一、中国禽流感流行株的分离鉴定（论文文献综述）
张伟[1]（2015）在《1999年～2013年山东鸡源H9N2亚型禽流感病毒遗传演化和血凝素抗原性研究》文中提出H9N2亚型禽流感属低致病性禽流感,是危害商品肉鸡、高产蛋鸡和种鸡的一种重要疫病,也是目前鸡群中流行范围最广、危害较大的疫病之一。自1992年在我国首次发生以来,至今已成为养鸡场的一种常见多发病。本研究通过对H9N2流行株的致病性、血凝抑制试验、鸡胚中和实验、疫苗免疫保护试验等评价了山东省H9N2流行株的抗原性变化；从全基因组角度解析了山东省近年来H9N2流行毒的基因重排特点,重点研究了1999年～2013年间H9N2血凝素蛋白（HA）的遗传变异规律。此外,探讨了基因变异对病毒抗原性的影响,研究了二者的变异相关性。1.H9N2病毒山东株的分离、鉴定与生物学特性测定在山东发病鸡群中分离鉴定了35株H9N2业型（其中2010年前分离鉴定19株,2010-2013年分离鉴定16株）,排除了外源病毒感染,利用终浓度稀释法进行了病毒纯化和生物学毒力测定,其中2010年以后分离的毒株的EID50/0.1ml在107.83～109.20之间,IVPI结果为0～0.17,与本实验室在1999年～2010年分离的毒株H9N2进行了生物学比较,毒力有所增强,应警惕H9N2毒力增强的趋势。2.H9N2病毒全基因组分析对HA基因的系统发育研究表明：分离鉴定的35株H9N2流行株均属于欧业谱系,其中有BJ94-1ike（1996～2005,3株）、Y280-1ike（1999-2009,4株）：S2-1ike（2010-2013,28株）,这表明S2-1ike业群为近年来山东地区H9N2主要的流行株。其中对2010年以后的16株流行毒之间核苷酸、氨基酸同源性分别为94.5%-100%、96.1%-100%,但与经典疫苗SD-1996的核苷酸、氨基酸同源性已降至90.0%-92.5%、91.8%～95.0%。蛋白裂解位点分析表明：1994年～2010年的H9N2流行毒株,其蛋白裂解位点基序多为PARSSRGL,而2010年以后的毒株则多数为PSRSSRGL,仍符合低致病性禽流感的序列特征,这与生物学毒力检测指标一致。选取CK/SD/S2/05等8个不同年代的流行株进行全基因组测序,发现均属于欧业谱系,相比HA和NA基因,除NS基因较为保守外,其它6个编码蛋白的遗传演化表现为多样性。CK/SD/DY/2009.CK/SD/SIX/2010.CK/SD/YT07/2010、CK/SD/HKY1/2013的PB2和M基因均来源于G1-like,CK/SD/BD/2008的PB2基因来源于F98-1ike,M基因来源于G1-like;而早期的分离毒株及参考株均来源于BJ94-1ike或F98-1ike。2005年之前的毒株属BJ94-like基因型,而2008年以后的毒株PB1、PA、NP基因属于F98-like,NA、NS基因属于BJ94-1ike,M基因属于G1-like,而在PB2.HA基因上出现F98-like.G1-like和BJ94-like.S2-like的变化。这表明H9N2亚型禽流感病毒流行毒株的发生了不同程度的重排现象,产生了多种基因型的H9N2病毒。3.H9N2病毒血凝素抗原性分析综合HA基因分型结果,筛选不同遗传进化分支上的代表性病毒（8株）,分别进行HI交叉抑制。结果发现,同源病毒对其本身血凝抑制效价较高,而不同时期的H9N2毒株之问,其HI交叉相对较低。表明我国H9N2流行病毒之间已在抗原性上发生了较大程度的变异。统计学分析表明,H9N2亚型AIVHI相关指数与其HA基因氨基酸的同源性具有显着相关性（p<0.05）,Y=-3.53X+2.4487,R=0.6398。说明H9N2亚型AIV的HI抗原性主要与HA丛因的遗传变异相关。进一步利用鸡胚中和试验也证明了这一点。4.疫苗免疫攻毒评价疫苗攻毒保护试验表明：利用流行株制备的疫苗与经典疫苗相比,其攻毒后的临床症状、病毒分离率及排毒量均显着降低,SD/96疫苗株对于YZ/00、JN/05这2个不同流行毒株对攻毒的保护率为80%,而对于流行株LC02/13的保护率只有40%；LC02/13灭活疫苗对于这4个流行株攻毒后的保护率为100%,进而证实利用新流行株制备的疫苗具有更好的保护效果。本论文对近年来山东鸡群中H9N2亚型禽流感的遗传演化与抗原性进行了系统分析与研究,同时进行了疫苗免疫效果评价探讨,研究结果为山东省H9N2亚型禽流感的防控提供了理论依据。
孙兰[2]（2020）在《H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用》文中提出H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）自首次分离至今,已在全世界各地造成了广泛的传播。在国内,H9N2亚型AIV呈地方性流行且传播范围广,不但给养殖业造成巨大的经济损失,也给公共卫生安全造成潜在的威胁。在免疫压力和抗原漂移作用下,AIV容易发生抗原变异,最终导致免疫失败。因此研发针对H9N2亚型AIV较为理想的单抗对H9亚型AIV监测和诊断有重要的意义。1.H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达选取 H9N2 AIV 流行株 A/Chicken/Taixing/10/2010（简称 rTX）和疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98（简称F98）作为研究对象,通过PCR分别扩增其HA基因和NP基因,将其克隆到真核表达载体PCAGGS上,成功构建出重组质粒PCAGGS-rTX-HA、PCAGGS-F98-HA 和 PCAGGS-rTX-NP。然后将其转染入 293T 细胞,通过间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和蛋白印迹试验（Western blot,WB）检测确定HA和NP蛋白均在体外正确表达,成功制备出用于制备单克隆抗体的免疫原。此外,通过将PCAGGS-rTX-NP进行双酶切获得的NP片段连接pET-32a上,构建原核重组质粒pET32a-rTX-NP,利用Roestta（DE3）进行优化表达,获得分子量约为73 KD的可溶性rNP,以作为下一步制备针对rTX毒株NP蛋白单克隆抗体的筛选原。2.H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用将重组质粒PCAGGS-rTX-HA和PCAGGS-F98-HA通过肌肉注射结合基因导入仪刺激的方式免疫6-8周龄BALB/c小鼠,三免后腹腔注射灭活病毒进行加强免疫,3天后取其脾细胞制备杂交瘤细胞。通过血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验和IFA对融合孔进行筛选,经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,其中有4株为针对rTX HA蛋白的单抗,分别命名为1B9、1C10、3E2和2D6;有2株为针对F98 HA蛋白的单抗,分别命名为1B2和1F10。抗体亚类鉴定结果显示,1B9、1C10和3E2的亚类均为IgM,2D6的亚类为IgG2a,1B2和1F10的亚类为IgG1;6株单抗腹水HI效价较高,均在210-215之间;IFA检测结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98产生特异性荧光,其余的单抗对毒株rTX产生特异性荧光;Western-blot试验结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98有特异性反应,其余的单抗都对毒株rTX有特异性反应,条带大小均为75KD;中和试验结果显示,单抗2D6、1B2和1F10都具有中和特性,其中1F10的中和效价最高;单抗特异性和广谱性鉴定结果显示,6株抗HA蛋白单抗只与H9亚型AIV有反应,而与其他亚型AIV和NDV无反应性,表明具有良好的特异性,其中有4株单抗对H9N2 AIV的反应谱较好;6株单抗对2017-2019年实验室分离株HI和IFA检测结果显示,有37.1%（10/27）的H9N2 AIV分离株与4株抗Y280-like代表株HA蛋白的单抗所识别的表位存在抗原差异性,有22.26%（6/27）的H9N2 AIV分离株获得了与抗F98毒株HA蛋白单抗识别表位类似的抗原位点。因此,这些单抗可用于流行株的抗原差异性分析,且近3年的流行株已发生了较大的抗原变异。3.H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备和鉴定将重组质粒PCAGGS-rTX-NP免疫小鼠进行单克隆抗体的制备。细胞融合10 d后,通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和EFA筛选阳性杂交瘤细胞。经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,分别命名为1B4、1E50、2E10、3A9、8F10和3E6。抗体亚类鉴定结果显示,2E10、3A9和1B4的亚类均为IgG2a,1E50的亚类为IgG1,3E6和8F10的亚类为IgM;采用ELISA试验对单抗腹水效价进行检测,效价在1:25600-1:204800之间;IFA试验结果表明6株单抗中只有3E6和8F10与rTX毒株有特异性的荧光反应;特异性试验结果表明单抗3E6、8F10、2E10和1B4这4株单抗不与NDV和IBV发生反应,具有良好的的特异性,单抗3A9和1E50的特异性不佳;广谱性鉴定结果表明单抗3E6、8F10和2E10的广谱性较好,除了不与H5N1亚型发生反应,与H9N2、H5N6和H7亚型的AIV都有很好的反应,而单抗1B4、3A9和1E50广谱性较差,只与部分H9N2亚型AIV和毒株W1-8（H7亚型）反应。综上所述,单抗3E6、8F10和2E10综合特性较好,在AIV流行病学调查等方面有一定的应用价值。
