一、从单头灰飞虱中检测水稻黑条矮缩病毒简单快速的方法（论文文献综述）
田淑萍[1]（2021）在《灰飞虱N6-甲基腺嘌呤修饰在水稻黑条矮缩病毒复制中的功能研究》文中认为水稻黑条矮缩病是由呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）的水稻黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）侵染导致的一种病害。RBSDV由介体灰飞虱（Laodelphax striatellus）以持久增殖方式传播,具有间歇性暴发流行等特点。发病植株严重矮缩、不能抽穗,严重威胁水稻高产、稳产。由于抗病品种的缺乏,切断介体灰飞虱的传毒是控制病害发生最有效的措施。m6A甲基化（N6-methyladenosine,N6-腺嘌呤甲基化）修饰是一种在自然界中广泛存在的RNA甲基化修饰类型,由甲基转移酶、去甲基化酶、结合蛋白协同调控,参与多种生物学过程。据报道,m6A修饰也会对寄主体内病毒的生命活动产生影响,寄主本身的细胞代谢、免疫系统等受到m6A修饰的调控,同时病毒相关的RNA也会被甲基化修饰进而影响病毒的侵染、复制和扩散等过程。目前为止,m6A修饰对于介体昆虫及其传播病毒的影响暂无相关报道。本研究通过定量检测和免疫荧光标记等方法,发现灰飞虱获得RBSDV后m6A总体水平下降;利用MERIP-Seq技术分析了带毒与无毒灰飞虱转录组水平上m6A修饰的情况,发现带毒灰飞虱m RNA上的m6A位点总数少于不带毒灰飞虱,并且两组灰飞虱有686个甲基化差异位点,说明灰飞虱m6A修饰可能与RBSDV的生命活动相关。我们接着克隆了灰飞虱中编码甲基转移酶的两个基因Ls METTL3和Ls METTL14的全长编码区（coding sequence,CDS）,并进行了系统发育树构建、多序列比对等生物信息学分析,发现这两个基因在进化中非常保守,不同物种中的这两个基因具有较高的同源性。通过显微注射ds RNA进行RNA干扰（RNAi）,沉默灰飞虱Ls METTL3和Ls METTL14基因的表达（以注射ds GFP作为对照）,并通过RT-q PCR检测到其相对表达量分别下降了61-79%,且沉默效果可以持续9 d以上。进而利用m6A定量检测和免疫荧光标记技术检测干扰后的灰飞虱m6A水平,发现注射ds Ls METTL3+14导致灰飞虱m6A水平下降了21.12%,说明Ls METTL3和Ls METTL14的表达产物具有甲基转移酶的功能;对无毒与饲毒三天的灰飞虱分别进行RNAi以降低灰飞虱m6A水平,再利用RT-q PCR、western blot和免疫荧光标记等方法检测RBSDV的积累量。结果显示,与注射ds GFP的灰飞虱相比,注射了ds Ls METTL3+14的灰飞虱体内RBSDV积累量显着增高。综上所述,RBSDV的侵染会导致介体灰飞虱体内m RNA的m6A水平降低,沉默灰飞虱甲基转移酶基因Ls METTL3和Ls METTL14使灰飞虱m6A水平降低后,RBSDV的积累量则显着增加,说明m6A修饰可能对灰飞虱体内的RBSDV复制有负调控作用,但其调控机制还需要更深入的研究。
张天则[2]（2021）在《基于RNA-seq的水稻新病毒RCDaV的鉴定及水稻响应RBSDV侵染的lncRNA-mRNA调控网络研究》文中研究说明水稻是我国最重要的粮食作物,在农业生产中占有重要的地位。水稻病毒病长期以来严重威胁水稻生产。鉴定发现水稻新病毒,研究水稻寄主响应病毒侵染的防卫机制,对保障水稻安全生产具有重要意义。为此,本论文基于高通量测序技术在水稻中鉴定到一个全新的小RNA病毒（picornavirus）,并进一步分析了该新病毒蛋白酶的功能及其切割位点和病毒的进化关系;另一方面,分析了水稻黑条矮缩病毒侵染水稻内长非编码RNA（long non-codingRNA,lncRNA）的转录调控变化情况,研究了病毒侵染下水稻lncRNA-mRNA的调控网络,取得如下研究结果:1.水稻卷曲矮缩相关病毒的鉴定及其编码蛋白酶的功能通过RNA-seq和生物信息学分析,在表现矮化、卷曲症状的水稻植株中发现了一种全新的小RNA病毒,命名为水稻卷曲矮缩相关病毒（rice curl dwarf-associated virus,RCDaV）。RCDaV基因组为一条8,987 nucleotide（nt）的正单链RNA,其3’末端有poly（A）尾巴,基因组编码两个多聚蛋白。利用蛋白酶体外切割实验鉴定了RCDaV 3C蛋白酶（3Cpro）的顺式和反式切割活性,发现RCDaV的两个多聚蛋白经3Cpro的切割加工可产生12个成熟蛋白,并确定了3Cpro的顺式和反式切割位点。值得注意的是,我们发现RCDaV 3Cpro切割的氨基酸位点具有较高保守性,为EPT/S,这完全不同于之前报道其他小RNA病毒3Cpro以Q（E）/G（S）二肽作为切割位点。该发现揭示了RCDaV 3Cpro可能是一种新型的病毒编码的丝氨酸蛋白酶。系统进化树分析发现RCDaV和7个未分类的小RNA病毒在小RNA病毒目（Picornavirales）下聚成一个新支,且这些病毒均编码核心motif为Gx SG的、切割位点为保守的EPT/S的3Cpro蛋白酶。根据系统进化树分析结果、相似的基因组结构、与现有7个小RNA病毒科病毒较低的蛋白同源性、编码新的3C蛋白酶以及保守的EPT/S切割位点,我们建议在小RNA病毒目下建立新的病毒科并将RCDaV和这7个未分类小RNA病毒归于其中。2.水稻响应水稻黑条矮缩病毒侵染的lncRNA-mRNA调控网络植物基因组可以转录产生lncRNA,其中一些已被确定为基因表达的重要调控因子。为了更好地了解水稻植株对水稻黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf-associated virus,RBSDV）侵染的响应机制,解析RBSDV侵染后lncRNA-mRNA的调控网络,对感染RBSDV和健康水稻植株进行了转录组测序和转录本表达比较分析。结果显示水稻中共有1,342个mRNA和22个lncRNA在RBSDV侵染后存在差异表达,并依此进一步构建了差异表达的lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）与差异表达的mRNA（differentially expressed mRNA,DEmRNA）的关联网络。转录组结果发现,大部分参与植物-病原体互作途径的差异表达基因在RBSDV侵染后上调表达,表明RBSDV侵染激活了水稻的防御反应。其中,56个植物-病原体互作途径相关的DEmRNA与20个DElncRNA存在共表达关系,表明这些DElncRNA和DEmRNA在水稻响应RBSDV侵染的防卫反应中发挥重要作用。为了验证预测出的DElncRNA-DEmRNA的调控关系,本研究还建立了一种利用水稻愈伤组织快速有效地验证lncRNA-mRNA调控关系的新方法,并选取了3个DElncRNA和7个预测相关的DEmRNA作为研究对象。结果发现有4个DEmRNA受这3个DElncRNA调控,从而为揭示水稻与RBSDV的分子互作机制提供新的研究思路和手段。
李济同[3]（2020）在《水稻GLK突变体对水稻黑条矮缩病的抗性的探究》文中提出水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）,主要由灰飞虱以不经卵传播方式传播。该病毒可侵染水稻、玉米和小麦,在侵染水稻后,导致植株的严重矮缩,多分蘖,结实率低等症状,造成严重的经济损失。近年来,随着暖冬效应增强,病毒主要传播源灰飞虱密度不断增大,携带病毒率提高,水稻黑条矮缩病发病率出现上升趋势,并在全国范围水稻种植区域不断蔓延,给我国水稻生产造成了巨大威胁和经济损失。我们前期研究表明水稻品种（GLK突变体）对RBSDV有一定的抗性。但是GLK如何对RBSDV产生抗性不清楚。本论文主要围绕水稻GLK突变体在田间对RBSDV抗性的影响,GLK与RBSDV互作抗性相关基因的表达进行研究与探讨。主要结果如下:1)GLK与RBSDV的田间抗性检测通过人工接种的方法,探讨水稻GLK突变体对RBSDV抗性的影响。研究结果表明,在GLK过表达株系中,水稻对RBSDV的抗性有了显着提升;在GLK缺失突变株系中,水稻对RBSDV的抗性有明显下降。通过以上田间结果再次证实,GLK能够参与到水稻抗性机制中。2)GLK与RBSDV的互作通过酵母双杂交技术和luciferase体内验证等实验技术研究分析,研究了水稻候选抗性基因GLK与水稻黑条矮缩病RBSDV的互作特性。结果表明GLK并不直接与RBSDV的13个基因片段有互作效应,即GLK不与RBSDV互作,既然没有直接互作关系,但是否有间接的互作关系。本文再通过水稻同源基因RX1和GLK的互作验证,来证明GLK、RX1和水稻RBSDV的关系,通过应用上述验证方法,同样发现GLK、RX1和RBSDV没有直接或间接的互作关系。3)抗性基因的表达与检测为了进一步明确GLK诱导抗性的内在机制,基于水稻中转录因子GLK可以调控WEKY40的表达来应答脱落途径的机制。通过对不同品种的植株中JA途径,SA途径中表达的抗性基因和WRKY40进行了检测,确认GLK是否参与到抗病性中。采用荧光定量PCR实验方法,检测了在五类植株,野生型、过表达品种（GLK1）、东粳、单突变体品种（glk2）,双突变体品种（glkl,2）中JA途径,SA途径相关的抗性基因和WRKY40的表达,验证了在GLK的参与下,JA途径和SA途径的抗性基因和WRKY40的表达情况。结果显示,在GLK过量表达植株中,JA途径和SA途径中的相关抗性基因有明显的增加,提升抗病性。但WRKY40的表达量几乎不变。在GLK单突变体和双突变体植株中,相关的抗性基因表达量要减少。从而可以判定,GLK参与到了植株抗病性的过程中,对植株抗病性起了关键性作用。但深入系统的内在抗性机制有待进一步探究。
