一、柔嫩艾美耳球虫Diclazuril抗性株与Clopidol抗性株的实验室诱导（论文文献综述）
李超,汤新明,吕艳丽,于咏兰,刘贤勇,索勋[1]（2021）在《我国鸡球虫抗药性现状和抗药机制研究进展》文中研究说明球虫病严重威胁养鸡业健康发展。随着抗球虫药物的使用,鸡球虫的抗药性越来越普遍,增加了该病的防控难度。本文对十年来鸡球虫抗药性调查文献进行了梳理,发现我国各地区鸡球虫对大部分常用药物均具有中度以上的抗药性,华东和华南地区最严重,西北和东北地区的抗药性最弱。在各类药物中,对聚醚离子载体类药物和地克珠利的检测最多,对前者接近一半地区达到完全抗药,而对地克珠利基本为中度抗药,对其他化学合成药物过半数达完全抗药。当然由于地区差异,同一地区仍存在敏感性不同的虫株。各种药物的抗药性产生机制不一样,可能涉及虫体的结构蛋白改变如SAG家族蛋白、细胞膜离子通道、糖或脂肪酸代谢酶如苹果酸脱氢酶或能量代谢酶如细胞色素氧化酶。随着鸡球虫抗药性逐步得到解析,系统监测、科学用药和免疫预防等综合举措将极大消减球虫病对养鸡业的影响,提升经济与社会效益。
姚亚文[2]（2021）在《基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究》文中认为鸡球虫病是一种寄生于鸡肠道危害严重的寄生虫病。目前,该病主要依赖于药物防治,药物的长期广泛使用导致鸡球虫出现严重耐药性。为研究鸡球虫耐药性产生的分子机制,本研究对柔嫩艾美耳球虫敏感株（DS）和盐霉素耐药株（SMR）进行全基因组重测序,利用选择性清除方法筛选出可能与盐霉素耐药相关的候选基因,并对3个耐药相关基因（柔嫩艾美耳球虫保守蛋白35（EtCHP35）、柔嫩艾美耳球虫保守蛋白40（EtCHP40）和柔嫩艾美耳球虫表面抗原（EtSAG））的特性进行了初步分析。1.全基因组重测序与选择性清除筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药相关基因本研究对柔嫩艾美耳球虫10株药物敏感株、3株实验室诱导的盐霉素耐药株和15株单卵囊分离的田间盐霉素耐药株进行了全基因组重测序分析,结果显示样品数据量均在1?Gb以上,Q20≥95%、Q30≥90%,与参考基因组比对结果显示比对率均高于82%,测序深度均大于14%,覆盖度（4×）均高于92%。利用选择性清除方法对柔嫩艾美耳球虫药物敏感株和盐霉素耐药株重测序结果进行分析,获得73个在敏感株受选择基因,共1221个SNPs位点,其中81个SNPs属于非同义突变;获得148个在盐霉素耐药株受选择基因,共2545个SNPs位点,其中118个SNPs位点属于非同义突变。GO富集分析结果显示,敏感株候选基因主要参与生物过程和分子功能,盐霉素耐药株候选基因主要参与生物代谢过程。KEGG通路分析结果显示,敏感株候选基因主要参与吞噬体、氧化磷酸化和新陈代谢等通路,盐霉素耐药株候选基因主要参与吞噬体,新陈代谢等通路。将选择性清除的候选基因与转录组结果关联分析,获得共有基因14个,这些基因主要参与核糖体和ATP转运等通路。2.3个耐药相关基因的克隆和生物信息学分析以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊c DNA第一链为扩增模板,成功克隆了EtCHP35,EtCHP40和EtSAG的ORF序列。对氨基酸序列分析显示,三个蛋白均无跨膜结构,有多个蛋白酶磷酸化位点,其中EtCHP35含一个逆转录酶位点,EtCHP40含一个天冬氨酸蛋白酶活性位点,EtSAG含一个信号肽,一个苏氨酸富集区,属于表面抗原家族（SAG family member）。成功构建原核重组表达质粒并诱导表达了三个重组蛋白（r EtCHP35,r EtCHP40和r EtSAG）,并制备了相应的抗体。3.3个耐药相关基因特性分析间接免疫荧光定位结果显示EtCHP35和EtCHP40主要分布在子孢子的表面和顶端,EtSAG主要分布在子孢子和第二代裂殖子的表面。体外抑制实验结果显示这3个蛋白与子孢子入侵宿主细胞无关。利用实时荧光定量PCR,对3个基因在柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段以及不同虫株（耐药株和敏感株）的mRNA转录水平进行分析,结果显示EtCHP35和EtSAG基因在敏感株孢子化卵囊阶段的mRNA转录水平最高,EtCHP40基因在第二代裂殖子阶段高表达。与敏感株相比,EtCHP35基因的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株和盐霉素耐药株第二代裂殖子阶段上调;EtCHP40基因在3株耐药株（地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株、盐霉素耐药株）第二代裂殖子阶段均上调,且在马杜拉霉素耐药株的转录水平显着高于其他耐药株;EtSAG基因的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株上调,在盐霉素和地克珠利耐药株的转录水平下调。且在不同浓度的盐霉素作用下,EtCHP35和EtCHP40的mRNA转录水平随着药物浓度的升高而升高。上述结果为进一步研究柔嫩艾美耳球虫耐药性产生的分子机制及建立田间鸡球虫耐药性快速检测方法提供了一定的基础。
王海霞[3]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的诱导及耐药相关基因特性的初步分析》文中提出球虫病是世界上危害严重的寄生虫病之一,对养鸡业造成了巨大的经济损失。随着药物的广泛使用及不合理使用,耐药性成为无法避免的问题,但球虫耐药性形成的机制至今不清楚,也没有找到控制球虫产生耐药性的靶基因。本研究通过实验室诱导获得了柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药虫株,观察了盐霉素耐药株和敏感株子孢子和裂殖子的超微结构,分析了盐霉素耐药株和敏感株的差异表达基因,检测了3个鸡球虫田间分离株的耐药状况,利用单卵囊分离技术获得22个柔嫩艾美耳球虫盐霉素田间耐药株,对柠檬酸合酶（EtCS）、甲硫氨酸氨基肽酶（EtMetAP）、锚蛋白重复序列（EtANK）3个球虫耐药相关基因的特性进行了初步分析。1.柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的实验室诱导与电镜观察采用药物浓度递增法,以15 mg/kg（药物/饲料）为起始诱导浓度,经过24次传代,用鸡体药敏试验检测,获得对盐霉素60 mg/kg完全耐药的柔嫩艾美耳球虫耐药株。利用透射电镜观察了盐霉素耐药株子孢子和裂殖子的超微结构,发现耐药株虫体的形态变得不规则、细胞膜粗糙与肿胀、细胞核形状变得不规则甚至溶解、微线减少、支链淀粉增多等。2.柔嫩艾美耳球虫敏感株和耐药株的比较转录组学分析利用RNA-seq对柔嫩艾美耳球虫敏感株和盐霉素耐药株的子孢子和裂殖子进行转录组测序分析。结果显示,与敏感株相比,耐药株子孢子获得17个上调表达基因、13个下调表达基因;耐药株裂殖子获得606个上调表达基因、496个下调表达基因,子孢子和裂殖子共有差异表达基因18个。GO分析发现,耐药株子孢子的差异表达基因主要参与离子结合过程,耐药株裂殖子的差异表达基因主要参与细胞蛋白质代谢过程。用qPCR对差异表达基因进行了验证,结果与转录组测序结果基本一致。3.鸡球虫田间分离株的耐药程度检测与柔嫩艾美耳球虫盐霉素田间耐药株的分离从安徽不同养殖场收集样品,获得3个鸡球虫田间株（AH1、AH2、AH3）,通过鸡体药敏试验检测了田间株对5种抗球虫药物（地克珠利、盐霉素、癸氧喹酯、甲基盐霉素、氯苯胍）的耐药程度,除AH2对氯苯胍中度耐药外,所测虫株对其他药物完全耐药。用琼脂糖技术分离获得22个柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离株,用qPCR分析了4个差异表达基因在2个单卵囊分离株及安徽1混合种的mRNA转录水平,与转录组测序结果一致。4.三个耐药相关基因特性的初步分析对3个球虫耐药相关基因（EtCS、EtMetAP、EtANK）进行克隆、表达与纯化,制备相应抗体,分析3个基因在柔嫩艾美耳球虫球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、裂殖子的转录水平和翻译水平,结果表明这三个基因在四个阶段的转录水平和翻译水平不一致,可能是翻译后修饰的结果。间接免疫荧光表明,EtCS、EtMetAP、EtANK分别定位于子孢子除折光体外的细胞质中、子孢子表面、子孢子的顶端、都定位于裂殖子的细胞膜和细胞质中。体外抑制实验表明,这3个蛋白都参与了子孢子入侵DF-1细胞的过程。用EtCS处理鸡巨噬细胞后发现,EtCS可与巨噬细胞结合,抑制巨噬细胞的增殖及NO的产生。对敏感株和不同耐药株进行转录水平分析,发现这3个基因在柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株中表达都显着上调,而在盐霉素耐药株中差异不显着,与转录组结果一致。但这3个基因在耐药株中的蛋白翻译水平与转录结果不一致。利用qPCR分析3个基因在单卵囊分离的盐霉素田间耐药株、安徽1混合种、单卵囊分离的地克珠利田间耐药株的mRNA转录水平,结果显示,与敏感株相比,3个基因在安徽1混合种的转录水平都很低;在3株地克珠利田间耐药株中,除EtCS在其中2株下调表达外,其余都上调表达;在3株盐霉素田间耐药株中,EtMetAP表达上调和EtCS表达下调,EtANK差异不明显;与盐霉素转录组结果不一致,可能是由于分离的田间耐药株存在多重耐药性。结论:本研究利用诱导获得的柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株和敏感株进行比较转录组学分析获得差异表达基因,用田间分离的柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株进行了验证,选取3个耐药相关基因进行初步分析,结果为进一步研究球虫耐药性产生的分子基础提供了基础。
