关系。（3）探究HPgV-2对人群宿主的潜在危害及细胞嗜性。（4）尝试建立HPgV-2的体外培养体系,进一步研究该病毒的生物学特性以及和HCV/HIV-1共感染关系。研究内容及方法1、人群调查（1）建立HPgV-2的血清学和核酸检测方法,筛查该病毒在不同人群中的感染情况。（2）扩增HPgV-2的全长基因组序列,并分析该病毒序列变异情况和分子进化关系。2、病毒的致病性和细胞嗜性研究（1）比较HPgV-2感染者肝功能血清学指标,探索HPgV-2对肝脏损伤指标的影响。（2）随访HPgV-2的HCV/HIV-1感染患者,观察HPgV-2的感染状态。对比HCV病毒清除前后肝功能血清指标和肝脏病理改变结果,探索HPgV-2与肝脏损伤的关系。（3）在随访过程中获取患者的肝脏组织和PBMCs,通过免疫组化和核酸原位杂交及核酸扩增方法确定HPgV-2的细胞嗜性。3、感染性克隆构建,探索体外培养方法（1）分析质粒载体和HPgV-2全基因组序列,确定单克隆位点,并合成单克隆位点序列,构建含单一克隆位点的质粒骨架载体。（2）运用PCR方法分段扩增HPgV-2全基因组序列,采用酶切连接方法将扩增片段逐一插入载体,构建HPgV-2全基因组克隆。（3）获得的HPgV-2全基因组克隆,经线性化及体外转录获得病毒全基因组RNA。（4）利用脂质体转染方法将HPgV-2全基因组RNA转染进入细胞系,经过细胞系培养及核酸和抗原检测等方法确定病毒是否体外拯救成功。主要结果1、HPgV-2的基因变异及感染特点研究（1）HPgV-2的抗原和核酸检测方法建立本研究合成了三条HPgV-2基因组部分序列多肽（P4,P9,P16）,以此建立了酶联免疫吸附试验（ELISA）来检测血清中的anti-HPgV-2抗体。参考已报道的HPgV-2基因组序列,设计了针对HPgV-2 5’UTR和NS3区域的巢式PCR扩增方法以及该病毒的核酸定量qRT-PCR检测方法。（2）HPgV-2的基因变异性分析本研究采用RT-PCR分段扩增方式获得6条HPgV-2近似全长核酸序列。通过基因组进化分析,发现目前已发现的国内HPgV-2株和国外毒株之间的变异非常小（93.6%-97.8%）。同时,HPgV-2在进化关系上和蝙蝠体内的持续性G病毒最为接近。（3）HPgV-2人群感染特点分析本研究收集了不同人群横断面血清样本共计8198份,检测结果提示HPgV-2和HCV、HIV-1感染相关;HCV人群中,HPgV-2抗体阳性率（1.23%）是健康献血员的8.23倍。在HCV/HIV-1共感染人群中,HPgV-2抗体阳性率（8.91%）是健康献血员的59.66倍,是HCV人群的7.25倍;HPgV-2核酸阳性率（3.47%）是 HCV 人群（0.29%）的 12.08 倍。2、HPgV-2在人体内感染状态、致病性及细胞嗜性研究（1）观察到HPgV-2在人体内能形成持续性感染及一过性感染两种状态,且能够独立于HCV,HIV-1形成稳定感染本研究收集了南方医院240例HCV感染者和广州市第八人民医院512例HCV/HIV-1共感染者样本,对HPgV-2核酸阳性患者进行纵向观察,发现HPgV-2在病人体内形成长达5年的持续性感染状态。同时,也观察到HPgV-2病毒从阳性到转阴的一过性的感染状态。当HPgV-2/HCV共感染患者接受直接抗病毒药物（DAAs）治疗时,HPgV-2不受DAAs药物抑制,能够在患者体内维持稳定感染状态;HCV病毒清除后继续随访半年,HPgV-2仍能在患者体内稳定存在。（2）HPgV-2对肝脏指标（肝功能血液指标、病理指标）HCV感染者中,HPgV-2 RNA阳性和阴性感染者之间ALT水平没有显着性差异（P=0.776）;HPgV-2血清学阳性感染者与阴性感染者ALT水平无显着性差异（P=0.298）;HPgV-2抗体水平高低（OD≥1.0或者OD<1.0）感染者ALT水平也没有显着影响（P=0.623）。HPgV-2/HCV合并感染患者接受DAAs治疗后,HCV被清除而HPgV-2在患者体内单独持续感染过程中,对比感染者肝脏指标和病理特征发现,HPgV-2未导致患者的肝脏指标异常或明显肝脏病理特征改变。（3）HPgV-2的细胞嗜性免疫组化实验只在肝组织浸润的淋巴细胞内检测到HPgV-2抗原信号;RNA原位杂交在肝脏细胞和浸润淋巴细胞中都能检测到HCV信号,但只在浸润淋巴细胞中检测到微弱的HPgV-2 RNA信号。RNA正负链原位杂交实验在外周血PBMC细胞中检测到HPgV-2正负链RNA信号（阳性率分别为8%-10%,5%-6%）以及HCV病毒的正负链RNA信号（阳性率分别为6%-11%,4%-6%）。CD4+、CD8+T细胞及B淋巴细胞亚群经流式分选富集后利用HCV/HPgV-2正负链RNA扩增实验主要在B淋巴细胞亚群中扩增到HCV和HPgV-2正负链 RNA。3、HPgV-2感染性克隆构建本研究分段扩增了 HPgV-2全基因组并通过单一酶切位点逐一连入骨架载体,成功获得了 HPgV-2全长克隆。HPgV-2全长克隆经体外转录获得病毒全基因组RNA后转染Vero细胞,经核酸和抗原检测显示我们构建的全长克隆能够拯救出HPgV-2,但病毒传代发现不能形成持续有效的感染。结论1、本研究确定中国人群中存在人持续性G病毒二型（HPgV-2）感染。目前已发现的中国HPgV-2株和国外HPgV-2病毒株基因序列高度保守。HPgV-2主要感染HCV人群,合并HIV-1感染显着增加HCV人群中HPgV-2感染率。2、HPgV-2在感染者体内能形成长达5年以上的稳定感染;DAAs药物或不能抑制HPgV-2复制;HPgV-2可以不依赖HCV/HIV-1病毒在患者体内形成单独的持续感染状态。3、HPgV-2不感染肝脏细胞,也不引发明显的肝脏损伤;研究结果首次发现HPgV-2是一个淋巴细胞嗜性病毒,且主要感染B淋巴细胞。4、本课题成功构建了 HPgV-2基因组全长克隆,但尚不能稳定组装成具有持续感染性的病毒颗粒。
陈曦[2]（2021）在《基因Ⅵ型NDV HN蛋白新毒力位点的鉴定及弱毒疫苗候选株的构建》文中指出新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的给世界养禽业造成极大危害的烈性传染病。迄今为止,已经在250多种鸟类以及少数的哺乳动物上发现了NDV的感染。为了适应庞大的宿主类型,与其它单股负链RNA病毒一样,NDV通过基因突变产生了大量的变异体,表现在多种多样的基因型。除宿主因素外,NDV的毒力主要是由其基因编码的膜融合蛋白（Fusion protein,F）裂解位点（Cleavage site,cs）决定的。虽然,基因Ⅵ型NDV的Fcs为强毒株类型,但有些毒株在鸡上表现出弱毒株特性,这表明基因Ⅵ型NDV的毒力可能受到其它毒力因子的影响。基因Ⅵ型NDV是一类宿主和抗原变异的病毒,易感宿主是鸽子,与用来生产并免疫我国家禽的ND疫苗的基因II型或ⅥI型NDV的同源性不高,常用的ND疫苗在鸽子上仅能提供部分保护。目前,缺少针对基因Ⅵ型的ND疫苗用以防控鸽子被NDV感染。因此,开展基因Ⅵ型NDV毒力的研究,并在此基础上研发针对该基因型的ND弱毒疫苗,对鸽源NDV的防控具有重要意义。本研究具体实验内容及结果如下:1.两株毒力差异较大的同源NDV毒株的生物学特性比较为了获得自然突变致弱的NDV毒株,实验室前期将一株分离自朱鹮的、中等毒力的基因Ⅵ型NDV毒株（CI10）在鸡胚中进行连续传代,多次传代后,发现传代株（CE16）的致病能力显着降低。为了对传代株有更加清楚的了解,本研究对CE16的生物学特性和致病性进行了全面的分析;与CI10相比,CE16产生的蚀斑大小缩小了约50%;在细胞上的增殖能力降低至原来的1/30;致病指数ICPI由1.04降至0.35,MDT由86 h延长至120 h以上;对鸡的致病性试验也显示CE16未能引起明显的临床症状,死亡率由100%降至0。为了进一步研究上述生物学表型及毒力改变的分子机制,本研究对两株毒株的全基因组序列进行了测序分析。结果显示,两毒株全长均为15192个核苷酸（Nucleotide,nt）,F蛋白序列完全一致且含有强毒株特征的Fcs。根据F基因的系统发育分析,两株毒株均属于基因Ⅵ型NDV。分子特征比较发现,与CI10相比,CE16基因上有6个nt的替换导致5个氨基酸（Amino acid,aa）的突变,这些突变位点分布于核衣壳蛋白（Nucleoprotein,NP）（A426T）、HN蛋白（A215G和T430A）以及聚合酶蛋白（Large polymerase protein,L）（E1694V和R1767G）。鉴于HN蛋白与NDV膜融合活性有关,而NP和L与病毒的增殖活性有关。推测上述表型差异的原因是由这5个位点上氨基酸的突变导致的。进一步的蛋白质3D结构模型预测分析发现:HN215的突变未引起明显的结构改变;HN430的突变使序列结构由β折叠变为无规则卷曲;L1694的突变显着改变了蛋白质结构;L1767的突变将α螺旋变成无规则卷曲。尽管NP426位没有相应的蛋白结构,但其位于NP蛋白中影响NP和磷蛋白（Phosphoprotein,P）互作的不规则区域内。上述结果为研究NDV毒力的分子机制提供了参考。2.基因Ⅵ型NDV CE16株反向遗传操作系统的构建为了研究CE16毒力减弱的分子机制以及研制基因Ⅵ型NDV弱毒活疫苗候选株,本研究以在鸡胚上连续传代致弱产生的NDV CE16株为骨架,构建基于T7启动子的基因Ⅵ型NDV反向遗传操作系统。首先,本研究选择经过改造的用于NDV拯救的克隆载体p BR322作为骨架载体,将病毒基因组全长c DNA分为8个不同带重复序列的亚基因片段,并采用酶切连接的方法,在该载体上成功组装出病毒的c DNA全长。为了获得精确的病毒全基因组序列末端,本研究分别在基因组c DNA的5’端引入T7 RNA聚合酶启动子、在3’端引入丁型肝炎病毒（Hepatitis delta virus,HDV）RNA核酶序列以及T7 RNA聚合酶终止子,构成NDV CE16全基因组c DNA的克隆质粒p BR322-CE16。同时将CE16株的NP、P和L的编码区序列克隆至p CAGGS表达载体上构建辅助质粒p CAGGS-NP、p CAGGS-P以及p CAGGS-L。最后,将上述构建好的全长c DNA质粒和三个辅助质粒共转染人喉表皮样癌（Hep-2）细胞,同时感染能够表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒（MVA-T7）。培养4天（dpi）后,分别收集细胞上清液及细胞,接种SPF鸡胚中进一步扩大培养,并利用血凝试验（Hemagglutination assay,HA）检测病毒滴度。经过上述方法,本研究成功获得了一株r CE16重组毒株,在鸡胚中连续传至10代后,仍具有良好的遗传稳定性。与CE16相比,r CE16在合胞体形成以及细胞中的增殖动力学均未发生明显改变;ICPI和MDT由原来的0.35和>120 h变为0.33和>120 h,毒力也未发生明显变化。因此,上述结果表明本研究成功构建了基于T7启动子的基因Ⅵ型NDV反向遗传操作体系,为后续研究NDV毒力的分子机制以及弱毒活疫苗提供了技术手段。3.利用反向遗传操作技术鉴定HN蛋白新毒力位点NDV的HN蛋白是影响毒力及致病性的重要毒力因子。为了研究CE16毒株HN蛋白上aa 215和aa 430的突变在NDV生物学特性及致病性改变中的作用。本研究首先构建了wt CE16、wt CI10、G215A及A430T的野生（wild type,wt）以及单位点突变HN蛋白。对4种HN蛋白表达效率、红细胞的吸附（Hemadsorption,HAd）能力、神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）活性、促细胞膜融合活性以及促F蛋白裂解能力等生物学功能进行评价分析。结果显示,4种HN蛋白在细胞表面的表达效率基本一致,表明氨基酸的突变未对HN的表达产生影响。