一、人胆管细胞癌荷瘤裸鼠模型的建立（论文文献综述）
贺竞毅[1]（2020）在《MANF与原发性肝癌预后相关性及其与索拉非尼治疗敏感性的机制研究》文中研究指明背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）和肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是原发性肝癌中最常见的两种类型,随着外科技术及药物发展,原发性肝癌患者预后得到显着提高,然而肿瘤转移和复发显着降低了患者的生存率和生活质量。索拉非尼是一种多激酶抑制剂,能够抑制肿瘤增殖和血管生成,是目前治疗肝癌的有效药物,能够显着延长患者的生存期,但是耐药性的产生严重影响了治疗效果。因此,如何提高肿瘤对索拉非尼的敏感性,是肝癌治疗中的热点问题。内质网应激是肝癌发病的关键通路,并参与调控癌细胞耐药,中脑星形细胞源性神经营养因子（MANF）是内质网应激信号通路的关键调控分子。然而,MANF与原发性肝癌预后及其调控肿瘤细胞对索拉非尼敏感性的分子机制尚不明晰。本研究中我们探索MANF与原发性肝癌预后相关性,并进一步探索MANF影响肝癌细胞系对索拉非尼敏感性的分子机制。第一部分MANF与肝细胞癌预后相关性及其与索拉非尼治疗敏感性的机制研究研究目的:探索MANF与肝细胞癌患者预后相关性,并探索MANF增加肝癌细胞对索拉非尼敏感性的分子机制。研究方法:1.利用Meta分析方法评价GEO数据库的24个相关数据集中肝细胞癌及癌旁肝组织中MANF表达情况,并通过亚组分析、Meta-回归分析、敏感性分析评价异质性程度及异质性来源。2.Western blot法及免疫组化法检测肝细胞癌患者的肝癌及癌旁肝组织的MANF表达水平,统计分析两种组织中MANF表达差异。两组间的比较根据数据特性选择应用Students’t检验或者one-way ANOVA分析;利用Pearson卡方检验或双尾Fisher精确检验比较两组间的分类资料;根据MANF表达水平将肝癌患者进行分组,利用Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验统计分析两组间总生存（overall survival,OS）和无病生存（disease free survival,DFS）。利用Cox 比例风险回归模型分析肝细胞癌病例的独立预后影响因素。3.PCR、Western blot法检测四种不同的肝组织来源细胞系（正常肝细胞L02以及肝癌细胞系HepG2、MHCC97-H）中MANF的mRNA和蛋白表达水平;上调（MANF质粒）或下调（siRNA）肝癌细胞系中MANF,检测细胞增殖等生物学行为差异。4.索拉非尼处理肝癌细胞系（HepG2、Huh-7、MHCC97-H）,检测肝癌细胞系中MANF表达水平变化。序贯上调或下调MANF,检测细胞增殖、侵袭以及凋亡等生物学行为变化。5.使用MANF稳定低表达HepG2细胞,构建裸鼠荷瘤模型,分组应用索拉非尼或安慰剂处理小鼠,动态观察记录肿瘤大小,统计分析不同组小鼠肿瘤大小差异。研究结果:1、通过筛选和评价后,最终纳入数据集24个,累计肝癌样本1475例,正常肝组织981例,所有数据集均来自于回顾性研究。本研究使用随机效应模型,I2被用来判断研究中存在的异质性。经检验,本次Meta分析无显着的发表偏倚和异质性。Meta分析发现MANF在肝细胞癌样本中表达高于正常肝脏组织。2.在266例肝癌病例中,肝细胞癌样本中的MANF表达量（141.503 ± 35.179）显着高于癌旁组织中的MANF表达量（137.1161±35.039,P<0.01）。MANF高表达患者的无病生存期（disease free survival,DFS）较MANF低表达患者短（P<0.05）,但总体生存期（overall survival,OS）无显着差异（P>0.05）,利用Cox比例风险回归模型分析发现血管侵犯（P<0.05）是患者肿瘤复发的独立危险因素。3.正常肝细胞系L02的MANF mRNA水平（0.5895±0.02627）显着低于肝细胞癌细胞系 HepG2（1.581±0.1455;P<0.01）、MHCC97-H（3.380±0.2901;P<0.01）。siRNA下调HepG2细胞中MANF表达,24h、48h和72h后实验组（MANF siRNA）细胞增殖率分别为 1.413±0.0173,1.863±0.0561 和 2.982±0.0708,而对照组（siNC）分别为 1.45±0.0798,1.944±0.0779 和 3.053±0.1275,两组间细胞增值率无统计学差异;MANF质粒转染上调HepG2细胞中MANF表达水平,24h、48h和72h后实验组（MANF质粒转染组）细胞增殖率为1.444±0.0243,1.997±0.0478 和 3.211±0.0351,对照组（Vector）为 1.368±0.0078,1.952±0.1287和3.085±0.1746结果无统计学差异。4.索拉非尼处理正常肝细胞和肝癌细胞系后,细胞内MANF表达水平显着升高,其中不同细胞系MANF表达水平在索拉非尼处理前后mRNA表达水平分别为:L02:1.352±0.0892 vs 1.895±0.1214（P<0.01）;HepG2:1.806±0.1372 vs 2.482±0.1383（P<0.01）;MHCC97-H:3.27±0.2504 vs 4.223±0.2544（P<0.01）。5.构建稳定敲低MANF表达的HepG2细胞,应用索拉非尼处理细胞,或利用PERK特异性抑制剂GSK2656157进行拯救实验处理HepG2,检测细胞抑制率,结果显示MANF下调组细胞抑制率为0.866±0.0343,而对照组细胞抑制率为0.765±0.0139,两组抑制率具有统计学差异,细胞侵袭（shNC,20±2;shMANF,2±1）和迁移能力（shNC,24.00±3.606;shMANF,3.333±1.528）下降,凋亡比例增加（shNC,5.933±0.2517;shMANF,14.23±0.4041）;而与单用索拉非尼相比,PERK特异性抑制剂GSK2656157可以降低细胞抑制率（0.801±0.0241）,恢复细胞迁移（50.33±5.033）和侵袭能力（51.33±4.163）,减少细胞凋亡比例（8.300±0.5291）,结果具有统计学差异。6.稳定敲低MANF的细胞应用索拉非尼处理后,与对照组相比PERK,GRP78,ATF6,XBP1,CHOP,BAX,BCL-2 和 cleaved-caspase-3 表达显着增加,两组差异均有统计学意义（P<0.01）。而相比索拉非尼处理组,联用PERK特异性抑制剂GSK2656157 可以降低索拉非尼引起的 XBP1（P<0.01）,CHOP（P<0.01）,BAX（P<0.01）,BCL-2（P<0.01）,和 cleaved-caspase-3（P<0.01）表达。7.将稳定敲低MANF（sh-MANF）的HepG2细胞种植于裸鼠,构建荷瘤模型,MANF下调组的肿瘤体积（0.48±0.1789）明显小于对照组（0.84±0.1140）（P<0.01）.将MANF下调组荷瘤小鼠随机分组,序贯利用索拉非尼处理,或利用PERK特异性抑制剂GSK2656157处理,结果显示索拉非尼联合PERK特异性抑制剂GSK2656157的小鼠肿瘤体积（1.5±0.1581）明显大于单用索拉非尼组（0.48±0.1789）（P<0.01）。研究结论:MANF在肝细胞癌中表达显着升高,与肝细胞癌预后呈正相关。MANF通过调节内质网应激增加肝细胞癌对索拉非尼的治疗敏感性。第二部分MANF与肝内胆管细胞癌预后相关性及其与索拉非尼治疗敏感性的机制研究研究目的:探索MANF与肝内胆管细胞癌患者预后相关性,并探索MANF增加肝内胆管细胞癌对索拉非尼敏感性的分子机制。研究方法:1.利用Meta分析方法评价GEO数据库的4个相关数据集中组织样本中肝内胆管癌及癌旁组织的MANF表达情况,通过I2和敏感性分析评价异质性程度及异质性来源,通过Begg法、Egger法和漏斗图法评价纳入的研究之间存在的偏倚。2.免疫组化法检测肝内胆管细胞癌及癌旁组织中MANF的蛋白表达水平。两组间的比较根据数据特性选择应用Students’t检验或者one-way ANOVA分析;利用Pearson卡方检验或双尾Fisher精确检验比较两组间的分类资料;利用Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验比较MANF表达量高低组间的总生存（overall survival,OS）和无病生存（disease free survival,DFS）;利用 Cox 比例风险回归模型分析肝内胆管细胞癌病例的独立预后影响因素。3.上调（MANF质粒）或下调（siRNA）HUCCT1和QBC939细胞中的MANF表达,检测细胞增殖等生物学行为差异。检测HUCCT-1和QBC939增殖能力差异;流式细胞技术检测凋亡比例差异。4.构建慢病毒sh-NC和sh-MANF稳定转染的HUCCT1和QBC939细胞系,序贯利用索拉非尼处理,或利用GRP78特异性抑制剂进行拯救实验,分析比较不同组细胞,检测细胞增殖、侵袭以及凋亡等生物学行为变化。Western blot法检测HUCCT1 细胞中 PERK,GRP78,PDI,IRE1 α,XBP1,CHOP,cleaved-caspase-3 and Bax的蛋白表达水平。5.将MANF稳定低表达的HUCCT1细胞系接种至裸鼠,建立裸鼠荷瘤模型,动态观察、记录肿瘤直径。待四周后应用索拉非尼处理裸鼠,动态观察记录各组肿瘤直径,分析不用组裸鼠肿瘤大小差异。研究结果:1、通过筛选和评价后,最终纳入数据集4个,累计肝内胆管细胞癌样本128例,正常肝组织109例,所有数据集均来自于回顾性研究。本研究使用随机效应模型,I2被用来判断研究中存在的异质性。本次Meta分析无显着的发表偏倚和异质性。敏感性分析显示,这些数据集无显着差异。Meta分析发现MANF在肝内胆管细胞癌样本中表达高于正常肝脏组织。2.在246例肝内胆管细胞癌病例中,肝内胆管细胞癌样本中的MANF的蛋白表达量（99.51 ± 29.16）显着高于癌旁组织中的MANF表达量（88.38±18.04）（P<0.01）。MANF 高表达患者的总体生存期（overall survival,OS;P<0.05）)和无病生存期（disease free survival,DFS;P<0.05）)较 MANF 低表达患者短,利用Cox 比例风险回归模型发现,MANF高表达（P<0.01）、HBV感染（P<0.05）、肿瘤个数（P<0.05）和肿瘤大小（P<0.05）是本研究中肝内胆管细胞癌病例的独立预后影响因素。3.检测发现在siRNA下调细胞中MANF 72小时后,对照组（siNC）和实验组（siMANF）细胞增殖率分别为HUCCT-1（siNC,2.684±0.2441;siMANF,2.115±0.2016;P<0.01）,QBC939 细胞（siNC,2.153±0.0791;siMANF,1.949±0.1362;P>0.05）。在质粒上调细胞中MANF表达72小时后,对照组（FLAG-NC）和实验组（FLAG-MANF）细胞增殖率分别为 HUCCT-1（FLAG-NC,2.707±0.1973;FLAG-MANF,2.797±0.1362;P>0.05）和 QBC939（FLAG-NC,2.249±0.1234;FLAG-MANF,2.258±0.1364;P>0.05）;流式细胞技术研究检测,上调和下调细胞中MANF的表达,24小时后实验组和对照组的细胞凋亡率分别为,HUCCT-1（siNC,6.533±0.2454;siMANF,6.817±0.4013;P>0.05;FLAG-NC,4.053±0.5632;FLAG-MANF,3.92±0.8671;P>0.05）和 QBC939 细胞（siNC,6.453±0.2011;siMANF,6.487±0.2676;P>0.05;FLAG-NC,7.023±0.1002;FLAG-MANF,7.23±0.1453;P>0.05）,凋亡比例无统计学差异。Western blot法检测发现,敲低MANF后HUCCT-1 细胞中 p-mTOR/mTOR（P<0.01）值降低,上调 MANF 后 HUCCT-1 细胞中p-mTOR/mTOR（P>0.05）值未见统计学差异,PERK（P>0.05）,GRP78（P>0.05）,IRE1 α（P>0.05）,CHOP（P>0.05）在上调和下调组中均未见统计学差异。4.