郝振凯,毕菲菲,韩贞艳,于咏兰,索勋,刘贤勇[4]（2019）在《鸡球虫耐药性研究进展》文中研究说明鸡球虫病是由球虫感染引起的消化道疾病,对全世界的养禽业带来巨大经济损失。球虫为顶复门、艾美耳属的细胞内寄生虫,能够感染鸡的球虫有7种,包括堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）、布氏艾美耳球虫（E. brunetti）、巨型艾美耳球虫（E. maxima）、和缓艾美耳球虫（E. mitis）、毒害艾美耳球虫（E. necatrix）、早熟艾美耳球虫（E. praecox）和柔嫩艾美耳球虫（E. tenella）[1]。它
戚南山[5]（2019）在《自噬对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵活性及抗药性的影响》文中研究表明柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是一种专性细胞内寄生的顶复门原虫,可引起鸡的球虫病,严重危害集约化养鸡业生产。当前鸡球虫病的防控主要采用化学药物配合活卵囊疫苗的技术手段,由此造成的抗药性、药物残留以及活疫苗潜在散毒风险等问题日益突出。由于鸡球虫复杂的生活史和生物学特性,人们至今对球虫的细胞生物学活性、入侵宿主以及抗药性等作用机制尚未全面了解,造成传统抗球虫药物的敏感性恢复、新型抗球虫药物及分子疫苗的研发面临巨大困难。近年来在对顶复门原虫自噬的研究中发现,通过药物的诱导或者抑制虫体的自噬可介导虫体发生程序性死亡,说明自噬对于寄生虫的细胞活性非常重要。鉴于此,本研究以E.tenella子孢子为研究对象,开展鸡球虫子孢子自噬方面的研究,以期揭示自噬对鸡球虫子孢子入侵活性及抗药性的作用机制,为新型抗球虫药的研发与抗球虫药抗药性的研究提供新的思路。1.E.tenella自噬标记蛋白Et ATG8的克隆表达及功能鉴定。本研究对E.tenella自噬相关基因（autophagy associated gene,Etatg8）进行了克隆、表达与亚细胞定位分析。结果显示,成功克隆获得全长为375 bp的Etatg8基因开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,编码124个氨基酸的Et ATG8蛋白,其三维结构与恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）Pf ATG8高度相似;Etatg8基因在虫体未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子及裂殖子4个发育阶段均有表达,但在未孢子化卵囊的转录水平显着高于其他3个阶段;Et ATG8蛋白在自噬诱导下呈点状聚集于子孢子及裂殖子胞浆中。结果表明,E.tenella具有与其他顶复门原虫、酵母以及哺乳动物等高度保守的atg8基因,Et ATG8蛋白在虫体自噬体膜的形成过程中起相同作用,可作为鸡球虫自噬研究的标记蛋白。2.E.tenella子孢子自噬的诱导、调节和检测。本研究以完全培养基培养的E.tenella子孢子为对照,利用营养缺陷型培养基、自噬调节剂处理子孢子建立自噬模型;利用免疫印迹（WB）、间接免疫荧光试验（IFA）及透射电镜（EM）等技术检测子孢子自噬体的形成及Et ATG8的表达。结果显示,饥饿或自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin）诱导的E.tenella子孢子可形成双层膜样自噬体结构;Et ATG8蛋白在自噬诱导下发生脂化,呈点状聚集于子孢子及裂殖子胞浆中,而3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine）可有效抑制自噬体的产生。结果表明,E.tenella与其他真核细胞一样具有保守的自噬机制。3.自噬对E.tenella子孢子入侵活性的作用研究。本研究利用化学发光法检测子孢子腺苷三磷酸（ATP）水平,利用台盼蓝染色法检测子孢子存活率,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）⊿⊿CT法研究自噬对子孢子入侵活性的影响。结果显示,子孢子随着饥饿处理时间延长其存活率呈现明显下降趋势,但ATP水平却有所增加;而利用3-MA处理后ATP水平逐渐降低。子孢子经过RP诱导产生的自噬有利于对宿主细胞的入侵,相反3-MA可抑制子孢子的入侵活性。结果表明E.tenella在饥饿培养基诱导条件下可通过自噬机制保持能量平衡,自噬诱导剂诱导虫体产生的自噬则有利于其对宿主细胞的入侵。4.自噬在E.tenella对莫能霉素（Monensin）抗药性产生的作用研究。本研究通过台盼蓝染色法研究莫能霉素对E.tenella广州株敏感虫株（Mon S-GZ）及耐药虫株（Mon R-GZ）虫体活性的影响,利用WB、IFA及TEM等技术研究莫能霉素对两个虫株的自噬诱导作用。结果发现,相比Mon R-GZ株,莫能霉素可诱导Mon S-GZ株产生自噬并介导虫体死亡,而自噬抑制剂3-MA可有效阻断Mon S-GZ株产生自噬并拯救虫体存活。结果表明,莫能霉素诱导的自噬可作为介导球虫死亡的一种机制,同时也为解释球虫抗药性的产生提供了新的理论依据。
张婷[6]（2019）在《双氢青蒿素对感染弓形虫及疟原虫小鼠免疫调节作用的研究》文中指出青蒿（Artemisia annua）是一种古老的退烧草药。从青蒿中提取的青蒿素是治疗疟疾的有效药物。双氢青蒿素（DHA）是在青蒿素原有的结构中引进了羟基,从而提高了其抗疟活性。研究发现DHA还具有抗炎、抗肿瘤作用,而且对红斑狼疮具有一定的治疗作用,但作用机理一直不是很清楚。本实验以DHA为实验药物,对其在感染弓形虫及伯氏疟原虫小鼠的免疫调节作用进行了研究。将小鼠攻虫后,分别在不同时间段进行DHA灌胃治疗,借助流式细胞仪对感染寄生虫小鼠脾脏及血液中B细胞、T辅助细胞（Th）、CD8+T细胞、自然杀伤细胞（NK）、自然杀伤T细胞（NKT）数量的变化进行分析。同时收集血清,利用多因子检测试剂盒对血清中细胞因子进行检测。实验数据显示健康小鼠经DHA灌胃后,脾脏中CD8+T细胞的数量及脾脏指数在一定时期显着增加。感染弓形虫的小鼠经DHA灌胃后脾脏及血液中T辅助细胞（Th）、CD8+T细胞的数量增加,B细胞的数量减少。感染伯氏疟原虫的小鼠经DHA灌胃治疗后,脾脏及血液中的辅助性T细胞（Th）、CD8+T细胞、自然杀伤细胞（NK）及自然杀伤T细胞（NKT）数量增加而促炎性细胞因子的产生降低。本研究表明:DHA对小鼠的免疫系统具有免疫调节作用,主要表现为（1）增加脾脏和血液中辅助性T细胞（Th）、CD8+T细胞、自然杀伤细胞（NK）及自然杀伤T细胞（NKT）的数量;（2）使失调的细胞因子水平趋于正常;（3）抑制B淋巴细胞的产生;（4）维持宿主免疫系统的平衡。
