一、山莨菪碱的化学研究（论文文献综述）
胡侠,付丽莎[1]（2021）在《液相色谱-串联质谱法同时快速测定婴幼儿谷物食品中3种莨菪烷生物碱》文中研究指明采用固相萃取净化去除样品中蛋白类物质的干扰,建立婴幼儿谷物食品中3种莨菪烷生物碱的液相色谱-串联质谱检测方法。样品经体积分数为80%（v/v）乙腈水溶液提取后,经Oasis PRiME HLB SPE固相萃取柱净化。净化后的样品采用Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（2.7μm, 3.0 mm×75 mm）分离,以0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液和0.1%（v/v）甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,多反应监测正离子模式扫描,采用基质溶液外标法定量。3种莨菪烷生物碱在1.0～50.0μg·L-1浓度范围内线性关系良好（R2﹥0.999）,方法的检出限均为0.5μg·kg-1;回收率为86.8%～103.3%,相对标准偏差为5.2%～8.9%。该方法前处理操作简便,灵敏度和准确度高,可实现婴幼儿谷物食品中3种莨菪烷生物碱的同时快速测定。
曾令江[2]（2021）在《莨菪碱脱氢酶催化机制及莨菪碱代谢工程研究》文中提出莨菪碱（Hyoscyamine）是茄科药用植物产生的代表性抗胆碱天然药物,其消旋体为着名药物阿托品（Atropine）。莨菪碱和阿托品均属于托品烷生物碱（Tropane alkaloids,TA）,莨菪碱在临床上广泛用于胃肠道不适、止痛解痉、治疗癫痫、晕车晕船等。茄科药用植物是工业化生产提取莨菪碱的唯一有效来源。其中,颠茄（Atropa belladonna L.）、草本曼陀罗（Datura stramonium）、三分三（Anisodus acutangulus）和澳洲毒茄杂交种（Duboisia×hybrid）等是生产莨菪碱的主要药材。颠茄是被《中华人民共和国药典》收录且人工种植面积最大的莨菪碱的药用原料植物。然而,莨菪碱在这些茄科药用植物中的含量很低,这也成为莨菪碱工业化利用的主效限制因子,直接导致其有效供给不足、价格居高不下。因此,开展莨菪碱的生物合成研究,鉴定合成莨菪碱的关键酶和相关基因,阐明关键酶的活性及其催化机制,对于拓展关于TA生物合成的认识具有重要科学意义;采用代谢工程育种技术培育莨菪碱高产的颠茄,能够从源头上降低莨菪碱生产成本和解决药物资源供给不足的问题,具有重要经济价值。根据已有研究,科学家推测莨菪醛（Hyoscyamine aldehyde）是莨菪碱生物合成的直接前体,其可能会被特定的乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase,ADH）还原生成莨菪碱,该酶有可能是提高莨菪碱产量的关键酶。此外,已有研究报道莨菪碱在莨菪碱6β-羟化酶（Hyoscyamine 6β-hydroxylase,H6H）催化下被转化为山莨菪碱并可进一步环氧化为东莨菪碱。因此阻断H6H介导的催化反应也是一种潜在的提高莨菪碱在植株中积累的代谢工程策略。本研究从颠茄中鉴定了一个在其侧根中高表达的乙醇脱氢酶基因并命名为莨菪碱脱氢酶基因（Hyoscyamine dehydrogenase,HDH）,对HDH催化活性和催化机制进行了研究,为采用代谢工程育种技术培育莨菪碱高产颠茄提供了一个重要基因;进一步研究HDH在颠茄莨菪碱生物合成中的代谢功能;考察了敲除Ab H6H基因对颠茄莨菪碱生物合成的影响。通过研究取得了以下结果:1.莨菪碱脱氢酶基因的克隆与表达研究采用表达相关性分析,从颠茄转录组中筛选获得了一个HDH候选基因的EST序列（aba＿locus＿4635）,随后采用末端快速扩增技术（Rapid-Amplification of c DNA Ends,RACE）获得了该候选基因1098 bp的全长c DNA。生物信息学分析结果显示,HDH属于氧化还原酶家族,编码1个含有366个氨基酸残基的多肽,其理论分子量为39 k Da。数字表达谱分析结果显示,HDH的组织表达模式与颠茄中已报道TA生物合成基因具有高度相似性,表现为在侧根中高水平表达。基于实时定量PCR的表达分析结果显示,HDH在颠茄侧根和主根中表达,在茎段和叶片中不表达;其在侧根中的表达量远高于在主根中的表达量。为进一步研究HDH在侧根中表达情况,从颠茄中克隆了1493 bp的HDH启动子（p HDH）片段。用p HDH驱动GUS报告基因表达,获得了转基因颠茄发根。对转基因颠茄发根的GUS染色和切片结果发现,p HDH主要在中柱鞘和内皮层特异性表达,这与TA生物合成途径中的PPAR和H6H等基因在中柱鞘表达结果具有高度相似性。上述关于HDH生物信息学和组织表达分析结果表明该基因极有可能是莨菪碱生物合成途径中的关键脱氢酶基因。2.莨菪碱脱氢酶的催化功能研究为研究HDH的催化功能,在大肠杆菌中重组并纯化获得了6×His-HDH重组蛋白,其分子量约为42.9 k Da,与HDH计算分子量吻合。HDH的底物（莨菪醛）极不稳定,很容易发生Retro-Claisen缩合反应。因此,莨菪醛不能在实验室制备也没有标准品可供购买。本研究采用体外连续催化的方法鉴定HDH还原莨菪醛功能:首先在酵母中表达CYP80F1并提取含有该酶的微粒体蛋白,在反应体系中加入海螺碱后,能够检测到莨菪醛（m/z为288.1584）的生成;在含有莨菪醛的该反应体系中加入纯化的重组HDH,能检测到莨菪碱的生产;而在对照反应体系中,未能检测到莨菪碱的生成。上述研究结果表明HDH能够将莨菪醛还原为莨菪碱。为进一步研究HDH作为还原酶的催化特性,使用莨菪醛的结构类似物苯乙醛作为底物对HDH的酶动力学进行了研究。HDH发挥还原酶催化活性的最适p H和温度分别为6.4和40°C。在最适反应条件下,HDH对苯乙醛的Km为44.46±10.73μM,kcat为228.4±21.39 min-1,kcat/Km为5.14 min-1.μM-1。由于HDH属于氧化还原酶家族,理论上能够氧化莨菪碱生成莨菪醛。以莨菪碱为底物,在反应体系中加入纯化的HDH,能够检测到莨菪醛。HDH发挥氧化酶催化活性的最适p H和温度分别为10.4和45°C。在最适反应条件下,HDH对莨菪碱的Km为33.36±4.69μM,kcat为7.49±0.51 min-1,kcat/Km为0.22 min-1.μM-1。通过比较HDH催化还原反应和催化氧化反应的kcat/Km,发现HDH的还原效率是其氧化效率的23.36倍。对HDH氧化莨菪碱的平衡常数测定结果表明,在p H 7.2（植物细胞生理p H）条件下HDH氧化活性很低。催化效率和平衡常数分析结果表明在植物细胞的生理p H条件下,HDH主要发挥还原酶功能。3.莨菪碱脱氢酶的催化机制研究为研究HDH将莨菪醛还原为莨菪碱的催化机制,采用结构生物学方法获得了分辨率为2.4?的HDH晶体结构。对HDH晶体结构分析发现,其是一个锌离子依赖的长链脱氢酶,包含两个结构域:一个由Rossman折叠组成的NADP（H）结合结构域;一个底物结合结构域。HDH催化活性中心包含一个由锌离子、Cys52、His74、Glu75和Cys168组成的四面体结构。Met124,Leu282和Ala305三个非极性氨基酸通过构型依赖的范德华力控制底物结合,构成了底物结合口袋。Ser54和Cys100两个极性氨基酸与底物的羰基形成氢键,是催化还原莨菪醛的关键残基。进一步采用点突变分析关键残基的功能,H74A点突变后,HDH对莨菪碱和苯乙醛均失去了催化活性;S54A还原苯乙醛的活性消失,其氧化活性极显着下降;C100G/Y/F三个点突变均保留了极低的催化活性。HDH点突变结果表明,Cys100可能与底物羰基形成氢键,从而稳定底物的朝向;Ser54在底物还原过程中,可能参与了质子传递。利用氘标记的[4-2H]NADPH研究了还原醛基的氢原子来源,只有以[4R-2H]NADPH作为辅因子时,才能检测到氘标记的还原产物,结果表明NADPH上的pro-R氢原子参与HDH催化的还原反应。4.过表达莨菪碱脱氢酶的代谢功能研究为研究HDH在莨菪碱生物合成代谢中的功能,采用基因工程技术获得了过表达HDH的颠茄发根。采用PCR对相关发根进行了检测,以区分对照发根和转HDH发根。