其它生物学研究发现,与wt CE16相比,A430T和wt CI10的HAd活性分别降低了27.5%和29.9%、NA活性分别升高了78.3%和95.5%、融合指数分别增加了56.6%和66.3%、F蛋白裂解指数也分别增加了40.9%和51.4%。而G215A的HAd活性升高了19.6%、NA活性升高了17.9%、融合指数增加了12.9%、F蛋白裂解指数增加了5%,但未产生显着的差异。上述结果从蛋白水平证明了HN430是影响HN生物学活性的一个重要功能位点。为了进一步研究HN430位对病毒的影响,本研究将A430T通过点突变的方式引入到p BR322-CE16中,构建p BR322-CE16-HNA430T。通过病毒拯救成功获得了r CE16-HNA430T,在鸡胚中连续传至10代后,仍具有良好的遗传稳定性。与r CE16相比,r CE16-HNA430T重组毒株产生合胞体的能力增强了约40%、HAd能力增强了约50%、NA活性提高了约130%、增殖能力增强了约8倍左右。致病指数结果显示:ICPI由0.33升至1.38,MDT由>120h缩短至86 h;对鸡的致病性试验也显示r CE16-HNA430T能引起严重的临床症状以及100%死亡率,证明r CE16-HNA430T的致病性显着增强。因此,本研究鉴定到HN430位氨基酸位点是有别于已经鉴定过的在细胞膜融合、病毒增殖和致病性等方面有重要作用的新毒力位点。上述结果为HN蛋白功能位点的研究奠定了基础。4.利用反向遗传操作技术构建基因Ⅵ型NDV弱毒活疫苗候选株目前,鸽子上常用的ND疫苗为鸡用的传统疫苗,与鸽子中流行的基因Ⅵ型NDV遗传距离约为20%。虽然NDV只有一个血清型,但基因型和抗原的不匹配使得传统疫苗不能完全防控流行株的感染和扩散。因此,为了研究专门针对鸽流行NDV毒株的弱毒活疫苗,本研究利用基因Ⅵ型NDV CE16弱毒株为研究对象,通过反向遗传操作技术将p BR322-CE16的Fcs由强毒型的112RRQKR/F117替换为传统疫苗株La Sota的112GRQGR/L117。通过病毒拯救获得r CE16-La（Fcs）,F基因测序发现该毒株含有弱毒型Fcs序列,并且感染细胞后无合胞体形成。对拯救毒株的生物学特性、致病性和遗传稳定性检测发现:r CE16-La（Fcs）在鸡胚上具有良好的增殖活性,HA效价为29,病毒含量高于108EID50/m L;致病性结果显示ICPI由0.33进一步降低至0、MDT仍>120 h,表明Fcs的突变使该基因Ⅵ型传代弱毒株的毒力进一步降低;分别在鸡胚中连续传15代、在鸽子脑中传5代后测定鸡胚第5、10和15代次以及鸽子脑的第1、3和5代次病毒的毒力及Fcs序列,结果显示该毒株在鸡胚传代过程中毒力未发生明显改变（ICPI:0～0.05）,在鸽子中未引起任何临床症状,并且每代次病毒的Fcs序列均未发生回复突变,证明该毒株具有良好的毒力和遗传稳定性。为了验证r CE16-La（Fcs）的攻毒保护效率,本研究将该毒株和La Sota分别对鸽子进行一免和二免,然后对免疫后血清中抗体的产生、基因Ⅵ型强毒攻毒后的保护能力以及排毒情况进行检测。结果显示,r CE16-La（Fcs）免疫鸽子28 dpi后,对基因Ⅵ型强毒株抗原的HI效价约为211,而La Sota产生的HI效价约为28.5;在接种基因Ⅵ型强毒株后均未发生任何的临床症状或死亡,表明r CE16-La（Fcs）和La Sota具有相同的免疫保护效力;此外,对攻毒后口腔和泄殖腔拭子中病毒的检测发现,r CE16-La（Fcs）能显着降低拭子阳性率以及缩短排毒时间。综上所述,r CE16-La（Fcs）在鸡胚中具有良好的增殖活性,并且毒力和遗传稳定性均符合OIE疫苗株标准;此外,与La Sota相比r CE16-La（Fcs）在免疫后产生的血清抗体在同源毒株做抗原时能产生更强的中和抗体活性,并且在同源强毒株给鸽子攻毒后能产生更强的攻毒保护率。虽然传代次数较短不能保证r CE16-La（Fcs）的毒力是否会返强,但根据前面的研究结果,只要Fcs和HN蛋白430的氨基酸不同时发生突变,就能确保该r CE16-La（Fcs）为弱毒株。因此,相比其它只突变了Fcs的基因Ⅵ型的弱毒疫苗株,本研究研发的疫苗候选株可能更稳定,更适合用来生产弱毒疫苗。
岳山[3]（2021）在《牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS4B抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究》文中指出牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）属于单股正链RNA病毒,BVDV是黄病毒科、瘟病毒属的成员,主要引起牛的腹泻、发热、白细胞减少、口腔及消化道黏膜糜烂和坏死、怀孕母牛流产或产畸型胎儿等为特征的一种接触性传染病,急性病毒感染可引起免疫抑制,妊娠30-120日龄感染引起犊牛持续性感染和免疫耐受。本病在世界各国牛场普遍存在,给畜牧业生产造成严重的经济损失,世界动物卫生组织（OIE）将其列为进出口动物贸易必须检疫疫病,我国列为二类疫病。先前研究显示BVDV基因组编码的非结构蛋白Npro和结构蛋白Erns（E0）能够抑制宿主先天性免疫应答,非结构蛋白NS4B在病毒复制复合物中起到关键支架作用,但是,关于其在病毒发病机理中的作用知之甚少。本研究主要对BVDV基因组编码的NS4B蛋白在先天性免疫应答过程中的作用进行探究,并阐明其在RIG-I样受体（RIG-I like receptors,RLRs）介导的I型干扰素信号通路中的作用及其分子机制。首先,本研究构建了p CDNA3.0-HA-NS4B真核表达质粒,通过PCR扩增NS4B基因,胶回收和酶切后对目的基因及表达载体进行连接,经过转化和双酶切鉴定后,将鉴定正确的重组质粒p CDNA3.0-HA-NS4B转染至HEK-293T和MDBK细胞中,Western blot验证NS4B的表达;进一步应用双荧光素酶报告基因、实时荧光定量PCR和ELISA方法验证NS4B对I型干扰素的影响。结果显示,经Western blot检测NS4B在39 KDa处出现明显的目的条带,证明真核表达载体构建成功。通过双荧光素酶报告基因和实时荧光定量PCR检测发现BVDV NS4B显着抑制Se V诱导的IFN-β启动子的激活,并呈剂量依赖性,同时NS4B抑制HEK-293T和MDBK细胞中IFN-β的m RNA水平。ELISA检测结果发现NS4B抑制Se V诱导的HEK-293T细胞上清液中IFN-β的分泌。研究表明BVDV NS4B具有抑制I型干扰素的特性。其次,为深入探究BVDV NS4B通过何种机制抑制RLRs介导的I型干扰素应答,通过对RLRs通路中下游信号分子IRF3的磷酸化检测发现过表达BVDV NS4B后能抑制HEK-293T细胞中的IRF3磷酸化水平,通过双荧光素梅报告基因检测NS4B与RLRs信号通路中的关键信号分子对IFN-β启动子的激活,发现NS4B显着抑制MDA5诱导的IFN-β表达。随后过表达NS4B,通过实时荧光定量PCR检测各信号分子的转录水平,发现在HEK-293T细胞转染后12 h和24 h两个时间段NS4B均降低了MDA5的m RNA水平,而在MDBK细胞转染后24 h也显着降低了MDA5的m RNA水平。再次通过免疫共沉淀试验证明了NS4B与MDA5相互作用,并且激光共聚焦检测确定NS4B与MDA5存在共定位现象,并定位于细胞质中。研究表明BVDV NS4B通过与MDA5相互作用抑制I型干扰素通路的激活。最后,为深入探索BVDV NS4B与MDA5中哪个结构域存在相互作用,构建了MDA5三个不同结构域的真核表达载体质粒,经Western blot验证,结果显示2CARD、HEL、CTD分别在34 KDa、70 KDa和20 KDa处出现明显的目的条带,通过免疫共沉淀试验发现BVDV NS4B与MDA5中的2CARD结构域相互作用。激光共聚焦检测发现NS4B与MDA5-2CARD存在共定位现象,并定位于细胞质中。综上所述,本研究证明了BVDV NS4B蛋白与RLRs信号通路MDA5结构域中的2CARD区相互作用来负调控I型干扰素的表达。进一步提高了对BVDV非结构蛋白参与逃避宿主先天性免疫应答机制的理解,为深入了解BVDV致病机理奠定了理论基础。
田健霞[4]（2021）在《嵌合鸡干扰素刺激因子12-2（ISG12-2）新城疫病毒载体疫苗免疫原性的初步评价》文中研究说明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的严重威胁养禽业的传染病。干扰素（Interferons,IFNs）是宿主天然免疫的关键因子,NDV感染机体后,细胞的病原模式识别受体（PRRs）识别病原相关分子模式（PAMPs）后与线粒体外膜中的接头蛋白（MAVS）结合,激活TANK结合激酶1（TBK1）。由于鸡缺乏调节因子IRF3,TBK1进一步激活IFN调节因子IRF7。激活的IRF7移位到细胞核中与ISRE结合,诱导I型干扰素表达,通过JAK/STAT通路激活大量的ISGs表达,其中包括鸡源干扰素刺激基因12-2[Interferon-stimulated gene 12（2）,ISG12（2）],发挥抗病毒作用。本实验室前期研究发现,NDV感染鸡后能明显上调ISG12（2）的表达,体外实验证实ISG12（2）能抑制NDV的复制,同时IFNs能刺激鸡胚成纤维细胞（DF-1）表达ISG12（2）。同时,ISG12（2）也能促进干扰素及干扰素信号通路一系列分子的表达,表明ISG12（2）对IFN存在正向调节。基于此,推测表达ISG12（2）的NDV载体疫苗,能提高宿主对疫苗的免疫反应,增强疫苗免疫效果,提高对宿主的保护率。本研究首先通过将ISG12（2）嵌合到NDV弱毒载体LaSota上,然后通过本实验室熟练应用的NDV反向遗传操作系统,成功拯救获得ISG12（2）嵌合株,并验证了嵌合株既具有NDV活性,又能成功表达ISG12（2）蛋白,通过检测MDT,ICPI,感染6周龄低抗体鸡,实验结果表明,ISG12（2）嵌合株能显着降低病毒的致病性。最后用拯救的ISG12（2）嵌合株免疫6周龄低抗体鸡,HI抗体效价可以达到免疫保护线24以上,能起到免疫保护效果,免疫三周后用强毒株F48E9攻毒,鸡都能100%存活,体外排毒结果也显示ISG12（2）嵌合株能明显减短排毒时间,转录组结果表明ISG12（2）嵌合株不仅能激活体液免疫,还能激活细胞免疫,发挥更好的免疫保护效果。综上所述,ISG12（2）LaSota嵌合株能刺激机体产生更好的免疫保护效果,ISG12（2）具备作为分子佐剂的能力。本论文的主要研究内容和结果如下:1.ISG12（2）正向调控IFNs的机制探究为了初步探究ISG12（2）如何调节IFN及其通路相关因子的表达,首先构建既能表达ISG12（2）蛋白又能表达EGFP蛋白的质粒pCMV-ISG12（2）-EGFP。然后验证其功能,发现该质粒能抑制NDV的复制,并上调IFN及其通路相关因子的表达。为了提高转录组测序样本质量的可靠性,先将质粒转染于DF-1细胞中,36 h后通过流式分选出表达ISG12（2）蛋白的细胞,提取RNA,进行转录组测序分析。结果显示表达ISG12（2）后,相比不表达ISG12（2）的对照组,共有差异表达基因1327个,其中差异上调表达基因有709个,差异下调表达基因618个,并且KEGG通路富集分析发现,主要的富集通路有m TOR信号通路,TGF-β信号通路,Toll样受体信号通路,细胞因子相互作用信号通路和甲型流感通路等,这些通路都与免疫相关。挑选差异表达基因IFNGR1,IL1R2,IFNAR2,IFNAR1,GHR,CXCR1,CXCL12,CSF1,SMURF2,ACVR2A,SKP1,RPS6KB1进行q RT-PCR验证,检测结果与转录组测序结果相符,说明ISG12（2）的确参与免疫调节,具备激活天然免疫和增强适应性免疫的功能。2.ISG12（2）NDV嵌合株的拯救及生物学特性测定将ISG12（2）嵌合到LaSota病毒载体上拯救毒株。