一、噬菌体的应用及其它（论文文献综述）
顾敬敏[1]（2014）在《金黄色葡萄球菌噬菌体GH15及其裂解酶三维结构与分子作用机制研究》文中认为金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是人畜共患的一种重要病原菌，可引起多种局部和全身性的感染疾病。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicilin-resistant S. aureus, MRSA）的出现给这些感染性疾病的临床治疗带来了极大的困难。噬菌体（bacteriophage）是一种可以感染细菌的病毒，它利用细菌内的细胞器合成自身所需的生物分子，在感染后期通过自身编码裂解酶所起的水解作用破坏细胞壁，从而杀死细菌释放子代噬菌体颗粒。由于噬菌体与其裂解酶具有快速杀灭特定病原菌的能力，使得二者在治疗耐药菌感染方面表现出极大的应用潜力。本研究拟以金黄色葡萄球菌的噬菌体及其裂解酶作为研究对象，探索噬菌体裂解酶作为治疗制剂的潜力及其裂解作用的分子机制。首先在医学临床分离到多株MRSA菌株，然后以分离到的MRSA菌株为宿主菌对噬菌体进行了分离、纯化和筛选，最终得到了一株具有广谱、高效裂解活性的烈性噬菌体，命名为GH15。对噬菌体GH15的全基因组进行了序列测定，结果表明该噬菌体全长为139.8Kb，共具有214个开放式阅读框（ORF），G+C%为30.23%。比对分析表明GH15与其它金葡菌噬菌体（K、G1、A5W、ISP和Sb-1）同源性较近。但是，在GH15基因组中不存在内含子，而同源性较近的这几个噬菌体分别在不同的基因中含有若干个内含子。内含子相关基因的比对和分析表明有内含子噬菌体和无内含子噬菌体的相关基因在内含子插入位点处具有明显的差异。相关的内含子基因序列与数据库中的任何基因都不具有同源性，因此可以推测这些内含子起源于噬菌体，而非其宿主菌或者其它来源，也就是说GH15很有可能在其它噬菌体基础上发生了内含子的丢失。通过SDS-PAGE和质谱分析共鉴定出GH15的10个结构蛋白，主要为组成衣壳和尾部的相关蛋白。进一步对基因组序列进行分析确定了GH15的裂解酶基因（LysGH15），并对其裂解酶LysGH15进行了表达和纯化。LysGH15对MRSA表现出高效的裂解活性，其最佳作用温度为37°C、最佳作用pH值为7.0；LysGH15表现出比噬菌体GH15更宽的裂解谱，可以裂解所有被检的24株MRSA。通过使小鼠感染MRSA制作了小鼠菌血症模型，对该模型进行治疗的实验中发现50μg的LysGH15即可以有效地治疗处于菌血症状态的小鼠。通过对小鼠血液和脾脏中菌含量进行持续的检测，表明LysGH15可以使菌血症小鼠血液和脾脏内的菌量快速的下降，显示出很强的清除感染细菌的能力，同时还可以降低小鼠体内IL-6、IL-4和INF-γ的mRNA水平。为了揭示LysGH15裂解金葡菌的作用机制，本研究拟对LysGH15蛋白的三维结构进行解析。但是，小角散射和二级结构预测分析表明全长LysGH15是由两个很长的linker连接三个近似球形的活性区域组成，表现出很大的摆动性，无法进行蛋白结晶。因此，分别对LysGH15的三个活性片段（CHAP、amidase-2、SH3b）进行了表达和结构解析。通过结晶条件的初筛和优化最终获得了CHAP片段和amidase-2片段的高质量晶体，并分别通过硒代和泡重原子的方法解析了这两个片段的三维结构。依据CHAP片段结构进行的位点突变、原子发射光谱分析（ICP-AES）、等温滴定量热法（ITC），thermal shift，圆二色谱分析（CD）和活性实验表明：CHAP可以通过5个氨基酸残基结合一个Ca2+，其中D45、D47和D56的侧链在结合Ca2+中起关键作用；Ca2+的丢失不会影响CHAP的二级结构，但是对其热稳定性具有轻微影响，它与CHAP的解离平衡常数为27μM；Ca2+在CHAP的裂解活性中起关键的调节作用，一旦丢失，将使CHAP失活；C54-H117-E134-N136四联体为CHAP的活性中心，其中C54的巯基起主要的攻击作用。通过amidase-2的结构可以看到H214、H324和C332三个氨基酸残基的侧链可以结合一个Zn2+，另外通过序列和结构的比对确定了与活性有关的氨基酸位点为E282和T330，并通过突变后的活性实验进行了进一步的验证。由于无法获得SH3b片段的晶体，所以采用了核磁共振技术对该片段进行了结构解析。首先表达了15N和13C单标和双标的SH3b蛋白，通过核磁共振技术获得了二维谱数据，通过计算、分析和优化最终获得了SH3b在溶液状态下的三维结构。核磁滴定与突变实验鉴定了SH3b与底物多肽“AGGGGG”相互作用的界面和关键氨基酸位点。在全长LysGH15蛋白水平对结构相关研究得出的结论进行了验证：将LysGH15上的C54突变为丝氨酸，结果LysGH15完全失活，结合Ca2+关键位点的突变也会对全长LysGH15的活性产生同样的影响，表明CHAP片段在全长的裂解活性中起关键作用；将全长LysGH15中的E282突变为丙氨酸，结果LysGH15的活性无明显的变化，表明amidase-2在全长的活性中所起的作用很小；将LysGH15中SH3b结合相关的位点进行突变，结果可以显着影响全长的活性，表明SH3b的结合活性在全长活性中起很大作用。综上，CHAP的水解活性与SH3b的结合活性共同促成了LysGH15的高效裂解活性。
李振[2]（2018）在《噬菌体防控苗期刺参弧菌感染的研究》文中认为刺参（Apostichopus japonicus）具有极高的经济价值,是中国北方重要的经济类水产养殖动物之一。刺参细菌性疾病是困扰刺参养殖业的主要问题,病原弧菌是其主要的致病菌。为消除病原菌威胁,大量的抗生素和化学类药物被投入使用,最终导致水环境污染,菌群微生态失衡,抗生素残留,细菌耐药性产生,制约了刺参养殖业的可持续发展,因此亟需一种新型的抑菌方式以替代抗生素。到目前为止,国际研究领域的主流替代方式是采用噬菌体疗法,关于噬菌体应用的研究已经成为热点,涉及诸多领域,如农业、畜牧业、食品安全保障行业等。鉴于此,本课题将噬菌体的应用策略引入到苗期刺参养殖领域,探索噬菌体疗法在该领域应用的有效性与安全性。本课题的主要研究内容和结果总结如下:（1）筛选获得引发苗期刺参感染的病原弧菌两株,分离得到相应病原菌的噬菌体,并对其进行了必要的理化性质分析。经透射电镜观察、生理生化实验和分子生物学实验鉴定两株病原弧菌为嗜环弧菌和灿烂弧菌,分别命名为嗜环弧菌VC1和灿烂弧菌VS-ABTNL。采用人工攻毒处理方式,测定了两株优势病原弧菌的半数致死量,嗜环弧菌VC1的半数致死量LD50值为8.75 × 105 CFU/g,半数致死浓度LD50值为3.45 × 106 CFU/mL,灿烂弧菌VS-ABTNL的半数致死量LD50值为3.40 × 104 CFU/g,半数致死浓度LD50值为1.68 × 105 CFU/mL,两株优势分离菌株对苗期刺参均具有高致病性。丝裂霉素C诱导实验结果表明该两株优势病原弧菌均为非溶源性菌株。从环境水样中分离得到嗜环弧菌VC1和灿烂弧菌VS-ABTNL的噬菌体各两株,分别命名为vibrio phage Vc1、vibrio phage Vc2和PVS2、PVS3。对分离纯化获得的四株噬菌体进行了形态学、一步生长曲线、宿主谱、体外抑菌和其它生理生化特性分析,结果表明,四株噬菌体宿主专一性强,裂解性高,在潜伏期、裂解量、体外抑菌效果方面,vibrio phage Vc1和PVS3分别强于vibrio phage Vc2和PVS2。将噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3提交到中国微生物菌种保藏中心,保藏号分别为CGMCC No.9101和CGMCC No.12263。（2）对噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的全基因组进行了高通量测序分析与注释,进一步确定了两株噬菌体的基因特性、分类学地位以及基因层面的应用安全性。采用氯化铯密度梯度离心浓缩噬菌体,提取两株噬菌体的基因组DNA,使用Illumina测序技术对两株噬菌体的全基因组DNA进行生物信息学分析,分析结果表明噬菌体vibrio phage Vc1和噬菌体PVS3均为双链线性DNA,vibrio phage Vc1基因组全长44,541 bp,GC含量为44.61%,预测出19个具有实际功能的基因,包含一个胞壁水解酶基因,而噬菌体PVS3基因组全长为43,573 bp,GC含量为43.95%,预测出具有23个实际功能的基因。以上两株噬菌体基因组均未发现tRNA编码基因,但均具有保守的RNA聚合酶基因。根据RNA聚合酶亲缘关系比对分析,进一步确定了噬菌体virbio phage Vc1和PVS3的分类学地位,噬菌体virbio phage Vc1属于长尾噬菌体科,T5-like噬菌体属;噬菌体PVS3属于长尾噬菌体科,T1-like（Tunalikevirus）噬菌体属。全基因组序列比对分析结果表明以上两株噬菌体在Genbank数据库中无同源性,均为新发现的噬菌体。同时,噬菌体virbio phage Vc1和PVS3的基因组中均未发现毒力基因、溶源基因及毒力转座子等致病因子,均属于裂解性噬菌体,因此具有基因水平的应用安全性。以上两株噬菌体的全基因组序列已经提交到NCBI,序列识别号分别为KJ502657以及MF497422。（3）设计三种噬菌体施用剂型——注射剂、冻干粉饲料添加剂和混合噬菌体液体浸浴剂,分别证明了三种噬菌体剂型在防控苗期刺参弧菌感染中的有效性。在人工攻毒条件下,注射噬菌体vibrio phage Vc1可以将刺参存活率由30%提高到60%,注射噬菌体PVS3可以将刺参存活率由20%提高到65%。噬菌体冻干粉制剂制备过程中,确定脱脂牛奶为最佳保护剂。饲喂实验中,噬菌体冻干粉按5%添加量添加基础饲料,实验结果表明,饲喂嗜环弧菌噬菌体可有效地提高刺参存活率,各处理组均达到60%以上,饲喂灿烂弧菌噬菌体也可有效地提高刺参存活率,各处理组均达到50%以上,并且两种混合噬菌体的饲喂处理组,刺参存活率均能达到抗生素处理组水平（80%）。混合噬菌体浸浴实验中,噬菌体浸浴组刺参存活率（85%）超过实验中抗生素处理组水平（65%）。同时,在噬菌体饲喂保护和浸浴治疗实验中,养殖水体和刺参肠道内均检测到噬菌体的存在,且肠道内噬菌体效价水平低于水体噬菌体效价水平。噬菌体4℃C长期保藏时,以脱脂牛奶为保护剂的噬菌体真空冷冻干燥处理对噬菌体效价的维持效果最佳,在监测的14个月时间内均保持较高效价水平（≥107PFU/mL）。（4）考察了施用噬菌体对苗期刺参主要生理指标的影响,涉及刺参体腔细胞层面、刺参体腔非特异免疫酶活层面、刺参生长指标及刺参肠道菌群结构层面。将高纯度噬菌体颗粒（≥1010PFU/mL）与刺参体腔细胞进行体外共培养,结果表明,噬菌体不会对刺参体腔细胞的形态、活性尤其是吞噬细胞活性产生影响。酶活层面主要考察注射噬菌体和饲喂噬菌体冻干粉对刺参体腔非特异免疫酶活的影响,注射实验又包含攻毒和非攻毒两种方式。在未攻毒情况下,注射噬菌体能显着提高刺参体腔液中一氧化氮合酶和酸性磷酸酶活性（P<0.05）,对溶菌酶和超氧化物歧化酶的活性无显着影响;在攻毒情况下,注射噬菌体会降低刺参溶菌酶和超氧化物歧化酶的应激反应水平,推测注射的噬菌体与刺参机体免疫系统有协同消杀病原菌作用,且在攻毒后的48 h,噬菌体处理组溶菌酶和超氧化物歧化酶水平与空白对照组无显着差异（P>0.05）,一氧化氮合酶和酸性磷酸酶水平仍显着高于空白对照组（P<0.05）,在60天的饲喂实验期间,饲喂含有噬菌体冻干粉的饲料同样能显着提高刺参体腔液中一氧化氮合酶和酸性磷酸酶活性（P<0.05）,以上结果表明噬菌体能被刺参的非特异免疫系统识别,引起刺参的部分免疫反应。此外,饲喂噬菌体不会对刺参的主要生长指标（增重、摄食率、饲料转化效率及脏壁比）产生影响,在降低实验中弧菌属微生物丰度的同时,不会影响刺参正常肠道菌群微生物的丰度水平,说明施用噬菌体有效地抑制了目标菌株的生长。综上,本研究从替代抗生素的角度出发,以两株病原弧菌——嗜环弧菌和灿烂弧菌为目标菌株,设计实验揭示了施用噬菌体在防控苗期刺参弧菌感染的有效性,能达到甚至超过抗生素的施用效果,在噬菌体的基因层面及刺参的主要生理指标方面证明了施用噬菌体的安全性。本研究最终确定了噬菌体疗法在苗期刺参养殖领域的可行性,为苗期刺参的绿色、安全、无抗化养殖开辟了一个新的思路。
