一、水牛实验感染大片吸虫及ELISA检测特异性抗体的变化（论文文献综述）
靳纬坤,袁湘祥,王锦辉,侯林静,郑梦伟,吴正姣,张为宇,邸文达[1]（2021）在《基于大片吸虫分泌排泄产物层析组分的牛片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立》文中研究说明为建立更敏感、特异的牛片形吸虫病早期诊断方法,本试验将收集的大片吸虫分泌排泄产物（Fasciola gigantica excretory-secretory products, FgESP）进行凝胶过滤层析并从中筛选出检测效果最优的UV280吸收峰,从此峰对应的组分中筛选出诊断效果最优的层析组分后将其作为抗原,通过棋盘滴定试验优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度、显色时间等,确定临界值,建立牛片形吸虫病间接ELISA诊断方法。对建立的方法进行敏感性和特异性试验,检测试验感染0～14周的水牛血清和临床160份水牛血清样本,并与已有的诊断抗原FgESP（阴阳临界值为0.320）进行诊断效果比较。结果显示,层析组分F22具有较优的检测效果。间接ELISA的最佳反应条件为:F22抗原包被浓度0.157μg/mL,待测血清与酶标二抗的稀释度分别为1∶400和1∶40 000,显色时间为25 min。应用建立的方法检测15份水牛阴性血清,确定D450 nm阴阳性临界值为0.408。比较F22与FgESP发现,二者特异性相似,但F22作为抗原的敏感性高于FgESP。检测试验感染大片吸虫的水牛0～14周血清,结果表明,从感染第2周开始F22-IgG水平极显着高于FgESP-IgG水平（P<0.01）,因此,F22比FgESP诊断效果更优。对160份水牛血清检测发现,F22阳性检出率为71.25%,FgESP阳性检出率为63.75%。上述结果表明,相比于FgESP,以F22作为诊断抗原建立的大片吸虫病间接ELISA诊断方法敏感性更高,可更有效地进行牛大片吸虫病的早期诊断。
龚静芝[2]（2021）在《片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立》文中研究说明片形吸虫病（Fasciolosis）是由大片吸虫（Fasciola gigantica）和肝片吸虫（Fasciola hepatica）引起的一种人畜共患寄生虫病。该病主要感染反刍动物和人,是一种食源性寄生虫病,受到感染的动物或人表现为急性肝炎、慢性肝纤维化、胆管炎等,严重时能造成动物的大量死亡,对人类及畜牧业的危害十分严重。目前对于该病的防控主要依赖于药物治疗,因此,对于该病的诊断、尤其是早期诊断尤为重要,能够做到早诊断、早治疗,就能减少该病对人类及动物健康的危害,降低畜牧业的经济损失。片形吸虫病的诊断研究一直是该领域的研究热点。目前临床上主要采用的经典粪便虫卵镜检法不能应用于片形吸虫病的早期诊断;国际上虽然存在几种较好的免疫学诊断方法,但是其诊断抗原多为虫体纯化的天然混合抗原,成本高,具有一定交叉反应。为解决这一重要难题,本课题在前期的蛋白组学的基础上,通过生物信息学方法筛选到一些候选的诊断靶标,通过原核表达、蛋白纯化、Western bloting对诊断靶标进行筛选及评价,并筛选到一个新组织蛋白酶（命名为CL7）,建立了间接ELISA方法,并用该方法对田间样品进行了检测。随后对筛选的诊断靶标蛋白CL7进行单克隆抗体及多克隆抗体制备,进而建立了双抗夹心ELISA方法,用于检测片形吸虫的循环抗原,以达到片形吸虫病的早期诊断的目的。具体内容概述如下:1.诊断靶标的筛选、表达纯化及间接ELISA方法的建立和优化本研究选取 Annexin（Ann）、Leucine aminopeptidase（LAP）、CUB domain protein（CUB）以及一个命名为CathepsinL7（CL7）新的组织蛋白酶家族成员的蛋白基因进行分子克隆、载体构建、体外原核表达,蛋白纯化,用Western bloting对四个诊断靶标进行筛选及评价,随后以四种蛋白为包被抗原建立相应的间接ELISA（indirect enzyme linked immunoabsordent assay iELISA）方法以筛选最佳诊断靶标。使用片形吸虫感染的羊阳性血清和健康羊阴性血清用来评价其敏感性,结果表明:Ann、CUB敏感性（SEN）较低;LAP、Ann+LAP、CL7的敏感性较高。使用片形吸虫感染的羊阳性血清（n=16）和其他常见寄生虫阳性血清（n=16）,进行交叉反应,结果显示CL7特异性（SPE）最高,其他二者次之。在四个靶标蛋白中CL7是最有潜力的。2.CL7生物信息学分析、单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立本实验首次对CL7基因进行研究,通过生物信息学分析,证明其属于CL家族一员（组织蛋白酶L）,因此命名为（CL7）,并将其基因序列上传GenB ank,基因号:MN150457。同时本文对CL7还进行结构域分析、建模和可靠性3D建模。为建立适用于早期诊断的夹心ELISA（sandwich ELISA sELISA）方法,以CL7作为免疫原分别免疫小鼠和新西兰兔,成功获得11株CL7单克隆抗体（mAbs）和兔多克隆抗体。选取四株高滴度单抗:2B5、3B10、5A2、9H9进行小鼠腹水的制备、纯化、效价测定,亚型表位鉴定。结果表明:2B5、3B10、5A2、9H9分别属:IgG1、IgG2b、IgG1、IgG3,叠加ELISA结果显示2B5与5A2识别相似或相同表位,3B10与9H9识别相似或相同表位。用2B5和3B10与兔多克隆抗体进行组合,建立多种sELISA方法。对比发现CL7单抗2B5与兔多抗组合建立的sELISA效果最佳。并对该CL7 sELISA建立标准曲线,用于循环抗原CL7的定量分析。经ROC统计分析显示:CL7 sELISA对片形吸虫感染羊血清（n=12）检测下线为1.087ng/mL（Cut-off:0.4115）,并将上述阳性血清用于SEN与SPE的评估,结果表明二者均达到100%,CL7 sELISA检测不同感染期水牛的阳性（3-7感染周）、阴性血清时,检测下线为2.009 ng/mL（Cut-off:0.4845）,SPE达到100%,SEN达到93.75%。因此CL7 sELISA可应用于反刍动物片形吸虫的早期诊断。综上所述,本实验成功表达了四种片形吸虫重组蛋白,发现了一个良好的诊断靶标蛋白CL7,并建立了一种可以用于早期诊断的sELISA方法,对片形吸虫的诊断具有重要的应用价值。
盛兆安[3]（2020）在《大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究》文中研究说明背景:片形吸虫病主要是由片形属的肝片吸虫和大片吸虫感染所致的人畜共患寄生虫病,对公共卫生安全造成严重威胁。片形吸虫在感染宿主的过程中会不断产生可溶性的分子及胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）调控宿主免疫微环境,在宿主体内建立持续感染。脊椎动物的胃肠道内共生微生物在维持免疫系统的发育和功能的同时,对宿主的营养和能量代谢平衡亦起着至关重要的作用。目前已经有大量的研究显示寄生虫与宿主肠道菌群具复杂的相互作用关系,本研究通过描绘大片形吸虫感染后对宿主肠道菌群与免疫相关分子相互关系,对宿主-寄生虫-肠道菌群的复杂关系深入探讨,为实验室研究转化临床应用奠定基础。方法:（1）通过大片吸虫囊蚴感染水牛、BALB/C小鼠,大片吸虫成虫ESP、15k EVs、100k EVs腹腔注射小鼠;（2）对涉及与寄生虫免疫相关的Th1型和Th2型免疫细胞因子、转录因子和Toll样受体,血清中特异性抗体等免疫学指标进行检测,初步推测大片吸虫感染所诱导的宿主免疫反应类型;（3）收集实验动物的肠道内容物,经Illumina Hi Seq测序平台进行16S r RNA测序分析,评价大片吸虫感染对肠道菌群构成和功能的影响;（4）使用差速离心的方法,对大片吸虫产生的两种不同形态的胞外囊泡15,000×g（15k EVs）和100,000×g（100k EVs）进行分离鉴定,使用shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行分析;（5）将免疫学指标与肠道菌群数据进行相关性分析,推断大片形吸虫感染与宿主肠道菌群的相互作用机制。结果:发现宿主对大片吸虫的易感性与Th2型免疫反应密切相关,大片吸虫感染早期诱导Th1/2混合型的免疫反应,慢性感染阶段则转为典型的Th2型免疫反应。血清中特异性的IgG和IgG1的抗体水平随感染进程呈上升趋势。表明大片吸虫感染所诱导的Th2型相关的细胞因子和IgG1可能是其在自然宿主水牛体内成功建立感染的关键。同时小鼠模型发现激活的ERK通路和抑制经典的TLRs-IKB-NF-κB（p65）通路,参与了大片吸虫诱导的Th2型免疫反应。依据不同离心力,成功分离鉴定了两种不同形态的胞外囊泡15k EVs和100k EVs,并经shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行鉴定,发现其中含有多种与免疫调控、诊断、疫苗候选分子相关的蛋白;体内实验发现ESP、15k EVs、100k EVs均可诱导小鼠Th2/Treg型免疫反应,并通过上调T细胞共抑制分子CLAT-4和PD-1,限制Th1型免疫的发展。水牛感染大片吸虫可显着降低水牛肠道菌群的α-多样性,肠道菌群的构成在不同胃肠道部位的结果差异较大。RDA/CCA分析在科水平上Peptostreptococcaceae和Family＿XIII与高水平的IgG1和IL4相关。F.gigantica感染显着减少水牛结肠中产短链脂肪酸（short-chain fatty acid,SCFAs）菌群Lachnospiraceae＿NK3A20＿group、Alistipes的丰度,降低结肠SCFAs浓度,大片吸虫感染小鼠同样观察到可减少结肠中产SCFAs的uncultured＿bacterium＿Lachnospiraceae丰度,提示Th2型免疫反应与下调菌群产生SCFAs相关。大片吸虫感染与成虫ESP、15k EVs、100k EVs注射均可降低小鼠结肠内容物菌群的α-多样性的,RDA/CCA分析Bacteroidetes和Proteobacteria与Th2和Treg型细胞因子具较强的相关性,而Bacteroidaceae和Cyanobacteria可能参与了大片吸虫感染引起的宿主纤维化的进程。结论:大片吸虫感染可通过调控宿主的肠道菌群的结构与菌群代谢产物影响宿主的免疫应答,促进其在宿主体内存活。对大片吸虫-宿主-肠道菌群作用关系的深入了解有助于我们更好的防控片形吸虫病提供参考。