在下调HUCCT1细胞中应用索拉非尼处理细胞,或序贯索拉非尼或利用GRP78特异性抑制剂VER155008进行拯救实验处理细胞,结果显示索拉非尼处理后MANF 下调组（HUCCT1,0.311±0.0566;QBC939,0.272±0.0323）相比对照组（HUCCT1,0.122±0.0251;QBC939,0.146±0.0335）细胞抑制率增加（P<0.01）,细胞侵袭（HUCCT1,shNC,80±14.14;shMANF,21±1.414;QBC939,shNC,30±7.071;shMANF,5±12.828;P<0.01）和迁移（HUCCT1,shNC,85±7.071;shMANF,34±5.657;QBC939,shNC,52.5±10.61;shMANF,16±5.657;P<0.01）能力下降,凋亡比例增加（HUCCT1,shNC,9.757±2.5627;shMANF,21.283±3.0595 QBC939,shNC,9.26±0.4419;shMANF,14.983±1.8464;P<0.01）;而与单用索拉非尼相比,GRP78特异性抑制剂VER155008可以降低细胞抑制率（HUCCT1,0.149±0.0618;QBC939,0.156±0.0212;P<0.01）,恢复细胞迁移（HUCCT1,104.5±21.92;QBC939,57.5±3.536;P<0.01）和侵袭能力（HUCCT1,60±7.071;QBC939,20±2.828;P<0.01）,减少细胞凋亡比例（HUCCT1,12.393±0.2078;QBC939,10.323±0.3024;P<0.01）。Western blot 法检测显示经索拉非尼处理后,相比对照组,MANF下调组的HUCCT1细胞PERK（P<0.05）,GRP78（P<0.05）,PDI（P<0.05）,ATF6（P<0.05）,XBP1（P<0.05）,CHOP（P<0.05）,和cleaved-caspase-3（P<0.05）表达显着增加。而应用PERK特异性抑制剂GSK2656157可以降低索拉非尼引起的ATF6（P<0.05）,XBP1（P<0.05）,CHOP（P<0.05）,和 cleaved-caspase-3（P<0.05）表达。5.利用慢病毒sh-NC和sh-MANF稳定转染的HUCCT1细胞系建立裸鼠荷瘤模型,种植肿瘤4周后应用索拉非尼处理,治疗两周后下调MANF组的肿瘤体积（0.566±0.059）明显小于对照组（0.845±0.08）（P<0.01）。研究结论:MANF在肝内胆管细胞癌中表达显着升高,与肝内胆管细胞癌预后呈正相关。MANF通过调节内质网应激增加肝内胆管细胞癌对索拉非尼的治疗敏感性。
万令飞[2]（2020）在《Ⅰ.miR-194-5p在间充质干细胞微环境调控肺癌增殖的作用及机制研究 Ⅱ.功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的增殖》文中研究指明近年来,肿瘤微环境的研究越来越引起人们的重视,人们将视线逐渐从主要关注肿瘤实质细胞本身,转向与肿瘤细胞相互作用的肿瘤微环境,这为深入理解肿瘤发生机制和治疗指出了新的方向与研究策略。肿瘤微环境中除了包含非细胞成分的细胞外基质（ECM）,细胞分泌的生长因子、趋化因子以及炎性因子外,还含有众多种类不同的细胞成分,如间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）、分化的成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和脂肪细胞等。其中间充质干细胞是一类成体干细胞,具有多向分化能力,还具有迁移到损伤组织和慢性炎症部位的能力,使得间充质干细胞在组织工程、细胞治疗方面有着广阔的应用前景。但近年来也有越来越多的证据表明间充质干细胞在肿瘤微环境中发挥着重要的调控作用。MSC在肿瘤细胞的刺激和诱导下,能够激活并分化产生癌相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblast,CAF）参与癌症发生发展。深入了解MSC与肿瘤细胞之间的相互作用,不仅能够寻找调控癌症的新靶点,还能够将肿瘤激活的MSC“黑暗面”转化为有利于人类健康的一面。肺癌是我国乃至世界范围内恶性程度较高的肿瘤之一,尽管治疗技术在进步,但是肺癌在癌症相关死亡人数中仍然占有非常高的比例。肺癌在发生发展的过程中伴随着丰富的血管化和纤维化,而MSC定位于血管周部位,提示肺癌组织中MSC的含量较丰富。本研究目的是为了探究肺癌组织来源的MSC与肿瘤细胞之间的相互作用并研究其调控机制,为肺癌的靶向治疗提供新的途径与理论支持。首先从人肺癌组织中分离MSC,并从形态学、细胞表面标记、多向分化能力等进行验证,实验结果显示所分离贴壁培养的间质细胞形态均一,形态类似于成纤维细胞,呈漩涡状生长,不表达内皮细胞和造血细胞标志,表达间质细胞的标记。免疫荧光结果进一步显示其表达间质细胞的标志物而不表达上皮细胞的标志物,并且通过特异性诱导脂肪分化和成骨分化,证明所分离的间质细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力,因此确定所分离的细胞符合MSC的鉴定特征。进一步通过裸鼠皮下共移植成瘤实验探究肺癌MSC对肺癌细胞的作用,实验结果表明肺癌MSC显着促进肺癌体内成瘤能力。随后通过miRNA芯片探究肺癌MSC与肺癌细胞共培养后肺癌细胞中miRNA的变化,发现多种抑制性miRNA下调,其中miR-194-5p引起了我们的研究兴趣,其在MSC与肿瘤细胞共培养后显着下调。通过慢病毒及mimics转染肺癌细胞,使得肺癌细胞过表达或抑制表达miR-194-5p进而进行功能性研究,结果显示miR-194-5p能够显着抑制肺癌细胞的增殖与侵袭能力。通过生物信息学技术,预测了miR-194-5p的下游靶基因为LIN28B,并且通过蛋白质免疫印迹技术进行了验证。进一步利用细胞因子芯片寻找肺癌MSC可能调控肺癌细胞miRNA改变的机制,结果显示肺癌MSC能够分泌b FGF下调肺癌细胞中miR-194-5p的表达来促进肺癌细胞的增殖。具体b FGF如何调控miR-194表达变化的分子机制仍在进行中。通过上述研究,本课题证明人肺癌组织中存在MSC,并且肺癌MSC显着促进肺癌增殖,进一步的研究表明,肺癌MSC能够通过分泌b FGF作用于肺癌细胞,调控miR-194-5p-LIN28B轴的表达,进而促进了肺癌的发生发展。该课题从肿瘤微环境的视角探讨肺癌MSC与肺癌细胞的相互作用及其初步机制,有望加深对肺癌微环境调控肺癌发生发展的认识。肝内胆管细胞癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是一种起源于肝内胆管上皮细胞的原发性肿瘤,其发病率是继肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）之后的第二大常见的原发性肝脏肿瘤。对于肝内胆管细胞癌病人,目前手术切除是唯一有效的治疗方案,但是术后病人复发率高。而对于晚期丧失手术切除可能的病人,目前缺乏可选择的治疗方案,病人预后非常差[39,40]。因此研发新型的低毒、高效、可以特异性靶向肿瘤的药物成为肝内胆管细胞癌研究领域的热点之一。石墨烯（graphene）是一种碳原子构成的单层片状结构的新型纳米材料。由于其独特的物理、化学性质近年来吸引了全世界各个领域科学家的广泛关注[41]。在生物、医学领域,石墨烯的衍生物氧化石墨烯（graphene oxide,GO）由于生物相容性好、比表面积大、表面易修饰等特点,在药物递送、生物成像、生物传感器、抗菌材料、癌症的诊断与治疗等方面都取得了较大的应用。氧化石墨烯制备方法简单,成本低,易于大规模生产。然而,经石墨氧化法直接制备的氧化石墨烯不能有效吸附双链DNA和RNA,这也在很大程度上限制了其在基因转染方面的应用。将具有正电荷的聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）接枝到氧化石墨烯上形成功能化的氧化石墨烯（GO-PEI）,从而使其表面可通过静电作用吸附带负电荷的核酸,此功能化的氧化石墨烯有望成为一种新型高效、低毒、低成本的基因递送载体（包括DNA及RNA）。近年来miRNA异常表达已被证明与肝内胆管细胞癌的发生和发展密不可分,发现和高效递送抑制性的miRNA对于肝内胆管细胞癌的治疗具有重要意义。到目前为止,合作者已利用GO-PEI可携带化疗药或者si RNA在体外抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。但利用GO-PEI作为药物载体携带抑制性的miRNA用于抑制肿瘤和肿瘤干细胞的增殖未见报道。通过高通量的miRNA芯片和TCGA公共数据库的交集寻找在肝内胆管细胞癌组织与癌旁相比下调的抑制性miRNA,包括miR-122-5p、miR-194-5p、let-7c-5p和miR-125b-5p等。进一步通过体内外功能实验发现,GO-PEI能够高效携带这些抑制miRNA进入肿瘤细胞内,抑制肿瘤细胞和肿瘤干细胞球的增殖,以及增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,显着下调与肿瘤细胞增殖相关的靶基因。并且通过裸鼠皮下荷瘤实验验证了GO-PEI能够高效携带miRNA抑制肿瘤细胞体内增殖。这部分课题探讨功能化的氧化石墨烯是否能够作为新型递送载体携带多个抑制性miRNA,进而抑制肝内胆管细胞癌的增殖能力,为肝内胆管细胞癌的药物递送治疗增加了可能性。
张家宁[3]（2020）在《Thrombospondin-1对于肝内胆管癌接受吉西他滨化疗的增敏作用和机制研究》文中认为目前在肝脏的原发性肿瘤中,肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,IC C）的发病率近年来逐渐攀升,仅次于肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）。由于肝内胆管癌（ICC）和肝细胞肝癌（HCC）的病理类型以及发病机制不同,其起病过程更为隐匿,病程发展更为迅速,而且预后极差。基于肝内胆管癌以上特点,很多患者确诊时已经失去手术时机,而且一些接受过手术的病人,术后很快出现了复发甚至病灶的全身转移,不再适合二次手术。化学治疗（化疗）是这些晚期病人常见且重要的治疗方式。目前对于肝内胆管癌的化疗是以吉西他滨为基础的治疗方案,但是由于吉西他滨化疗有效率低,很多病人化疗效果不佳,出现耐药现象。因此我们希望通过肝内胆管癌组织建立的人源性肿瘤组织异种移植（patient-derived xenografts,P DX）模型中筛选出一些能够预测化疗的血清学标志物或者对于化疗增敏的分子,从而有助于临床病人的筛选或者治疗。基于以上问题,我们首先进行了目标分子的筛选以及它化疗效果的验证,并对其现象背后可能存在的生物学机制进行了探究。第一部分Thrombospondin-1（TSP1）的表达水平能反映肝内胆管癌（ICC）对吉西他滨化疗的敏感性研究目的:应用人源性肿瘤组织异种移植（patient-derived xenografts,PDX）模型,筛选出能够反映肝内胆管癌对于吉西他滨化疗敏感性的目标分子,并通过临床样本验证目标分子的表达水平能否反映化疗敏感性。研究方法:建立PDX模型后,通过吉西他滨药敏实验筛选出了化疗敏感组以及耐药组的模型,利用转录组以及蛋白芯片技术在不同组别PDX模型中筛选出了目标分子;进一步通过PCR,免疫组化等方法在不同PDX模型中进行目标分子表达水平的验证;以及应用ELIAS、免疫组化等技术,通过临床样本验证目标分子的表达水平能否反映出ICC患者对于吉西他滨化疗的敏感性。研究结果:应用转录组测序和蛋白芯片技术对于不同组别的PDX模型检测后,我们发现吉西他滨化疗敏感组模型中TSP1的表达水平显着高于耐药组,后续通过PCR以及免疫组化技术证实TSP1在转录组水平和蛋白水平上均有显着差异。在临床队列中,我们发现TSP1的表达水平与吉西他滨化疗药物的敏感性相关,组织中或血清中TSP1的高水平能够预测吉西他滨较好的化疗效果和较长的生存时间。研究结论:TSP1在化疗敏感组织中表达水平明显高于耐药组织,在以吉西他滨为基础药物进行化疗的肝内胆管癌病人中,发现TSP1的表达水平与吉西他滨化疗药物的敏感性相关,组织中或血清中TSP1的高水平能够预测吉西他滨较好的化疗效果,病人的生存获益。第二部分Thrombospondin-1（TSP1）增强吉西他滨对肝内胆管癌的化疗效果研究目的:由于TSP1的表达水平与吉西他滨的化疗敏感性相关,本研究拟考查TSP1在吉西他滨化疗中的生物学作用。研究方法:利用TSP1重组蛋白,通过对其单独应用以及和吉西他滨联合应用,在细胞水平通过CCK8、EDU、以及克隆形成实验探索其对于肝内胆管癌细胞系（HCCC9810以及RBE）的生物学功能;又进一步建立裸鼠皮下荷瘤模型在动物水平去验证TSP1对于肝内胆管癌的生物学作用,以及TSP1能否对于吉西他滨的化疗起到增敏的效果。