蒋大秀[3]（2019）在《2016-2018年华东地区H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究》文中进行了进一步梳理H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）对家禽表现为低致病性,引起呼吸道症状、产蛋下降等轻微症状,感染鸡排毒时间长,如若继发感染其它病原体死淘率将增加,造成养禽业严重的经济损失。近年来,不断有H9N2亚型AIV感染人的病例出现,甚至有患者病情严重,H9N2病毒对哺乳动物致病力的机制的研究与其它亚型禽流感病毒相比相对较少。H9N2亚型AIV具有流行范围广、传播效率高的流行特点,而且能够提供内部基因给其它亚型流感病毒产生重组病毒,具有大流行的风险,应对其进行长期监测和病原特点分析。本研究对2016年10月至2018年9月期间华东地区活禽交易市场（Live poultry markets,LPMs）和家禽养殖场进行了禽流感病毒流行病学监测,并对H9N2亚型AIV进行了病毒的分离鉴定和基因测序,同时选取了代表性H9N2亚型AIV进行了传播性试验、S基因型H9N2亚型AIV进行了小鼠的致病性试验。1、H9N2亚型禽流感病毒病原学调查2016年10月至2018年9月期间,在华东地区LPMs共采集泄殖腔/喉头棉拭子样品2183份,经SPF鸡胚分离和血凝-血凝抑制试验鉴定了 518株AIV和NDV病毒,病毒总阳性分离率为23.73%,其中H9N2亚型252株（11.54%,252/2183）;养鸡场疑似H9N2临床样品中分离鉴定156株H9N2亚型AIV。LPMs病毒阳性样品中H9N2病毒分离率最高（48.65%,252/518）,其次是 H5 亚型（21.81%,113/518）、H3 亚型（14.1%,73/518）、H7亚型（4.83%,25/518）等。2011年7月到2016年9月（统计周期约为12个月）分离率在 0.21%-0.78%,2016 年 10 月至 2018 年 9 月为 8.49%-15.12%,LPMs 中 H9N2 亚型AIV阳性分离率有明显上升。鸡仍然是H9N2亚型AIV的易感宿主;样品主要来源于华东地区江苏、安徽、山东等省市;近两年LPMs中的H9N2亚型AIV在夏季亦有较高的分离率,未表现出明显的季节性流行特征,可能与病毒的热稳定性增强有关。2、华东地区家禽中流行的H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化特征本文对测得的394个HA基因、302个NA基因、69组内部基因的核苷酸及其编码氨基酸进行了系统性分析,并选取其中具有代表性的69个分离株绘制出全基因系统发生树进行遗传进化分析。运用MEGA6.0邻接法（neighbor-joining method,NJ）绘制出了各基因片段的系统发生树,经分析,HA基因、NA基因均属于Y280-Like,内部基因PB2基因、M基因属于G1-Like,其余4个内部基因均属于F/98-Like,本研究中的H9N2亚型分离株均属于S基因型。H9N2分离株潜在糖基化位点与2012年分离株WJ57基本一致,389个分离株（389/394）HA蛋白具有7个潜在N-糖基化位点（HA1:11,123,280,287,295;HA2:154,213）,与Y280相比,缺失了 HA1 200位糖基化位点,增加了 HA1 295位糖基化位点;294株（294/302）病毒NA蛋白具有5个潜在N-糖基化位点（69,86,146,200,234）,与WJ57/12相似。其中,有11（11/302）个分离株增加了 NA蛋白第44位、14（14/302）个增加了第402位潜在N-糖基化位点。可影响病毒的受体结合特性的HA蛋白226位几乎（392/394）均发生了 Q→L突变,更倾向于结合哺乳动物受体。前期研究表明HA蛋白381K与PA蛋白672L是影响H9N2亚型AIV气溶胶传播特性的关键氨基酸位点,本研究中6个毒株（6/394）发生了 K381R的突变,PA蛋白第672位均为L。PA蛋白K356R、PB2蛋白E627K是影响H9N2亚型AIV对哺乳动物致病性的重要的氨基酸位点,本研究中所有的分离株PB2蛋白均为627E、PA蛋白均为356R。3、H9N2亚型禽流感病毒传播特性及致病性初步研究2016年以来H9N2病毒在鸡群中分离率明显上升,且不断有人感染病例报道,不同基因型毒株传播能力、致病性是否不同,目前还没有系统的研究。从近12年H9N2亚型AIV中筛选出16株进行气源性传播试验,包括3株O基因型（SD07、W4和Dh0801D11）,1株T基因型（HeN86）,和12株S基因型。16株病毒中符合HA381K和PA672L的毒株有W4、HeN86、C1、HeN131、SQ68、WJ57、TM118、SDKD1、AH320、AH463、FJ1802 和 292HZ共12株。S基因型H9N2亚型AIV均具有气源性传播特性,即使GC510、A6的HA蛋白381为R,但是2008年分离株C1只能检测到血清转化而无排毒;其它基因型毒株中除HeN86具有上述分子标记但无气溶胶传播特性,其余病毒均符合。近两年的S基因型毒株气源性传播能力增强,暴露组排毒时间早、排毒持续时间长（第9天）、血清转化水平高;AH320和SDKD1毒株可跨宿主传播（鸡-豚鼠）,而且在检测期范围内暴露组豚鼠排毒直到暴露后14天。8个S基因型H9N2亚型AIV对小鼠低致病性,体重增长率在17.06%-22.89%,均有不同程度的增重降低,SDKD1组增重最少。病毒复制水平和组织分布差异明显,主要在肺脏复制,特别是攻毒后第3天和第5天,部分毒株在心脏、肾脏、肝脏和脾脏中亦能检测到病毒。感染后第3天、5天,各个攻毒组小鼠肺脏均呈现出以瘀血、出血、肺泡间质增生或广泛的炎性细胞渗透等间质性肺炎变化。因此,S基因型病毒普遍具有气源性传播能力、对小鼠低致病性但可从鸡传播给豚鼠,且在小鼠中组织分布更广,提示对公共卫生可能存在威胁。
陈晓涵[4]（2020）在《重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗研究及应用》文中研究表明高致病性H5和H7亚型禽流感的暴发不仅给养禽业造成重大损失,也给人类的生命健康构成严重威胁,而疫苗免疫是预防禽流感的主动措施、关键环节和最后防线。因此,为了防止H5和H7亚型禽流感在中国的肆虐,重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9H7-Re1株）于2017年在养殖场中广泛应用。但是,2017年底以来的全国禽流感流行病学调查结果显示,我国H5亚型禽流感病毒以2.3.2.1和2.3.4.4分支为主,并且2.3.4.4d分支和2.3.2.1d分支病毒已成为当前威胁我国养禽业的主要流行株。进一步的抗原性分析和攻毒试验结果表明,Re-8株疫苗株与2018年分离到的2.3.4.4d和2.3.2.1d分支代表病毒株均存在较大抗原性差异,并且在临床上所使用的二价灭活疫苗不能对当时流行的H5亚型高致病性禽流感病毒提供完全保护作用,因此需要将H5N1 Re-8株疫苗种毒进行更新。此外,H7N9 H7-Re1株与分离到的部分H7N9病毒的抗原性差异较大,并且这种差异还在不断增加,因此将H7N9 H7-Re1株疫苗种毒一并进行更新。本研究将构建的H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re2株重组禽流感病毒进行系统鉴定（种毒病毒含量、HA和NA基因的序列分析、对鸡胚和雏鸡毒力、特异性、免疫原性以及纯净性）。此外,我们将3株病毒在鸡胚中传至13代,测定所有代次病毒的鸡胚半数致死量和HA效价。结果表明,H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re2株重组病毒生物安全度高、特异性强、免疫原性好、适合在鸡胚中稳定增殖,病毒液纯净,均符合作为禽流感灭活疫苗种毒要求。随后,我们用Re-11、Re-12和H7-Re2株疫苗种毒制备成重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株+H7N9 H7-Re2株）,对其安全性和免疫效果等进行实验室研究。结果表明,三价灭活疫苗对SPF鸡、SPF鸭和商品鹅均安全,免疫后无不良反应;3批灭活苗免疫家禽后21d,SPF鸡、SPF鸭和商品鹅的HI抗体效价平均值分别可达到7.7log2、7.7log2和4.2log2以上。三价灭活疫苗免疫鸡用亲本毒株和流行毒株攻击,无发病死亡及排毒现象。当SPF鸡的HI抗体效价达到3log2时,可获得抗死亡保护;达到4log2时,可获得完全保护;SPF鸭H5亚型Re-11株、Re-12株HI抗体≥2log2时可对H5亚型效检毒株攻击提供完全保护,H7亚型H7-Re2株HI抗体≥3log2时,对异源H7N2亚型毒株攻击提供完全保护。最后,进行了临床上蛋种鸡、白羽肉种鸡、北京油鸡、固始鸡、商品白羽肉鸡和种鸭免疫三价灭活疫苗的抗体检测,以评价该疫苗的临床应用效果。结果表明,该疫苗安全性良好,免疫后的家禽均无明显不良反应;该三价灭活疫苗可以诱导蛋种鸡、白羽肉种鸡、北京油鸡、固始鸡和种鸭产生良好的抗体;免疫后的商品白羽肉鸡,在出栏检测时具有较高的抗体效价;疫苗免疫家禽后,可有效预防当前我国流行的H5和H7亚型禽流感病毒引起的禽流感。本研究表明重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株+H7N9H7-Re2株）对SPF鸡和水禽均具有良好的安全性和免疫保护效果。并且该三价疫苗已于2019年在全国广泛应用,为控制高致病性禽流感发挥了重要作用。