在工程菌C58C1（p Ri A4、p BI121-HDH）中能够检测到423 bp的rol B基因片段、795 bp的NPTII片段和1184 bp的35S::HDH基因片段,在转HDH的发根也检测到上述相应基因片段。在对照农杆菌中C58C1（p Ri A4、p BI121）中能够检测到423 bp的rol B基因片段、795 bp的NPTII片段,但没有检测到1184 bp的35S::HDH基因片段;在用p BI121作为对照质粒转化的发根中,检测到rol B和NPTII的相应片段,而未能检测到35S::HDH片段。基因表达分析结果表明,转HDH基因发根中HDH表达量比对照得到了极大程度提高。分子检测结果表明,HDH基因整合到颠茄基因组中,同时其表达水平得到大幅度提高,意味着HDH介导的催化步骤得到强化。为了分析过表达HDH对颠茄TA合成的影响,采用LC-MS检测颠茄发根培养物中TA含量。结果显示对照发根中莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量分别为1.35mg/g（DW）、0.69 mg/g（DW）和0.43 mg/g（DW）;过表达HDH的不同发根株系中莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量分别为1.83～4.03 mg/g（DW）、1.16～1.73 mg/g（DW）和0.62～1.28 mg/g（DW）。上述研究结果表明在颠茄发根中过表达HDH能够有效促进莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱的合成。虽然发根是代谢工程研究的有力工具,但由于其规模化培养技术并不成熟而难以实现商业化应用。本研究进一步采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法,培育获得了过表达HDH的颠茄植株。通过分子检测,鉴定出过表达HDH的转基因颠茄株系。过表达HDH颠茄植株中莨菪碱含量均得到显着提高。上述研究结果表明,HDH是一个能够有效提高颠茄植株中莨菪碱含量的重要基因。5.敲除莨菪碱6β-羟化酶提高莨菪碱含量的代谢工程研究莨菪碱6β-羟化酶（H6H）催化莨菪碱的6β-羟化转化为山莨菪碱,并能进一步将山莨菪碱环氧化为东莨菪碱。因此,敲除该基因可能会导致莨菪碱的积累水平提高。本文采用CRISPR/Cas9技术敲除颠茄H6H基因,并研究了敲除该基因对莨菪碱含量变化的影响。针对颠茄H6H第二外显子DNA序列设计了g RNA序列5’-TGGATTACCAGAAAAGCTGATGG-3’,并构建了植物表达载体p Cas9-H6H。在该表达载体中,g RNA由拟南芥U6启动子驱动表达;Cas9来源于酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）,由35S启动子驱动表达。经根癌农杆菌EHA105介导遗传转化获得了颠茄转基因植株,分子检测结果表明,在15株再生植物中,有11株为阳性转基因植物;转基因颠茄中H6H基因突变位点检测结果表明:11株转基因植物中,4株未发生编辑,7株被成功编辑,突变率约为63.6%;其中H9、H14和H15是纯合突变;H1为双等位突变;H4、H6和H8为单链突变。进一步对3个纯合突变的转基因颠茄植株进行生物碱含量分析,结果表明在纯合突变植株中均未检测到山莨菪碱和东莨菪碱,在根和叶中均出现莨菪碱的积累;在H9、H14和H15根中莨菪碱含量相对于野生型颠茄分别增加了3.68、4.21和4.28倍。在H9、H14和H15叶片中莨菪碱的含量分别比野生型增加了0.61、0.76和2.22倍。上述研究结果表明在颠茄植株中敲除H6H有效的阻止了莨菪碱向山莨菪碱和东莨菪碱的转化,从而增加了颠茄中莨菪碱的积累。综上所述,本研究包括两大部分研究内容:（1）莨菪碱脱氢酶（HDH）的分子生物学和生物化学研究;（2）莨菪碱的代谢工程研究。第一部分研究发现HDH在颠茄侧根中高水平表达并主要定位于中柱鞘和内皮层;HDH具有典型的氧化还原酶催化特征,既能将莨菪醛还原为莨菪碱,又能将莨菪碱氧化为莨菪醛,但在植物细胞生理p H条件下主要发挥还原酶的功能;酶动力学研究结果表明HDH是莨菪碱合成中的限速酶;HDH蛋白质晶体结构解析、关键氨基酸位点的突变和氘标记NADPH的饲喂示踪研究揭示了该酶的催化机制,其活性中心是一个由Zn2+、His74、Glu75、Cys52和Cys168组成的四面体结构;Met124、Leu282和Ala305三个非极性氨基酸构成底物结合口袋;His74、Ser54和Cys100是维持HDH催化活性的重要氨基酸;NADPH C4位的pro-R氢原子参与HDH催化的还原反应。第二部分研究发现过表达HDH能够提高颠茄发根和植株中莨菪碱的含量;敲除H6H能够阻断莨菪碱转化为山莨菪碱和东莨菪碱,并导致莨菪碱的积累和含量提高。HDH的表达分析和催化机制研究,对于完善TA生物合成的理论知识体系具有重要意义;开展莨菪碱的代谢工程研究并获得莨菪碱高含量的新材料,为解决莨菪碱药物资源供应问题提供了重要技术支撑。
白利文[3]（2020）在《血液中农药、临床药物、毒品的液质筛查方法研究》文中进行了进一步梳理法医毒物分析的主要任务是如何快速准确的从复杂基质中检测出痕量毒物、毒品及药物。毒物筛查即通过物理条件、化学反应和仪器分析,判断涉案检材中是否具有某类或某个化合物的检验鉴定工作,随着检测技术的发展,金标性质的气相色谱-质谱和液相色谱-质谱检测为筛查提供了很多便利,已经成为筛查中的必备手段,但是由于毒物种类繁多、检材性质复杂,如何有效的去除杂质、降低仪器的基质效应,提高目标物的提取率,又成为毒物分析人员面临的又一难题。本文利用快速、灵敏的超高效液相色谱-三重四级杆质谱作为检测手段,以毒物分析中常见检材-血为研究对象,对常见的毒品、农药及临床药物等三类高出现率毒物的理化性质、结构特点、色谱行为等进行研究,最终实现了同一条件下对三大类上百种毒物的分离检验,建立了一套包含检材前处理、仪器筛查、筛查结果数据处理等,自动、快速、准确的筛查方法。研究内容主要包含以下内容:1、通过比较最常见的沉淀蛋白、液液萃取、固相萃取三种前处理方法,在均衡回收率和基质效应的前提下,建立了同时提取血液中28种农药、29种毒品、92种临床药物的前处理方法;2、在质谱的自动优化程序下结合手动操作,优化了149种毒物的质谱方法,并通过比较不同的色谱柱和流动相,建立了一次同时分析149种毒物的液相色谱质谱方法;3、对各种目标化合物采取了分时间段监测的质谱编辑方法,并利用该类仪器定量分析软件对筛查方法进行编辑,使筛查结果明了直观,本方法可在2 min-3 min内对上百种毒物进行判定。本文以超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪器和Oasis PRiME HLB固相萃取柱,建立了血液中28种农药、29种毒品、92种临床药物的液相色谱质谱联用筛查方法。血液样品经4%磷酸水溶液稀释后,震荡、离心,取上清液过Oasis PRiME HLB固相萃取柱,淋洗、洗脱后接收洗脱液,氮吹至干、定容,过膜后,装瓶、进样分析。本文采用ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱（150 mm×2.1 mm,1.8μm）,流动相为乙腈-5 mmol/L甲酸铵-甲酸水溶液（pH 3）,电喷雾电离,正离子模式,质谱多反应监测（MRM）。本文中对各种目标化合物采取了分时间段监测的质谱编辑方法,并利用该类仪器定量分析软件处理筛查结果,使筛查结果可以更加直观的呈现,便于出具检验鉴定报告。本文提供的筛查方法:1.毒品类化合物的检出限为0.1 ng/mL-50 ng/mL,基质效应为90.8%-107.2%,回收率为71.3%-99.7%,线性关系良好的浓度范围为10 ng/mL-500ng/mL,可以满足实际毒品案件中毒品成分的筛查需求;2.临床药物类化合物的检出限为0.05 ng/mL-80 ng/mL,基质效应为81.2%-112.1%,回收率为71.0%-101.9%,线性关系良好的浓度范围为10 ng/mL-500 ng/mL,可以满足实际临床药物中毒案件中临床药物成分的筛查需求;3.农药类化合物的检出限为0.1 ng/mL-10 ng/mL,基质效应为83.5%-108.6%,回收率为68.7%-98.7%,线性关系良好的浓度范围为10 ng/mL-500 ng/mL,可以满足实际农药中毒案件中农药成分的筛查需求。本文建立的血液中农药、临床药物、毒品的液质筛查方法可以应用于实际案件中常见未知毒物毒品的筛查,筛查结果查看和处理更加便捷、高效,但目标物的种类数量有待扩充,前处理有待进一步优化。