韩生义[3]（2020）在《沙门氏菌的噬菌体试验性治疗及噬菌体抗性机制研究》文中提出沙门氏菌是一种危害公众健康的重要病原体,能引起人和动物食物中毒和急性肠道疾病。随着沙门氏菌耐药性增强和耐药谱的变广,通过抗生素来预防和治疗沙门氏菌感染越发困难。据此,我们建立口服沙门氏菌的小鼠感染模型;对噬菌体对沙门氏菌小鼠感染模型的治疗效果进行评估;并对沙门氏菌对噬菌体的抗性机制进行了深入研究。为研究沙门氏菌QH的遗传进化特点和致病性,对沙门氏菌QH的全基因组进行了比较分析和小鼠感染模型建立。与其他沙门氏菌相比,沙门氏菌QH基因组含有较多的前噬菌体和基因岛,其核苷酸和同义密码子的使用模式表明突变压力和自然选择在基因水平上影响了沙门氏菌QH的进化趋势,而其独特的密码子使用模式有助于增强其对环境的适应性和对宿主的致病性。在沙门氏菌QH的感染早期,小鼠外周血中CD4+和CD8+淋巴细胞亚群的水平显着降低,但一些细胞因子（IFN-β1,IFN-γ和CXCL10）转录水平的升高可能在抗沙门氏菌感染中具有多种免疫效应。此外,小鼠外周血中IL10的转录和翻译水平显着升高,表明IL10介导的免疫抑制作用可能在口服沙门氏菌QH感染的早期起了重要作用。从国内不同地理位置分离了4株烈性沙门氏菌噬菌体,发现它们都属于肌尾科并具有相似的生物学特性,与另外2株国内的和2株智利的噬菌体具有相似的进化模式。基于4株噬菌体基因组中AT含量>GC含量的背景,通过信息熵分析表明整体核苷酸使用偏好是由噬菌体所有的基因决定的。密码子不同位置核苷酸的使用偏好性要比所有基因的整体核苷酸使用偏好性强（p<0.001）,而这种遗传特性直接导致了同义密码子倾向于A/T结尾。而噬菌体核苷酸组成约束和自然选择迫使噬菌体在整体密码子使用模式方面具有相同的进化趋势。核苷酸组成约束也在噬菌体同义密码子使用模式形成过程中起重要作用,包括码子第1位的keto skew、第2位的嘧啶skew和第3位的AT skew。噬菌体SP1对沙门氏菌QH的吸附速度快,裂解效率高。然而,噬菌体SP1对小鼠感染模型的治疗效果不好,虽然通过口服噬菌体SP1一定程度上缓解了小鼠的临床症状,但在持续的给药治疗过程中,小鼠的脾脏载菌量依然达到3.1×105 cfu/mL,我们推测噬菌体治疗时间较晚和沙门氏菌QH对噬菌体SP1产生抗性是可能主要原因。我们从沙门氏菌QH中筛选出一株对噬菌体SP1耐受的突变株QHM,噬菌体SP1无法吸附在突变株QHM的表面。沙门氏菌QH脂多糖是噬菌体SP1受体,突变株QHM基因组上与脂多糖合成相关的rfaJ基因721bp处的碱基从G突变为T,造成了编码谷氨酸的密码子GAG突变为终止密码子TAG,从而使得糖基转移酶的合成失败,最终使得突变株QHM的脂多糖结构不完整。为进一步验证rfaJ基因的功能,我们构建了缺失株QHΔrfaJ发现,rfaJ基因敲除后会造成脂多糖结构不完整,噬菌体SP1无法吸附和感染缺失株QHΔrfaJ。最后,通过分析沙门氏菌QH、突变株QHM和噬菌体SP1之间的生长关系和波动实验,我们发现,这种抗性机制是通过自然突变产生,与噬菌体SP1无关。本实验对沙门氏菌QH及其噬菌体的生物学特性和遗传进化关系进行了全面系统的研究;并通过小鼠感染模型及噬菌体治疗实验,对食源性沙门氏菌感染小鼠后引起的免疫应答反应和噬菌体的治疗效果进行了系统的评估;同时,对沙门氏菌对噬菌体的抗性机制进行了深入的研究。为沙门氏菌感染后的噬菌体治疗和抗性机制的研究提供了理论依据。
欧阳敏[4]（2019）在《致病弧菌宽谱噬菌体的分离鉴定、生物特性和应用研究》文中指出致病弧菌是可引起人和水生生物共患病的一类病原性弧菌。弧菌的防治一般采用抗生素或化学制剂等,但随着耐药性菌株的出现,防控变得十分棘手,由此,噬菌体的应用重新出现在大众视野。本研究意在筛选对多种致病性弧菌具有高效裂解性的宽谱噬菌体,并应用此类噬菌体制备成新型生物抑菌剂,来控制水产品养殖和加工过程中致病性弧菌的繁殖和污染。（1）从海鱼、淡水鱼、贝类宰杀污血水样品中分离纯化得到27株弧菌噬菌体,6株弧菌噬菌体透射电镜下形态分别为短尾噬菌体科和肌尾噬菌体科两类。经裂解谱测定,得噬菌体VppYZU-Y1和噬菌体OY-1裂解谱最宽,在pH5.0～12.0条件下噬菌体的稳定性较好,属于耐碱不耐酸型;50℃～80℃条件下噬菌体活性逐步降低。对噬菌体进行最佳感染复数、一步生长曲线的测定,挑选得到出稳定性好,裂解能力强的噬菌体。（2）采用全基因组测序的方法测定噬菌体的基因信息。噬菌体OY-1的全基因组信息未找到同源噬菌体,判断该噬菌体为新噬菌体。噬菌体OY-1的基因组全长为43479 bp,其中编码基因总长度分别为38403 bp,平均长度分别为936.66 bp,占总长的88.33%,GC含量为49.26%,有41个开放阅读框（ORFs）。己知编码基因中有DNA聚合酶等调控核酸代谢和表达的基因、主要衣壳蛋白等结构蛋白基因、蛋白酶裂解相关的基因等。未发现抗生素耐药基因以及毒力基因,为后续应用实验安全性提供理论依据。。（3）涂布测定弧菌正常生长与经噬菌体处理后的生长曲线,对比得出噬菌体对弧菌的跨种抑制效果。总菌落数均随着时间的延长而增加,噬菌体组总菌落数在培养过程中始终低于对照组,2株噬菌体对三种不同弧菌及混合菌都表现有明显抑制作用,尤其是噬菌体VppYZU-Y1对拟态弧菌CICC 21613前12 h抑制几乎达到0 CFU/mL,于8～12 h与对照组出现最大差值,噬菌体VppYZU-Y1效果普遍优于噬菌体OY-1。（4）结晶紫96孔板法测定噬菌体对弧菌的抗生物膜能力。结果经SPASS分析表明MOI在0.1及以上都有极显着效果,噬菌体VppYZU-Y1对副溶血性弧菌CICC 21617生物膜处理后OD600nm值下降90%左右;25℃和37℃温度下两株噬菌体及噬菌体混合液对三种单菌和混合弧菌均表现出极显着效果。表明在这两株噬菌体的干扰下,弧菌难以形成生物膜,以及形成生物膜后能被噬菌体有效去除。（5）弧菌污染在水产品加工中对产品品质及安全影响大,尤其鲭鱼科易受弧菌影响产生生物胺等安全问题,因此应用噬菌体联合乳酸菌发酵鲭鱼改善鱼肉品质。检测发酵鱼肉的微生物指标、TVBN、TBARS、pH、生物胺等,初步发现乳酸菌能提高发酵鱼品质,但在鱼块被弧菌污染的情况下,由于发酵初期由于乳酸菌生长代谢慢但弧菌生长速度快因此不能及时控制产品质量,应用分离的噬菌体联合乳酸菌共同作用于弧菌污染的鲭鱼,结果表明噬菌体在发酵鱼体系中对弧菌有明显抑制效果,且添加有噬菌体的实验组pH值一直低于对照组;TVBN值和TBARS值结果显示乳酸菌噬菌体联合组比其它组能更长时间的保持在限值以内。利用噬菌体前期高效裂解弧菌的特性联合乳酸菌能有效改善发酵鱼品质。
闫广谋[5]（2019）在《大肠杆菌噬菌体裂解酶突变体与融合蛋白Colicin-Lysep3的构建及其菌外裂解活性的研究》文中认为在动物生产及动物疾病防治中,经常发生不规范、超量使用抗生素的情况,诱使很多病原菌产生耐药性。“超级细菌”（多重耐药性的病原菌）的产生使细菌耐药问题变得更加复杂和严峻。细菌耐药性问题有愈演愈烈的趋势,已经严重威胁到公共卫生安全及人用抗生素资源。噬菌体裂解酶能高效、快速、特异地裂解耐药性病原菌,并且细菌对裂解酶不易产生耐受性。肽聚糖是细胞壁的骨架,裂解酶能催化肽聚糖,导致骨架断裂,细菌裂解。革兰氏阳性（G+）菌的肽聚糖在细胞壁的外层,裂解酶直接与之发生作用从而裂解细菌,因此针对G+菌噬菌体裂解酶制剂便于制备。但是,革兰氏阴性（G-）菌细胞壁外层是紧密的外膜蛋白,外膜蛋白仅允许小分子量的物质透过。阴性菌的肽聚糖在周质空间,因而裂解酶不能从菌外透过外膜接触肽聚糖裂解G-菌,阻碍了针对革兰氏阴性菌的裂解酶制剂的研发。本研究针对这一问题进行了研究,探索裂解酶透过G-菌外膜的方法,构建基因工程裂解酶从菌外杀灭大肠杆菌。对自然界中能透过G-菌外膜的大分子蛋白Colicin A、Lys AB2、SPN9CC、Lys PA26、D8进行生物信息学分析。将这5种已知蛋白的序列进行同源性分析、比对,发现它们的同源性不相关。因此推测,它们的跨膜功能与氨基酸序列无关。使用在线软件TMHMM分析它们跨膜区域的结构,使用在线软件Ex PASy对它们进行理化性质分析,利用在线软件SWISS-MODEL进行了同源模建、三级结构预测。发现这几种蛋白的共同点是,在某个区域或末端带正电荷数的氨基酸与疏水性氨基酸比例较高。因此推测在裂解酶末端修饰疏水性氨基酸、带正电荷氨基酸能帮助裂解酶透过G-菌细胞外膜。为了验证推测是否正确,进行了实验研究。首先对裂解酶C端修饰疏水性氨基酸单因素对其透过细胞外膜影响进行了研究。前期研究的噬菌体裂解酶Lysep3不能从菌外裂解大肠杆菌,以Lysep3为基础分别在它的C端修饰上不同疏水性氨基酸Ile、Val、Leu、Phe、Ala,构建了疏水指数分别为1.711、2.311、2.889、4.089、4.089的5种融合裂解酶Lysep3-3、Lysep3-5、Lysep3-7、Lysep3-12a、Lysep3-12b。其中Lysep3-12a、Lysep3-12b疏水指数相同,氨基酸序列不同。原核表达并纯化了这5种融合裂解酶。实验显示它们在p H=5和浓度1.75μg/m L时裂解细胞活性最强。Lysep3-12a、Lysep3-12b的裂解细胞能力相同,说明裂解酶的活性与氨基酸序列无关。研究表明,裂解酶C端的疏水性氨基酸,能帮助噬菌体裂解酶从菌外裂解大肠杆菌,且融合裂解酶裂解G-菌的能力与C端修饰的疏水性氨基酸的数量相关,修饰的数量越多其杀菌能力愈强。在Lysep3的C端修饰上KRKRK 5个阳离子氨基酸构建成融合裂解酶Lysep3-5aa,修饰KRKRKRKRKR 10个阳离子氨基酸构建成融合裂解酶Lysep3-10aa,同样的方法修饰KRKRKRKRKRKRKRK15个阳离子氨基酸构建成融合裂解酶Lysep3-15aa,它们的等电点分别为11.37、12.31、12.48。原核表达并纯化上述融合裂解酶,分别与大肠杆菌作用后,发现它们都有一定的杀菌能力,并且杀菌能力和C端修饰的带正电氨基酸数呈正相关。其中,融合裂解酶Lysep3-15aa杀菌活性较好,并能对沙门氏菌、志贺杆菌、绿脓杆菌有一定的杀菌能力。根据以上实验数据,在Lysep3 C端修饰一定数量的疏水性氨基酸、带正电氨基酸;为了增强其识别大肠杆菌的能力,在其N端与大肠杆菌素识别区BR进行融合修饰,构建而成Colicin-Lysep3。原核表达并纯化了Colicin-Lysep3。电镜下观察Colicin-Lysep3能使大肠杆菌细胞壁裂解,细胞内容物外泄,部分细胞形成菌影。Colicin-Lysep3在p H=5时杀菌性能最强。同时它也表现出肽类杀菌剂一般的特点,杀菌性能与剂量、时间有一定的关系。灌服Colicin-Lysep3的小鼠,在小肠前段目标大肠杆菌含量与对照组相比平均减少10.70%;小肠后段减少3.23%,盲肠减少2.63%。进一步研究表明,Colicin-Lysep3杀菌机制是:其识别区域与大肠杆菌进行结合后,在C端电荷及疏水性氨基酸帮助下,裂解酶透过外膜接触肽聚糖,对其乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4糖苷键发生催化反应,使之断裂,细胞壁骨架破裂,在胞内压力的作用下,细菌内容物外泄而死亡。直接将Colicin-Lysep3用于饲料添加剂,成本高昂。本研究采用无痕迹、二次同源重组的方法,将分离的一株抗逆性好的枯草芽孢杆菌的Spo0 A基因替换成Colicin-Lysep3基因,构建工程菌株△B.subtilis。△B.subtilis表达Colicin-Lysep3,并将其分泌到菌外,△B.subtilis具有体内外杀灭大肠杆菌的功能。综上,在大肠杆菌噬菌体裂解酶C端修饰疏水性氨基酸,带电荷氨基酸,能帮助其从菌外裂解G-菌;在一定范围内,末端添加的疏水性氨基酸、带电荷氨基酸的数量与其透过外膜的能力成正比例。为制备从菌外裂解G-菌基因工程噬菌体融合裂解酶提供了理论基础。
