一、抗牛T细胞表面抗原单克隆抗体的鉴定（论文文献综述）
高嫦娥[1]（2021）在《PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究》文中研究指明研究背景与目的靶向T细胞抑制性检测点肿瘤免疫治疗是当今生物医学研究的最热点。研究表明,利用单抗药物直接作用于PD-1可以有效地阻断抑制性免疫检测点,激活T细胞,增强T细胞的功能,达到治疗肿瘤的目的。在机体的免疫系统中,肠道由于接触抗原的表面积最大并且免疫细胞数量较多,因而被认为是体内最大的免疫器官[1],发生于结直肠的恶性肿瘤与免疫逃逸有关。本研究利用CRISPR/Cas9技术对T细胞PD-1基因进行靶向敲除,采用小鼠结肠癌模型进行PD-1基因敲除的T细胞的体内抗肿瘤作用及其可能机制研究,采用非人灵长类动物食蟹猴作为实验动物,高度模拟PD-1基因敲除T细胞在体内的安全性评价,以期建立利用CRISPR/Cas9技术靶向T细胞PD-1基因进行肿瘤细胞免疫治疗的策略,进而为临床研究的实施奠定坚实的实验基础。第一章:小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其机制研究第一部分:小鼠PD-1基因敲除T细胞的建立及其体外抑制肿瘤的作用[方法]在GENEBANK数据库中查找获得小鼠PD-1基因序列,设计靶向小鼠PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体。分离获得小鼠外周血PBMC,富集细胞数量为1×107,加入敲除PD-1基因的PX458敲除载体5μg,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术和T7E1酶切验证PD-1基因的敲除。体外培养结直肠癌细胞株CT-26,分为:阴性对照组:CT-26细胞组、PD-1基因敲除T细胞组,实验组:CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除的T细胞及PD-1单抗共培养组。绘制各组细胞生长曲线,细胞杀伤检测试剂盒检测PD-1基因敲除的T细胞的杀伤能力,通过流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比例的变化及体外分泌细胞因子的水平变化。[结果]成功获得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表达载体,建立小鼠PD-1基因敲除T细胞,对其体外特性进行检测,结果显示:流式细胞仪检测PD-1基因敲除T细胞CD3、CD4、CD8比例无明显变化;PD-1基因敲除T细胞与结直肠癌细胞株CT-26在不同效靶比作用下体外抑制肿瘤效应结果显示:各组细胞生长曲线示:与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,72小时细胞活率明显下降,与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,与肿瘤细胞共培养后:IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平增加。[结论]建立了稳定的体外定向敲除T细胞抑制性免疫检测点PD-1的技术,获得了小鼠同种异体PD-1基因敲除T细胞,体外实验显示,可抑制肿瘤细胞的生长,为体内抗肿瘤的研究奠定了基础。第二部分:小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及可能机制[方法]培养结直肠癌细胞株CT-26,制备小鼠结直肠癌移植瘤模型;实验分组分别为模型对照组（经尾静脉注射PBS）、阴性对照组（经尾静脉注射未经基因敲除的T细胞）、PD-1基因敲除T细胞组（经尾静脉注射PD-1基因敲除的T细胞）、PD-1单抗组（经尾静脉注射PD-1单抗）,观察结直肠癌移植瘤模型中各组小鼠体重,活动度,生存期等,绘制小鼠生存率曲线;处死各组中小鼠,分别取肝,肺和肠等组织进行病理学分析;分离MLNs、脾脏淋巴细胞,采用流式细胞仪检测MLNs、脾脏CD4+,CD8+T细胞,Treg细胞比例,ELISA法检测MLNs、血清中肿瘤免疫相关细胞因子的分泌水平变化。[结果]与模型对照组相比较,同种异体PD-1基因敲除T细胞可抑制结直肠癌荷瘤小鼠原位移植瘤的生长及向肝脏和肺部的转移,延长了小鼠的存活时间。PD-1基因敲除T细胞回输结直肠荷瘤小鼠,ELISA结果显示,与同模型对照组、阴性对照组相比较,PD-1基因敲除T细胞回输组MLNs和血清中IFN-y,TNF-α和IL-12的水平增加,IL-6无明显变化,IL-17水平减少。在结直肠癌小鼠PD-1基因敲除T细胞回输后,PD-1敲除组小鼠的CD44+CD62L-记忆T细胞比例明显提升,CD4+FoxP3+调节性T细胞比例降低。[结论]同种异体PD-1基因敲除T细胞在结直肠癌中显示出体内抑制肿瘤转移的作用,且可能通过依赖CD8+T细胞在结直肠癌中发挥抗肿瘤作用。第二章:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性评价第一部分:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的建立及其生物学特性[方法]在GENEBANK数据库中搜索食蟹猴PD-1基因序列,设计靶向食蟹猴PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的sgRNA表达载体;分离培养食蟹猴PBMC,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术及T7E1酶切鉴定PD-1基因的敲除。在细胞因子刺激下诱导食蟹猴T细胞增殖,定期观察细胞形态变化及集落形成并计数,绘制食蟹猴PD-1基因敲除T细胞生长曲线,FACS检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞周期、凋亡,CCK-8法检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞增殖,以及食蟹猴PD-1基因敲除T细胞表面特征分子的表达,通过ELISA法检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞分泌的IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2水平。[结果]成功获得了靶向食蟹猴PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向食蟹猴PD-1基因的敲除重组表达载体sgRNA/Cas9,成功培养了食蟹猴PD-1基因敲除的T细胞,细胞生长周期为28天,生长曲线呈S形,符合Logistic生长曲线。CCK-8法检测结果显示,与未经敲除PD-1基因的T细胞相比较,PD-1基因敲除的T细胞增殖未受到抑制,生长曲线基本与未经敲除PD-1基因的T细胞相同;流式细胞仪检测T细胞表型无改变,具有杀伤性作用的CD8+T细胞所占比例有所升高;细胞周期及凋亡检测结果显示:与未经敲除PD-1基因的T细胞相比较,PD-1基因敲除的T细胞G0/G1期,S期,G2/M期比例两者无统计学差异,早期凋亡、死亡细胞比例两者无统计学差异。ELISA法对细胞因子IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2进行检测,结果显示:PD-1基因敲除的T细胞释放细胞因子与相同培养条件下,未进行PD-1敲除的T细胞释放细胞因子量统计学无差异。[结论]抑制性检查点基因PD-1的破坏导致PD-1表达的降低,但在体外培养期间不影响PD-1基因敲除T细胞的活力、PD-1基因敲除T细胞特征标志物的表达、PD-1基因敲除T细胞凋亡和PD-1基因敲除T细胞周期,且扩增的PD-1基因敲除T细胞也不影响具有细胞因子表达的能力,为其体内安全性评价奠定基础。第二部分:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性评价[方法]多次富集PD-1基因敲除T细胞后,经静脉回输入食蟹猴体内,参照人细胞因子诱导的淋巴细胞回输有效剂量（2×107/kg）,溶解于100ml 0.9%氯化钠注射液中,对照组经静脉注射100ml/（kg·次）0.9%氯化钠注射液,每3d上午同一时间给药1次,共给药3次,分别在回输后4h,24h,48h,1w,2w,3w,4w直到100天抽取外周血,流式细胞仪检测CD3,PD-1的表达,观察各组食蟹猴体重,活动度等一般情况,监测血常规、血生化,ELISA法检测各组食蟹猴Th1:IL-2、IL-12、IFN-γ;Th2:IL-4、IL-10;炎症细胞因子:TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子水平的变化,并分别取肝、肺、骨髓、脾脏、胸腺、甲状腺、垂体、肾上腺、睾丸等组织进行病理学分析,观察其毒性反应。[结果]将PD-1基因敲除的T细胞回输到食蟹猴体内,PD-1基因敲除的T细胞未显示出对其体重、活动度等一般情况的影响,血液学检查指标:白细胞数、单核细胞数与对照组相比,均未出现明显变化;生化学检查指标:总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、谷草转移酶、谷丙转移酶、尿素氮、肌酐等与对照组相比,均未出现明显变化;组织病理学分析显示没有与输注的PD-1基因敲除T细胞相关的损伤;流式细胞术监测外周血中PD-1基因敲除的T细胞的体内持久性为两个月。[结论]我们的研究结果证明了食蟹猴用于评估PD-1基因敲除T细胞免疫治疗安全性的效用,并为基于T细胞的过继免疫治疗提供了新的策略。