杜晖,任静,郑妍[4]（2020）在《高效液相色谱法同时测定莨菪浸膏片中的4种活性组分》文中提出目的建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定莨菪浸膏片中东莨菪碱、山莨菪碱、硫酸阿托品和东莨菪内酯的含量。方法采用Welch C18（150 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,甲醇-0.05%磷酸溶液梯度洗脱,流速1.0 mL/min,进样量20μL,检测波长215 nm。结果 4种组分分别在0.501～20.059μg/mL,0.988～19.761μg/mL,0.468～9.361μg/mL和0.502～10.030μg/mL浓度范围内线性关系良好,平均回收率在98.3%～100.0%之间,RSD小于2.8%。结论该方法简单准确,灵敏度高,可用于莨菪浸膏片真伪辨析和质量控制。
平措绕吉,扎西卓嘎,海梅荣[5]（2019）在《藏医药学研究进展》文中提出藏医学发展至今,开始活跃。不可否认,传统医学有独特的魅力,但最重要的还是天时地利,使得藏地遍地药材。藏民们有独特的藏药文化,而这种药学的传统文化的理论势必与现代化发展碰撞与科学交织。本文通过对藏药的药性理论体系、生化药理研究进展讨论藏医药学的发展史,为藏医药三因五源理论与当代科学结合展开系统性的研究奠定理论基础。
邱飞[6]（2019）在《托品烷生物碱生物合成途径中三个新基因的发现与功能鉴定》文中进行了进一步梳理天然产物（Natural Products）是药物的重要来源,在治疗疾病、维护健康和改善生活质量等方面起到十分重要的作用。托品烷生物碱（Tropane Alkaloids,TAs）是一类具有独特托品烷骨架（Tropane Skeleton）的生物碱。莨菪碱（Hyoscyamine）和东莨菪碱（Scopolamine）是TAs中最具代表性的药物,在临床上作为抗胆碱药物用于麻醉镇痛、止咳平喘、治疗晕动症和农药中毒等。茄科药用植物如颠茄（Atropa belladonna）、曼陀罗（Datura species）和澳洲毒茄杂交种（Dubiosia×hybrid）是生产TAs的主要来源。颠茄为国内外多部药典收录且大规模人工种植,是最为重要的生产TAs的药用植物。颠茄叶片中TAs含量很低,莨菪碱含量一般为0.2%干重（Dry Weight,DW）,东莨菪碱含量一般为0.02%DW。莨菪碱和东莨菪碱的市场需求巨大,来源十分有限,导致其药物资源短缺。代谢工程技术和合成生物学技术被认为是解决药物资源短缺问题最为有效的方法,但是代谢工程和合成生物学都依赖于鉴定生物合成途径中的基因/酶。迄今为止,共有9个TAs生物合成途径基因/酶被鉴定,而关于还原苯丙酮酸、活化苯乳酸、合成海螺碱和还原莨菪醛的酶/基因还有待发现。本研究针对TAs生物合成途径中的三个酶促反应,包括还原苯丙酮酸、活化苯乳酸和合成海螺碱,采用分子生物学、生物信息学、生物化学和生物技术等多学科的理论、方法和技术,寻找并鉴定编码这些TAs生物合成酶的新基因,具体包括:苯丙酮酸还原酶基因（Phenylpyruvate Reductase,PPR）、苯乳酸UDP-糖基转移酶（Phenyllactate UDP-Glycosyltransferase,PLA-UGT）和海螺碱合成酶（Littorine Synthase,LS）。本研究取得的主要结果如下:1.苯丙酮酸还原酶基因（PPR）的克隆与功能鉴定（1）PPR的克隆与生物信息学分析。对颠茄转录组中16个甘油酸脱氢酶基因和已报道的TAs生物合成途径基因进行表达相关性分析,锁定并克隆了一个在侧根中高水平表达的候选基因,并将其命名为PPR。PPR与微生物PPR（Phenylpyruvate Reductase,PPR）和植物HPPR（Hydroxylphenylpyruvate Reductase,HPPR）具有共同起源,属于NAD（P）H依赖的脱氢酶家族。PPR在氨基酸序列上与微生物PPR和植物HPPR差异较大。（2）PPR的催化活性鉴定与动力学分析。在大肠杆菌中表达并纯化了携带6个组氨酸标签的PPR（6×His-tagged PPR）。催化活性分析结果显示,PPR不仅能催化苯丙酮酸还原为苯乳酸,而且也能催化p-羟基苯丙酮酸还原为为p-羟基苯乳酸。PPR对苯丙酮酸和p-羟基苯丙酮酸的Km分别为2.77±0.39 mM和2.25±0.34 mM,表明其对这两个不同底物的亲和力没有显着差异。PPR对苯丙酮酸和p-羟基苯丙酮酸的Kcat/Km分别为108.30±4.33 S-1·M-1和12.88±0.44 S-1·M-1,表明PPR还原苯丙酮酸的效率比还原p-羟基苯丙酮酸效率高8.41倍。上述研究结果表明PPR的主要功能是还原苯丙酮酸生成苯乳酸。（3）PPR的组织表达分析。采用qPCR检测了PPR在颠茄侧根、主根、茎和叶中的表达量,结果显示PPR在根中特异表达,在侧根中的表达量远高于其在主根中的表达量。PPR的组织表达模式与已报道的TAs生物合成基因的组织表达模式高度类似。为进一步研究PPR在侧根中表达情况,克隆了该基因1195 bp的启动子（pPPR）,并获得了转化pPPR::GUS的颠茄毛状根。GUS组织化学染色的转基因毛状根切片结果发现,pPPR特异性的在中柱鞘和内皮层细胞中发挥作用。这与颠茄的腐胺N-甲基转移酶基因（Putrescine N-methyltransferase,PMT）和莨菪碱6β-羟化酶基因（Hyoscyamine6β-hydroxylase,H6H）启动子在中柱鞘特异表达的结果基本一致。（4）PPR-RNAi颠茄毛状根中相关代谢产物的含量分析。为进一步研究PPR在TAs生物合成中的作用,采用RNAi技术获得了干扰PPR的颠茄毛状根。分子检测结果表明,PPR-RNAi颠茄毛状根中该基因表达量仅为对照的18.7441.92%。所有PPR-RNAi毛状根株系中苯乳酸含量均大幅降低,仅为对照的0.486.41%。当PPR被干扰后,毛状根中莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量与对照毛状根相比均大幅度下降。在PPR-RNAi毛状根中,莨菪碱含量为对照的0.499.14%,山莨菪碱为对照的2.2921.56%,东莨菪碱为对照的4.5140.60%。抑制PPR导致了其直接产物苯乳酸和相关TAs含量的大幅度下降,表明PPR参与了TAs的生物合成。2.苯乳酸UDP-糖基转移酶基因（PLA-UGT）的克隆与功能鉴定（1）PLA-UGT的克隆与生物信息学分析。对颠茄转录组中102个糖基转移酶基因进行表达相关性分析,锁定了5个unigene作为候选基因进一步开展生物信息学分析。分子系统进化分析结果发现,abalocus19485与拟南芥AT4G15480.1和AT3G21560.1聚在一起,表明abalocus19485可能具有与这两个拟南芥UGT类似的功能,即催化苯丙烷类化合物和UDP-葡萄糖生成糖酯类化合物。因此推测abalocus19485最有可能是PLA-UGT。（2）PLA-UGT的组织表达分析。PLA-UGT的组织表达模式与PPR以及已报道的TAs生物合成基因的组织表达模式高度类似,即在根中特异表达,在侧根中的表达量远高于其在主根中的表达量。为进一步研究PLA-UGT在侧根中表达情况,克隆了该基因1329bp的启动子（pPLA-UGT）,并获得了转化pPLA-UGT::GUS的颠茄毛状根。GUS组织化学染色的转基因毛状根切片结果发现,pPLA-UGT在中柱鞘和内皮层细胞中发挥作用。（3）PLA-UGT的催化活性鉴定。在大肠杆菌中表达并纯化了携带6个组氨酸标签的PLA-UGT（6×His-tagged PLA-UGT）。由于没有苯乳酰葡萄糖的标准品,本研究采用高分辨质谱鉴定相关化合物。催化活性分析结果显示,新产物的保留时间为3.80 min,其质荷比值为327.1084,与负离子形式的苯乳酰葡萄糖准分子离子的质荷比一致,表明PLA-UGT催化苯乳酸和UDP-葡萄糖生成了苯乳酰葡萄糖。（4）抑制PLA-UGT对TAs相关代谢物生物合成的影响。采用病毒诱导的基因沉默（Virus Induced Gene Silencing,VIGS）方法,在颠茄幼苗中沉默PLA-UGT。