王亚琴,姜军,黄德青,周雪平,洪健,吴建祥[4]（2018）在《南方水稻黑条矮缩病毒dot-ELISA检测试剂盒的应用性能验证》文中研究说明以制备的抗南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）单抗2C2为核心,建立了检测水稻叶片和白背飞虱虫中SRBSDV的dot-ELISA试剂盒。试剂盒的灵敏度分析表明,当SRBSDV感染病叶稀释到1∶10 240倍（w/v,g/m L）、单头携毒白背飞虱稀释到1∶51 200倍（头/μL）时仍能检测到SRBSDV。建立的试剂盒检测感染SRBSDV的水稻和携毒白背飞虱呈阳性反应,而检测感染水稻黑条矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻瘤矮病毒、水稻条纹花叶病毒、水稻锯齿矮缩病毒的病叶和健康水稻及非携毒白背飞虱呈阴性反应。试剂盒的田间样品检测结果与RT-PCR方法的检测结果的符合率达到100%,核酸测序和序列比对结果发现RT-PCR检测阳性的样品确实感染SRBSDV。试验结果表明,建立的检测试剂盒能准确、有效地检测田间白背飞虱及水稻样品中的SRBSDV,可为我国南方水稻黑条矮缩病的检测和诊断、预测预警及科学防控提供技术服务。
赵冲[5]（2018）在《水稻黑条矮缩病毒P5-2蛋白水稻互作因子鉴定及功能初步研究》文中研究说明水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）,主要由灰飞虱以不经卵方式传播。该病毒可侵染水稻、玉米和小麦,在侵染水稻后,导致植株的严重矮缩、多分蘖、结实率低等症状,造成严重的经济损失。RBSDV基因组是由10条dsRNA片段组成,按照其在PAGE上的迁移率由快到慢依次称为S1-S10。其中S5基因组含有2个ORF,ORF1编码P5-1蛋白,ORF2编码P5-2蛋白。P5-2是一种非结构蛋白,目前有研究表明,在本氏烟中P5-2蛋白定位于叶绿体中,但其功能尚不明确。本论文为了探究RBSDVP5-2的致病作用机理,我们构建了 P5-2过量表达拟南芥。RBSDVP5-2蛋白在野生型拟南芥中表达导致植株的严重矮缩,这表明P5-2是病毒的重要致病因子。利用酵母双杂交技术筛选水稻（日本晴）cDNA文库中与P5-2互作的水稻因子,结果显示P5-2与多个寄主因子互作,通过同源序列对比,预测功能分析,发现在酵母内与P5-2互作的寄主因子包括ZFP（TFⅡIA型锌指转录因子）、BBTI5（Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂）、R3H（水稻功能未知蛋白）等。针对筛选出的水稻因子,通过酵母双杂交技术验证ZFP、BBTI5、R3H和P5-2蛋白在酵母内的互作。为了进一步验证P5-2与水稻因子在植物体内互作,我们构建一系列荧光标记或Luc（luciferase）植物表达载体。通过浸润本氏烟,荧光素酶互补实验（Split-luciferase）验证P5-2与水稻转录因子ZFP、蛋白酶抑制剂BBTI5、RNA结合蛋白R3H在植物细胞内存在互作;用激光共聚焦显微镜观察P5-2蛋白与互作因子的亚细胞定位（Co-localization）,发现RBSDV P5-2在细胞核中与水稻转录因子ZFP互作,在细胞质与蛋白酶抑制剂BBTI5互作,在细胞质和细胞核中与R3H互作。为了进一步分析以上P5-2互作水稻因子在抗病毒中的作用,本研究利用CRISPR-cas9基因编辑技术构建P5-2互作因子突变体水稻。通过农杆菌介导的转化方法获取水稻T0代突变体植株,对水稻ZFP、BBTI5、R3H CRISPR-cas9敲除突变体植株进行分子检测,结合靶标序列测序结果,我们获得ZFP、BBTI5、R3H敲除T0代纯和突变体植株。用带RBSDV灰飞虱接种ZFP、BBTI5突变体植株,qRT-PCR定量分析病毒含量,结果表明,ZFP、BBTI5 CRISPR-cas9 T1代突变体植株与野生型植株相比,病毒含量和发病率明显较低,这些结果表明病毒P5-2水稻互作因子ZFP、BBTI5在水稻抗病毒中起着重要的作用。另外,本研究需要用到受水稻黑条矮缩病毒的水稻病株,因此为了快速检测植物中是否携带病毒以此来加快实验进程,本研究建立了重组聚合酶扩增技术（RPA）,并且通过对反应最适温度等条件的探索,表明37℃的温度反应20 min后即可观察到明显的检测结果,证明了 RPA检测RBSDV的方法更加简便、快速、高效,适合用于田间和实验室检测水稻RBSDV。本论文研究结果可为解析RBSDVP5-2与水稻寄主因子ZFP、BBTI5的互作机制、病毒的致病机理等研究提供理论基础。
周长伟[6]（2018）在《灰飞虱对水稻病毒病（RSV/RBSDV）植株选择性分析及机制初探》文中指出由水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）引起的水稻条纹叶枯病以及由水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）引起的黑条矮缩病给我国的水稻产量造成了巨大的损失。这两种病毒均由介体灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）以持久方式传播,不同的是,RSV可以由灰飞虱经卵传播给后代,而RBSDV则不能经卵传播。目前,灰飞虱对水稻条纹叶枯病株和黑条矮缩病株的选择偏好性尚不清楚。研究灰飞虱对条纹叶枯病植株和黑条矮缩病植株的选择偏好性,对于解析由灰飞虱介导的两种病害的流行规律具有重要意义。本文首先通过灰飞虱无毒成虫、若虫以及带毒成虫、若虫对两种病毒的水稻病株和健株的选择趋向性实验,统计分析灰飞虱的选择偏好性。然后分析对灰飞虱嗅觉相关基因表达丰度,筛选带毒（RSV）和无毒昆虫体内的表达差异基因,并对嗅觉受体辅助受体Orco进行了基因克隆和功能分析。这些研究为进一步解释灰飞虱选择趋向水稻病/健植株机理奠定了基础。1、RSV带毒与无毒灰飞虱对水稻病/健植株选择性分析将饥饿处理后的灰飞虱（带毒和无毒）成虫和若虫分别放入“Y”型昆虫嗅觉仪入口,让昆虫进行避光选择,对灰飞虱的选择进行统计。结果显示,带毒灰飞虱若虫显着趋向健康植株,而无毒灰飞虱若虫显着趋向感染RSV的水稻植株;带毒成虫显着趋向健康植株,而无毒成虫对水稻病/健植株趋向性无显着差异。2、RBSDV带毒与无毒灰飞虱对水稻病/健植株选择性分析创制了灰飞虱病株（RBSDV）产卵法获得低龄带毒若虫:将无毒灰飞虱成虫（雌雄配对）放入含有RBSDV病株的大烧杯中,让其在病株上产卵。结果显示,灰飞虱可以在RBSDV病株上正常产卵,卵亦可正常孵出,若虫孵出后即可取食病株,与常规病株饲毒方法相比,病株产卵法使灰飞虱若虫最早在二龄即可带毒,且不影响灰飞虱带毒率,此法获得的低龄带毒若虫可以用于分析RBSDV带毒若虫对病/健水稻的选择性。以饥饿处理的带毒（RBSDV）和无毒灰飞虱若虫进行病/健植株选择性分析,结果显示,带毒若虫对水稻RBSDV病/健植株趋向性无显着差异,无毒若虫同样如此。3、灰飞虱嗅觉受体辅助受体Orco的克隆与表达分析以荧光定量PCR分析带毒（RSV）和无毒灰飞虱体内嗅觉相关基因表达丰度,结果显示,嗅觉受体辅助受体Orco、气味结合蛋白OBP5和OBP8、化学感受蛋白CSP3在带毒和无毒昆虫体内表达差异较大,可能参与了灰飞虱对病/健植株的识别。接下来,本论文对灰飞虱Orco（LstrOrco）展开了研究。通过RACE-PCR扩增获得LstrOrco全长基因,其ORF共1437 bp,编码478个氨基酸,整个蛋白共含有7个跨膜区。序列比对显示,不同昆虫目之间的Orco序列高度保守,其C端序列尤其保守。表达特性分析显示,LstrOrco主要在灰飞虱头部表达,若虫和雄虫体内的表达量显着高于雌虫,并且LstrOrco的表达可受到RSV侵染的显着刺激;此外,LstrOrco的表达还受到温度的影响,高温和低温均抑制其表达,这可能与高、低温环境下灰飞虱的滞育相适应。4、灰飞虱Orco的功能分析通过饲喂方法对LstrOrco进行RNAi,将RNAi处理的灰飞虱放入“H”型昆虫嗅觉仪入口,对灰飞虱的趋向性和反应时间进行统计。结果显示,通过饲喂dsRNA成功实现对LstrOrco的表达沉默,抑制LstrOrco后,灰飞虱对水稻植株的主要表现为“无应答”,其“不反应率”与对照处理组相比显着升高;统计各处理组中“应答”昆虫的响应时间,发现LstrOrco的表达抑制后灰飞虱的响应时间显着延长。同时以“Y”型昆虫嗅觉仪分析各处理组昆虫对病/健植株的趋向性,结果显示,LstrOrco的表达抑制后,灰飞虱对RSV病/健水稻植株的趋向性差异不显着。这些结果表明,LstrOrco在灰飞虱嗅觉信号传导和探寻行为方面发挥了重要作用,本研究为未来发展以嗅觉信号为基础的农业害虫管理策略的提供了基础。
