一、硫酸链霉素滴鼻液的制备与疗效观察（论文文献综述）
洪天一[1]（2020）在《蝎黄解痉治哮颗粒影响NF-κB和HIF-1α信号传导通路治疗哮喘的调控机制》文中指出研究目的支气管哮喘是儿科常见的呼吸系统疾病,严重危害儿童的身体健康。且病情顽固难愈,病程迁延反复,如果未及时治疗,可伴随终身[1]。研究表明,气道慢性炎症是气道重塑的发生基础,而重塑则是气道炎症缓慢发展的必然结果,气道持续性的炎症反应以及损伤和修复,最终导致组织增生和气道狭窄[2-3]。核转录因子Kappa B（NF-κB）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）分别是炎症和缺氧反应中的关键转录因子,受上游的丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的调控,从而激活其下游的血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、转化生长因子β1（TGF-β1）等基因表达,在气道炎症反应[4-8]和气道重塑演进过程中[9-11]发挥重要作用。蝎黄解痉治哮颗粒为导师冯晓纯教授基于中医理论与前人总结经验的自拟方,全方由麻黄、全蝎、杏仁、白果、苦参、甘草等组成。以《摄生众妙方》中定喘汤为基础,加减化裁而来,加入祛风解痉的虫类药全蝎为理论基础,具有宣肺解痉、止咳平喘的功效。本课题文以NF-κB和HIF-1αα作为切入点,探讨蝎黄解痉治哮颗粒对MAPKs信号通路调节NF-κB和HIF-1αα的作用,阐述其缓解支气管哮喘气道炎症和气道重塑的机制,为今后中医药防治哮喘病的基础研究提供必要的理论与实验依据。研究方法实验一:建立急性哮喘小鼠模型,分为对照组、模型组、蝎黄解痉治哮颗粒高剂量组（XHG）、蝎黄解痉治哮颗粒低剂量组（XHD）和孟鲁司特组（Montelukast）。体内实验观察指标:（1）雾化激发时观察小鼠一般状态及行为学;（2）支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中细胞计数及细胞因子;（3）肺组织切片进行苏木精-伊红（haematoxylin and eosin,HE）染色、过碘酸雪夫（periodic acid-schiff,PAS）染色、Masson染色进行病理检查和比较结果;（4）通过免疫组化法检测肺组织中p-ERK 1/2、p-p38MAPK、p-JNK 和 Akt、p-NF-κBp65 蛋白表达,及其下游通路的 VEGF、MMP-9、TGF-β1蛋白表达。体外实验观察指标:（1）检测药物对16HBE（人支气管上皮细胞）细胞毒性实验;（2）免疫荧光法检测LPS诱导16HBE细胞中p-NF-KB p65表达,以及蝎黄解痉治哮颗粒的干预作用。实验二:建立哮喘气道重塑模型小鼠,分为对照组、模型组、蝎黄解痉治哮颗粒高剂量组（XHG）、蝎黄解痉治哮颗粒低剂量组（XHD）和孟鲁司特组（Montelukast）。体内实验观察指标:（1）支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中细胞计数及炎症细胞因子的变化;（2）肺组织切片进行苏木精-伊红（haematoxylin and eosin,HE）染色、过碘酸雪夫（periodic acid-schiff,PAS）染色、Masson染色进行病理检查和比较结果;（3）通过免疫组化法检测肺组织中p-ERK 1/2、p-p38、p-JNK、Akt和HIF-1α蛋白表达,及其下游通路的VEGF、MMP-9、TGF-p1蛋白表达,以及α-SMA蛋白表达;（4）免疫荧光法检测哮喘模型小鼠肺组织内α-SMA蛋白表达;（5）免疫蛋白印记法（Western Blot,WB）检测模型小鼠肺组织内α-SMA蛋白表达水平。体外实验观察指标:（1）检测药物对ASMC（气道平滑肌细胞）细胞毒性实验;（2）免疫荧光法检测LPS诱导RASMC细胞p-NF-κB p65蛋白表达,以及蝎黄解痉治哮颗粒的干预作用。研究结果实验—结果（1）OVA致敏小鼠出现哮喘发作表现。（2）实验结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠BALF中炎症细胞总数及分类细胞计数（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞）明显升高,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理后,炎症细胞数量及分类细胞计数明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。