qPCR检测结果显示,在PLA-UGT-VIGS颠茄侧根中,其表达量仅为对照的9.89%。PLA-UGT-VIGS颠茄中莨菪碱含量仅为对照的30.88%。沉默PLA-UGT研究结果初步表明该基因参与TAs生物合成。为进一步确证PLA-UGT的功能,采用RNAi技术获得了抑制PLA-UGT的颠茄毛状根。分子检测结果显示RNAi毛状根中PLA-UGT的表达量较对照大幅度降低,仅为对照的7.5511.99%。基于质谱的代谢产物分析结果发现,PLA-UGT干扰毛状根株系中海螺碱、莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量较对照都大幅度下降。PLA-UGT干扰毛状根中海螺碱含量为对照的7.1221.50%,莨菪碱含量为对照的3.6514.29%,山莨菪含量为对照的7.2035.20%,东莨菪碱含量为对照的6.0225.30%。PLA-UGT干扰毛状根中托品的含量较对照出现了更高水平的积累,为对照的2.333.03倍。抑制PLA-UGT的研究结果表明该基因参与TAs的生物合成。3.海螺碱合成酶酶基因（LS）的克隆与功能鉴定（1）LS的克隆与生物信息学分析。对颠茄转录组中33个丝氨酸羧肽酶基因进行表达相关性分析,锁定abalocus17884作为候选基因进一步开展生物信息学分析。分子系统进化分析结果发现,abalocus17884与功能验证的AtSAT、AtSCT、AtSMT、AtSST、BnSCT1、BnSCT2和CtAT1聚在一起。所有这些基因都属于丝氨酸羧肽酶类-酰基转移酶（Serine Carboxylpeptidase-like Acyltransferase,SCPL-AT）,具有催化苯丙烷类糖酯化合物与特定酰基受体酯化缩合的功能。推测abalocus17884可能具有酯化酶的功能,将其命名为海螺碱合成酶基因（Littorine Synthase,LS）。（2）LS的组织表达分析。LS在颠茄的根中特异性表达,在侧根中的表达水平比主根中的高。为进一步研究LS在侧根中表达情况,克隆了该基因1629 bp的启动子（pLS）,并获得了转化pLS::GUS的颠茄毛状根。GUS组织化学染色的转pLS::GUS毛状根切片结果发现,pLS在内皮层和中柱鞘细胞中高水平表达。（3）抑制LS对TAs相关代谢物生物合成的影响。采用VIGS在颠茄幼苗中沉默LS。在LS-VIGS颠茄侧根中,其表达量仅为对照的19.95%,LS-VIGS颠茄中莨菪碱含量仅为对照的30.04%。沉默LS研究结果初步表明该基因参与TAs生物合成。为进一步确证LS的功能,采用RNAi技术获得了抑制LS的颠茄毛状根。分子检测结果表明,LS-RNAi颠茄毛状根中LS的表达量较对照大幅度降低,仅为对照的3.7920.35%。基于质谱定量的代谢产物分析结果发现,LS干扰毛状根中TAs（海螺碱、莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱）都大幅度下降。在LS-RNAi毛状根株系ILS-1和ILS-5中,4种TAs处于痕量水平。对托品和苯乳酸的含量检测结果发现,LS-RNAi毛状根中这两种TAs的前体化合物含量较对照显着提高。抑制LS的研究结果表明,该基因参与TAs的生物合成。（4）采用合成生物学技术鉴定LS的功能。LS属于SCPL-AT,前人研究表明SCPL-AT通常需要翻译后加工才具有活性。在烟草叶片中瞬时表达携带HA标签的LS,western blot检测发现LS在翻译后被切割成不同肽段。基于western blot检测结果,同时由于无法制备获得LS的前体苯乳酰葡萄糖,本研究采用在烟草中重建海螺碱合成途径的方法验证LS的功能。在向烟草叶片注射托品和苯乳酸的情况下,在烟草叶片中单独表达LS时,能够检测到痕量的海螺碱;而LS和PLA-UGT共表达时,海螺碱含量约为单独表达LS时的8.5倍。在YFP（阴性对照）和单独表达PLA-UGT的烟草叶片中均没有海螺碱生成。上述研究结果表明LS具有合成海螺碱的功能。综上所述,本研究针对TAs生物合成途径中有待发现的新基因开展了相关研究,从颠茄中鉴定了TAs生物合成途径中三个新基因,包括PPR、PLA-UGT和LS。这三个基因具有类似的组织表达模式,表现为在侧根中特异性/高水平表达,且PPR、PLA-UGT和LS主要在侧根中柱鞘和内皮层中表达。PPR能够高效率催化苯丙酮酸还原为苯乳酸,PLA-UGT能够催化苯乳酸和UDP-葡萄糖生成苯乳酰葡萄糖,LS的功能是合成海螺碱。转基因研究结果表明,分别抑制PPR、PLA-UGT和LS都会导致TAs含量的大幅度下降。PPR、PLA-UGT和LS的发现和功能鉴定,不仅在分子生物学和生物化学方面解析了TAs生物合成途径的三个酶促反应步骤,也为今后利用这些新基因开展TAs的代谢工程和合成生物学研究提供了必需基因。
陈阳[7]（2019）在《基于肠道菌群的葛根芩连汤干预急性肠炎模型大鼠的作用机制研究》文中指出1目的本研究以经方葛根芩连汤为研究对象,建立葡聚糖硫酸钠诱导的急性肠炎动物模型,通过研究葛根芩连汤及不同配伍对正常和模型大鼠肠菌肠道菌群多样性的影响及其药效成分代谢规律的差异性,结合炎性指标,从菌群代谢角度来初步探讨葛根芩连汤的配伍规律,希冀为深入揭示葛根芩连汤的深层次作用机制奠定基础。2方法2.1葛根芩连汤对急性肠炎模型大鼠的治疗作用通过建立葡聚糖硫酸钠诱导的急性肠炎大鼠模型,采用酶联免疫吸附法测定TNF-α、IL-6、IL-10的含量,结合结肠损伤、部分结肠干湿度比及病理切片等评分,探究葛根芩连汤对急性肠炎的治疗作用。2.2葛根芩连汤对急性肠炎模型大鼠肠道微生物多样性的影响采用高通量测序16S r RNA技术,研究全方及不同配伍组对急性肠炎模型大鼠的整体肠道菌群组成和比例的的影响,并找到门和属水平差异性的物种。2.3肠道菌群对葛根芩连汤主要成分的代谢差异研究运用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术分析葛根芩连汤及不同配伍与体外肠道菌群厌氧孵育后黄酮类、皂苷类和生物碱类成分的代谢情况,结合多元统计学分析,探讨配伍对葛根芩连汤主要成分肠菌代谢的影响。3结果3.1葛根芩连汤对急性肠炎模型大鼠的治疗作用模型鼠出现体重减轻、粪便隐血、结肠水肿、结肠隐窝和上皮结构破坏,提示模型具有急性肠炎的病理特征;模型鼠较正常鼠血清TNF-α、IL-6含量显着升高,而IL-10含量明显降低。与模型组比较,经葛根芩连汤及不同配伍干预后,大鼠毛发正常、体重增加、结肠损伤减轻;病理形态学结果显示,肠腺体变长且丰富,得到一定程度恢复,其黏膜层内隐窝结构损伤程度得到缓解,出血和水肿得到减轻;TNF-α、IL-6含量的降低,IL-10含量的升高。3.2葛根芩连汤对急性肠炎模型大鼠肠道微生物多样性的影响Alpha多样性和Beta多样性显示,各组大鼠肠道菌群组成有明显差异,除全方去芩连组外均能下调急性肠炎引起的菌群丰度和多样性的增加。Bifidobacterium（双歧杆菌属）等有益菌只出现在正常组中;与正常相比,模型组Lactobacillus（乳酸杆菌属）显着减少,Bacteroides（拟杆菌属）、Escherichia-shigella（大肠杆菌志贺氏菌属）、Clostridiumsensustricto1（梭菌属）上调;与模型组比较,葛根芩连汤不同配伍均能降低与肠道炎症疾病相关的Clostridiumsensustricto1（梭菌属）的数量;全方组、全方去甘草组、芩连组均可显着性增加有益菌Akkermansia（阿克曼菌属）的数量;全方去甘草组引起RuminococcaceaeUCG013增加;全方去芩连组中有害菌Desulfovibrio（脱硫弧菌属）、有益菌Allobaculum和BacteroidalesS24-7ukn富集;全方去葛根组引起Proteobacteria（变形菌门）及Burkhonderiales（伯克氏菌目）的上调且Allobaculum和BacteroidalesS24-7ukn相对丰度下降。3.3肠道菌群对葛根芩连汤主要成分的代谢差异研究经肠道菌群代谢后鉴定了全方中5个黄酮类原型成分、1个皂苷类原型成分、4个生物碱原型及14个代谢产物,多元统计分析结果显示葛根芩连汤的不同配伍聚为5类,找出了分类的10个差异性成分,并初步探讨了配伍对成分代谢的规律。4结论葛根芩连汤是通过降低IL-6和TNF-α的水平,升高IL-10水平,抑制炎症反应,减轻黏膜损伤,调节肠道菌群的多样性,来发挥对DSS诱导的AE模型大鼠的治疗作用。结合肠菌对药物的代谢研究,得出疾病与菌群、药物之间存在着复杂的网络关系,不同配伍可造成肠道菌群异常改变及成分代谢的水平差异:全方及全方去甘草组在抗炎及对黏膜修复作用更为明显;黄芩黄连是葛根芩连汤中调节肠道菌群平衡的关键药味,且配伍葛根、甘草后对调节肠道菌群的作用增强;全方组中黄芩苷和汉黄芩苷代谢较不同配伍组多,有益于其药效的发挥、大多黄连生物碱类成分在肠道代谢增加,比较不同配伍组的结果分析推测甘草可能是加快生物碱类成分代谢的方中重要药味。