通过PCR、酶切、连接等分子克隆方法,在NDV LaSota原始株（r LaSota）和F蛋白裂解位点突变株（r LaSota/Fmut）的全基因组载体中插入ISG12（2）。在此基础上,借助实验室NDV反向遗传系统,成功拯救了r LaSota、r LaSota/Fmut、r LaSota-ISG12（2）、r LaSota-ISG12（2）/Fmut毒株。通过Western Blot和间接免疫荧光,验证了拯救的嵌合株既能高效表达ISG12（2）蛋白,又具有NDV活性。通过细胞因子检测、病毒增殖能力及致病性测定发现,表达ISG12（2）的嵌合株,相比未表达的NDV,在体内和体外均能更好地促进IFNs、IL-16、IL-18、IL-22等细胞因子的表达,抑制NDV的增殖,从而降低病毒的致病性。病理组织切片观察发现,嵌合了ISG12（2）的毒株感染鸡后,并未在脾脏、法氏囊等免疫器官中引起相关的炎症病理变化。3.嵌合ISG12（2）的LaSota毒株的免疫保护效果评估将成功拯救的毒株通过点眼滴鼻的接种方式,以105 EID50的接种剂量6周龄低抗体鸡,进行免疫-攻毒保护试验。NDV强毒株F48E9攻毒后,通过抗体效价的动态变化监测,4株拯救的病毒均能诱导鸡产生高抗体。通过病毒体外排泄、病毒载量、组织病理变化和存活率的检测发现,r LaSota-ISG12（2）拯救毒株能100%保护鸡群,明显减少病毒体外排泄,降低组织的病毒载量,且阻止NDV强毒株对各组织的病理损伤。进一步研究发现r LaSota-ISG12（2）组,相对r LaSota组,明显上调IFNα、IFNβ、IL-16、IL-18、IL-22等免疫相关因子的表达,并且这些细胞因子的上调,并不会导致脾脏等相关免疫组织的病理变化,避免了细胞因子风暴引起的不良反应。通过对免疫后鸡的脾脏进行转录组测序分析发现,嵌合ISG12（2）后的LaSota拯救毒株,免疫后能更好地激活鸡的体液免疫和细胞免疫,促使该弱毒株发挥更好的免疫保护作用。综上所述,本研究成功构建并拯救了表达ISG12（2）的NDV嵌合株。该嵌合株,借助ISG12（2）促进干扰素、白介素等细胞因子表达的功能,降低病毒的致病性,并且增强鸡的天然免疫和适应性免疫途径,更好地防控鸡不被NDV强毒株感染。这些研究结果,为以鸡源ISG12（2）为分子佐剂增强家禽疫苗的免疫原性,提高疫苗的保护效果,奠定了基础。
陈鑫[5]（2021）在《重组腺相关病毒载体介导的环状RNA circFBXW4在肝纤维化中的功能及机制研究》文中认为肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是由各种感染、免疫反应、理化因素等长时间的刺激下,肝脏中各类细胞外基质（extracellular matrix,ECM）代谢失衡,造成纤维结缔组织异常增生和肝脏结构紊乱。临床上肝纤维化的早期症状并不典型,目前尚缺乏灵敏的早期诊断指标。研究发现,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）激活并分化为肌成纤维细胞,是细胞外基质分泌的主要细胞来源。因此,肝星状细胞的活化被认为是肝纤维化启动和持续阶段的中心环节。肝星状细胞的活化过程受各种非编码RNA（noncoding RNA,nc RNA）的联合调控,深入研究肝纤维化发生的分子机制将为研发新型治疗手段提供一定的研究基础。非编码RNA在肝纤维化发生、发展的过程中具有重要的调控作用。其中,微小RNA（micro RNA,miRNA）和长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）在肝纤维化相关的机制探究和临床意义已有大量的研究报道。近年来,环状RNA（circular RNA,circRNA）作为一类新兴的非编码RNA分子被发现,其与各类疾病的生理过程密切相关。内源性circRNAs是通过反向剪切以共价键形成的环状RNA分子,其稳定性高可耐受核酸酶的降解,在不同的物种间具有保守性,在组织和细胞不同的发育阶段和生理状态呈现特异性表达。circRNAs的分子结构特性使其作为新型的临床诊断标记物在开发上具有明显的优势,现已发展成生物医学的热点研究领域之一。circRNAs在各类疾病中的功能及作用机制逐渐引起研究者们的广泛关注,然而,有关circRNAs在肝纤维化中的表达谱分析和具体机制尚有待阐明。在本研究中,构建了小鼠肝纤维化进展和逆转模型,采用肝脏原位灌流技术,分离提取小鼠肝脏的原代肝星状细胞。运用高通量测序技术,分析肝纤维化小鼠原代肝星状细胞中的circRNAs表达谱,鉴定发现大量的circRNAs分子存在差异性表达。其中,circFBXW4的表达水平在肝纤维化进展期显着降低,并随肝纤维化的逆转过程表达恢复,提示circFBXW4可能与肝纤维化发生、发展的病理过程密切相关,引起了我们的重点关注并对其展开了功能学探究。研究中采用重组腺相关病毒为载体,介导circFBXW4靶向肝脏的基因治疗,实验发现提高circFBXW4的水平可抑制肝纤维化过程中的肝损伤,减少肝组织中的纤维增生和胶原沉积,一定程度上修复了肝脏结构紊乱的现象。同时,运用慢病毒生物载体构建了circFBXW4过表达的稳转肝星状细胞株,发现过表达circFBXW4抑制肝星状细胞由静息态向激活态的转化,阻滞其细胞周期,减少活化态肝星状细胞的恶性增殖。此外,利用非病毒载体系统中的阳离子脂质体介导法,发现干扰circFBXW4的生物信号对肝星状细胞具有反向调控功能。以上结果提示,circFBXW4可能是一种抗肝纤维化的RNA分子。在机制探究方面,大部分外显子来源且定位在细胞质中的circRNAs,常通过竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ce RNA）参与调控目的基因的表达,进而影响生物学功能。因此,本研究进一步运用micro RNAs芯片技术,分析原代肝星状细胞中micro RNAs的差异表达,并通过生物信息学预测circFBXW4可能结合的micro RNAs分子,经验证发现circFBXW4可靶向结合miR-18b-3p,并调控其表达水平。micro RNAs芯片分析及实验检测均发现,miR-18b-3p在肝纤维化的过程中表达上调,其具有促进肝星状细胞中纤维介质表达的功能,并且circFBXW4与miR-18b-3p的表达呈负相关关系。抑癌基因F框/WD-40域蛋白7（F box and WD 40 domain containing protein 7,FBXW7）是miR-18b-3p的靶基因之一,本研究发现circFBXW4通过靶向结合miR-18b-3p进而调控FBXW7信号通路。此课题在动物、组织、细胞、分子等多个维度,进行了关于circFBXW4表型及机制的初步探究。发现circFBXW4是调节肝星状细胞活化和肝纤维化发展的关键生物分子,其可能作为一种预测肝纤维化进展和逆转病理过程的潜在生物标志物。
王倩云[6]（2021）在《AIM2炎症小体在EV71引起脑炎发病机制的研究及杆状病毒作为SARS-CoV-2活病毒疫苗载体的初步探索》文中进行了进一步梳理本论文分为两个部分组成,主要讨论了AIM2炎症小体在EV71引起脑炎发病机制的研究及杆状病毒作为SARS-CoV-2活病毒疫苗载体的初步研究。第一部分:本研究主要利用肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）感染其易感细胞人横纹肌瘤细胞（Rhabdomyoma,RD）和人神经母细胞瘤（Neuroblastoma cells,SK-N-SH）,利用荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和蛋白免疫印记（Western-Blot,WB）,酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测EV71感染两种细胞系后黑色素瘤缺乏因子2（Absent in melanoma 2,AIM2）炎症小体及其下游基因的表达,通过流式细胞术检测EV71感染引起细胞焦亡情况。将纯化后的EV71通过颅内注射方式免疫出生24h C57野生型（Wild type,WT）及AIM2基因敲除鼠(AIM2 Gene knockout,AIM2-/-),对其感染后引起的临床症状进行评分,取感染后7d小鼠脑组织进行固定,脱蜡至水,HE染色观察EV71感染引起的炎症反应并通过免疫组织化学染色法（Immunohistochemistry,IHC）检测EV71及AIM2的表达情况,qRT-PCR检测脑组织中VP1,Caspase1和IL-1β的表达水平。分离培养鉴定小鼠原代神经元细胞,观察EV71感染小鼠原代神经元细胞引起的形态学变化,EV71感染WT和AIM2-/-小鼠原代神经元细胞48h上清病毒滴度测定,qRT-PCR检测AIM2,Caspase1及IL-1β的表达,流式细胞术检测细胞焦亡情况。实验结果显示EV71感染RD、SK-N-SH细胞及小鼠原代神经元细胞可以激活AIM2炎症小体及其下游基因的表达。通过建立EV71感染小鼠原代神经元细胞模型,发现在感染AIM2-/-小鼠原代神经元细胞上清中检测到较高的病毒滴度,说明在原代神经元细胞中AIM2对EV71的复制同样具有抑制作用。EV71感染AIM2-/-鼠后脑组织较野生鼠观察到严重的炎性浸润和空泡形成,且VP1表达较野生型鼠也较高,表明AIM2可以抑制EV71病毒在脑中的复制。这些结果为宿主如何抵抗病毒感染,病毒免疫逃逸机制及抗病毒药物设计提供理论依据。第二部分:本研究构建了两种重组杆状病毒,其中一个是将人源的SARS-CoV-2的S基因克隆至p10启动子下游,利用Bac to Bac真核表达系统表达S蛋白并展示在病毒表面,另外一个是用哺乳动物启动子元件CMV启动子取代杆状病毒原有的p10和Polh启动子,将人源的SARS-CoV-2的S蛋白克隆至CMV启动子下游,利用杆状病毒有效转导进入哺乳动物细胞的特性将S基因带入哺乳动物细胞并在CMV启动子作用下表达外源S蛋白。采用皮下加腹腔注射重组病毒的方式,每两周免疫一次,共四次免疫BALB/c雌性小鼠,末次免疫10天后用ELISA检测血清中S蛋白特异性抗体生成情况;分离脾细胞后流式细胞技术检测IFN-γ和IL-4确定特异性细胞免疫应答类型;最后利用SARS-CoV-2假病毒检测小鼠血清中的中和抗体的效价。实验结果显示,两种方式构建的重组杆状病毒与野生杆状病毒及PBS组比较均可引起特异性细胞免疫和体液免疫应答,并且具有显着性差异。重组杆状病毒免疫小鼠后血清中S蛋白特异性抗体水平较高。假病毒系统检测免疫后小鼠体内产生的中和抗体水平,结果显示两种方式构建的重组杆状病毒抗体有明显的的提高。这些结果表明表达S蛋白的重组杆状病毒可以作为潜在的活病毒疫苗载体。
李庆超,钟劲[7]（2020）在《分子生物学技术推进丙型肝炎病毒的发现和研究——2020年诺贝尔生理学或医学奖解读》文中研究指明在全球范围内估计有7 100万丙型肝炎病毒感染者,其中相当多的患者会发展为肝硬化或肝癌,因此丙型肝炎病毒对人类健康造成重大威胁。2020年诺贝尔生理学或医学奖授予哈维·阿尔特、迈克尔·霍顿和查尔斯·赖斯,以表彰他们在"发现丙型肝炎病毒"工作中的卓越贡献。丙型肝炎病毒的研究历程无疑是人类与病毒斗争的胜利历史。从最初病毒的发现到抗病毒药物的成功研发,分子生物学技术的应用都发挥了关键的作用,为现代病毒学研究树立了典范。