鞠勇[5]（2016）在《2013-2015年华东地区H9N2禽流感病毒的流行病学调查及单克隆抗体的研制》文中研究表明禽流感是由禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）引起的一种禽类传染病,可分为高致病性禽流感（HPAI）、低致病性禽流感（LPAI）和非致病性禽流感（NPAI）3种。低致病性禽流感以H9N2亚型为主型。在我国,特殊的地理环境和养殖模式为禽流感的发生和传播提供了有利条件,同时活禽交易和免疫压力的存在又为AIV的重组和变异提供了条件。为了持续监测家禽中AIV的带毒和变异情况,本研究对2013-2015年间华东地区活禽市场棉拭样品和家禽的临诊病料进行了AIV的分离与鉴定,并对分离到的H9N2亚型AIV进行全基因组序列测定和遗传进化分析；对华东地区流行株之间及流行株与经典疫苗株F98之间的抗原性差异进行了评价；选取H9N2亚型禽流感的G1亚系分支代表株WXQ3进行了单克隆抗体的研制。本研究旨在了解H9N2亚型AIV的遗传变异和抗原性差异,从而为我国禽流感防控措施的制定提供依据。1.2013-2015年华东地区H9N2亚型禽流感病毒的流行病学调查及基因组遗传进化分析2013-2015年在江苏2个活禽交易市场持续采样,共采集棉拭样品4500份,家禽的临诊病料305份。样品处理后接种鸡胚分离病毒,以血凝和血凝抑制试验结合RT-PCR方法对病毒进行鉴定,结果显示,共分离到35株H9亚型禽流感病毒。其中,棉拭样品中H9亚型AIV的分离率为0.75%,而病料的分离率为0.33%。宿主的分布情况显示,鸡中AIV的分离率很高。35株H9N2亚型AIV的HA基因核苷酸序列遗传进化分析表明,35株H9N2亚型AIV均属于Y280亚系（Clade h9.4.2）,在2013年后仍为华东地区的主要流行株（与本实验室前期的研究数据一致）。但是病毒之间存在一定的差异,分离到的35株毒株的核苷酸与Y280株同源率为89.8%-91.8%,表明H9N2亚型病毒也在活跃地变异和重组。所有分离株HA基因的226和228位氨基酸分别均为嗜禽源细胞的谷氨酰胺（Gln, Q）和甘氨酸（Gly, G）。对神经氨酸酶（NA）基因的遗传进化分析表明,所有的NA基因均属于Y280亚系分支,且茎部在63-65位都缺失了3个氨基酸。基因型分析表明,所分离到的H9N2亚型都属于一种V基因型,HA、NA来源于Y280, PB2、M来源于G1, PB1、PA、NP、NS来源于F98。2.H9N2亚型AIV流行株的抗原差异性分析在H9N2病毒遗传进化分析的基础上,以交叉血凝抑制试验进行抗原性分析,筛选出了2株分别位于不同遗传进化分支上的2株H9N2亚型AIV代表株JSWX和JSYZ110。将2株病毒和F98疫苗株灭活免疫SPF鸡,21天后以100μL 106EID50剂量滴鼻点眼攻毒,排毒结果显示JSYZ110和JSWX试验组无论是针对同源还是异源毒株的攻毒均有排毒,排毒率均为3/10,F98试验组不论针对攻毒株JSYZ110还是JSWX,排毒率均为4/10。结果表明这两株流行株之间的抗原性差异不大,但与F98株之间存在较大的抗原差异性。3.G1亚系分支的H9N2禽流感病毒单克隆抗体的研制选择H9N2亚型AIV的G1亚系分支代表株WXQ3进行单克隆抗体的研制。病毒经差速离心法纯化后免疫6-8周龄Balb/c母鼠,通过血凝抑制法筛选阳性克隆,最终得到5株能稳定分泌抗体的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为2E4、4D10、8B2、3F6和10G8。血凝抑制试验结果显示,这5株单抗对WXQ3均具有血凝抑制性,效价分别为25、27、23、24和24。特异性结果显示,这5株单抗与H5亚型AIV、H7亚型AIV、NDV和IBV都不反应,特异性良好。交叉血凝抑制试验结果显示,2E4对WXQ3、HN、JSYZ110株有血凝抑制作用,4D10、3F6、10G8对WXQ3、HN、F98、JSYZ110和AHFY040株有血凝抑制作用,8B2对WXQ3.HN和AHFY040株有血凝抑制作用。Western-blot试验结果显示,只有4D10、8B2、3F6对WXQ3有反应,50 kDa左右出现一条特异性条带。间接免疫荧光试验结果显示,4D10、8B2和3F6对WXQ3有特异性荧光,2E4对HN有特异性荧光,2E4、4D10、8B2、3F6、10G8对F98都有荧光。综上所述,4D10、3F6、10G8三株单抗具有广谱性。
丁园[6]（2019）在《2016～2018年间江苏及周边地区发病鸡群H9N2亚型禽流感病毒监测及抗原性差异分析》文中研究指明H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV）,但与很多其他病原混合感染时会产生致病协同作用,从而导致感染鸡群严重发病。目前,H9N2亚型AIV在国内鸡群中的流行非常普遍,即使在抗体水平很高的免疫鸡群仍然经常发现感染带毒现象,严重的还会导致临床发病,分析认为可能与流行毒株的变异导致抗原性与疫苗毒株间存在一定的差异有关。因此,通过系统监测阐明流行毒株的遗传进化规律,对于指导疫苗毒株的筛选和提高临床免疫防控的效果具有重要的意义。本研究对江苏省及周边地区2016-2018年间规模化鸡场H9N2亚型AIV的感染和发病情况进行了跟踪监测,对发病鸡群进行病原分离和鉴定,对分离毒株进行系统的遗传进化分析和抗原性差异比较分析,以期为本地区鸡感染H9亚型AIV的防控提供参考。1、发病鸡群H9N2亚型AIV分离鉴定与遗传进化分析监测期内共分离鉴定到53株H9N2亚型AIV流行毒株,对所有分离株进行血凝素（HA）基因测序和遗传进化分析,从构建的系统发育进化树上可以看出所有分离株均属于A/chicken/Beijing/1/1994-like代表的h9.4.2亚系,且所有分离株在系统发育进化树上分布比较集中,均属于h9.4.2.5亚系,但是也可以进一步细分为不同的小进化分支。根据HA基因序列推导的所有毒株HA蛋白的裂解位点氨基酸序列全部为RSSR,符合典型的LPAIV裂解位点序列特征。大部分分离株的HA蛋白在第203位氨基酸处发生了突变,由T变为I/V,使得第200位糖基化位点缺失,第297位氨基酸位点处发生突变,由P变为S,从而在295位处多了一个潜在的糖基化位点NCS。新的糖基化位点的出现或者原有糖基化位点的缺失都有可能造成病毒毒力以及抗原性的改变。大多数分离株在第234位受体结合位点均由Q变为L,该位点的突变已被证明可增加病毒感染哺乳动物的可能性。2、不同进化分支H9N2亚型AIV分离株抗原性差异研究为了进一步确定同一亚系下面不同的细小进化分支上的毒株在抗原性上是否存在差异,又进一步根据绘制的系统发育进化树,在h9.4.2.5亚系分支中选取了 7个不同细小进化分支上的病毒株,分别是 Ck/JS/YZ0418/2016、Ck/JS/TZ0218/2017、Ck/JS/YZ0725/2017、Ck/JS/YZ-HJ0510/2017、Ck/JS/YZ-GL0916/2016、Ck/JS/YZ-GY 1024/2017 和Ck/JS/YZ-GY0822/2017,进行了抗原性差异比较分析。试验一将160只1日龄健康海兰褐母雏随机分为8组,每组20只,用上述7个毒株分别制备成油乳剂灭活苗,其中7组鸡分别在7日龄和35日龄时分别用上述灭活疫苗进行免疫,每只鸡肌肉注射0.5 mL疫苗,另一组作为非免疫对照组。分别在30日龄、60日龄、100日龄和127日龄采血分离血清,并用分离株Ck/JS/NT0428/2018制备的血凝抗原分别测定HI抗体水平。结果显示,这7个病毒株都有良好的免疫原性,但用同一种抗原测定的HI抗体效价存在显着的差异,反映出相互之间可能存在一定的抗原差异性。试验二根据交叉免疫抗体检测结果进一步选择了不同小进化分支上差异显着的4个病毒株进行了交叉免疫攻毒保护试验,分别是Ck/JS/YZ0418/2016、Ck/JS/TZ0218/2017、Ck/JS/YZ-GY1024/2017 和 Ck/JS/YZ-GY0822/2017。将50只7日龄的SPF鸡随机分为5组,每组10只;前4组分别免疫以上述4个毒株制备的油乳剂灭活疫苗,最后一组作为非免疫对照组。免疫后21天用分离株Ck/JS/NT0428/2018进行攻毒,攻毒剂量为1082EID50/只。攻毒后每日观察鸡群临床表现,结果显示,免疫组的鸡临床表现正常,对照组部分鸡有一过性食欲不振等现象。分别在攻毒后第3、6、9天采集每组鸡的咽拭子和泄殖腔拭子,应用实时荧光定量PCR定量检测排毒情况。结果表明,4种疫苗免疫均能显着降低排毒水平,但组间存在较为显着的差异,同一进化分支的病毒对应的疫苗免疫组排毒保护效果最佳。综上所述,本研究的结果显示所有分离株都同属于h9.4.2.5亚系分支,但处在不同细小分支的病毒株的抗原性差异明显。