沈俊涛[6]（2019）在《基于CRISPR-Cas的肺炎克雷伯杆菌的噬菌体抗性：生物信息学分析和工程菌构建》文中进行了进一步梳理噬菌体感染是微生物发酵工业面临的一个棘手问题,至今仍无良策。本研究致力于探索基于CRISPR-Cas技术的噬菌体感染问题的解决方案。本文以肺炎克雷伯杆菌为例,从噬菌体的分离与分析开始,探究了天然CRISPR-Cas系统与（前）噬菌体之间的相互作用关系,建立了基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑技术,探索了增强CRISPR-Cas9的噬菌体抗性水平的方法。本文的研究既包括利用公共数据库中的资源从生物信息学的角度进行的理论分析,也有从实验的角度对相关问题进行的探索论证。主要研究结果如下:首先,对感染肺炎克雷伯杆菌工业发酵菌株的噬菌体进行了分离、生理特性和基因组分析,并考察了噬菌体感染对1,3-丙二醇发酵过程的影响。系统进化树的分析结果显示,噬菌体phiKpS2属于Kp34属肺炎克雷伯杆菌噬菌体,是一类在自然界分布广泛的克雷伯杆菌噬菌体。发酵实验表明,噬菌体感染会导致发酵长时间停滞,发酵周期延长,生产效率降低。此外,发现噬菌体感染对细胞生长和代谢的影响与感染时细胞所处生长阶段有密切关系。其次,对肺炎克雷伯杆菌的CRISPR-Cas系统和前噬菌体进行了系统的生物信息学分析。鉴定出了一种新的Ⅰ型CRISPR亚型,命名为I-E*,并对其基本特征包括在染色体上的位置、基因的组织结构、Cas蛋白、tracrRNA的结构、PAM位点和进化来源等进行了确定;CRISPR间隔序列主要来源于噬菌体、前噬菌体和质粒,提示其主要功能是防止外来遗传元件入侵。揭示了前噬菌体是肺炎克雷伯杆菌基因组可塑性的重要原因之一;在全球范围内流行的CG258型菌株含有较多高度保守的前噬菌体,包括其特有的两个P2-P4噬菌体系统;肺炎克雷伯杆菌染色体上的获得型抗生素抗性基因（aARGs）集中存在于CG258型和CRISPR 阳性菌株中,其中CG258型菌株的aARGs有60%位于前噬菌体区域,而CRISPR 阳性菌株的aARGs仅有10%位于前噬菌体区域,显示CRISPR-Cas系统和CG258的前噬菌体可能分别独立地参与了ARG在染色体上的整合。发现CRISPR-Cas系统和前噬菌体的分布都依赖与菌株的MLST分型,且CRISPR中存在高比例的自我靶向的间隔序列:这些可能是在肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统对前噬菌体的存在影响有限的原因。接着,对5株潜在肺炎克雷伯杆菌工业菌株的前噬菌体诱导性进行了检测,对其中一株菌的前噬菌体诱导过程进行了定量分析,并对诱导出的两个前噬菌体进行了全基因组分析。实验结果显示,肺炎克雷伯杆菌在丝裂霉素C（MMC）诱导下易发生前噬菌体大量增殖,细胞裂解死亡。其中,肺炎克雷伯杆菌W3的基因组中有2个可诱导的前噬菌体,且存在自发诱导现象。诱导出的噬菌体PKPW3.1和PKPW3.3在NCBI phage数据库中没有同源噬菌体,说明是新的噬菌体类型。对前噬菌体携带的tRNA分析显示,PKPW3.1和PKPW3.3中含有三种tRNA（tRNA-Arg,tRNA-Asn,tRNA-Thr）,是肺炎克雷伯杆菌前噬菌体中最常见的tRNA类型。前噬菌体在基因组中的高丰度、可诱导性及自发诱导性,说明在以肺炎克雷伯杆菌为基础的发酵工业中前噬菌体是导致噬菌体感染的风险因素之一。然后,建立了一种基于CRISPR-Cas9的肺炎克雷伯杆菌噬菌体基因组编辑技术。揭示了30-60 bp的短同源臂可以高效地实现包括点突变、基因删除和插入、移码突变在内的多种遗传操作,从而大大简化了基于CRISPR-Cas的噬菌体基因组编辑中繁琐的模板构建过程。通过对177个sgRNA的预测活性与实际测定活性的相关性分析,证实来源于真核生物的sgRNA预测模型不能用来预测针对噬菌体的sgRNA活性。揭示了低活性的sgRNA也可以用来进行基于同源重组的噬菌体基因组编辑,通过移码突变可以快速的判断噬菌体基因的必需性;并以噬菌体phiKpS2为例,通过移码突变和基因删除等,对其17%的基因的必需性进行了初步验证。最后,分析了针对噬菌体的sgRNA的活性分布,考察了噬菌体从单一靶标和多靶标CRISPR-Cas系统中逃逸的机制,发现通过表达Mu Gam干扰噬菌体DNA双链断裂修复可显着增强CRISPR-Cas系统噬菌体抗性。在针对噬菌体的sgRNA中,活性低的sgRNA数量较多。在177个sgRNA中,活性最低的那部分,即EOP>0.1的sgRNA约占49.7%,而EOP<10-4,即活性最高的那部分sgRNA仅占4.5%。噬菌体有多种逃逸CRISPR-Cas系统的方式,包括非同源末端接合、同源重组和靶向区域的大片度删除。5个sgRNAs串联的多靶标CRISPR-Cas系统可促进靶向区域的大片段删除,但没有显着增强菌株的噬菌体抗性。发现Mu Gam蛋白可显着增强CRISPR-Cas系统噬菌体抗性,且这种增强效应对不同活性的sgRNA均适用。表达Mu Gam后噬菌体逃逸的方式发生了改变,逃逸噬菌体中野生型和发生靶向区域大片段删除的突变体都增加了。未来在对肺炎克雷伯杆菌发酵菌株选育的过程中需要进行前噬菌体的诱导性检测,或考虑开发基于CRISPR-Cas系统的前噬菌体清除技术;另外,通过对噬菌体双链断裂修复机制的深入研究,未来可以设计更好的干扰策略来防止噬菌体逃逸。
牛冬燕[7]（2009）在《应用噬菌体控制牛及其饲养环境中大肠杆菌O157：H7的研究》文中认为食源性致病菌一大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）已成为危害人类健康的严重世界性公共卫生问题。牛及其饲养环境是大肠杆菌O157:H7的主要寄居场所及重要的传播源,在饲养场建立切实可行的控制策略可以有效地从源头上降低甚至完全消除致病菌的流行,减少和切断致病菌通过食物链和环境污染等途径传播,从而保障人类健康。目前,控制动物个体及其饲养环境中的病原菌尚无有效方法。本论文主要通过动物实验及体外裂解实验考察噬菌体的体内控制效果、裂解能力和宿主范围,并通过探索牛及其饲养环境中天然噬菌体的分布特性、变化规律及在同一生态系统中噬菌体与大肠杆菌O157:H7之间的相互作用关系,探讨和评价在饲养场实施噬菌体控制策略的有效性和可行性,为保障食品源头安全和环境安全创建一个高效、绿色、安全、无公害的生物防治平台。以攻毒感染公牛为模型,选用直肠粪样法和直肠肛门连接处粘液拭子法监测大肠杆菌O157:H7的排泄量/检出率,考察四株噬菌体（rV5、wV7、wV8和wV11）口服给药的控制效果。综合对照组和给药组的检测结果,粪样的总阳性率（78.9%,202/256）显着高于拭子样本（62.9%,161/256;P＜0.01）,二者之间的检测一致性为一般到中等（fairto moderate,κ=0.36～0.45）;给药组口服噬菌体后,大肠杆菌O157:H7的总排泄量显着降低（P＜0.05）。粪样法比拭子法更能准确和有效地监测噬菌体的控制效果,口服四株噬菌体的混合制剂降低了牛大肠杆菌O157:H7的总排泄量。以加拿大阿尔伯塔（Alberta）地区商业化肉牛和奶牛饲养场及临床病例分离获得的422株大肠杆菌O157:H7菌株为研究对象,采用噬菌体分型技术和脉冲场电泳技术（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）鉴定牛源分离株的噬型特征和基因型,通过建立微孔板分析法计算噬菌体裂解分离株的感染复数,评价噬菌体的宿主谱和裂解能力。噬菌体wV7、wV8、rV5和wV11的宽噬率分别为100%、96.4%、81.0%和76.1%;wV7裂解分离株的感染复数最低（0.004～0.006,P＜0.0001）,其次为rV5和wV11（0.002～0.04,P＜0.0001）,wV8最高（25～29,P＜0.0001）;牛源分离株对rV5、wV11和wV8的易感性与其噬型和/或PFGE基因型有关。研究表明噬菌体的宿主谱和裂解能力的评价指标感染复数应同时作为筛选治疗性噬菌体的标准;口服给药的四株噬菌体可以有效裂解大部分受检菌株,不同饲养场的菌株对噬菌体wV8表现出不同的易感性,发现噬菌体rV5、wV11和wV8的易感性受其噬菌体表型和/或PFGE基因型影响,而噬菌体wV7的宿主谱和裂解能力不受菌株的噬菌体表型和PFGE基因型的影响,能够高效裂解所有受检分离株。自2007年5～11月,采用初筛法和富集法从加拿大阿尔伯塔省南部两家商业化肉牛饲养场采集的个体直肠粪样、新鲜地面粪样、水槽中的饮用水和沉淀物样本（简称饮水样）以及地面粪尿泥浆样本中检测和分离天然大肠杆菌O157:H7噬菌体。噬菌体的总检出率为28.0%（239/855）,其中粪尿泥浆样本检出率显着高于其它样本,达94.6%（35/37,P＜0.001）;地面粪样中噬菌体的检出率呈周期性振荡变化,其中5月份最高（P＜0.05）;另外,统计学分析显示若噬菌体在环境中的检出率较高时,大肠杆菌O157:H7在牛群中的检出率则较低（P＜0.01）,Pearson相关性分析表明,同一个体粪样中噬菌体和大肠杆菌O157:H7的存在呈负向相关（r=-0.11,P＜0.05）。噬菌体广泛存在于牛场的动物个体及其周围环境中,粪尿泥浆中噬菌体的检出率高于地面粪样和饮水样,地面粪样中噬菌体检出率与大肠杆菌O157:H7呈现类似的周期性振荡变化规律;统计学分析显示存在于动物个体及其环境中的噬菌体均能显着降低大肠杆菌O157:H7在牛群中的检出率。综上,本论文证明了噬菌体控制大肠杆菌O157:H7的有效性和可行性,初步揭示了饲养牛的生态系统中天然噬菌体检出率的变化规律为周期性振荡,统计分析表明了天然噬菌体能够降低致病菌在牛群中的检出率,为噬菌体控制策略在商业化饲养场的真正实施提供了可靠的事实依据和理论支持,开启了应用绿色、安全、无公害的生物防治手段有效保障食品源头安全和环境安全的先河。
毕晓泽[8]（2019）在《大菱鲆溶藻弧菌噬菌体制剂制备及其应用效果评价》文中研究指明大菱鲆（Scophthalmus maximus L）是我国北方沿海地区主要养殖的经济名贵鱼类,具有极高的营养价值和商业价值。但随着大菱鲆养殖产业的日益发展,以弧菌为病原菌的细菌性病害也越来越严重,且此病一旦发生,病鱼死亡率可高达15%以上。噬菌体这种天然抑菌剂绿色、安全、环保,相对于传统的抗生素药物具有不引发耐药性、不残留、对环境无污染等优点。本研究以溶藻弧菌噬菌体PVA1为主要研究对象,考察其治疗效果和安全性,并研制出一种可常温保存的溶藻弧菌噬菌体制剂,同时对其应用效果进行评价。主要工作内容如下:（1）验证了溶藻弧菌对大菱鲆的致病性,并对由溶藻弧菌引起的大菱鲆弧菌病的治疗效果进行考察,结果显示:溶藻弧菌浸浴攻毒半数致死量为7.85′106 CFU/mL,腹腔攻毒半数致死量为1.52′106 CFU/g;浸浴攻毒治疗时MOI≈10即浓度为2.66′107PFU/mL为最佳治疗浓度;腹腔注射攻毒治疗结果为MOI≈10实验组治疗效果明显。（2）溶藻弧菌噬菌体PVA1急、亚慢性腹腔攻毒实验结果显示,急性腹腔注射攻毒中100倍治疗浓度的溶藻弧菌噬菌体不会引起大菱鲆短期内死亡,并未检测出溶藻弧菌噬菌体LC50;为期1个月的亚慢性腹腔注射攻毒对实验大菱鲆生存率、体重体长无明显影响;本部分实验对大菱鲆各项血浆生化、肝脏、肾脏和脾脏组织细胞无显着性影响。（3）对大蒜素在常温下对噬菌体的保藏作用进行研究,研发出一种溶藻弧菌噬菌体制剂其配方为:含有4.32′107 PFU/mL噬菌体、0.1250 mg/mL大蒜素、2.5mmol/mLNaCl和5.0 mmol/mL MgCl2,并对其应用效果进行评价结果显示本噬菌体制剂实验组大菱鲆生存率为70.00%,与5 mg/L强力霉素（Doxycycline）实验组76.7%生存率无显着性差异。