研究结果:CCK8、EDU以及克隆形成的结果均显示TSP1重组蛋白本身对于肝内胆管癌细胞的生长并没有起到抑制作用,但是TSP1重组蛋白联合吉西他滨一起使用时的效果比单独使用吉西他滨的化疗效果要好;而且在动物水平,我们通过对于裸鼠的皮下荷瘤实验得到了和细胞水平类似的实验结果,发现TSP1组荷瘤小鼠（单独应用TSP1）和空白对照组荷瘤小鼠相比,肿瘤的大小和生长速度并没有显着的统计学差异;但是TSP1+吉西他滨组荷瘤小鼠（TSP1和吉西他滨联合使用）的作用效果要好于吉西他滨单药组,前者荷瘤小鼠肿瘤的大小和生长速度受到明显抑制。研究结论:细胞实验以及动物实验证实了TSP1可以作为吉西他滨的化疗增敏剂,在联合吉西他滨一起应用时效果要比吉西他滨单独作用的疗效更好。第三部分TSP1可抑制肝内胆管癌细胞对油酸的摄取,从而增加吉西他滨的治疗效果研究目的:文献报道TSP1和CD36结合后会影响脂肪酸的摄取,而且由于脂代谢的异常会影响吉西他滨的化疗效果,本部分研究拟探索在肝内胆管癌中,TSP1是否会通过影响脂肪酸代谢促进了吉西他滨的化疗敏感性。研究方法:应用代谢组学对差异脂肪酸的筛选（实验组在肝内胆管癌细胞系加入TSP1重组蛋白,对照组加入生理盐水）。利用CCK8、EDU、克隆形成等实验同时在其它肝内胆管癌细胞系验证此脂肪酸对于吉西他滨化疗的影响,以此来确定在肝内胆管癌细胞中,此脂肪酸的变化是否能对吉西他滨化疗的效果产生影响;然后通过油红染色实验确定TSP1是否会影响肝内胆管癌细胞对于此脂肪酸的摄取,进一步检测此脂肪酸相关的代谢产物,进一步证实TSP1是否通过影响脂代谢增加了吉西他滨的化疗效果。研究结果:代谢组学的检测筛选出油酸作为差异脂肪酸,通过在细胞系验证发现TSP1会抑制肝内胆管癌细胞对于油酸的摄取。并且我们通过细胞功能学实验发现油酸的加入会减弱吉西他滨的药物疗效,进一步对于油酸代谢产物的检测,发现了导致吉西他滨药物抵抗的相关代谢产物ATP以及ROS水平的增加;而加入TSP1后会使得细胞对于油酸的摄取减少,其相关的代谢产物ATP以及ROS水平也会随之下降,增强吉西化疗的化疗效果。研究结论:TSP1可以通过抑制肝内胆管癌细胞对于油酸的摄取,提高了吉西他滨的化疗效果,起到了化疗增敏剂的作用。
林海[4]（2020）在《Lnc-ATB通过miR-200c相关信号通路调控胆管癌增殖及转移的机制研究》文中指出第一部分胆管癌组织中Lnc-ATB/miR-200c的表达及临床意义目的:研究Lnc-ATB与miR-200c在胆管癌组织中的表达及相关性,初步探讨其临床意义。方法:应用q RT-PCR方法检测Lnc-ATB及miR-200（miR-200a/b/c）在30例胆管癌组织及相应非癌组织中的表达。对两者表达量进行相关性分析,并结合患者的临床病理资料分析其临床意义。结果:通过比较30例胆管癌患者肿瘤组织及其相应非癌组织中Lnc-ATB及miR-200a/b/c表达水平,发现胆管癌组织中Lnc-ATB表达升高（3.807±0.907 VS1.049±0.510,P<0.001）,而miR-200a（2.260±0.899 VS 3.099±1.062,p<0.05）,miR-200b（1.338±0.587 VS 2.268±0.510,P<0.001）及miR-200c（0.469±0.251 VS1.452±0.410,P<0.001）表达均降低,其中以miR-200c表达降低最为明显。相关性分析提示胆管癌组织中Lnc-ATB高表达与miR-200c低表达密切相关（P<0.01）。Lnc-ATB呈高表达的胆管癌患者肿瘤体积较大,容易合并淋巴结转移,TNM分期较晚。而miR-200c呈低表达的胆管癌患者容易合并淋巴结转移,具有较晚的TNM分期。结论:胆管癌组织中Lnc-ATB表达升高,miR-200c表达降低,两者表达呈负相关。Lnc-ATB可能在胆管癌中发挥癌基因作用,而miR-200c可能发挥抑癌基因作用。第二部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中表达及功能目的:通过体外实验探讨Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中的表达及生物学作用。方法:应用q RT-PCR方法检测胆管癌细胞系HUCCT1、RBE、TFK1、Huh-28和人支气管上皮细胞BEC中Lnc-ATB/miR-200c的表达。采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中的Lnc-ATB表达水平,用q RT-PCR方法检测Lnc-ATB及miR-200c表达水平的变化。将Hu CCT1细胞同时转染带有野生型或突变型psi CHECK2-Lnc-ATB结合位点的质粒与miR-200c模拟物。转染后48h用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行荧光素酶活性测定,结合生物信息学分析,初步确定Lnc-ATB与miR-200c的调控关系及结合位点。采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达结合共转染miR200c抑制剂建立三组不同Lnc-ATB/miR200c表达水平的细胞。三组细胞分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组（si RNA-Lnc-ATB组）,si RNA-Lnc-ATB+共转染miR200c抑制剂组及阴性对照组,应用q RT-PCR方法检测各组细胞miR-200c表达水平变化。通过CCK8细胞增殖实验、流式细胞周期实验及细胞凋亡实验、Transwell试验分析Lnc-ATB/miR-200c信号轴对HUCCT1和RBE细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移能力的影响。结果:与正常BEC细胞相比,Lnc-ATB在HUCCT1、RBE、TFK1、Huh-28四种胆管癌细胞株中呈高表达,而miR-200c呈相对低表达,其中以HUCCT1、RBE细胞最为明显,因此选择HUCCT1、RBE细胞进行si RNA干扰实验。si RNA干扰实验显示敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达可以提高miR-200c的表达水平,并且si RNA1干扰效果优于si RNA2,因此采用si RNA1序列进行后续试验。生物信息学分析表明,Lnc-ATB含有潜在的miR-200c结合位点,预测miR-200c为Lnc-ATB的靶基因。双荧光素酶报告分析表明,miR-200c模拟物可以明显抑制带有野生型miR-200c结合位点的psi CHECK2-Lnc-ATB的荧光素酶活性,而在带有突变型miR-200c结合位点的psi CHECK2-Lnc-ATB中没有观察到这种现象。应用si RNA-Lnc-ATB体外敲低HUCCT1和RBE细胞Lnc-ATB表达可以升高miR-200c的表达水平,从而导致细胞增殖活力以时间依赖性方式下降,并促进细胞凋亡及G0/G1期阻滞,抑制细胞的迁移能力。然而,当将miR-200c抑制剂共转染入细胞以降低miR-200c表达时,可以逆转si RNA-Lnc-ATB对胆管癌细胞增殖、凋亡、G0/G1期阻滞及迁移能力的抑制。结论:胆管癌细胞中Lnc-ATB表达升高,miR-200c表达降低,Lnc-ATB通过抑制miR-200c表达参与调控胆管癌细胞的生长及迁移过程。第三部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴调控胆管癌生长和迁移的分子机制目的:研究Lnc-ATB/miR-200c相关信号通路因子在胆管癌细胞中的表达,为后续进一步研究提供理论指导。方法:采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达,结合共转染miR200c抑制剂建立三组不同Lnc-ATB/miR200c表达水平的细胞。三组细胞分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组（si RNA-Lnc-ATB组）,si RNA-Lnc-ATB+共转染miR200c抑制剂组及阴性对照组（NC组）。应用Western blotting检测三组细胞之间细胞周期相关蛋白CCND1/CDK2、细胞凋亡相关蛋白BCL-2/Caspase-3及EMT相关信号通路因子ZEB1/2及E-cadherin/N-cadherin的表达差异。结果:体外敲低HUCCT1细胞Lnc-ATB表达可以抑制CCND1/CDK2表达,升高Caspase-3表达,降低BCL-2表达,抑制ZEB1/2表达,上调E-cadherin表达并下调N-cadherin表达。而将miR-200c抑制剂共转染入HUCCT1细胞后可以抑制miR-200c表达上调,进而逆转上述分子蛋白的表达变化。结论:Lnc-ATB通过抑制miR-200c表达调控胆管癌细胞周期、凋亡及EMT相关信号通路因子的表达,从而促进胆管癌细胞的增殖及迁移。第四部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌体外移植瘤模型中的作用目的:研究Lnc-ATB/miR-200c信号轴对胆管癌细胞成瘤作用及体内相关信号通路因子表达的影响,初步探讨其是否可能作为胆管癌诊断及治疗的潜在分子靶标。方法:设计包装携带有lentivirus-RNAi-Lnc-ATB,miR-200c抑制剂及阴性对照（negative control）的慢病毒,先利用该病毒感染HUCCT1细胞系,得到长期稳定表达的三组细胞,分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组,敲低Lnc-ATB表达+共转染miR-200c抑制剂组及阴性对照组（NC组）。采用5周BALB/c裸鼠,随机分为三组,每组5只,分别取符合条件的三组HUCCT1细胞悬液建立裸鼠皮下移植瘤模型,连续饲养观察3周,每隔3天观察并记录期间肿瘤体积变化。待饲养3周后将裸鼠处死,比较肿瘤体积大小。采用免疫组织化学方法分析细胞增殖标志物PCNA在三组裸鼠肿瘤组织中的表达水平。利用Western blotting检测三组裸鼠肿瘤组织中细胞周期相关蛋白CCND1/CDK2、细胞凋亡相关蛋白BCL-2/Caspase-3及EMT相关信号通路因子ZEB1/2及E-cadherin/N-cadherin的表达差异。结果:采用慢病毒转染技术敲低HUCCT1细胞Lnc-ATB表达构建的裸鼠皮下移植瘤组织体积较小并伴有PCNA表达降低,而同时稳定转入miR-200c抑制剂的肿瘤细胞构建的裸鼠肿瘤组织体积及PCNA表达可以恢复。采用慢病毒转染技术敲低Lnc-ATB表达的HUCCT1细胞构建的裸鼠皮下移植瘤中的CCND1/CDK2及BCL-2表达降低,Caspase-3表达升高,ZEB1/2及N-cadherin表达降低,E-cadherin表达升高。而稳定转入si RNA-Lnc ATB+miR-200c抑制剂的肿瘤细胞构建的裸鼠移植瘤组织可以恢复其表达。结论:Lnc-ATB/miR-200c通过调控细胞周期、细胞凋亡及EMT相关信号通路因子表达促进胆管癌细胞的成瘤作用。Lnc-ATB/miR-200c或许可能成为胆管癌诊治的潜在分子靶标。