陈彪[7]（2018）在《华南地区RSMV的分布及其对介体叶蝉生命参数的影响》文中提出水稻条纹花叶病毒（Rice stripe mosaic virus,RSMV）是弹状病毒科（Rhabdoviridea）细胞质弹状病毒属（Cytorhabdovirus）的暂定新种,2015年由作者所在研究室首次发现于我国广东省罗定地区。该病毒由电光叶蝉以持久增殖型方式传播,引发的水稻条纹花叶病对我国水稻的生产构成潜在威胁。由于RSMV是一种新发现的水稻病毒,其流行规律及分布区域尚未清楚。本研究建立了RSMV的分子检测方法,对华南地区进行了广泛的田间调查,并探索了病毒对电光叶蝉生命参数的影响。主要研究结果如下:1、建立了同步检测水稻条纹花叶病毒和水稻瘤矮病毒的双重RT-PCR检测方法。由于RSMV和水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus,RGDV）感染水稻后所引起的早期症状较为相似,且均可由电光叶蝉传播,本研究建立了一种可同时检测两种病毒的双重RT-PCR的方法,可实现媒介昆虫带毒率的快速检测及水稻早期病株的快速诊断。该检测方法可从单头电光叶蝉或相当于0.001mg的病叶样品的总RNA提取物中检测出RSMV和RGDV。2、初步明确了RSMV在我国华南地区的分布及发生情况。2017年和2018年,连续两年对华南地区早稻、晚稻水稻条纹花叶病发生情况进行了田间调查,结果表明该病的发生区域广泛。在广东的西南部、广西的东部和海南中部均可见病株,其中广东西南部部分地区发病较重。其中广东省罗定市田间水稻病株多为RSMV和RGDV复合侵染,复合侵染率为80.88%（165/204）。3、对部分病区田间叶蝉带毒率进行了系统检测。结果表明,病区电光叶蝉高比例同时携带RSMV和RGDV两种病毒。其中,太平镇2017-2018年越冬期RSMV带毒率为63.33%100%,RGDV带毒率23.33%90.00%。罗平镇2017-2018年越冬期RSMV带毒率43.33%100%,RGDV带毒率26.78%73.33%。罗镜镇2017-2018年越冬期RSMV带毒率46.78%90.00%,RGDV带毒率6.78%66.78%。与此同时,病区普遍发生的黑尾叶蝉也具有较高的带毒率（平均44.77%）,但室内传毒试验未能证实其传毒能力。4、初步揭示RSMV对介体电光叶蝉生长发育具有不利影响,但对其繁殖能力具有刺激作用。与无毒叶蝉相比,25℃条件下,带毒电光叶蝉若虫发育历期延长0.97天,成虫寿命缩短3.8天,产生子代叶蝉的数量有所增加（约增加47.41%）,但带毒子代种群中雌雄虫比例无明显变化。以上研究结果为深入揭示水稻条纹花叶病的发生规律提供了基础资料,并为制定该病害的预测及防控对策提供依据。
吴建祥,饶黎霞,陈浙,傅帅,周雪平[8]（2017）在《检测南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条的建立》文中研究指明由白背飞虱Sogatella furcifera（Horváth）传播的南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice blackstreaked dwarf virus,SRBSDV）是目前我国南方水稻上危害最严重的病毒,为开发简便、快速、准确的SRBSDV病毒检测技术和检测试剂,以感染SRBSDV的植物粗提液为免疫原,利用杂交瘤技术制备了2株抗SRBSDV的单抗（14A8和15G6）,并利用制备的单抗建立了可快速、特异、灵敏地检测SRBSDV的胶体金免疫试纸条。结果表明,2株制备单抗的抗体类型及亚类均为Ig G1、kappa链,单抗腹水的间接ELISA效价均达到10-7;Western blot分析表明,2株单抗均与SRBSDV的外壳蛋白亚基有特异反应,而不与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）反应。以制备14A8和15G6单抗分别为捕获抗体和胶体金标记抗体,开发成能在5 min内准确、特异地检测水稻植物和白背飞虱传毒介体体内SRBSDV的胶体金免疫试纸条;灵敏度分析表明,该检测试纸条的检测水稻病叶的灵敏度达到1∶6 400倍（g/m L）,检测单头携毒白背飞虱的灵敏度达到1∶51 200倍（单头/μL）。田间样品检测结果表明,该试纸条的检测结果与RT-PCR的符合率达到100%。建立的SRBSDV胶体金免疫试纸条可对南方水稻黑条矮缩病毒进行快速、特异、灵敏的诊断和检测。
孙志广[9]（2017）在《水稻品种9194抗灰飞虱及其传播黑条矮缩病基因的定位》文中认为灰飞虱（Laodelphax striatellxs Fallen）是水稻生产的主要害虫之一,广泛分布于亚洲水稻种植区,不仅能够直接刺吸造成危害,还是水稻条纹叶枯病（Rice stripe virus disease,RSVD）和水稻黑条矮缩病（Rice black-streaked dwarf virus disease,RBSDVD）等病毒病的传播介体,对水稻生产造成严重危害。近年来,尤其是在长江中下游及华北稻区,伴随着灰飞虱大发生,RBSDVD已成为该地区的主要水稻病毒病害。水稻一旦带毒,很难治愈,被称为水稻“癌症”。“切断毒链,治虫控病”是目前防治水稻黑条矮缩病的主要策略。当前对灰飞虱的防治主要是依赖化学农药,然而由于灰飞虱迁飞性强,兼之种群数量大,且传毒瞬时,导致防虫治病的效果并不十分理想,而且农药的过度使用不但增加了生产成本、污染环境、杀伤天敌,还促使灰飞虱抗药性增强。因此,在筛选抗性资源和发掘抗性基因的基础上,培育并利用抗性品种被认为是防治灰飞虱及其传播病害最经济有效的策略。然而,由于RBSDVD由灰飞虱以持久性不经卵方式传播,其抗性鉴定复杂,难度大,导致相关研究严重滞后。因此,抗灰飞虱及其传播水稻黑条矮缩病基因的发掘,对加速培育抗灰飞虱及水稻黑条矮缩病新品种具有重要的理论和实践意义。经多年多点的重病区自然鉴定和人工接种鉴定,本研究筛选到一个高抗RBSDVD的水稻品种9194,分析发现该品种还兼抗传毒介体灰飞虱。利用9194与高感水稻黑条矮缩病和灰飞虱的粳稻品种苏御糯（SYN）构建F2:3群体,进行抗灰飞虱及RBSDVD的遗传分析和基因定位。进一步构建BC2F2:3群体,利用该群体完成了 一个抗RBSDVD主效QTLqRBSDV11的精细定位。主要研究内容如下:1.水稻品种9194抗黑条矮缩病的遗传分析及基因定位（1）本研究自2010-2016年（2014年除外）连续6年,在江苏省连云港市和河南省开封市等黑条矮缩病重发区,进行抗黑条矮缩病水稻资源的筛选与鉴定。其中一籼稻品种9194,在多年多点的鉴定中发病率均小于5%,表现稳定高抗水稻黑条矮缩病。而另一粳稻品种苏御糯平均发病率大于75%,高感水稻黑条矮缩病。与田间鉴定结果相一致,经人工接种鉴定,进一步验证了 9194稳定高抗水稻黑条矮缩病,苏御糯为一个高感黑条矮缩病的水稻品种。因此9194和苏御糯可作为理想的配组亲本进行水稻黑条矮缩病的研究工作。（2）为发掘9194携带的抗水稻黑条矮缩病QTL,本研究利用9194和苏御糯构建F2:3分离群体,对796个株系在重病区进行自然接种鉴定,选取表型鉴定重复性较好的212个家系,进行抗黑条矮缩病的遗传分析。212个家系的黑条矮缩病抗性呈正态分布,表明该性状由多个数量性状位点（QTL）控制。利用Windows QTL Cartographer 2.5进行水稻黑条矮缩病抗性基因的分析,共检测到4个QTLs,即qRBSDV3、qRBSDV6、qRBSDV9和qRBSDV11,分别位于第3、6、9和11染色体上,LOD值分别为2.34、4.42、7.26和7.16,贡献率分别为5.4%,10.3%,35.5%和31.1%,共解释表型变异的82.3%。且四个QTLs位点抗性等位基因均来自抗病亲本9194。其中,qRBSDV9和qRBSDV11的贡献率均超过了 30%,为两个抗RBSDVD的主效QTLs。进一步以感病亲本苏御糯为轮回亲本,针对qRBSDV6、qRBSDV9和qRBSDV11,构建回交群体,从BC3F2中筛选获得携带单个、两个和三个QTLs的单株,并对各单株后代进行黑条矮缩病抗性鉴定,结果表明三个位点的黑条矮缩病的抗性存在累加作用。（3）本研究针对qRBSDV11位点,构建了一个包含94个家系的BC2F2:3次级分离群体,表型鉴定并结合QTL分析,验证了 9194中的qRBSDV11位点是稳定表达的。并进一步利用9194/苏御糯BC2F2:3、BC3F2:3和BC4F2:3群体共10,911个株系,最终将qRBSDV11精细定位于2个Indel标记HTA11-71和HTA11-83之间约163 kb的物理区间。该区间共包含20个ORFs,通过测序比对发现3个基因在亲本间存在氨基酸序列上的差异,暂时将其列为候选基因。qRBSDV11的精细定位为该基因的图位克隆奠定了基础。2.9194抗灰飞虱的遗传分析和QTL定位9194不仅高抗RBSDVD,且兼抗介体灰飞虱。进一步通过排趋性和抗生性测验,表明9194对灰飞虱的抗性主要是由排趋性引起的。为发掘9194携带的抗灰飞虱QTLs,分析9194抗RBSDVD和介体灰飞虱之间的关系,本研究完成了 104个9194/苏御糯的F2:3家系的灰飞虱抗性鉴定,发现该群体表型频率直方图呈现非典型的双峰分布,表明该性状可能由多个数量性状位点（QTL）控制。进一步利用WindowsQTL Cartographer 2.5进行灰飞虱抗性基因的分析,共检测到4个QTLs,命名为qSBPH1、qSBPH5、qSBPH8和qSBPH9,分别位于第1、5、8和9染色体上,LOD值分别为2.72、2.78、2.15 和 2.85,贡献率分别为 13.7%、11.0%、12.0%和 21.0%,共解释表型变异的57.7%。遗传分析表明这四个QTLs位点增强抗性的等位基因均来自高抗亲本9194。其中,qSBPH9的贡献率超过了 20%,表明其是一个抗灰飞虱主效QTL。通过与之前检测的抗RBSDVD QTLs位点的比较分析,qSBP,H9与qRBSDV9的定位在相同的染色体区间,表明该位点可能兼抗灰飞虱和水稻黑条矮缩病。本研究发掘定位的水稻抗灰飞虱和黑条矮缩病QTLs,为利用分子育种技术培育抗灰飞虱和黑条矮缩病水稻品种,提供了技术支撑。同时也为抗灰飞虱和水稻黑条矮缩病基因的图位克隆及抗性分子机制的阐明奠定了基础。