高明春[2]（2021）在《IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制》文中认为牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza 3 virus,BPIV3）是引起犊牛呼吸道感染的重要病原体之一,世界各国的牛群感染BPIV3的抗体阳性率通常在50%到90%之间。BPIV3可感染肺上皮细胞与肺泡巨噬细胞,发生组织损伤和免疫抑制,随后继发细菌感染导致严重的支气管肺炎。IL10（Interleukin10,IL10）是极少数具有强大的负调节功能的抗炎性细胞因子,上皮细胞、单核巨噬细胞等都是IL10发挥抑制性作用的靶细胞。许多病毒感染后依靠多种途径诱导宿主IL10表达来负调控宿主免疫应答,IL10负调控免疫应答的相关机制在HIV（Human immunodeficiency virus）、FMDV（Foot-and-Mouth disease virus）、LCMV（Lymphocytic choroid meningitis virus）、PCV2（Porcine circovirus type 2）、PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）等病毒的致病机制中发挥重要作用,BPIV3感染中IL10是否及如何调控免疫应答尚未清楚。本研究分离BPIV3流行毒株并分析其致病特征,证实BPIV3流行株能够感染牛与鼠的上皮细胞与单核巨噬细胞。建立小鼠呼吸道感染模型与鼠原代巨噬细胞感染模型。以小鼠与原代巨噬细胞的高通量转录组数据证实BPIV3可能利用IL10及其重要的下游产物SOCS3（Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）下调宿主的抗感染免疫应答。随后开展了牛IL10、IL10R1、SOCS3的生物学活性与作用机制研究,证实牛IL10与IL10受体结合转导信号,激活JAK-STAT3通路来迅速高表达SOCS3,在小鼠与牛细胞上都具有类似的生物学活性。最终探索了BPIV3主要依赖My D88、p38 MAPK以及NF-κB信号通路来表达IL10,负调控宿主抗病毒应答并提高BPIV3复制能力的相关机制。本研究为阐明IL10/STAT3/SOCS3信号轴在BPIV3感染中的致病作用和抑制IL10通路防制牛呼吸道传染病奠定了理论基础。首先对2017年黑龙江省、河北省等地的群发犊牛肺炎1793份血清进行了BPIV3的抗体调查,结果表明近70%的犊牛呼吸道疾病可部分归因于BPIV3所参与的感染。随后自病牛鼻拭子中分离到了一株BPIV3,其具有感染MDBK、BHK21、BBEC、BL、BTB、BT、ML、PBMC、BMDM等牛与小鼠多种上皮细胞与单核巨噬细胞的能力。分离株经呼吸道感染小鼠肺脏并对其进行了致病性的分析,感染鼠肺脏发生病理变化,并且肺内病毒在12 d内不能够被完全清除,感染肺脏发生了多种炎性因子的表达,检测到重要的调节性抑炎性因子IL10在感染后的12 d之内,大多数检测时间点的转录均显着高于对照。通过高通量转录组测序、差异表达分析与基因富集及蛋白质相互作用网络分析,在小鼠与原代巨噬细胞感染BPIV3前后重要宿主免疫与调控分子的变化模式。BPIV3感染小鼠与感染巨噬细胞后,在感染早期显着上调了IL10与SOCS3表达,SOCS3几乎在所有分组中都得到了显着的转录激活。大多数组别中Tyk2、STAT1、STAT2、IRF7、ISG15、Mx1、RSAD2、PML等关键抗感染免疫基因被显着下调,IL10与SOCS3参与了BPIV3感染后抑制宿主抗病毒应答。为进一步研究牛IL10的信号转导以及其是否能发挥免疫负调控作用,克隆了牛IL10、牛IL10R1与SOCS3基因并分析其生物信息与进化保守性。对IL10、IL10R1胞外区与SOCS3进行了蛋白表达与纯化,并制备了相应的高效价抗体。采用腺病毒系统表达了牛IL10、IL10R1胞外区,然后在牛与鼠细胞上证实重组IL10可快速并强烈诱导SOCS3的表达,这种作用可以被IL10R1胞外区所抑制。IL10与SOCS3都具有抑制Ⅰ型干扰素及其下游分子表达的功能,即牛IL10与SOCS3可用于牛与鼠细胞的负免疫调控研究,而IL10R1胞外区可作为IL10通路的阻断剂。进一步探讨BPIV3感染中IL10参与负调控的相关机制,研究表明BPIV3以时间与剂量依赖性的方式诱导原代巨噬细胞与肺上皮细胞在感染极早期迅速上调IL10的m RNA并大量分泌IL10蛋白,同时TNF-α与Ⅰ型干扰素及其下游蛋白Mx1的表达受到了显着的抑制。IL10在原代巨噬细胞中的产量远高于上皮细胞,外源与内源性的IL10都可提高BPIV3的滴度。IL10R1胞外区作为游离的受体竞争掉IL10或抑制剂阻断IL10产生的通路都能降低病毒的复制能力。在My D88（Myeloid differentiation factor,MYD88）缺失与My D88抑制剂处理的BMDM细胞上,IL10/SOCS3的表达大幅降低,表明依赖My D88分子转导信号的通路在BPIV3感染过程中诱导IL10的表达起到了重要作用。此外,应用通路抑制剂证实NF-κB和p38 MAPK在BPIV3诱导IL10表达中为关键通路。JAK-STAT通路中的多种JAK与STAT分子均参与IL10与BPIV3之间复杂的调控作用。综上所述,BPIV3是我国犊牛传染性肺炎的主要病原之一,感染后可显着上调IL10与SOCS3的表达并引起宿主免疫抑制,主要下调以Ⅰ型干扰素及其下游分子介导的抗病毒应答,这种由IL10介导的负调控依赖于My D88、NF-κB和p38 MAPK信号通路。本研究可为进一步阐明BPIV3的分子致病机制与开发以调控IL10为靶标的免疫防控提供理论基础。
奚溪[3]（2021）在《靶向EGFR Ⅲ结构域新纳米抗体筛选及其重组表达系统的比较研究》文中提出目的:通过分析靶向EGFR的单克隆抗体与纳米抗体的抗原表位与它们导致的EGFR内化、下调的关系,发现了EGFR III结构域是它们共同的抗原表位。与单价纳米抗体相比,双特异性的纳米抗体能更有效的促进EGFR内化入胞,通过偶联可携带成像探针或者小分子毒素药物入胞,因此双特异性纳米抗体是更有开发价值的肿瘤靶向分子。为了开发不同抗原表位的双特异性纳米抗体,对抗原表位的分析,靶向EGFR的配对抗体西妥昔与抗体H11能最有效促进EGFR内化和下调。因此对能同时阻断西妥昔与H11的靶向EGFR III结构域纳米抗体进行筛选。方法:新纳米抗体的筛选通过抗原的重组表达、噬菌体免疫文库的建立、分子对接对抗原表位的预测以及纳米抗体的重组表达四个部分进行。第一部分研究为构建免疫原,通过两种策略对EGFR III结构域进行重组表达,并验证重组EGFR III结构域与抗体H11的亲和力来确定其是否可以作为免疫原使用;第二部分研究为噬菌体免疫文库建立与筛选,通过免疫双峰骆驼产生强烈的免疫反应来构建免疫文库,将纳米抗体片段转入噬菌体展示质粒。共构建了两个噬菌体文库,通过生物淘选、SPR高通量亲和力测序、抗原表位特异性筛选,筛选出特定EGFR III结构域抗原表位的全新纳米抗体,通过同源建模对获得新纳米抗体的结构与EGFR III结构域进行分子对接,对其抗原表位与抗原决定簇进行预测。第三部分研究为重组表达系统对纳米抗体活性的影响,通过大肠杆菌与毕赤酵母两种表达系统对两种靶向EGFR III结构域的纳米抗体进行重组表达,并通过液质联用、亲和力测定和荧光成像技术对不同表达系统获得的纳米抗体进行比较和评价。第四部分研究为对筛选出的全新纳米抗体进行重组表达,通过偶联荧光分子与小分子药物对全新纳米抗体的肿瘤靶向作用进行初步评价。结果:获得了一个靶向EGFR III结构域的全新纳米抗体。第一部分研究中,两种重组表达的策略均可以得到与H11高亲和力的EGFR III结构域,选用更优的表达策略进行放大,最终获得2mg EGFR III结构域作为免疫原。第二部分研究中,通过七次免疫使骆驼产生了强烈的免疫反应,获得了效价可靠的血清,建立了两个库容和多样性足够的噬菌体文库,通过两轮的生物淘选与亲和力筛选,最终从两个文库中各筛选出一个可以同时阻断西妥昔与H11结合EGFR的纳米抗体,经过序列比对,两个纳米抗体仅第五位氨基酸存在差异,确认为同一个纳米抗体AS32611。建立了AS32611的同源模型,AS32611的抗原表位可能位于EGFR III结构域:RTK,G,Q,DGD,TSGQK（405-407,410,411,434-436,459-463）。AS32611的抗原决定簇位于CDR2区。第三部分研究中,毕赤酵母表达系统比大肠杆菌表达系统能提高纳米抗体6-22倍的产量,并且确认靶向EGFR的纳米抗体在毕赤酵母表达过程中并无糖基化修饰。第四部分研究中,通过毕赤酵母表达系统获得新纳米抗体AS32611,将荧光分子和微管抑制剂MMAE、DM1与AS32611偶联,通过细胞实验与荧光成像实验,证明新纳米抗体AS32611的肿瘤靶向作用。结论:通过抗原构建和多轮筛选,最终获得了一个靶向EGFR III结构域全新抗原表位的纳米抗体AS32611,其抗原表位与纳米抗体9G8和单克隆抗体马妥珠部分重合,通过结合位置可以预测出AS32611的抗肿瘤机制与纳米抗体9G8和单克隆抗体马妥珠相似,通过抑制EGFR二聚化的机制来抑制下游通路的激活。细胞实验证明了AS32611可以作为肿瘤靶向载体携带小分子入胞,可以作为一种肿瘤靶向配体。