李雪晶[8]（2020）在《肝脏缺失组蛋白甲基转移酶SETD2导致脂代谢紊乱和肝癌的发生》文中研究指明SETD2是哺乳动物细胞中主要催化组蛋白H3K36三甲基化（H3K36me3）修饰的甲基转移酶。H3K36me3修饰是从酵母到哺乳动物中最保守的表观遗传标记之一,其主要定位于基因的转录区域,在维持转录保真度、RNA可变剪接以及DNA损伤修复过程中具有重要的作用。许多研究发现SETD2在多种癌症中经常发生突变,扮演着抑癌基因的角色。在我们的研究中,我们首先借助TCGA上的癌症数据库分析发现SETD2在肝癌中具有较高的突变率,突变率为4-5%,并且发现SETD2突变的肝癌患者的整体生存率更低。为了研究SETD2在肝癌发生发展过程中的功能,我们构建了Setd2肝脏特异性敲除的小鼠模型,发现Setd2缺失会诱导小鼠自发形成原发性肝癌（HCC）。同时在DEN诱导的HCC小鼠模型中,肝脏缺失Setd2的小鼠的肿瘤数目和大小显着增加。在研究Setd2抑制肝癌的分子机制的过程中,我们发现在DEN处理的条件下,肝脏中Setd2缺失会抑制p53信号通路的激活。此外,通过组织转录组测序和H3K36me3 ChIP-seq分析,我们发现在肝脏中Setd2与脂代谢稳态平衡密切相关。基因表达验证的结果显示Setd2缺失会抑制Abca1、Abcg5/8和Cyp7a1等胆固醇代谢基因的表达。进一步研究发现,在p53野生型的细胞中,SETD2基因沉默导致p53蛋白水平下调,进而抑制ABCA1的表达;然而,在p53突变的细胞中,p53的靶基因不能响应上游信号,SETD2敲低依然会导致ABCA1表达下调,并且通过ChIP-qPCR实验证明了 SETD2通过介导H3K36me3修饰直接调控ABCA1的表达。ABCA1的正常表达对于维持体内脂质稳态平衡是至关重要的。通过脂质含量的测定,我们发现肝脏和血清中的脂质水平在Setd2肝脏特异性缺失的小鼠中显着上调。此外,小鼠实验表明高脂饮食会显着地促进Setd2缺失相关的HCC的发展进程。通过H3K27ac ChIP-seq分析,我们预测了 c-Jun/AP-1在Setd2缺失的肝癌中被激活。进一步在细胞水平和小鼠水平上证明了 Setd2缺失通过促进脂质累积进而诱导c-Jun/AP-1高表达。c-Jun在肝癌中起着癌基因的作用,在Setd2缺陷的细胞中,高表达的c-Jun会抑制DNA损伤应答信号通路以及ATM的磷酸化,进而抑制p53的表达,最终促进癌症的发展。综上所述,我们的研究发现了 Setd2缺失是肝癌的驱动因素之一,揭示了 Setd2调节胆固醇稳态和c-Jun/AP-1信号传导的潜在机制,为SETD2突变的肝癌患者提供了新的治疗策略。
赵文凯[9]（2020）在《小鼠DDX18对IFN-β产生和病毒增殖的影响》文中研究说明DEAD-box家族蛋白是一类数量众多、结构高度保守的RNA解旋酶,参与多种生物学过程。近年来,大量的研究发现,DEAD-box RNA解旋酶还参与天然免疫调控,尤其在调控干扰素（Interferon,IFN）产生方面发挥重要作用,但不同的DEAD-box RNA解旋酶对IFN的产生及其下游信号通路的调控作用不同。本实验室前期研究发现猪源DDX18（p DDX18）和人源DDX18（h DDX18）与转录因子IRF3相互作用并抑制IRF3介导的IFN-β启动子激活,从而抑制IFN-β产生,从细胞水平证实DDX18具有调控干扰素的功能。为了从机体水平进一步证实DDX18对干扰素的调控作用,本研究首次在鼠源细胞上验证了鼠源DDX18（mDDX18）负调控IFN-β产生,并在DDX18+/-小鼠体内评价了mDDX18敲低对病毒感染诱导IFN及IFN刺激基因（ISG）表达和对HSV-1及VSV增殖的影响。主要研究内容与结果如下:1. 干扰mDDX18促进病毒诱导的IFN-β产生采用特异性si RNA干扰鼠巨噬细胞RAW264.7内源性DDX18的表达,分析干扰mDDX18表达后对病毒诱导的IFN及ISG表达的影响。结果显示:干扰mDDX18表达显着上调仙台病毒（Sendai virus,Se V）、人单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）和水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）诱导的IFN-βmRNA水平以及IFN-β下游信号通路中ISG15、ISG56的表达,证实mDDX18具有负调控IFN-β产生的特性。2. mDDX18抑制IFN-β产生不依赖其ATP酶和解旋酶活性从RAW264.7细胞中克隆了mDDX18的全长c DNA,构建了表达野生型mDDX18及其ATP酶活性位点突变体（mDDX18-K219E）、解旋酶活性位点突变体（mDDX18-S354L）的重组慢病毒。将重组慢病毒转导RAW264.7细胞后用Se V或VSV刺激,Real-time PCR检测IFN-β以及ISG15、ISG56的mRNA表达,ELISA检测细胞上清中IFN-β的含量。结果显示:过表达野生型mDDX18显着抑制Se V和VSV诱导的IFN-β、ISG15和ISG56的表达,而且两种酶活突变体的抑制效果与野生型mDDX18无显着差异。结果表明mDDX18具有抑制IFN-β产生的特性而且不依赖其解旋酶活性和ATP酶活性。3. mDDX18基因敲除小鼠的鉴定与繁育为了进一步证实mDDX18对IFN-β产生的影响,委托生物公司通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了mDDX18基因敲除的F0代小鼠。将F0代DDX18+/-小鼠杂交后,发现获得的子代小鼠为杂合子(DDX18+/-)或野生型(DDX18+/+),没有mDDX18完全敲除的纯合子(DDX18-/-),推测mDDX18基因的完全敲除导致胚胎致死。比较了DDX18+/-小鼠与野生型小鼠的mDDX18表达水平,证实DDX18+/-小鼠的mDDX18表达水平显着降低,但小鼠在体重和形态上并无明显差异,后续使用mDDX18+/-小鼠进行体内研究。4. 敲低小鼠DDX18促进病毒诱导的IFN-β产生分离DDX18+/+与DDX18+/-小鼠腹腔巨噬细胞（mouse peritoneal macrophages,MPM）,分别感染Se V、HSV-1和VSV,分析DDX18+/+与DDX18+/-MPM细胞对病毒诱导的IFN及ISG表达的影响。结果显示:在Se V、HSV-1和VSV感染下,相比于DDX18+/+MPM,DDX18+/-MPM细胞中IFN-β、ISG15和ISG56 mRNA水平显着上调。结果表明,在MPM细胞上,敲低小鼠DDX18上调病毒诱导的IFN-β产生,进一步证实mDDX18负调控IFN-β产生。5. 敲低小鼠DDX18促进HSV-1诱导的抗病毒天然免疫反应将HSV-1经尾静脉注射感染6周龄野生型和DDX18+/-小鼠,同时设置未感染对照。在感染18h后采集血液,通过ELISA检测血清中的IFN-β含量;在感染3d后处死小鼠,采集脑组织和肺脏,通过Real-time PCR检测组织器官中IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA水平,HE染色观察肺脏病理变化,同时通过TCID50检测脑组织中HSV-1的载量。将HSV-1经尾静脉注射感染8周龄野生型和DDX18+/-小鼠,连续12 d观察其存活情况。结果显示:在HSV-1感染条件下,相比野生型小鼠,mDDX18+/-小鼠的脑组织和肺脏中IFN-β、ISG15和ISG56的表达水平明显升高,血清中IFN-β的含量增加,脑组织HSV-1载量降低。与未感染组相比,HSV-1感染导致mDDX18+/-小鼠和野生型小鼠肺组织的肺泡壁明显增宽,并存在淋巴细胞和单核细胞浸润,但HSV-1感染的mDDX18+/-小鼠肺组织出现更多的单核细胞,提示mDDX18+/-小鼠对HSV-1感染产生了更强的抗病毒反应。HSV-1感染条件下,相比野生型小鼠,DDX18+/-小鼠的存活率更高,且两者间存在显着差异。以上结果表明,敲低小鼠DDX18表达可促进HSV-1诱导的IFN-β产生,抑制HSV-1增殖,且DDX18+/-小鼠相比DDX18+/+小鼠对于HSV-1感染具有更强的耐受力。6. 敲低小鼠DDX18促进VSV诱导的抗病毒天然免疫反应进一步以VSV为例,评价了敲低DDX18表达对RNA病毒诱导天然免疫的影响。将VSV-GFP经尾静脉注射感染8周龄野生型和DDX18+/-小鼠,同时设置未感染对照。在感染18h后采集血液,通过ELISA检测血清中的IFN-β含量。在感染1d后处死小鼠,采集肝脏、脾脏和肺脏组织,通过Real-time PCR检测组织中IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA水平,同时通过TCID50检测脾脏和肝脏中VSV-GFP的载量。结果显示:在VSV-GFP感染条件下,相比野生型小鼠,mDDX18+/-小鼠的肝脏、脾脏和肺脏组织中IFN-β、ISG15和ISG56的表达水平明显升高,血清中IFN-β的含量增加,脾脏和肝脏中的病毒含量降低。以上结果表明,敲低小鼠DDX18表达可促进VSV诱导的IFN-β产生,抑制VSV增殖。
高又文[10]（2020）在《野生鼠血清标本中持续性G病毒感染的分子流行病学研究》文中指出研究背景持续性G病毒（Pegivirus）是单股正链RNA病毒,属于黄病毒科持续性G病毒属,具有与丙型肝炎病毒属病毒相类似的基因组结构。流行病学研究显示,该病毒属病毒能够感染人、马、猪、猿猴、蝙蝠以及鼠等哺乳动物。野生鼠（包括家鼠）与人类生活密切,是多种病原体重要的传播宿主。关于鼠持续性G病毒（rodentpegivirus,RPgV）感染野生鼠及其流行病学特征的调查资料尚少,只有两篇报道,分别是Kapoor等在仓鼠科沙漠林鼠血清中检测到rodent pegivirus,以及Firth等在纽约居民区采集的鼠科挪威鼠体内检测到rat pegivirus。中国尚无野生鼠携带pegivirus病毒的流行病学资料。第一个持续性G病毒,人持续性G病毒（human pegivirus,HPgV）于1995年被发现,当时称为庚型肝炎病毒（HGV）或者GB病毒C型（GBV-C）,后来发现HGV并不引起病毒性肝炎,反而可以延缓HIV感染者的疾病进程。但2015年,在马病毒性肝炎血清中分离到的Theilar氏疾病相关病毒（Theilar’s disease associated virus,TDAV）,被认为是该病的病原体,说明持续性G病毒可能具有致病性。随着研究的广泛开展,pegivirus病毒受到越来越多的关注,新的pegivirus病毒也在不断被发现。2015年,人pegivirus 2型病毒（HPgV-2）在丙型肝炎患者或反复输血的血友病患者样本中检测到,其序列既有最早发现的人pegivirus病毒序列的特征,又具有丙型肝炎病毒HCV的序列特征,流行病学研究显示,HPgV-2与HCV感染密切相关,但其致病性尚待确定。此外,在猿猴体内检测到的pegivirus序列也存在新大陆与旧大陆猴SPgV之间的序列差异。而在有着病毒库之称的蝙蝠体内发现的pegivirus病毒序列具有更丰富的多样性。深入研究不同动物和人类感染的持续性G病毒序列,能够为该病毒属病毒的来源、传播与进化提供信息。研究目的本研究以广东省广州市白云和越秀城区以及福建省厦门市城区作为研究现场,在人群密集处采集野生鼠,研究中国野生鼠血清样本中是否存在pegivirus病毒感染,以及其血清学和分子流病学特征。在获得病毒序列的基础上,进行序列分析,研究pegivirus病毒的分子进化特征。研究方法1野生鼠样本的采集选取广东广州白云区,越秀区,福建厦门城区人群活动密集区域为调查现场。从2015年3月-2016年3月,采用笼捕法捕捉野生鼠样本,分离血清,进行种属鉴定,记录信息。2 pegivirus病毒的调查研究血清样本通过RNA抽提及逆转录后,使用针对NS3区序列的巢式引物检测核酸保守序列NS3部分区域,测序,进行序列相似性同源性分析,构建系统进化树。3 pegivirus血清学研究构建Luciferase荧光素酶和鼠pegivirus NS3或者E2蛋白融合表达的重组载体,在真核细胞中表达,收获抗原蛋白,建立荧光素酶免疫吸附方法（luciferase immunosorbent assay,LISA）检测鼠血清样本中抗RPgV NS3抗体和抗RPgV E2抗体。