孙林[10]（2016）在《基于miRNA和siRNA策略抗水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的研究》文中研究指明水稻是我国重要的粮食作物之一,种植面积约占粮食播种总面积的30%,产量接近粮食总产量的44%。稻米品质好,价值高,是我国主要的商品粮食,亦是发酵工业的重要原料。水稻病害是限制水稻进一步提高产量和品质的主要瓶颈之一。水稻条纹叶枯病（Rice stirp disease）和水稻黑条矮缩病（Rice black-streaked dwarf disease）是在水稻生产中普遍发生的、危害严重的病毒病害。发病严重时,感病植株死亡,最终导致水稻产量明显降低,甚至绝产;即使存活到成熟,也表现为生长严重受阻,对水稻生产造成严重损失;并且两种病毒病均是由灰飞虱持久性传播的,在田间,这两种病害可以同时发生,加重发病症状,对水稻生产造成更加严重的危害。RNA沉默（RNA silencing）是一种广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核生物中,由双链RNA（double strand RNA,dsRNA）引发的,通过序列特异性的相互作用来抑制基因表达的现象,被认为是真核生物阻止病毒、转座子等外来核酸的入侵,维持生物基因组稳定性的重要防御机制。其中,小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）和微小RNA（microRNA,miRNA）是沉默RNA的最主要组成部分。利用RNA干扰技术培育抗病毒的转基因植物是目前常用的一种抗病毒基因工程策略,通常称为RNA介导的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance,RMVR）。其中,利用人工合成microRNA（artificial miRNA,amiRNA）的RNA介导病毒抗性策略培育抗病毒转基因植物取得了很大进展,具有抗性表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特点,被认为是一种具有较大应用价值的植物抗病毒基因工程策略。此外,随着对RNA介导的病毒抗性的不断研究,利用RNAi策略防治病毒病已经不止局限于培育获得高病毒抗性的转基因植物。目前,有研究表明,给传毒昆虫介体饲喂dsRNA,可以使昆虫介体失去传毒能力。这种防控病毒病的方法主要是切断植物病毒的传播途径,不需要产生转基因植物就可以达到防治病毒的目的,更加具有生物安全性。本研究以水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）为实验材料,利用嵌合人工miRNA策略,培育获得了具有较高抗病水平且能够稳定遗传的双抗RSV和RBSDV转基因水稻新材料;以灰飞虱和RSV为实验材料,利用RNA沉默技术,对可能参与昆虫介体传播病毒的相关蛋白进行了功能验证,在此基础上,利用RNAi对昆虫体内的传毒相关蛋白进行基因沉默,阻断昆虫对病毒的传播,减轻病毒对作物的危害。双抗病毒转基因水稻新材料的获得,为我们进一步将现代生物技术与传统育种技术相结合培育抗病毒水稻新品种奠定了基础;介体传毒相关蛋白的鉴定,为我们进一步高效地利用rna沉默技术控制病毒病的危害提供重要依据。主要研究结果和结论如下:（1）基于amirna策略培育双抗rsv和rbsdv转基因水稻新材料基于amirna抗病毒策略,选取水稻内源的osa-mir528作为前体,利用wmd网站设计靶向于rsv及rbsdv的cp基因及其3′-utr区上的有效amirna;然后选择了分别靶向于rsv和rbsdv的cp基因中间片段、3′端、3′-utr区域的3个amirna（分别命名为amir-rsvm,amir-rsv3,amir-rsvu和amir-rbsdvm,amir-rbsdv3,amir-rbsdvu）。利用重叠pcr（overlappcr）将其替换掉osa-mir528自身的mirna有效片段;然后嵌合连入改造好的pcambia1300表达载体,获得了能同时靶向于rsv和rbsdv的3个amirna前体二聚体植物表达载体（pamir-m,pamir-3和pamir-u）。将构建好的3个植物表达载体导入农杆菌eha105,瞬时侵染本生烟验证其有效性,3d后amirna的northern分析结果表明,构建好的amirna植物表达载体在侵染的本生烟体内能有效地表达,产生成熟的amirna,并下调靶基因的表达。5′-rlm-race实验表明,amirna能精确介导靶基因序列的剪切。通过农杆菌介导的基因转化方法转化临稻10愈伤组织,经除草剂ppt筛选和pcr检测,分别获得含有pamir-m,pamir-3和pamir-u的t0代转基因植株为35株、37株、48株;转基因植株内,各类改造后的pre-amirna均能被识别,并表达产生成熟的amirna。t0代转基因植株经过连续自交,结合除草剂抗性检测和pcr鉴定,获得t2代植株。t2代转基因植株病毒抗性鉴定结果显示,各转基因株系都表现出了对rsv和rbsdv的不同程度的抗性,包含pamir-m,pamir-3和pamir-u的转基因株系对rsv的抗病率分别为29.52%,44.14%和54.17%;对rbsdv的抗病率分别为26.66%,36.04%和45.83%。对获得的转基因植株进行southern和northern杂交分析,结果表明,外源基因以不同的拷贝数整合到了水稻基因组中。在转基因植株中靶病毒rna的下调是由初级的amirna介导所诱发的,并且沉默可以通过sirna途径向双边延长,初级的amirna和次级的sirna共同介导转基因植株对病毒的抗性。遗传稳定性分析表明转基因和其介导的病毒抗性能在转基因植株中稳定遗传。（2）介体传毒相关蛋白的鉴定及干扰基因的表达对介体传毒的影响以已报道的灰飞虱体内与RSV互作的蛋白基因NCuP作为候选基因,设计引物,利用RT-PCR克隆得到目的基因。利用qRT-PCR技术,研究灰飞虱NCuP在介体的不同发育阶段的表达特性,发现其在灰飞虱的整个发育过程中均有表达,但不同发育时期的表达是存在差异的,1龄若虫的NCuP表达量最高,随着昆虫的生长其表达量逐渐降低。qRT-PCR检测RSV的侵染对不同龄期灰飞虱NCuP表达的影响,结果显示,带毒灰飞虱体内的NCuP的表达水平明显高于无毒灰飞虱体内的NCuP的表达水平,初步表明NCuP可能参与了RSV在介体内的繁殖传播。体外合成NCuP的dsRNA,饲喂带RSV的灰飞虱,利用qRT-PCR检测靶基因及病毒基因在昆虫体内的表达情况,结果显示,饲喂dsNCuP的灰飞虱体内NCuP的表达水平和RSV的积累水平均有显着降低,推测NCuP可能参与了RSV在介体内的繁殖。对饲喂dsNCuP的灰飞虱进行获毒率和传毒率的检测发现,对照组的获毒率和传毒率分别为41.44%和68.33%,而饲喂dsNCuP的灰飞虱的获毒率和传毒率分别为28.89%和23.89%。表明,干扰灰飞虱体内的NCuP的表达可以显着降低灰飞虱的获毒率和传毒率。
二、从单头灰飞虱中检测水稻黑条矮缩病毒简单快速的方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、从单头灰飞虱中检测水稻黑条矮缩病毒简单快速的方法（论文提纲范文）
（1）灰飞虱N6-甲基腺嘌呤修饰在水稻黑条矮缩病毒复制中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 水稻黑条矮缩病毒研究进展 |
| 1.1.1 水稻黑条矮缩病的危害与症状 |
| 1.1.2 水稻黑条矮缩病毒粒子特点及复制包装 |
| 1.2 水稻黑条矮缩病毒传播介体灰飞虱 |
| 1.2.1 灰飞虱生物学特征 |
| 1.2.2 灰飞虱为害特点 |
| 1.2.3 灰飞虱传毒特性 |
| 1.2.4 RBSDV在灰飞虱体内的侵染循回及其调控 |
| 1.3 m~6A RNA甲基化 |
| 1.3.1 RNA甲基化概述 |
| 1.3.2 m~6A甲基化概述 |
| 1.3.3 m~6A甲基转移酶 |
| 1.3.4 m~6A甲基化生物学功能 |
| 1.4 m~6A高通量测序技术 |
| 1.5 目的与意义 |
| 第二章 RBSDV获取对灰飞虱体内m~6A甲基化的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 RBSDV毒源的扩繁 |
| 2.1.3 带毒与不带毒灰飞虱体内m~6A水平检测 |