方佳成[4]（2021）在《泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用》文中研究指明癌症已经成为危害人类健康的主要疾病,据世卫组织国际癌症研究机构数据显示,2020年,全球男性和女性将合计出现约1930万和1000万的新发病例和癌症死亡病例,其中的1800万例和930万例将来自实体瘤。然而,对肿瘤治疗的系统评估数据显示,欧洲药物管理局在2009-2013年度批准的大多数抗癌药物未能对患者的整体生命质量产生重大改善。因此,需要继续提高抗肿瘤药物的临床疗效。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法是发展迅速的肿瘤靶向治疗技术,它们通过特异性识别在恶性细胞和正常组织细胞之间差异过表达的靶标抗原,达到辨识肿瘤和消融肿瘤的目的。ADC和CAR-T实现安全性与有效性的关键,在于其所识别的靶标抗原是否具备足够的肿瘤特异性。因而,鉴别出理想的靶标抗原至关重要。理想的靶标抗原由恶性细胞特异性表达,然而肿瘤特异性抗原屈指可数。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上表达升高,在正常细胞上限制性表达,这一特性使得它们亦能够作为有效定位恶性肿瘤的靶标分子。目的:以发现理想的肿瘤相关抗原为出发点,着力于打造肿瘤相关抗原发现新平台,构建全面的泛实体瘤肿瘤相关抗原图谱,为癌症研究人员和广泛的科学与医药界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用经统一处理的TCGA和GTEx的RNA序列数据,对19种类型实体瘤中的20242个HUGO基因进行差异分析;通过将阈值设置为Benjamini-Hochberg adjusted p值为0.01,log2Fold Change为1.0,保留那些在肿瘤细胞群中显着差异表达的HUGO基因;结合蛋白质亚细胞定位信息,排除不具备胞外结构域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表达信息和HPA和HPM的蛋白质丰度信息的数据集,获取在正常组织中受限表达的蛋白分子;使用公开的Blood Spot平台,发现那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表达的蛋白分子。2.将RNA测序的读段计数数据转换为TPM格式,并将每个基因在其配对适应症和正常组织中的TPM值作为差异表达分析的输入数据。采用非参数Mann-Whitney U检验分析,计算并绘制每个候选靶标分子在特定适应症中的表达相比其在各个人体正常组织中的表达的差异表达谱。3.提取并整理TCGA中泛癌表型数据中的癌组织学分级,病理分级和TNM分期信息;通过挖掘MC3（“多中心多癌种突变识别”）TCGA MAF（“突变注释格式”）数据,确定靶标基因的非沉默体细胞突变（SNP和INDEL）。结合m RNA表达数据,汇编用于评价靶标基因的异质表达模式的综合数据集。4.从TCGA下载并提取靶标基因组变异数据,从Onco KB收集致癌或功能性基因组变异信息,注释并统计靶标基因的变异类型及发生频率,确定在临床上有应用价值的携带特异性驱动变异的功能性靶标。5.通过杂交瘤技术制备CDH17特异性单克隆抗体,进而运用流式细胞术、过表达共定位分析、结合亲和力检测、抗体测序和可变区序列进化关系分析等,多重表征抗体的各项指标。通过偶联mc-Val Cit PABC-MMAE,制备CDH17靶向型ADC。结合体外杀伤实验与细胞内化评估,完成效应分子的初筛验证。6.通过构建KM12SM和COLO205结肠癌细胞系CDX动物模型,综合评估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的体内抗肿瘤活性。通过制备和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子,并对给药的荷瘤小鼠的心/肺/肝/肾/结肠/直肠/脾脏进行HE染色,评估CDH17靶向型ADC对小鼠的组织毒性。7.通过慢病毒载体感染CD3+T细胞,制备LYPD3靶向型CAR-T细胞。通过对CAR-T细胞进行分化检测,确定其向效应细胞持续分化的能力。通过体外细胞杀伤实验和细胞因子分泌检测,研究LYPD3靶向型CAR-T细胞对肿瘤细胞的的特异性杀伤作用。通过对荷瘤小鼠循环血中的CAR-T细胞进行计数和检测肿瘤组织中的T细胞浸润水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T细胞在小鼠体内发挥持久抗肿瘤作用的机制。结果:1.开发专门的算法和汇编整合有泛实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组信息的综合数据集。2.系统地识别肿瘤相关抗原。通过我们的肿瘤相关抗原发现平台,筛选得到75个潜在的肿瘤相关抗原分子。特别是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做进一步的临床前研究。3.基于CDH17蛋白定向开发的ADC分子可以在体内显着消融KM12SM和COLO205异种移植瘤,并对高表达CDH17蛋白的结肠癌病人来源的异种移植瘤表现出一定的肿瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在体外对高药敏度的COLO205显示高水平的细胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE对COLO205的抑瘤水平相当（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。两次单药静脉注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以剂量依赖性的方式抑制KM12SM在小鼠体内的生长,但无法完全清除肿瘤。在COLO205 CDX模型中,按同样的给药方式静注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg剂量的第一针治疗可以起到平缓异种移植肿瘤增长的效果,且两周后的第二针治疗亦能继续起到溶瘤效果;3 mg/kg的中剂量治疗组有部分小鼠的肿瘤在后期出现反弹;6 mg/kg的高剂量治疗可以根治异种移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠体内具有相对可控的组织毒性。制备了能和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子677-MMAE,观察到在677-MMAE给药组小鼠的结直肠的局部组织中有炎症反应,聚集了大量的淋巴细胞;但在其它组织中没有出现炎症反应。此外,在观察期内,小鼠对chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的体内耐受良好,用药期间未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。5.LYPD3靶向型CAR-T细胞能够在小鼠体内对PC9异种移植肿瘤发挥持久的抗肿瘤作用。且小鼠对LYPD3-CAR-T的耐受良好,在观察期内未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。进一步调查发现,LYPD3-CAR-T细胞不仅在小鼠外周血中大量存在,还在高响应LYPD3-CAR-T治疗的PC9异种移植瘤组织中大量浸润。此外,LYPD3-CAR-T治疗组的小鼠脾脏内出现大量CD3+T细胞,但在对照组中却没有。CAR-T细胞的记忆表型对于激发持久的免疫应答至关重要。数据显示,LYPD3-CAR-T细胞在输注前,其中的Tn/Tscm细胞和Tcm细胞比例分别高达52.4%和21.7%,具有良好的向效应细胞分化的潜能。结论:通过开发肿瘤相关抗原识别算法和整合来自19种实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组数据,完成了泛实体瘤相关抗原的探索。通过考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T细胞在模型小鼠中的抗肿瘤活性,例证了CDH17和LYPD3蛋白分别作为ADC和CAR-T靶标开发的可行性。
孙思萌[5]（2021）在《大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素B亚基单克隆抗体的制备及其初步应用》文中提出
刘娅菲[6]（2021）在《抗4-1BB（CD137）纳米抗体的制备及功能研究》文中进行了进一步梳理
马玲玲[7]（2021）在《产气荚膜梭菌Beta1毒素单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立》文中认为