王晶[7]（2019）在《柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用》文中研究指明鸡球虫病由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道引起,其所属的顶复门寄生虫可引起许多动物的肠道球虫病,其中7种艾美耳属球虫特异性感染家禽后,定植于肠道特定部位黏膜上皮细胞形成病灶,引起吸收不良或出血性肠炎,对家禽养殖业危害严重。多年来科研人员先后研制出大量抗球虫药物应用于临床治疗,但由于出现耐药虫株及药物残留引发的食品安全问题,免疫预防已成为当前研究热点。本试验将来自不同地域的野毒株柔嫩艾美耳球虫（山东株、吉林株、黑龙江株）用单孢子囊接种技术进行杂交,利用RAPD技术进行多态性分析,筛选出杂交株F2,再对杂交株F2代卵囊进行物理和化学两种方法致弱并进行抗球虫效果检测,具体内容如下:杂交虫株的培育:将山东株（S）与吉林株（J）柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊通过单卵囊技术接种雏鸡,收获卵囊后提取基因组DNA,利用RAPD技术对16个山东株与吉林株杂交后代的单孢子囊扩增产物进行了分析。在分析中发现1株单孢子囊扩增产物的RAPD谱带与其它株和亲本株都不同,此虫株与两亲本株间的相似值为0.83480.8340,远远小于子代株与亲本株平均相似值0.9604,又远远大于株间相似值的平均值0.6627。因此该虫株为山东株与吉林株的杂交虫株（杂交一代,F1）。获得的杂交F1进一步与黑龙江株进行杂交（杂交二代,F2）,并用RAPD方法对14个杂交后代单孢子囊扩增产物进行分析,找到了1株与亲本株相似性为0.83570.8354的虫株,确定其为杂交株F2。杂交株F2致弱及抗球虫效果检测:将柔嫩艾美耳球虫卵囊进行物理和化学两种方法致弱,物理方法采用超声波细胞破碎仪处理孢子化卵囊,超声条件为功率200W致弱10min,化学方法采用含有叠氮钠的化学致弱剂与孢子化卵囊混合,置于4℃冰箱致弱40d。免疫后根据雏鸡存活率、体重变化、粪便计分、粪便中卵囊计数、盲肠病变计分、血液中抗体OD值变化对免疫效果进行评价。试验表明,超声波致弱柔嫩艾美耳球虫杂交株F2卵囊10min可完全破碎球虫卵囊但使其仍保持良好的免疫原性,在7日龄和14日龄时对雏鸡免疫4×103个卵囊,攻虫后7d雏鸡平均增重达89.01g,与对照组每只鸡平均增重21.31g相比差异极显着（p<0.01）,攻虫存活率达100%。在7日龄和14日龄时给雏鸡灌服化学致弱的球虫卵囊8×103个,21日龄攻虫,攻虫后7d雏鸡平均增重达90.61g,与对照组相比差异极显着（p<0.01）,攻虫存活率也达100%。其他指标也说明免疫效果较好,在二次免疫后7d,使用间接ELISA法可以在血清中检测到抗体。因此,在一定功率下超声处理杂交株F2卵囊和使用化学致弱剂致弱F2株卵囊,能使其毒力降低并保持良好的免疫原性,可作为疫苗使用。确定雏鸡最佳免疫时间为7日龄和14日龄,确定最佳免疫剂量为超声波致弱的卵囊每个雏鸡4×103个,化学致弱剂致弱的卵囊每个雏鸡8×103个。将这两种方法致弱的卵囊初步制成弱毒苗,使用饮水投苗和饲料投苗两种方法,投放到长春吉星实业有限公司、吉林德翔牧业有限公司、正大集团德大有限公司的四个养鸡场,共免疫了88万只雏鸡,据合作公司统计,增加了一定经济效益,减少了球虫病造成的损失。
谢雨翔[8]（2017）在《柔嫩艾美耳球虫耐药株与敏感株差异基因筛选及膜骨架蛋白1的初步研究》文中认为柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是一种单细胞胞内寄生虫,也是严重危害养鸡业的重要病原之一。目前对于球虫病的防治,仍主要依靠于药物。球虫病防治药物主要分为两大类:离子载体类抗生素和化学合成药物,马杜拉霉素（Maduramycin）和地克珠利（Diclazuril）是这两类药物中比较具有代表性的药物。在长期用药物控制球虫病的同时,球虫极易对药物产生耐药性,为球虫病的防治带来了困境。为了能揭开球虫耐药性神秘的面纱,实验室前期通过药物诱导获得了马杜拉霉素耐药株和地克珠利耐药株。为了探索球虫的耐药机制,本文利用RNA-seq方法比较了柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株和地克珠利耐药株与敏感株的差异,筛选出差异基因,分析了差异基因的相关功能,对差异表达基因膜骨架蛋白1（IMC1）的特性进行了初步研究,为深入研究球虫的耐药机制奠定了一定基础。1.柔嫩艾美耳球虫2个耐药株的耐药性检测为确定实验室长期保存的柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株和地克珠利耐药株的遗传稳定性,采用鸡体试验法,以抗球虫指数（ACI）、最适抗球虫活性百分率（POAA）、病变记分减少率（RLS）和相对卵囊产量（ROP）4项指标,评价2个耐药株对地克珠利、癸氧喹酯（Decoquinate）、马杜拉霉素等3种抗球虫药物的耐药性,并以柔嫩艾美耳球虫敏感株为对照。结果显示,敏感株对3种抗球虫药物均无耐药性,4项指标全部阴性。马杜拉霉素耐药株对马杜拉霉素为完全耐药,4项指标全部阳性。地克珠利耐药株对地克珠利为完全耐药,4项指标全部阳性。结果表明,在实验室已繁殖保存10余年的柔嫩艾美耳球虫2个耐药虫株对其诱导药物具有完全耐药性,实验室保种繁殖方法可行,虫株遗传稳定性良好,为利用该虫株进行球虫耐药性相关研究奠定了基础。2.基于RNA-seq方法进行柔嫩艾美耳球虫耐药株与敏感株差异基因的筛选利用RNA-seq方法筛选柔嫩艾美耳球虫2个耐药株与敏感株之间的差异基因,对耐药株与敏感株孢子化卵囊进行转录组测序与分析,筛选差异基因,与柔嫩艾美耳球虫基因组数据库进行比对,进行差异基因的功能分类。结果显示,地克珠利耐药株与敏感株相比,上调基因330个,下调基因49个。马杜拉霉素耐药株与敏感株相比,上调基因672,下调基因398个。马杜拉霉素耐药株与地克珠利耐药株相比,上调基因8个,下调基因20个。这些差异基因的生物学功能主要集中为参与代谢过程、生物调节、细胞形成、运输过程、生物合成、基因表达等,研究结果为探讨球虫耐药性产生的分子机制打下了坚实的基础。3.柔嫩艾美耳球虫膜骨架蛋白1基因功能特性的初步研究根据柔嫩艾美耳球虫耐药株与敏感株转录组分析比较结果,选取耐药株与敏感株的差异表达下调基因膜骨架蛋白1（IMC1）,利用RT-PCR扩增技术,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板克隆IMC1,经过PCR和酶切鉴定正确后测序,将测序正确的序列连接到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-EtIMC1,并在大肠杆菌BL21中诱导表达,获得重组蛋白rEt IMC1,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用RT-q PCR和Western-blot检测EtIMC1在耐药株和敏感株中的转录水平和表达水平。结果显示,EtIMC1在地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株中的转录水平显着低于敏感株,蛋白在耐药株中为低表达,转录与表达水平趋势一致。间接免疫荧光检测发现该蛋白位于虫体表面,体外抑制试验结果显示用抗rEtIMC1多克隆抗体孵育后的子孢子入侵DF-1细胞,其入侵率比对照组下降80%。研究结果提示,EtIMC1的低表达可能有助于在药物作用前期帮助球虫逃避药物的损害,以及提高对药物损害的抵抗能力,同时Et IMC1可能在子孢子入侵宿主细胞过程中发挥了重要作用。本研究为阐明球虫耐药性产生的分子机理提供了一定基础。
李莎,董辉,黄兵[9]（2015）在《寄生虫潜在药物靶标—乳酸脱氢酶》文中进行了进一步梳理寄生虫是包括原虫、吸虫、绦虫、线虫、棘头虫等在内的一大类生物的总称,可引起重要的人畜寄生虫病。抗寄生虫药物的长期使用甚至是滥用使得寄生虫对现有药物产生了明显的抗药性,急需开发新型药物以有效控制寄生虫感染。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）是糖酵解途径的末端酶,在还原型辅酶Ⅰ（NADH）和氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）的辅助下,催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应,释放能量供寄生虫所需。本文针对抗寄生虫药物靶标的鉴定方法以及寄生虫LDH作为潜在药物靶标的研究进展进行了综述,对阐明药物的分子作用机理及研发新药具有重要的理论意义。