4 pegivirus全长序列分析扩增鼠pegivirus病毒全长序列,与Genbank数据库中下载的参考序列进行比对,分析序列特征,并利用贝叶斯统计模型分析序列进化信息。研究结果1野生鼠感染pegivirus病毒检测结果野生鼠携带pegivirus的种属类型包含2目2科5种。其中啮齿目鼠科占据了三个物种,分别是褐家鼠（Rattus norvegicus,219只,69.5%）,黄胸鼠（Rattus tanezumi/R.brunneusculus13 只,4.1%）,黄毛鼠（Rattus losea/R.rattus,34 只,10.8%）,此外还包含食虫目鼩鼱科的物种,鼩鼱（Suncus murinus,48只,15.9%）,褐家鼠是研究现场的优势鼠种。315份血清样本中RPgV RNA阳性样本为68份,野生鼠携带pegivirus病毒核酸检测总阳性率为21.6%。其中在219份褐家鼠血清样本中检测到62份阳性,阳性率28.31%;在13份黄胸鼠样本中检测到1份,阳性率为7.69%;在34份黄毛鼠血清样本中检测到2份,阳性率为5.88%,在48份鼩鼱样本中检测到3份阳性,阳性率为6.25%。本研究所获的鼠pegivirus序列与目前已知的RPgV序列（KJ950934,NC021154）均在一个分支。此外,本研究检测为阳性的动物种属中,除了已经报道的褐家鼠/挪威鼠之外,还包括黄胸鼠,黄毛鼠两类啮齿动物,以及食虫目的鼩鼱,但所有种属携带病毒的序列均落在RPgV分支,并无独特分支,说明本研究中不同种属的鼠样本中所感染的RPgV序列高度同源。2鼠pegivirus血清学调查结果利用荧光素酶免疫吸附方法共检测212份血清样本,其中NS3抗体阳性109份,阳性率为57.4%。NS3核酸和抗体双阳性样本26份,核酸阴性而抗体阳性样本为83份,核酸阳性但抗体阴性样本10份。同样的方法检测207份血清样本中的E2抗体,97份判定为阳性。其中,核酸和E2抗体双阳性样本97份,核酸阴性但E2抗体阳性样本为98份,核酸阳性但E2抗体阴性样本12份。NS3抗体和E2抗体两种检测方法检出结果差异显着。3 pegivirus病毒序列分析扩增获得三条野生鼠携带pegivirus病毒的近全长序列。在同一种属的pegivirus氨基酸序列比较中,相似度最高的序列集中在非结构蛋白NS3区域。在NS5B区与RatPgV相似度最高,与旧世界猿猴SPgV该区域的相似度最低。但是在E2,NS4B和NS5A区,本研究中RPgVs的氨基酸序列与同一分支内蝙蝠BPgV序列的相似性高于对应区域沙漠林鼠RodentPgV。此外,本研究中RPgVs序列与蝙蝠GBV-D和人HPgV-2型相比,蝙蝠序列在保守区NS3和NS5B的相似性高于人HPgV-2型。但是在E1,E2,NS2,NS4B和NS5A区域的氨基酸序列比较中,人HPgV-2型与本研究中RPgVs序列的相似度均高于同蝙蝠GBV-D的比较结果。通过Bayesian MCMC统计模型分析pegivirus病毒进化速率为 6.061 ×10-4/site/year。结论1首次在中国野生鼠体内检测到pegivirus,鼠种包括褐家鼠,黄毛鼠,黄胸鼠以及食虫目的鼩鼱体内也携带该病毒,扩充了 pegivirus的流行病学资料。本研究筛检序列NS3和NS5B区与挪威鼠ratPgV高度相似,符合国内外研究pegivirus的流行具有种属特异性的报道。2应用luciferase真核表达载体,建立了鼠pegivirus血清学检测方法。首次填补了 pegivirus病毒在鼠类宿主中的血清学资料。3扩增近全长序列。与基因库不同种属参考序列进行比对,发现鼠pegivirus病毒的不同编码区具有多样性。总体而言,持续性G病毒NS3区进化速率较慢,变异小,所有序列具有共同的起源,尚无证据说明该病毒跨种传播。
二、中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定（论文提纲范文）
（1）人持续性G病毒二型在中国人群中的检出及其感染性克隆初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 黄病毒科病毒 |
| 1.2 GBV-C病毒(HPgV)简介 |
| 1.3 HPgV-2病毒简介 |
| 1.4 Pegivirus病毒的培养体系探索 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 HPgV-2在国内人群中的发现 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 HPgV-2感染人的致病性及细胞嗜性 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.2 技术路线 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 HPgV-2感染性克隆探索 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 技术路线 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 本研究的不足之处 |
| 5.3 下一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 缩略词汇总表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（2）基因Ⅵ型NDV HN蛋白新毒力位点的鉴定及弱毒疫苗候选株的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 NDV病原分子生物学研究进展 |
| 1.1 新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)毒力因子 |
| 1.1.1 新城疫(Newcastle disease,ND)概述 |
| 1.1.2 NDV的分类及分子病原学 |
| 1.1.3 NDV的感染增殖 |
| 1.1.4 NDV表型及遗传多样性 |
| 1.1.5 NDV的毒力 |
| 1.2 NDV反向遗传操作技术简介 |
| 1.3 NDV疫苗研究进展 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 第二章 两株毒力差异较大的同源NDV毒株的生物学特性比较 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、实验动物和毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的纯化 |
| 2.2.2 病毒致病指数 |
| 2.2.3 蚀斑形成试验及病毒滴度测定 |
| 2.2.4 病毒在细胞上的增殖规律 |
| 2.2.5 动物试验 |
| 2.2.6 病毒核酸提取及反转录 |
| 2.2.7 病毒基因组序列的测定 |
| 2.2.8 序列的拼接及比对分析 |
| 2.2.9 遗传进化分析 |
| 2.2.10 蛋白3D结构预测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒的致病指数 |
| 2.3.2 病毒的生物学特性 |
| 2.3.3 病毒对4周龄SPF鸡的致病性试验 |
| 2.3.4 病毒基因组特征及差异氨基酸位点的突变频率 |
| 2.3.5 遗传进化分析 |
| 2.3.6 NDV HN和L蛋白结构模型 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 基因Ⅵ型NDV CE16株反向遗传操作系统的构建及评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒、质粒载体和单抗 |
| 3.1.2 SPF 鸡和SPF 鸡胚 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物的设计与合成及次基因片段的扩增与测序 |
| 3.2.2 CE16株全基因组cDNA克隆质粒的构建 |
| 3.2.3 辅助质粒的构建 |
| 3.2.4 辅助质粒的功能性验证 |
| 3.2.5 rCE16的拯救 |
| 3.2.6 间接免疫荧光鉴定rCE16的增殖 |
| 3.2.7 rCE16与CE16增殖特性及形成合胞体能力的比较 |
| 3.2.8 rCE16致病性检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 分段扩增CE16全基因组序列的PCR结果 |
| 3.3.2 p BR322-CE16质粒的构建 |
| 3.3.3 辅助质粒序列的PCR及酶切鉴定结果 |
| 3.3.4 利用微基因组系统验证辅助质粒 |
| 3.3.5 rCE16在基因水平的验证 |
| 3.3.6 rCE16的间接免疫荧光结果 |
| 3.3.7 rCE16与CE16在细胞中产生的膜融合特性及增殖动力学比较 |
| 3.3.8 rCE16与CE16的毒力分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 利用反向遗传操作技术鉴定HN蛋白新毒力位点 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、毒株及质粒 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 主要试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 质粒的构建 |
| 4.2.2 间接免疫荧光技术验证HN蛋白的表达 |
| 4.2.3 HN蛋白的生物学活性检测 |
| 4.2.4 pBR322-CE16-HNA430T的构建 |
| 4.2.5 rCE16-HNA430T的拯救及鉴定 |
| 4.2.6 rCE16-HNA430T和rCE16生物学活性比较 |
| 4.2.7 rCE16-HNA430T和rCE16的致病性比较 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 质粒的表达鉴定 |
| 4.3.2 HN蛋白的生物学活性分析 |
| 4.3.3 拯救毒株在基因水平的验证及遗传稳定性评价 |
| 4.3.4 病毒的生物学特性分析 |
| 4.3.5 病毒的致病指数 |
| 4.3.6 病毒对4周龄SPF鸡的致病性试验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 利用反向遗传操作技术构建基因Ⅵ型NDV弱毒活疫苗候选株 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、病毒、质粒载体和单抗 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 主要试剂配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 pBR322-CE16-La(Fcs)全长cDNA质粒的构建 |
| 5.2.2 rCE16-La(Fcs)的拯救及鉴定 |
| 5.2.3 rCE16-La(Fcs)的致病性和病毒滴度测定 |
| 5.2.4 rCE16-La(Fcs)的Fcs序列测定和遗传稳定性分析 |
| 5.2.5 rCE16-La(Fcs)在鸽子上的免疫效果评价 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 病毒的拯救 |
| 5.3.2 rCE16-La(Fcs)的毒力测定 |
| 5.3.3 rCE16-La(Fcs)的Fcs序列的鉴定以及传代稳定性评价 |
| 5.3.4 血清中抗体水平研究 |