王雅坤[8]（2021）在《EtCab蛋白在鸡球虫入侵中的作用及其重组乳酸菌疫苗免疫保护性研究》文中研究说明鸡球虫是专性胞内原虫,寄生于鸡的肠上皮细胞,引起的鸡球虫病给养禽业造成巨大经济损失。鸡球虫对宿主细胞的粘附和入侵是其完成内生性发育的关键,一系列重要的蛋白质参与鸡球虫的入侵过程,已被证明与入侵相关的球虫蛋白有微线蛋白、棒状体蛋白、一些表面抗原和蛋白激酶等。最近的研究发现,钙结合蛋白也与某些寄生虫的入侵相关,但其在鸡球虫入侵宿主细胞中的作用尚未见报道。疫苗免疫是防治鸡球虫病的有效手段之一,由于使用传统弱毒或强毒球虫疫苗进行免疫存在诸多缺陷,新型鸡球虫疫苗的研发成为目前研究的热点。乳酸杆菌是肠道常在的“食品级”益生菌,可以维持肠道稳态、提高机体免疫力。基因工程乳酸杆菌可以作为活载体递呈鸡球虫抗原蛋白,这种新型活载体疫苗成为防治鸡球虫病的理想选择。本课题通过制备鸡柔嫩艾美耳球虫钙结合蛋白（Eimeria tenella membrane-associated calcum-binding protein,EtCab）的单克隆抗体,对EtCab蛋白进行亚细胞定位,研究EtCab在球虫不同发育阶段的动态表达,及其在粘附和入侵宿主细胞过程中所介导的功能,构建表面表达EtCab蛋白的重组乳酸杆菌疫苗,对重组乳酸杆菌疫苗进行动物免疫保护力评价。具体研究内容如下:1、EtCab单克隆抗体的制备、鉴定与应用按照常规方法制备并获得10株稳定分泌抗EtCab单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为G9D3、D4F10、A2C10、E11C4、G10C8、C5C2、E1C11、G2G7、G6C1和D9F1,其中E11C4属于Ig G2b亚型,其余9株属于Ig G1亚型,ELISA相加试验发现10株单克隆抗体中E11C4识别一个抗原识别位点,其余9株识别另一个抗原识别位点。Western blot试验证明E11C4株单抗能特异性识别天然EtCab蛋白,间接ELISA法测定其效价及亚型,E11C4株细胞上清的效价为1:1.6×103,纯化的腹水效价为1:1.28×105。利用制备的E11C4单抗进行间接免疫荧光试验（IFA）,结果显示,不透化的条件下EtCab位于柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）子孢子的细胞膜,透化的条件下EtCab位于子孢子的细胞膜和细胞质,说明EtCab蛋白是E.tenella的表面蛋白。2、EtCab在入侵宿主细胞中功能的初步研究为分析EtCab蛋白在粘附和入侵过程中的作用,本课题使用相对荧光定量PCR和Western blot的方法研究EtCab在E.tenella不同发育阶段的转录水平和蛋白表达水平,利用酵母粘附模型研究EtCab蛋白在粘附中的作用,利用入侵抑制试验研究EtCab蛋白在入侵中的作用。结果发现,EtCab在E.tenella的所有发育阶段均转录和表达。子孢子中EtCab基因转录水平明显高于其他三个阶段,是未孢子化卵囊阶段的3.11倍（P<0.001）;孢子化卵囊中EtCab的转录水平与未孢子化卵囊中的转录水平相比无显着差异（P>0.05）;裂殖子中EtCab的转录水平与未孢子化卵囊相比显着降低（P<0.01）。在子孢子阶段和裂殖子阶段,EtCab蛋白表达水平最高,表达水平相比差异不显着（P>0.05）,裂殖子中EtCab蛋白表达水平是孢子化卵囊中的1.93倍,是未孢子化卵囊的14.13倍。粘附试验结果显示,表面表达EtCab的酵母细胞对宿主细胞的粘附率（62.10%）与对照组（24.58%）相比差异显着（P<0.001）,是对照组的2.5倍。入侵抑制试验结果显示,经EtCab抗体处理后的E.tenella子孢子入侵DF-1细胞能力明显下降,其中多抗对子孢子入侵的阻断能力较强,其中多抗的入侵阻断能力较强,多抗（200μg/m L）入侵抑制率最高为58.17%。结果说明,EtCab在E.tenella粘附和入侵宿主细胞中发挥重要作用。3、重组乳酸杆菌疫苗的构建与鉴定在实验室前期构建的持续表达型表面展示系统P32-SP-AP基础上,更换信号肽SP和锚定蛋白AP为乳酸杆菌Mur O基因或枯草芽孢杆菌Pgs A基因,插入EtCab基因,共构建三种重组乳酸杆菌表达质粒P32-SP-EtCab-AP、P32-Mur O-EtCab和P32-Pgs A-EtCab,电转至乳酸杆菌后,Western blot鉴定重组EtCab蛋白的表达,IFA分析重组乳酸杆菌表面展示效率。试验发现三种重组乳酸杆菌均可表面展示EtCab蛋白,重组乳酸杆菌P32-Pgs A-EtCab-NC8的表面展示率为44.90%,P32-SP-EtCab-AP-NC8的表面展示率为33.87%,P32-Mur O-EtCab-NC8的表面展示率为21.25%。结果说明,三种表面展示系统均可将外源蛋白展示到乳酸杆菌表面,其中Pgs A与EtCab组合具有更高的蛋白展示效率。4、重组乳酸杆菌疫苗的免疫保护作用评价为研究重组乳酸杆菌疫苗在抗鸡球虫感染中的作用,本课题选用表面展示率最高的重组乳酸杆菌P32-Pgs A-EtCab-NC8进行动物免疫保护试验,通过检测平均增重、盲肠病变、卵囊排出量、ACI及血清抗体等指标评价其免疫保护效果。结果显示P32-Pgs A-EtCab-NC8免疫组、NC8免疫组和PBS免疫组的ACI的抗球虫指数分别为170.79、151.45和114.77。P32-Pgs A-EtCab-NC8免疫组在一定程度上可以改善感染E.tenella后造成的生长迟缓,减轻盲肠病变程度,减少卵囊的排出,提高机体的lg G的抗体水平（P<0.05）;提高外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞亚型比例（P<0.01）。本课题制备了具有良好特异性,能稳定分泌抗EtCab蛋白Ig G2b型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,证明EtCab蛋白是E.tenella的表面蛋白,在子孢子和裂殖子阶段高度表达,在粘附和入侵宿主细胞过程中介导重要的功能,成功制备表面展示EtCab蛋白的重组乳酸杆菌,免疫重组乳酸杆菌可以有效预防鸡球虫感染。
徐玲玲[9]（2021）在《RTP4与IZUMO1的相互作用以及对受精的影响》文中认为哺乳动物通过有性生殖的方式繁衍后代,受精是有性生殖得以实现的最重要一环。受精的整个过程包括精子获能、透明带识别反应、顶体反应以及最终的精卵膜融合。已知精子上的IZUMO1和卵细胞膜上JUNO是实现精卵膜融合的必需分子。然而仅有IZUMO1和JUNO只能使细胞粘附,不足以使细胞膜融合,因此哺乳动物精卵膜融合应该是一个多分子协作的过程,一定存在其它分子来协助IZUMO1和JUNO发挥作用。本实验鉴定了RTP4与IZUMO1和JUNO的相互作用以及对受精的影响,为认识精卵膜融合机制积累了新资料。首先,克隆了大鼠rtp4的cDNA。构建了pGAD-rtp4酵母表达载体和pCMVC-Flag-rtp4真核表达载体。其中pGAD-rtp4分别与实验室保存的pGBK-Izumo1和pGBK-juno进行酵母双杂交。结果表明RTP4与IZUMO1存在相互作用,但与JUNO不存在相互作用。接着,用pCMV-C-Flag-rtp4与实验室保存的pCMVC-HA-Izumo1共同转染293 T细胞,免疫共沉淀实验进一步确认了RTP4与IZUMO1存在相互作用。然后,构建pET-28a-rtp4原核表达载体,转化E.coli BL21（DE3）表达并纯化得到HIS-RTP4融合蛋白。用纯化后的HIS-RTP4融合蛋白免疫小鼠,得到RTP4腹水多克隆抗体。以自制的RTP4腹水多克隆抗体为一抗,对小鼠睾丸和卵巢组织切片进行免疫荧光染色。结果显示:RTP4在小鼠睾丸中表达于精原细胞、精母细胞和支持细胞的细胞质中,并且存在于成熟的精子中;在小鼠卵巢中表达于卵丘细胞的细胞质中和卵子的细胞膜上。此外,以自制的RTP4腹水多克隆抗体为一抗,对大小鼠的精子和小鼠MII期卵子进行定位发现:RTP4定位于顶体反应前大鼠精子的顶体和尾部,顶体反应后大鼠精子的头部前端且少量存在于尾部前半段;定位于顶体反应前小鼠精子的顶体和尾部前半段,顶体反应后小鼠精子的整个头部和尾部前半段;定位于小鼠MII期卵子的细胞膜上。另外,以自制的RTP4腹水多克隆抗体和兔抗IZUMO1血清多抗为一抗,在大鼠和小鼠精子上进行了RTP4与IZUMO1共定位观察。结果发现:顶体反应前,RTP4与IZUMO1共定位于大鼠和小鼠精子的顶体处,但顶体反应后没有共定位。最后,利用自制的RTP4腹水多克隆抗体分别处理小鼠的精子和卵子,并进行体外受精,结果发现:RTP4对小鼠体外受精率的影响不显着。实验发现,RTP4与IZUMO1存在相互作用,并且在大鼠和小鼠的生殖组织、生殖细胞中均有表达。推测RTP4可能参与了精卵融合事件。
刘晓涵[10]（2021）在《鸡滑液囊支原体NADH氧化酶单克隆抗体的制备与鉴定》文中研究指明滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）是引起禽类呼吸道疾病的主要病原体,鸡或火鸡感染MS会引起气囊炎、关节渗出性滑膜炎,发病鸡出现跛行、产蛋减少和体制下降的现象,可垂直传播给后代,给全世界养禽业造成巨大的经济损失。MS感染大多数情况下呈区域性的发病,很少发生大规模的爆发。近几年,由于我国对MS防控相对鸡毒支原体（Mycoplasma galliscepticum,MG）较薄弱,导致MS感染越发严重。NADH氧化酶（NADH oxidase,NOX）是一种氧化还原酶,是维持生物代谢生长的重要酶类。有研究表明NOX不仅具有酶的催化作用,在某些致病菌中还是膜表面黏附相关因子,能协助病原菌黏附宿主细胞,甚至影响毒力。本实验室前期研究表明MS的NOX不仅在胞浆中发挥催化酶的功能,在MS的膜表面也有少量存在,且具有免疫原性,是可能的黏附相关蛋白。本研究用本实验室前期构建好的重组菌株E.coli BL21（p ET28a-MSNOX）,通过IPTG诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组MSNOX（recombinant MSNOX,r MSNOX）蛋白于上清和沉淀中均表达,用His-Tag磁珠纯化上清中的r MSNOX蛋白,得到较为纯净的r MSNOX蛋白。用纯化后的r MSNOX蛋白与弗氏佐剂同体积混合乳化,对BALB/c小鼠进行免疫,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠效价,将效价最高小鼠的脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞融合。通过间接ELISA和有限稀释法对融合的杂交瘤细胞进行筛选,直至筛选出能够稳定分泌抗r MSNOX蛋白抗体的杂交瘤细胞株。采用间接ELISA和免疫印迹法（Western blot）对单克隆抗体进行特异性的检测,将获得的杂交瘤细胞连续传代10次和反复冻融,测试杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。本研究成功制备了一株能够稳定分泌抗r MSNOX蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为2F4,经间接ELISA、Western blot、悬浮免疫荧光结果显示,该单克隆抗体均可与滑液囊支原体发生特异性反应,并且与其他禽类致病菌不发生反应。通过单克隆抗体亚型分析试剂盒,鉴定该单克隆抗体为Ig G2b亚类,κ链;通过连续传代,反复冻融,仍然具有稳定分泌抗体的能力,表明该单克隆抗体具有很好的稳定性;通过秋水仙素法对杂交瘤细胞株进行染色体分析,该株杂交瘤细胞2F4有98±5条染色体,符合杂交瘤细胞染色体的数目;将杂交瘤细胞经腹腔注射至6-8周龄BALB/c小鼠中制备腹水,经间接ELISA检测腹水效价达到1:2048000。综上所述,本研究成功表达和纯化了r MSNOX蛋白,且成功制备了1株能够稳定分泌抗r MSNOX蛋白抗体的杂交瘤细胞株,为建立滑液囊支原体的检测方法及进一步研究MSNOX在MS致病机制中的作用奠定了基础。