周飞亚[10]（2015）在《安徽三株柔嫩艾美耳球虫的耐药性分析》文中研究指明鸡球虫病（Coccidiosis）是严重危害养鸡业的一种肠道寄生虫病,其中致病性最强、危害最大的是柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）。为了检测安徽省庐江县、青阳县和肥西县三个地区E.tenella的耐药性情况,分别采集庐江县、青阳县和肥西县三个地区的养鸡场球虫病患病鸡的盲肠内容物并培养,通过分离单卵囊进行分离纯化,根据卵囊的生物学特性和分子生物学技术进行纯种E.tenella卵囊的鉴定,为耐药性的检测奠定基础。本研究根据对庐江县、青阳县和肥西县三个地区进行调查,最终选定三个地区均经常使用的五种抗球虫药物作为检测药物,即磺胺氯吡嗪钠（Sulfachloropyrazine sodium）、地克珠利（Diclazuril）、妥曲珠利（Toltrazuril）、氨丙啉（Amprolium）以及氯羟吡啶（Clopidol）。分别采用抗球虫指数（ACI）、相对盲肠卵囊产量（ROP）、病变记分减少率（RLS）和最适抗球虫活性百分率（POAA）四项指标进行综合耐药性判定;通过同工酶电泳分别获得上海标准株、南京标准株、各药物的耐药虫株和三个地理株的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）乳酸脱氢酶（LDH）、以及葡萄糖磷酸异构酶（GPI）的同工酶谱,通过比较酶谱间的差异进行耐药性分析;利用随机扩增多态性DNA（RAPD）的方法扩增上海标准株、南京标准株和三个地理株的基因,根据DNA条带的相似性与差异性观察耐药性的产生情况以及遗传变异情况。根据耐药性的检测结果,结合莫能霉素（Monensin）、尼卡巴嗪（Nicarbazin）和球虫酯（乙氧酰胺苯甲酯）（Ethopabate）的作用机制与作用峰期的特点,采用莫能霉素+尼卡巴嗪+球虫酯配合用药,以抗球虫指数、相对盲肠卵囊产量、病变记分减少率和最适抗球虫活性百分率四项指标综合判定疗效,筛选最佳的药物浓度。结果显示:利用琼脂小块分离球虫单卵囊的技术简单可靠,成功率高,分离后的卵囊经分子生物学技术和生物学特性鉴定均为纯种E.tenella,分别命名为庐江株、青阳株和肥西株;鸡体试验法检测可知庐江株球虫对妥曲珠利与氨丙啉敏感,对氯羟吡啶中度耐药,对地克珠利与磺胺氯吡嗪钠完全耐药;青阳株球虫对地克珠利与妥曲珠利敏感,对磺胺氯吡嗪钠与氯羟吡啶完全耐药,对氨丙啉中度耐药;肥西株球虫对磺胺氯吡嗪钠敏感,对地克珠利、氯羟吡啶和氨丙啉完全耐药,对妥曲珠利中度耐药;E.tenella上海标准株与南京标准株的均只含有一条LDH-2酶带,氨丙啉耐药株有一条特征性的LDH-3酶带,磺胺氯吡嗪钠耐药株与氯羟吡啶耐药株有一条不同于标准株的LDH-2酶带,地克珠利耐药株和妥曲珠利耐药株酶带与标准株的酶谱一致,三个地理株与耐药株有交叉条带,与鸡体试验检测结果相符;磺胺氯吡嗪钠耐药株与标准株含有GPI-1与GPI-2酶带,其余耐药株均有不同于标准株的特征性GPI同工酶带,庐江株与肥西株都与耐药株有交叉的GPI同工酶带,与鸡体试验检测结果一致,但是青阳株有一条不同于其他耐药株的GPI-5酶带,可能与青阳株球虫耐受其他抗球虫药物有关;G6PD同工酶检测中,标准株、磺胺氯吡嗪钠耐药株以及地克珠利耐药株均只含有G6PD-1一条酶带,因此不能通过G6PD同工酶判断球虫是否对这两种药物耐药,妥曲珠利耐药株、氯羟吡啶耐药株和氨丙啉耐药株都不同于标准株的G6PD同工酶谱,三个地理株的G6PD同工酶谱与耐药株有交叉,与鸡体试验检测结果一致,但青阳株有一条特有的G6PD-4酶带;RAPD分析结果中,各虫株之间的DNA条带不尽相同,相似值位于48.00%72.00%之间,上海标准株与南京标准株之间的相似值最高,为72.0%,三个地理株与两个标准株之间的相似值处于较低水平,表明球虫耐药后发生了基因变异;莫能霉素110mg.kg-1+尼卡巴嗪125 mg.kg-1+球虫酯8 mg.kg-1治疗三个地区的E.tenella混合虫株,ACI为181.21,属于高效抗球虫药,能够有效解决庐江县、青阳县和肥西县三个地区的鸡E.tenella的耐药问题。
二、柔嫩艾美耳球虫Diclazuril抗性株与Clopidol抗性株的实验室诱导（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、柔嫩艾美耳球虫Diclazuril抗性株与Clopidol抗性株的实验室诱导（论文提纲范文）
（1）我国鸡球虫抗药性现状和抗药机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 我国鸡球虫抗药性现状 |
| 1.1 文献检索与筛选 |
| 1.2 我国各地区鸡球虫抗药性现状 |
| 1.2.1 华东地区： |
| 1.2.2 华南地区： |
| 1.2.3 西南地区： |
| 1.2.4 西北地区： |
| 1.2.5 东北地区： |
| 1.2.6 华北地区： |
| 1.2.7 华中地区： |
| 2 球虫抗药性机制研究 |
| 2.1 抗药虫株的获得 |
| 2.2 常见抗球虫药物抗药机制研究 |
| 2.2.1 聚醚离子载体类药物： |
| 2.2.2 三嗪类： |
| 2.2.3 磺胺类药物： |
| 2.2.4 癸氧喹酯和氯羟吡啶： |
| 3 结论及展望 |
（2）基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗球虫药 |
| 1.1.1 聚醚离子载体类抗球虫药 |
| 1.1.2 化学合成类抗球虫药 |
| 1.2 鸡球虫耐药性产生的原因 |
| 1.2.1 遗传因素 |
| 1.2.2 药物选择压力 |
| 1.2.3 生物学因素 |
| 1.3 鸡球虫耐药性的研究现状 |
| 1.4 其他顶复门原虫耐药性的研究现状 |
| 1.5 全基因组重测序 |
| 1.6 选择性清除 |
| 1.7 展望 |
| 第二章 全基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药相关基因 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 试验药物 |
| 2.2.4 实验试剂 |
| 2.2.5 实验仪器 |
| 2.2.6 子孢子的收集与纯化 |
| 2.2.7 基因组重测序 |
| 2.2.8 选择性清除分析结果与转录组测序结果的关联分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 虫体的收集与纯化 |
| 2.3.2 DNA的提取检测 |
| 2.3.3 质控结果 |
| 2.3.4 样品与参考基因组比对结果 |
| 2.3.5 基于Hp&Fst的选择消除分析结果 |
| 2.3.6 候选基因SNP位点的分布 |
| 2.3.7 基因功能富集分析 |
| 2.3.8 与转录组的关联分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 3 个耐药相关基因的克隆和生物信息学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物和实验虫株 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 试验仪器 |
| 3.2.4 敏感株孢子化卵囊的收集与纯化 |
| 3.2.5 cDNA第一链模板的制备 |
| 3.2.6 基因克隆 |
| 3.2.7 生物信息学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因的克隆 |
| 3.3.2 生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 3个耐药相关基因功能特性的初步分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物与细胞 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 实验虫株的收集与纯化 |
| 4.2.6 cDNA模板的制备 |
| 4.2.7 重组表达质粒的构建 |
| 4.2.8 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.2.9 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.10 重组蛋白的反应原性分析 |
| 4.2.11 多克隆抗体的制备 |
| 4.2.12 实时荧光定量PCR |
| 4.2.13 间接免疫荧光定位 |
| 4.2.14 体外抑制实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组表达质粒的构建 |
| 4.3.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.3.3 重组蛋白的纯化 |
| 4.3.4 重组蛋白的反应原性分析 |
| 4.3.5 3个基因在DS不同发育阶段的mRNA转录水平 |
| 4.3.6 三个蛋白在DS虫体上的定位分析 |
| 4.3.7 三个多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验 |