陈朋朋[8]（2019）在《电磁诱导结晶分离东莨菪碱的技术研究》文中研究指明东莨菪碱是一种应用广泛的托品烷类生物碱,具有多种生物活性,主要从洋金花中提取获得。由于东莨菪碱性质不稳定,生产中常通过冷冻结晶的方法将其转化为氢溴酸东莨菪碱,这样即有利于分离纯化操作,又有利于保护其光学活性。然而,在冷冻结晶过程中,存在结晶时间长、产品收率低等问题。因此,开发一种快速、高效的新型结晶方法,对东莨菪碱的生产具有重要意义。本研究以东莨菪碱为分离对象,考察了电磁诱导结晶分离东莨菪碱的作用效果,探讨了电磁诱导结晶的机理,评价了电磁场下获得的晶体的品质,优化了电磁诱导结晶工艺。主要研究结果如下:（1）磁场对东莨菪碱结晶过程具有增益效果:以结晶诱导时间、晶体生长速率、晶体纯度和回收率等为指标,从磁场方向、磁场强度及结晶溶剂三个角度,考察了磁场对东莨菪碱结晶过程的具体作用效果。发现磁场可以缩短结晶时间、提高晶体纯度、增加晶体生长速率和结晶回收率。（2）磁场破坏了东莨菪碱与溶剂之间的氢键:利用量子化学方法,模拟了东莨菪碱和不同溶剂的最低能量构象,计算出东莨菪碱与不同溶剂间按不同比例结合时的最稳定形态,得出东莨菪碱与不同溶剂之间,均可形成以氢键为主要作用的结合物。然后,通过磁场对溶液物理性质的考察,发现磁场可以使溶液的吸光度增加、表面张力降低、溶解度降低、粘度和密度降低。推测原因为磁场破坏了分子间的氢键,降低了溶质与溶剂和溶剂与溶剂间的分子间相互作用,从而改变溶液物理性质,加速晶核的形成和晶体的生长。（3）磁场提高了氢溴酸东莨菪碱晶体的品质:利用现代分析仪器对氢溴酸东莨菪碱晶体的品质进行了评价。首先,通过红外光谱说明磁场下氢溴酸东莨菪碱的化学结构未发生变化。其次,利用DSC热分析仪检测说明晶体熔程降低、熔点升高和熔融焓升高,表明磁场下晶体排列更加规则和紧密;通过扫描电镜发现磁场对晶体具有“压缩效应”;通过XRD衍射仪说明了磁场下的晶体结晶度更高;通过旋光仪说明了磁场下晶体的旋光度更高。（4）获得了电磁诱导东莨菪碱最佳结晶工艺:对电磁诱导结晶的工艺进行了优化,在考察了溶剂种类、溶液浓度、温度、氢溴酸添加量、磁场强度、磁化时间等因素对结晶过程影响的基础上,选择温度、浓度、氢溴酸添加量为因素,以纯度和回收率为指标,进行三因素三水平响应面实验。最佳工艺条件为:浓度为98 mg/mL,氢溴酸添加量为1:1.1,温度为15℃。在此条件下,氢溴酸东莨菪碱的晶体纯度为:99.22%,回收率为84.14%。
王雄飞,孙毅坤,钟苗,段晓杰,罗世林,杨雨薇,袁瑞娟[9]（2018）在《消旋山莨菪碱的杂质研究》文中研究说明目的鉴定消旋山莨菪碱未知杂质。方法采用多种色谱、光谱方法联合对消旋山莨菪碱中的未知杂质进行分析,确定未知杂质结构。结果消旋山莨菪碱在存储过程中因水解而产生杂质,经过高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用技术、薄层色谱法和核磁共振技术鉴定,杂质为6β-羟基托品和托品酸。结论消旋山莨菪碱中的杂质为水解产物6β-羟基托品和托品酸,应对这两种杂质进行质量控制。
汤齐,高霞,耿婷,黄文哲,刘丽芳,王振中[10]（2017）在《肠道菌群与中药相互作用的研究进展》文中进行了进一步梳理肠道菌群作为人体内庞大的微生态系统,与人体健康状况有着密切的关联。其特点是数量大、种类多,一旦失调,将会引发各种疾病。中药对肠道菌群的稳态具有调节作用,同时肠道菌群对中药成分具有代谢转化作用,中药与肠道菌群的相互作用研究对实现中药现代化具有重要意义。对近年来关于肠道菌群与中药相互作用的研究成果进行整理归纳,为后续进一步深入研究中药与肠道菌群的关系提供参考。
二、山莨菪碱的化学研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、山莨菪碱的化学研究（论文提纲范文）
（1）液相色谱-串联质谱法同时快速测定婴幼儿谷物食品中3种莨菪烷生物碱（论文提纲范文）
| 1 实验部分 |
| 1.1 仪器、试剂与材料 |
| 1.2 标准溶液的配制 |
| 1.3 样品前处理 |
| 1.4 色谱条件 |
| 1.5 质谱条件 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 仪器条件的优化 |
| 2.2 样品提取与净化条件的选择 |
| 2.3 线性关系 |
| 2.4 方法的灵敏度和精密度 |
| 2.5 实际样品测定 |
| 3 结 语 |
（2）莨菪碱脱氢酶催化机制及莨菪碱代谢工程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 药用托品烷生物碱的来源和临床药效 |
| 1.2 托品烷生物碱生物合成 |
| 1.2.1 托品烷生物碱生物合成途径 |
| 1.2.2 组学助力托品烷生物碱生物合成途径解析 |
| 1.2.3 腐胺N-甲基转移酶(Putrescine N-methyltransferase,PMT) |
| 1.2.4 腐胺N-甲基氧化酶(N-Methylputrescine oxidase,MPO) |
| 1.2.5 Ⅲ型聚酮合成酶(TypeⅢpolyketide synthase,PYKS) |
| 1.2.6 托品酮合成酶(Tropinone synthase,CYP82M3) |
| 1.2.7 托品酮还原酶(Tropinone reductase,TR) |
| 1.2.8 苯丙氨酸氨基转移酶(L-Phenylalanine:4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferase,Ar AT4) |
| 1.2.9 苯丙酮酸还原酶(Phenylpyruvic acid reductase,PPAR) |
| 1.2.10 海螺碱生物合成二酶系统:苯乳酸葡萄糖基转移酶(Phenyllactate UDP-glycosyltransferase,UGT1)和海螺碱合成酶(Littorine synthase,LS) |
| 1.2.11 海螺碱变位酶(Littorine Mutase,CYP80F1) |
| 1.2.12 莨菪碱脱氢酶/莨菪醛还原酶(Hyoscyamine dehydrogenase/Hyoscyamine aldehyde reductase,HDH/HAR) |
| 1.2.13 莨菪碱6β-羟化酶(Hyoscyamine6β-hydroxylase,H6H) |
| 1.3 托品烷生物碱生物合成酶催化机制研究 |
| 1.3.1 腐胺N-甲基转移酶催化机制 |
| 1.3.2 III型聚酮合酶催化机制 |
| 1.3.3 托品酮还原酶I和II的催化机制 |
| 1.3.4 莨菪碱6β-羟化酶催化机制 |
| 1.4 商业化生产托品烷生物碱的瓶颈和技术改良 |
| 1.4.1 商业化生产托品烷生物碱的瓶颈 |
| 1.4.2 代谢工程提高托品烷生物碱产量 |
| 1.4.3 微生物工厂生产托品烷生物碱 |
| 第2章 绪论 |
| 2.1 选题依据、研究目的与意义 |
| 2.2 拟解决的科学问题 |
| 2.3 研究内容和技术路线 |
| 第3章 莨菪碱脱氢酶基因克隆与功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 质粒与菌株 |
| 3.1.3 常规试剂、耗材 |
| 3.1.4 自配试剂 |
| 3.1.5 培养基的配制 |
| 3.1.6 通用仪器设备 |
| 3.1.7 常规分子生物学方法 |
| 3.1.8 基于转录组挖掘HDH编码基因 |
| 3.1.9 HDH基因全长序列的获取 |
| 3.1.10 HDH基因的表达模式qPCR分析 |
| 3.1.11 颠茄基因组步移文库构建 |
| 3.1.12 HDH启动子克隆与pHDH::GUS载体构建 |