二、抗牛T细胞表面抗原单克隆抗体的鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗牛T细胞表面抗原单克隆抗体的鉴定（论文提纲范文）
（1）PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景及立题依据 |
| 一、转移性结直肠癌的治疗现状及研究进展 |
| 二、靶向PD-1肿瘤细胞免疫治疗的机制及发展现状 |
| 三、大肠癌发生与肿瘤免疫治疗的关系研究进展 |
| 四、本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第一章、小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其机制研究 |
| 第一部分、小鼠PD-1基因敲除T细胞的建立及其体外抑制肿瘤的作用 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 靶向PD1基因sgRNA的设计构建及鉴定 |
| 2. PCR扩增和T7E1酶切鉴定 |
| 3. PD-1基因敲除T细胞亚群比例检测 |
| 4. PD-1基因敲除T细胞体外抑制肿瘤细胞生长 |
| 5. PD-1基因敲除T细胞与CT-26细胞株共培养的体外抗肿瘤效应 |
| 6. PD-1基因敲除T细胞与CT-26细胞株共培养的体外细胞因子分泌 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及可能机制 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 结直肠癌小鼠模型中CD8~+细胞中PD-1表达显着升高 |
| 2. 小鼠结直肠癌移植瘤模型的建立 |
| 3. 小鼠CT-26结直肠癌移植瘤模型体内抗肿瘤效应 |
| 4. 小鼠CT-26结直肠癌模型体内抗肿瘤效应可能机制 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二章、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的体内安全性评价 |
| 第一部分、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的建立及其生物学特性 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 食蟹猴外周血T细胞的培养 |
| 2. 食蟹猴PD-1敲除T细胞载体的构建及敲除效率的检测 |
| 3. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞增殖的影响 |
| 4. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞亚群的影响 |
| 5. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞周期的影响 |
| 6. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞死亡殖的影响 |
| 7. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞细胞因子分泌的影响 |
| 8. 混合淋巴细胞反应 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的体内安全性评价 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 食蟹猴一般情况 |
| 2. 食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内持续时间的检测 |
| 3. 食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性的评价 |
| 4. PD-1基因敲除T细胞回输对食蟹猴各组织器官的影响 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 PDH/PD-L1信号通路及其相关抗肿痛免疫疗法在结直肠癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛呼吸道疾病病原及其固有免疫应答 |
| 1.1 牛呼吸道病原识别病原的分子基础 |
| 1.2 气道和肺上皮细胞对牛呼吸系统疾病的抵抗能力 |
| 1.3 固有免疫系统的效应细胞 |
| 第二章 牛副流感病毒3 型感染及其逃避宿主免疫的研究进展 |
| 2.1 宿主范围与传播特点 |
| 2.2 流行病学与基因型 |
| 2.3 BPIV3 编码基因与蛋白特征 |
| 2.4 牛副流感的临床症状与病理变化 |
| 2.5 病原分离与鉴定 |
| 2.6 BPIV3 造成的经济损失 |
| 2.7 BPIV3 的治疗与预防 |
| 2.8 副黏病毒拮抗Ⅰ型干扰素的研究概况 |
| 第三章 IL10 的信号转导与其在病毒致病中的作用 |
| 3.1 白细胞介素-10 的来源细胞与基本作用 |
| 3.2 IL10 的受体与信号转导 |
| 3.3 IL10 的相关家族与病毒编码的IL10 |
| 3.4 IL10 在病毒致病中的作用 |
| 3.5 IL10 重要产物SOCS3 在病毒感染中的作用 |
| 3.6 病毒诱导IL10 产生的信号通路 |
| 3.7 阻断IL10 清除病毒感染的新策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犊牛BPIV3 血清抗体调查与BPIV3 A的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 血清与病料采集 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 2.2 鼻棉拭子中的BPIV3 鉴定与分离培养 |
| 2.3 病毒的鉴定与纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 3.2 BPIV3 分离培养 |
| 3.3 BPIV3 的特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 BPIV3 感染C57BL/6 小鼠与巨噬细胞的转录组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要动物、细胞与毒株 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 2.2 转录样本的制备 |
| 2.3 转录组测序 |
| 2.4 qPCR验证转录组测序结果 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 3.2 BPIV3 感染鼠巨噬细胞后细胞因子的变化 |
| 3.3 BPIV3 感染C57 小鼠后肺组织的转录组分析 |
| 3.4 BPIV3 感染原代巨噬细胞转录组测序与分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的重组表达及特性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆与生物信息学分析 |
| 2.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 2.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 2.4 牛IL10、IL10R1 腺病毒制备及蛋白表达 |
| 2.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建 |
| 2.6 构建牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体 |
| 2.7 牛IL10 的生物学活性及信号通路研究 |
| 2.8 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆 |
| 3.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 3.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 3.4 牛IL10、IL10R1 胞外区的腺病毒感染细胞与表达蛋白鉴定 |
| 3.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建与活性分析 |