BALF中细胞因子检测结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1(β水平增加,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可显着降低哮喘小鼠BALF中TNF-αα、IL-6、IL-1β水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）HE染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠炎症细胞广泛浸润到气管及血管周围。经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理显着改善这种情况。PAS染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠气道周围杯状细胞增生明显,黏液分泌增加,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道杯状细胞增生及黏液分泌。Masson染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠肺气道上皮维化程度加深,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道上皮纤维化程度。（4）免疫组化法检测小鼠肺组织中p-ERκ1/2、p-JNK、p-p38 MAPK、AKT、p-NF-KB p65、VEGF、MMP-9和TGF-β1蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,模型组小鼠肺组织中各蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制上述蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）免疫荧光法检测LPS诱导16HBE细胞中p-NF-κB p65蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,LPS诱导的16HBE细胞中p-NF-κB p65蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制p-NF-κB p65蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。实验二结果（1）实验结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠BALF中炎症细胞总数及分类细胞计数（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞）明显升高,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理后,炎症细胞数量及分类细胞计数明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。BALF中细胞因子检测结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠TNF-α IL-6、IL-1β水平增加,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可显着降低哮喘小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1p水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）HE染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠炎症细胞广泛浸润到气管及血管周围。经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理显着改善这种情况。PAS染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠气道周围杯状细胞增生明显,黏液分泌增加,附着于上皮管腔内,部分地方形成粘液栓。经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道杯状细胞增生及黏液分泌。Masson染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组可见上皮细胞紊乱、脱落,气道壁增厚,气管腔狭窄,部分小血管形成和大量胶原纤维沉积,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道上皮纤维化程度。（3）免疫组化法检测小鼠肺组织中p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK、AKT、HIF-1α、VEGF、MMP-9和TGF-p1蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,模型组小鼠肺组织中各蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制这些蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）免疫荧光法检测LPS诱导RASMCs中p-NF-KB p65蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,LPS诱导的RASMCs中p-NF-κBp65蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制p-NF-κB p65蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）分别通过免疫组化法、免疫荧光法和WB法检测模型小鼠肺组织中αα-SMA蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,模型组α-SMA蛋白表达明显增加,与模型组相比较,高剂量蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制α-SMA蛋白表达。研究结论（1）蝎黄解痉治哮颗粒可抑制急性哮喘模型小鼠和哮喘气道重塑模型小鼠BALF中炎症细胞和相关细胞因子的表达,减轻了模型小鼠气道内炎症反应。（2）蝎黄解痉治哮颗粒可显着减少急性哮喘模型小鼠和哮喘气道重塑模型小鼠气道及血管周围炎症细胞浸润,减少气道杯状细胞增生及黏液分泌,减少胶原细胞沉积降低气道上皮下纤维化程度。（3）由急性哮喘模型小鼠肺组织实验结果证实,蝎黄解痉治哮颗粒能抑制MAPKs、Akt、NF-<B通路的激活,以及其下游VEGF、MMP-9、TGF-β1的表达,阻止了由此引发的支气管哮喘的反复发作。（4）由哮喘气道重塑模型小鼠肺组织实验结果证实,蝎黄解痉治哮颗粒能抑制MAPKs、Akt、HIF-1α通路的激活,以及其下游VEGF、MMP-9、TGF-β1的表达,阻止了由此引发的支气管哮喘的反复发作。（5）蝎黄解痉治哮颗粒能抑制哮喘气道重塑模型小鼠肺组织内α-SMA的表达,进而减轻哮喘模型小鼠的气道高反应和减缓气道重塑。（6）蝎黄解痉治哮颗粒可抑制LPS诱导的16HBE细胞和RASMCs中p-NF-κB p65蛋白表达。
辛晓芳[2]（2016）在《以岗梅为主的银蒿解热合剂质量标准及药效研究》文中进行了进一步梳理目的:本课题通过采用抗炎、镇痛、解热药理实验研究,并且结合薄层色谱鉴别实验,对以广东地产药材岗梅为主的银蒿解热合剂进行质量标准提高及对其主要药效研究,并且对岗梅解热作用也作相关研究,为该合剂提供更完善的实验依据,并为广东地产药材岗梅的研究提供参考。方法:主要分为质量标准提高和药理实验两方面,分别从四大部分进行研究:（1）银蒿解热合剂质量标准提高:在该合剂原有质量标准的基础上,通过薄层色谱鉴别法（TLC）对银蒿解热合剂当中的主药岗梅,及金银花、连翘、桑叶、柴胡以及绵马贯众等六味药材进行定性鉴别,进一步完善其质量标准,为银蒿解热合剂日后用药质量提供实验参考,使其临床用药的安全性保证更有依据。（2）银蒿解热合剂抗炎实验研究:通过醋酸致小鼠腹腔内毛细血管通透性增高法、二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验和灭菌棉球致大鼠蹊部肉芽组织增生法,分别从急性炎症和慢性炎症两个方面研究银蒿解热合剂抗炎作用。