王伟利[7]（2006）在《不同源性禽流感病毒株的分离鉴定及其主要基因信息的研究》文中研究说明经过病毒分离从鸡、鸭、鹅、鸽子和猪等咽喉、泄殖腔棉拭子和体内样品中分离到17株鸡源、鹅源、鸭源、鸽源和猪源禽流感病毒，经负染后用电子显微镜观察，可见球形，外被囊膜的病毒颗粒。经HI和NI试验和荧光RT-PCR技术鉴定为H5亚型或H9亚型禽流感病毒。对各毒株EID50、IVPI、ICPI和致病性试验结果表明，分离到4株鸡源、8株鹅源、1株鸭源、1株鸽源和1株猪源H5N1亚型高致病性禽流感病毒株；1株鸡源H5N2亚型和1株鸡源H9N2亚型低致病性禽流感病毒株。经过理化特性试验可知：AIV分离株均为热不稳定性，56℃30min、60℃10min和65-70℃3min即可被灭活。禽流感病毒分离株对乙醚、氯仿和酸均敏感。根据GeneBank中已知的基因序列，设计合成6对用于扩增H5N1、H5N2、H9N2亚型血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因的特异性引物。提取病毒基因组总RNA，运用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分别扩增6株鸡源、8株鹅源、1株鸭源、1株鸽源和1株猪源病毒分离株的的两个基因片段，并分别连接到载体pMD18-T上，转化到感受态细胞，提取质粒，进行PCR和酶切鉴定及其序列测定。结果表明：分别扩增和克隆出上述各毒株的HA和NA两基因片段，该15株H5N1亚型AI毒株HA基因阅读框基因全长1707bp，编码568个氨基酸。HA1、HA2的裂解位点附近有连续6个碱性氨基酸（RRRKKR）的插入，为高致病性AIV的分子特征。在HA肽链上有6个或7个潜在的糖基化位点。受体结合位点相对应的氨基酸分别为YWIHELY，左侧壁氨基酸为SGVSS，右侧壁氨基酸为NGQSG。决定宿主特异性的受体结合位点226位和228位氨基酸具有与禽类细胞受体结合特异性。NA基因阅读框基因全长为1350bp（G7 1410bp），编码450（G7 469）个氨基酸。有3个或4个（G7）糖基化位点。H5N1亚型毒株（除G7外）在NA基因第48位氨基酸后缺失了20个氨基酸，具有当地流行株的特征。H5N2和H9N2 AIV毒株血凝素（HA）阅读框基因全长分别为1695 bp、1683bp，分别编码564个氨基酸和560个氨基酸。HA1、HA2的裂解位点附近无连续碱性氨基酸的插入，为非高致病性AIV的特征。H5N2亚型AIV株的NA基因全长1401bp，编码467个氨基酸；H9N2亚型AIV株NA基因全长1410bp，编码470个氨基酸，其受体结合位点的氨基酸分别为YWTNVLY，左侧壁氨基酸为NGQQG，右侧壁为GTSKA。利用分析软件对分离株之间的HA、NA基因，对分离株与参考毒株的之间的HA、NA基因进行同源性比较分析。分离株之间同源性比较结果表明：分离株之间的HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.4％～99.6％和95.2％～99.5％；NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.9％～100％和95.3％～100％。分离株与参考毒株株之间的HA基因和NA基因的同源性比较结果表明：分离株与参考株之间HA基因的核苷酸、氨基酸同源性分别为94.2％～99.9％和94.2％～99.6％；分离株与参考株之间的NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为86.0％～100％和86.6％～100％。本地区分离到的17个毒株遗传演化关系发现：同一亚型毒株同源性比较高，没有明显宿主差异。分离株的基因来源不同，因此导致毒株基因多样性。根据GeneBank中已知的AIV8个基因序列设计合成11对特异性引物，从尿囊液中提取病毒基因组总RNA，运用RT-PCR技术分别扩增2株鹅源和1株鸽源分离株的8个基因片段的cDNA，克隆、序列测定。结果表明，所克隆到的8个片段即HA、NA、NP、M、PB1、PB2、PA和NS，各基因均包含相应的病毒基因完整开放阅读框架。8个基因片段的长度分别为1730bp、1371 bp（1410bp）、1542 bp、2322 bp、2330 bp、2233 bp、1020 bp和884 bp核苷酸，并分别编码568、449（G7为469）、499、757、759、716、351和230个氨基酸。通过3株H5N1亚型禽流感病毒株全基因遗传演化分析表明：本区域内毒株分两组，G7组：其NA基因、NS基因均无氨基酸缺失，与A／GS／HK／ww28／00各基因同源性为98.1％～99.6％，其中与HA、NA、NP和PB14个基因的核苷酸均高于99.1％、因此G7的4个基因可能由A／GS／HK／ww28／00提供，两毒株均来源于A／GS／GD／1／96，一同处于等位基因内；G8、P组：在NA基因第48位氨基酸后缺失了20个氨基酸，在NS基因第79-84位缺失5个氨基酸；与其它参考毒株处于同一等位基因内。用1株鹅源H5N1亚型AIV对非免疫鸡进行滴鼻点眼、肌肉注射、静脉注射三种途径攻毒，攻毒后18-196h可以从咽喉、泄殖腔拭子分离到病毒。攻毒后24-240h可以从心、肝、脾脏、肺脏、肾脏、脑和肌肉等脏器利用荧光RT-PCR及免疫荧光检测到病原，结果表明该毒株对鸡有较强的致病性，病毒抗原在各部位定植时间不同。
张溢珊[8]（2018）在《6株H9N2亚型AIV分离鉴定、全基因组分析及鹅源毒株感染与免疫特性研究》文中研究说明全球广泛流行的低致病性H9N2亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）可引起家禽、野鸟和部分哺乳动物感染H9N2亚型禽流感（Avian Influenza,AI）。水禽不单是AIV的天然宿主,还是候鸟与家禽间病毒传播的重要媒介。AIV基因易发生突变和重组,导致毒力、亲嗜性和抗原性发生变化,并成为其他亚型流感病毒重组基因的供体。密切跟踪本病毒的变异动态,筛选疫苗候选株,对禽流感防控及维护公共卫生安全具有重要意义。本试验自2015年10月至2017年3月在广东佛山某活禽交易市场采集的469份拭子样品中分离获得6株H9N2亚型AIV。对6株分离株病毒作全基因测序,应用生物软件分析序列,结果表明,各分离株HA和NA基因来源于BJ94亚系,6株病毒HA蛋白裂解位点附近的氨基酸序列均符合低致病性毒株特征（2株为PARSSR↓GL,4株为PSRSSR↓GL）。4株分离株HA蛋白受体结合位点出现Q226L（H3编号）的变化,存在结合人α2,6-唾液酸受体倾向性。6株分离株均出现NA茎部区域氨基酸缺失。PB2、M基因来源于G1亚系,M2蛋白出现S31N位点突变,提示存在对金刚烷胺和金刚乙胺耐药特性。PB1、PA、NP、NS基因来源于F98亚系,6株病毒NS1蛋白出现P42S位点的突变,使得病毒可颉颃宿主体内干扰素的产生。分析显示6株病毒内部基因与人类流感H7N9、H10N8、H5N6亚型的内部基因相似性较高,提示分离毒与上述人类病毒之间可能存在基因重组现象。试验对鹅源A/Goose/Guangdong/A11/2016（H9N2）（GS/A11）株的相关生物学特性进行测定,测定结果显示,鸡胚最小致死量的平均死亡时间（MDT）为120 h,该毒株对鸡胚半数感染量(EID50)为10-8.632/0.1 mL。为了解H9N2对鹅的致病性,以106EID50剂量经静脉注射6周龄雏鹅（流感抗体阴性）,攻毒显示,试验鹅无明显临床症状,但排毒检测发现可经喉气管和泄殖腔排毒。对攻毒鹅的气管进行病理组织学观察和病毒分布观察,结果表明,攻毒鹅气管黏膜结构被破坏,上皮细胞变性坏死、脱落、少量炎性细胞浸润;免疫组化可见感染鹅气管黏膜上皮细胞中有病毒阳性信号。试验为了解鹅源GS/A11株对鹅的免疫原性,将GS/A11株制成油乳灭活疫苗,对鹅作免疫试验,结果表明,在一次免疫后第2周免疫鹅开始产生抗体,在二次免疫后第4周平均抗体水平达到峰值（8.1 log2）。取毒株GS/A11制备的特异性血清和H9N2亚型AIV早期代表株A/Chicken/Shanghai/10/01（H9N2）（SH10）血清（购买于哈尔滨维科生物技术开发公司）分别与分离的6株H9N2毒株和代表株SH10作交叉HI试验,HI交叉试验结果表明6株分离株与代表株的抗原性存在差异。本试验构建鹅源GS/A11株的HA蛋白进行原核表达系统、并优化表达条件。对获得的HA蛋白进行纯化、Western blot验证。Western Blot试验结果显示在56 k Da位置出现一条清晰的蛋白印迹,表明成功原核表达获得H9 HA蛋白,为实验室研究H9N2亚型AIV HA蛋白相关的下游试验（单克隆抗体制备、亚单位疫苗的研究、重组活载体疫苗的研究等）提供一定基础。课题研究为探究H9N2 AIV近期流行进化要点,明确其在禽流感传播与突变过程的作用及其疫苗候选株的选择提供了依据。