| 3.1.13 pHDH::GUS转基因毛状根获得 |
| 3.1.14 pHDH::GUS转基因毛状根组织化学染色 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 HDH候选基因的筛选 |
| 3.2.2 HDH候选基因克隆与表达分析 |
| 3.2.3 候选HDH启动子的表达分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第4章 莨菪碱脱氢酶催化活性鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 设备 |
| 4.1.4 HDH蛋白质表达和纯化 |
| 4.1.5 CYP80F1 蛋白质表达以及微体蛋白分离 |
| 4.1.6 HDH催化活性测定 |
| 4.1.7 HDH最适反应条件测定 |
| 4.1.8 HDH酶动力学参数K_m和V_(max)以及反应平衡常数测定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HDH原核表达载体构建及大肠杆菌异源表达纯化 |
| 4.2.2 HDH催化莨菪醛还原生成莨菪碱 |
| 4.2.3 HDH氧化莨菪碱生成莨菪醛 |
| 4.2.4 HDH最适反应条件 |
| 4.2.5 HDH平衡常数测定 |
| 4.2.6 HDH酶动力学参数 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第5章 莨菪碱脱氢酶催化机制解析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 质粒与菌株 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 设备 |
| 5.1.4 HDH蛋白质大量诱导以及蛋白质纯化 |
| 5.1.5 HDH蛋白的晶体生长与结构解析 |
| 5.1.6 HDH蛋白的结构分析与分子对接 |
| 5.1.7 HDH点突变以及突变体活性分析 |
| 5.1.8 酶法合成[4-~2H]NADPH |
| 5.1.9 使用氘代[4-~2H]NADPH还原苯乙醛 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 获得HDH晶体以及结构解析 |
| 5.2.2 HDH蛋白结构解析 |
| 5.2.3 HDH蛋白的分子对接 |
| 5.2.4 HDH底物结合位点及催化关键残基 |
| 5.2.5 解析HDH催化机制 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第6章 过表达莨菪碱脱氢酶基因提高莨菪碱含量的代谢工程研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试剂与培养基配制 |
| 6.1.2 过表达HDH颠茄毛状根获得和分子检测 |
| 6.1.3 颠茄毛状根中托品烷生物碱的提取及含量测定 |
| 6.1.4 过表达HDH颠茄植株获得及分子检测 |
| 6.1.5 颠茄植株托品烷生物碱提取及含量测定 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 在颠茄发根中过表达HDH提高莨菪碱含量 |
| 6.2.2 过表达HDH培育莨菪碱含量提高的颠茄植株 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第7章 敲除莨菪碱6β-羟化酶基因提高莨菪碱含量的代谢工程研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 AbH6H编码区基因组序列的克隆与sg RNA设计 |
| 7.1.2 AbH6H敲除载体构建和工程菌的获得 |
| 7.1.3 AbH6H敲除转基因植株获得和分子检测 |
| 7.1.4 AbH6H敲除转基因纯合植株生物碱含量检测 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 AbH6H编码区基因组序列的克隆与sg RNA设计及载体构建 |
| 7.2.2 AbH6H基因组敲除转基因颠茄的获得与分子检测 |
| 7.2.3 敲除AbH6H的颠茄中托品烷生物碱含量分析 |
| 7.3 小结与讨论 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 特色与创新 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 学习期间发表论文及参加课题 |
（3）血液中农药、临床药物、毒品的液质筛查方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 注释说明清单 |
| 引言 |
| 1 筛查技术研究进展 |
| 1.1 血液检材的前处理方法 |
| 1.1.1 沉淀蛋白法 |
| 1.1.2 液液萃取法 |
| 1.1.3 固相萃取法 |
| 1.1.4 Qu ECh ERS方法 |
| 1.2 仪器检验技术 |
| 1.2.1 气相色谱-质谱法 |
| 1.2.2 液相色谱-质谱法 |
| 1.2.3 其他筛查技术 |
| 2 毒物毒品筛查方法的建立 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 标准溶液配制 |
| 2.3 样品前处理 |
| 2.3.1 乙腈沉淀蛋白法 |
| 2.3.2 丙酮萃取法 |
| 2.3.3 固相萃取法 |
| 2.4 实验条件 |
| 2.4.1 色谱条件 |
| 2.4.2 质谱条件 |
| 2.5 方法学考察 |
| 2.5.1 专属性考察 |
| 2.5.2 线性和检出限 |
| 2.5.3 回收率、基质效应 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 针对血液检材前处理方法的选择 |
| 2.6.2 筛查方法中色谱柱选择 |
| 2.6.3 质谱方法的编辑方法 |
| 2.6.4 调整色谱方法 |
| 2.6.5 液质筛查方法的应用前景 |
| 2.6.6 筛查方法用以定量时的问题 |
| 2.6.7 液质筛查方法亟待研究的内容 |
| 3 筛查方法编辑 |
| 3.1 采集各种目标化合物色谱和质谱信息 |
| 3.2 编辑筛查质谱方法 |
| 3.3 编辑筛查数据处理和查看方法 |
| 3.3.1 数据处理方法 |
| 3.3.2 数据查看方法 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 149 种毒物毒品标准溶液色谱图 |
| 在学研究成果 |
| 致谢 |
（4）高效液相色谱法同时测定莨菪浸膏片中的4种活性组分（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 溶液的制备 |
| 1.2.1. 1 样品溶液 |
| 1.2.1. 2 对照品溶液 |
| 1.2.2 色谱条件 |
| 2 结果 |
| 2.1 专属性考察 |
| 2.2 线性范围和检测限的考察 |
| 2.3 重复性及稳定性考察 |
| 2.4 样品测定及回收率考察 |
| 3 讨论 |
| 3.1 检测波长 |
| 3.2 提取溶剂 |
| 3.3 流动相 |
| 4 结论 |
（5）藏医药学研究进展（论文提纲范文）
| 1 前言 |
| 2 藏医学的基础理论 |
| 3 藏药 |
| 4 藏药化学成分及药理 |
| 5 藏药炮制技术 |
| 6 结论与展望 |
（6）托品烷生物碱生物合成途径中三个新基因的发现与功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 托品烷生物碱 |
| 1.2 托品烷生物碱生物合成途径 |
| 1.2.1 鸟氨酸脱羧酶 |
| 1.2.2 腐胺N‐甲基转移酶 |
| 1.2.3 N‐甲基腐胺氧化酶 |
| 1.2.4 Ⅲ型聚酮合酶 |
| 1.2.5 托品酮合成酶 |
| 1.2.6 托品酮还原酶 |
| 1.2.7 芳香族氨基酸氨基转移酶 |
| 1.2.8 海螺碱变位酶 |
| 1.2.9 莨菪碱6β‐羟化酶 |