| 2.1.4 MeRIP-seq技术分析带毒与不带毒灰飞虱m~6A差异 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 RBSDV毒源的扩繁 |
| 2.2.2 带毒与不带毒灰飞虱体内m~6A水平对比 |
| 2.2.3 MeRIP-seq技术分析带毒与不带毒灰飞虱m~6A差异 |
| 2.3 本章小结及讨论 |
| 第三章 Ls METTL3、Ls METTL14 序列扩增及分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 灰飞虱METTL3、METTL14 同源基因序列的挖掘 |
| 3.1.2 Ls METTL3、Ls METTL14 序列克隆 |
| 3.1.3 LsMETTL3、LsMETTL14序列结构特征分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Ls METTL3、Ls METTL14 完整CDS序列 |
| 3.2.2 LsMETTL3、LsMETTL14序列结构特征分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 灰飞虱m~6A水平的改变对其体内RBSDV的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 ds RNA合成 |
| 4.1.2 显微注射无毒灰飞虱 |
| 4.1.3 实时荧光定量PCR |
| 4.1.4 显微注射饲毒三天后的灰飞虱 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 dsRNA合成 |
| 4.2.2 干扰效果检测 |
| 4.2.3 RNA干扰后灰飞虱m~6A水平变化 |
| 4.2.4 RNA干扰对灰飞虱体内RBSDV的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 全文总结及讨论 |
| 5.1 实验结果总结 |
| 5.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）基于RNA-seq的水稻新病毒RCDaV的鉴定及水稻响应RBSDV侵染的lncRNA-mRNA调控网络研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 高通量测序在植物病毒研究中的应用 |
| 1.1.1 高通量测序简述 |
| 1.1.2 利用NGS技术发现新病毒 |
| 1.1.3 利用基于NGS的转录组测序研究寄主响应病毒侵染 |
| 1.1.4 长非编码RNA在植物中功能简述 |
| 1.2 小RNA病毒目简介 |
| 1.2.1 小RNA病毒目病毒的分类及其基因组特征 |
| 1.2.2 正链RNA病毒编码的蛋白酶 |
| 1.2.3 小RNA病毒目病毒编码的蛋白酶 |
| 1.3 水稻黑条矮缩病毒研究进展 |
| 1.3.1 水稻黑条矮缩病的危害与症状 |
| 1.3.2 水稻黑条矮缩病毒粒子形态 |
| 1.3.3 水稻黑条矮缩病毒基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.2.2RNA反转录 |
| 2.2.3 高保真PCR |
| 2.2.4 PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.5 限制性内切酶消化 |
| 2.2.6 同源重组载体构建 |
| 2.2.7 3’和5’RACE |
| 2.2.8 RT-qPCR |
| 2.2.9 聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳 |
| 2.2.10 Western blot |
| 3 水稻卷曲矮缩相关病毒的鉴定及其编码蛋白酶的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 高通量测序及序列拼接 |
| 3.1.2.2 位点定向突变 |
| 3.1.2.3 体外蛋白酶切割实验 |
| 3.1.2.4 蛋白原核表达纯化与蛋白N端测序 |
| 3.1.2.5 生物信息学分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 一种新的水稻小RNA病毒的鉴定 |
| 3.2.2 新病毒的基因组特征 |
| 3.2.3 RCDaV 3Cpro的顺式切割活性 |
| 3.2.3.1 RCDaV 3Cpro具有体外顺式切割活性 |
| 3.2.3.2 RCDaV 3Cpro催化三联体的鉴定 |
| 3.2.3.3 N端测序确定RCDaV 3Cpro顺式切割位点 |
| 3.2.3.4 无细胞蛋白表达系统验证RCDaV 3Cpro顺式切割位点 |
| 3.2.4 RCDaV3Cpro的反式切割活性 |
| 3.2.5 RCDaV编码的多聚蛋白上各蛋白切割位点的鉴定 |
| 3.2.5.1 P1区域的各蛋白切割位点鉴定 |
| 3.2.5.2 P2区域的各蛋白切割位点鉴定 |
| 3.2.5.3 P3区域的各蛋白切割位点鉴定 |
| 3.2.6 RCDaV 3Cpro切割位点保守性分析 |
| 3.2.7 RCDaV与小RNA病毒目下其他病毒的系统发育关系 |
| 3.2.8 新建立的科中有相同的蛋白酶切割模式 |
| 3.2.9 MaPV和 ApGIV1切割位点验证 |
| 3.3 讨论 |
| 4 水稻响应RBSDV侵染的lncRNA-mRNA调控网络研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 水稻培养及RBSDV病毒接种 |
| 4.1.2.2 转录组测序及组装 |
| 4.1.2.3 lncRNA的鉴定 |
| 4.1.2.4 mRNA与lncRNA差异表达分析 |
| 4.1.2.5 GO注释与KEGG富集 |
| 4.1.2.6 DElncRNA靶向mRNA的预测 |
| 4.1.2.7 lncRNA-mRNA调控网络的构建 |
| 4.1.2.8 水稻愈伤组织的诱导及农杆菌侵染 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转录组测序结果 |
| 4.2.2 RBSDV侵染后水稻差异表达的mRNA和lncRNA |
| 4.2.3 DEmRNA的功能特征 |
| 4.2.4 DElncRNA调控基因的功能分析 |
| 4.2.5 DElncRNA-DEmRNA的共表达网络 |
| 4.2.6 DEmRNA和DElncRNA转录组表达模式的RT-qPCR验证 |
| 4.2.7 lncRNA对mRNA反式调控关系验证 |
| 4.3 讨论 |
| 5 全文总结、创新点与展望 |
| 附文Ⅰ RBSDV外壳蛋白与灰飞虱卵黄原蛋白及受体的分子互作 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 卵黄原蛋白及受体 |
| 1.1.2 病毒利用Vg或者Vg R突破卵巢屏障 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.1.1 植物材料、飞虱 |
| 1.2.1.2 质粒、菌株、试剂及抗体 |
| 1.2.2 激光共聚焦显微镜观察昆虫卵巢组织 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 Ls Vg、Ls Vg R序列特征 |
| 1.3.2 RBSDV CP与 LsVg、LsVgR间的互作 |
| 1.3.3 RBSDV CP与 LsVg、LsVgR在灰飞虱卵巢组织共定位 |
| 1.3.4 RBSDV CP与 RSV CP在灰飞虱未孵育虫卵中的定位 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 本文所用引物列表 |
| 附录Ⅱ RCDaV基因组全序列 |
| 附录Ⅲ 进化树中所用到的病毒 |
| 附录Ⅳ 常见专业名词中英文对照及缩写 |
| 附录Ⅴ 常用缓冲液和培养基配方 |
（3）水稻GLK突变体对水稻黑条矮缩病的抗性的探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 水稻黑条矮缩病毒研究进展 |
| 1.1.1. 水稻黑条矮缩病的发生与危害 |
| 1.1.2. 水稻黑条矮缩病毒的研究 |
| 1.1.3. RBSDV的传播介体 |
| 1.1.4. RBSDV的检测方法 |
| 1.2 GLK的研究进展 |
| 1.2.1. 转录因子GLK |
| 1.2.2. GLK的功能研究 |
| 1.3 GLK对各抗性基因表达途径中抗性基因的研究 |
| 1.3.1. GLK参与调控WRKY40对ABA的应答 |
| 1.3.2. GLK对JA及SA途径相关抗性基因的研究 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 GLK突变体对RBSDV的田间抗病性检测 |
| 2.1. 引言 |
| 2.2. 材料与方法 |
| 2.2.1. 材料 |
| 2.2.2. 方法 |
| 2.3. 结果与分析 |
| 2.4. 小结与讨论 |