宿春虎[9]（2014）在《2011-2013年华东地区禽流感病毒流行病学调查及H9N2亚型禽流感病毒的抗原性分析》文中研究表明H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）自上个世纪90年代以来已经广泛在我国和世界各地流行,不仅仅给养禽业造成了巨大的经济损失,而且给公共卫生安全造成的隐患不可估量,对人类的健康也构成了巨大的威胁。在我国,独特的地理环境及养殖模式为此病的发生、传播提供了有利条件。而免疫压力及活禽市场的存在又为H9N2亚型禽流感病毒的重组和变异提供了必要条件。本研究对2011-2013年问华东地区家禽的临床病料和活禽市场棉拭样品进行病毒的分离鉴定,对分离到的H9N2亚型AIV进行全基因组序列测定和遗传进化分析；对分离到的两株H10亚型AIV H10N8和H10N9进行了生物学特性和遗传进化分析；评价了我国华东地区当前流行株中自制候选疫苗和目前普遍采用的F98疫苗的疫苗保护效力。木研究为禽流感的防控提供了流行病学资料及疫苗选择的实验依据。1.2011-2013年华东地区禽流感病毒的流行病学调查以及分离鉴定2011-2013年在江苏省及附近地区采集禽类的临床病料340份,在华东地区活禽市场采集棉拭样品3100份,将病料和棉拭样品处理后接种鸡胚分离病毒,以血凝和血凝抑制试验结合RT-PCR鉴定病毒,共分离31株H5亚型禽流感病毒、36株H9亚型禽流感病毒和31株新城疫病毒（NDV）。其中,棉拭中H5亚型AIV、H9亚型AIV和NDV的分离率分别为0.42%、0.52%和0.45%,病料中三种病毒的分离率分别为5.29%、5.88%和5.00%。活禽市棉拭样品病毒分离结果显示,可分离到H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10和H11等8种亚型禽流感病毒,鸭和鸡的样品中各分离6种亚型禽流感病毒,而鹅的样品中分离到3种亚型禽流感病毒。鸡样品中禽流感病毒血清型的多样性为病毒的变异提供了有利条件。2.36株H9N2亚型禽流感病毒全基因组的遗传进化分析对36株H9N2亚型AIV血凝素（HA）基因核苷酸序列的遗传进化分析表明, Y280亚系（Clade h9.4.2.4）在2011年后成为华东地区的主要流行株（34株）,F98亚系（Cladeh9.4.2.1）和G1亚系（Clade h9.4.1）仅各有1株。值得注意的是这些不同Clade之间的病毒有较大程度的变异,相同Clade之间的病毒也在出现较大的变异,如Clade h9.4.2.4（Y280亚系）的毒株已进化出更多的小分支,且各小分支与Y280株同源率也只有90.9%-94.7%。分离株HA基因的228位氨基酸均为甘氨酸（Gly,G）,226位类F98株和类G1株为嗜禽源细胞的谷氨酰胺（Gln,Q）其余均为嗜哺乳动物细胞的亮氨酸（Leu,L）。对神经氨酸酶（NA）基因的分析表明,所有的NA基因均属于欧亚种系中的F98亚系,且在茎部缺失了63-65位3个氨基酸；而对其内部基因的分析中表明,目前华东地区内部基因的整体变异情况不大。但是Qa/WX3/13株中PA基因、NP基因、NS基因明显不同于其他分离株,分别属于Y439亚系、G1亚系、G1亚系。耐药性的分析表明,对达菲（奥赛他韦）和对扎那米韦产生拮抗作用的位点没有明显的突变,但是除了Qa/WX3/13株外其余分离株均对金刚烷胺产生了耐药性。3.两株H10亚型禽流感病毒的起源分析和生物学特性测定对从鸡以及野鸡体内分别分离到H10N9以及H10N8亚型病毒进行生物学特性测定和遗传进化分析。IVPI结果显示两株H10亚型毒株均为低致病型禽流感病毒。全基因序列测定与遗传进化分析结果显示,该两株分离株所有基因片段均属于欧亚系。H10N9毒株中NA基因与2013年流行的H7N9禽流感高度同源,提示其极有可能是此次暴发的NA供体。H10N8株与2013年暴发的感染人的H10N8江西株JX346同源性较差,该分离株可能是候鸟迁徙路线上的基因重组型病毒。4.H9N2候选疫苗株的筛选以及免疫效果评价在H9N2病毒遗传进化分析的基础上进一步进行抗原性分析和生物学特性分析,筛选出了2株分别位于不同遗传进化分支上的2株疫苗候选株Ck/yz4/12和Dk/Yc2/13进行免疫,并以F98疫苗株作为对照。两次免疫后14天以106EID50剂量的亲木株滴鼻点眼攻毒,评介疫苗的免疫保护效力。病毒排毒显示Ck/yz4/12株灭活疫苗免疫鸡可以对同源毒株和异源毒株的攻击提供良好的免疫保护,可作为H9N2亚型禽流感灭活疫苗的候选株。
陈琳[10]（2015）在《H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及其遗传进化分析》文中提出禽流感是由禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）感染禽类后引起的一种疾病综合征,包括呼吸道、消化道、产蛋量下降或免疫抑制等疾病,可分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感三类。虽然H9N2亚型禽流感病毒属于低致病性禽流感,但疫病在我国广泛流行,且还发生了多起感染人的事件。由于H9N2禽流感病毒具有频繁变异与重组的特性,不仅给养殖业造成了巨大的损失,同时也严重威胁着人类的生命安全。预防和控制禽流感最有效的手段就是接种疫苗,目前国内比较常见的用来制备H9N2亚型禽流感的疫苗株主要是A/Chicken/Shanghai/F/98（F株）与A/Chicken/Shanghai/6/96等。这些毒株均是08年之前分离的,与现在流行株的抗原性差异非常大,因而疫苗急需升级换代。本试验从2013年在浙江、安徽、安徽等地活禽市场所采样品中分离获得8个H9 AIV分离株。这些H9N2禽流感毒株通过10倍稀释,分别经接种鸡胚尿囊腔接种,最后取尿囊液血凝效价最高的进行下一轮的纯化。三次纯化后,收集最高稀释度和血凝效价的鸡胚尿囊液,存放于-80度冰箱。通过鸡胚尿囊RNA的提取后,经过反转录、PCR等获得所需要的目的基因片段（其中PB2、 PB1、PA、HA、NP基因分成两段扩增）。PCR产物割胶回收并纯化,并送上海美吉公司进行测序。序列测定完成后用DNAstar软件中的SeqMan程序进行序列拼接、用MegAlign程序对拼接后的序列序列进行同源性分析。并用Mega6软件绘制进化树,分析不同年份、不同地域的H9N2亚型AIV流行毒株的遗传进化。结果表明：这8株分离株它们之间的HA基因的同源性为95.7-100%,氨基酸的同源性为96.4-99.8%,NA的核苷酸同源性在93.7%-99.8%之间,氨基酸的的同源性为93.1%-99.8%,NS的核苷酸同源性为95.3%-100%,M的核苷酸同源性为98.2%-100%、NP的核苷酸同源性为95.3%-100%、PA的核苷酸同源性为97.2%-100%、PB1的核苷酸同源性为96.1%-100%、PB2的核苷酸同源性为96.1%-100%。遗传进化分析结果表明,这8株H9N2亚型禽流感病毒株的HA、NA、 NS、M、NP、PA、PB1、PB2基因均属于同一亚系分支,具有较高的同一性。但这些H9N2 AIV与之前的疫苗毒（F株）的HA基因的遗传关系较远,不在同一分支上。结论：现在的H9N2 AIV流行株在抗原性方面较为一致,但与过去毒株的抗原性相差甚远；这些H9N2 AIV流行株的获得,为新的H9 AIV疫苗研制奠定了毒株的基础。
二、中国禽流感流行株的分离鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国禽流感流行株的分离鉴定（论文提纲范文）
（1）1999年～2013年山东鸡源H9N2亚型禽流感病毒遗传演化和血凝素抗原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照缩略词表（Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽流感病毒的分子结构 |
| 1.2 AIV致病的分子机制 |
| 1.3 AIV的流行病学 |
| 1.4 禽流感防控的公共卫生意义 |
| 1.5 本课题的提出背景及意义 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感病毒株的分离鉴定与生物学特性研究 |
| 摘要 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的演化 |
| 摘要 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 H9N2亚型禽流感病毒全基因组测序及遗传演化分析 |
| 摘要 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 山东鸡源H9N2亚型禽流感病毒抗原性分析 |
| 摘要 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 H9N2亚型禽流感常规灭活疫苗对流行毒株的免疫保护 |
| 摘要 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: 禽流感病毒及其单克隆抗体制备的研究进展 |
| 1 禽流感病毒的分子生物学特性 |
| 2 H9N2亚型禽流感的流行情况 |
| 3 禽流感主要检测方法 |
| 4 单克隆抗体技术 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（3）2016-2018年华东地区H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述: H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究 |
| 前言 |