丛聪,袁玉玉,王丽丽,李晓宇,李淑英,徐永平[9]（2019）在《噬菌体在食品应用中的安全性》文中提出近几年来,经食物传播的细菌性感染疾病处于增多的趋势,各国早已开始密切关注食品安全的问题。噬菌体是细菌的天敌,在很早之前已被人们用来治疗各种细菌性疾病,近几十年来噬菌体在食品工业上的应用也显示出广阔的前景,尤其是在即食食品领域可作为食品添加剂来杀灭食源性致病菌。噬菌体本身具有的宿主特异性特点也说明它是保障食品安全的理想工具。但消费者心中依旧存在很多顾虑和排斥,噬菌体本身是否会对人体有害?噬菌体具有哪些潜在的风险?……为了消除大众对于噬菌体的误解,本文旨在探讨噬菌体自身安全性的问题,并对噬菌体在食品工业中的应用前景进行探讨。
朱孔福[10]（2019）在《金黄色葡萄球菌噬菌体80αSak结构生物学研究和光修复酶phr相关蛋白表达纯化》文中提出第一部分:金黄色葡萄球菌噬菌体80α Sak的结构生物学研究Sak蛋白最早是在乳酸链球菌噬菌体u136中鉴定并命名的,与其它噬菌体来源的重组酶构成Sak家族。u136 Sak是目前唯一得到结构解析的Sak家族蛋白,电镜负染结构表明其为11聚体圆环状结构,与人源Rad52蛋白N端结构域类似,被认为是Rad52的早期进化源蛋白之一。根据序列、结构或功能上的相似性,Sak家族被划为Rad52-like超家族,Sak家族蛋白的相关研究,有利于揭示Rad52类似蛋白的作用机制。金黄色葡萄球菌是一种人类致病菌,最近在金黄色葡萄球菌噬菌体80α基因组复制研究中,鉴定得到80α Sak蛋白,根据序列和功能上的相似性,该蛋白被划入Sak家族,并且与人源Rad52端N结构域在体外功能上类似,可能是人源Rad52蛋白的同源蛋白。Rad52是双链DNA断裂（DSB）修复的核心蛋白之一,可以以Rad51依赖型和Rad51非依赖型两种方式参与DSB的同源重组修复。为阐明Rad52的具体作用机制,人源Rad52 N端及其与核酸复合物的晶体结构得到解析。研究结果显示,Rad52在溶液状态下,呈11聚体环状结构,内部疏水,表面亲水并含两个DNA结合位点。无规则构象的单链DNA首先结合外结合位点,在一定作用力下打开β夹子,滑落至内结合位点。在该位点,Rad52与核酸磷酸骨架相互作用,使其形成利于配对的B型结构,完成退火反应。冷冻电镜图片结果符合11聚体圆环结构,但在单链DNA加入后,Rad52组装形成较多复杂的圆环或类圆环的网络堆积,目前其组装机制并无详细报导。由于人源Rad52蛋白在过去近20年的研究中无论从电镜还是晶体的角度都未能成功阐明圆环结构到圆环堆积结构的组装机制,且本实验室长期致力于金葡菌相关蛋白研究,故而我们拟以金葡菌噬菌体80α Sak为研究对象,对其电镜结构进行解析。在本文中,我们从进化、结构及功能上确定了 80α Sak与人源Rad52 N端是同源蛋白,并使用冷冻电镜对80α Sak溶液结构进行了三维重构。重构结果表明80α Sak在溶液中以单环、螺旋环和双环三种结构存在,且双环存在“面对面”和“背对面”两种构象。动态光散射、静态光散射和分子排阻层析实验对重构结果进行了支撑。DNA与80α Sak孵育后的负染结构表明,双环结构是圆环堆积体的主体结构单元。故我们认为在溶液状态,单环结构是80αSak的主体结构,部分单环结构可经过螺旋结构过渡形成双环结构,双环结构可组装成较低聚集度的圆环堆积链,加入单链DNA后,圆环堆积链聚集度提升,可能是80α Sak与核酸的主要作用形式。该发现,对更好的理解Rad52相关蛋白的作用机制有一定启发作用。第二部分:光修复酶phr相关蛋白的表达纯化太阳光紫外线对生物个体的影响是多面的。植物和自养微生物能利用太阳光合成糖类化合物,进而转化成其它活性物质或生物能。人体也能利用紫外线进行维生素D的转化合成。然而紫外线照射会引起CPD、6-4PP等多种类型的DNA光损伤。光修复系统在生物界保守,是光损伤修复的主要执行者。但人类等哺乳动物中并无光损伤修复系统,而是通过核苷酸切除反应去除损伤位点,修复过程较长,效率较低,造成CPD累积引发人体皮炎、皮疹、黑色素堆积甚至皮肤癌。为应对太阳光紫外线损伤,常用方法为涂抹防晒霜。但由于目前所用防晒品具有一定的限制,我们希望通过在己知具有较高修复活性的植物或藻类中寻求合适的光修复系统进行研究,为其作为防晒品添加剂的工业化应用奠定基础。通过文献查阅和数据库检索,我们拟对具有300多年食用历史的钝顶螺旋藻进行光修复酶蛋白的纯化和酶活测定。在本研究中,我们对钝顶螺旋藻光修复酶phr及其突变体蛋白和大肠杆菌phr蛋白进行了大肠杆菌表达系统的表达纯化,以大肠杆菌phr为阳性对照,确定了钝顶螺旋藻phr同时具有单链和双链DNA损伤修复活性,相关蛋白的表达纯化和酶活研究为钝顶螺旋藻phr更深层次的机制研究提供样品,为其工业化应用奠定基础。
二、噬菌体的应用及其它（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、噬菌体的应用及其它（论文提纲范文）
（1）金黄色葡萄球菌噬菌体GH15及其裂解酶三维结构与分子作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 噬菌体作为治疗应用的研究概述 |
| 1.1 噬菌体概述 |
| 1.2 作为治疗和检测应用的噬菌体 |
| 1.3 噬菌体的制备 |
| 1.4 噬菌体的“鸡尾酒”疗法 |
| 1.5 噬菌体疗法的应用 |
| 第二章 噬菌体裂解酶的研究进展 |
| 2.1 噬菌体裂解酶概述 |
| 2.2 裂解酶的结构组成 |
| 2.3 裂解酶的三维结构 |
| 2.4 细菌对裂解酶产生抗性的可能 |
| 2.5 裂解酶的特异性 |
| 2.6 裂解酶应用的安全性 |
| 2.7 裂解酶应用的潜在风险 |
| 2.8 裂解酶与抗生素的协同作用 |
| 2.9 裂解酶的应用 |
| 2.10 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌及其噬菌体的分离鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 噬菌体 GH15 全基因组序列测定和分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 裂解酶 LYSGH15 的原核表达及体内外抑菌活性 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 裂解酶 LYSGH15 三维结构解析 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 裂解酶 LYSGH15 作用机制研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）噬菌体防控苗期刺参弧菌感染的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 刺参与刺参养殖业现状 |
| 1.1.1 刺参的生物学特征及其营养价值 |
| 1.1.2 刺参经济产业的发展与瓶颈分析 |
| 1.1.3 弧菌病与刺参腐皮综合征 |
| 1.1.4 刺参非特异性免疫 |
| 1.2 噬菌体简介 |
| 1.2.1 噬菌体重要里程碑式事件 |
| 1.2.2 噬菌体分类与生物学特性 |
| 1.2.3 弧菌噬菌体基因组研究 |
| 1.3 噬菌体防控主要水产养殖类致病菌 |
| 1.3.1 水产养殖业抗生素替代的必要性分析 |
| 1.3.2 噬菌体防控水产养殖类致病菌 |
| 1.3.3 噬菌体在水产养殖业中应用前景 |
| 1.3.4 噬菌体保藏 |
| 1.4 论文研究目的及内容 |
| 2 致病弧菌及其噬菌体的分离纯化与理化性质 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和设备 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验条件 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要仪器设备 |
| 2.2.5 引物合成 |
| 2.2.6 溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 病原菌的分离纯化 |
| 2.3.2 病原菌生理生化指标测定 |
| 2.3.3 病原菌形态学鉴定 |
| 2.3.4 病原菌分子生物学鉴定 |
| 2.3.5 病原菌的药敏分析 |
| 2.3.6 病原菌致病能力检测 |
| 2.3.7 宿主菌的非溶源性检测 |
| 2.3.8 裂解性噬菌体筛选分离纯化 |
| 2.3.9 噬菌体的扩增与浓缩 |
| 2.3.10 噬菌体效价测定 |
| 2.3.11 噬菌体形态学观察 |
| 2.3.12 噬菌体氯仿敏感性测试 |
| 2.3.13 噬菌体宿主谱测定 |
| 2.3.14 噬菌体吸附速率测定 |
| 2.3.15 噬菌体一步生长曲线测定 |
| 2.3.16 噬菌体的体外抑菌效率测定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 患病刺参的症状与病原菌菌落形态 |
| 2.4.2 两株病原菌的透射电镜观察 |
| 2.4.3 两株病原菌的生理生化指标 |
| 2.4.4 两株病原菌的亲缘关系确定 |
| 2.4.5 两株病原菌的药物敏感性 |
| 2.4.6 两株病原菌的半数致死量与半数致死浓度(LD_(50)) |
| 2.4.7 病原菌的非溶源性确定 |
| 2.4.8 噬菌体的噬菌斑形态 |
| 2.4.9 噬菌体透射电镜形态 |
| 2.4.10 噬菌体对氯仿的敏感性 |
| 2.4.11 噬菌体的宿主谱范围 |
| 2.4.12 噬菌体的吸附速率 |
| 2.4.13 噬菌体的一步生长曲线 |
| 2.4.14 噬菌体的体外抑菌效果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的全基因组测序与注释 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和主要仪器设备 |
| 3.2.1 实验菌株与噬菌体 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 vibrio phage Vc1和PVS3噬菌体颗粒的纯化与浓缩 |
| 3.3.2 CsCl等密度梯度离心及回收 |
| 3.3.3 两株噬菌体的全基因组DNA提取 |
| 3.3.4 DNA浓度与电泳纯度分析 |
| 3.3.5 两株噬菌体的全基因组测序 |
| 3.3.6 两株噬菌体基本生物信息学分析 |
| 3.3.7 两株噬菌体全基因组基因功能预测和蛋白图谱注释 |
| 3.3.8 噬菌体的主要功能基因比对与进化分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的全基因组DNA检测 |
| 3.4.2 高通量测序分析数据质检 |
| 3.4.3 高通量测序分析基因含量预测 |
| 3.4.4 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的基因分布结果 |
| 3.4.5 噬菌体vibrio phageVc1和PVS3的开放阅读框预测 |
| 3.4.6 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的Go数据库分析 |