| 1.3 托品烷生物碱代谢工程研究 |
| 1.4 托品烷生物碱合成生物学研究 |
| 第2章 绪论 |
| 2.1 选题依据、研究目的与意义 |
| 2.2 拟解决的科学问题 |
| 2.3 研究内容和技术路线 |
| 第3章 苯丙酮酸还原酶基因克隆与功能分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 常规仪器设备 |
| 3.1.3 分子生物学试剂及试剂盒 |
| 3.1.4 生化试剂以及耗材 |
| 3.1.5 常规试剂与培养基的配置 |
| 3.1.6 常规分子生物学实验方法 |
| 3.1.7 苯丙酮酸还原酶候选基因筛选 |
| 3.1.8 构建颠茄RACE文库 |
| 3.1.9 PPR基因全长序列的获取 |
| 3.1.10 合成颠茄第一链cDNA |
| 3.1.11 cDNA全长序列扩增 |
| 3.1.12 PPR生物信息学分析 |
| 3.1.13 PPR重组蛋白表达以及纯化 |
| 3.1.14 PPR重组蛋白质浓度测定 |
| 3.1.15 PPR重组蛋白催化活性测定 |
| 3.1.16 PPR最适反应条件以及酶动力学参数 |
| 3.1.17 PPR组织表达分析 |
| 3.1.18 PPR干扰毛状根获取及分子检测 |
| 3.1.19 PPR启动子克隆以及组织化学染色 |
| 3.1.20 毛状根中苯乳酸和苯丙酮酸含量测定 |
| 3.1.21 TAs提取及含量测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 筛选苯丙酮酸还原酶基因 |
| 3.2.2 克隆颠茄PPR的 cDNA序列 |
| 3.2.3 PPR的生物信息学分析 |
| 3.2.4 PPR重组蛋白催化活性测定 |
| 3.2.5 PPR重组蛋白质最适反应条件 |
| 3.2.6 PPR重组蛋白质酶动力学参数 |
| 3.2.7 PPR组织表达和启动子组织化学染色分析 |
| 3.2.8 获得RNAi干扰PPR的颠茄毛状根和相关分子检测 |
| 3.2.9 RNAi干扰PPR对苯乳酸和苯丙酮酸含量的影响 |
| 3.2.10 RNAi干扰PPR对 TAs含量的影响 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第4章 苯乳酸UDP‐糖基转移酶基因克隆与功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 PLA‐UGT蛋白质纯化以及酶促催化反应 |
| 4.1.3 采用VIGS在颠茄中瞬时沉默PLA‐UGT |
| 4.1.4 PLA‐UGT干扰颠茄毛状根获得和分子检测 |
| 4.1.5 UPLC‐MS/MS测定颠茄毛状根中代谢物的含量 |
| 4.1.6 GC‐MS检测转基因毛状根中托品的含量 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 组织表达相关性筛选糖基转移酶候选基因 |
| 4.2.2 PLA‐UGT候选基因的筛选 |
| 4.2.3 PLA‐UGT克隆 |
| 4.2.4 PLA‐UGT生物信息学分析 |
| 4.2.5 PLA‐UGT重组蛋白催化活性鉴定 |
| 4.2.6 PLA‐UGT的组织表达以及启动子组织化学染色分析 |
| 4.2.7 采用VIGS在颠茄植株中沉默PLA‐UGT |
| 4.2.8 获得RNAi干扰PLA‐UGT的颠茄毛状根和相关分子检测 |
| 4.2.9 RNAi干扰PLA‐UGT对 TAs含量的影响 |
| 4.2.10 RNAi干扰PLA‐UGT对托品和苯乳酸含量的影响 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第5章 海螺碱合成酶基因克隆与功能分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物表达载体 |
| 5.1.2 Western blot检测瞬时转化烟草表达的蛋白 |
| 5.1.3 瞬时转化烟草叶片鉴定LS的功能 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 海螺碱合成酶候选基因的筛选与克隆 |
| 5.2.2 LS的生物信息学分析 |
| 5.2.3 LS的组织表达以及启动子组织化学染色分析 |
| 5.2.4 采用VIGS在颠茄植株中沉默LS |
| 5.2.5 获得RNAi干扰LS的颠茄毛状根和相关分子检测 |
| 5.2.6 RNAi干扰LS对 TAs含量的影响 |
| 5.2.7 RNAi干扰LS对托品和苯乳酸含量的影响 |
| 5.2.8 Western blot分析LS翻译后加工 |
| 5.2.9 采用合成生物学手段鉴定LS的功能 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 特色与创新 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 学习期间发表论文及参加课题 |
（7）基于肠道菌群的葛根芩连汤干预急性肠炎模型大鼠的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 葛根芩连汤对急性肠炎模型大鼠的治疗作用 |
| 1 仪器、试药与材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 饮片 |
| 1.4 动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 葛根芩连汤及不同配伍组药液配制 |
| 2.2 实验动物分组 |
| 2.3 动物模型的建立 |
| 2.4 动物给药 |
| 2.5 标本采集及处理 |
| 2.6 动物检测指标及方法 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 葛根芩连汤及其配伍对大鼠体重的影响 |
| 3.2 葛根芩连汤及其配伍对大鼠DAI的影响 |
| 3.3 葛根芩连汤及其配伍对大鼠部分结肠W/D的影响 |
| 3.4 葛根芩连汤及其配伍对大鼠结肠CMDI的影响 |
| 3.5 葛根芩连汤及其配伍对结肠病理组织切片及HPS的影响 |
| 3.6 对生化指标IL-6、IL-10、TNF-α含量的影响 |
| 4 小结与讨论 |
| 第二章 葛根芩连汤对急性肠炎大鼠肠道微生态多样性研究 |
| 1 仪器、试药与材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 饮片 |
| 1.4 动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 葛根芩连汤及不同配伍组药液配制 |
| 2.2 实验动物分组 |
| 2.3 动物模型的建立 |
| 2.4 动物给药 |
| 2.5 标本采集及处理 |
| 2.6 细菌总DNA提取及质量检测 |
| 2.7 细菌16S rDNA PCR扩增 |
| 2.8 Miseq文库的构建和测序 |
| 2.9 序列优化及生物信息学分析 |
| 2.10 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 样本总DNA质量检验 |
| 3.2 细菌16S rDNA PCR扩增 |
| 3.3 优化序列信息及样本数据统计 |
| 3.4 OTU分析 |
| 3.5 样本稀释曲线及Alpha多样性分析 |
| 3.6 Beta多样性分析 |
| 3.7 门水平群落组成及物种差异分析 |
| 3.8 属水平群落组成及物种差异分析 |
| 3.9 LEfSe差异物种分析 |
| 3.10 环境因子关联分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第三章 肠道菌群对葛根芩连汤不同配伍的代谢差异研究 |
| 1 仪器、试药与材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 饮片 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 药物溶液的制备 |
| 2.2 对照品溶液及内标溶液的制备 |