薛淑一[5]（2019）在《白头翁皂苷B4通过Notch通路对肝癌的抑制作用及其机制研究》文中研究表明目的:通过建立HepG2和Huh-7肝癌细胞模型与裸鼠异种移植肿瘤模型,从体外和体内实验探讨白头翁皂苷B4（Anemoside B4,AB4）抑制肝癌的作用,并从Notch通路的角度探究其可能的作用机制。方法:1.将肝癌细胞随机分组为对照组、AB4给药组、阳性对照组（DAPT组）,采用MTT及克隆形成实验检测AB4对肝癌细胞的抑制作用,AnnexinV-FITC/PI染色检测AB4给药后肝癌细胞的凋亡情况,蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测AB4给药后肝癌细胞凋亡相关蛋白的表达。2.建立荷瘤裸鼠异种移植模型,随机分组为对照组、AB4给药组、阳性对照组（DAPT组）,探究AB4对荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用;制作荷瘤裸鼠肿瘤组织病理切片,采用HE染色观察AB4给药后组织病理形态;运用免疫组化检测AB4给药后肿瘤组织Ki67的表达,以探究肿瘤组织中肝癌细胞的增殖情况。3.运用Western blot检测AB4作用后肝癌细胞Notch通路相关蛋白的表达情况,运用免疫组化检测AB4给药后荷瘤裸鼠肿瘤组织Notch相关蛋白的表达情况。结果:1.MTT实验中,AB4在一定范围内以浓度依赖性的方式抑制HepG2和Huh-7细胞的增殖。HepG2细胞最佳给药浓度为50μmol/L,给药时间为24 h,IC50为50.58±1.58μmol/L;Huh-7细胞最佳给药浓度为45μmol/L,给药时间为24 h,IC50为45.05±1.77μmol/L。克隆形成实验显示,采用50、100μmol/L AB4给药能显着抑制HepG2细胞的克隆形成（p<0.01）,45、100μmol/L AB4能显着抑制Huh-7细胞的克隆形成（p<0.01）。Annexin V-FITC/PI染色检测显示50μmol/L AB4能诱导肝癌细胞HepG2发生凋亡,45μmol/L AB4能诱导肝癌细胞Huh-7发生凋亡。Western Blot实验显示50μmol/L AB4给药后可以显着增高HepG2细胞凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Cytochrome C的表达（p<0.01）,45μmol/L AB4给药后可以显着增高Huh-7细胞凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Cytochrome C的表达（p<0.01）。2.AB4能显着抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,60 mg/kg AB4组、120 mg/kg AB4组及阳性对照组（DAPT组）的抑瘤率分别为24.05%、59.67%和66.67%;HE染色观察随60、120 mg/kg剂量的AB4给药后,肿瘤组织细胞轮廓模糊,细胞边界不清晰,形状不规则,细胞核大小不一,并出现核固缩、核碎裂、核质不清晰等现象;免疫组化实验证明AB4随60、120 mg/kg剂量的AB4给药后,肿瘤组织Ki67的表达降低,与对照组相比,具有显着性差异（p<0.05或p<0.01）。3.Western Blot实验证明肝癌细胞HepG2经50、100μmol/L AB4给药后,Notch相关蛋白Notch 1、Jagged 1、NICD 1、Hes 1、Hey 1表达均显着性降低（p<0.05或p<0.01）,而25μmol/L AB4给药后各蛋白表达与对照组相比无显着性意义。选取50μmol/L AB4与Notch通路抑制剂DAPT共同作用于HepG2细胞,发现DAPT加强了这种抑制作用。在肝癌细胞Huh-7中,Notch 1、Hes 1、Hey 1蛋白在45、100μmol/L AB4作用下,蛋白表达显着性降低（p<0.05或p<0.01）,在25μmol/L AB4作用下与对照组相比无显着性意义;Jagged 1、NICD 1蛋白在25、45、100μmol/L AB4作用下,蛋白表达均显着性降低（p<0.05或p<0.01）。选取45μmol/L AB4与DAPT共同作用于Huh-7细胞,发现DAPT亦能加强这种抑制作用。免疫组化实验发现荷瘤裸鼠经AB4（60、120 mg/kg）给药后肿瘤组织中Notch 1和Hes 1蛋白表达降低（p<0.05或p<0.01）。结论:1.AB4对肝癌细胞HepG2和Huh-7的增殖具有抑制作用,能够增高细胞中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Cytochrome C的表达诱导凋亡的发生。2.AB4抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,并抑制肿瘤组织Ki67的表达,从而抑制肿瘤组织细胞的增殖。3.AB4抑制肝癌的作用可能与抑制Notch信号通路相关蛋白Notch 1、Jagged 1、NICD 1、Hes 1、Hey 1的表达有关。
商天宇[6]（2019）在《PKHD1通过Notch信号通路对肝内胆管癌的抑癌效应及潜在分子机制研究》文中提出目的:检测PKHD1基因在胆管癌（CC）及癌旁正常组织中的表达,研究CRISPR/Cas9敲除PKHD1对人肝内胆管癌HCCC-9810及RBE细胞株的细胞行为学能力影响,测定Notch通路相关蛋白,观察敲除组细胞株的成瘤能力,通过体内及体外,细胞及动物实验探索PKHD1潜在的作用机制。方法:运用qRT-PCR检测PKHD1在CC及正常肝组织中的表达情况。设计PKHD1 guide RNA,构建CRISPR/Cas9双载体基因敲除PKHD1慢病毒系统,分别感染HCCC-9810及RBE细胞。采用PCR测序验证重组质粒构建以及PKHD1基因的敲除效果。Edu法检测Hucct-1细胞增殖状况。划痕实验、Transwell细胞试验观察敲除PKHD1前后细胞迁移和侵袭能力变化。采用Western blot检测Notch通路相关调控蛋白的表达变化。构建裸鼠皮下荷瘤模型,观察裸鼠移植瘤生长,30天后处死裸鼠,测量肿瘤体积和重量,免疫组化法检测各组裸鼠荷瘤组织中PKHD1及MMP9蛋白的表达水平。结果:PKHD1在CC组织中的mRNA表达水平均显着低于正常组织（P<0.01）;成功构建了PKHD1基因部分敲除的稳定HCCC-9810及RBE细胞系;与野生型细胞相比,PKHD1基因部分敲除后,Notch、Jagged-1、NICD蛋白表达水平显着增高（P<0.05）。敲除组中细胞的增长明显快于阴性对照组和空白对照组（P<0.01）,同时阴性及空白对照未见显着差异（P>0.05）。划痕实验示PKHD1基因部分敲除后细胞迁移能力增强。transwell小室证实敲除组穿过小室的能力与两对照组相比显着增加（P<0.01）,同样阴性及空白对照组间没有显着差异（P>0.05）;裸鼠皮下种植瘤结果发现,敲除组裸鼠皮下种植瘤生长速度、最终体积及质量明显大于空白对照组及阴性对照组,瘤组织内PKHD1蛋白表达明显降低,与细胞上皮间质转化相关的基质金属蛋白酶MMP9在PKHD1基因敲除组荷瘤组织中表达上调。结论:PKHD1基因在肝内胆管癌组织中表达降低,在HCCC-9810和RBE细胞中靶向敲低PKHD1能显着促进人肝内胆管癌细胞的增殖、侵袭迁移及体内肿瘤的生长能力,PKHD1基因可能通过Notch信号通路发挥其抑癌效应。
陶华[7]（2019）在《沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究》文中研究指明背景:在中国十大最常见的恶性肿瘤中,食管癌排名第六,仅次于胃肠道肿瘤的胃癌,呈现双高特征,即高发病率和高死亡率,而且往往呈区域聚集性。中两部卫生资源匮乏的农村尤其高发,食管癌高额的医疗费用仍是当地居民的上要疾病负担,严重的威胁个人的生命健康及生活质量,给家庭、社会带来巨大的影响。随着现代医疗水平突飞猛进的提高,临床上,食管癌的预防、诊治工作也取得了显着的进展,治疗方案的制定需要综合患者的临床分期、全身情况、当地吹院的条件设备及医疗水平等因素。外科手术仍是目前食管癌最重要的治疗手段,然而,局部晚期食管癌患者的预后并不理想。针对有手术机会的ⅡA-Ⅲ期食管鳞癌,单纯手术切除5年生存率低,有待进一步提高。由于食管癌对化疗和放疗敏感性较差,术后化疗或术后放疗均未能有效提高食管癌患者的预后。早期诊治成为改善食管癌患者预后的关键。然而食管癌的病因和发病机制尚不完全明了,基因突变、染色体重排、转录调控及修饰等基因遗传学的改变在食管癌中无疑发挥着极其重要的作用。因此,寻找食管癌特异性相关基因将可能为食管癌的诊断和治疗提供新的理论依据、成为针对该肿瘤的防治关键。表观遗传调控并不涉及DNA序列改变,是一个动态可逆、可遗传的过程,与诸多疾病的关系密切,组蛋白去乙酸化酶（Histone deacetylase,HDACs）、组蛋白乙酰化转移酶（histone acetylase,HATs）,不仅是维持核心组蛋白去乙酰化和乙酰化两者之间稳态的基础,而且有利于染色质状态的调节。进而影响基因的表达,因此,乙酰化调控是表观遗传学调控最重要的方式之一。蛋白家族HDACs有众多的成员。组蛋白脱乙酰化酶6（HDAC6）因其结构中含有两个且功能上独立的HDAC催化结构域,归属于一种比较特殊的HDACs成员。HDAC6的主要作用是催化乙酰化αα-微管蛋白、热休克蛋白90（Heat shock protein 90,HSP90）等非组蛋白的脱酰化效应。而组蛋白酰基化作用并不受控于 HDAC6活性的特异性抑制。通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控,HDAC6在肿瘤的形成中起着重要作用。分裂周期中,发生在细胞中的不适当脱乙酰化、从细胞质到细胞核的再分配,都可能导致转录抑制,并且异常基因表达从而诱导肿瘤的发生、发展。当下研究的焦点、热点问题之一就是HDACs及其抑制剂。已有大量的研究表明,抑制HDACs的表达或活性成为治疗恶性肿瘤行之有效的分子靶点。越来越多的研究表明,许多恶性肿瘤包括乳腺癌、口腔鳞癌、白血病、肺癌等组织中HDAC6表达异常,表明其在参与肿瘤的形成中起着不愈言说的作用。HSP90是对许多蛋白质的稳定性和功能起至关重要的分子伴侣蛋白,以维持细胞蛋白质稳态和细胞存活。同样,在肿瘤发生过程中,HSP90对肿瘤发展中不可缺少的多种致癌蛋白的稳定性和功能至关重要。HSP90在食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）细胞系中的表达量较正常的食管上皮细胞的表达量明显增加。HSP90抑制剂能阻断食管癌细胞的增殖效应,该抑制剂如17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素（17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG）。当 HDAC6沉默、失活或敲除时,作为HDAC6的底物HSP90,将发生高乙酰化作用,从而造成HSP90活性的丧失。联合抑制HDAC6和HSP90显示很好的协同作用,在人白血病细胞中,HDAC6和HSP90的联合抑制在抗癌活性中具有协同作用。HSP90-HDAC6的药物治疗可能是食管癌的一种有前景的策略。然而,迄今为止,国内外尚罕见有关HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖及转移的作用机制的研究报道。目的:1、探讨HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义;2、构建慢病毒载体并制备,该载体携带HDAC6基因并将其靶向沉默,奠定了后续体内、外实验工具的基石,该表达系统的应用,以期验证其进行食管癌基因治疗的有效性;3、探讨慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制的功能学（食管癌细胞生物学特性）影响,为食管癌临床治疗的新靶向系统最终应用提供实验依据和科学理论。方法:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义分别采集10例食管癌及癌旁组织,qRT-PCR和Western blot方法检测组织中HDAC6 mRNA及HDAC6蛋白的表达情况。另外选取90例食管癌标本,IHC检测食管癌中组织中HDAC6的表达情况,分析HDAC6的表达与食管癌患者临床病理的关系。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1根据HDAC6基因（NM0001130416.1）序列为标靶,通过BLAST 同源性分析,设计、选择两段寡核甘酸序列,长度为21 nt,作为以HDAC6基因为靶点的shRNA片段序列,以该序列为模板,即能合成两对DNA单链片段,并以次为引物,经退火、双酶切后,也同样的把pLKO.1-增强型绿荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）质粒进行双酶切,连接、转化两种双酶切后的产物,获得2个质粒:以HDAC6基因为模板,合成了 2对长引物单链DNA片段,退火后双消化,同一双消化质粒pLKO。1-增强型绿色荧光蛋白（增强型绿色荧光蛋白,EGFP）2.2 qRT-PCR和Western blot方法检测食管正常上皮细胞系（HEEC-1）及KYSE140、KYSE170和KYSE180三株ESCC细胞系中HDAC6基因的表达情况,将转染稳定的细胞筛出。获得的质粒分别转染ESCC细胞系（KYSE140、KYSE180）,分别用qRT-PCR和Western blot方法检测HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达水平,以HDAC6基因为靶点,筛选出沉默表达效应最显着的质粒;基于该质粒,通过基因克隆技术,可将携带有 HDAC6 基因靶向沉默的 shRNA 片段-pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒包装质粒构建。