| 3.6 牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体的构建 |
| 3.7 牛IL10 和IL10R的生物学活性 |
| 3.8 牛IL10 的信号通路 |
| 3.9 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 IL10 在牛副流感病毒3 型感染中的作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染细胞表达IL10 并发挥其活性 |
| 2.2 IL10/IL10R1对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 感染细胞诱导IL10 的转录与表达 |
| 3.2 BPIV3 感染对STAT3 表达的影响 |
| 3.3 BPIV3 感染对SOCS3 转录的影响 |
| 3.4 BPIV3 感染对其他细胞因子表达的影响 |
| 3.5 IL10对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3.6 IL10 受体阻断对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 IL10 与牛副流感病毒3 型感染的相互调控 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染诱导IL10 产生的信号通路 |
| 2.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 诱导IL10 产生所依赖的信号通路 |
| 3.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）靶向EGFR Ⅲ结构域新纳米抗体筛选及其重组表达系统的比较研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 研究背景 |
| 1.1 表皮生长因子受体及其治疗药物的概述 |
| 1.1.1 表皮生长因子受体研究现状 |
| 1.1.2 靶向EGFR单克隆抗体研究现状 |
| 1.1.3 靶向EGFR纳米抗体研究现状 |
| 1.1.4 EGFR III结构域作为抗原表位与EGFR内化及下调的关系 |
| 1.2 纳米抗体的概述 |
| 1.2.1 纳米抗体的结构与理化性质 |
| 1.2.2 纳米抗体与抗体结构的比较及其的优势 |
| 1.2.3 纳米抗体的筛选与表达策略 |
| 1.2.4 纳米抗体在肿瘤中作为靶向载体的研究现状 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第2章 EGFR III结构域的重组表达及其亲和力的验证 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 EGFR III结构域的重组表达 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.3 基于表面等离子共振技术的EGFR III结构域功能验证 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.4 本章讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 骆驼免疫及噬菌体展示文库的建立与筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 双峰骆驼免疫及其血清效价评价 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 纳米抗体-噬菌体展示文库的建立 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.4 纳米抗体-噬菌体展示文库的高通量筛选 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 纳米抗体的同源模型构建与分子对接 |
| 3.5.1 实验材料 |
| 3.5.2 实验方法 |
| 3.5.3 实验结果 |
| 3.6 本章讨论 |
| 3.7 本章小结 |
| 第4章 纳米抗体重组表达系统的比较研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 通过大肠杆菌表达系统重组表达两种靶向EGFR纳米抗体 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 通过毕赤酵母表达系统重组表达两种靶向EGFR纳米抗体 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 基于表面等离子共振技术比较两种表达系统重组纳米抗体的亲和力 |
| 4.4.1 实验材料 |
| 4.4.2 实验方法 |
| 4.4.3 实验结果 |
| 4.5 基于高效液相-质谱联用技术探究纳米抗体-毕赤酵母表达的糖基化修饰问题 |
| 4.5.1 实验材料 |
| 4.5.2 实验方法 |
| 4.5.3 实验结果 |
| 4.6 基于荧光成像技术比较两种表达系统重组纳米抗体的入胞 |
| 4.6.1 实验材料 |
| 4.6.2 实验方法 |
| 4.6.3 统计学验证 |
| 4.6.4 实验结果 |
| 4.7 本章讨论 |
| 4.8 本章小结 |
| 第5章 新纳米抗体AS32611 作为肿瘤靶向配体的初步评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 两种表达系统对纳米抗体AS32611 重组表达的比较研究 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 实验结果 |
| 5.3 纳米抗体AS32611 的亲和力测定 |
| 5.3.1 实验材料 |
| 5.3.2 实验方法 |
| 5.3.3 实验结果 |
| 5.4 基于荧光成像技术探究纳米抗体AS32611-荧光分子偶联物的入胞 |
| 5.4.1 实验材料 |
| 5.4.2 实验方法 |
| 5.4.3 实验结果 |
| 5.5 纳米抗体AS32611-MMAE和 AS32611-DM1 偶联物抗肿瘤活性的初步评价 |
| 5.5.1 实验材料 |
| 5.5.2 实验方法 |
| 5.5.3 实验结果 |
| 5.6 本章讨论 |
| 5.7 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗体偶联药物的知识现状 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC发展简史 |
| 1.1.2 获得监管批准的上市ADC |
| 1.1.3 临床试验中的在研ADC及其靶标图谱 |
| 1.1.4 抗体骨架和靶标的选择 |
| 1.1.5 连接子类型和偶联技术 |
| 1.1.6 有效载荷 |
| 1.1.7 ADC在体内的工作原理 |
| 1.1.8 ADC对难治性癌症的治疗 |
| 1.1.9 ADC的毒性问题 |
| 1.1.10 ADC耐药机制 |
| 1.1.11 未来展望 |
| 1.2 嵌合抗原受体T细胞的知识现状 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T发展简史 |
| 1.2.2 CAR-T细胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T细胞受体的结构 |
| 1.2.4 获得监管批准的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T细胞疗法的毒性 |
| 1.2.6 未来挑战、机会和应用 |
| 1.3 本课题的研究目标 |
| 第二章 基于多组学构建泛实体瘤相关抗原图谱 |
| 引言 |
| 2.1 数据采集与分析方法 |
| 2.1.1 正常组织转录组和蛋白组的数据采集 |
| 2.1.2 蛋白质亚细胞定位数据的采集与编译 |
| 2.1.3 人体组织器官的重排与映射 |
| 2.1.4 正常组织的表达及其分级 |
| 2.1.5 基因在肿瘤及其癌旁组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.6 基因在肿瘤与其他正常组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.7 肿瘤组织转录组、基因组和表型数据的编译 |
| 2.1.8 功能相关突变的注释 |
| 2.1.9 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.1.10 肿瘤相关抗原与癌细胞功能状态的相关性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 临床试验的检索策略 |
| 2.1.13 统计分析 |
| 2.2 分析结果 |
| 2.2.1 组装综合数据集并通过算法识别肿瘤相关抗原 |
| 2.2.2 肿瘤相关抗原的表达谱与差异表达谱 |
| 2.2.3 肿瘤相关抗原的异质表达谱 |
| 2.2.4 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.2.5 癌症驱动基因变异全景 |
| 2.2.6 候选肿瘤相关抗原的组合评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制备及抗结直肠癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 TCGA与 GTEx中 CDH17的m RNA数据的获取与分析 |