| 3.4.7 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3基因组的功能基因确定 |
| 3.4.8 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3全基因组蛋白图谱 |
| 3.4.9 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的分类地位 |
| 3.4.10 噬菌体胞壁水解酶一级与二级蛋白结构 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 噬菌体应用剂型的制备及其防控效果评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和设备 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验用细菌菌株和噬菌体 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 仪器设备 |
| 4.2.5 饲料原料 |
| 4.2.6 试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 噬菌体针剂制备 |
| 4.3.2 噬菌体真空冷冻干燥处理最优保护剂选择 |
| 4.3.3 噬菌体浸浴制剂的制备 |
| 4.3.4 攻毒用嗜环弧菌VC1和灿烂弧菌VS-ABTNL的制备 |
| 4.3.5 噬菌体针剂对刺参的攻毒治疗效果考察 |
| 4.3.6 饲喂噬菌体的饲料制备与基础成分分析 |
| 4.3.7 饲喂噬菌体添加剂对刺参的攻毒保护效果考察 |
| 4.3.8 混合噬菌体制剂对刺参的攻毒保护效果考察 |
| 4.3.9 刺参养殖水体和刺参肠道噬菌体效价测定 |
| 4.3.10 噬菌体注射针剂的温度与pH耐受性检测 |
| 4.3.11 不同噬菌体制剂的长期保藏效果考察 |
| 4.3.12 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 不同保护剂冻干处理对噬菌体效价的影响 |
| 4.4.2 不同保护剂处理的噬菌体冻干粉的溶解时间 |
| 4.4.3 不同噬菌体冻干处理组的含湿量测定结果 |
| 4.4.4 噬菌体注射治疗效果 |
| 4.4.5 新型饲料基础成分分析 |
| 4.4.6 嗜环弧菌噬菌体饲喂保护效果 |
| 4.4.7 灿烂弧菌噬菌体饲喂保护效果 |
| 4.4.8 浸浴混合噬菌体对刺参的保护效果 |
| 4.4.9 饲喂实验中刺参养殖水体和肠道的噬菌体效价检测 |
| 4.4.10 浸浴实验中刺参养殖水体和肠道的噬菌体效价检测 |
| 4.4.11 噬菌体注射针剂对温度与pH的耐受性分析 |
| 4.4.12 不同噬菌体制剂长期保藏效果比对 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 施用噬菌体对刺参主要生理指标的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验动物及菌种、噬菌体 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器设备 |
| 5.2.4 试剂配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 高纯度噬菌体颗粒制备 |
| 5.3.2 刺参体腔细胞的提取与原代培养 |
| 5.3.3 噬菌体颗粒与刺参体腔细胞共培养 |
| 5.3.4 噬菌体对刺参吞噬活性影响的考察 |
| 5.3.5 噬菌体对刺参非特异免疫酶活影响的考察 |
| 5.3.6 饲喂噬菌体对刺参非特异免疫酶活影响的考察 |
| 5.3.7 苗期刺参体腔液样本酶活的测定 |
| 5.3.8 考察饲喂噬菌体对刺参生产状态影响 |
| 5.3.9 刺参肠道菌群高通量分析样品准备 |
| 5.3.10 生物菌群结构多样性分析 |
| 5.3.11 数据统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 刺参体腔细胞体外培养相对活性检测 |
| 5.4.2 体外共培养噬菌体对刺参体腔细胞的影响 |
| 5.4.3 噬菌体共培养对刺参吞噬细胞吞噬活性的影响 |
| 5.4.4 注射噬菌体对刺参主要非特异免疫酶活的影响 |
| 5.4.5 饲喂噬菌体对刺参非特异免疫酶活的影响 |
| 5.4.6 饲喂噬菌体对刺参生长状态的影响 |
| 5.4.7 饲喂噬菌体对刺参肠道菌群结构的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 嗜环弧菌vibrio phage Vcl ORF在线预测结果 |
| 附录B 灿烂弧菌vB_VspS_VS-ABTNL-3(PVS3)ORF在线预测结果 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（3）沙门氏菌的噬菌体试验性治疗及噬菌体抗性机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 沙门氏菌相关研究进展 |
| 1.1 沙门氏菌基本概况 |
| 1.2 沙门氏菌流行状况 |
| 1.3 沙门氏菌的分子分型方法 |
| 1.4 沙门氏菌感染导致的炎症反应 |
| 1.5 沙门氏菌抗生素的滥用和危害 |
| 1.6 沙门氏菌的耐药机制 |
| 1.6.1 质粒介导的耐药性传播-基因盒-整合子机制 |
| 1.6.2 抗生素靶标基因突变引起的耐药性 |
| 1.6.3 沙门氏菌的主动外排机制 |
| 1.6.4 沙门氏菌由于外膜通透性降低而产生的耐药性 |
| 1.7 抗生素的替代物 |
| 1.7.1 抗菌肽 |
| 1.7.2 中药制剂 |
| 1.7.3 益生菌 |
| 1.8 抗菌肽?中药制剂和益生菌的不足和缺点 |
| 1.8.1 抗菌肽 |
| 1.8.2 中药制剂 |
| 1.8.3 益生菌 |
| 2 噬菌体的研究进展 |
| 2.1 噬菌体的生物学分类 |
| 2.2 噬菌体的研究现状 |
| 2.2.1 噬菌体作为抗菌药物的优缺点 |
| 2.2.2 噬菌体的应用研究进展 |
| 2.3 细菌对噬菌体的防御策略 |
| 2.3.1 宿主阻止噬菌体吸附 |
| 2.3.2 宿主抑制噬菌体遗传物质的注入 |
| 2.3.3 阻断和抑制噬菌体基因组复制 |
| 2.3.4 流产感染系统(Abortive infection systems,Abi系统) |
| 2.3.5 群体感应(Quorum sensing)系统 |
| 第二章 沙门氏菌QH的分离筛选、基因组比较分析及小鼠感染模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样品和实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂和溶液 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1沙门氏菌分离鉴定和药敏实验 |
| 1.2.2 沙门氏菌全基因组测序 |
| 1.2.3 沙门氏菌密码子使用模式的计算 |
| 1.2.4 小鼠口服沙门氏菌感染模型建立和评估 |
| 2.结果 |
| 2.1 沙门氏菌分离鉴定、药敏实验和生长曲线 |
| 2.2 沙门氏菌QH的全基因组测序和分析 |
| 2.3 沙门氏菌QH的密码子使用模式分析 |
| 2.4 沙门氏菌QH感染后小鼠外周血中T淋巴细胞亚群的变化 |
| 2.5 沙门氏菌QH感染后小鼠体内细胞因子转录水平的变化 |
| 2.6 沙门氏菌QH感染后小鼠体内细胞因子表达水平的变化 |
| 3.讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 沙门氏菌噬菌体的分离、筛选及基因组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 沙门氏菌噬菌体的分离筛选 |
| 1.2.2 噬菌体的浓缩与超离 |
| 1.2.3 噬菌体的电镜观察 |
| 1.2.4 噬菌体的生物学特性研究 |
| 1.2.5 噬菌体基因组的提取 |
| 1.2.6 噬菌体基因组测序 |
| 1.2.7 噬菌体基因组的分析 |
| 1.2.8 噬菌体基因组在基因水平上的核苷酸使用模式分析 |
| 1.2.9 进化动力对噬菌体整体密码子使用模式的影响 |
| 1.2.10 噬菌体的相对同义密码子使用值的计算与分析 |
| 1.2.11 特定核苷酸skew在密码子使用偏好中的作用 |
| 1.2.12 通过噬菌体的同义密码子使用模式分析其遗传多样性 |
| 2 结果 |
| 2.1 噬菌体的分离筛选及形态学观察 |
| 2.2 噬菌体的生物学特性 |
| 2.3 噬菌体的基因组和进化特点分析 |
| 2.4 噬菌体基因水平上的核苷酸使用偏好性 |
| 2.5 突变压力和自然选择对噬菌体密码子整体使用模式的影响 |
| 2.6 Fine-tune翻译选择对同义密码子使用偏好的影响 |
| 2.7 自然选择对密码子使用偏好性的影响 |
| 2.8 噬菌体在密码子使用模式上的进化趋势 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 噬菌体对小鼠感染模型治疗效果的评估 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细菌、噬菌体和实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂和溶液 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 沙门氏菌的前期准备 |
| 1.2.2 噬菌体的透析 |
| 1.2.3噬菌体对沙门氏菌的裂解实验 |
| 1.2.4噬菌体对小鼠感染模型的治疗实验 |
| 1.2.5 噬菌体对小鼠感染模型的治疗效果评估 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 噬菌体对沙门氏菌的裂解实验结果 |
| 2.1.1 电镜观察噬菌体SP1对沙门氏菌QH吸附和裂解过程 |
| 2.1.2 噬菌体SP1对沙门氏菌QH的裂解效率 |
| 2.2 噬菌体对小鼠沙门氏菌感染后的治疗效果评估 |
| 2.2.1 小鼠外周血中CD4+和CD8+细胞亚群的变化 |
| 2.2.2 小鼠脾脏中细胞因子转录水平的变化 |
| 2.2.3 小鼠外周血中细胞因子表达水平的变化 |
| 2.2.4 小鼠健康状态的评估 |
| 2.2.5 小鼠脾脏载菌量的测定 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第五章 沙门氏菌QH对噬菌体SP1的抗性机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 噬菌体耐受突变株QHM的筛选 |
| 1.2.2 透射电镜观察噬菌体SP1对突变株QHM的吸附 |
| 1.2.3 噬菌体SP1的受体成分鉴定 |
| 1.2.4 突变株QHM全基因组测序及与沙门氏菌QH的基因组比较 |
| 1.2.5 PCR验证突变株QHM基因组上的rfaJ基因突变位点 |
| 1.2.6 沙门氏菌QH和突变株QHM脂多糖完整性鉴定 |
| 1.2.7 沙门氏菌QHΔrfaJ缺失株的构建及鉴定 |
| 1.2.8 缺失株QHΔrfaJ对噬菌体SP1 的抗性验证 |
| 1.2.9 沙门氏菌QH,突变株QHM与噬菌体SP1 之间的生长关系 |
| 1.2.10 波动试验 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 突变株的筛选和透射电镜观察 |