2.3采用 Invitrogen公司的共转染系统,进行制备慢病毒表达载体系统（Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP）及其相关的质量检测,qRT-PCR 和 Western blot分别检测转染后KYSE140、KYSE180细胞株中HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达。3、慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制表达对食管癌细胞生物学特性的影响3.1靶向HSP90-HDAC6抑制对食管癌细胞生物学特性体外实验采用构建的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统感染食管癌细胞株 KYSE140和 KYSE180。3.1.1 CCK-8法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞增殖的影响;3.1.2 Transwell法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.3 CCK-8法检测不同浓度的HDAC6抑制剂 Tuabasin A对食管癌细胞增殖的影响;3.1.4 Transwell法检测不同浓度的Tuabasin A对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.5 Western blot及免疫荧光法检测HDAC6 siRNA、不同浓度的Tubastatin A对α微管蛋白乙酰化的影响;3.1.6 免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation,CO-IP）检测 HDAC6 siRNA、不同浓度Tubastatin A对HSP90蛋白乙酰化的影响;3.1.7 Western blot检测不同浓度的HSP90特异性抑制剂 PU-H71、Tubastatin A对下游蛋白质表达的影响;3.1.8 CCK-8法检测HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响;3.1.9 Transwell法检测 HSP90-HDAC6抑制剂对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.10 Western blot检测HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白质表达的影响。3.2 HSP90-HDAC6抑制剂对裸鼠皮下食管癌细胞移植瘤生长抑制作用的实验研究建立食管癌细胞KYSE140移植瘤模型,接种2周成瘤后,根据治疗方式的不同,按照随机数字法,将裸鼠分为PU-H71组、TubastatinA组、PU-H71+TubastatinA组,并设赋形剂为对照组,进行腹腔注射,观察其对荷瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本、存活情况及下游蛋白表达的影响。结果:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义1.1 qRT-PCR法检测HDAC6mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（5.13±3.78）VS（2.12±2.04）。较之于癌旁组织,在ESCC组织中HDAC6 mRNA的相对表达量显着增加,差异明显,组间差异比较具有统计学意义（P<0.05）。1.2 Western Blot法检测HDAC6蛋白在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（2.35±1.64）VS（1.21±0.57）。HDAC6蛋白在ESCC组织中的相对表达量较癌旁组织的相对表达量明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。1.3免疫组织化学检测结果显示HDAC6阳性表达位于癌细胞核。90份食管鳞状细胞癌组织标本中,62份HDAC6阳性表达,表达率为68.9%。1.4在ESCC患者中,食管癌患者的临床病理分期及淋巴结转移与HDAC6的表达有关（P<0.05）;而性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化、肿瘤浸润深度与HDAC6的表达无关（P<0.05）。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1干扰靶点的设计结果人HDAC6特异性shRNA-1序列（正向序列:CCGGGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCACCCAAC TGCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCA CCCAACTGC）;人HDAC6特异性shRNA-2序列（正向序列:CCGGGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAGTTAACT CCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAG TTAACTCC）。2.2 测序鉴定重组质粒 pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP经BLAST软件分析,重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序结果与原始序列比对,设计序列正确插入载体,并无碱基的缺大、突变、移位,证实合成的实验组与对照组干扰靶点均已成功构建成重组质粒,符合预期设计,载体构建成功。2.3采用共转染策略制备经PCR鉴定的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点。3、HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响3.1 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性体外实验3.1.1 CCK-8检测了阴性对照组、干扰靶点1和十扰靶点2 组 ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的增殖能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞增殖率均明显降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.2 Transwell检测了阴性对照组、干扰靶点1和干扰靶点2组ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的迁移运动能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞穿膜数均显着减少,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.3一致地,HDAC6抑制剂Tuabasin A,也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的增殖,并呈剂量依赖性。当Tuabasin A的浓度达到500 nM时,较之于阴性对照组,抑制剂组细胞增殖率明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.1.4一致地,Tuabasin A也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的迁移运动,并呈剂量依赖性。当浓度达到500 nM时,与阴性对照组比较,抑制组细胞穿膜数均显着减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,且在食管癌KYSE140细胞中更为明显（P<0.05）。3.1.5 α-微管蛋白是HDAC6的一个靶点,与细胞运动有关。Western blot法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达量增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在KYSE140和KYSE180细胞中,阴性对照组、TuabasinA（100 nM）组、TuabasinA（500 nM）组、Tuabasin A（1μM）乙酰化α微管蛋白的相对表达量逐渐增加,差异比较具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光检测中发现,冷诱导微管破坏后,微管被分解,KYSE140和KYSE180细胞中几乎不能观察到微管。与阴性对照组相比,Tuabasin A处理的细胞中检测到更多微管（P<0.05）。3.1.6免疫共沉淀法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,乙酰化HSP90蛋白在干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在HDAC6抑制剂的研究中,呈现一致地结果。在KYSE140和 KYSE180 细胞中,阴性对照组、Tuabasin A（100 nM）组、Tuabasin A（500 nM）组、TuabasinA（1 μM）中HSP90蛋白乙酰化量呈现递增的趋势,组间比较差异明显,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.7 HSP90抑制剂PU-H71、Tubastatin A调节蛋白质的表达。在KYSE140和KYSE180细胞中,与对照组相比,PU-H71处理的细胞中EGFR、Akt、磷酸激酶和磷酸化ERK水平降低。在KESE140和KYSE180细胞系中,Tubastatin A治疗还可降低蛋白EGFR、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）和磷酸化ERK（p-ERK）的表达水平,但抑制的程度较HSP90抑制剂低（P<0.05）。3.1.8 CCK-8检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组的平均细胞增殖率分别为 100.00%、91.45%、78.26%、62.03%,联合Tubastatin A+PU-H71与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞活力（P<0.05）。3.1.9 Transwell检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组细胞穿膜转移数呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组细胞穿膜转移数明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。联合Tubastatin A+PU-H71 治疗与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞迁移运动能力（P<0.05）。3.1.10 Western blot检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。两种细胞系的实验结果均致的表明,Tuabasin A和PU-H71联合治疗与单独的Tuabasin A或PU-H71治疗相比,EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白表达水平最低。3.2 HDAC6-HSP90 i对食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤的影响3.2.1裸鼠皮下移植瘤的造模选用人食管鳞状细胞癌KYSE140细胞株裸鼠皮下移植,观测移植瘤不同时间段成瘤的大小。裸鼠腹股沟接种区平均2周左右出现移植瘤,3 周后直径约0.2-0.6 cm,接种的所有动物均存活下来,并在体形成了肿瘤,接种点无发热、红肿、破溃等炎症反应。第3周开始,PU-H71+Tubastatin A注射组裸鼠移植瘤直径均明显低于上述其他三对照组移植瘤的直径,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）;第6周开始,PU-H71注射组裸鼠移植瘤直径均低于赋形剂注射组、Tubastatin A注射组移植瘤的直径,差异有统计学意义（P<0.05）。