| 1 H9N2亚型禽流感病毒流行病学 |
| 2 H9N2亚型禽流感病毒基因片段遗传进化及表达蛋白功能 |
| 3 H9N2亚型禽流感病毒传播特性及致病性研究 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 H9N2亚型禽流感病毒病原学调查 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 华东地区家禽中流行的H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化特征 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒传播特性及致病性初步研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗研究及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 H7亚型禽流感的流行 |
| 1.3 H5亚型禽流感的流行 |
| 1.4 高致病禽流感疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 全病毒灭活疫苗 |
| 1.4.2 重组病毒活载体疫苗 |
| 1.4.3 DNA疫苗 |
| 1.4.4 通用流感疫苗 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 重组禽流感病毒H5N1 亚型Re-11 株、Re-12 株和H7N9 亚型H7-Re2 株生物特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒种 |
| 2.1.2 病毒株 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 血清 |
| 2.1.5 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 种毒的系统鉴定 |
| 2.2.2 种毒的传代及病毒含量的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 种毒的系统鉴定 |
| 2.3.2 种毒的传代及病毒含量的测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的实验室研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 制苗用种毒 |
| 3.1.2 攻毒用病毒株 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 检测用HI抗原 |
| 3.1.5 主要试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 抗原配比及有效成分相容性研究 |
| 3.2.2 3批三价疫苗物理性状检验 |
| 3.2.3 3批三价疫苗安全性试验 |
| 3.2.4 3批三价疫苗免疫效力试验 |
| 3.2.5 三价疫苗对流行毒株的免疫效力试验 |
| 3.2.6 HI抗体与攻毒保护关系研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗原配比及有效成分相容性研究 |
| 3.3.2 成品物理性状的检验 |
| 3.3.3 3批三价疫苗安全性试验 |
| 3.3.4 3批三价疫苗免疫效力试验 |
| 3.3.5 三价疫苗对流行毒株的免疫效力试验 |
| 3.3.6 HI抗体与攻毒保护关系研究 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的临床应用评估 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 疫苗 |
| 4.1.2 抗原及标准阳性血清 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 蛋种鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.2 白羽肉种鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.3 北京油鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.4 固始鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.5 商品白羽肉鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.6 种鸭安全性和免疫效果评估 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 安全性评估结果 |
| 4.3.2 蛋种鸡免疫效果评估 |
| 4.3.3 白羽肉种鸡免疫效果评估 |
| 4.3.4 北京油鸡免疫效果评估 |
| 4.3.5 固始鸡免疫效果评估 |
| 4.3.6 商品白羽鸡免疫效果评估 |
| 4.3.7 种鸭免疫效果评估 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）2013-2015年华东地区H9N2禽流感病毒的流行病学调查及单克隆抗体的研制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 2013-2015年华东地区H9N2亚型禽流感病毒的流行病学调查及基因组遗传进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H9N2亚型AIV流行株的抗原差异性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 G1亚系分支的H9N2禽流感病毒单克隆抗体的研制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文目录 |
（6）2016～2018年间江苏及周边地区发病鸡群H9N2亚型禽流感病毒监测及抗原性差异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 禽流感病毒的病原学简述 |
| 2 H9N2亚型禽流感在中国的流行情况 |
| 3 H9N2亚型禽流感的遗传进化 |
| 3.1 HA基因的系统发育 |
| 3.2 基因型多样性 |
| 4 H9N2亚型禽流感的检测方法 |
| 5 H9N2亚型禽流感的防控策略 |
| 6 结论 |
| 第一章 2016-2018年江苏省及周边地区部分发病鸡群H9N2亚型禽流感病毒监测 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 标准抗原和阳性血清 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要分析生物学软件 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 样品保存液 |
| 1.7 SPF鸡胚 |
| 1.8 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品采集与处理 |
| 2.2 病毒的分离培养 |
| 2.3 病毒的鉴定 |
| 2.3.1 1%红细胞的制备 |
| 2.3.2 血凝试验 |
| 2.3.3 血凝抑制试验 |
| 2.4 HA基因扩增及序列分析 |
| 2.4.1 病毒RNA的提取及cDNA制备 |
| 2.4.2 PCR扩增HA目的基因 |
| 2.4.3 PCR产物克隆鉴定及序列测定 |
| 2.4.4 HA基因遗传进化及糖基化位点和受体结合位点分析 |
| 3 结果 |
| 3.2 HA基因分析结果 |
| 3.2.1 HA基因测序结果分析 |
| 3.2.2 HA基因核苷酸及推导的氨基酸同源性分析 |
| 3.2.3 HA基因遗传进化分析 |
| 3.2.4 HA蛋白氨基酸变异分析 |
| 4 讨论 |
| 第二章 H9N2亚型AIV分离株抗原性差异比较研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 鸡胚和实验鸡 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 7株H9N2亚型禽流感病毒株灭活疫苗的制备 |
| 2.2 交叉免疫抗体测定试验 |
| 2.2.1 试验分组 |
| 2.2.2 HI抗体检测 |
| 2.3 交叉免疫攻毒保护试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗体差异性分析 |
| 3.1.1 HI抗体检测结果 |
| 3.2 抗体动态变化分析 |
| 3.3 交叉免疫攻毒保护试验 |
| 3.3.1 试验鸡攻毒后的临床表现 |
| 3.3.2 试验鸡免疫攻毒后的排毒情况 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）不同源性禽流感病毒株的分离鉴定及其主要基因信息的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 禽流感病原学研究进展 |