周鸿让[4]（2020）在《重组酶介导的核酸等温扩增技术快速检测棘球绦虫的研究》文中研究指明棘球蚴病（Echinococcosis）又称包虫病（Hydatidosis）,是一种可引起严重疾病负担并影响全球公共卫生安全和畜牧业发展的慢性人兽共患寄生虫病[1],可造成严重的医疗、社会和经济负担及后果[2-5]。所以早期、准确的诊断和检测,实时监测各类宿主的感染情况,对该病的防控具有重要意义[1,6]。本研究针对棘球绦虫的鉴别与棘球蚴病诊断方法的可操作性、检测灵敏度以及特异性,并依据重组酶介导的等温扩增方法（Recombinase-aided isothermal amplification,RAA）的原理,建立了检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的核酸等温扩增技术,具体开展以下三部分研究工作,以期为棘球绦虫的检测以及棘球蚴病的诊断提供可选择的检测方法:一、重组酶介导的等温核酸扩增技术检测细粒棘球绦虫G1方法的建立与初步应用评价本部分以细粒棘球绦虫G1（EgG1）线粒体基因序列（GenBankTM No.AF297617）作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成6对引物。经筛选获取最佳引物,并从温度、引物及醋酸镁3个方面以优比RAA反应体系。以PCR作为平行对照,分别以不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的含目的基因片段不同拷贝数的pMD19-T（Simple）克隆质粒进行RAA灵敏度扩增检测,同时以多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、贾第鞭毛虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板进行RAA扩增用于特异性评价。此外,分别对不同样本（感染EgG1的动物组织样本（10份）、模拟现场阳性犬粪样本（3份）以及现场阳性犬粪样本（5份））进行检测,以验证所建立的RAA检测方法的可靠性和实用性。本研究建立的RAA法可在40 min内特异性扩增EgG1的目的基因片段。经优化确立最佳温度为37℃,最佳引物（10μmol/L）用量为2μL,即反应浓度为0.4μmol/L,最佳醋酸镁（280mmol/L）用量为2.5μL,即反应浓度为14 mmol/L的反应体系。灵敏度方面,RAA法最低可检测到10 pg基因组DNA以及104个拷贝数的质粒;特异性方面,以其他寄生虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。感染EgG1样本检测结果均为阳性,且与PCR检测结果一致。二、重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用评价本部分以多房棘球绦虫（Em）线粒体基因序列（GenBankTM No.AB01 8440）作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成5对引物。经筛选获取最佳引物后,再从温度、引物及醋酸镁3个方面以优化RAA反应体系。以PCR作为平行对照,分别以不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的质粒进行RAA扩增,以评价RAA检测方法的灵敏度;同时以其他寄生虫基因组DNA为模板进行RAA扩增用于特异性评价。此外,分别对不同样本（感染Em的动物组织样本（9份）、模拟现场阳性犬粪样本（3份）以及现场阳性犬粪样本（2份））进行检测,以验证所建立的RAA检测技术的可靠性和实用性。本研究建立的RAA法可在40 min内特异性扩增Em的目的基因片段。经优化确立最佳温度为37℃,最佳引物（10μmol/L）用量为2μL,即反应浓度为0.4μmol/L,最佳醋酸镁（280mmol/L）用量为2.5μL,即反应浓度为14 mmol/L的反应体系。灵敏度方面,RAA法最低可检测到10 pg基因组DNA以及104个拷贝数的质粒;特异性方面,以其他寄生虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。感染的样本检测结果均为阳性,且与PCR检测结果一致。三、重组酶介导的多重核酸等温扩增法鉴别细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫技术的建立与初步应用评价本部分利用第一与第二部分所设计的引物（专利申请号:20191116433 7.5）建立了可在40 min内特异性扩增EgG1与Em目的基因片段的重组酶介导的多重核酸等温扩增方法（Multiplex recombinase-aided isothermal amplification,mRAA）。实验分别从温度、引物及醋酸镁3个方面进行多重RAA反应体系的优化。以mPCR作为平行对照,应用mRAA方法扩增不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的质粒,以评价RAA检测方法的灵敏度;同时检测多种寄生虫的基因组DNA,以评价其特异性。对所建立的方法优化后,应用于样本（感染棘球绦虫的动物组织样本19份（Eg,10份;Em,9份）、模拟现场阳性犬粪样本3份（含Eg与Em混合样本,3份）以及现场阳性犬粪样本7份（Eg,5份;Em,2份））的检测,以验证所建立的mRAA检测技术的可靠性和实用性。本研究经优化确立了最佳温度为37℃,EgG1正、反向引物（10μmol/L）最佳用量各为1μL,即反应浓度为0.2μmol/L,Em正、反向引物（10μmol/L）各为1.5μL,即反应浓度为0.3 μmol/L,醋酸镁（280mmol/L）最佳用量为2.5 μL,即反应浓度为14 mmol/L的反应体系。在灵敏度检测方面,mRAA最低可检测出0.1 ng的基因组DNA以及104个拷贝数的质粒;在特异性检测方面,以其他寄生虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。感染样本mRAA检测结果均为阳性,且与mPCR检测结果一致。本研究建立的RAA以及mRAA检测方法较常规PCR快速,检测灵敏度和特异性均较高,其在EgG1与Em虫种的鉴定方面以及棘球蚴病基因诊断方面具有重要价值,为快速检测提供一种新的敏感和特异的工具。有望为棘球蚴病的现场防治工作提供高效、快速的技术支撑。
贾骁晔[5]（2020）在《肝片吸虫病诊断候选抗原的筛选和制备》文中进行了进一步梳理肝片吸虫病是由肝片吸虫（Fascioloa hepatica,F.hepatica）寄生于人和家畜肝脏、胆管,引起肝炎、胆管炎以及全身性营养障碍的一种新兴人畜共患寄生虫病。该病严重影响了全球畜牧业的发展,也造成了极其严重的公共卫生问题,吸引了全世界的广泛关注。为了丰富和拓展肝片吸虫病的诊断靶点,突破肝片吸虫病原学诊断方法的局限性,研究更加经济、快速、特异、敏感的肝片吸虫感染病的诊断方法,本研究通过肝片吸虫噬菌体展示cDNA文库的筛选、肝片吸虫特异性抗原分子的生物信息学分析、相应抗原基因的克隆、重组质粒的构建以及重组蛋白的诱导表达与Western Blot鉴定分析等研究方法和技术对肝片吸虫病的诊断候选抗原进行了筛选和制备。结果如下:（1）通过对肝片吸虫噬菌体展示cDNA文库的筛选和分析,成功获得了38条肝片吸虫基因,包括24条为已明确的肝片吸虫蛋白基因,14条为肝片吸虫假定蛋白基因。并从中筛选了5个肝片吸虫特异性抗原基因作为肝片吸虫病诊断候选抗原用于后续探索研究:组织蛋白酶L（Cathepsin L,Cat）、假定蛋白D915000758、假定蛋白D915001617、假定蛋白D915005900以及假定蛋白D915010969。（2）对5个候选抗原分子进行了基本的生物信息学分析,并成功预测了这些抗原分子的蛋白质空间结构。组织蛋白酶L具有完整的开放阅读框,编码区序列长981 bp,编码326个氨基酸;该蛋白为稳定的亲水性蛋白,其多肽链和主链骨架盘绕折叠形成了包含103个的α-螺旋、65个延伸链、22个β-转角和136个无规则卷曲的构象。假定蛋白D915000758开放阅读框完整,编码区序列长345bp,编码114个氨基酸;是一种稳定的亲水性蛋白,其空间构象包含58个的α-螺旋、7个延伸链、7个β-转角和42个无规则卷曲。假定蛋白D915001617开放阅读框完整,编码区序列长798 bp,编码265个氨基酸;为不稳定的疏水性蛋白,其空间构象包含159个的α-螺旋、40个延伸链、14个β-转角和52个无规则卷曲。假定蛋白D915005900开放阅读框完整,编码区序列长345 bp,编码114个氨基酸;为不稳定的亲水性蛋白,其空间构象包含11个的α-螺旋、27个延伸链、4个β-转角和72个无规则卷曲。假定蛋白D915010969开放阅读框完整,编码区序列长147 bp,编码48个氨基酸;该蛋白为稳定的亲水性蛋白,其空间构象包含17个的α-螺旋、9个延伸链、6个β-转角和16个无规则卷曲。（3）通过PCR克隆了诊断候选抗原基因片段,并成功连接表达载体pET-32a,转化至BL21（DE3）感受态细胞。（4）通过IPTG成功诱导重组蛋白进行原核表达。SDS-PAGE表明重组蛋白pET-Cat L、pET-000758、pET-001617、pET-005900和pET-010969在37℃被诱导6 h后,均以包涵体形式进行表达,蛋白分子量大小分别为:55 kDa、32 kDa、50 kDa、32 kDa和25 kDa。Western-Blot证明这5种重组蛋白都可以被肝片吸虫阳性血清特异性识别,具有良好的免疫反应性。综上所述,得出以下结论:肝片吸虫组织蛋白酶L、假定蛋白D915000758、假定蛋白D915001617、假定蛋白D915005900以及假定蛋白D915010969具有良好的免疫反应性,可成为潜在的肝片吸虫病诊断候选抗原靶点,应用于肝吸虫病的诊断研究中。