（3）银蒿解热合剂镇痛实验研究:通过热板法和醋酸致小鼠扭体法,所致疼痛分别类似于急性锐痛和慢性钝痛,来研究银蒿解热合剂在镇痛方面的作用。（4）银蒿解热合剂及岗梅的解热实验研究:通过千酵母致大鼠发热实验探索合剂在解热方面的药效,以及岗梅药材水提取液在解热方面的作用。结果:（1）对银蒿解热合剂中岗梅、金银花、柴胡、桑叶、绵马贯众及连翘6种药材所建立的薄层色谱鉴别方法具有简便、快捷、重复性好,专属性强的优点,可作为该制剂的定性质量控制方法,并为该制剂质量标准提高提供实验依据。（2）银蒿解热合剂能明显抑制小鼠腹腔内炎性物质的渗出（P<0.05）,且抗炎作用呈一定的量效关系;另外与空白组比较,银蒿解热合剂的低、中、高剂量组对二甲苯致耳廓肿胀均有明显的抑制作用（P<0.01）;各给药组与模型对照组对比,均有极显着性差异（P<0.01）,对肉芽组织增生有抑制作用。岗梅中剂量组有一定的抗炎作用。（3）热板法实验结果表明银蒿解热合剂中、高剂量组60min,90min,120min与空白组均有极显着性差异（P<0.01）;扭体法实验中银蒿解热合剂低、中、高剂量组及岗梅中剂量组与空白组比较,均有极显着性差异（P<0.01）,均能明显提高大鼠的痛阈值。岗梅中剂量组也具有一定的镇痛作用。（4）解热实验中,银蒿解热合剂各组及岗梅各给药组自第5h起,均在各时段均与空白组有极显着性差异（P<0.01）,且银蒿解热合剂各给药组及岗梅各给药组的解热作用均呈量效关系。结论:本次实验建立的银蒿解热合剂中岗梅、金银花等6种药材的薄层鉴别方法专属性强、重现性高,可作该合剂的定性质量控制标准。银蒿解热合剂及其主药岗梅均具有抗炎、镇痛、解热的药理作用。对急性炎症实验中的醋酸致毛细血管通透性增高及二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验,银蒿解热合剂中剂量及高剂量组的抗炎作用较为显着,对于慢性炎症实验中的棉球肉芽肿实验,银蒿解热合剂中剂量组其抗炎作用也比较明显。因此,笔者以为银蒿解热合剂对急性炎症的抗炎作用优于慢性炎症。而镇痛实验中,通过热板法及扭体法两个致小鼠急性锐痛和慢性钝痛的实验,说明银蒿解热合剂具有一定的镇痛作用。而对干酵母致热反应,银蒿解热合剂及岗梅药材各组均有解热作用,且银蒿解热合剂高剂量组有显着的解热作用,岗梅高剂量组解热作用较明显。
阳元娥[3]（2016）在《抗甲型流感病毒卵黄抗体的制备、活性评价及其应用研究》文中进行了进一步梳理由于甲型流感病毒变异快、抗甲流病毒的化学药物毒副作用大,易产生耐药性,同时有效疫苗的制备难度很大,因此寻找一种安全、简便、高效的甲型流感防治药物成为目前具有挑战性的研究课题。卵黄抗体（Egg yolk immunoglobulin, IgY）具有来源广、特异性好、安全无残留、性能稳定及价格合理等优点,在病毒性疾病的预防、治疗和诊断方面具有广阔的应用前景。本课题采用灭活甲型流感病毒为抗原免疫产蛋鸡,制备特异性IgY,对IgY的体内外抗病毒活性及其在甲型流感病毒检测中的应用进行研究,为特异性IgY在甲型流感的预防、治疗及检测方面的应用提供理论依据。研究内容分为四部分：1抗甲型流感病毒卵黄抗体的制备1.1以灭活甲型H1N1流感病毒A/广东/732/2009（H1N1）pdm09和A/加利福尼亚州/7/2009（H1N1）pdm09毒株及季节性甲型流感病毒A/广东/622/2009（H1 N1）和A/广东/749/2009（H3N2）毒株为抗原分别免疫蛋鸡获得特异性IgY。采用PEG沉淀法得到IgY纯度95.80%,回收率93.01%。1.2经ELISA检测,不同抗原免疫产生的抗体效价随时间的变化趋势基本一致,1 mg/mL的IgY的最高效价达3200,最高效价在卵黄中可持续6周,高效价抗体（>2500）在卵黄中可持续10周以上。2抗甲型H1N1流感病毒卵黄抗体的体外活性评价主要对抗甲型H1N1流感病毒A／广东/732/09（H1N1）pdm09 IgY的抗病毒活性进行了分子水平和细胞水平上的评价。2.1琼脂扩散和荧光免疫实验,结果表明IgY能与病毒颗粒结合并使其产生沉淀；Western Blot分析和HI实验,结果显示IgY能与病毒表面的主要膜蛋白神经氨酸酶（NA）、血凝素（HA）、核蛋白（NP）及基质蛋白（M）发生特异性结合,能有效抑制病毒对红细胞的凝集作用,1.0mg/mL的IgY能完全抑制红细胞凝集的最高稀释倍数为128。