| 2.3 培养基及肠道菌群混悬液的制备 |
| 2.4 肠菌代谢培养 |
| 2.5 样品处理方法 |
| 2.6 液相色谱条件 |
| 2.7 质谱条件 |
| 2.8 数据处理分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 黄酮类原型成分及代谢产物UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析 |
| 3.2 皂苷类原型成分及代谢产物UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析 |
| 3.3 生物碱类原型成分及代谢产物UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析 |
| 3.4 主要成分代谢差异分析 |
| 3.5 多元统计分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 :文献综述 中药与肠道菌群相互作用研究概述 |
| 参考文献 |
| 附录2 :在校期间发表论文 |
（8）电磁诱导结晶分离东莨菪碱的技术研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题来源 |
| 1.2 课题背景及意义 |
| 1.3 东莨菪碱研究现状 |
| 1.3.1 东莨菪碱的理化性质 |
| 1.3.2 东莨菪碱的生物活性 |
| 1.3.3 东莨菪碱的获取途径 |
| 1.3.4 东莨菪碱的分离纯化 |
| 1.4 结晶技术研究现状 |
| 1.4.1 结晶基本原理 |
| 1.4.2 结晶技术分类 |
| 1.5 磁性诱导结晶技术研究进展 |
| 1.5.1 磁场对结晶过程的影响 |
| 1.5.2 电磁诱导东莨菪碱结晶机理探讨 |
| 1.6 拟研究内容 |
| 第二章 电磁诱导对东莨菪碱结晶过程的影响 |
| 2.1 材料及仪器 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 磁场装置 |
| 2.2.2 东莨菪碱的检测方法 |
| 2.2.3 磁场对不同溶剂结晶的影响 |
| 2.2.4 磁场方向对晶体生长的影响 |
| 2.2.5 磁场强度对晶体生长的影响 |
| 2.2.6 磁场对晶体生长速率的影响 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 液相分析 |
| 2.3.2 东莨菪碱标准曲线 |
| 2.3.3 磁场对不同溶剂结晶的影响 |
| 2.3.4 磁场方向对晶体生长的影响 |
| 2.3.5 磁场强度对晶体生长的影响 |
| 2.3.6 磁场对晶体生长速率的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 电磁诱导东莨菪碱结晶作用机理探讨 |
| 3.1 材料及仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 溶质与溶剂间结合力的模拟分析 |
| 3.2.2 东莨菪碱与溶剂间相互作用的紫外光谱分析 |
| 3.2.3 磁场对溶液物理性质的影响 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 溶质与溶剂间结合力的模拟分析 |
| 3.3.2 磁场对溶液物理性质的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 电磁诱导东莨菪碱晶体的品质评价 |
| 4.1 材料及仪器 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 红外光谱分析 |
| 4.2.2 差热分析 |
| 4.2.3 晶体的形貌分析 |
| 4.2.4 衍射分析 |
| 4.2.5 晶体的旋光度测定 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 红外光谱分析 |
| 4.3.2 差热分析 |
| 4.3.3 晶体的形貌分析 |
| 4.3.4 衍射分析 |
| 4.3.5 晶体的旋光度测定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 电磁诱导东莨菪碱结晶工艺优化 |
| 5.1 材料及仪器 |
| 5.1.1 材料与试剂 |
| 5.1.2 仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1单因素实验 |
| 5.2.2 响应面优化 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 结晶溶剂的选择 |
| 5.3.2 浓度对结晶的影响 |
| 5.3.3 氢溴酸添加量对结晶的影响 |
| 5.3.4 温度对结晶的影响 |
| 5.3.5 磁场强度对结晶的影响 |
| 5.3.6 磁场作用时间对结晶的影响 |
| 5.3.7 响应面法优化电磁诱导东莨菪碱结晶工艺 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 |
（9）消旋山莨菪碱的杂质研究（论文提纲范文）
| 1 仪器与试药 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试药 |
| 1.3 供试品和对照品的制备 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 高效液相色谱法鉴别 |
| 2.2 液相色谱-质谱联用技术鉴定杂质 |
| 2.3 薄层色谱法鉴别杂质 |
| 2.4 核磁共振技术鉴别杂质 |
| 3 讨论 |
（10）肠道菌群与中药相互作用的研究进展（论文提纲范文）
| 1 中药对肠道菌群的调节作用研究 |
| 1.1 中药调节肠道菌群的机制 |
| 1.1.1 增加肠道的益生菌 |
| 1.1.2 减少肠道的有害菌 |
| 1.2 中药调节肠道菌群的研究方法 |
| 1.2.1 传统培养法 |
| 1.2.2 宏基因组法 |
| 1.2.3 MALDI-TOF-MS细菌检测法 |
| 1.3 中药对不同疾病的肠道菌群的调节作用 |
| 1.3.1 肥胖 |
| 1.3.2糖尿病 |
| 1.3.3 肠易激综合征 (IBS) |
| 1.3.4 免疫调节 |
| 1.3.5 其他 |
| 2 肠道菌群对中药有效成分的代谢转化研究 |
| 2.1 肠道菌群代谢转化中药的机制 |
| 2.2 肠道菌群代谢转化中药的研究方法 |
| 2.2.1 体外孵育法 |
| 2.2.2 体内代谢生物样品分析法 |
| 2.3 肠道菌群对中药中不同成分的代谢转化 |
| 2.3.1 糖苷类 |
| 2.3.2 苯丙素类 |
| 2.3.3 生物碱类[42] |
| 2.3.4 甾类化合物[42] |
| 3 结语与展望 |
四、山莨菪碱的化学研究（论文参考文献）
- [1]液相色谱-串联质谱法同时快速测定婴幼儿谷物食品中3种莨菪烷生物碱[J]. 胡侠,付丽莎. 大连民族大学学报, 2021(03)
- [2]莨菪碱脱氢酶催化机制及莨菪碱代谢工程研究[D]. 曾令江. 西南大学, 2021
- [3]血液中农药、临床药物、毒品的液质筛查方法研究[D]. 白利文. 中国人民公安大学, 2020(12)
- [4]高效液相色谱法同时测定莨菪浸膏片中的4种活性组分[J]. 杜晖,任静,郑妍. 安徽医药, 2020(04)
- [5]藏医药学研究进展[J]. 平措绕吉,扎西卓嘎,海梅荣. 中国民族医药杂志, 2019(12)
- [6]托品烷生物碱生物合成途径中三个新基因的发现与功能鉴定[D]. 邱飞. 西南大学, 2019(05)
- [7]基于肠道菌群的葛根芩连汤干预急性肠炎模型大鼠的作用机制研究[D]. 陈阳. 上海中医药大学, 2019(03)
- [8]电磁诱导结晶分离东莨菪碱的技术研究[D]. 陈朋朋. 合肥工业大学, 2019(01)
- [9]消旋山莨菪碱的杂质研究[J]. 王雄飞,孙毅坤,钟苗,段晓杰,罗世林,杨雨薇,袁瑞娟. 药物评价研究, 2018(02)
- [10]肠道菌群与中药相互作用的研究进展[J]. 汤齐,高霞,耿婷,黄文哲,刘丽芳,王振中. 中草药, 2017(17)