侯林静[6]（2019）在《大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化》文中认为本研究目的是从大片形吸虫分泌排泄产物（Fasciola gigantila Excretory-Secretory Products,FgESP）凝胶过滤层析组分及其鉴定蛋白成分中筛选出大片形吸虫病早期诊断抗原并建立诊断方法,为大片形吸虫病的诊治及开发早期诊断试剂盒奠定基础。本研究通过制备成虫FgESP,进行凝胶过滤层析,从中收集第一个波峰及其附近层析组分,依次命名为F1、F2、F3、……Fn等。以不同层析组分作为抗原,筛选出检测效果较优层析组分。同时将效果较好层析组分进行质谱分析,选取有潜在诊断价值的3个候选抗原进行原核表达。以较优层析组分作为诊断抗原与标准阳性和标准阴性水牛血清反应,建立并优化间接ELISA方法;分别将3个重组蛋白及其混合蛋白作为诊断抗原与标准阳性和标准阴性水牛血清及感染大片形吸虫4周小鼠血清反应,进行间接ELISA方法优化。应用优化好的ELISA方法检测0～14周水牛血清以及广西部分地区700份奶牛血清Ig G抗体水平,比较Fg ESP与较优层析组分作为诊断抗原的结果。本研究筛选检测效果较好层析组分为F21、F22与F23。将效果较好的层析组分进行质谱分析,结果含有硫氧还蛋白过氧化物酶1（Thioredoxin Peroxidase-1,TPx-1）、组织蛋白酶 B3（Cathepsin B3,Cat B3）和组织蛋白酶L1（Cathepsin L1,Cat L1）、热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）和微管蛋白（Tubulin proteins）等潜在诊断价值的候选抗原。筛选出TPx-1、Cat B3和Cat L1作为诊断候选抗原,进行原核表达。FgTPx-1表达形式为可溶性蛋白和包涵体两种,FgCat B3和FgCat IL1表达形式均为包涵体。FgTPx-1、FgCat B3和FgCat L1重组蛋白分子量分别为46 kDa、40 kDa和39 kDa。效果较优的层析组分F22作诊断抗原的最优条件是包被浓度为0.157 μg/mL,水牛血清稀释倍数为1:400,二抗稀释倍数为1:40000,阴阳临界值为0.391。F22层析组分最优浓度为常用FgESP抗原用量（2.5 μg/mL）的1/16。通过间接ELISA优化结果显示FgTPx-1和FgCat B3单个蛋白对水牛阴阳性血清反应P/N值较小。FgTPx-1和FgCat B3浓度为1.25 μg/mL,小鼠血清稀释倍数为1:100时P/N值较大。FgCat L1用水牛血清和小鼠血清优化时,均在抗原浓度为0.157 μg/mL,血清比例为1:100时P/N值较大。混合蛋白浓度为0.313μg/mL,水牛血清比例为1:100时P/N值较大,混合蛋白浓度为1.25 μg/mL,小鼠血清比例为1:100时P/N值较大。混合蛋白与FgCat L1在0～14周实验感染水牛血清检测时,实验组OD450nm值整体呈上升趋势,混合蛋白阴阳性差值在1～8周检测时略低于FgCat L1。将FgESP、F22、FgCat IL1与混合蛋白进行间接ELISA诊断比较,用实验感染水牛第4周血清优化,F22层析组分在血清稀释比为1:400,P/N值最大,其次为FgESP。用水牛标准血清优化,4个诊断抗原P/N值均较大。用实验感染小鼠4周血清优化,F22层析组分在血清稀释比为1:400时,P/N值最大,4个诊断抗原阴阳性差异均较大。FgESP与小鼠血清灵敏性略低于其他蛋白,其中FgCat L1与混合蛋白作为诊断抗原时,阴阳性差异大,但两者P/N值较接近。F22检测水牛0～14周血清抗体水平结果为从第2周抗体水平明显开始升高,快速升至4周后呈平缓上升趋势,FgESP检测结果为从第2周抗体水平明显升高,抗体水平呈平缓上升趋势。抗F22-IgG水平均明显高于抗FgESP-IgG水平。FgESP和F22层析组分检测0～14周水牛血清的准确率为100%。普查广西部分地区700份奶牛血清,F22的阳性检出率为50.43%,FgESP的阳性检出率为45.29%。F22建立的间接ELISA方法效果较好。本研究发现有效层析组分主要集中于第一个峰、获得检测效果较优层析组分F22并建立了以层析组分F22为诊断抗原的间接ELISA方法。本研究原核表达的FgTPx-]、FgCat L1和FgCat B3三种重组蛋白,可为进行进一步功能研究奠定基础。FgESP、F22和FgCat L1与混合蛋白对大片形吸虫病的诊断结果表明,F22、FgCat L1诊断效果较好,混合蛋白无明显优势,其中F22可进行水牛大片形吸虫病较早期诊断,为开发大片形吸虫病早期诊断试剂盒奠定基础。
王晓旭[7]（2019）在《肝片吸虫病诊断抗原的筛选及间接ELISA方法的建立》文中研究说明肝片吸虫病是由肝片形吸虫（Fasciola hepatica）寄生于牛、羊等反刍动物的肝脏和肝胆管内而引起的一种吸虫病。本病呈世界性流行,据统计,全球约有2.5亿-3亿牛、羊感染片形吸虫,每年因片形吸虫感染造成的经济损失超过30亿美元,特别重要的是,该虫还可感染人,是一种非常重要的人兽共患病病原。因此,肝片吸虫病不仅给畜牧业生产带来巨大经济损失,同时也给人类健康带来极大威胁。目前,我国对肝片吸虫病的诊断主要以虫卵检查法和剖检法为主,但虫卵检查只能检测肝片吸虫感染晚期的动物,而肝片吸虫对动物的危害则主要集中在感染早期的移行阶段;剖检法是对疑似感染的动物进行剖杀检查,不适用于活体诊断。近年来发展了一些免疫学诊断方法,如间接血凝、ELISA方法等,但这些方法多处在实验室研究阶段,还没有在临床中大面积应用。虽然国外已有商品化的诊断试剂盒,但其价格十分昂贵。因此,我们急需建立一种早期、敏感,特异的诊断方法,为其市场化奠定基础。利用本实验室前期研究的绵羊肝片吸虫阳性血清与肝片吸虫排泄分泌抗原免疫共沉淀产物的质谱分析结果,筛选出5种存在于肝片吸虫生长发育各个时期的蛋白,分别为组织蛋白酶L1（Cathepsin L1,CL1）、组织蛋白酶L2（Cathepsin L2,CL2）、热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）、亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidase,LAP）和天冬氨酰内肽酶（Legumain,LEG）,其中LEG在肝片吸虫蛋白中的研究还未见报道。通过RT-PCR获得肝片吸虫的cDNA,设计特异性引物扩增出5种蛋白的基因片段,目的片段经双酶切后,连接至表达载体pET-28a（+）中,将连接产物转化至BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE,确定蛋白正确表达后再Western blot分析蛋白是否具有反应原性。对蛋白的纯化方法及条件进行优化,收集纯化后的蛋白并进行浓度测定。蛋白纯化后,对5种蛋白进行棋盘法ELISA检测,棋盘法结果进行分析后,根据P/N值筛选出CL1为最适ELISA诊断蛋白进行后续优化实验。优化间接ELISA反应条件,包括包被液选择、包被蛋白浓度、封闭液选择及封闭时间摸索、一抗、二抗浓度、血清中非特异性因素的去除、特异性实验、敏感性实验及阴阳性临界值确定等。结果表明:最佳包被液为碳酸盐缓冲液（CBS）,包被抗原最适浓度为7.5μg/mL,最佳封闭液为5%的脱脂乳,最佳封闭温度及时间为37℃2 h,最佳一抗稀释浓度为1:200,37℃孵育2 h,二抗按照1:10000倍稀释最佳;建立的间接ELISA诊断方法不与大片吸虫、日本血吸虫等阳性血清发生交叉反应。本方法重复性好,批内及批间的变异系数均低于10%,特异性为97.3%,敏感性为94.0%,最早可以检出人工感染28天的肝片吸虫绵羊血清。与国外商品化诊断试剂盒比较其符合率为99.1%。临床检测了黑龙江省及吉林省的绵羊308份血清,阳性率为3.9%。本实验成功地表达了5种蛋白,筛选出了反应原性良好,能适用于肝片吸虫病诊断的蛋白——组织蛋白酶L1,并利用该蛋白作为诊断抗原建立了检测肝片吸虫抗体的间接ELISA方法,该方法具有早期、敏感、特异、价格低廉等优点。为肝片吸虫病诊断试剂盒的研究奠定基础。
李雪[8]（2018）在《大片吸虫两种CD59样蛋白的生物信息分析及体外重组表达》文中研究表明片形吸虫体被的表面富含糖蛋白。这些体被的蛋白与宿主组织和体液直接接触,是寄生虫与宿主发生生化反应,身体的免疫反应和生理反应的位置,对片形吸虫的宿主免疫机制与免疫逃避等有重要作用。研究片形吸虫的体被蛋白对片形吸虫的免疫预防、治疗以及疫苗的研究有着重要的作用。本实验通过PCR扩增与序列测序获得了大片吸虫CD59-1与CD59-2蛋白基因序列。FgCD59-1蛋白大小为122个氨基酸残基,FgCD59-2蛋白大小为127氨基酸残基。两个蛋白皆N端有一个信号肽片段,C端有一个GPI锚定片段,序列内皆有一个LY6/CD59的保守结构域“CCXXXXCN”。通过序列相似性比对分析发现,大片吸虫的FgCD59-1、FgCD59-2蛋白序列与肝片吸虫的FhCD59-1、FhCD59-2蛋白序列的相似性非常高。对大片吸虫CD59-1蛋白6个克隆测序分析和大片吸虫CD59-2蛋白3个克隆测序分析证实了 FgCD59-1和FgCD59-2蛋白多态性不高。将大片吸虫FgCD59-1、FgCD59-2蛋白序列与肝片吸虫的FhCD59-1、FhCD59-2蛋白,以及其他43种蛋白构建系统进化树,发现FgCD59-1与肝片吸虫 CD59 样蛋白 FhCD59-1、FhCD59-4、FhCD59-5、FhCD59-6、FhCD59-7、FhCD59-8属于同一个分群。而FgCD59-2与FhCD59-2属于同一个分群。通过应用SWISS-MODEL、modeller等一系列的生物信息学软件,对FgCD59-1和FgCD59-2蛋白的一级结构、二级结构和三级结构、跨膜区域、亚细胞定位进行了预测和分析,并预测构建了较为准确的FgCD59-1和FgCD59-2蛋白的同源模型。根据FgCD59-1和FgCD59-2基因的序列设计出两对带有酶切位点的特异性引物,从大片吸虫虫体提取大片吸虫的RNA,并通过RT-PCR扩增出目的片段。克隆测序验证后,克隆载体进行重组克隆。鉴定序列正确后双酶切出粘性未端,并将其连接到表达载体pET-32a中,成功构建出带有Trx标签与 6His 标签的表达质粒 pET-32a-FgCD59-1 和 pET-32a-FgCD59-2。将鉴定正确的重组质粒转化到表达细菌BL21中,通过IPTG诱导蛋白表达,优化表达菌、表达温度、诱导表达IPTG浓度等表达条件,之后大量获得融合蛋白包涵体。将包涵体变性复性之后,获得蛋白序列不变的可溶性蛋白,并使用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。结果证明确实得到了FgCD59-1融合蛋白和FgCD59-2融合蛋白。本研究获得并分析了FgCD59-1、FgCD59-2两个蛋白基因,预测分析了蛋白结构并构建了两个同源模型。成功构建了 2个蛋白基因的表达载体,并获得2个目的融合蛋白。为进一步研究两种蛋白的结构性质,以及其在大片吸虫免疫过程中的作用奠定了基础。