2.2空斑减数试验,结果说明IgY能有效中和病毒,直接抑制病毒对宿主细胞的吸附,IC50< 2.0 μg/mL;能有效阻止病毒吸附于细胞；能抑制细胞内病毒的复制增殖；体外抗病毒作用明显、稳定。3抗甲型H1N1流感病毒卵黄抗体的小鼠体内抗病毒活性研究3.1 IgY对A/广东/732/2009（H1N1）pdm09感染小鼠的死亡保护作用将BALB/C小鼠随机分为15组,正常组,模型组,磷酸奥司他韦治疗组,抗A/广东/732/09 （H1N1）pdm09 IgY预防组（含大、中、小剂量3组）、治疗组（含大、中、小剂量3组）和预防-治疗组（含大、中、小剂量3组）,阴性IgY中剂量预防组、治疗组和预防-治疗组。以5LD50的流感病毒液每只50.0gL滴鼻感染小鼠造模,正常组以生理盐水滴鼻对照。预防组在感染前2h给药1次；治疗组自感染后2h开始给药,每天1次,持续给药4天；预防-治疗组感染前2h给药1次,其他给药同治疗组。自造模当日起连续观察2周,计算各组存活率及体重保持率。结果显示：①模型组和阴性IgY各组的存活率都为10%。特异性IgY各组存活率≥90%,与模型相比较有极显着性差异,P<0.001。②模型组和阴性IgY各组的小鼠体重均先下降,后缓慢上升,显着低于正常组。特异性IgY各组体重明显高于模型组。特异性IgY中剂量治疗组的体重变化和存活率与磷酸奥司他韦治疗组无差异。3.2 IgY对A／广东/732/09 （H1N1）pdm09感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响将BALB/C小鼠随机分为6组,正常组,模型组,磷酸奥司他韦治疗组,抗A/广东/732/09 （H1N1）pdm09 IgY中剂量预防组、治疗组和预防-治疗组。分别在感染后第3天和第6天随机处死小鼠,摘取肺脏。计算肺指数与肺指数抑制率,应用RT-PCR测定感染小鼠肺组织病毒载量,HA实验测定感染小鼠肺组织病毒滴度,HE染色光镜观察感染小鼠肺部组织的病理学变化。结果显示：①各个时间点,模型组与IgY各组的肺指数均有上升趋势,但IgY各组肺指数明显低于模型组。感染后第3天,IgY各组与模型组相比有显着性差异,P<0.05；感染后第6天,IgY各组与模型组相比较有极显着性差异,P<0.01。②各个时间点,模型组小鼠肺组织病毒载量和病毒滴度都明显高于IgY各组。IgY预防-治疗组与模型组相比较,具有极显着差异,P<0.001；其他各组与模型组相比较,均具有极显着性差异,P<0.01。③在病理组织切片中,IgY各组的肺组织结构基本完整,坏死与浸润级别低。4甲型H1N1流感病毒表面增强拉曼光谱免疫分析方法的建立与应用以柠檬酸三钠为还原剂成功制备金溶胶；用4,4’-联吡啶作为拉曼标记分子对金溶胶进行标记制备标记金溶胶；用IgY与标记金溶胶结合制备标记免疫金溶胶；标记免疫金溶胶与标记金溶胶的SERS图谱相一致。采用硅烷化、醛基化的方法在凹形载玻片上进行IgY的组装,制备固相抗体。优化实验步骤,建立表面增强拉曼光谱标记免疫分析检测甲型H1N1流感病毒的方法,对甲型H1N1流感病毒进行检测,病毒滴度在0.2 TCID50到2000 TCID50范围内,4,4’-联吡啶的SERS信号和抗原浓度呈线性关系,线性方程是Y=2348.4 X-1525.8,相关系数为0.9998。
戚秀中[4]（2016）在《鼻嗅御感方对FM1-6-E2流感病毒的防护及其免疫调节作用研究》文中研究表明研究目的:通过动物实验及体外抗病毒实验,观察鼻嗅御感方对FM1-6-E2流感病毒的防护作用,并通过检测其对流感模型小鼠全身免疫及局部黏膜免疫功能的影响,探讨其防治流感的可能作用机制,以期为临床流感防控提供一种便捷、有效的药物,并阐释其部分科学原理。研究方法:（1）鼻嗅御感方体外抗FM1-6-E2流感病毒效果观察:分别将狗肾传代细胞（Madin-Daby canine kidney cells,MDCK）进行先给药后感染处理及药物病毒混合后再感染处理,通过CCK-8法检测细胞增殖情况,观察鼻嗅御感方对流感病毒的预防作用及直接灭活作用。（2）鼻嗅御感方体内防治流感效果观察:将BABL/c小鼠随机分为5组,即空白对照组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组及金刚烷胺组。各组小鼠连续给药/生理盐水7d,第8天,除空白对照组外全部小鼠滴鼻感染FM1-6-E2流感病毒液,造模2h后,各组小鼠继续给药/生理盐水7d。