| 5.3.5 rCE16-La(Fcs)对PPMV-1/SX-01/15攻毒鸽子后的保护效率 |
| 5.3.6 强毒株攻毒后的排毒情况 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1.主要试剂 |
| 2.主要仪器 |
| 3.主要溶液的配制 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS4B抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻/黏膜病研究进展 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 BVDV分类与基因组 |
| 1.1.3 BVDV基因组结构蛋白和非结构蛋白 |
| 1.1.4 BVDV流行情况 |
| 1.2 抗病毒天然免疫及Ⅰ型干扰素信号通路的研究进展 |
| 1.2.1 抗病毒天然免疫 |
| 1.2.2 抗病毒天然免疫受体 |
| 1.2.3 Ⅰ型干扰素的研究进展 |
| 1.2.4 RNA病毒诱导的Ⅰ型干扰素产生的信号通路 |
| 1.2.5 TLRs介导的信号通路 |
| 1.2.6 RLRs介导的信号通路 |
| 1.3 黄病毒科非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制的研究进展 |
| 1.3.1 WNV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.3.2 ZⅠKV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.3.3 YFV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.3.4 JEV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.3.5 DENV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.3.6 HCV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制 |
| 1.4 瘟病毒属CSFV和 BVDV抑制Ⅰ型干扰素研究进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 BVDV NS4B真核表达载体的构建及对ⅠFN-β的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、毒株及质粒 |
| 2.1.2 质粒构建载体图谱及多克隆位点 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 BVDV和 SeV的增殖 |
| 2.2.4 病毒/细胞总RNA的提取 |
| 2.2.5 重组质粒的构建 |
| 2.2.6 磷酸钙转染 |
| 2.2.7 质粒电击转染MDBK细胞 |
| 2.2.8 免疫印记分析 |
| 2.2.9 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.10 实时荧光定量RT-PCR |
| 2.2.11 ELISA检测细胞上清液中IFN-β的分泌 |
| 2.2.12 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BVDV NADL株感染MDBK细胞结果 |
| 2.3.2 BVDV-NS4B扩增结果 |
| 2.3.3 重组质粒pCDNA3.0-HA-NS4B的鉴定 |
| 2.3.4 Western blot验证pCDNA3.0-HA-NS4B表达结果 |
| 2.3.5 BVDV NS4B抑制SeV诱导的IFN-β启动子活性 |
| 2.3.6 BVDV NS4B蛋白抑制SeV诱导的IFN-β表达 |
| 2.3.7 BVDV NS4B蛋白抑制SeV诱导的细胞上清液中IFN-β的分泌 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛病毒性腹泻病毒NS4B蛋白对RLRs通路的抑制作用研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株及质粒 |
| 3.1.2 质粒构建载体图谱及多克隆位点 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 RLRs通路信号分子重组质粒的构建 |
| 3.2.2 磷酸钙转染 |
| 3.2.3 质粒电击转染MDBK细胞 |
| 3.2.4 免疫印记分析 |
| 3.2.5 BVDV NS4B对 IRF3 磷酸化的影响 |
| 3.2.6 NS4B和 RLRs信号通路中各信号分子对IFN-β启动子的激活 |
| 3.2.7 实时荧光定量检测NS4B蛋白对内源性RLRs通路各信号分子的转录水平. |
| 3.2.8 免疫共沉淀 |
| 3.2.9 激光共聚焦 |
| 3.2.10 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RLRs各信号分子双酶切鉴定结果 |
| 3.3.2 RLRs各信号分子Western blot表达结果 |
| 3.3.3 BVDV NS4B抑制IRF3 的磷酸化 |
| 3.3.4 BVDV NS4B作用靶点位于MDA5 及其上游水平 |
| 3.3.5 BVDV NS4B抑制内源性MDA5 的表达 |
| 3.3.6 BVDV NS4B与外源性MDA5 相互作用 |
| 3.3.7 BVDV NS4B与外源性MDA5 共定位 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 BVDV NS4B蛋白对MDA5 不同结构域作用机制研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、菌株和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 MDA5 不同结构域引物设计 |
| 4.2.2 磷酸钙转染 |
| 4.2.3 免疫印记分析 |
| 4.2.4 免疫共沉淀 |
| 4.2.5 激光共聚焦 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MDA5-2CARD、MDA5-HEL、MDA5-CTD重组质粒双酶切鉴定 |
| 4.3.2 MDA5 各结构域Western blot表达结果 |
| 4.3.3 BVDV NS4B与外源性MDA5-2CARD相互作用 |
| 4.3.4 BVDV NS4B与外源性MDA5-2CARD共定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（4）嵌合鸡干扰素刺激因子12-2（ISG12-2）新城疫病毒载体疫苗免疫原性的初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 新城疫及宿主蛋白ISG12(2)研究进展 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 NDV的分类地位及基因组结构 |
| 1.1.2 NDV的分子结构及蛋白功能 |
| 1.1.3 NDV的生命周期 |
| 1.1.4 ND的流行现状 |
| 1.2 NDV反向遗传学研究进展 |
| 1.3 新城疫疫苗研究进展 |
| 1.4 干扰素的概述 |
| 1.4.1 干扰素的产生 |
| 1.4.2 干扰素的功能 |
| 1.5 ISG12 蛋白的研究进展 |
| 1.5.1 ISG12 家族相关功能研究 |
| 1.5.2 ISG12 对抗病毒天然免疫的影响 |
| 1.6 本研究目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 ISG12(2)正向调控IFNs的机制探究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒、菌株与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 pCMV-ISG12(2)-EGFP真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2.2 ISG12(2)的原核表达 |
| 2.2.3 Western Blot验证ISG12(2)蛋白和EGFP蛋白的表达 |
| 2.2.4 pCMV-ISG12(2)-EGFP真核重组质粒的功能验证 |
| 2.2.5 转录组测序 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ISG12(2)多克隆抗体的制备 |
| 2.3.2 pCMV-ISG12(2)-EGFP真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 pCMV-ISG12(2)-EGFP质粒促进干扰素表达抑制NDV复制的功能鉴定 |
| 2.3.4 转录组测序分析ISG12(2)激活干扰素信号通路的方式 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ISG12(2)NDV嵌合株的拯救及生物学特性测定 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 细胞与质粒 |
| 3.1.2 鸡胚、1 日龄雏鸡 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 嵌合ISG12(2)的LaSota病毒载体的构建 |
| 3.2.2 重组病毒的拯救 |
| 3.2.3 重组病毒的鉴定 |
| 3.2.4 拯救毒株生物学特性的鉴定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 重组病毒载体的构建 |
| 3.3.2 重组病毒的拯救及鉴定 |
| 3.3.3 拯救毒株生物学特性的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 嵌合ISG12(2)的LaSota毒株的免疫保护效果评估 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 疫苗株与病毒 |
| 4.1.2 低抗鸡和鸡胚 |
| 4.1.3 主要试验试剂和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫-攻毒试验分组 |
| 4.2.2 免疫-攻毒后HI抗体效价动态监测 |
| 4.2.3 攻毒后体外排毒情况 |
| 4.2.4 攻毒后组织体内病毒载量检测 |
| 4.3.5 攻毒后病理组织学观察 |
| 4.2.6 免疫后脾脏组织中免疫相关因子量的检测 |
| 4.2.7 免疫后脾脏组织的转录组测序分析 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 免疫-攻毒后鸡ND抗体效价的动态监测 |
| 4.3.2 免疫-攻毒后存活率 |
| 4.3.3 攻毒后体外排毒情况检测 |
| 4.3.4 攻毒后组织体内病毒载量检测 |
| 4.3.5 病理组织学观察 |
| 4.3.6 免疫后脾脏组织中免疫相关因子的表达 |
| 4.3.7 免疫后脾脏组织的转录组测序分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要仪器、试剂配方及实验方法 |