施维[9]（2018）在《片形吸虫及其分泌排泄产物对巨噬细胞极化和宿主细胞免疫应答作用的研究》文中研究表明片形吸虫的两个致病种大片形吸虫和肝片形吸虫均能感染人和哺乳动物引起片形吸虫病,不同宿主的易感性不同,这与片形吸虫对宿主免疫应答的调控或逃避有关。肝片形吸虫及其ESP已被证实能诱导小鼠和牛巨噬细胞的M2型极化,而大片形吸虫在宿主中能否引起相似的免疫反应尚无明确的结论。本研究旨在通过体内外试验探讨大片形吸虫及其ESP在不同宿主引起的巨噬细胞极化和固有免疫反应的差异及其免疫机制,并将淋巴插管模型应用于片形吸虫ESP对宿主免疫细胞的作用研究,以探明片形吸虫及其ESP对宿主免疫应答的调控机制,为理解大片形吸虫与宿主免疫系统的相互作用提供可靠的理论基础。本研究取得以下成果:1.用大片形吸虫囊蚴感染水牛、昆明小鼠（KM）和C57BL/6Nju小鼠（B6）,分别于水牛感染后4周、10周、14周和小鼠感染后3周、4周、7或8周处死。通过肝组织切片观察到水牛和小鼠肝脏均能从炎症浸润向结缔组织增生转归,水牛感染14周可见肝内肉芽组织和成虫形成。实时荧光定量PCR检测肝脏枯否细胞（巨噬细胞）分子标志和细胞因子mRNA表达量,并用ELISA检测血清IFN-γ和IL-4,结果显示:随着感染病程的加剧水牛枯否细胞表型从M2型极化向M1、M2型共上调的趋势转变,KM小鼠枯否细胞表型则由前期的M1+M2混合型向M0型转归,而B6小鼠则表现为更明显的M2型极化。结果表明:大片形吸虫感染水牛和小鼠可诱导肝脏KC表型和细胞因子的表达变化存在较大宿主差异,这些变化的宿主差异是与不同宿主肝脏的载虫能力、损伤修复能力、病变程度以及虫体在宿主体内移行、发育密切相关的。2.用大片形吸虫分泌排泄产物200μg FgESP腹腔注射KM小鼠和B6小鼠,4天、7天隔日注射作为短期试验组,14周每周注射作为长期试验组,注射PBS为对照。通过肝组织切片观察到FgESP腹腔短期注射不会引起小鼠肝脏明显的组织学变化,而长期注射会导致细胞膜通透性增加、结缔组织增生和纤维化趋势。实时荧光定量PCR检测肝脏枯否细胞（巨噬细胞）分子标志和细胞因子mRNA表达量,结果显示:KM小鼠短期注射FgESP会引起肝组织iNOSmRNA表达下调,但B6小鼠CD206、Arg-2、YM-1的表达上调,两种小鼠枯否细胞均表现出M2型极化优势;两种小鼠长期注射FgESP则引起完全不同的KCs表型趋势,其中KM小鼠表现为M1和M2型同时上调的混合型,B6则表现为M1和M2均没变化的M0型。3.用200 gg/mL大片形吸虫分泌排泄产物FgESP体外刺激水牛原代BLMΦ和B6小鼠来源的传代iPMΦ（野生型）两类MΦ48小时。实时荧光定量PCR测定两类巨噬细胞表面分子标志和细胞因子mRNA表达量,化学法测定细胞Arg-1,Griess法测定细胞上清NO浓度,ELISA测定上清IFN-γ、IL-4浓度,结果显示:水牛BLMΦCD68基因表达下调、Arg-2基因表达上调,Arg-1、NO的合成增加,上清中的IFN-γ浓度下降、IL-4没有明显变化,提示可能存在M2型极化和细胞激活的抑制或凋亡的发生;小鼠野生型iPMΦArg-1合成增加,上清中的IL-4浓度显着升高,而IFN-γ、NO浓度没有变化,也提示M2型极化。结果表明:FgESP体外刺激不同宿主MΦ均能诱导M2型极化。4.用2000μg/mL FgESP分别体外刺激B6小鼠来源的基因敲除iPMΦ（MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-、TLR-2/4-/-）,测定上清NO、IFN-γ、IL-4浓度和细胞裂解物的Arg-1含量,并与野生型iPMΦ进行比较,结果显示:MyD88的缺失导致IL-4的分泌与对照组无差异,而MyD88、TRIF同时缺失导致IL-4的分泌减少,两者均低于野生型iPMΦ;无论是MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-还是TLR-2/4-/-iPMΦ,FgESP体外刺激诱导的Arg-1产量均与对照组无差异。结果表明:FgESP体外刺激小鼠传代巨噬细胞能诱导依赖于MyD88及其相关通路的M2型激活,促进Th2型细胞因子分泌,促进Arg-1合成和NO分泌抑制,而TRIF和TLR2、TLR4也有可能以某种方式发挥作用。5.通过外科手术成功构建绵羊的股骨前伪输入淋巴插管、肝脏输入淋,巴插管,成功率分别为约70%和33%左右。6.将200μg荧光标记的肝片形吸虫分泌排泄产物FhESP于绵羊股骨前区域多点皮下注射（OVA设为对照抗原）,并通过股骨前伪输入淋巴插管收集0～7天不同时间点的淋巴液并分离免疫细胞,流式细胞术分析免疫细胞种类和抗原吞噬细胞的比例,荧光实时定量PCR测定巨噬细胞表面分子标志mRNA表达量,ELISA测定淋巴液的IFN-γ和IL-4,结果显示:FhESP注射刺激能使股骨前输入淋巴中的中性粒细胞、单核细胞的比例分别在注射后4～8小时和8～12小时特异性升高,淋巴细胞的比例在注射后4～8小时特异性降低,DCs的比例在注射后4～8小时升高但与OVA对照抗原相比缺乏统计学差异,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞样细胞的比例在各时间点无明显改变;抗原吞噬细胞的数量在注射后4～12h的短暂提高,其中,嗜酸性粒细胞、单核细胞和树突状细胞对FhESP的早期吞噬具有特异性,但DCs的两个亚群的比例变化不具抗原特异性;FhESP刺激能导致淋巴液分离到的细胞M2型分子标志CD206、Arg-2和YM-1的表达均在刺激后24小时内特异性上调,淋巴液IL-4在0～8h特异性升高,IFN-γ、IL-10、IL-12的含量没有特异性变化。结果表明:绵羊股骨前伪输入淋巴插管操作简单,成功率高,适用于免疫反应动力学试验,通过该模型我们发现FhESP能在绵羊体内促进单核细胞和中性粒细胞的快速招募,提高吞噬细胞抗原吞噬能力,特异性诱导巨噬细胞M2型极化和Th2细胞因子分泌。综上所述,本文认为大片形吸虫感染导致肝脏枯否细胞表型极化趋势和细胞免疫应答趋势存在较大的宿主差异,主要取决于宿主肝脏的载虫能力、损伤修复能力和病变进程。大片形吸虫分泌排泄产物FgESP则能在体、内外诱导动物宿主巨噬细胞依赖于MyD88信号通路的M2型极化,并刺激分泌Th2型细胞因子,通过上调Arg-1抑制NO分泌降低巨噬细胞清除病原的能力,可能是大片形吸虫逃避巨噬细胞免疫杀伤的策略。此外,在绵羊身上成功构建并应用伪输入淋巴插管模型研究肝片形吸虫分泌排泄产物FhESP对宿主免疫细胞的作用,发现FhESP具有早期招募中性粒细胞和单核细胞、提高吞噬细胞早期抗原吞噬、诱导M2型巨噬细胞和Th2型细胞免疫的能力。
岳东梅[10]（2017）在《大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析》文中认为片形吸虫不仅感染牛羊等反刍动物,而且也可感染人体,严重威胁着人和动物的健康。因此,建立高效准确的诊断方法是防控该病的研究重点。片形吸虫包括肝片形吸虫、大片形吸虫及其中间型,目前对于大片形吸虫及其中间型的相关研究相对较少。因此,本研究选择大片形吸虫为研究对象,通过对大片形吸虫排泄分泌（ES）抗原与宿主的互作,旨在筛选、鉴定及分析出具有诊断潜力的蛋白,为建立大片形吸虫的诊断方法奠定基础。本研究分为三部分。第一部分,对大片形吸虫的鉴定。首先,将采自广西南宁的144条片形吸虫虫体进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。形态学鉴定这144条虫体均为片形吸虫。对这144条虫体的核糖体第二内转录间隔区（ITS-2）序列进行了扩增、测序,结果表明144个PCR样品的测序结果区别于肝片形吸虫及中间型,而均与大片形吸虫ITS-2序列（GenBank accession AJ557569）匹配率达99.7%,从而判定分离得到的144条片形吸虫均为大片形吸虫,不含中间型。第二部分,大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选。首先,利用体外培养方法收集大片形吸虫虫卵,对虫卵进行体外培养孵出毛蚴感染淡水螺,使其在淡水螺体内生长发育,直至尾蚴逸出螺体脱尾形成囊蚴,收集形成的囊蚴（感染虫卵后35 d）,并进一步用囊蚴经口感染水牛（约500个囊蚴/头）,在水牛感染后的14 d、42 d、70 d、98 d,分别采血制备血清。其次,利用体外培养方法分别收集大片形吸虫ES抗原,将收集的ES抗原免疫家兔制备阳性血清,用间接ELISA方法检测其抗体效价,结果表明ES抗原制备的阳性血清效价可达到1:1 000,说明大片形吸虫ES抗原的免疫原性较好,可用于后续的试验。然后,将大片形吸虫ES抗原分别与水牛各时间段的血清互作,通过免疫共沉淀和LC-MS/MS（质谱）试验,共获得了465个非冗余蛋白。进一步用BlastP同源性比对、UniProt鉴定,找到57个已知蛋白,分别在42 d、70 d和98 d的蛋白有13（22.8%）个、5（8.8%）个和7（12.3%）个,同时存在于42 d和70 d、70 d和98 d、42 d和98 d的可被鉴定的蛋白分别有8（14%）个、5（8.8%）、1（1.8%）个,同时存在于42 d、70 d和98 d可被鉴定的蛋白有18（31.6%）个。进一步用生物信息学分析,预测α-微管蛋白和亮氨酸氨肽酶等蛋白具有诊断价值。第三部分,对筛选出的具有代表性的α-微管蛋白和亮氨酸氨肽酶进行克隆、原核表达,并探索其作为片形吸虫病诊断抗原的可行性。结果表明,成功克隆了片段长为1 356 bp、能编码452个氨基酸、理论分子量为48.99 kDa的α-微管蛋白基因和片段长为1 572 bp、能编码523个氨基酸、理论分子量为56.38 kDa的亮氨酸氨肽酶基因。这两个蛋白的二级结构预测都以无规卷曲为主,抗原表位在整个序列均有分布。三级结构的主要功能区域都在N端。将α-微管蛋白基因插入载体pGEX-6P-1（+）,亮氨酸氨肽酶基因插入载体pET-30a分别进行原核表达。发现经IPTG诱导表达的重组蛋白pGEX-6P-1（+）-FgAT分子量约为76 kDa（含载体携带的26 kDa的GST标签）,且以融合蛋白形式表达,经Glutathione-Sepharose beads纯化后,获得了较高纯度的重组蛋白pGEX-6P-1（+）-FgAT;经IPTG诱导表达的重组蛋白pET-30a-FgLAP分子量约为56 kDa,以包涵体形式表达,经Ni-NTA His bind Resin纯化后获得较高纯度的重组蛋白pET-30a-FgLAP。这两个重组蛋白分别与大片吸虫ES抗原免疫家兔后制备的阳性血清、水牛感染大片吸虫不同期的阳性血清反应,经Western Blot分析证实均具有免疫反应性。本研究通过以上三个部分的试验,成功鉴定出大片形吸虫ES抗原中与宿主互作的蛋白,包括465个非冗余蛋白。利用生物信息学分析,筛选出57个已知蛋白,并进一步鉴定出具有代表性的α-微管蛋白基因和亮氨酸氨肽酶基因。通过对这两个基因的克隆、表达及免疫反应性分析,推断出它们在大片形吸虫病诊断中具有很大的潜力。