| 2.2 噬菌体SP1的受体成分鉴定 |
| 2.3 突变株QHM全基因组测序及与沙门氏菌QH基因组比较 |
| 2.4 沙门氏菌QH和突变株QHM脂多糖完整性鉴定 |
| 2.5 沙门氏菌QHΔrfaJ缺失株的构建及鉴定 |
| 2.5.1 pKD46电转后的鉴定 |
| 2.5.2 同源重组片段的制备 |
| 2.5.3 同源重组片段导入后阳性转化子的筛选与鉴定 |
| 2.5.4 缺失株QHΔrfaJ的筛选与鉴定 |
| 2.6 缺失株QHΔrfaJ对噬菌体SP1 的抗性验证 |
| 2.7 沙门氏菌QH,突变株QHM与噬菌体SP1 之间的生长关系 |
| 2.8 波动试验结果 |
| 3.讨论 |
| 本章小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（4）致病弧菌宽谱噬菌体的分离鉴定、生物特性和应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 水产品行业现状 |
| 1.2 鲭鱼概况 |
| 1.3 发酵酸鱼概况 |
| 1.4 水产品中致病弧菌种类及危害 |
| 1.4.1 拟态弧菌 |
| 1.4.2 副溶血性弧菌 |
| 1.4.3 溶藻弧菌 |
| 1.4.4 创伤弧菌 |
| 1.5 水产品中致病弧菌的传统防治措施 |
| 1.5.1 食品生产中的控制措施 |
| 1.5.2 临床治疗及其耐药株的流行 |
| 1.6 噬菌体生物学特性 |
| 1.6.1 噬菌体分类 |
| 1.6.2 噬菌体的生长过程 |
| 1.6.3 噬菌体抗菌作用 |
| 1.6.4 噬菌体的应用 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 宽谱噬菌体的分离 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基与溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 噬菌体的分离 |
| 2.2.2 噬菌体的纯化 |
| 2.2.3 噬菌体的增殖 |
| 2.2.4 噬菌体效价的测定 |
| 2.2.5 噬菌体的保存 |
| 2.2.6 噬菌体的电镜观察 |
| 2.2.7 噬菌体特异性与裂解谱测定 |
| 2.2.8 噬菌体pH稳定性的测定 |
| 2.2.9 噬菌体热稳定性的测定 |
| 2.2.10 噬菌体最佳感染复数的测定 |
| 2.2.11 噬菌体一步生长曲线的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 噬菌体的分离纯化 |
| 2.3.2 噬菌体透射电镜结果 |
| 2.3.3 噬菌体裂解谱测定结果 |
| 2.3.4 噬菌体的pH稳定性 |
| 2.3.5 噬菌体的热稳定性 |
| 2.3.6 噬菌体的最佳感染复数 |
| 2.3.7 噬菌体的一步生长曲线 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 噬菌体全基因组测序 |
| 3.1 材料与设备 |
| 3.1.1 宿主菌 |
| 3.1.2 噬菌体 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器与设备 |
| 3.1.5 培养基与溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 噬菌体粗颗粒的提取 |
| 3.2.2 噬菌体颗粒的纯化 |
| 3.2.3 噬菌体基因组DNA的提取 |
| 3.2.4 噬菌体基因组DNA序列的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 噬菌体颗粒的纯化 |
| 3.3.2 噬菌体DNA样品检测 |
| 3.3.3 噬菌体基因组概述 |
| 3.3.4 噬菌体编码基因功能分析 |
| 3.3.5 噬菌体基因组安全性评估 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 宽谱噬菌体对弧菌的抑制作用研究 |
| 4.1 材料与设备 |
| 4.1.1 菌株来源 |
| 4.1.2 噬菌体 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 培养基与溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 宽谱噬菌体对不同种单一敏感株的跨种抑制 |
| 4.2.2 宽谱噬菌体对混合敏感株的跨种抑制 |
| 4.2.3 噬菌体对生物被膜的抑制 |
| 4.2.3.1 不同MOI下噬菌体对宿主菌生物被膜的抑制 |
| 4.2.3.2 单一噬菌体对不同敏感株生物被膜的抑制 |
| 4.2.3.3 混合噬菌体对不同敏感株生物被膜的抑制 |
| 4.2.4 噬菌体对生物被膜的去除 |
| 4.2.4.1 单一噬菌体对不同敏感株生物被膜的去除 |
| 4.2.4.2 混合噬菌体对不同敏感株生物被膜的去除 |
| 4.2.5 噬菌体对生物被膜的抑制观察 |
| 4.2.5.1 生物膜表面弧菌菌落计数 |
| 4.2.5.2 扫描电镜观察噬菌体对生物膜的去除作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 宽谱噬菌体对不同种单一敏感株的跨种抑制 |
| 4.3.2 宽谱噬菌体对混合敏感株的跨种抑制 |
| 4.3.3 噬菌体对生物被膜的抑制 |
| 4.3.3.1 不同MOI下噬菌体对宿主菌生物被膜的抑制 |
| 4.3.3.2 单一噬菌体对不同敏感株生物膜的抑制 |
| 4.3.3.3 混合噬菌体对不同敏感株生物被膜的抑制 |
| 4.3.4 噬菌体对生物被膜的去除 |
| 4.3.4.1 单一噬菌体对不同敏感株生物被膜的去除 |
| 4.3.4.2 混合噬菌体对不同敏感株生物被膜的去除 |
| 4.3.5 噬菌体对生物被膜的抑制观察 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 噬菌体联合乳酸菌发酵鲭鱼的应用研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌种来源 |
| 5.1.2 噬菌体来源 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 培养基与溶液配置 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 发酵鲭鱼样品的制备 |
| 5.2.2 琼脂平板测定发酵鱼细菌总数 |
| 5.2.3 MRS测定发酵鱼乳酸菌总量 |
| 5.2.4 TCBS测定发酵鱼弧菌总量 |
| 5.2.5 发酵酸鱼中噬菌体效价的测定 |
| 5.2.6 发酵鱼pH值测定 |
| 5.2.7 发酵鱼TVBN(挥发性碱性氮)测定 |
| 5.2.8 发酵鱼TBARS(脂质过氧化)测定 |
| 5.2.9 发酵鱼生物胺测定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 乳酸菌发酵鲭鱼过程中微生物及理化性质的变化 |
| 5.3.1.1 菌落数测定 |
| 5.3.1.2 pH值 |
| 5.3.1.3 挥发性碱性氮(TVBN) |
| 5.3.1.4 脂质过氧化(TBARS) |
| 5.3.1.5 生物胺(BA) |
| 5.3.2 弧菌污染对发酵鲭鱼品质影响 |
| 5.3.2.1 菌落数测定 |
| 5.3.2.2 pH值 |
| 5.3.2.3 挥发性碱性氮(TVBN) |
| 5.3.2.4 脂质过氧化(TBARS) |
| 5.3.2.5 生物胺(BA) |
| 5.3.3 噬菌体乳酸菌发酵鲭鱼体系中对弧菌的抑制作用 |
| 5.3.3.1 菌落数测定 |
| 5.3.3.2 噬菌体效价 |
| 5.3.3.3 pH值 |
| 5.3.3.4 挥发性碱性氮(TVBN) |
| 5.3.3.5 脂质过氧化(TBARS) |
| 5.3.3.6 生物胺(BA) |
| 5.4 本章小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间研究成果 |
（5）大肠杆菌噬菌体裂解酶突变体与融合蛋白Colicin-Lysep3的构建及其菌外裂解活性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 噬菌体及其裂解酶在应对细菌耐药性中的优势与不足 |
| 1 细菌耐药性问题的严重性促进了噬菌体及其裂解酶的研究 |
| 2 噬菌体生物学特性及其裂解细菌的机制 |
| 3 噬菌体的生物学特性具有替代抗生素制剂的特点 |
| 4 噬菌体制剂在治疗疾病的临床试验及应用 |
| 5 噬菌体制剂面临的问题 |
| 第二章 革兰氏阳性菌裂解酶制剂的研究进展 |
| 1 革兰氏阳性菌噬菌体裂解酶制剂的研究进展 |
| 2 分子生物学技术能推进噬菌体及裂解酶制剂的发展 |
| 3 总结 |
| 第三章 从菌外裂解革兰氏阴性菌的噬菌体裂解酶研究进展 |
| 1 革兰氏阴性菌细胞壁的结构阻碍了裂解酶从菌外裂解细菌 |
| 2 天然透过革兰氏阴性菌外膜蛋白的蛋白质、肽 |
| 3 采用物理方法帮助裂解酶透过细菌外膜 |
| 4 化学透膜剂协同裂解酶透过细胞外膜 |
| 5 人工合成裂解酶 |
| 6 总结 |
| 第四章 食品安全级表达外源蛋白枯草芽孢杆菌工程菌的研究进展 |
| 1 枯草芽孢杆菌启动子的一般特性及提高转录的策略 |
| 2 合适的信号肽是分泌表达的关键 |
| 3 提高分泌系统功能的方法 |
| 4 枯草芽孢杆菌外分泌蛋白酶影响了目标蛋白的产量 |
| 5 构建高通量表达蛋白基因工程菌株的技术策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 穿透革兰氏阴性菌细胞外膜天然蛋白和肽的生物信息学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 修饰裂解酶C端疏水性氨基酸及其对大肠杆菌杀菌活性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 修饰裂解酶C端带正电荷氨基酸对裂解大肠杆菌菌活性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 融合裂解酶Colicin-Lysep3 的构建及其杀菌机制的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 表达Colicin-Lysep3 的枯草芽孢杆菌基因突变株的构建及其体内外杀菌活性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 论文发表及科研成果 |
| 致谢 |
（6）基于CRISPR-Cas的肺炎克雷伯杆菌的噬菌体抗性：生物信息学分析和工程菌构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩写表 |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 噬菌体 |
| 1.1.1 噬菌体研究简史 |
| 1.1.2 噬菌体的感染和繁殖机制 |
| 1.1.3 噬菌体与宿主之间的相互作用 |
| 1.1.3.1 宿主的噬菌体抗性机制 |
| 1.1.3.2 噬菌体的适应机制 |
| 1.1.4 噬菌体的宿主谱 |
| 1.2 前噬菌体 |
| 1.3 CRISPR-Cas系统 |
| 1.4 肺炎克雷伯杆菌 |