仅在 Tuabasin A（10 mg/kg）和 PU-H71（50 mg/kg）联合注射的裸鼠中观察到显着的肿瘤抑制作用。3.2.2观察裸鼠存活情况及皮下移植瘤大体标本对照组、Tuabasin A组、PU-H71组裸鼠活动少,精神状态、食欲差,嗜睡等,而PU-H71组+Tuabasin A组裸鼠活动多,精神状态好,食欲佳。联合PU-H71+Tuabasin A注射显着抑制肿瘤生长,有利于改善裸鼠的生存质量。Tuabasin A和PU-H71联合注射组移植瘤体积较小,瘤体周围能看到较明显完整的包膜形成,形状较规整,有清楚的界限,无明显浸润、粘连的现象,能较完整的剥离肿瘤组织。而瘤体内注射赋形剂、TuabasinA组的裸鼠中,移植瘤的体积则较大,瘤体组织与周围无明显的界限,边缘毛糙,瘤体周围无完整的包膜形成,更有甚至,表面皮肤将受累。3.2.3 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响荷瘤裸鼠移植瘤中,赋形剂注射对照组、单独Tubastatin A（100 nM）注射组、单独 PU-H71（100 nM）注射组、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）注射组瘤体中EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,比较具有统计学意义（P<0.05）。与其他三组相比,TuabasinA（10mg/kg）和PU-H71（50 mg/kg）联合注射组裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平最低。此外,IHC 分析也显示,Tuabasin A（10 mg/kg）+PU-H71（50 mg/kg）联合注射组可显着抑制荷瘤裸鼠移植瘤中EGFR蛋白的表达。结论:1、HDAC6高表达于食管癌组织中,促进食管癌的发生、发展,有望作为食管癌治疗的重要靶点。2、采用共转染策略制备,成功的将慢病毒穿梭质粒载体构建后,制备了 HDAC6基因靶向沉默表达的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP重组慢病毒载体,经PCR鉴定和Western blot检测方法,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点,为进一步开展HDAC6基因的食管癌治疗临床前研究提供了必须的实验工具。3、HSP90作为HDAC6的底物,其配体的活性部分能够被HDAC6介导的脱乙酰化效应激活。构建的HDAC6基因靶向沉默慢病毒载体通过RNAi在体外可有效抑制食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖和细胞迁移运动能力,沉默HDAC6之后,HSP90的脱乙酰化效应随着沉默,表现出HSP90的乙酰化过度,从而导致HSP90配体活性散失,两者联合抑制具有协同作用。联合HDAC6抑制剂（TubastatinA）和HSP90抑制剂（PU-H71）与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖、细胞迁移运动能力及EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白水平。4、食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤造模成功,HSP90-HDAC6抑制剂显着的抑制肿瘤的生长,有利于改善裸鼠的生存质量,HSP90-HDAC6抑制剂显着降低裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平。5、靶向沉默HDAC6基因可能通过HSP90的过度乙酰化有效阻断食管癌中细胞信号传导通路EGFR、p-AKT及p-ERK表达谱的变化,开辟了阐述食管癌发病机制的全新分子生物学学说,临床应用前景呈现出一片大好的趋势。
张朝赫[8]（2017）在《3.0T MR弥散成像评价光动力治疗QBC939胆管癌荷瘤裸鼠疗效及病理相关研究》文中研究表明研究背景和目的:肝脏胆管细胞癌（cholangiocarcinoma,CC）恶性程度高、侵袭性强、发病隐匿、是我国胆道系统常见的、死亡率较高的恶性肿瘤之一。根治性切除术是治愈胆管癌的唯一手段,然而临床上可以进行根治性切除的患者低于10%。光动力（photodynamic therapy PDT）在国外是一种比较成熟的胆管癌治疗手段,而在我国临床上应用金丝桃素作为光敏剂进行胆管癌局部治疗还相对较少。胆管癌恶性程度高,肿瘤血管生成、细胞增殖是病变进展的重要生物学行为,直接决定其恶性程度。本课题以人QBC939胆管癌皮下荷瘤裸鼠模型为基础,利用金丝桃素作为光敏剂进行光动力治疗,利用磁共振平扫T1WIT2WI、弥散加权成像（DWI）对光动力治疗QBC939胆管癌裸鼠模型疗效进行评估,将MVD、Ki67检测结果进行对比,探讨利用MR-DWI检查在评估光动力在治疗人QBC939胆管癌皮下荷瘤裸鼠模型疗效方面的应用价值、浅谈金丝桃素PDT治疗QBC939胆管癌的机制,观察以金丝桃素作为光敏剂进行PDT治疗的近期疗效,从而为3.0TMRI评估光动力治疗胆管癌疗效提供重要临床依据。材料与方法:利用人QBC939胆管癌细胞株建立30只皮下移植瘤裸鼠模型,并将其平均分为A（对照组）、B（金丝桃素PDT组）两组,处理前后进行MRI和DWI扫描,MR序列包括轴位、矢状位、冠状位tirmT2WI序列、轴位、矢状位dark-fluid T1WI序列。DWI检查采用diff-mddw序列行轴位DWI扫描,激励次数（NXE）=1,b值分别为:0/mm2-300s/mm2,0/mm2-700s/mm2,得到两组 b 值下 A、B 两组处理前后人 QBC939胆管癌裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤病灶的DWI图及相应ADC图,筛选出最佳ADC图,测量ADC值。A、B两组分别注射胜生理盐水、金丝桃素,然后进行光照处理,A组实验鼠在完成第二次影像学检查后同B组一起处死,两组荷瘤裸鼠病灶进行常规HE染色切片,并进行免疫组化CD34染色计数微血管密度MVD和Ki67染色。结果:QBC939胆管癌病灶ADC值与Ki67呈负相关,P<0.05结果具有统计学意义;与MVD相关性较差,P>0.05结果不具有统计学意义;治疗后急性期内治疗组B组肿瘤体积为（3.11±0.78）cm3小于A组对照组体积（1.83±0.38）cm3。利用金丝桃素光动力治疗后B组胆管癌组织ADC值（985.39±36.99）×10-6mm2较A组ADC值（811.94±34.89）×10-6mm2明显升高;KI67降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:利用3.0T MRI 4通道正交动物线圈得到不同序列（T1WIT2WI和DWI）可以清晰显示荷瘤鼠肿瘤组织形态、内部信号、周围组织局部受侵情况;ADC值与肿瘤Ki67有着良好相关性,可以在细胞水平上反映光动力治疗后人QBC939胆管癌裸鼠皮下移植瘤模型的肿瘤实性部分细胞增殖受限程度;DWI显示光动力治疗在体胆管癌具有良好的疗效,可以为光动力治疗胆管癌的临床应用提供重要帮助。
李振凯,张炳远,代冬冬,高源,张宪祥,胡继霖,卢云[9]（2013）在《肝门部胆管癌神经浸润动物模型的建立》文中指出目的建立肝门部胆管癌神经浸润裸鼠模型。方法将培养的胆管癌细胞系QBC939细胞接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠背部皮下原代胆管细胞癌动物模型,取原代肿瘤组织接种于裸鼠腹腔近肝脏处,建立腹腔二代移植瘤模型,成瘤后行种植瘤组织解剖学和病理学观察。结果肝门部胆管癌背部皮下原代种植瘤成瘤率为100%（5/5）,未见神经浸润;腹腔二代移植瘤成瘤率为45%（9/20）,神经浸润率为22%（2/9）,神经浸润模型成功率为10%（2/20）。病理学观察显示为瘤细胞大小不一,形态多样,不规则;细胞分化程度低,胞浆减少,细胞核大,异形性明显,大小不等,可见核分裂像;无明显腺管样结构。结论肝门部胆管癌细胞具有较强的神经浸润性,应用QBC939细胞系建立肝门部胆管癌神经浸润裸鼠模型为研究肝门部胆管癌神经浸润方式及生物学特性创建了良好的实验平台。
成伟[10]（2012）在《慢病毒介导的RNA干扰沉默Tiam1基因对胆管癌生物学行为的影响》文中研究指明胆管癌是最常见的一类胆道恶性肿瘤之一,近年来发病率逐年增加。胆管癌因为其特殊的解剖位置使得大多数患者在发现时已经临近晚期,丧失了根治手术的机会,因此胆管癌的手术切除率和5年生存率一直不让人满意。胆管癌对放化疗不敏感,其他一些非手术疗法也难以取得理想效果。目前仍然缺乏早期发现胆管癌的有效办法和综合治疗胆管癌的理想方案。加深对胆管癌生物学特性的了解,探寻胆管癌发生发展的内在机制,寻求有效的早期诊断和治疗方法,对于提高胆管癌的疗效,改善胆管癌患者预后具有积极意义。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（T lymphoma invasion and metastasis inducing factor1, Tiaml）被认为是一种原癌基因,与肿瘤的侵袭转移能力密切相关。Tiam1基因通过对细胞骨架的调节作用、诱导膜皱褶、调节粘附分子的亲和力等一系列作用,发挥促进肿瘤细胞增殖和迁移的功能。Tiam1在淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌和肺癌等多种肿瘤组织及肿瘤细胞中高表达,其表达水平与肿瘤的侵袭转移能力密切相关。胆管癌最重要的生物学行为表现在顺胆管的侵袭和胆管周边组织、淋巴结及远处组织的转移。尽管Tiam1基因在多种肿瘤中的表达情况及其与各种肿瘤关系已经有学者阐述,但Tiam1基因在胆管癌的表达、功能及其机制国内外尚未见报道。因此,本研究结合临床资料分析、RNA干扰沉默基因及体内外实验等多种实验方法,从人群、分子、细胞、动物水平观察Tiam1基因在胆管癌中的作用,探讨其机制,为胆管癌的诊断和治疗提供新的基因靶点。本研究纲要：第一章：观察Tiam1基因在人胆管癌组织和良性胆管组织中的表达差异,探讨其表达水平和肿瘤分化程度、侵袭转移能力之间的关系；第二章：构建靶向干扰Tiam1基因表达的慢病毒载体,确认干扰效果后滴度测试,备下一步功能实验；第三章：使用特异性靶向干扰Tiam1基因表达的慢病毒载体作用胆管癌细胞后,观察胆管癌细胞增殖、侵袭转移能力的改变；第四章：建立稳定干扰Tiaml基因的裸鼠种植瘤模型,观察Tiam1基因沉默后裸鼠种植瘤生物学行为改变。第一章Tiam1在人胆管癌组织及细胞系中的表达及其意义目的：研究Tiam1基因在人胆管癌组织和良性胆管组织中的表达特点,分析Tiam1基因表达与肿瘤分化程度、侵袭转移能力之间的关系,观察Tiam1基因在人胆管癌细胞株的表达情况。方法：应用免疫组化法检测83例胆管癌组织和25例良性胆管组织Tiam1表达情况,收集胆管癌患者临床资料,分析Tiam1基因表达与胆管癌患者临床病理特征之间的关系,Real-time PCR检测人胆管癌细胞系QBC939和RBE中Tiam1的表达水平。结果：胆管癌组织中的Tiam1蛋白表达阳性率明显高于良性胆管组织（P<0.001）,胆管癌Tiam1蛋白表达与胆管癌的分化程度、TNM分期、是否淋巴结转移相关（P<0.05）,与性别、年龄、是否有远处转移无明显相关（P>0.05）。Tiam1mRNA在QBC939和RBE细胞中均有表达,在RBE细胞中的表达较高。结论：（1）Tiam1在胆管癌组织中表达明显升高,并随胆管癌恶性程度增加而升高；（2）Tiam1在RBE细胞中表达较高,选择REB细胞进行后续实验。第二章Tiam1基因RNA干扰慢病毒载体制备、包装与病毒滴度测定检测目的：筛选有效的Tiam1-siRNA序列,构建重组慢病毒Tiam1-shRNA表达载体,进行慢病毒滴度测试和包装。方法：设计针对Tiam1靶基因序列的siRNA序列,构建重组shRNA穿梭质粒,共转染293T细胞行慢病毒包装。Tiam1-shRNA慢病毒载体感染RBE细胞后观察报告基因表达情况评估转染效率,Real-time PCR检测感染的目的细胞内Tiam1基因的mRNA表达情况评估干扰效率。构建满意的慢病毒载体行滴度测试和大量包装。结果：重组质粒的DNA测序结果显示与预期DNA序列吻合,重组成功。Tiam1-shRNA慢病毒载体感染RBE细胞后观察目的细胞感染效率达到80%以上,Real-time PCR检测Tiam1基因的表达情况显示Tiam1基因表达下调超过90%。