二、水牛实验感染大片吸虫及ELISA检测特异性抗体的变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、水牛实验感染大片吸虫及ELISA检测特异性抗体的变化（论文提纲范文）
（1）基于大片吸虫分泌排泄产物层析组分的牛片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 虫体及血清 |
| 1.3 FgESP层析组分的制备 |
| 1.4 UV280 吸收峰及较优层析组分的筛选 |
| 1.5 基于FgESP最优层析组分的间接ELISA方法的建立 |
| 1.5.1 间接ELISA操作方法 |
| 1.5.2 抗原、血清和酶标二抗最佳工作浓度的确定 |
| 1.5.3 最佳显色时间确定 |
| 1.5.4 阴阳临界值的确定 |
| 1.5.5 敏感性试验 |
| 1.5.6 特异性反应 |
| 1.6 间接ELISA检测试验感染的水牛 |
| 1.7 临床检测 |
| 1.8 数据统计 |
| 2 结 果 |
| 2.1 UV280吸收峰的筛选 |
| 2.2 最优层析组分的筛选 |
| 2.3 间接ELISA方法的建立 |
| 2.3.1 抗原、血清和酶标二抗最佳工作浓度及显色时间的优化 |
| 2.3.2 临界值的确定 |
| 2.3.3 特异性试验结果 |
| 2.3.4 敏感性试验结果 |
| 2.4 试验感染水牛0～14周血清的检测 |
| 2.5 临床检测 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（2）片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫的生物学特征和生活史 |
| 1.1.1 片形吸虫的主要生物学特性 |
| 1.1.2 片形吸虫的生活史 |
| 1.2 片形吸虫病的临床表现和流行趋势及危害 |
| 1.2.1 片形吸虫病的临床表现 |
| 1.2.2 片形吸虫病的流行趋势及危害 |
| 1.3 片形吸虫病的治疗和预防 |
| 1.4 片形吸虫病诊断研究进展 |
| 1.4.1 经典方法 |
| 1.4.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.4.3 免疫学诊断 |
| 1.5 片形吸虫诊断抗原研究进展 |
| 1.5.1 排泄分泌物抗原ESP |
| 1.5.2 脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding proteins FABP) |
| 1.5.3 谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase GST) |
| 1.5.4 鞘脂激活蛋白样蛋白(Saposin-like protein SAP) |
| 1.5.5 亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase LAP) |
| 1.5.6 组织蛋白酶(Cathepsin proteases CAT) |
| 1.5.7 其他抗原 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 诊断靶标的筛选、表达纯化及间接ELISA方法的建立和优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 肝片吸虫总RNA的提取 |
| 2.2.2 反转录步骤 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.4 Ann CUB目的基因的合成 |
| 2.2.5 Ann CUB克隆载体的构建 |
| 2.2.6 Ann CUB表达载体的构建 |
| 2.2.7 Ann、CUB、CL7、LAP原核表达和纯化 |
| 2.2.8 Ann、CUB、LAP、CL7 Western blotting免疫反应性分析 |
| 2.2.9 筛选最佳抗原靶标 |
| 2.2.10 计算统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Ann、CUB目的基因的合成和Ann、CUB、CL7双酶切鉴定 |
| 2.3.2 Ann、CUB、LAP、CL7表达载体测序结果 |
| 2.3.3 Ann、CUB、LAP、CL7重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.3.4 Ann、CUB、LAP、CL7重组蛋白的免疫反应性 |
| 2.3.5 Ann、CUB、LAP、CL7多种间接ELISA方法建立 |
| 2.3.6 LAP、Ann+LAP、CL7三种ELISA方法特异性实验 |
| 2.3.7 CL7 iELISA方法的评价 |
| 2.3.8 CL7 iELISA方法田间样本检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CL7单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与细胞 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CL7抗原的序列上传和生物学分析 |
| 3.2.2 BALB/c小鼠免疫 |
| 3.2.3 鼠单克隆抗体制备 |
| 3.2.4 单抗腹水制备和纯化 |
| 3.2.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.2.6 兔多克隆抗体制备 |
| 3.2.7 夹心ELISA方法的建立 |
| 3.2.8 夹心ELISA方法的评价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CL7生物学分析 |
| 3.3.2 CL7单克隆抗体的制备 |
| 3.3.3 CL7兔多克隆抗体制备 |
| 3.3.4 CL7夹心ELISA方法的建立和评价 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（3）大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病的研究概述 |
| 1.1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行现状 |
| 1.1.3 片形吸虫病的防控现况 |
| 1.2 片形吸虫与宿主的相互作用机制 |
| 1.2.1 片形吸虫的生活史 |
| 1.2.2 片形吸虫宿主适应性 |
| 1.2.3 宿主抗片形吸虫感染的机制 |
| 1.2.4 宿主的免疫应答与片形吸虫感染的互作关系 |
| 1.2.5 片形吸虫的免疫逃避策略 |
| 1.3 蠕虫感染与肠道菌群之间相互作用研究进展 |
| 1.3.1 蠕虫感染对微生物丰富度和多样性的影响 |
| 1.3.2 蠕虫感染对宿主代谢的影响 |
| 1.3.3 蠕虫与肠道菌群相互作用关系的假设 |
| 1.3.4 蠕虫-微生物相互作用关系的应用 |
| 1.3.5 片形吸虫与肠道菌群的可能机制 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 大片吸虫感染对水牛宿主免疫微环境的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂、耗材 |
| 2.2.3 主要设备、仪器 |
| 2.2.4 试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物感染及取材 |
| 2.3.2 RNA的分离及反转录 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR检测(RT-q PCR) |
| 2.3.4 血清抗体检测 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 水牛感染大片吸虫肝门淋巴结免疫学指标变化 |
| 2.4.2 水牛感染大片吸虫脾脏免疫学指标变化 |
| 2.4.3 水牛感染大片吸虫血清中抗大片吸虫ESP特异性抗体检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 大片吸虫胞外囊泡的分离鉴定与蛋白质组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 3.2.3 主要的仪器设备 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.3 .实验方法 |
| 3.3.1 大片吸虫ESP和 EVs的收集 |
| 3.3.2 蛋白浓度定量分析 |
| 3.3.3 电镜观察 |
| 3.3.4 粒径检测 |
| 3.3.5 Western blot鉴定胞外囊泡所含蛋白质 |
| 3.3.6 Shotgun鉴定100k胞外囊泡中蛋白 |
| 3.3.7 小鼠免疫与感染 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 大片吸虫成虫ESP、EVs的分泌特征 |