| 1 禽流感的流行状况 |
| 1.1 禽流感的世界流行状况 |
| 1.2 禽流感的国内流行状况 |
| 1.3 禽流感流行病学特点 |
| 2 禽流感的危害 |
| 2.1 禽流感对养禽业的危害 |
| 2.2 禽流感对畜牧业的危害 |
| 2.3 禽流感病毒对野生哺乳动物的危害 |
| 2.4 禽流感病毒对人的危害 |
| 3 禽流感病原 |
| 3.1 禽流感概况 |
| 3.2 禽流感病毒结构 |
| 3.3 禽流感病毒的化学组成 |
| 3.4 禽流感病毒的抵抗力 |
| 3.5 禽流感病毒基因组、编码的蛋白质及其功能 |
| 4 禽流感病毒的复制 |
| 5 禽流感病毒的致病力 |
| 6 禽流感病毒的抗原性变异 |
| 7 禽流感病毒的传播 |
| 8 禽流感的主要临床症状和主要病理组织学变化 |
| 8.1 禽流感的主要临床症状 |
| 8.2 禽流感主要病理解剖学变化 |
| 8.3 禽流感病理组织学变化 |
| 9 水禽在禽流感中的作用 |
| 10 候鸟在禽流感中的作用 |
| 11 禽流感诊断进展 |
| 12 禽流感病毒疫苗的研制 |
| 12.1 灭活疫苗 |
| 12.2 基因工程疫苗 |
| 综述二 禽流感病毒基因组、编码蛋白、功能及分子致病性研究进展 |
| 1 禽流感病毒基因组 |
| 2 病毒的主要蛋白及功能 |
| 2.1 血凝素 |
| 2.2 神经氨酸酶 |
| 2.3 核蛋白 |
| 2.4 基质蛋白 |
| 2.5 非结构蛋白 |
| 2.6 聚合酶 |
| 3 禽流感病毒的抗原性变异及其进化 |
| 3.1 抗原漂移 |
| 3.2 抗原转变 |
| 3.3 缺损干扰颗粒和RNA重组 |
| 3.4 禽流感病毒的进化 |
| 4 禽流感病毒致病性的分子基础 |
| 4.1 HA与细胞表面特异性病毒受体的结合是导致病毒感染的先决条件 |
| 4.2 宿主细胞蛋白酶种类及活性对HA裂解性具有重要影响 |
| 4.3 禽流感病毒毒力高低与HA裂解位点氨基酸的性质及组成序列有关 |
| 4.4 裂解位点插入细胞的多肽序列会使病毒对裂解的敏感性增加 |
| 4.5 裂解位点附近的糖链对HA的裂解有影响 |
| 4.6 NA对禽流感病毒的致病性有一定影响 |
| 4.7 NS基因对毒力的影响 |
| 4.8 NP对禽流感病毒复制及感染能力的影响 |
| 综述三 禽流感及其公共卫生意义 |
| 1 人禽流感流行病学现状 |
| 2 决定宿主特异性的因素 |
| 2.1 HA的细胞受体结合位点 |
| 2.2 HA上的受体结合位点与宿主细胞的HA受体的关系 |
| 2.3 NA的氨基酸组成及其糖基化对流感病毒宿主特异性的影响 |
| 2.4 NP对禽流感病毒的宿主特异性的影响 |
| 2.5 其他基因对流感病毒宿主特异性的影响 |
| 3 禽流感病毒跨种属感染人的机制 |
| 4 禽流感病毒对人呼吸道的感染机制 |
| 4.1 禽流感病毒基因高变异率是决定其对人致病的主要因素 |
| 4.2 禽流感病毒通过进化具备侵入人体并在人体内有效复制的能力 |
| 5 从人流感的起源看禽流感与人流感的关系 |
| 6 禽流感与公共卫生意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 实验一 不同原性禽流感病毒株的分离鉴定与生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离结果 |
| 2.2 血清学鉴定结果 |
| 2.3 血凝素亚型鉴定结果 |
| 2.4 荧光RT-PCR检测结果 |
| 2.5 电镜观察结果 |
| 2.6 血凝素热稳定性实验结果 |
| 2.7 化学特性实验结果 |
| 2.8 EID_(50)的测定结果 |
| 2.9 鸡静脉指数(IVPI)实验结果 |
| 2.10 鸡脑内致病指数(ICPI)实验结果 |
| 2.11 致病性实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 不同原性禽流感病毒株血凝素基因和神经氨酸酶基因的扩增、克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR结果 |
| 2.2 重组质粒的PCR鉴定结果 |
| 2.3 重组质粒的限制性内切鉴定结果 |
| 2.4 17株不同亚型禽流感病毒毒株HA基因、NA基因的核苷酸和氨基酸序列测定与特征性分析 |
| 2.5 AI病毒分离株HA基因和NA基因的比较分析及其遗传演化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 两株鹅源和1株鸽源H5N1亚型AIV分离株全基因克隆及序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增结果 |
| 2.2 PCR产物纯化、克隆及PCR鉴定结果 |
| 2.3 测序结果与基因序列同源性分析 |
| 2.4 8个基因的遗传进化分析结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验四 试验鸡感染鹅源H5N1亚型禽流感病毒后排毒规律以及鸡体内病毒抗原定位动态的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 试验组的临床症状 |
| 2.2 ELD_(50)和LD_(50)的测定结果 |
| 2.3 病毒分离结果 |
| 2.4 病毒鉴定结果 |
| 2.5 荧光RT-PCR检测结果 |
| 2.6 免疫荧光检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）6株H9N2亚型AIV分离鉴定、全基因组分析及鹅源毒株感染与免疫特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词英汉对照表 |
| 1 前言 |
| 1.1 禽流感简史与危害 |
| 1.2 禽流感病毒分子特征 |
| 1.2.1 病毒粒子结构特征 |
| 1.2.2 病毒基因组结构特征 |
| 1.3 基因组编码蛋白的结构及蛋白特性 |
| 1.3.1 RNA聚合酶复合体蛋白 |
| 1.3.2 血凝素 |
| 1.3.3 神经氨酸酶 |
| 1.3.4 核蛋白 |
| 1.3.5 基质蛋白 |
| 1.3.6 非结构蛋白 |
| 1.4 H9N2亚型禽流感 |
| 1.4.1 H9N2亚型禽流感宿主分布情况 |
| 1.4.2 H9N2亚型禽流感危害 |
| 1.4.3 我国H9N2亚型禽流感疫苗应用概况 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 参考血清、抗原、SPF鸡胚及雏鹅 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品的处理 |
| 2.2.2 病毒分离 |
| 2.2.3 病毒鉴定与纯化 |
| 2.2.4 毒株全基因组克隆与遗传进化分析 |
| 2.2.5 毒株GS/A11株生物学特性测定 |
| 2.2.6 毒株GS/A11鹅的感染排毒试验 |
| 2.2.7 毒株GS/A11感染鹅组织学观察与病毒分布研究 |
| 2.2.8 鹅源毒GS/A11免疫原性试验与HI交叉反应试验 |
| 2.2.9 毒株GS/A11 HA蛋白重组表达质粒的构建 |
| 2.2.10 阳性重组表达质粒的诱导表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 6株H9亚型禽流感病毒分离鉴定结果 |
| 3.2 6株H9亚型禽流感病毒全基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.3 全基因序列分析结果 |
| 3.3.1 HA基因序列分析结果 |
| 3.3.2 NA基因序列分析结果 |
| 3.3.3 PB2 基因序列分析结果 |
| 3.3.4 PB1 基因序列分析结果 |
| 3.3.5 PA基因序列分析结果 |
| 3.3.6 NP基因序列分析结果 |
| 3.3.7 M基因序列分析结果 |
| 3.3.8 NS基因序列分析结果 |
| 3.4 鹅源毒株GS/A11 MDT测定、EID50测定结果 |
| 3.4.1 鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT)测定结果 |
| 3.4.2 鸡胚半数感染量(EID50)测定结果 |
| 3.5 鹅攻毒试验结果 |
| 3.5.1 鹅感染排毒研究结果 |
| 3.5.2 鹅气管病理组织学观察结果 |
| 3.6 鹅源毒株GS/A11免疫原性试验及HI交叉反应试验结果 |
| 3.6.1 毒株GS/A11免疫应答试验结果 |
| 3.6.2 毒株GS/A11和毒株SH10血清HI交叉反应试验结果 |
| 3.7 GS/A11株HA蛋白原核表达载体构建结果 |
| 3.7.1 GS/A11株HA基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.7.2 重组表达质粒pET30a-HA-A11双酶切鉴定结果 |
| 3.8 重组表达质粒PET30A-HA-A11原核系统表达结果 |
| 3.8.1 PET30a-HA(Rosetta)表达GS/A11-HA蛋白不同诱导时间表达结果 |