Tiam1-shRNA慢病毒载体构建成功,病毒滴度1x109TU/mL。结论：成功构建Tiam1-shRNA慢病毒载体,可有效转染RBE细胞,有效下调RBE细胞Tiam1基因表达。第三章RNAi靶向抑制Tiam1基因表达对胆管癌细胞的生物学影响目的：研究靶向抑制Tiam1的表达对人胆管癌细胞增殖、迁移活性的影响。方法：将人胆管癌RBE细胞分为三组,实验组和对照组分别转染Tiam1shRNA慢病毒载体和shRNA阴性对照慢病毒载体、空白组不做处理。Real-timePCR内源验证Tiam1基因的表达情况。细胞周期实验和MTT实验检测细胞增殖活力,Transwell实验检测细胞迁移活力。结果：Real-timePCR检测提示实验组Tiam1表达水平明显低于对照组和空白组（p<0.05）,提示Tiam1shRNA对RBE细胞的Tiam1基因沉默有效。细胞周期实验提示实验组细胞周期中S期所占比例相比对照组和空白组明显降低（p<0.05）,说明Tiam1基因表达下调后,细胞增殖速度受到了抑制。MTT实验结果提示实验组总体生长速度比较对照组和空白组显着降低（p<0.05）,提示靶向抑制Tiam1基因表达后抑制了胆管癌细胞的增殖活力。Transwell检测结果显示,实验组转移率显着低于对照组和空白组（p<0.05）,提示靶向抑制Tiam1基因表达可以明显抑制RBE细胞的迁移能力。结论：靶向沉默Tiaml的表达可以抑制胆管癌细胞的增殖与迁移活性。第四章RNAi靶向抑制Tiam1基因表达对RBE细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究目的：研究靶向抑制Tiam1的表达对人胆管癌裸鼠皮下种植瘤生长的影响。方法：将实验裸鼠分为三组：实验组、对照组和空白组分别皮下接种Tiam1-shRNA慢病毒载体感染的RBE细胞、shRNA阴性慢病毒载体感染的RBE细胞和未被感染的RBE细胞。建立人胆管癌裸鼠皮下种植瘤模型,计算成瘤率。致瘤成功后每3天测量种植瘤的体积,绘制增长曲线。21天后处死裸鼠,获取肿瘤,称重。Real-time PCR方法检测裸鼠移植瘤中Tiaml基因的表达。结果：各组裸鼠皮下种植瘤5天后观察均成功,成瘤率100%。实验组裸鼠种植瘤生长速度明显低于对照组和空白组（P<0.05）；终点重量也显着低于对照组和空白组（P<0.05）。Real-time PCR检测结果显示实验组裸鼠移植瘤中Tiam1基因的表达明显低于对照组和空白组（P<0.05）。结论：Tiam1-shRNA’慢病毒颗粒转染的RBE细胞种植后,在裸鼠体内经过21天进展仍然能够有效沉默Tiam1基因。RNA干扰沉默Tiam1基因后可以抑制裸鼠种植瘤生长。
二、人胆管细胞癌荷瘤裸鼠模型的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人胆管细胞癌荷瘤裸鼠模型的建立（论文提纲范文）
（1）MANF与原发性肝癌预后相关性及其与索拉非尼治疗敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: MANF与肝细胞癌预后相关性及索拉非尼治疗敏感性的机制研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分: MANF与肝内胆管细胞癌预后相关性及其与索拉非尼治疗敏感性的机制研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ Diagnostic and prognostic values of MANF expression in hepatocellular carcinoma |
| 外文论文Ⅱ Mesencephalic Astrocyte-derived Neurotrophic Factor, a Prognostic Factor of Cholangiocarcinoma, Affects Sorafenib Sensitivity of Cholangiocarcinoma Cells by Deteriorating ER Stress |
（2）Ⅰ.miR-194-5p在间充质干细胞微环境调控肺癌增殖的作用及机制研究 Ⅱ.功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的增殖（论文提纲范文）
| Ⅰ. miR1945p在间充质干细胞微环境调控肺癌增殖的作用及机制研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1. 肺癌研究现状 |
| 1.1.1. 肺癌流行病学特征 |
| 1.1.2. 肺癌致病因素 |
| 1.2. 间充质干细胞微环境与肺癌 |
| 1.2.1. 间充质干细胞的定义 |
| 1.2.2. 间充质干细胞与肿瘤微环境 |
| 1.2.3. 间充质干细胞与肺癌 |
| 1.3. miRNA与肺癌研究进展 |
| 1.3.1. miRNA的生物学特性 |
| 1.3.2. miRNA在肺癌中的作用 |
| 1.4. 本文研究内容与意义 |
| 第2章 人肺癌组织来源的MSC促进肿瘤增殖 |
| 2.1. 引言 |
| 2.2. 实验材料 |
| 2.2.1. 肺癌病人标本和实验细胞 |
| 2.2.2. 仪器设备 |
| 2.2.3. 试剂及耗材 |
| 2.3. 实验方法 |
| 2.3.1. 肺癌MSC的分离 |
| 2.3.2. 细胞复苏 |
| 2.3.3. 细胞传代与冻存 |
| 2.3.4. 流式细胞术检测MSC表面标记 |
| 2.3.5. 免疫荧光染色 |
| 2.3.6. MSC成骨分化诱导 |
| 2.3.7. MSC成脂分化诱导 |
| 2.3.8. 小鼠皮下荷瘤实验 |
| 2.4. 实验结果 |
| 2.4.1. 人肺癌组织MSC的分离与鉴定 |
| 2.4.2. 肺癌MSC促进肺癌细胞体内增殖 |
| 2.5. 本章小结 |
| 第3章 肺癌组织MSC下调肺癌细胞中miR1945p促进肺癌增殖与迁移 |
| 3.1. 引言 |
| 3.2. 实验材料 |
| 3.2.1. 肺癌病人标本和肺癌细胞系 |
| 3.2.2. 仪器设备 |
| 3.2.3. 试剂及耗材 |
| 3.3. 实验方法 |
| 3.3.1. 质粒转化 |
| 3.3.2. 质粒提取与扩增 |
| 3.3.3. 慢病毒包装及感染 |
| 3.3.4. RNA的提取 |
| 3.3.5. 实时荧光定量PCR |
| 3.3.6. 肿瘤干细胞球形成实验 |
| 3.3.7. Transwell迁移实验 |
| 3.3.8. 小鼠皮下荷瘤实验 |
| 3.3.9. 蛋白质免疫印迹 |
| 3.4. 实验结果 |
| 3.4.1. 肺癌 MSC 下调肺癌细胞中 mi R-194-5p 的表达 |
| 3.4.2. miR-194-5p 下调促进肺癌细胞增殖 |
| 3.4.3. 预测 miR-194-5p 下游靶基因为 LIN28B |
| 3.4.4. 肺癌 MSC 通过分泌 bFGF 下调肺癌中的 miR-194-5p 表达 |
| 3.5. 小结 |
| 3.6. 讨论 |
| 结论 |
| Ⅱ. 功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1. 肝内胆管细胞癌研究状况 |
| 1.1.1. 肝内胆管细胞癌简介 |
| 1.1.2. 诱发肝内胆管细胞癌的因素 |
| 1.1.3. GO-PEI作为递送载体的相关研究 |
| 1.1.4. Micro RNA(miRNA)的作用机制及肿瘤治疗 |
| 第2章 功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的研究 |
| 2.1. 引言 |
| 2.2. 实验材料 |
| 2.2.1. 纳米材料和实验细胞 |
| 2.2.2. 仪器设备 |
| 2.2.3. 试剂及耗材 |
| 2.3. 实验方法 |
| 2.3.1. 细胞的复苏 |
| 2.3.2. 细胞传代与冻存 |
| 2.3.3. 制备及纯化GO-PEI实验 |
| 2.3.4. 凝胶阻滞实验 |
| 2.3.5. 凋亡流式检测 |
| 2.3.6. CCK8增殖实验 |
| 2.3.7. 肿瘤克隆形成实验 |
| 2.3.8. TCGA和miRNA芯片分析 |
| 2.3.9. miRNA实时荧光定量PCR |
| 2.3.10. 流式细胞术检测 |
| 2.3.11. 激光共聚焦显微镜观察 |
| 2.3.12. 肿瘤干细胞球形成实验 |
| 2.3.13. 体内荷瘤实验 |
| 2.4. 实验结果 |
| 2.4.1. GO-PEI的构建及表征 |
| 2.4.2. GO-PEI-miRNA复合物的凝胶阻滞实验 |
| 2.4.3. GO-PEI对细胞的凋亡和毒性研究 |
| 2.4.4. TCGA及miRNA芯片寻找ICC中下调的抑制性miRNA |
| 2.4.5. GO-PEI能够携带miRNA进入肿瘤细胞内 |
| 2.4.6. GO-PEI携带4种抑制性miRNA对肿瘤干细胞特性的影响 |
| 2.4.7. GO-PEI携带4种抑制性miRNA可增强肿瘤细胞对Sorafenib的敏感性 |
| 2.4.8. GO-PEI携带4种抑制性miRNA在体内显着抑制肿瘤增殖 |
| 2.5. 讨论 |
| 结论 |
| 总结 |
| Ⅰ. miR1945p在间充质干细胞微环境调控肺癌增殖的作用及机制研究 |
| Ⅱ. 功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的研究 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）Thrombospondin-1对于肝内胆管癌接受吉西他滨化疗的增敏作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 Thrombospondin-1(TSP1)的表达水平能反映肝内胆管癌(ICC)对吉西他滨化疗的敏感性 |
| 一、前言 |
| 二、材料方法 |
| 三、实验步骤 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Thrombospondin-1(TSP1)增强吉西他滨对肝内胆管癌的化疗效果 |
| 一、前言 |
| 二、材料方法 |
| 三、实验步骤 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TSP1可抑制肝内胆管癌细胞对于油酸的摄取,从而增加吉西他滨的治疗效果 |
| 一、前言 |
| 二、材料方法 |
| 三、实验步骤 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Thrombospondin-1(TSP1)相关的生物学功能以及在疾病中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）Lnc-ATB通过miR-200c相关信号通路调控胆管癌增殖及转移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:胆管癌组织中Lnc-ATB/miR-200c的表达及临床意义 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中表达及功能 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴调控胆管癌生长和迁移的分子机制 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌体外移植瘤模型中的作用 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分:全文总结 |
| 1.研究结论 |
| 2.本研究的创新性 |
| 3.研究不足和展望 |
| 综述 长链非编码RNA在恶性肿瘤诊治中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（5）白头翁皂苷B4通过Notch通路对肝癌的抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 体外实验探究AB4对肝癌细胞的抑制效果 |
| 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 药物溶液的配制 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞复苏 |
| 2.4 细胞传代 |
| 2.5 细胞冻存 |
| 2.6 MTT实验 |
| 2.7 克隆形成实验 |
| 2.8 Annexin V-FITC/PI染色 |