| 3.4.2 大片吸虫成虫15k EVs、100k EVs鉴定 |
| 3.4.3 虫体回收 |
| 3.4.4 肝脏病理损伤评分 |
| 3.4.5 血清中ALT、AST的变化 |
| 3.4.6 血清中特异性抗体的变化 |
| 3.4.7 大片吸虫成虫100k EVS的蛋白组整体分析 |
| 3.4.8 大片吸虫成虫100k EVS鉴定的蛋白分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠T细胞分化相关TLR-ERK通路的初探 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物及材料 |
| 4.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 4.2.3 主要的实验仪器、设备 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠囊蚴感染分组 |
| 4.3.2 小鼠腹腔注射分组 |
| 4.3.3 样品收集 |
| 4.3.4 RT-q PCR检测 |
| 4.3.5 抗体ELISA检测 |
| 4.3.6 动物病理组织切片的制备 |
| 4.3.7 组织匀浆的制备 |
| 4.3.8 细胞因子ELISA检测 |
| 4.3.9 Western blot检测 |
| 4.3.10 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 小鼠感染大片吸虫囊蚴结果 |
| 4.4.2 大片吸虫 成虫 ESP、15k EVs和100k EVs腹腔注射小鼠模型 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 大片吸虫感染对水牛胃肠道菌群的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要试剂/耗材 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 测序数据的分析 |
| 5.5 结果 |
| 5.5.1 肠系膜淋巴结、肝门淋巴结、脾脏和肝脏TLRs在感染组和对照组的表达情况 |
| 5.5.2 α-多样性分析 |
| 5.5.3 主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCo A) |
| 5.5.4 水牛感染大片吸虫对胃肠道菌群各分类水平组成 |
| 5.5.5 LEf Se(Line Discriminant Analysis(LDA)Effect Size,LEf Se)分析 |
| 5.5.6 CCA/RDA分析 |
| 5.5.7 结肠中SCFAs水平检测 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 小结 |
| 第六章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠菌群的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 实验动物及材料 |
| 6.2.2 主要试剂、耗材 |
| 6.2.3 实验设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 小鼠囊蚴感染对结肠内容肠道菌群构成的影响 |
| 6.4.2 腹腔注射小鼠模型结肠内容物菌群分析结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 水牛RT-qPCR使用引物 |
| 附表2 小鼠RT-qPCR使用引物 |
| 附表3 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况及参加科研项目 |
（4）重组酶介导的核酸等温扩增技术快速检测棘球绦虫的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 棘球绦虫与棘球蚴病检测技术 |
| 2.1 病原学检查 |
| 2.2 影像学诊断 |
| 2.3 免疫学诊断 |
| 2.4 分子生物学诊断 |
| 3 研究目的和内容 |
| 3.1 研究目的 |
| 3.2 研究内容 |
| 第一部分 重组酶介导的等温核酸扩增技术检测细粒棘球绦虫方法的建立及初步应用评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 寄生虫样本及其基因组DNA来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 寄生虫材料基因组DNA验证 |
| 2.2.3 引物设计与筛选 |
| 2.2.4 质粒构建 |
| 2.2.5 RAA反应体系的建立 |
| 2.2.6 PCR反应体系的建立 |
| 2.2.7 扩增反应条件的优化 |
| 2.2.8 RAA检测灵敏度评价 |
| 2.2.9 RAA检测特异性评价 |
| 2.2.10 不同种类标本的RAA法检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同寄生虫基因组提取验证 |
| 3.2 EgG1的引物筛选结果 |
| 3.3 RAA反应体系优化 |
| 3.4 PCR反应体系优化 |
| 3.5 RAA检测灵敏度验证 |
| 3.6 RAA检测特异性验证 |
| 3.7 样本检测 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 寄生虫样本及其基因组DNA来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 寄生虫材料基因组DNA验证 |
| 2.2.3 引物设计与筛选 |
| 2.2.4 质粒构建 |
| 2.2.5 RAA反应体系的建立 |
| 2.2.6 PCR反应体系的建立 |
| 2.2.7 扩增反应条件的优化 |
| 2.2.8 RAA检测灵敏度评价 |
| 2.2.9 RAA检测特异性评价 |
| 2.2.10 不同种类标本的RAA法检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同寄生虫基因组提取验证 |
| 3.2 Em的引物筛选结果 |
| 3.3 RAA反应体系优化 |
| 3.4 PCR反应体系优化 |
| 3.5 RAA检测灵敏度验证 |
| 3.6 RAA检测特异性验证 |
| 3.7 样本检测 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 重组酶介导的多重核酸等温扩增法鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫技术的建立及初步应用评价 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 寄生虫样本及其基因组DNA来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 寄生虫材料基因组DNA验证 |
| 2.2.3 引物设计与筛选 |
| 2.2.4 质粒构建 |
| 2.2.5 多重RAA反应体系的建立 |
| 2.2.6 多重PCR反应体系的建立 |
| 2.2.7 扩增反应条件的优化 |
| 2.2.8 多重RAA检测灵敏度评价 |
| 2.2.9 多重RAA检测特异性评价 |
| 2.2.10 不同种类标本的多重RAA法检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同寄生虫基因组提取验证 |
| 3.2 目的片段的扩增 |
| 3.3 多重RAA反应体系优化 |
| 3.4 PCR反应体系优化 |
| 3.5 多重RAA检测灵敏度验证 |
| 3.6 多重RAA检测特异性验证 |
| 3.7 样本检测 |
| 4 讨论 |
| 研究小结 |
| 1 主要结果 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与建议 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 申请专利与发表文章 |
| 附件 |
（5）肝片吸虫病诊断候选抗原的筛选和制备（论文提纲范文）
| 项目资助基金 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 肝片吸虫及肝片吸虫病概述 |
| 1.1.1 肝片吸虫 |
| 1.1.2 肝片吸虫病的流行性 |
| 1.1.3 肝片吸虫病临床症状体征 |
| 1.1.4 肝片吸虫病的防治 |
| 1.2 肝片吸虫检测方法 |
| 1.2.1 病原学检测 |
| 1.2.2 分子生物学检测 |
| 1.2.3 免疫学检测 |
| 1.2.4 其它检查方法 |
| 1.3 肝片吸虫病诊断抗原研究进展 |
| 1.3.1 组织蛋白酶家族(CAT) |
| 1.3.2 天冬氨酰内肽酶(LEG) |
| 1.3.3 谷胱甘肽S-转移酶(GST) |
| 1.3.4 脂肪酸结合蛋白(FABP) |
| 1.3.5 鞘脂激活蛋白样蛋白家族(SAP) |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第2章 肝片吸虫诊断候选抗原的筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 肝片吸虫噬菌体cDNA展示文库和阳性血清 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 噬菌体展示及免疫筛选用相关试剂的配制 |
| 2.1.5 阳性噬菌体初筛 |
| 2.1.6 阳性噬菌体的复筛 |
| 2.1.7 诊断候选抗原的筛选 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 阳性噬菌体初筛 |
| 2.2.2 阳性噬菌体复筛 |
| 2.2.3 阳性克隆的鉴定与分析 |