| 第三章 GLK与RBSDV的互作验证 |
| 3.1. 引言 |
| 3.2. 材料与方法 |
| 3.2.1. 材料 |
| 3.2.2. 酵母菌株与质粒 |
| 3.2.3. 方法 |
| 3.3. 结果与分析 |
| 3.3.1. RBSDV各片段扩增 |
| 3.3.2. RBSDV各片段与GLK载体的构建 |
| 3.3.3. GLK与RBSDV各片段的互作 |
| 3.3.4. 水稻RX1同源基因与GLK和RBSDV各基因片段的互作 |
| 3.4. 小结与讨论 |
| 第四章 GLK对JA和SA途径以及WRKY40等抗性基因的影响 |
| 4.1. 引言 |
| 4.2. 材料与方法 |
| 4.2.1. 使用仪器 |
| 4.2.2. 方法 |
| 4.2.3. 数据处理 |
| 4.3. 结果分析 |
| 4.3.1. SA途径中NPR1的表达情况 |
| 4.3.2. SA途径中EDS1的表达情况 |
| 4.3.3. SA途径中ICS1的表达情况 |
| 4.3.4. JA途径中COI1的表达情况 |
| 4.3.5. JA途径中AOS1的表达情况 |
| 4.3.6. WRKY40对GLK的响应 |
| 4.4. 小结与讨论 |
| 附录A |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）南方水稻黑条矮缩病毒dot-ELISA检测试剂盒的应用性能验证（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒资源和传毒介体及单克隆抗体 |
| 1.2 dot-ELISA检测试剂盒的成分和操作步骤 |
| 1.2.1 检测水稻叶片中SRBSDV |
| 1.2.2 检测白背飞虱体内SRBSDV |
| 1.3 dot-ELISA检测试剂盒的性能测定 |
| 1.3.1 特异性分析 |
| 1.3.2 灵敏度分析 |
| 1.3.3 稳定性分析 |
| 1.4 田间样品应用检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 试剂盒的特异性和灵敏度 |
| 2.2 试剂盒的稳定性 |
| 2.3 试剂盒对田间样品的检测性能 |
| 3 讨论 |
（5）水稻黑条矮缩病毒P5-2蛋白水稻互作因子鉴定及功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 水稻黑条矮缩病毒 |
| 1.1 水稻黑条矮缩病的发生与危害 |
| 1.2 水稻黑条矮缩病毒的研究进展 |
| 1.3 RBSDV P5-2功能研究进展 |
| 1.4 酵母双杂交原理 |
| 1.5 分裂荧光素酶互补技术 |
| 1.6 亚细胞定位研究技术 |
| 1.7 CRISPR-cas9基因编辑技术 |
| 2 本研究的目的和意义 |
| 第二章 RBSDV P5-2蛋白水稻互作因子鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PHYG-YPF-P5-2载体的构建 |
| 2.2 P5-2过量表达拟南芥表型 |
| 2.3 诱饵pGBKT7/P5-2载体的构建 |
| 2.4 pGBKT7/P5-2自激活及毒性检测 |
| 2.5 酵母双杂交筛选阳性克隆 |
| 2.6 阳性克隆检测分析 |
| 2.7 阳性克隆测序分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 水稻ZFP、BBTI5、R3H与RBSDV P5-2互作验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ZFP、BBTI5、R3H基因克隆 |
| 2.2 酵母表达载体的构建 |
| 2.3 酵母双杂交验证互作 |
| 2.4 LUC荧光载体的酶切验证 |
| 2.5 CFP/YFP荧光标签载体的酶切验证 |
| 2.6 Split-luciferase验证P5-2与水稻ZFP、BBTI5、R3H在植物体内互作 |
| 2.7 RBSDV P5-2与水稻R3H、BBTI5、ZFP细胞定位 |
| 2.8 RBSDV P5-2与水稻ZFP、BBTI5、R3H的亚细胞共定位 |
| 3 小结与讨论 |
| 第四章 RBSDV P5-2蛋白水稻互作因子ZFP、BBTI5抗病毒功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ZFP CRISPR-cas9水稻突变体植株的分子检测 |
| 2.2 BBTI5 CRISPR-cas9水稻突变体植株的分子检测 |
| 2.3 R3H CRISPR-cas9水稻突变体植株的分子检测 |
| 2.4 纯合体突变体植株靶标测序验证 |
| 2.5 灰飞虱带毒率测定 |
| 2.6 ZFP、BBTI5水稻突变体植株RBSDV抗性鉴定 |
| 3 小结与讨论 |
| 第五章 RPA法快速检测水稻植株中黑条矮缩病毒 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 采集水稻样品的检测 |
| 2.2 RPA法检测病毒模板浓度的优化 |
| 2.3 RPA法检测病毒反应温度与反应时间的优化 |
| 2.4 RPA的灵敏性和特异性 |
| 3 小结与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 学术论文发表情况 |
| 致谢 |
（6）灰飞虱对水稻病毒病（RSV/RBSDV）植株选择性分析及机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 传毒介体灰飞虱 |
| 1.1 灰飞虱取食行为与危害 |
| 1.2 以灰飞虱为媒介传播水稻条纹病毒 |
| 1.3 以灰飞虱为媒介传播水稻黑条矮缩病毒 |
| 2 植物病毒影响行为 |
| 2.1 植物病毒对昆虫生理特性的影响 |
| 2.2 植物病毒对昆虫选择寄主的影响 |
| 2.3 植物病毒对植物挥发物的影响 |
| 2.4 植物病毒对稻飞虱选择性的影响 |
| 3 昆虫的嗅觉系统 |
| 3.1 昆虫的嗅觉蛋白 |
| 3.2 昆虫的嗅觉受体辅助受体 |
| 第二章 RSV带毒与无毒灰飞虱对水稻病/健植株选择性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RSV带毒若虫对RSV病株的选择偏好 |
| 2.2 无毒若虫对RSV病株的选择偏好 |
| 2.3 RSV带毒成虫对RSV病株的选择偏好 |
| 2.4 无毒成虫对RSV病株的选择偏好 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 RBSDV带毒与无毒灰飞虱对水稻病/健植株选择性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RBSDV侵染寄主水稻后的检测 |
| 2.2 RBSDV病株饲毒后带毒若虫检测 |
| 2.3 不同龄期灰飞虱中RBSDV基因表达量相对分析 |
| 2.4 灰飞虱带毒率检测 |
| 2.5 RBSDV带毒若虫对RBSDV病株的选择偏好 |
| 2.6 无毒若虫对RBSDV病株的选择偏好 |
| 3 讨论 |
| 第四章 灰飞虱嗅觉受体辅助受体LSTRORCO的克隆与表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 无毒/带毒灰飞虱嗅觉基因表达差异分析 |
| 2.2 LsrrOrco的RT-PCR扩增 |
| 2.3 来自灰飞虱的LstrOrco序列的鉴定 |
| 2.4 无毒和RSV带毒的灰飞虱LstrOrco在发育不同阶段的表达特性 |
| 2.5 无毒和RSV带毒的灰飞虱LstrOrco在身体不同部位的表达特性 |
| 2.6 无毒和RSV带毒的灰飞虱LstrOrco在不同温度的表达特性 |
| 3 小结与讨论 |
| 第五章 灰飞虱嗅觉基因LSTRORCO的功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNAi处理后昆虫的抑制率 |
| 2.2 RNAi处理后昆虫的不反应率 |
| 2.3 RNAi处理后昆虫的反应时间 |
| 2.4 RSV带毒若虫RNAi饲喂处理后对RSV病株的选择偏好 |
| 2.5 无毒若虫RNAi饲喂处理后对RSV病株的选择偏好 |
| 3 小结与讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 常用缓冲液及试剂配制方法 |
| 学术论文发表情况 |
| 致谢 |
（7）华南地区RSMV的分布及其对介体叶蝉生命参数的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词及中英文对照 |
| 1 前言 |
| 1.1 水稻病毒 |
| 1.1.1 水稻病毒病简介 |
| 1.1.2 水稻病毒的症状 |
| 1.1.3 水稻病毒种类及分布 |
| 1.1.4 水稻病毒传播介体及寄主范围 |
| 1.2 植物病毒检测方法研究 |
| 1.2.1 症状诊断 |
| 1.2.2 生物学检测法 |
| 1.2.3 电镜检测 |
| 1.2.4 血清学检测 |