| 4.3.8 3个基因在不同耐药株和敏感株的转录水平分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的诱导及耐药相关基因特性的初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 耐药性的定义 |
| 1.2 耐药性的类型 |
| 1.2.1 交叉耐药性 |
| 1.2.2 多重耐药性 |
| 1.3 实验室耐药虫株的诱导 |
| 1.4 耐药性检测的方法 |
| 1.4.1 鸡体检测法 |
| 1.4.2 同工酶分析法 |
| 1.4.3 超微结构的比较法 |
| 1.4.4 PCR技术测定法 |
| 1.5 抗球虫药物作用机理及其耐药性 |
| 1.5.1 离子载体类抗生素及其耐药机理 |
| 1.5.2 磺胺类抗球虫药物的耐药性 |
| 1.5.3 喹啉类抗球虫药物耐药性 |
| 1.5.4 抗硫胺素类抗球虫药物耐药性 |
| 1.5.5 吡啶类抗球虫药物的耐药性 |
| 1.5.6 三嗪类抗球虫药物及其耐药性 |
| 1.6 控制鸡球虫耐药性产生的策略 |
| 1.6.1 控制球虫的传播 |
| 1.6.2 合理的用药方案 |
| 1.6.3 综合治疗 |
| 1.6.4 定期检测耐药性 |
| 1.7 展望 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的实验室诱导 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 试验虫株 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.2.5 试验药物 |
| 2.2.6 柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的实验室诱导 |
| 2.2.7 透射电子显微镜观察盐霉素耐药株与敏感株子孢子和第二代裂殖子的超微结构 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的诱导 |
| 2.3.2 诱导虫株的耐药性检测 |
| 2.3.3 透射电子显微镜观察敏感株与耐药株的超微结构 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 柔嫩艾美耳球虫敏感株与盐霉素耐药株差异基因的筛选与验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验虫株 |
| 3.2.3 实验药物 |
| 3.2.4 实验试剂 |
| 3.2.5 实验仪器 |
| 3.2.6 敏感株与盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子的收集与纯化 |
| 3.2.7 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子转录组测序 |
| 3.2.8 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子差异表达基因的验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子总RNA的提取 |
| 3.3.2 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子测序数据生物信息分析 |
| 3.3.3 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子差异基因的筛选 |
| 3.3.4 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子差异基因的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 现场鸡球虫感染现状和耐药程度调查及盐霉素田间耐药株的分离 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 试验药物 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 田间株粪便样品的收集及繁殖 |
| 4.2.6 形态学鉴定田间株球虫种类 |
| 4.2.7 多重PCR鉴定球虫种类 |
| 4.2.8 药敏试验验证田间株耐药性 |
| 4.2.9 抗盐霉素田间株单卵囊的分离 |
| 4.2.10 qPCR分析差异表达基因在田间分离株的转录水平 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 形态学鉴定田间株球虫种类 |
| 4.3.2 多重PCR鉴定球虫种类 |
| 4.3.3 药敏试验验证田间株耐药性 |
| 4.3.4 单卵囊分离田间盐霉素耐药株 |
| 4.3.5 差异表达基因在单卵囊分离株和田间混合种转录水平的分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 3个耐药相关基因功能特性初步研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验虫株、原核表达载体及细胞 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 实验仪器 |
| 5.2.5 敏感株孢子化卵囊的收集与纯化 |
| 5.2.6 敏感株孢子化卵囊总RNA的提取与c DNA的合成 |
| 5.2.7 耐药基因的扩增 |
| 5.2.8 基因的生物信息学分析 |
| 5.2.9 重组表达质粒的构建 |
| 5.2.10 重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 5.2.11 重组蛋白反应原性分析 |
| 5.2.12 抗重组蛋白多克隆抗体的制备 |
| 5.2.13 耐药基因在不同发育阶段和不同耐药株的转录水平分析 |
| 5.2.14 耐药基因在不同发育阶段和不同耐药株的翻译水平分析 |
| 5.2.15 耐药相关蛋白在子孢子入侵DF-1细胞后的定位 |
| 5.2.16 田间盐霉素耐药株和地克珠利耐药株对耐药基因进行验证 |
| 5.2.17 多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验 |
| 5.2.18 柠檬酸合酶对体外培养鸡巨噬细胞功能的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 敏感株孢子化卵囊的总RNA提取 |
| 5.3.2 耐药基因的克隆 |
| 5.3.3 基因的生物信息学分析 |
| 5.3.4 重组表达质粒的构建 |
| 5.3.5 重组蛋白的表达与纯化 |
| 5.3.6 重组蛋白的反应原性分析 |
| 5.3.7 三个基因在不同发育阶段的转录水平及翻译水平分析 |
| 5.3.8 三个基因在不同耐药株中的转录和翻译水平分析 |
| 5.3.9 三个基因在田间分离株的mRNA转录水平分析 |
| 5.3.10 三个蛋白在子孢子入侵DF-1细胞后的定位分析 |
| 5.3.11 多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验 |
| 5.3.12 柠檬酸合酶对体外培养鸡巨噬细胞功能的影响 |
| 5.3.13 r Et CS对一氧化氮(NO)生成量的测定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）鸡球虫耐药性研究进展（论文提纲范文）
| 1 鸡球虫耐药性研究概况 |
| 2 鸡球虫耐药性检测方法 |
| 2.1 笼饲试验 |
| 2.2 细胞检测 |
| 3 耐药虫株的实验室诱导 |
| 4 常见抗球虫药物耐药机制研究 |
| 4.1 聚醚离子载体类药物 |
| 4.2 磺胺类药物 |
| 4.3 癸氧喹酯 |
| 4.4 氯羟吡啶 |
| 4.5 氨丙啉 |
| 4.6 三嗪类 |
| 5 展望 |
（5）自噬对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵活性及抗药性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 养鸡业发展对人类生活具有重要意义 |
| 1.1.1.1 全球养鸡业发展概况 |
| 1.1.1.2 养鸡业面临的巨大挑战 |
| 1.1.2 鸡球虫病对养鸡业发展造成巨大危害 |
| 1.1.2.1 鸡球虫病概况 |