| 2.2.4 候选抗原的筛选 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 候选抗原蛋白分子的生物信息学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 生物信息学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 肝片吸虫组织蛋白酶L |
| 3.2.2 假定蛋白D915_000758 |
| 3.2.3 假定蛋白D915_001617 |
| 3.2.4 假定蛋白D915_005900 |
| 3.2.5 假定蛋白D915_010969 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 候选抗原基因的克隆以及重组质粒的构建 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 主要试剂及耗材 |
| 4.1.2 相关培养基和试剂的配制 |
| 4.1.3 肝片吸虫抗原基因特异性引物的设计与合成 |
| 4.1.4 特异性抗原基因的克隆 |
| 4.1.5 重组克隆质粒的构建 |
| 4.1.6 重组表达质粒的构建 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 肝片吸虫组织蛋白酶L |
| 4.2.2 假定蛋白D915_000758 |
| 4.2.3 假定蛋白D915_001617 |
| 4.2.4 假定蛋白D915_005900 |
| 4.2.5 假定蛋白D915_010969 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 候选抗原的诱导表达及鉴定 |
| 5.1 材料及方法 |
| 5.1.1 仪器与试剂材料 |
| 5.1.2 相关试剂的配制 |
| 5.1.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 5.1.4 SDS-PAGE检测重组蛋白表达 |
| 5.1.5 包涵体蛋白的纯化 |
| 5.1.6 Western-Blot分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 融合蛋白pET-Cat L的表达与鉴定 |
| 5.2.2 融合蛋白pET-000758 的表达与鉴定 |
| 5.2.3 融合蛋白pET-001617 的表达与鉴定 |
| 5.2.4 融合蛋白pET-005900 的表达与鉴定 |
| 5.2.5 融合蛋白pET-010969 的表达与鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 :中英文缩略词对照表 |
| 附录二 :作者简介 |
| 致谢 |
（6）大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.1 片形吸虫概述 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行情况 |
| 1.1.3 片形吸虫病防控 |
| 1.2 片形吸虫病诊断研究 |
| 1.2.1 用于检测抗体的诊断抗原 |
| 1.2.1.1 应用ESP及其纯化产物作诊断抗原的研究 |
| 1.2.1.2 应用重组蛋白作诊断抗原的研究 |
| 1.2.1.3 应用其它物质作诊断抗原的研究 |
| 1.2.2 用于检测抗原的诊断抗体 |
| 1.3 片形吸虫试剂盒的研究 |
| 1.4 课题研究目的与意义 |
| 第二章 大片形吸虫分泌排泄产物凝胶过滤层析组分和重组蛋白FgTPx-1、FgCatB3与FgCat L1的制备及质谱分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂、耗材 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大片形吸虫分泌排泄产物制备 |
| 2.2.2 大片形吸虫层析组分制备及筛选 |
| 2.2.2.1 FgESP凝胶过滤层析 |
| 2.2.2.2 层析组分收集 |
| 2.2.2.3 间接ELISA筛选较优层析组分 |
| 2.2.3 大片形吸虫分泌排泄产物及层析组分质谱 |
| 2.2.3.1 蛋白提取和浓度测定 |
| 2.2.3.2 蛋白酶解 |
| 2.2.3.3 肽段脱盐 |
| 2.2.3.4 肽段质谱鉴定 |
| 2.2.3.5 质谱数据搜库 |
| 2.2.4 重组蛋白制备 |
| 2.2.4.1 设计引物 |
| 2.2.4.2 FgTPx-1目的基因PCR扩增 |
| 2.2.4.3 pMD18-FgTPx-1克隆质粒构建 |
| 2.2.4.4 pET32α-FgTPx-1、pET28α-FgCat B3及pET28α-FgCat L1表达质粒的构建 |
| 2.2.4.5 阳性克隆小量表达与鉴定 |
| 2.2.4.6 蛋白大量表达及破菌检测 |
| 2.2.4.7 可溶性蛋白纯化 |
| 2.2.4.8 包涵体蛋白纯化 |
| 2.2.5 重组蛋白质谱鉴定 |
| 2.2.6 数据统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 大片形吸虫分泌排泄产物浓度测定 |
| 2.3.2 层析组分收集和浓度测定 |
| 2.3.3 层析组分的筛选 |
| 2.3.4 大片形吸虫分泌排泄产物及部分层析组分质谱结果 |
| 2.3.5 目的基因扩增结果 |
| 2.3.6 克隆载体、表达载体构建结果 |
| 2.3.7 蛋白诱导表达检测 |
| 2.3.8 纯化蛋白检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 大片形吸虫分泌排泄产物及层析组分质谱结果分析 |
| 2.4.2 蛋白表达结果分析 |
| 第三章 大片形吸虫分泌排泄产物凝胶过滤层析组分和重组蛋白FgTPx-1、FgCatB3及FgCat L1作诊断抗原建立及优化间接ELISA方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂、耗材 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 F22层析组分作诊断抗原建立及优化间接ELISA方法 |
| 3.2.2 重组蛋白作诊断抗原优化间接ELISA方法 |
| 3.2.3 应用间接ELISA方法检测实验感染水牛和广西部分地区自然感染奶牛血清抗体水平 |
| 3.2.4 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 F22层析组分作诊断抗原间接ELISA方法优化结果 |
| 3.3.2 重组蛋白作诊断抗原间接ELISA方法优化结果 |
| 3.3.3 间接ELISA应用结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 F22层析组分优化分析 |
| 3.4.2 重组蛋白优化分析 |
| 3.4.3 各个抗原诊断效果分析 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 项目资助 |
（7）肝片吸虫病诊断抗原的筛选及间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 肝片吸虫 |
| 1.2 肝片吸虫病诊断技术研究现状 |
| 1.2.1 临床检查与流行病学调查 |
| 1.2.2 实验室诊断 |
| 1.2.3 医学影像学 |
| 1.2.4 免疫学诊断方法 |
| 1.2.5 分子生物学方法 |
| 1.3 肝片吸虫诊断相关抗原 |
| 1.3.1 组织蛋白酶 |
| 1.3.2 谷胱甘肽S转移酶 |
| 1.3.3 热休克蛋白70 |
| 1.3.4 亮氨酸氨基肽酶 |
| 1.3.5 天冬氨酰内肽酶 |
| 1.3.6 半胱氨酸蛋白酶 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 虫体的采集 |
| 2.1.2 血清的 |
| 2.1.3 主要使用仪器及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 肝片吸虫虫体鉴定 |
| 2.2.2 目的蛋白的表达及纯化 |
| 2.2.3 诊断抗原的筛选 |
| 2.2.4 肝片吸虫病间接ELISA检测方法的初步建立 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 肝片吸虫的鉴定 |
| 3.1.1 形态学鉴定 |
| 3.1.2 分子生物学鉴定 |
| 3.2 目的基因的表达及纯化 |
| 3.2.1 目的基因扩增结果 |
| 3.2.2 生物信息学分析 |
| 3.2.3 进化树的构建 |
| 3.2.4 质粒双酶切结果 |
| 3.2.5 重组质粒双酶切鉴定结果 |
| 3.2.6 小量诱导表达结果 |
| 3.2.7 BCA蛋白浓度的测定 |
| 3.2.8 蛋白的反应原性分析 |
| 3.3 诊断抗原的筛选 |
| 3.4 肝片吸虫间接ELISA方法的初步建立 |
| 3.4.1 间接ELISA方法条件的优化 |
| 3.4.2 阴阳性临界值的确定 |
| 3.4.3 肝片吸虫间接ELISA方法的效果评价 |
| 3.4.4 临床样品检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肝片吸虫虫体的鉴定 |
| 4.2 肝片吸虫病的诊断抗原 |
| 4.3 诊断抗原的纯化 |
| 4.4 肝片吸虫病诊断方法 |
| 5 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）大片吸虫两种CD59样蛋白的生物信息分析及体外重组表达（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 缩略词表 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫病的概述 |
| 1.2 片形吸虫病的诊断研究 |
| 1.2.1 血清学检测 |
| 1.2.2 粪抗原检测 |
| 1.2.3 牛奶抗原/抗体检测 |
| 1.3 片形吸虫的疫苗研究 |
| 1.4 片形吸虫体被蛋白的研究 |
| 1.5 CD59样蛋白的研究 |