观察小鼠染毒后的行为改变,观察并记录各组小鼠染毒后7d的体重情况,染毒后10d的生存情况。计算各组小鼠染毒7d后的体质量变化,染毒10d后的死亡率、死亡保护率及中位生存时间。（3）鼻嗅御感方对流感模型小鼠免疫功能的影响:将BABL/c小鼠随机分为5组（分组、用药及造模方法同前）。分别于病毒感染前及染毒3d、7d后取血,流式法检测血清CD3、CD4、CD8含量及NK细胞杀伤活性,ELISA法检测血清分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A,SIg-A）、γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）含量;颈椎脱臼法处死小鼠,称重测定肺指数、脾指数及胸腺指数,流式法检测脾组织CD3、CD4、CD8含量及NK细胞杀伤活性;收集呼吸道分泌物,ELISA法检测SIg-A含量。结果:（1）鼻嗅御感方体外抗FM1-6-E2流感病毒效果观察:与模型组比较,8%浓度鼻嗅御感中药挥发油预防给药,可以明显提高病毒液攻击下MDCK细胞的OD值（P<0.001）,1%、2%、4%浓度中药挥发油及阳性对照药物金刚烷胺的作用并不明显;与模型组比较,鼻嗅御感中药挥发油及金刚烷胺与病毒液混合后再攻击MDCK细胞,均能显着提高病毒抑制率（P<0.001）。（2）鼻嗅御感方体内防治流感效果观察:小鼠于病毒感染2d后陆续发病,与模型组比较,高剂量鼻嗅御感方及金刚烷胺均能改善流感模型小鼠的精神、行为、饮食及体质量降低情况（P<0.001,P=0.001）;鼻嗅御感方能显着降低染毒小鼠的死亡率,延长中位生存时间（P=0.006）。（3）鼻嗅御感方对流感模型小鼠免疫功能的影响:预防给药7d后,与模型组比较,中药高剂量组及金刚烷胺组小鼠胸腺指数明显提高;小鼠血清NK细胞杀伤活性明显增强,血清CD3、SIg-A及INF-γ含量均显着升高;小鼠脾组织NK细胞杀伤活性、CD3含量、CD4/CD8比值均显着升高;小鼠呼吸道SIg-A分泌显着升高。病毒感染3d、7d后,与模型组比较,中药高剂量组及金刚烷胺组小鼠肺指数降低,胸腺指数升高;小鼠血清NK细胞杀伤活性明显增强,血清CD3、SIg-A及INF-γ含量均显着升高;小鼠脾组织NK细胞杀伤活性、CD3含量、CD4/CD8比值均显着升高;小鼠呼吸道SIg-A分泌显着升高。中药高剂量给药对上述指标的改善效果与金刚烷胺比较,差异有统计学意义。结论:鼻嗅御感方对FM1-6-E2流感病毒具有防护作用,其作用机制与直接杀灭病毒、提高机体的全身免疫及局部黏膜免疫功能密切相关。
崔子寅[5]（2015）在《甘露糖受体介导的多糖重组抗原铜绿假单胞菌疫苗的研制及其免疫分子机制》文中认为随着免疫学研究的不断深入和基因工程技术的迅速发展，为避免传统灭活苗接种剂量较大，产生免疫力较慢，弱毒苗毒力返强的缺点，针对不同疾病已开展了各种新型基因工程疫苗的研制。但这些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、难以诱导机体产生有效免疫应答等不足，从而需要某种载体或佐剂来弥补这种不足。传统载体或佐剂又存在许多缺陷，如引起局部炎症反应、致癌、不易在体内降解等，所以需要研发新型载体或佐剂来克服上述缺点[183]。壳聚糖，是来自甲壳素的天然高分子多糖，在体内其能被溶菌酶生物降解。具有黏膜粘附的特点，是一种黏膜吸收增强剂，己被用作黏膜给药的载体。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）由乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物[186]，具有良好的生物相容性、成囊、成膜和无毒性。在美国PLGA已通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典[187]。甘露糖是目前唯一用于在临床上的糖质营养素，其可直接被利用合成糖蛋白，参与免疫细胞上甘露糖受体介导的内吞等免疫调节作用，进一步激活T淋巴细胞，提高MHC-I和MHC-II分子的抗原递呈。因此运用壳聚糖、PLGA和甘露糖这三种可生物降解材料作为新型的疫苗载体或佐剂具有巨大的潜力。本研究采用分子生物学技术，从铜绿假单胞菌标准株ATCC27853和铜绿假单胞菌水貂分离株DL9基因组中获得外膜蛋白OprF190-342和OprI21-83的基因，并通过融合PCR的方法将其融合在一起。