| 1.1.2.2 鸡球虫病综合防控技术的研究进展 |
| 1.1.2.3 鸡球虫病新型防控策略的研究进展 |
| 1.1.2.4 当前防控鸡球虫病面临的挑战 |
| 1.1.3 自噬研究为鸡球虫病防控带来新的思路 |
| 1.1.3.1 自噬的概述 |
| 1.1.3.2 顶复门原虫自噬机制的研究进展 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.1.1 E.tenella自噬标记蛋白EtATG8 的克隆表达及功能鉴定 |
| 1.3.1.2 E.tenella子孢子自噬的诱导、调节和检测 |
| 1.3.1.3 自噬对E.tenella子孢子入侵活性的作用机制研究 |
| 1.3.1.4 自噬在E.tenella对莫能霉素抗药性形成中的作用研究 |
| 1.3.2 技术路线 |
| 第二章 E.tenella自噬标记蛋白ATG8 的克隆表达及功能鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物和饲料 |
| 2.2.2 虫株、菌株和载体 |
| 2.2.3 主要试剂耗材 |
| 2.2.4 抗体 |
| 2.2.5 溶液配制 |
| 2.2.6 主要仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 虫体收集与纯化 |
| 2.3.2 RNA提取和RT-PCR扩增 |
| 2.3.3 克隆、测序和生物信息学分析 |
| 2.3.4 EtATG8重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.5 抗rEtATG8 多克隆抗体的制备 |
| 2.3.6 Etatg8在E.tenella四个发育阶段的转录水平分析 |
| 2.3.7 EtATG8在E.tenella四个发育阶段的表达水平分析 |
| 2.3.8 间接免疫荧光试验 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 Etatg8的克隆与序列分析 |
| 2.4.2 rEtATG8 蛋白的表达纯化 |
| 2.4.3 Anti-r EtATG8 多克隆抗体的制备 |
| 2.4.4 Etatg8在E.tenella四个发育阶段的转录水平 |
| 2.4.5 EtATG8在E.tenella四个发育阶段的表达水平 |
| 2.4.6 EtATG8在E.tenella子孢子和裂殖子的亚细胞定位 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 E.tenella子孢子自噬体的诱导、调节和检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 虫株 |
| 3.2.2 主要试剂耗材 |
| 3.2.3 抗体 |
| 3.2.4 溶液配制 |
| 3.2.5 主要仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 子孢子的制备 |
| 3.3.2 饥饿诱导E.tenella子孢子自噬模型的建立 |
| 3.3.3 自噬调节剂的筛选 |
| 3.3.4 E.tenella子孢子自噬的调节 |
| 3.3.5 自噬标记蛋白EtATG8 表达水平的WB检测 |
| 3.3.6 E.tenella子孢子自噬的IFA检测 |
| 3.3.7 E.tenella子孢子自噬的电镜观察 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 饥饿诱导E.tenella子孢子自噬模型的确定 |
| 3.4.2 自噬调节剂的浓度确定 |
| 3.4.3 自噬的饥饿诱导结果 |
| 3.4.4 自噬调节剂对E.tenella子孢子自噬的调节作用 |
| 3.4.5 E.tenella子孢子自噬体的电镜观察结果 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 自噬对E.tenella子孢子入侵活性的作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 虫株 |
| 4.2.2 主要试剂耗材 |
| 4.2.3 抗体 |
| 4.2.4 溶液配制 |
| 4.2.5 主要仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 子孢子的制备 |
| 4.3.2 饥饿诱导与自噬调节 |
| 4.3.3 ATP水平与存活率的监测 |
| 4.3.4 自噬对子孢子入侵活性的影响研究 |
| 4.3.5 数据统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 自噬对E.tenella子孢子活性的影响 |
| 4.4.2 自噬对E.tenella子孢子能量的影响 |
| 4.4.3 自噬对球虫入侵活性的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 自噬在E.tenella对莫能霉素抗药性形成中的作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物和饲料 |
| 5.2.2 虫株、菌株和载体 |
| 5.2.3 主要试剂耗材 |
| 5.2.4 抗体 |
| 5.2.5 溶液配制 |
| 5.2.6 主要仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 抗药虫株Mon-R GZ strain的诱导 |
| 5.3.1.1 诱导方法 |
| 5.3.1.2 单卵囊扩增传代 |
| 5.3.1.3 抗药性检测 |
| 5.3.2 子孢子制备 |
| 5.3.3 子孢子存活率监测 |
| 5.3.4 免疫印迹分析 |
| 5.3.5 间接免疫荧光试验 |
| 5.3.6 透射电镜观察 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 抗药虫株Mon-R GZ strain的诱导结果 |
| 5.4.2 子孢子存活率 |
| 5.4.3 免疫印迹检测结果 |
| 5.4.4 间接免疫荧光观察结果 |
| 5.4.5 透射电镜观察结果 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文讨论与总结 |
| 6.1 全文讨论 |
| 6.1.1 E.tenella自噬标记蛋白EtATG8 的克隆表达与功能鉴定 |
| 6.1.2 E.tenella子孢子在饥饿及自噬调节剂条件下的自噬调节与检测 |
| 6.1.3 自噬对E.tenella子孢子入侵活性的影响 |
| 6.1.4 莫能霉素诱导E.tenella产生自噬介导的球虫抗药性机制 |
| 6.2 全文总结 |
| 6.3 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（6）双氢青蒿素对感染弓形虫及疟原虫小鼠免疫调节作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 青蒿素及其衍生物的历史渊源 |
| 1.1.1 青蒿素 |
| 1.1.2 青蒿素衍生物 |
| 1.1.3 青蒿素的抗疟历史渊源 |
| 1.2 青蒿素及其衍生物抗寄生虫方面的研究进展 |
| 1.2.1 抗日本血吸虫的作用 |
| 1.2.2 抗弓形虫作用 |
| 1.2.3 抗肺孢子虫作用 |
| 1.2.4 抗利什曼原虫作用 |
| 1.2.5 抗球虫作用 |
| 1.2.6 抗锥虫作用 |
| 1.3 青蒿素及其衍生物的抗炎作用 |
| 1.4 青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用 |
| 1.5 青蒿素及其衍生物的免疫调节作用 |
| 1.6 脾脏的结构与功能 |
| 1.6.1 脾脏的结构 |
| 1.6.2 脾脏与寄生虫 |
| 1.7 寄生虫感染后细胞因子的变化 |
| 1.7.1 细胞因子与弓形虫感染 |
| 1.7.2 细胞因子与疟原虫感染 |
| 第二章 双氢青蒿素对健康小鼠的免疫调节作用 |
| 2.1 双氢青蒿素对健康小鼠免疫细胞的调节作用 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试验试剂 |
| 2.1.3 试验用主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 试验方法 |
| 2.1.5 样品的采集 |
| 2.1.6 外周血单细胞的获得 |