| 附录2 转录组测序数据补充材料 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）重组腺相关病毒载体介导的环状RNA circFBXW4在肝纤维化中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验细胞 |
| 2.3 实验物品 |
| 2.4 仪器与设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 小鼠肝纤维化形成和逆转模型的建立 |
| 3.2 原位灌流小鼠原代细胞 |
| 3.3 circFBXW4 腺相关病毒载体的构建与鉴定 |
| 3.4 circFBXW4 腺相关病毒的包装 |
| 3.5 小鼠尾静脉注射腺相关病毒 |
| 3.6 血清谷丙转氨酶的测定 |
| 3.7 血清谷草转氨酶的测定 |
| 3.8 肝组织羟脯氨酸的测定 |
| 3.9 肝组织苏木精-依红染色(hematoxylin eosin,HE)染色 |
| 3.10 肝组织Masson染色 |
| 3.11 免疫荧光染色 |
| 3.12 免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色 |
| 3.13 肝星状细胞培养 |
| 3.14 脂质体介导细胞转染小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA) |
| 3.15 质粒大提和细胞转染 |
| 3.16 流式分析细胞周期 |
| 3.17 流式分析细胞凋亡 |
| 3.18 CCK8 细胞增殖试验 |
| 3.19 EDU-555 细胞增殖检测 |
| 3.20 DNA提取 |
| 3.21 双萤光素报告基因检测 |
| 3.22 RNA提取 |
| 3.23 细胞质、细胞核RNA分离提取 |
| 3.24 Real-time qPCR |
| 3.25 microRNA qPCR |
| 3.26 冰冻切片RNA荧光原位杂交 |
| 3.27 蛋白提取和变性 |
| 3.28 Western blot |
| 3.29 数据处理方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 小鼠肝纤维化模型的构建及鉴定 |
| 4.2 肝脏原代肝星状细胞中circRNAs高通量测序及分析 |
| 4.3 circFBXW4 在肝纤维化进展及逆转过程中的表达变化 |
| 4.4 环状RNA circFBXW4 的分子组成、稳定性及亚细胞定位 |
| 4.5 重组腺相关病毒载体介导的circFBXW4 过表达对小鼠肝纤维化的影响 |
| 4.6 慢病毒载体介导的circFBXW4 过表达对肝星状细胞活化,增殖及凋亡的影响 |
| 4.7 阳离子脂质体介导的circFBXW4 沉默对肝星状细胞活化及增殖的影响 |
| 4.8 原代肝星状细胞中micro RNA芯片检测及circFBXW4 ceRNA机制分析 |
| 4.9 miR-18b-3p对小鼠肝星状细胞活化的影响 |
| 4.10 原代肝星状细胞中circRNAs-microRNAs-mRNAs分子调控机制的研究 |
| 4.11 阳离子脂质体介导的FBXW7 过表达/沉默对肝星状细胞的影响 |
| 4.12 circFBXW4 靶向miR-18b-3p调控FBXW7 信号通路 |
| 5 讨论 |
| 5.1 第一部分:肝纤维化小鼠的原代肝星状细胞中差异表达的circRNAs高通量测序及分析 |
| 5.2 第二部分:重组腺相关病毒载体、慢病毒载体、阳离子脂质体介导circFBXW4 在体内、体外对肝纤维化和肝星状细胞活化的影响 |
| 5.3 第三部分:circFBXW4 通 过靶向miR-18b-3p调控FBXW7信号通 路的ceRNA机制研究 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 环状RNA在肝脏相关疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
（6）AIM2炎症小体在EV71引起脑炎发病机制的研究及杆状病毒作为SARS-CoV-2活病毒疫苗载体的初步探索（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 AIM2 炎症小体在EV71 引起脑炎发病机制的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞培养 |
| 2.1.2 细胞与病毒 |
| 2.1.3 Western-blot相关试剂 |
| 2.1.4 荧光定量PCR相关试剂 |
| 2.1.5 ELISA相关试剂 |
| 2.1.6 流式检测相关试剂 |
| 2.1.7 荧光定量引物 |
| 2.1.8 细胞免疫荧光相关试剂 |
| 2.1.9 实验动物 |
| 2.2 实验试剂配制 |
| 2.3 实验器材 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.4.2 病毒扩增、超离浓缩 |
| 2.4.3 TCID_(50)检测 |
| 2.4.4 Trizol法提RNA |
| 2.4.5 RNA逆转录反应 |
| 2.4.6 荧光定量聚合酶链式反应 |
| 2.4.7 Western-blot检测目的蛋白表达 |
| 2.4.8 ELISA检测上清中细胞因子 |
| 2.4.9 流式检测细胞凋亡 |
| 2.4.10 实验动物 |
| 2.4.11 原代神经元细胞分离培养 |
| 2.4.12 细胞免疫荧光 |
| 2.4.13 细胞免疫荧光共聚焦 |
| 2.4.14 HE染色 |
| 2.4.15 免疫组织化学染色 |
| 2.4.16 统计学分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 EV71 感染引起RD、SK-N-SH细胞中AIM2 炎症小体的表达增加 |
| 3.2 EV71 感染引起RD、SK-N-SH细胞中AIM2 通路下游基因的表达增加 |
| 3.3 EV71 感染引起RD、SK-N-SH细胞焦亡 |
| 3.4 小鼠原代神经元细胞分离鉴定 |
| 3.5 EV71 感染小鼠原代神经元细胞模型建立 |
| 3.6 AIM2 抑制EV71 在小鼠原代神经元细胞中的复制 |
| 3.7 AIM2 对EV71 感染引起小鼠脑炎有保护性作用 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 杆状病毒作为SARS-CoV-2 活病毒疫苗载体的初步探索 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 细胞及病毒 |
| 2.2 主要试剂与器材 |
| 2.3 主要培养基配置 |
| 2.4 引物设计与合成 |
| 2.5 转移载体pFast Bac Dual的改造 |
| 2.6 双酶切鉴定重组质粒 |
| 2.7 重组杆状病毒的构建 |
| 2.8 重组杆状病毒转导BHK细胞 |
| 2.9 Western blot检测重组杆状病毒转导BHK细胞S蛋白表达 |
| 2.10 实验动物 |
| 2.11 ELISA检测特异性IgG |
| 2.12 脾淋巴细胞分离培养 |
| 2.13 流式细胞术检测INF-γ和IL-4 因子 |
| 2.14 中和实验 |
| 2.15 数据分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 构建重组杆状病毒vAc-S-CMV、vAc-S |
| 3.2 检测vAc-S-CMV、vAc-S重组杆状病毒的表达 |
| 3.3 S蛋白引起的体液免疫应答 |
| 3.4 重组病毒引起的细胞免疫 |
| 3.5 中和效应检测 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 SARS-CoV-2 研究进展 |
| 前言 |
| 1.SARS-CoV-2 病原体的确定 |
| 2.SARS-CoV-2 生物学特征 |
| 3.SARS-CoV-2 基因组结构 |
| 4.SARS-CoV-2 结构蛋白 |
| 4.1 S蛋白 |
| 4.2 N蛋白 |
| 4.3 M蛋白 |
| 4.4 E蛋白 |
| 5.SARS-CoV-2 免疫学研究 |
| 6.SARS-CoV-2 疫苗的研究现状 |
| 6.1 SARS-CoV-2 灭活疫苗 |
| 6.2 SARS-CoV-2 减毒活病毒疫苗 |
| 6.3 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗 |
| 6.4 SARS-CoV-2 活病毒载体疫苗 |
| 6.5 SARS-CoV-2 DNA疫苗 |
| 6.6 SARS-CoV-2 RNA疫苗 |
| 结语 |
| 参考文献 |
（7）分子生物学技术推进丙型肝炎病毒的发现和研究——2020年诺贝尔生理学或医学奖解读（论文提纲范文）
| 1 祸起隐微：病毒性肝炎传播中的小针头、大漏洞 |
| 2 踪迹诡秘：神秘的非甲非乙型肝炎 |
| 3 原形毕露：丙型肝炎病毒的发现 |
| 4 分毫析厘：感染性的全长HCV克隆的构建 |
| 5 工利其器：HCV细胞研究模型构建 |
| 6 九转功成：抗HCV小分子药物的研发 |
| 7 结语 |
（8）肝脏缺失组蛋白甲基转移酶SETD2导致脂代谢紊乱和肝癌的发生（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肝癌表观遗传学概述 |
| 1.1.1 表观遗传学概述 |
| 1.1.2 肝癌概述 |
| 1.1.3 DNA甲基化与肝癌 |
| 1.1.4 组蛋白修饰与肝癌 |
| 1.1.5 非编码RNA与肝癌 |
| 1.2 SETD2蛋白 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 SETD2的蛋白结构 |
| 1.2.3 SETD2的表达调控 |
| 1.2.4 SETD2的生物学功能 |
| 1.2.5 SETD2与癌症 |
| 1.3 c-Jun/AP-1 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 c-Jun/AP-1的表达与活性调控 |
| 1.3.3 c-Jun/AP-1与癌症 |
| 1.4 脂质代谢 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 胆固醇稳态调控机制 |
| 1.4.3 脂代谢的转录调控机制 |
| 1.4.4 脂代谢与癌症 |
| 1.5 本文研究思路和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、细胞系和小鼠 |
| 2.1.2 质粒、抗体和试剂 |
| 2.1.3 实验器材 |
| 2.1.4 培养基和溶液配方 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 siRNA和gRNA |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠模型构建 |
| 2.2.2 小鼠基因组提取 |
| 2.2.3 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.4 小鼠肝脂提取 |
| 2.2.5 小鼠血清收集方法 |
| 2.2.6 细胞培养 |
| 2.2.7 细胞转染 |
| 2.2.8 稳定敲低/敲除细胞系的构建 |
| 2.2.9 质粒提取 |
| 2.2.10 RNA提取与反转录 |