| 1.6 生物信息学研究 |
| 1.7 本课题的目的和意义 第二章 大片吸虫两种CD59样蛋白编码区扩增、测序和分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫种及菌种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂的配制 |
| 2.1.5 FgCD59样蛋白质编码区扩增引物和M13引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 大片吸虫成虫总RNA的提取 |
| 2.2.2 FgCD59样蛋白序列反转录扩增和PCR扩增 |
| 2.2.3 序列测序 |
| 2.2.4 FgCD59样蛋白质编码区序列的克隆 |
| 2.2.5 阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.6 蛋白序列的测序分析与对比分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 克隆测序结果 |
| 2.3.2 FgCD59-1与FgCD59-2的碱基序列分析 |
| 2.3.3 FgCD59-1与FgCD59-2的蛋白序列分析 |
| 2.3.4 FgCD59-1、FgCD59-2与FhCD59-1、FhCD59-2序列比对 |
| 2.3.5 序列系统进化树的构建和分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 第三章 大片吸虫CD59-1, CD59-2的蛋白质结构预测和分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 FgCD59样蛋白初级结构性质预测 |
| 3.2.2 FgCD59样蛋白跨膜结构预测 |
| 3.2.3 FgCD59样蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.4 FgCD59样蛋白二级结构分析 |
| 3.2.5 FgCD59样蛋白三级结构预测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 FgCD59样蛋白初级结构分析 |
| 3.3.2 FgCD59样蛋白跨膜区域预测 |
| 3.3.3 FgCD59样蛋白二级结构预测 |
| 3.3.4 FgCD59样蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3.5 FgCD59样蛋白三级结构预测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 第四章 大片吸虫两种CD59样蛋白的体外重组表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 试剂的配制 |
| 4.1.4 FgCD59样蛋白质编码区扩增引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 大片吸虫成虫总RNA的提取 |
| 4.2.2 目的蛋白序列反转录扩增和PCR扩增 |
| 4.2.3 PCR产物纯化和测序 |
| 4.2.4 FgCD59样蛋白质编码区序列的克隆 |
| 4.2.5 阳性克隆的鉴定 |
| 4.2.6 表达载体的构建及鉴定 |
| 4.2.7 重组蛋白的表达与诱导表达条件的检测和优化 |
| 4.2.8 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.9 Western blot检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 目的序列的扩增 |
| 4.3.2 构建载体鉴定 |
| 4.3.3 表达载体的构建及鉴定 |
| 4.3.4 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 第五章 结论 参考文献 致谢 攻读学位期间发表论文情况 |
（9）片形吸虫及其分泌排泄产物对巨噬细胞极化和宿主细胞免疫应答作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 缩略词表 第一篇 文献综述 |
| 引言 |
| 第一章 蠕虫感染与宿主免疫应答 |
| 1.1 抗蠕虫感染固有免疫应答概述 |
| 1.2 抗蠕虫感染的固有免疫细胞 |
| 1.3 抗蠕虫感染的病原识别受体(PRRs) |
| 1.4 抗蠕虫感染的辅助性T细胞(Th)免疫 |
| 第二章 巨噬细胞的激活和调控与蠕虫感染 |
| 2.1 巨噬细胞的不同亚型 |
| 2.2 巨噬细胞信号通路与免疫学功能实现 |
| 2.3 巨噬细胞在蠕虫感染中的作用 |
| 第三章 片形吸虫与片形吸虫病免疫学的研究进展 |
| 3.1 片形吸虫与片形吸虫病的研究概况 |
| 3.2 片形吸虫与宿主免疫应答 |
| 3.3 片形吸虫分泌排泄产物与宿主免疫 |
| 3.4 巨噬细胞与抗片形吸虫免疫 |
| 第四章 淋巴插管模型在免疫学研究中的应用 |
| 4.1 大动物淋巴插管模型的研究进展 |
| 4.2 大动物输入淋巴插管及其应用研究 |
| 第五章 本课题的目的和意义 第二篇 实验研究 |
| 第一章 大片形吸虫感染对宿主肝脏枯否细胞极化及细胞免疫应答的作用 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 大片形吸虫分泌排泄产物对宿主巨噬细胞极化的作用及相关关键信号通路的初探 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 输入淋巴人造插管模型在片形吸虫细胞免疫研究的应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 全文结论 创新点 参考文献 致谢 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 1 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.3 流行情况 |
| 1.1.4 防控 |
| 1.2 大片形吸虫病诊断的研究进展 |
| 1.2.1 经典方法 |
| 1.2.2 免疫诊断方法 |
| 1.2.3 吸虫抗原的检测 |
| 1.2.4 分子生物学方法 |
| 1.3 研究的目的与意义 2 材料与方法 |
| 2.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 大片吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 3 结果与分析 |
| 3.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 3.1.1 大片形吸虫形态学鉴定结果 |
| 3.1.2 大片形吸虫ITS |
| 3.1.3 大片形吸虫ITS |
| 3.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 3.2.1 大片形吸虫ES抗原免疫家兔后制备多抗的间接ELISA结果 |
| 3.2.2 免疫共沉淀SDS |
| 3.2.3 质谱数据分析 |
| 3.3 大片形吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 |
| 3.3.1 大片形吸虫FgAT和FgLAP基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 FgAT和FgLAP的理化特性、结构功能域和三级结构预测 |
| 3.3.3 重组质粒pGEX-6P-1(+)-FgAT和pET-30a-FgLAP的双酶切结果 |
| 3.3.4 重组蛋白的诱导表达结果 |
| 3.3.5 重组蛋白pGEX-6P-1(+)-FgAT和pET-30a-FgLAP的纯化结果 |
| 3.3.6 目的蛋白的Western Blot分析 4 讨论 |
| 4.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 4.2 大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选 |
| 4.3 大片形吸虫AT和LAP蛋白的免疫反应性分析 5 结论 参考文献 致谢 个人简历 |
四、水牛实验感染大片吸虫及ELISA检测特异性抗体的变化（论文参考文献）
- [1]基于大片吸虫分泌排泄产物层析组分的牛片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立[J]. 靳纬坤,袁湘祥,王锦辉,侯林静,郑梦伟,吴正姣,张为宇,邸文达. 中国畜牧兽医, 2021(08)
- [2]片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立[D]. 龚静芝. 扬州大学, 2021
- [3]大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究[D]. 盛兆安. 广西大学, 2020
- [4]重组酶介导的核酸等温扩增技术快速检测棘球绦虫的研究[D]. 周鸿让. 中国疾病预防控制中心, 2020
- [5]肝片吸虫病诊断候选抗原的筛选和制备[D]. 贾骁晔. 西北民族大学, 2020(08)
- [6]大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化[D]. 侯林静. 广西大学, 2019(01)
- [7]肝片吸虫病诊断抗原的筛选及间接ELISA方法的建立[D]. 王晓旭. 黑龙江八一农垦大学, 2019(09)
- [8]大片吸虫两种CD59样蛋白的生物信息分析及体外重组表达[D]. 李雪. 广西大学, 2018(12)
- [9]片形吸虫及其分泌排泄产物对巨噬细胞极化和宿主细胞免疫应答作用的研究[D]. 施维. 广西大学, 2018(05)
- [10]大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析[D]. 岳东梅. 黑龙江八一农垦大学, 2017(08)