| 1.4.1 肺炎克雷伯杆菌感染与防治 |
| 1.4.2 肺炎克雷伯杆菌生产生物基化学品的研究进展 |
| 1.4.3 肺炎克雷伯杆菌的噬菌体、前噬菌体及CRISPR-Cas系统 |
| 1.5 工业发酵过程中的噬菌体感染与防治 |
| 1.5.1 噬菌体感染及危害 |
| 1.5.2 噬菌体感染防治现状 |
| 1.5.2.1 污染源的控制 |
| 1.5.2.2 菌株轮换使用 |
| 1.5.2.3 传统的基因工程策略 |
| 1.5.3 基于CRISPR-Cas系统的噬菌体抗性策略 |
| 1.6 论文选题及设计思想 |
| 2 一株感染产1,3-丙二醇克雷伯杆菌的噬菌体的分离与分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验使用的菌株、噬菌体及实验条件 |
| 2.2.2 噬菌体的分离与纯化 |
| 2.2.3 噬菌体形态的透射电镜测定 |
| 2.2.4 噬菌体基因组提取和限制性内切酶分析 |
| 2.2.5 噬菌体最佳感染复数的测定 |
| 2.2.6 噬菌体吸附速率的测定 |
| 2.2.7 噬菌体一步生长曲线的测定 |
| 2.2.8 噬菌体的温度、pH、紫外照射敏感性测定 |
| 2.2.9 噬菌体效价及发酵产物的分析方法 |
| 2.2.10 噬菌体phiKpS2全基因组测序及基因注释 |
| 2.2.11 生物信息学分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 噬菌体的分离及形态 |
| 2.3.2 噬菌体的限制性内切酶分析 |
| 2.3.3 噬菌体感染动力学 |
| 2.3.4 噬菌体的稳定性 |
| 2.3.5 噬菌体感染对肺炎克雷伯杆菌生长的影响 |
| 2.3.6 噬菌体感染对肺炎克雷伯杆菌发酵产1,3-丙二醇的影响 |
| 2.3.7 噬菌体phiKpS2的基因组注释与分析 |
| 2.3.8 噬菌体phiKpS2的比较基因组分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统和前噬菌体的生物信息学分析及诱导性前噬菌体的检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验所用菌种及其分型方法 |
| 3.2.2 CRISPR-Cas系统、前噬菌体和抗生素抗性基因的鉴定 |
| 3.2.3 CRISPR-Cas间隔序列来源与系统特征分析 |
| 3.2.4 前噬菌体的诱导 |
| 3.2.5 透射电镜分析 |
| 3.2.6 细菌及噬菌体基因组提取 |
| 3.2.7 基因组测序与注释 |
| 3.2.8 RT-PCR分析 |
| 3.2.9 基因组比对与可视化方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统的多样性和组织结构 |
| 3.3.2 肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas新亚型I-E~*的来源分析 |
| 3.3.3 CRISPR间隔序列与克雷伯杆菌MLST型 |
| 3.3.4 CRISPR间隔序列的来源 |
| 3.3.5 肺炎克雷伯杆菌CRISPR系统中存在的自我靶向的间隔序列 |
| 3.3.6 前噬菌体在肺炎克雷伯杆菌中的分布 |
| 3.3.7 肺炎克雷伯杆菌及前噬菌体的比较基因组分析 |
| 3.3.8 CG258型肺炎克雷伯杆菌中几个特征性前噬菌体 |
| 3.3.9 前噬菌体与CRISPR-Cas系统的相互作用 |
| 3.3.10 前噬菌体与染色体编码的抗生素基因的关系 |
| 3.3.11 肺炎克雷伯杆菌前噬菌体可诱导性检测 |
| 3.3.12 前噬菌体诱导性的定量分析 |
| 3.3.13 可诱导前噬菌体的基因组分析 |
| 3.3.14 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细菌、噬菌体和培养条件 |
| 4.2.2 质粒构建方法 |
| 4.2.3 sgRNA活性的评估 |
| 4.2.4 重组噬菌体的分离与分析方法 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 构建适用于肺炎克雷伯杆菌的SpCas9-sgRNA系统 |
| 4.3.2 评估sgRNA在基于CRISPR-Cas9的噬菌体抗性中的活性 |
| 4.3.3 不同CRISPR靶点的噬菌体突变模式比较 |
| 4.3.4 噬菌体phiKpS2的基因组编辑 |
| 4.3.4.1 通过短同源臂进行噬菌体点突变 |
| 4.3.4.2 通过短同源臂进行噬菌体基因的删除和交换 |
| 4.3.4.3 噬菌体基因的移码突变 |
| 4.3.4.4 弱sgRNA用于噬菌体基因组删除及可能的机制 |
| 4.3.5 通过基因编辑对phiKpS2中几个基因必要性的初步确定 |
| 4.3.6 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 基于CRISPR-Cas9增强细菌噬菌体抗性的策略 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 细菌、噬菌体和培养条件 |
| 5.2.2 sgRNA活性的评估 |
| 5.2.3 质粒构建方法 |
| 5.2.4 重组噬菌体的分离与分析方法 |
| 5.2.5 数据分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 sgRNA在噬菌体抗性中的活性分布 |
| 5.3.2 单靶标CRISPR-Cas9系统的噬菌体抗性 |
| 5.3.3 多靶标CRISPR-Cas9系统的噬菌体抗性 |
| 5.3.4 Mu Gam可显着增强CRISPR-Cas9系统的噬菌体抗性 |
| 5.3.5 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（7）应用噬菌体控制牛及其饲养环境中大肠杆菌O157：H7的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 大肠杆菌O157:H7的研究进展 |
| 1.1.1 大肠杆菌O157:H7的发现及起源 |
| 1.1.2 大肠杆菌O157:H7基因的进化和演变 |
| 1.1.3 大肠杆菌O157:H7的生物学特性及发病机制 |
| 1.1.4 大肠杆菌O157:H7的流行病学 |
| 1.1.5 牛—大肠杆菌O157:H7主要的寄主动物 |
| 1.1.6 大肠杆菌O157:H7的其它寄主动物 |
| 1.1.7 控制牛感染大肠杆菌O157:H7的策略 |
| 1.2 噬菌体的研究进展 |
| 1.2.1 噬菌体的发现 |
| 1.2.2 噬菌体的类型 |
| 1.2.3 早期噬菌体治疗的研究 |
| 1.2.4 噬菌体控制细菌感染的研究进展 |
| 1.2.5 大肠杆菌O157:H7噬菌体的研究进展 |
| 1.2.6 应用噬菌体防治或控制细菌性感染的优势 |
| 1.2.7 噬菌体疗法可能的应用方式及范围 |
| 1.3 本论文的研究意义和主要工作 |
| 参考文献 |
| 2 饲养牛口服裂解性大肠杆菌O157:H7噬菌体的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及设备 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 菌种及噬菌体 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 仪器 |
| 2.2.5 溶液配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 混合菌悬液的制备、纯化及浓度测定 |
| 2.3.2 混合噬菌体悬液的制备及其效价的测定 |
| 2.3.3 牛攻毒及口服噬菌体治疗试验 |
| 2.3.4 直肠粪便及直肠肛门连接处粘液拭子样本的采集 |
| 2.3.5 大肠杆菌O157:H7的检测 |
| 2.3.6 噬菌体的检测 |
| 2.3.7 数据处理 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 不同试验组大肠杆菌O157:H7浓度的变化 |
| 2.4.2 不同采样方法对于大肠杆菌O157:H7阳性检出率的影响 |
| 2.4.3 粪样法和拭子法检测大肠杆菌O157差异的比较 |
| 2.4.4 不同试验组噬菌体阳性率的比较 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 噬菌体口服给药的有效性和可行性 |
| 2.5.2 噬菌体口服给药存在的问题 |
| 2.5.3 评价噬菌体控制效果方法的选择 |
| 2.6 小结 |
| 参考文献 |
| 3 四株大肠杆菌O157:H7裂解性噬菌体宿主谱及裂解能力的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及设备 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 菌种及噬菌体 |
| 3.2.3 试剂 |
| 3.2.4 仪器 |
| 3.2.5 溶液及培养基配置 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 采样计划 |
| 3.3.2 样品采集 |
| 3.3.3 大肠杆菌O157:H7的检测 |
| 3.3.4 待测牛源大肠杆菌O157:H7分离株噬菌体表型的鉴定 |
| 3.3.5 待测牛源大肠杆菌O157:H7分离株基因表型的鉴定 |
| 3.3.6 高效价噬菌体的制备 |
| 3.3.7 微孔板分析法测定噬菌体宿主范围和裂解能力 |
| 3.3.8 数据处理 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 牛源大肠杆菌O157:H7分离株对四株噬菌体的易感性 |
| 3.4.2 比较噬菌体对不同饲养场的分离株的裂解能力 |
| 3.4.3 人源大肠杆菌O157:H7分离株对四株噬菌体的易感性 |
| 3.4.4 噬菌体对牛源和人源分离株裂解能力的比较 |
| 3.4.5 比较噬菌体裂解能力之间的相关性 |
| 3.4.6 大肠杆菌O157:H7分离株对噬菌体的易感性与其PFGE基因型的相关性 |
| 3.4.7 大肠杆菌O157:H7对噬菌体的易感性与其表型的比较 |
| 3.4.8 大肠杆菌O157:H7分离株的PFGE基因型与其噬菌体表型的相关性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 噬菌体的特异性识别吸附与宿主谱 |
| 3.5.2 噬菌体的裂解能力 |
| 3.5.3 治疗性噬菌体的筛选标准 |
| 3.5.4 大肠杆菌O157:H7分离株的多样性 |
| 3.6 小结 |
| 参考文献 |
| 4 商业化肉牛饲养场中天然大肠杆菌O157:H7噬菌体的检出率及其对大肠杆菌O157:H7的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料及设备 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 菌种 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.2.4 仪器 |
| 4.2.5 溶液配置 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 实验设计及饲养场选用 |
| 4.3.2 样本采集 |