利用DNAStar、DNAMAN和多个生物学网站对其进行生物信息学分析。OprF190-342-OprI21-83基因的核苷酸序列在铜绿假单胞菌不同菌株间高度保守；蛋白成亲水性，二级结构主要以α螺旋为主。随后综合多种有利于直接表达具有活性重组蛋白的条件，在大肠杆菌表达系统中成功可溶性表达铜绿假单胞菌标准株ATCC27853的外膜蛋白OprF190-342-OprI21-83（FI），利用凝血酶去除其载体上的GST标签，实现无标签蛋白FI的可溶性表达。巨噬细胞和树突细胞等免疫细胞表面都具有丰富甘露糖受体（MMR）的表达，用甘露糖修饰载体，则能通过受体介导的吞噬作用，来提高细胞对于药物的摄取。因此，本研究以甘露糖和壳聚糖为材料，在氰基硼氢化钠的催化下，使甘露糖的羧基与壳聚糖的氨基发生缩合反应，将甘露糖修饰到壳聚糖上，获得甘露糖修饰的壳聚糖衍生物。以已获得的铜绿假单胞菌外膜融合蛋白FI为模式抗原，采用离子凝聚法和复乳法成功制备了含有抗原FI的壳聚糖微球载体疫苗（FI-CS-MPs）、甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗（FI-MCS-MPs）、壳聚糖包衣的PLGA微球载体疫苗（FI-CP-MPs）和甘露糖修饰的壳聚糖包衣的PLGA微球载体疫苗（FI-MCP-MPs）。并通过扫描电镜、粒径测定仪、BCA蛋白浓度测定等方法对这四种生物可降解多糖微球载体疫苗的表征进行了检测。结果显示四种微球疫苗均成正球体，形态规则，分散性良好，表面不光滑成粗糙状态，无褶皱；平均粒径大小都在23μm；包封率与载药量良好；在体外抗原释放实验中，可降解多糖微球载体疫苗在最初的12小时内释放出约30%50%的抗原FI，并且经过甘露糖修饰的微球载体疫苗的释放率始终高于未经甘露糖修饰的微球载体疫苗。以获得的四种可降解多糖微球载体疫苗为基础，将模式抗原FI标记上FITC荧光，通过流式细胞术和激光共聚焦两种免疫学技术，比较小鼠巨噬细胞RAW264.7对这四种可降解多糖微球载体疫苗的摄取情况。结果显示，小鼠巨噬细胞RAW264.7对含有FITC-FI的微球载体疫苗的摄取率比游离的FITC-FI显着增高；且对甘露糖修饰的微球载体疫苗摄取率最高，显着高于对照组。通过免疫荧光和免疫组化的方法，体内外均成功验证经过甘露糖修饰的微球载体疫苗可以靶向小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠NALT组织上的巨噬细胞甘露糖受体。本研究利用小鼠巨噬细胞RAW264.7和NF-κB和MAPK信号通路试剂盒，通过Western-blot方法，揭示生物可降解多糖微球载体疫苗可以显着激活小鼠巨噬细胞RAW264.7NF-κB和MAPK信号通路。并且经过甘露聚糖抑制甘露糖受体，甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗激活这两条信号通路的现象明显消失。用获得的生物可降解多糖微球载体疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠，间接ELISA和流式细胞术检测免疫后各个时间点小鼠黏膜和系统体液特异性抗体水平和T淋巴细胞亚型情况。结果显示，在体液水平方面，最先检测到的抗体为肺脏研磨液中的FI特异性IgM，随着免疫时间的延续其抗体效价逐渐减少；在鼻腔灌洗液和支气管灌洗液中，甘露糖修饰的壳聚糖微球组特异性IgA抗体效价在免疫初期显着高于对照组；并且在滴鼻免疫的远端黏膜部位小肠灌洗液中，与对照组相比甘露糖修饰的壳聚糖微球组特异性IgA抗体水平也显着增高；在激活黏膜部位抗体水平的同时，在血清中的特异性IgA和IgG水平也显着增高，甘露糖修饰的壳聚糖微球组显着高于对照组。肺脏、小肠派尔氏结和脾脏中，甘露糖修饰的壳聚糖微球组的T淋巴细胞亚型CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+均显着升高，并伴随细胞培养上清液中IL-4和IFN-γ的显着表达，提示甘露糖修饰的微球疫苗呈现混合Th1/Th2反应。生物可降解多糖微球载体疫苗可以显着提高最小致死量铜绿假单胞菌攻毒小鼠的存活率。在BALB/c小鼠体内，生物降解多糖微球载体疫苗具有良好的滴鼻免疫效果，随后本研究通过间接ELISA和HE染色组织学观察等方法，研究其在本体动物水貂中滴鼻黏膜免疫后，抗体水平的变化情况，评价其免疫效果。