| 3.8.2 PET30a-HA(Rosetta)表达GS/A11-HA蛋白不同IPTG诱导浓度表达结果 |
| 3.8.3 PET30a-HA(Rosetta)表达GS/A11-HA蛋白可溶性分析结果 |
| 3.9 GS/A11-HA蛋白纯化及表达产物的WESTERN-BLOT鉴定结果 |
| 3.9.1 PET30a-HA(Rosetta)表达GS/A11-HA蛋白纯化结果 |
| 3.9.2 表达产物Western-blot鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 分离株全基因组序列分析 |
| 4.1.1 分离株HA和NA基因变异及其提示 |
| 4.1.2 分离株内部基因变异及其提示 |
| 4.2 分离株基因组蛋白位点变化分析 |
| 4.2.1 分离株HA和NA基因蛋白氨基酸位点变异及其提示 |
| 4.2.2 分离株内部基因蛋白氨基酸位点变化分析 |
| 4.3 GS/A11株动物感染试验结果分析 |
| 4.4 毒株GS/A11免疫原性试验及血清HI交叉反应试验分析 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）2011-2013年华东地区禽流感病毒流行病学调查及H9N2亚型禽流感病毒的抗原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 研究一 2011-2013年华东地区禽流感病毒的流行病学调查以及分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 36株H9N2型禽流感病毒全基因组的遗传进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 两株H10亚型禽流感病毒的起源分析和生物学特性测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究四 H9N2候选疫苗株的筛选以及免疫效果评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文目录 |
（10）H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及其遗传进化分析（论文提纲范文）
| 英文缩写对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禽流感概述 |
| 2 禽流感重要历史事件 |
| 3 禽流感的病原学特征 |
| 3.1 形态结构及生物学特性 |
| 3.2 禽流感的遗传变异特性 |
| 3.2.1 抗原漂移 |
| 3.2.2 抗原转变 |
| 4 流感病毒致病机制 |
| 4.1 血凝素(HA)与流感病毒致病性的关系 |
| 4.1.1 HA的裂解 |
| 4.1.2 HA受体结合与释放 |
| 4.2 神经氨酸酶(NA)与流感病毒致病性的关系 |
| 4.3 聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)与流感病毒致病性的关系 |
| 4.4 核蛋白(NP)与流感病毒致病性的关系 |
| 4.5 基质蛋白(M)与流感病毒致病性的关系 |
| 4.6 非结构蛋白(NS)与流感病毒致病性的关系 |
| 5 禽流感疫苗研究 |
| 5.1 全病毒灭活疫苗 |
| 5.1.1 同源苗 |
| 5.1.2 异源苗 |
| 5.1.3 经分子修饰重配的灭活苗 |
| 5.2 亚单位疫苗 |
| 5.3 基因重组活载体疫苗 |
| 5.4 DNA疫苗 |
| 5.5 病毒样颗粒疫苗 |
| 5.6 冷适应流感弱毒疫苗 |
| 5.7 表位疫苗 |
| 6 H9N2禽流感病毒的危害 |
| 6.1 H9N2禽流感养殖业的危害 |
| 6.2 H9N2禽流感对人类的潜在危害 |
| 7 研究的目的与意义 |
| 第二章 H9亚型禽流感病毒全基因组的序列分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器设备和器材 |
| 1.4 3.8%柠檬酸钠的配制 |
| 1.5 0.5%鸡红细胞悬液制备 |
| 1.6 LB培养基配制 |
| 1.7 引物序列设计 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒分离鉴定及纯化 |
| 2.2 病毒的血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验 |
| 2.3 病毒的纯化 |
| 2.4 病毒全基因组测序 |
| 2.4.1 抽提尿囊液RNA(用QIGEN Rneasy KIT) |
| 2.4.2 M-MLV反转录 |
| 2.4.3 PCR扩增各基因片段 |
| 2.4.4 PCR产物电泳鉴定 |
| 2.4.5 PCR产物割胶回收及纯化 |
| 2.5 病毒全基因组序列分析及遗传进化分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒分离结果 |
| 3.2 病毒纯化结果 |
| 3.3 H9亚型AIV全基因组片段扩增结果 |
| 3.4 HA基因的测序相关结果及遗传进化分析 |
| 3.4.1 HA基因测序结果及关键位点分析 |
| 3.4.2 HA基因核苷酸及氨基酸序列同源性的分析 |
| 3.4.3 HA基因遗传进化分析 |
| 3.5 NA基因的测序相关结果及遗传进化分析 |
| 3.5.1 NA基因测序结果及关键位点分析 |
| 3.5.2 NA基因序列同源性的分析 |
| 3.5.3 NA基因遗传进化分析 |
| 3.6 NS基因的测序相关结果及遗传进化分析 |
| 3.6.1 NS基因测序结果及关键位点分析 |
| 3.6.2 NS基因序列同源性的分析 |
| 3.6.3 NS基因遗传进化分析 |
| 3.7 M基因的测序相关结果及遗传进化分析 |
| 3.7.1 M基因测序结果及关键位点分析 |
| 3.7.2 M基因序列同源性的分析 |
| 3.7.3 M基因遗传进化分析 |
| 3.8 NP基因的测序相关结果及遗传进化分析 |
| 3.8.1 NP基因测序结果及关键位点分析 |
| 3.8.2 NP基因序列同源性的分析 |
| 3.8.3 NP基因遗传进化分析 |
| 3.9 PA基因的测序相关结果及遗传进化分析 |
| 3.9.1 PA基因测序结果及关键位点分析 |
| 3.9.2 PA基因序列同源性的分析 |
| 3.9.3 PA基因遗传进化分析 |
| 3.10 PB1基因的测序相关结果及遗传进化分析 |
| 3.10.1 PB1基因测序结果及关键位点分析 |
| 3.10.2 PB1基因序列同源性的分析 |
| 3.10.3 PB1基因遗传进化分析 |
| 3.11 PB2基因的测序相关结果及遗传进化分析 |
| 3.11.1 PB2基因测序结果及关键位点分析 |
| 3.11.2 PB2基因序列同源性的分析 |
| 3.11.3 PB2基因遗传进化分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 8株H9N2分离株HA序列分析讨论 |
| 4.2 8株H9N2分离株NA序列分析讨论 |
| 4.3 8株H9N2分离株8个基因片段同源性和遗传进化分析讨论 |
| 第三章 结论 |
| 1. 结论 |
| 2. 本研究创新点 |
| 3. 尚需进一步深入研究的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、中国禽流感流行株的分离鉴定（论文参考文献）
- [1]1999年～2013年山东鸡源H9N2亚型禽流感病毒遗传演化和血凝素抗原性研究[D]. 张伟. 中国农业大学, 2015(07)
- [2]H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用[D]. 孙兰. 扬州大学, 2020(01)
- [3]2016-2018年华东地区H9N2亚型禽流感病毒分子流行病学及致病性研究[D]. 蒋大秀. 扬州大学, 2019
- [4]重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗研究及应用[D]. 陈晓涵. 中国农业科学院, 2020
- [5]2013-2015年华东地区H9N2禽流感病毒的流行病学调查及单克隆抗体的研制[D]. 鞠勇. 扬州大学, 2016(02)
- [6]2016～2018年间江苏及周边地区发病鸡群H9N2亚型禽流感病毒监测及抗原性差异分析[D]. 丁园. 扬州大学, 2019
- [7]不同源性禽流感病毒株的分离鉴定及其主要基因信息的研究[D]. 王伟利. 吉林农业大学, 2006(01)
- [8]6株H9N2亚型AIV分离鉴定、全基因组分析及鹅源毒株感染与免疫特性研究[D]. 张溢珊. 佛山科学技术学院, 2018(03)
- [9]2011-2013年华东地区禽流感病毒流行病学调查及H9N2亚型禽流感病毒的抗原性分析[D]. 宿春虎. 扬州大学, 2014(01)
- [10]H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及其遗传进化分析[D]. 陈琳. 福建农林大学, 2015(08)