| 3.3.2 免疫原的设计与制备 |
| 3.3.3 制备靶向CDH17 的单克隆抗体的免疫方案 |
| 3.3.4 抗体可变区基因测序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 3.3.6 抗体结合亲和力的测定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗体偶联vc MMAE |
| 3.3.8 细胞内吞实验 |
| 3.3.9 细胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀产物的银染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.13 免疫组化 |
| 3.3.14 免疫荧光 |
| 3.3.15 流式细胞实验 |
| 3.3.16 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.17 体内抑瘤活性实验 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道肿瘤和正常组织中的表达 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗体的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制备与表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在体外的抗肿瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠对CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T细胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 试剂耗材及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TCGA与 GTEx中 LYPD3 m RNA数据的获取与分析 |
| 4.3.2 抗体人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 CD3+T细胞的复苏与激活 |
| 4.3.5 CD3+T细胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T细胞分化与耗竭的检测 |
| 4.3.7 CAR-T体外细胞杀伤 |
| 4.3.8 CAR-T体内活性实验 |
| 4.3.9 细胞因子的检测 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T细胞在PC9 肺腺癌异种移植模型中抗肿瘤活性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）EtCab蛋白在鸡球虫入侵中的作用及其重组乳酸菌疫苗免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫及鸡球虫病概述 |
| 1.1.1 鸡球虫 |
| 1.1.2 鸡球虫病 |
| 1.2 鸡球虫生物学研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫的致病性 |
| 1.2.2 鸡球虫入侵相关因子研究进展 |
| 1.3 钙结合蛋白及在顶复门原虫中的研究进展 |
| 1.3.1 钙结合蛋白分类 |
| 1.3.2 钙结合蛋白在顶复门原虫中的研究进展 |
| 1.4 鸡球虫疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 鸡球虫疫苗概述 |
| 1.4.2 鸡球虫重组乳酸菌疫苗研究进展 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物、虫株和菌株 |
| 2.1.2 质粒、引物和基因合成 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.1.4 主要试验试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 EtCab蛋白鼠源单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.2.3 E.tenella不同发育阶段虫体的收集与纯化 |
| 2.2.4 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.2.5 EtCab在不同发育阶段的转录水平差异分析 |
| 2.2.6 EtCab在不同发育阶段的翻译水平差异分析 |
| 2.2.7 细胞粘附试验 |
| 2.2.8 体外抗体阻断试验 |
| 2.2.9 乳酸杆菌重组表达质粒的构建 |
| 2.2.10 重组乳酸杆菌的制备 |
| 2.2.11 重组乳酸杆菌的表达与鉴定 |
| 2.2.12 动物免疫保护性试验 |
| 2.2.13 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 EtCab单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.1.1 重组蛋白的制备 |
| 3.1.2 小鼠血清抗体效价检测 |
| 3.1.3 阳性杂交瘤细胞株筛选 |
| 3.1.4 单克隆抗体抗原识别位点分析 |
| 3.1.5 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 3.1.6 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.1.7 单克隆抗体的纯化 |
| 3.1.8 单克隆抗体的效价鉴定 |
| 3.2 EtCab蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3 EtCab的动态表达 |
| 3.3.1 转录水平的差异分析 |
| 3.3.2 表达水平的差异分析 |
| 3.4 EtCab蛋白在粘附和入侵中的作用 |
| 3.4.1 粘附宿主细胞作用 |
| 3.4.2 抗体阻断入侵宿主细胞作用 |
| 3.5 重组乳酸杆菌疫苗的构建与鉴定 |
| 3.5.1 重组EtCab蛋白的表达鉴定 |
| 3.5.2 重组乳酸杆菌表面荧光强度的鉴定 |
| 3.6 重组乳酸杆菌疫苗的免疫效果评价 |
| 3.6.1 体重增重变化 |
| 3.6.2 盲肠病变计分 |
| 3.6.3 卵囊排出量情况 |
| 3.6.4 抗球虫指数ACI |
| 3.6.5 外周血血清IgG抗体水平 |
| 3.6.6 外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群比例 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EtCab蛋白是首次发现的定位于寄生虫细胞膜的CREC蛋白 |
| 4.2 EtCab蛋白在球虫粘附和入侵宿主细胞中介导重要功能 |
| 4.3 表面展示EtCab蛋白重组乳酸杆菌疫苗具有良好免疫保护力 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
| 附录 |
（9）RTP4与IZUMO1的相互作用以及对受精的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略说明 |
| 第一章 RTP4 的研究进展 |
| 1 RTP家族概述 |
| 1.1 气味受体的发现 |
| 1.2 RTP家族研究进展 |
| 1.2.1 RTP1和RTP2 的研究进展 |
| 1.2.2 RTP3 的研究进展 |
| 1.2.3 RTP5 的研究进展 |
| 2 RTP4 研究进展 |
| 2.1 RTP4 基本介绍 |
| 2.2 RTP4 作为干扰素刺激基因 |
| 2.2.1 在反刍动物妊娠中的作用 |
| 2.2.2 在病毒抑制和免疫中的作用 |
| 2.2.3 在预防抑郁症中的作用 |
| 2.2.4 在急性Q热中的作用 |
| 2.3 RTP4 作为阿片受体辅助蛋白 |
| 2.4 RTP4 的其它功能 |
| 第二章 RTP4与IZUMO1 的相互作用以及对受精的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 实验细胞及实验用载体 |
| 2.1.5 实验常用溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠卵巢组织总RNA的提取 |
| 2.2.2 大鼠卵巢组织cDNA的合成 |
| 2.2.3 大鼠卵巢组织cDNA的检测 |
| 2.2.4 大鼠rtp4 CDS区全长的克隆 |
| 2.2.4.1 大鼠rtp4 CDS区全长克隆引物的设计与合成 |
| 2.2.4.2 大鼠rtp4 CDS区全长的克隆 |
| 2.2.4.3 大鼠rtp4-Blunt克隆载体的构建 |
| 2.2.5 酵母双杂交实验 |
| 2.2.5.1 大鼠pGAD-rtp4 酵母表达载体的构建 |
| 2.2.5.2 pGAD-rtp4 重组质粒转化酵母感受态细胞 |
| 2.2.5.3 酵母双杂交实验 |
| 2.2.6 免疫共沉淀实验 |
| 2.2.6.1 大鼠pCMV-C-Flag-rtp4 真核表达载体的构建 |
| 2.2.6.2 293 T细胞的培养 |