| 2.9 蛋白免疫印迹法(Western Blot) |
| 2.10 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 AB4对肝癌细胞的抑制作用 |
| 1.1 MTT实验检测AB4 对肝癌细胞增殖率的影响 |
| 1.2 克隆形成实验检测AB4 对肝癌细胞的长期抑制效果 |
| 2 AB4 诱导肝癌细胞发生凋亡 |
| 2.1 Annexin V-FITC/PI染色检测肝癌细胞凋亡情况 |
| 2.2 Western Blot实验检测肝癌细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 第二部分 体内实验探究AB4对荷瘤裸鼠的抑制作用 |
| 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 细胞与实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 药物溶液的配制 |
| 2.2 实验动物饲养 |
| 2.3 荷瘤裸鼠模型的制备 |
| 2.4 随机分组与给药 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 AB4 给药后荷瘤裸鼠成瘤情况 |
| 2 AB4 给药后对荷瘤裸鼠肿瘤组织形态学的影响 |
| 3 AB4 给药后对荷瘤裸鼠肿瘤组织Ki67 表达的影响 |
| 讨论 |
| 第三部分 AB4 对肝癌的抑制作用与Notch通路的关系 |
| 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Western Blot实验 |
| 2.2 免疫组织化学实验(Immunohistochemistry) |
| 2.3 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 Western Blot实验检测肝癌细胞Notch通路相关蛋白的表达 |
| 2 Immunohistochemistry实验检测荷瘤裸鼠肿瘤组织Notch通路相关蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（6）PKHD1通过Notch信号通路对肝内胆管癌的抑癌效应及潜在分子机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 :PKHD1在胆管癌组织及癌旁正常组织的表达 |
| 1 试剂与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第二部分 :PKHD1对肝内胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭机制研究 |
| 1 试剂与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织来源及患者资料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要方法 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 HDAC6 mRNA在食管癌组织及癌旁组织中的表达水平 |
| 2.2 食管癌组织及癌旁组织中的HDAC6蛋白的表达水平 |
| 2.3 免疫组织化学检测结果 |
| 2.4 食管癌组织中HDAC6的表达水平与食管癌临床病理特征关系 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 靶向沉默HDAC6基因shRNA慢病毒载体的构建和制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 载体及细胞 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 1.6 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 干扰靶点设计结果 |
| 2.2 重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序鉴定 |
| 2.3 HDAC6 mRNA在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.4 HDAC6蛋白在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.5 慢病毒干扰后KYSE140和KYSE180细胞中HDAC6 mRNA和蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响 |
| 第一节 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体外实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.2 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞的迁移运动 |
| 2.3 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.4 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞迁移运动 |
| 2.5 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加α微管蛋白的乙酰化作用 |
| 2.6 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加HSP90的乙酰化作用 |
| 2.7 HSP90抑制剂和TubastatinA调节下游蛋白质的表达 |
| 2.8 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响 |
| 2.9 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞迁移的影响 |
| 2.10 HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白表达的影响 |
| 第二节 HDAC6siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体内实验研究 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 2.2 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HSP90相关性抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间参编的书籍 |
| 攻读博士学位期间获得奖项 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（8）3.0T MR弥散成像评价光动力治疗QBC939胆管癌荷瘤裸鼠疗效及病理相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 QBC939裸鼠胆管癌模型3.0TMR成像及ADC值与MVD、Ki67相关性探讨 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 制备人QBC939胆管癌细胞株荷瘤裸鼠模型 |
| 1.2.2 实验分组 |
| 1.2.3 3.0TMRI扫描 |
| 1.2.4 图像处理及ADC值计算 |
| 1.2.5 实验鼠病理学及免疫组化检查: |
| 1.2.6 Ki67蛋白表达的判定 |
| 1.3 统计学方法 |
| 结果 |
| 2.1 MRI扫描结果 |
| 2.2 DWI-MRI |
| 2.3 病理及免疫组化结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 MRI-DWI弥散加权成像评估光动力治QBC939裸鼠皮下移植瘤疗效评价的相关研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 结果 |
| 1. MRI影像学表现 |
| 2. 治疗前后肿瘤大小、ADC值与免疫组化结果的改变 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（10）慢病毒介导的RNA干扰沉默Tiam1基因对胆管癌生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英汉缩略名词对照表 |
| 前言 |
| 第一章 Tiam1在人胆管癌组织及细胞系中的表达及其意义 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 胆管癌组织中Tiam1蛋白的表达 |
| 2.2 胆管癌组织中Tiam1蛋白表达与胆管癌临床病理特征的关系(表1.2) |
| 2.3 胆管癌细胞中Tiam1 mRNA的表达水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二章 Tiam1基因RNA干扰慢病毒载体制备、包装与病毒滴度测定检测 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组慢病毒载体的构建和鉴定 |
| 2.2 RNAi慢病毒包装 |
| 2.3 目的细胞感染 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 RNAi靶向抑制Tiam1基因表达对胆管癌细胞的生物学影响 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 慢病毒载体转染RBE细胞的效率评估 |
| 2.2 各组RBE细胞中Tiam1 mRNA的表达 |
| 2.3 流式细胞术分析细胞周期分布 |
| 2.4 细胞的增殖能力噻唑蓝法(MTT)检测 |
| 2.5 Transwell检测细胞迁移能力 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 RNAi靶向抑制Tiam1基因表达对RBE细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 人胆管癌裸鼠皮下种植瘤模型的建立 |
| 2.2 裸鼠移植瘤生长情况及终点体积 |
| 2.3 裸鼠移植瘤Tiam1基因的表达水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
四、人胆管细胞癌荷瘤裸鼠模型的建立（论文参考文献）
- [1]MANF与原发性肝癌预后相关性及其与索拉非尼治疗敏感性的机制研究[D]. 贺竞毅. 山东大学, 2020(04)
- [2]Ⅰ.miR-194-5p在间充质干细胞微环境调控肺癌增殖的作用及机制研究 Ⅱ.功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的增殖[D]. 万令飞. 北京工业大学, 2020(06)
- [3]Thrombospondin-1对于肝内胆管癌接受吉西他滨化疗的增敏作用和机制研究[D]. 张家宁. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [4]Lnc-ATB通过miR-200c相关信号通路调控胆管癌增殖及转移的机制研究[D]. 林海. 苏州大学, 2020(06)
- [5]白头翁皂苷B4通过Notch通路对肝癌的抑制作用及其机制研究[D]. 薛淑一. 青岛大学, 2019(02)
- [6]PKHD1通过Notch信号通路对肝内胆管癌的抑癌效应及潜在分子机制研究[D]. 商天宇. 福建医科大学, 2019(07)
- [7]沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究[D]. 陶华. 苏州大学, 2019(08)
- [8]3.0T MR弥散成像评价光动力治疗QBC939胆管癌荷瘤裸鼠疗效及病理相关研究[D]. 张朝赫. 大连医科大学, 2017(01)
- [9]肝门部胆管癌神经浸润动物模型的建立[J]. 李振凯,张炳远,代冬冬,高源,张宪祥,胡继霖,卢云. 中国普外基础与临床杂志, 2013(05)
- [10]慢病毒介导的RNA干扰沉默Tiam1基因对胆管癌生物学行为的影响[D]. 成伟. 中南大学, 2012(03)