| 2.1.7 脾脏单细胞的获得 |
| 2.1.8 结果与分析 |
| 2.1.9 讨论 |
| 2.2 双氢青蒿素对健康小鼠血清中细胞因子的调节作用 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 主要试验试剂 |
| 2.2.3 试验用主要仪器与耗材 |
| 2.2.4 试验方法 |
| 2.2.5 血清的采集与分离 |
| 2.2.6 细胞因子的检测 |
| 2.2.7 结果与分析 |
| 2.2.8 讨论 |
| 第三章 双氢青蒿素对感染弓形虫小鼠的免疫调节作用 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 试验所用药物 |
| 3.1.3 DHA的准备和药物的施用 |
| 3.1.4 主要试验试剂 |
| 3.1.5 试验用主要仪器与耗材 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 DHA对感染弓形虫小鼠免疫调节作用试验设计 |
| 3.2.2 样品的采集 |
| 3.2.3 外周血单细胞的获得 |
| 3.2.4 脾脏单细胞的获得 |
| 3.2.5 细胞因子的检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 DHA抑制了感染弓形虫小鼠的脾脏指数,下调了脾脏中B细胞的数量,并且上调了脾脏中Th细胞及CD8~+T细胞的数量 |
| 3.3.2 DHA促进了血液中Th细胞及CD8~+T 细胞的产生,但抑制了感染弓形虫小鼠血液中的B细胞数量 |
| 3.3.3 DHA抑制了感染弓形虫小鼠血清中的促炎细胞因子的数量 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 双氢青蒿素对感染疟原虫小鼠的免疫调节作用 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 试验所用药物 |
| 4.1.3 DHA的准备和药物的施用 |
| 4.1.4 主要试验试剂 |
| 4.1.5 试验用主要仪器与耗材 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 DHA对感染疟原虫小鼠的免疫调节作用试验设计 |
| 4.2.2 样品的采集 |
| 4.2.3 外周血单细胞的获得 |
| 4.2.4 脾脏单细胞的获得 |
| 4.2.5 细胞因子的检测 |
| 4.2.6 生物软件和分析工具 |
| 4.2.7 统计学处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 DHA抑制了感染伯氏疟原虫小鼠的脾脏过度肿大,上调了脾脏中的CD8~+T细胞,NK细胞和NKT细胞的数量 |
| 4.3.2 DHA促进了伯氏疟原虫感染小鼠中血液Th,NK和 NKT细胞的产生 |
| 4.3.3 DHA抑制了感染伯氏疟原虫小鼠血清中的促炎细胞因子的数量 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
（7）柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫病概述 |
| 1.1 鸡球虫分类 |
| 1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.3 柔嫩艾美耳球虫发育过程 |
| 1.4 鸡感染球虫后的发病机制 |
| 1.5 柔嫩艾美耳球虫病变特点 |
| 1.6 展望 |
| 第二章 鸡球虫病活疫苗的研究进展 |
| 2.1 强毒苗的研制 |
| 2.2 弱毒苗的研制 |
| 2.3 鸡对球虫的免疫应答 |
| 2.4 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫不同地理株杂交株制备 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 实验动物及饲养 |
| 1.2.2 虫株复壮 |
| 1.2.3 卵囊分离 |
| 1.2.4 卵囊孢子化 |
| 1.2.5 孢子化卵囊的灭菌和纯化 |
| 1.2.6 孢子囊的制备 |
| 1.2.7 单孢子囊胶囊制备及扩增 |
| 1.2.8 柔嫩艾美耳球虫DNA的提取 |
| 1.2.9 选择引物 |
| 1.2.10 PCR反应条件 |
| 1.2.11 数据分析 |
| 1.2.12 虫株的培育及鉴定 |
| 1.2.12.1 杂交F1 虫株的培育 |
| 1.2.12.2 杂交F1 虫株的鉴定 |
| 1.2.12.3 杂交F2 虫株的培育 |
| 1.2.12.4 杂交F2 虫株的鉴定 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 杂交虫株F1 的培育结果 |
| 1.3.2 杂交虫株F2 的培育 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫杂交株F2致弱方法及抗球虫效果检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 免疫保护效果评价指标 |
| 2.2.1.1 测量体重 |
| 2.2.1.2 存活率 |
| 2.2.1.3 血便计分 |
| 2.2.1.4 麦克马斯特法检测粪便中卵囊数(OPG) |
| 2.2.1.5 盲肠病变计分 |
| 2.2.2 超声波致弱卵囊方法 |
| 2.2.3 化学致弱剂的配制及致弱方法 |
| 2.2.4 动物试验免疫程序设计 |
| 2.2.5 ELISA检测雏鸡抗体水平 |
| 2.2.6 卵囊抗原制备 |
| 2.2.7 间接ELISA最佳反应条件的选择 |
| 2.2.8 间接ELISA实验步骤 |
| 2.2.9 数据处理 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 体重变化 |
| 2.3.2 攻虫7d存活率 |
| 2.3.3 血便计分 |
| 2.3.4 攻虫后第7d卵囊数OPG |
| 2.3.5 盲肠病变计分 |
| 2.3.6 血清抗体OD值 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 弱毒苗试验推广 |
| 3.1 试验方法 |
| 3.1.1 计算雏鸡每日饮水和饲料量 |
| 3.1.2 计算免疫剂量 |
| 3.1.3 弱毒苗的使用方法 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 疫苗特性 |
| 3.3.2 投苗方法比较 |
| 3.3.3 弱毒苗免疫效果比较 |
| 3.3.4 经济效益分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）柔嫩艾美耳球虫耐药株与敏感株差异基因筛选及膜骨架蛋白1的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 抗球虫药作用机制 |
| 1.1.1 干扰虫体生物膜离子转运的药物 |
| 1.1.2 影响辅酶吸收和合成的药物 |
| 1.1.3 抑制虫体线粒体功能的药物 |
| 1.1.4 作用于虫体类质体的药物 |
| 1.1.5 抑制核酸合成的药物 |
| 1.2 耐药虫株的形成与鉴别 |
| 1.2.1 自发突变个体重复选择的结果 |
| 1.2.2 药物的选择压力 |
| 1.2.3 鉴别方法 |
| 1.3 耐药性产生的机制 |
| 1.3.1 细胞与亚细胞水平 |
| 1.3.2 代谢水平 |
| 1.3.3 分子水平 |
| 1.4 耐药性的延缓或解决措施 |
| 1.4.1 合理用药 |
| 1.4.2 新药研制 |
| 1.4.3 营养添加剂的抗球虫作用 |
| 1.4.4 中草药的开发 |
| 1.4.5 疫苗的作用 |
| 1.5 展望 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫2个耐药株的耐药性评估 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 饲料 |
| 2.2.3 试验药物 |
| 2.2.4 球虫来源 |
| 2.2.5 试验分组 |
| 2.2.6 试验步骤 |
| 2.2.7 耐药性判定方法及标准 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 马杜拉霉素耐药株的测定 |
| 2.3.2 地克珠利耐药株的测定 |