| 2.2.6.3 磁珠法免疫沉淀目标蛋白 |
| 2.2.6.4 Western-blot检测免疫共沉淀结果 |
| 2.2.7 RTP4 腹水多克隆抗体的制备 |
| 2.2.7.1 大鼠pET-28a-rtp4 原核表达载体的构建 |
| 2.2.7.2 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白的表达 |
| 2.2.7.3 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白的鉴定 |
| 2.2.7.4 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白的纯化及鉴定 |
| 2.2.7.5 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白浓度测定 |
| 2.2.7.6 RTP4 腹水多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.2.8 RTP4 在小鼠睾丸组织中的定位 |
| 2.2.9 RTP4与IZUMO1 在小鼠精子顶体反应前后的定位 |
| 2.2.10 RTP4与IZUMO1 在大鼠精子顶体反应前后的定位 |
| 2.2.11 RTP4 在小鼠卵巢组织中的定位 |
| 2.2.12 RTP4 在小鼠MII期卵子上的定位 |
| 2.2.13 抗体抑制体外受精实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠卵巢组织cDNA检测 |
| 3.2 大鼠rtp4 CDS区全长的克隆 |
| 3.3 大鼠rtp4-Blunt克隆载体的PCR鉴定 |
| 3.4 酵母双杂交实验 |
| 3.4.1 pGAD-rtp4 酵母表达载体的构建 |
| 3.4.2 pGAD-rtp4 转化酵母感受态菌落PCR鉴定 |
| 3.4.3 酵母双杂交 |
| 3.5 免疫共沉淀实验 |
| 3.5.1 大鼠PCMV-C-Flag-rtp4 真核表达载体的构建 |
| 3.5.2 免疫共沉淀 |
| 3.6 大鼠RTP4 腹水多克隆抗体的制备 |
| 3.6.1 大鼠pET-28a-rtp4 原核表达载体的构建 |
| 3.6.2 大鼠HIS-RTP4 原核蛋白的表达及鉴定 |
| 3.6.3 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.6.4 大鼠HIS-RTP4 融合蛋白的浓度测定 |
| 3.6.5 RTP4 腹水多克隆抗体的鉴定和特异性检测 |
| 3.7 RTP4 在小鼠睾丸组织的定位 |
| 3.8 RTP4与IZUMO1 在小鼠精子上的定位 |
| 3.8.1 RTP4 在小鼠精子上的定位 |
| 3.8.2 RTP4与IZUMO1 在小鼠精子上的共定位 |
| 3.8.3 利用Image J软件分析RTP4与IZUMO1 在小鼠精子上的共定位结果 |
| 3.9 RTP4与IZUMO1 在大鼠精子上的定位 |
| 3.9.1 RTP4 大鼠精子上的定位 |
| 3.9.2 RTP4与IZUMO1 在大鼠精子上的共定位 |
| 3.9.3 利用Image J软件分析RTP4与IZUMO1 在大鼠精子上的共定位结果 |
| 3.10 RTP4 在小鼠卵巢组织的定位 |
| 3.11 RTP4 在小鼠MII期卵子上的定位 |
| 3.12 抗体抑制体外受精实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RTP4 在生殖组织和生殖细胞的定位 |
| 4.2 RTP4与IZUMO1和JUNO的相互作用 |
| 4.3 RTP4 对小鼠体外受精的影响 |
| 5 小结和创新点 |
| 5.1 小结 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间参与的科研项目和发表论文 |
（10）鸡滑液囊支原体NADH氧化酶单克隆抗体的制备与鉴定（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 支原体概述 |
| 1.2 滑液囊支原体 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 临床症状及病理变化 |
| 1.2.4 致病机制 |
| 1.2.5 鉴别诊断 |
| 1.2.6 疾病防治 |
| 1.3 NADH氧化酶 |
| 1.3.1 NADH氧化酶概述 |
| 1.3.2 NADH 氧化酶生理特性 |
| 1.3.3 NADH 氧化酶与致病力 |
| 1.3.4 滑液囊支原体与NADH氧化酶 |
| 1.4 单克隆抗体 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、细胞系及试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂及配制 |
| 2.2 rMSNOX蛋白的表达和纯化 |
| 2.2.1 rMSNOX蛋白的表达 |
| 2.2.2 rMSNOX蛋白的纯化 |
| 2.2.3 纯化蛋白的检测 |
| 2.2.4 纯化蛋白浓度测定 |
| 2.3 单克隆抗体的制备 |
| 2.3.1 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.3.2 小鼠免疫 |
| 2.3.3 骨髓瘤细胞的复苏 |
| 2.3.4 饲养细胞的准备 |
| 2.3.5 脾细胞的制备 |
| 2.3.6 骨髓瘤细胞的洗涤 |
| 2.3.7 脾细胞和骨髓瘤细胞的融合 |
| 2.3.8 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.3.9 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.3.10 杂交瘤细胞的冻存 |
| 2.4 单克隆抗体的生物学特性研究 |
| 2.4.1 杂交瘤细胞株的稳定性测试 |
| 2.4.2 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 2.4.3 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.4.4 单克隆抗体腹水的制备 |
| 2.4.5 腹水效价测定 |
| 2.4.6 杂交瘤细胞染色体分析 |
| 2.4.7 悬浮免疫荧光试验 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 rMSNOX蛋白的纯化及浓度 |
| 3.2 间接ELISA方法的建立 |
| 3.3 三次免疫小鼠抗体效价检测结果 |
| 3.4 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.5 杂交瘤细胞生长状况 |
| 3.6 单克隆抗体的生物学特性研究 |
| 3.6.1 杂交瘤细胞的稳定性 |
| 3.6.2 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.6.3 单克隆抗体特异性鉴定结果 |
| 3.6.4 单克隆抗体腹水效价测定结果 |
| 3.6.5 杂交瘤细胞染色体分析结果 |
| 3.6.6 悬浮免疫荧光试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 rMSNOX蛋白的纯化 |
| 4.2 动物免疫 |
| 4.3 细胞融合 |
| 4.4 杂交瘤细胞的筛选及克隆化 |
| 4.5 单克隆抗体亚类 |
| 4.6 杂交瘤细胞的染色体分析 |
| 4.7 NADH氧化酶单克隆抗体 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、抗牛T细胞表面抗原单克隆抗体的鉴定（论文参考文献）
- [1]PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究[D]. 高嫦娥. 昆明医科大学, 2021(01)
- [2]IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制[D]. 高明春. 吉林大学, 2021
- [3]靶向EGFR Ⅲ结构域新纳米抗体筛选及其重组表达系统的比较研究[D]. 奚溪. 吉林大学, 2021(01)
- [4]泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用[D]. 方佳成. 西北大学, 2021(12)
- [5]大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素B亚基单克隆抗体的制备及其初步应用[D]. 孙思萌. 东北农业大学, 2021
- [6]抗4-1BB（CD137）纳米抗体的制备及功能研究[D]. 刘娅菲. 新疆大学, 2021
- [7]产气荚膜梭菌Beta1毒素单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立[D]. 马玲玲. 宁夏大学, 2021
- [8]EtCab蛋白在鸡球虫入侵中的作用及其重组乳酸菌疫苗免疫保护性研究[D]. 王雅坤. 山东农业大学, 2021(01)
- [9]RTP4与IZUMO1的相互作用以及对受精的影响[D]. 徐玲玲. 内蒙古大学, 2021(12)
- [10]鸡滑液囊支原体NADH氧化酶单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 刘晓涵. 山东农业大学, 2021