| 1.2.5 分子生物学检测 |
| 1.3 水稻条纹花叶病毒研究现状 |
| 1.3.1 病害的发现及病原鉴定 |
| 1.3.2 介体传毒特征 |
| 1.3.3 病毒的基因组及其编码产物 |
| 1.4 植物病毒对媒介昆虫的影响 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验工具 |
| 2.1.2 供试水稻品种及供试叶蝉 |
| 2.1.3 主要仪器及用品 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病害调查 |
| 2.2.2 检测方法建立 |
| 2.2.3 人工接毒试验 |
| 2.2.4 病毒越冬调查 |
| 2.2.5 RSMV对电光叶蝉生命参数的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RSMV和RGDV检测体系建立 |
| 3.1.1 单一检测RSMV的RT-PCR方法 |
| 3.1.2 单一检测RGDV的RT-PCR方法 |
| 3.1.3 同时检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR方法 |
| 3.1.4 双重RT-PCR检测方法应用 |
| 3.2 水稻条纹花叶病病情调查及介体叶蝉带毒率调查 |
| 3.2.1 华南地区水稻条纹花叶病分布 |
| 3.2.2 华南地区水稻疑似病样检测结果 |
| 3.2.3 华南地区田间叶蝉带毒率检测结果 |
| 3.3 人工接毒试验 |
| 3.3.1 病毒不能侵染烟草、玉米和拟南芥 |
| 3.3.2 病毒不能通过摩擦和种子传毒 |
| 3.4 RSMV越冬调查研究 |
| 3.4.1 越冬期电光叶蝉动态变化 |
| 3.4.2 越冬期电光叶蝉带毒率调查 |
| 3.4.3 病毒越冬寄主调查 |
| 3.5 RSMV对电光叶蝉生长发育和繁殖的影响 |
| 3.5.1 病毒对电光叶蝉若虫历期的影响 |
| 3.5.2 病毒对电光叶蝉成虫寿命的影响 |
| 3.5.3 病毒对电光叶蝉繁殖能力的影响 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 RSMV和RGDV双重RT-PCR检测方法的建立与应用 |
| 4.2 RSMV和RGDV复合侵染引起更严重症状 |
| 4.3 RSMV的地理分布及发生趋势 |
| 4.4 RSMV越冬场所及效率 |
| 4.5 黑尾叶蝉是否RSMV传毒介体值得研究证实 |
| 4.6 RSMV对介体电光叶蝉的影响 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（8）检测南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 免疫原的制备及其免疫 |
| 1.2.2 杂交瘤细胞及其单抗特性分析 |
| 1.2.3 SRBSDV胶体金免疫试纸条的制备 |
| 1.2.4 试纸条的使用方法及其特性分析 |
| 1.2.5 胶体金免疫试纸条的田间检测应用 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 杂交瘤细胞及其单抗腹水的制备 |
| 2.2 Western blot分析单抗特异性 |
| 2.3 dot-ELISA分析单抗的特异性和灵敏度 |
| 2.4 胶体金免疫试纸条的建立及其特性 |
| 2.5 胶体金免疫试纸条的田间样品检测 |
| 3 讨论 |
（9）水稻品种9194抗灰飞虱及其传播黑条矮缩病基因的定位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 水稻灰飞虱概况 |
| 1.1 灰飞虱的形态特征 |
| 1.1.1 若虫 |
| 1.1.2 成虫 |
| 1.1.3 卵 |
| 1.2 灰飞虱的发生和危害 |
| 1.3 灰飞虱的生物学特性 |
| 1.3.1 寄主植物 |
| 1.3.2 生活史 |
| 1.3.3 越冬 |
| 1.3.4 生活习性 |
| 1.4 灰飞虱暴发成灾原因 |
| 1.4.1 气候因素 |
| 1.4.2 耕作制度 |
| 1.4.3 作物抗性 |
| 1.4.4 药剂抗性 |
| 1.4.5 天敌 |
| 1.5 灰飞虱防治技术研究 |
| 1.5.1 推广种植抗性品种 |
| 1.5.2 清除田间杂草 |
| 1.5.3 适当调整播期 |
| 1.5.4 适期化学防治 |
| 2 水稻抗灰飞虱遗传基础研究 |
| 2.1 水稻对灰飞虱的抗性机制研究 |
| 2.2 水稻抗灰飞虱的遗传基础 |
| 3 水稻黑条矮缩病概况 |
| 3.1 水稻黑条矮缩病的发生和危害 |
| 3.2 水稻黑条矮缩病的病害特征及抗性评价标准 |
| 3.2.1 水稻黑条矮缩病的病害特征 |
| 3.2.2 水稻黑条矮缩病抗性评价标准 |
| 3.3 水稻黑条矮缩病毒分子生物学特性 |
| 3.3.1 水稻黑条矮缩病毒的分类地位 |
| 3.3.2 水稻黑条矮缩病毒的基本特征 |
| 3.3.3 水稻黑条矮缩病毒的基因结构及其特征 |
| 3.3.4 水稻黑条矮缩病毒基因组编码蛋白 |
| 3.4 介体灰飞虱传毒特性及其机制 |
| 3.4.1 介体灰飞虱传毒特性 |
| 3.4.2 介体灰飞虱传毒机制 |
| 3.5 水稻黑条矮缩病抗性遗传研究进展 |
| 3.5.1 水稻黑条矮缩病的抗性分类 |
| 3.5.2 水稻黑条矮缩病抗性基因定位研究 |
| 3.6 水稻黑条矮缩病的防治 |
| 4 本研究目的与意义 |
| 第二章 水稻品种9194抗黑条矮缩病的遗传分析和QTL检测 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 水稻黑条矮缩病重病区鉴定及评价标准 |
| 1.3 分子连锁图谱构建和QTL分析 |
| 1.4 植物总DNA的提取(SDS小量提取法) |
| 1.5 PCR反应 |
| 1.6 PCR产物的检测 |
| 1.7 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 9194对水稻黑条矮缩病的抗性表现 |
| 2.2 9194抗水稻黑条矮缩病基因的遗传分析 |
| 2.3 9194抗水稻黑条矮缩病的QTL检测 |
| 2.4 检测到的四个QTLs对黑条矮缩病的抗性具有累加作用 |
| 3 讨论 |
| 第三章 水稻品种9194抗灰飞虱的遗传分析和QTL检测 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 灰飞虱虫源及饲养 |
| 1.3 灰飞虱表型鉴定及评价标准 |
| 1.3.1 改良的苗期集团筛选法鉴定及评价标准 |
| 1.3.2 排趋性鉴定及评价标准 |
| 1.3.3 抗生性鉴定及评价标准 |
| 1.3.4 耐害性鉴定及评价标准 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 水稻品种9194和苏御糯的灰飞虱抗性比较 |
| 2.2 9194的灰飞虱排趋性分析 |
| 2.3 9194的灰飞虱抗生性分析 |
| 2.4 9194抗灰飞虱的遗传分析 |
| 2.5 9194抗灰飞虱的QTL检测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 水稻品种9194抗黑条矮缩病基因qRBSDV11的精细定位 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 灰飞虱虫源及饲养 |
| 1.3 灰飞虱带毒率检测 |
| 1.4 水稻黑条矮缩病人工接种鉴定及评价标准 |
| 1.5 SSR引物和InDel引物的设计 |
| 1.6 植物总DNA的提取(CTAB大量提取法) |
| 1.7 植物总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.8 候选基因预测与扩增 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 利用BC_2F_(2:3)群体验证qRBSDV11 |
| 2.2 qRBSDV11的精细定位 |
| 2.3 qRBSDV11定位区间内的基因预测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 全文小结 |
| 1 全文结论 |
| 1.1 籼稻品种9194稳定高抗水稻黑条矮缩病 |
| 1.2 9194兼抗介体灰飞虱 |
| 1.3 利用9194/SYN F_(2:3)群体分别检测到4个抗灰飞虱和4个抗水稻黑条矮缩病QTLs |
| 1.4 qRBSDV6、qRBSDV9和qRBSDV11对水稻黑条矮缩病的抗性具有加性效应 |
| 1.5 抗水稻黑条矮缩病主效QTL qRBSDV11被精细定位于163 kb的区间 |
| 2 本研究的创新之处 |
| 2.1 本研究筛选鉴定了一份稳定、高抗黑条矮缩病水稻资源 |