| 4.3.3 噬菌体样本预处理 |
| 4.3.4 噬菌体的检测和分离 |
| 4.3.5 大肠杆菌O157:H7的检测 |
| 4.3.6 数据处理及统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 噬菌体的检出率 |
| 4.4.2 地面粪样中噬菌体检出率的变化规律 |
| 4.4.3 大肠杆菌O157:H7和噬菌体的检出率 |
| 4.4.4 初筛法和富集法对噬菌体检测分离的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 不同类型样本中噬菌体的检出率及其变化规律 |
| 4.5.2 牛及其饲养环境中噬菌体和大肠杆菌O157:H7之间的相互作用 |
| 4.5.3 富集法与初筛法对噬菌体检出率的比较和评价 |
| 4.6 小结 |
| 参考文献 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 创新点摘要 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）大菱鲆溶藻弧菌噬菌体制剂制备及其应用效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 大菱鲆养殖现状 |
| 1.1.1 大菱鲆简介 |
| 1.1.2 大菱鲆细菌性疾病简介 |
| 1.2 溶藻弧菌简介 |
| 1.2.1 水产养殖中常见的弧菌病及其病原菌 |
| 1.2.2 溶藻弧菌 |
| 1.3 噬菌体在水产中的应用及其安全性 |
| 1.3.1 噬菌体简介 |
| 1.3.2 噬菌体在水产养殖中的应用 |
| 1.3.3 噬菌体安全性 |
| 1.4 噬菌体保藏方法 |
| 1.4.1 噬菌体保藏方法 |
| 1.4.2 植物提取物在水产中的应用 |
| 1.4.3 大蒜素简介 |
| 1.5 本论文研究意义 |
| 1.6 本论文研究思路 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 噬菌体治疗大菱鲆溶藻弧菌感染效果研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验条件 |
| 2.2.3 实验菌种 |
| 2.2.4 实验噬菌体 |
| 2.2.5 引物合成 |
| 2.2.6 实验主要试剂 |
| 2.2.7 实验溶液的配制 |
| 2.2.8 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 病原菌活化 |
| 2.3.2 溶藻弧菌的分子生物学鉴定 |
| 2.3.3 攻毒用溶藻弧菌制备 |
| 2.3.4 半数致死量(LD50)测定 |
| 2.3.5 噬菌体扩增 |
| 2.3.6 噬菌体效价测定 |
| 2.3.7 噬菌体浓缩 |
| 2.3.8 大菱鲆溶藻弧菌攻毒的噬菌体治疗实验 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 溶藻弧菌的分子生物学鉴定实验结果 |
| 2.4.2 病原菌半数致死量(LD_(50))实验结果 |
| 2.4.3 大菱鲆溶藻弧菌攻毒的噬菌体治疗实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 溶藻弧菌噬菌体PVA1 安全性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验动物与养殖条件 |
| 3.2.2 实验主要试剂 |
| 3.2.3 实验溶液配制 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 噬菌体浓缩纯化 |
| 3.3.2 溶藻弧菌噬菌体急性腹腔注射攻毒实验 |
| 3.3.3 溶藻弧菌噬菌体亚慢性腹腔注射攻毒实验 |
| 3.3.4 麻醉与解剖 |
| 3.3.5 血清生化检验 |
| 3.3.6 组织切片制作 |
| 3.3.7 HE染色 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 溶藻弧菌噬菌体急性腹腔注射攻毒实验结果 |
| 3.4.2 溶藻弧菌噬菌体亚慢性腹腔注射攻毒实验结果 |
| 3.4.3 血清生化检验实验结果 |
| 3.4.4 溶藻弧菌噬菌体亚慢性腹腔攻毒组织切片观察实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 可常温保存的溶藻弧菌噬菌体制剂制备 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验动物与养殖条件 |
| 4.2.2 实验主要试剂 |
| 4.2.3 实验溶液配制 |
| 4.2.4 实验主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大蒜素(40%)最小抑菌浓度(MIC)测定法 |
| 4.3.2 溶藻弧菌噬菌体制剂制备 |
| 4.3.3 溶藻弧菌噬菌体制剂应用效果评价 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 大蒜素(40%)最小抑菌浓度(MIC)测定实验结果 |
| 4.4.2 溶藻弧菌噬菌体制剂制备实验结果 |
| 4.4.3 溶藻弧菌噬菌体制剂应用效果评价实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）噬菌体在食品应用中的安全性（论文提纲范文）
| 1 前言 |
| 2 噬菌体概述 |
| 3 噬菌体在食品工业中的应用 |
| 3.1 原料采集时杀灭病原菌 |
| 3.2 生产及加工环节的消毒 |
| 3.3 原料消毒并延长食品储藏期 |
| 3.4 检测食源性致病菌 |
| 4 已开发的食品级噬菌体制剂产品 |
| 5 噬菌体的特征 |
| 5.1 宿主特异性 |
| 5.2 增殖能力强 |
| 5.3 安全无毒副作用 |
| 5.3.1 自然界中广泛存在 |
| 5.3.2 对肠道菌群无害 |
| 5.3.3 有长期使用的历史 |
| 6 噬菌体对食源性致病菌的裂解机制 |
| 7 噬菌体的潜在风险 |
| 7.1 噬菌体的溶原现象 |
| 7.2 噬菌体的转导作用 |
| 7.3 出现抗噬菌体菌株 |
| 8 总结 |
（10）金黄色葡萄球菌噬菌体80αSak结构生物学研究和光修复酶phr相关蛋白表达纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 金黄色葡萄球菌噬菌体80α Sak结构生物学研究 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 金黄色葡萄球菌噬菌体80α Sak蛋白的发现 |
| 1.2 Sak家族蛋白简介 |
| 1.2.1 Sak家族划分 |
| 1.2.2 Sak家族蛋白研究现状 |
| 1.3 DNA双链断裂修复 |
| 1.4 Rad52蛋白参与同源重组的机制研究 |
| 1.5 本篇拟解决问题 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 基因克隆及质粒构建 |
| 2.1.1 基因克隆 |
| 2.1.2 PCR产物回收 |
| 2.1.3 酶切和连接 |
| 2.1.4 感受态细胞制备 |
| 2.1.5 连接子转化及扩增 |
| 2.1.6 阳性克隆鉴定 |
| 2.2 重组蛋白的表达纯化 |
| 2.2.1 80α Sak蛋白的表达 |
| 2.2.2 80α Sak蛋白的纯化 |
| 2.3 80α Sak的进化分析及结构预测 |
| 2.4 80α Sak蛋白活性检测 |
| 2.4.1 等温滴定量热实验 |
| 2.4.2 80α Sak蛋白单链退火活性检测 |
| 2.5 电镜观察与数据收集 |
| 2.5.1 负染样品的制备 |
| 2.5.2 冷冻样品的制备 |
| 2.5.3 冷冻样品的数据收集 |
| 2.5.4 图像处理及模型构建 |
| 2.6 80α Sak蛋白颗粒大小及聚集状态检测 |
| 2.6.1 动态光散射(DLS)实验 |
| 2.6.2 静态光散射(SLS)实验 |
| 2.6.3 S200分子筛标定实验 |
| 2.7 80α Sak蛋白与ssDNA复合物的负染观察 |
| 第3章 实验结果与讨论 |
| 3.1 基因克隆和重组质粒构建 |
| 3.2 重组蛋白的表达鉴定和分离纯化 |
| 3.3 80α Sak蛋白与Rad52相关蛋白进化关系分析 |
| 3.4 80 αSak与人源Rad52的结构比对与活性鉴定 |
| 3.4.1 80α Sak与人源Rad52的结构比对 |
| 3.4.2 80α Sak的活性鉴定 |
| 3.5 80αSak蛋白单颗粒负染样品制备及结果分析 |
| 3.6 80α Sak单颗粒冷冻电镜数据处理及结果分析 |
| 3.7 80αSak聚集状态的生化表征 |
| 3.8 80α Sak与单链DNA复合物负染分析 |
| 本篇小结 |
| 参考文献 |
| 第二篇 光修复酶phr相关蛋白表达纯化 |
| 第4章 综述 |
| 4.1 DNA光损伤简介 |
| 4.2 DNA光损伤修复途径简介 |
| 4.3 光修复酶简介 |
| 4.4 DNA光损伤防护措施 |
| 4.5 本篇拟解决问题 |
| 第5章 实验材料与方法 |
| 5.1 基因克隆及质粒构建 |
| 5.1.1 基因克隆 |
| 5.1.2 PCR产物回收及Gibson连接 |
| 5.1.3 连接子转化及扩增 |
| 5.1.4 阳性克隆鉴定 |
| 5.2 重组蛋白的表达纯化 |
| 5.2.1 重组蛋白的表达 |
| 5.2.2 重组蛋白的纯化 |
| 5.3 钝顶螺旋藻光修复酶phr的单/双链嘧啶二聚体修复活性测定 |
| 第6章 实验结果与讨论 |
| 6.1 基因克隆和重组质粒构建 |
| 6.2 重组蛋白的表达鉴定和分离纯化 |
| 6.3 钝顶螺旋藻光修复酶phr的单/双链嘧啶二聚体修复活性测定 |
| 本篇小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果 |
四、噬菌体的应用及其它（论文参考文献）
- [1]金黄色葡萄球菌噬菌体GH15及其裂解酶三维结构与分子作用机制研究[D]. 顾敬敏. 吉林大学, 2014(10)
- [2]噬菌体防控苗期刺参弧菌感染的研究[D]. 李振. 大连理工大学, 2018(02)
- [3]沙门氏菌的噬菌体试验性治疗及噬菌体抗性机制研究[D]. 韩生义. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [4]致病弧菌宽谱噬菌体的分离鉴定、生物特性和应用研究[D]. 欧阳敏. 扬州大学, 2019(02)
- [5]大肠杆菌噬菌体裂解酶突变体与融合蛋白Colicin-Lysep3的构建及其菌外裂解活性的研究[D]. 闫广谋. 吉林大学, 2019(02)
- [6]基于CRISPR-Cas的肺炎克雷伯杆菌的噬菌体抗性：生物信息学分析和工程菌构建[D]. 沈俊涛. 大连理工大学, 2019(01)
- [7]应用噬菌体控制牛及其饲养环境中大肠杆菌O157：H7的研究[D]. 牛冬燕. 大连理工大学, 2009(10)
- [8]大菱鲆溶藻弧菌噬菌体制剂制备及其应用效果评价[D]. 毕晓泽. 大连理工大学, 2019(03)
- [9]噬菌体在食品应用中的安全性[J]. 丛聪,袁玉玉,王丽丽,李晓宇,李淑英,徐永平. 国外医药(抗生素分册), 2019(05)
- [10]金黄色葡萄球菌噬菌体80αSak结构生物学研究和光修复酶phr相关蛋白表达纯化[D]. 朱孔福. 中国科学技术大学, 2019(02)