| 2.3.3 敏感株球虫的测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 基于RNA-Seq的耐药株与敏感株的差异基因筛选及验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验虫株 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 主要实验所需仪器 |
| 3.2.5 3 个虫株3个不同批次孢子化卵囊的收集与纯化 |
| 3.2.6 3 个虫株各批次孢子化卵囊总RNA的抽提 |
| 3.2.7 cDNA文库的构建和Illumina HiSeq~(TM) 2000 测序 |
| 3.2.8 差异基因的验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 3 个虫株孢子化卵囊的转录组测序 |
| 3.3.2 差异基因的筛选 |
| 3.3.3 差异基因功能分类 |
| 3.3.8 差异基因的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 膜骨架蛋白1基因功能特性初步研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验虫株、原核表达载体和细胞 |
| 4.2.3 实验所需主要试剂 |
| 4.2.4 主要实验所需仪器 |
| 4.2.5 3 个不同虫株的收集与纯化 |
| 4.2.6 3 个虫株孢子化卵囊总RNA的抽提与cDNA的制备 |
| 4.2.7 EtIMC1的克隆与序列分析 |
| 4.2.8 重组蛋白EtIMC1的表达与纯化 |
| 4.2.9 EtIMC1重组蛋白多克隆抗体的制备 |
| 4.2.10 EtIMC1在3个虫株转录水平的差异分析 |
| 4.2.11 EtIMC1在3个虫株蛋白质翻译水平的差异分析 |
| 4.2.12 EtIMC1在柔嫩艾美耳球虫入侵DF-1 细胞不同发育阶段的分布与定位分析 |
| 4.2.13 兔抗rEtIMC1多克隆抗体对球虫子孢子入侵DF-1 细胞的体外抑制分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 DS、DZR、MRR孢子化卵囊总RNA的提取 |
| 4.3.2 EtIMC1基因的克隆和序列分析 |
| 4.3.3 rEtIMC1的诱导表达及其纯化 |
| 4.3.4 EtIMC1在3个虫株孢子化卵囊的转录水平差异分析 |
| 4.3.5 3 个虫株EtIMC1蛋白翻译水平的分析 |
| 4.3.6 EtIMC1天然蛋白的间接免疫荧光定位 |
| 4.3.7 兔抗rEtIMC1多克隆抗体对子孢子入侵DF-1 细胞的体外抑制实验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）寄生虫潜在药物靶标—乳酸脱氢酶（论文提纲范文）
| 1 抗寄生虫药物靶标的鉴定方法 |
| 1.1 基于药物作用前后寄生虫形态结构变化的方法 |
| 1.2 基于鉴定寄生虫抗药性基因的方法 |
| 1.3 基于寄生虫基因组学的方法 |
| 1.4 基于寄生虫蛋白质组学的方法 |
| 2 寄生虫LDH是潜在的药物靶标 |
| 2.1 原虫LDH |
| 2.1.1 疟原虫LDH |
| 2.1.2 弓形虫LDH |
| 2.1.3 球虫LDH |
| 2.2 吸虫LDH |
| 2.2.1 日本血吸虫LDH |
| 2.2.2 华支睾吸虫LDH |
| 2.2.3 殖盘殖盘吸虫LDH |
| 2.2.4 其他吸虫LDH |
| 2.3 绦虫LDH |
| 2.3.1 棘盘瑞利绦虫LDH |
| 2.3.2 猪囊尾蚴LDH |
| 2.3.3 亚洲带绦虫LDH |
| 2.3.4 细粒棘球绦虫LDH |
| 2.4 线虫LDH |
| 2.4.1 旋毛虫LDH |
| 2.4.2 捻转血毛线虫LDH |
| 2.4.3 球鞘毛首线虫LDH |
| 2.5 棘头虫LDH |
（10）安徽三株柔嫩艾美耳球虫的耐药性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 文献综述 |
| 1 鸡球虫病的防治现状 |
| 2 球虫耐药性现状 |
| 3 球虫的耐药机制 |
| 4 球虫耐药性的特点 |
| 5 耐药性的检测方法 |
| 6 耐药性的解决措施 |
| 引言 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验虫株 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试验用药物及批号 |
| 1.1.4 分子生物学试剂 |
| 1.1.5 一般化学试剂 |
| 1.1.6 主要仪器设备 |
| 1.1.7 主要溶液的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 E.tenella卵囊的分离与纯种虫株鉴定 |
| 1.2.2 鸡体试验 |
| 1.2.3 同工酶电泳分析 |
| 1.2.4 随机引物扩增多态性DNA分析 |
| 1.2.5 联合用药解决耐药性 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 E.tenella的卵囊分离与纯种株鉴定 |
| 2.1.1 E.tenella单卵囊的分离 |
| 2.1.2 纯种卵囊的生物学特性鉴定 |
| 2.1.3 感染鸡的临床症状与病理剖检 |
| 2.1.4 纯种卵囊的分子生物学方法鉴定 |
| 2.2 鸡体试验结果 |
| 2.2.1 试验组鸡的临床症状及病理变化 |
| 2.2.2 庐江株试验组各指标检测结果 |
| 2.2.3 青阳株试验组各指标检测结果 |
| 2.2.4 肥西株试验组各指标检测结果 |
| 2.3 同工酶电泳结果 |
| 2.3.1 乳酸脱氢酶电泳结果 |
| 2.3.2 葡萄糖磷酸异构酶电泳结果 |
| 2.3.3 葡萄糖6磷酸脱氢酶电泳结果 |
| 2.4 随机引物扩增多态性DNA分析 |
| 2.4.1 随机引物筛选结果 |
| 2.4.2 5株柔嫩艾美耳球虫扩增多态性分析 |
| 2.4.3 株间相似性分析 |
| 2.5 联合用药对混合虫株的疗效结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 E.tenella的卵囊分离与纯种株鉴定 |
| 3.2 鸡体试验 |
| 3.3 同工酶电泳分析 |
| 3.3.1 乳酸脱氢酶电泳结果分析 |
| 3.3.2 葡萄糖磷酸异构酶电泳结果分析 |
| 3.3.3 葡萄糖6磷酸脱氢酶电泳结果分析 |
| 3.4 随机引物扩增多态性DNA分析 |
| 3.5 联合用药解决耐药性 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 学术成果 |
四、柔嫩艾美耳球虫Diclazuril抗性株与Clopidol抗性株的实验室诱导（论文参考文献）
- [1]我国鸡球虫抗药性现状和抗药机制研究进展[J]. 李超,汤新明,吕艳丽,于咏兰,刘贤勇,索勋. 寄生虫与医学昆虫学报, 2021(02)
- [2]基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究[D]. 姚亚文. 中国农业科学院, 2021
- [3]柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的诱导及耐药相关基因特性的初步分析[D]. 王海霞. 中国农业科学院, 2020
- [4]鸡球虫耐药性研究进展[J]. 郝振凯,毕菲菲,韩贞艳,于咏兰,索勋,刘贤勇. 中国兽医杂志, 2019(06)
- [5]自噬对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵活性及抗药性的影响[D]. 戚南山. 华南农业大学, 2019
- [6]双氢青蒿素对感染弓形虫及疟原虫小鼠免疫调节作用的研究[D]. 张婷. 沈阳农业大学, 2019(03)
- [7]柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用[D]. 王晶. 吉林农业大学, 2019(03)
- [8]柔嫩艾美耳球虫耐药株与敏感株差异基因筛选及膜骨架蛋白1的初步研究[D]. 谢雨翔. 中国农业科学院, 2017(05)
- [9]寄生虫潜在药物靶标—乳酸脱氢酶[J]. 李莎,董辉,黄兵. 中国动物传染病学报, 2015(03)
- [10]安徽三株柔嫩艾美耳球虫的耐药性分析[D]. 周飞亚. 安徽农业大学, 2015(05)