| 2.2.11 实时荧光定量PCR |
| 2.2.12 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.13 染色质免疫共沉淀 |
| 2.2.14 免疫组化 |
| 2.2.15 苏木精-伊红染色 |
| 2.2.16 油红O染色 |
| 2.2.17 谷草转氨酶和谷丙转氨酶的测定 |
| 2.2.18 总胆固醇和甘油三酯的测定 |
| 2.2.19 高通量测序建库方法 |
| 2.2.20 常用的数据分析平台与软件 |
| 2.2.21 统计分析方法 |
| 第三章 肝脏缺失组蛋白甲基转移酶SETD2导致脂代谢紊乱和肝癌的发生 |
| 3.1 基于肝癌数据库分析SETD2与肝癌的关系 |
| 3.1.1 SETD2在临床肝癌样本中具有较高突变率 |
| 3.1.2 SETD2突变的肝癌患者生存率较低 |
| 3.2 构建Setd2肝脏特异性敲除小鼠模型 |
| 3.2.1 Setd2条件性敲除小鼠模型 |
| 3.2.2 Setd2肝脏特异性敲除小鼠模型鉴定 |
| 3.3 Setd2肝脏特异性敲除小鼠易发生原发性肝癌 |
| 3.3.1 Setd2肝脏特异性敲除对小鼠的生长无影响 |
| 3.3.2 Setd2肝脏特异性敲除小鼠易发生原发性肝癌 |
| 3.4 Setd2肝脏特异性敲除促进DEN所诱导的肝癌的发生发展 |
| 3.4.1 肝脏缺失Setd2对DEN诱导的肝癌模型小鼠的生长无影响 |
| 3.4.2 肝脏缺失Setd2促进DEN所诱导的肝癌的发生发展 |
| 3.4.3 肝癌相关标志物的检测 |
| 3.5 高通量测序预测Setd2在肝脏中参与调控的生物学功能 |
| 3.5.1 差异表达基因的功能分析 |
| 3.5.2 肝脏缺失Setd2影响胆固醇稳态平衡 |
| 3.5.3 Setd2缺失导致H3K36me3整体水平下降 |
| 3.5.4 Setd2在肝脏中参与调控脂代谢通路 |
| 3.6 肝脏缺失Setd2导致脂质累积增加 |
| 3.6.1 肝脏缺失Setd2使小鼠肝重增加 |
| 3.6.2 肝脏缺失Setd2使小鼠脂质累积增加 |
| 3.7 肝脏缺失Setd2通过抑制胆固醇外排从而促进脂质累积 |
| 3.8 Setd2调控脂代谢的分子机制 |
| 3.8.1 Setd2缺失抑制p53信号通路 |
| 3.8.2 Setd2介导p53的表达调控脂代谢 |
| 3.8.3 SETD2在p53突变的细胞系中调控脂代谢 |
| 3.8.4 H3K36me3修饰是胆固醇外排相关基因的表达所必需的 |
| 3.8.5 SETD2与胆固醇外排相关基因的表达呈正相关 |
| 3.9 Setd2缺失促进转录因子AP-1激活 |
| 3.9.1 预测Setd2缺失的肝癌中活跃的转录因子 |
| 3.9.2 转录因子AP-1在Setd2缺失的肝癌组织中高表达 |
| 3.9.3 转录因子AP-1在Setd2缺失的多种细胞系中高表达 |
| 3.10 胆固醇调控转录因子c-JUN/AP-1的活性 |
| 3.10.1 无胆固醇培养条件抑制c-JUN/AP-1的激活 |
| 3.10.2 胆固醇水平上升促进c-JUN/AP-1的激活 |
| 3.11 SETD2与c-JUN共敲低可恢复p53及其下游靶基因的表达 |
| 3.12 脂质累积促进Setd2缺失相关的肝癌的发生发展 |
| 3.12.1 高脂饮食小鼠模型中Setd2缺失促进脂质累积 |
| 3.12.2 体内实验证明脂质累积促进c-Jun/AP-1的激活 |
| 3.12.3 高脂饮食促进Setd2缺失相关的肝癌的发生发展 |
| 3.12.4 DEN&HFD小鼠模型中Setd2缺失导致脂质累积增加 |
| 3.13 小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
| 缩略词表 |
（9）小鼠DDX18对IFN-β产生和病毒增殖的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 DExD/H-box家族蛋白概述 |
| 1.2 DEAD-box家族蛋白参与天然免疫调控 |
| 1.2.1 DEAD-box家族蛋白正调控天然免疫 |
| 1.2.2 DEAD-box家族蛋白负调控天然免疫 |
| 1.3 DEAD-box家族蛋白影响病毒的增殖 |
| 1.3.1 DDX1、DDX3与DDX5 影响病毒的增殖 |
| 1.3.2 其它DEAD-box蛋白影响病毒的增殖 |
| 1.4 基因敲除小鼠在DEAD-box家族蛋白研究中的应用 |
| 1.4.1 基于基因编辑技术的基因敲除小鼠模型构建 |
| 1.4.2 DEAD-box家族蛋白基因敲除小鼠的构建与应用 |
| 第2章 研究目的与意义 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株、菌株与动物 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 工具酶、试剂盒、血清和主要化学试剂 |
| 3.1.4 Western blot实验材料 |
| 3.1.5 培养基和抗生素的配制 |
| 3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制 |
| 3.1.7 主要实验仪器及设备 |
| 3.1.8 动物实验所需的材料和试剂 |
| 3.1.9 分子生物学及序列分析软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞及动物组织总RNA的提取 |
| 3.2.2 cDNA的合成及目的片段扩增 |
| 3.2.3 限制性内切酶酶切反应 |
| 3.2.4 PCR产物或酶切产物的电泳检测 |
| 3.2.5 PCR产物或酶切产物的回收与纯化 |
| 3.2.6 外源DNA片段与质粒载体的连接反应 |
| 3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.8 连接产物的转化 |
| 3.2.9 重组质粒的制备 |
| 3.2.10 质粒的转染 |
| 3.2.11 慢病毒的包装与检测 |
| 3.2.12 Real-time PCR |
| 3.2.13 Western blot |
| 3.2.14 siRNA干扰实验 |
| 3.2.15 基因敲除小鼠的生产、繁育和检测 |
| 3.2.16 HSV-1、VSV及 VSV-GFP病毒的增殖 |
| 3.2.17 病毒滴度的测定 |
| 3.2.18 小鼠攻毒实验与样品处理 |
| 3.2.19 MPM细胞的分离 |
| 3.2.20 鼠源IFN-βELISA检测 |
| 3.2.21 统计学方法 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 干扰mDDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生 |
| 4.1.1 siRNA干扰效果检测 |
| 4.1.2 干扰mDDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生 |
| 4.2 mDDX18 抑制IFN-β产生不依赖其ATP酶和解旋酶活性 |
| 4.2.1 mDDX18 ATP酶和解旋酶活性突变位点的确定 |
| 4.2.2 mDDX18及其酶活突变体质粒的构建 |
| 4.2.3 mDDX18及其酶活突变体重组慢病毒的包装与表达 |
| 4.2.4 mDDX18 抑制IFN-β产生不依赖其ATP酶和解旋酶活性 |
| 4.3 mDDX18基因敲除小鼠的鉴定与繁育 |
| 4.4 敲低小鼠DDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生 |
| 4.4.1 MPM细胞的分离与鉴定 |
| 4.4.2 敲低小鼠DDX18 促进病毒诱导的IFN-β产生 |
| 4.5 敲低小鼠DDX18对HSV-1 诱导的天然免疫反应和病毒增殖的影响 |
| 4.5.1 敲低小鼠DDX18 促进HSV-1 诱导的IFN-β产生 |
| 4.5.2 敲低小鼠DDX18 抑制HSV-1 的增殖 |
| 4.6 敲低小鼠DDX18对VSV诱导的天然免疫反应和病毒增殖的影响 |
| 4.6.1 敲低小鼠DDX18 促进VSV诱导的IFN-β产生 |
| 4.6.2 敲低小鼠DDX18 抑制VSV的增殖 |
| 第5章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 小鼠DDX18对IFN-β产生的影响 |
| 5.1.2 小鼠DDX18对病毒增殖的影响 |
| 5.1.3 DDX18调控天然免疫的机制探讨 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）野生鼠血清标本中持续性G病毒感染的分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 pegivirus病毒概述 |
| 2 荧光素酶免疫共沉淀检测系统简介 |
| 3 分子演化及贝叶斯系统发育分析 |
| 第二章 广州和厦门城区野生鼠携带持续性G病毒流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 鼠血清pegivirus抗体检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 pegivirus病毒进化起源研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略语词汇表 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
四、中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定（论文参考文献）
- [1]人持续性G病毒二型在中国人群中的检出及其感染性克隆初步探索[D]. 万政伟. 南方医科大学, 2021
- [2]基因Ⅵ型NDV HN蛋白新毒力位点的鉴定及弱毒疫苗候选株的构建[D]. 陈曦. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS4B抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究[D]. 岳山. 黑龙江八一农垦大学, 2021(01)
- [4]嵌合鸡干扰素刺激因子12-2（ISG12-2）新城疫病毒载体疫苗免疫原性的初步评价[D]. 田健霞. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]重组腺相关病毒载体介导的环状RNA circFBXW4在肝纤维化中的功能及机制研究[D]. 陈鑫. 安徽医科大学, 2021(01)
- [6]AIM2炎症小体在EV71引起脑炎发病机制的研究及杆状病毒作为SARS-CoV-2活病毒疫苗载体的初步探索[D]. 王倩云. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]分子生物学技术推进丙型肝炎病毒的发现和研究——2020年诺贝尔生理学或医学奖解读[J]. 李庆超,钟劲. 自然杂志, 2020(06)
- [8]肝脏缺失组蛋白甲基转移酶SETD2导致脂代谢紊乱和肝癌的发生[D]. 李雪晶. 武汉大学, 2020(06)
- [9]小鼠DDX18对IFN-β产生和病毒增殖的影响[D]. 赵文凯. 华中农业大学, 2020(02)
- [10]野生鼠血清标本中持续性G病毒感染的分子流行病学研究[D]. 高又文. 南方医科大学, 2020(01)