| 2.2 解析了9194抗水稻黑条矮缩病和传毒介体灰飞虱的遗传基础,完成了抗黑条矮缩病主效QTLqRBSDV11的精细定位 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）基于miRNA和siRNA策略抗水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 水稻条纹病毒的研究进展 |
| 1.1.1 水稻条纹叶枯病 |
| 1.1.2 水稻条纹病毒 |
| 1.1.3 水稻条纹病毒的基因组转录及复制 |
| 1.1.4 水稻条纹病毒传的传毒介体及传毒机制 |
| 1.2 水稻黑条矮缩病毒的研究进展 |
| 1.2.1 水稻黑条矮缩病 |
| 1.2.2 水稻黑条矮缩病毒 |
| 1.2.3 水稻黑条矮缩病毒的基因组转录及复制 |
| 1.2.4 水稻黑条矮缩病毒的传毒介体及传毒机制 |
| 1.3 水稻病毒病的防治 |
| 1.3.1 通过化学防治来控制病害 |
| 1.3.2 运用品种抗性来控制病害 |
| 1.3.3 基因工程技术来控制病害 |
| 1.4 RNA沉默 |
| 1.4.1 小干扰RNA |
| 1.4.2 微小RNA |
| 1.5 RNA沉默与植物病毒抗性 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒源 |
| 2.1.2 供试植物、昆虫 |
| 2.1.3 菌株和质粒 |
| 2.1.4 序列测定 |
| 2.1.5 常用化学试剂与分子生物学试剂 |
| 2.1.6 引物设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 osa-miR528的克隆 |
| 2.2.1.1 水稻总DNA的提取 |
| 2.2.1.2 osa-miR528的PCR扩增 |
| 2.2.1.3 DNA片段的回收 |
| 2.2.1.4 目的基因DNA片段与pMD18-T载体的连接 |
| 2.2.1.5 感受态细胞制备 |
| 2.2.1.6 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.1.7 转化菌落PCR鉴定 |
| 2.2.1.8 质粒DNA的小量提取 |
| 2.2.2 amiRNA的筛选 |
| 2.2.3 amiRNA植物表达载体的构建 |
| 2.2.3.1 amiRNA植物表达载体的构建策略 |
| 2.2.3.2 pre-miR528改造为pre-amiR-RSV和pre-amiR-RBSDV |
| 2.2.3.3 质粒DNA的酶切 |
| 2.2.3.4 目的片段与质粒DNA的连接 |
| 2.2.3.5 冻融法转化农杆菌 |
| 2.2.4 农杆菌介导的瞬时表达 |
| 2.2.5 Northern杂交分析 |
| 2.2.5.1 植株总RNA的提取 |
| 2.2.5.2 总RNA的甲醛凝胶电泳 |
| 2.2.5.3 总RNA的转膜 |
| 2.2.5.4 探针制备 |
| 2.2.5.5 DIG标记有效性检测 |
| 2.2.5.6 预杂交与杂交 |
| 2.2.5.7 洗膜与显影 |
| 2.2.6 植株siRNA/miRNA的Northern blot分析 |
| 2.2.6.1 植株siRNA/miRNA的提取 |
| 2.2.6.2 sRNA聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.6.3 sRNA转膜 |
| 2.2.6.4 miRNA探针的制备 |
| 2.2.6.5 miRNA杂交 |
| 2.2.7 5'-RLM-RACE验证miRNA靶基因的剪切位点 |
| 2.2.8 农杆菌介导的水稻转化及转基因植株的获得 |
| 2.2.8.1 预培养 |
| 2.2.8.2 农杆菌侵染和共培养 |
| 2.2.8.3 转化植株的获得 |
| 2.2.8.4 再生植株的PPT抗性检测 |
| 2.2.8.5 再生植株总DNA的小量提取 |
| 2.2.8.6 再生植株的PCR检测 |
| 2.2.9 转基因水稻植株的抗病性鉴定 |
| 2.2.10转基因植株的ELISA检测 |
| 2.2.11转基因植株的Southern blot分析 |
| 2.2.11.1 水稻总DNA的提取 |
| 2.2.11.2 转基因植株总DNA的酶切 |
| 2.2.11.3 DNA凝胶电泳 |
| 2.2.11.4 DNA转膜 |
| 2.2.11.5 探针标记 |
| 2.2.11.6 DIG标记有效性的检测 |
| 2.2.11.7 预杂交与杂交 |
| 2.2.11.8 洗膜与显影 |
| 2.2.12 转基因植株的遗传稳定性分析 |
| 2.2.13 amiRNA二级结构的预测 |
| 2.2.14 灰飞虱NCuP基因的克隆 |
| 2.2.15 qRT-PCR检测灰飞虱体内目的基因的表达量 |
| 2.2.16 灰飞虱的饲毒实验 |
| 2.2.17 检测灰飞虱的带毒率 |
| 2.2.18 体外转录合成NCuP的dsRNA |
| 2.2.19 dsRNA饲喂灰飞虱 |
| 2.2.20 灰飞虱的获毒试验 |
| 2.2.21 灰飞虱的传毒试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基于amiRNA策略培育双抗RSV和RBSDV转基因水稻新材料 |
| 3.1.1 水稻osa-miR528的扩增 |
| 3.1.2 amiRNA的筛选及引物设计 |
| 3.1.3 pre-miRNA的改造 |
| 3.1.3.1 靶向于RSV CP基因不同区段的人工miRNA前体的构建 |
| 3.1.3.2 靶向于RBSDV CP基因不同区段的人工miRNA前体的构建 |
| 3.1.3.3 双抗植物表达载体的构建 |
| 3.1.4 农杆菌介导的瞬时侵染检测amiRNA表达载体的有效性 |
| 3.1.5 Northern blot检测靶RNA的积累 |
| 3.1.6 5'-RLM-RACE验证miRNA靶基因的剪切位点 |
| 3.1.7 T_0代转基因再生植株的获得及检测 |
| 3.1.8 转基因植株的amiRNA的表达检测 |
| 3.1.9 T_2代转基因植株的抗性鉴定 |
| 3.1.10 T_2代转基因植株的Northern杂交分析 |
| 3.1.11 T_2代转基因植株的amiRNA杂交分析 |
| 3.1.12 T_2代转基因植株的siRNA杂交分析 |
| 3.1.13 转基因植株的Southern blot分析 |
| 3.1.14 转基因和病毒抗性的遗传稳定性分析 |
| 3.1.15 amiRNA二级结构的预测 |
| 3.2 介体传毒相关蛋白的鉴定及沉默传毒相关蛋白对介体传毒的影响 |
| 3.2.1 灰飞虱NCuP基因的克隆 |
| 3.2.2 NCuP基因在灰飞虱不同发育时期的表达特性 |
| 3.2.3 RSV的侵染对不同龄期灰飞虱NCuP基因表达的影响 |
| 3.2.4 体外转录合成dsNCuP |
| 3.2.5 dsNCuP干扰灰飞虱体内的RSV表达 |
| 3.2.6 饲喂dsNCuP对灰飞虱获毒效率的影响 |
| 3.2.7 饲喂dsNCuP对灰飞虱传毒效率的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 靶向RSV和RBSDV CP基因不同区段的ami RNA介导了对两种病毒的抗病性 |
| 4.2 沉默灰飞虱体内与RSV互作的基因影响灰飞虱对RSV的传播 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文及成果 |
四、从单头灰飞虱中检测水稻黑条矮缩病毒简单快速的方法（论文参考文献）
- [1]灰飞虱N6-甲基腺嘌呤修饰在水稻黑条矮缩病毒复制中的功能研究[D]. 田淑萍. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]基于RNA-seq的水稻新病毒RCDaV的鉴定及水稻响应RBSDV侵染的lncRNA-mRNA调控网络研究[D]. 张天则. 浙江大学, 2021(01)
- [3]水稻GLK突变体对水稻黑条矮缩病的抗性的探究[D]. 李济同. 扬州大学, 2020(01)
- [4]南方水稻黑条矮缩病毒dot-ELISA检测试剂盒的应用性能验证[J]. 王亚琴,姜军,黄德青,周雪平,洪健,吴建祥. 中国植保导刊, 2018(07)
- [5]水稻黑条矮缩病毒P5-2蛋白水稻互作因子鉴定及功能初步研究[D]. 赵冲. 南京农业大学, 2018(03)
- [6]灰飞虱对水稻病毒病（RSV/RBSDV）植株选择性分析及机制初探[D]. 周长伟. 南京农业大学, 2018(08)
- [7]华南地区RSMV的分布及其对介体叶蝉生命参数的影响[D]. 陈彪. 华南农业大学, 2018(08)
- [8]检测南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条的建立[J]. 吴建祥,饶黎霞,陈浙,傅帅,周雪平. 植物保护学报, 2017(06)
- [9]水稻品种9194抗灰飞虱及其传播黑条矮缩病基因的定位[D]. 孙志广. 南京农业大学, 2017(07)
- [10]基于miRNA和siRNA策略抗水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的研究[D]. 孙林. 山东农业大学, 2016(08)