结果显示，甘露糖修饰的微球疫苗组在免疫初期的血清IgG抗体水平显着高于对照组，且持续到免疫观察末期。壳聚糖微球载体疫苗可以显着提高铜绿假单胞菌攻毒水貂的存活率，FI-CS-MPs、FI-CP-MPs、FI-MCS-MPs和FI-MCP-MPs组水貂的存活率分别是62.5%、62.5%、75%和62.5%，但由于实验过程中的攻毒过程为急性感染，所以甘露糖修饰的壳聚糖微球疫苗组存活率与未经甘露糖修饰的壳聚糖微球疫苗组存活率无显着差异。组织学观察，壳聚糖微球载体疫苗可以显着减轻铜绿假单胞菌攻毒水貂肺脏和脾脏的炎症反应。总之，本研究成功制备含有铜绿假单胞菌外膜融合蛋白FI的经过甘露糖修饰的壳聚糖可生物降解微球载体疫苗（FI-MCS-MPs和FI-MCS-MPs）。体内外验证其可以靶向巨噬细胞甘露糖受体。经过BALB/c小鼠和本体动物水貂滴鼻免疫以后，显示与对照组相比其可以较早的显着增强黏膜和系统体液及细胞免疫应答，呈现混合Th1/Th2反应。对铜绿假单胞菌攻击的小鼠和水貂具有很好的保护率。因此，甘露糖修饰的壳聚糖可生物降解微球载体是一个很有潜力的可生物降解滴鼻黏膜免疫疫苗载体。为生物可降解多糖微球载体疫苗在水貂等经济毛皮动物中的应用提供可靠的理论和实验依据。
王鹏程[6]（2015）在《商陆的性味研究》文中研究表明中药性味理论是中药学理论体系的重要组成部分,是指导中医临床用药的重要依据,是中药区别于植物药、天然药物的突出标志,是中医与中药之间的桥梁。中药的性味是根据药物作用机体所产生的效应和针对临床病证的实际疗效,经实践验证,最终归纳总结出来的,是对中药复杂的多层次作用的高度概括。在此框架下,将中药与对应属性相结合,强调其诸多方面药性中的特征性内容,根据中医辨证用药原则,与其临床应用中所体现出的功效作用相对应,进行药性与功效的关联性方面的研究探讨,对传统中药药性理论的再升华具有重要意义。然而,在性味理论长期的发展过程中,由于人们对于中药性味的认识以及对于中药性味判定的方法学的演变,使得众多中药性味的标定混乱,具体到单味中药某一“性”或“味”的标定,历代医家也多为此所争论不休。现代研究也困惑于如何科学合理地阐明中药性味标定的依据,药味与药性之间的关系、以及中药性味的精细结构。因此,如何阐明中药性味理论的科学内涵,又能保持和发扬中医药自身的特色优势,一直是中医药学者面临的艰巨任务和巨大挑战。商陆为石竹目商陆科商陆属植物商陆（Phytolacca acinosa Roxb.）或垂序商陆（Phytolacca americana L,）的干燥根。商陆作为药物使用的历史悠久,始载于《神农本草经》；其临床疗效突出,同时也是着名的有毒中药。商陆在我国大部分地区均有分布,主产于河南、陕西等地。关于商陆的性味,《神农本草经》中记载商陆味辛平；《得配本草》说商陆苦、辛、冷；《本草从新》中描述商陆苦寒。而到了现代,《中国药典》中记载商陆味苦性寒。显然对于商陆的性味,历史记载与现代的《中国药典》的描述存在很大的差异。本文发现商陆的“味”主要集中在“苦”味,“辛”味和“酸”味；而对于商陆“性”的描述,主要集中在“寒”性和“平”性。我们可以发现,历代本草对商陆的味大体分为两种观点,以《神农本草经》为代表的清代以前本草认为商陆主要为“辛”味和“酸”味；而清代以后的中药着作及《中国药典》认为商陆为“苦”味；两种观点有着鲜明的时间节点；而商陆“性”的演变,与商陆“味”的演变时间一致。为了合理诠释商陆性味演变的科学内涵,并为正确指导临床实践和科学研究提供理论依据,本文对其性味进行了研究。对此,本课题以商陆性味为研究对象,试图通过运用中药性味可拆分性和可组合性研究的研究模式解决商陆在性味及功效等认识方面存在的问题,也为证明“中药性味的可拆分性和可组合性”,揭示中药一味一性的客观存在,验证“一药X味Y性（Y≤X）”的假说提供客观依据,进而为下一步揭示其药性（气）的科学内涵提供前期研究基础。同时也为发现并研究出能够治疗重大或疑难疾病需要的创新药物奠定基础。为此本论文开展了以下几个方面的研究工作：1.文献综述。以性味问题为中心,系统搜集古今文献中与性味理论相关的记载,厘清了中药性味及关于商陆的名称、品种、产地发展与演变过程,了解近现代有关性味研究的理论及商陆药理与化学成分研究成果、临床应用总结,完成关于中药性味理论研究及商陆的研究综述,为本文实验研究的开展奠定丰富有效的文献基础,同时确定本文研究对象为Phytolacca acinosa Roxb的干燥根。2.商陆的性味考证研究。通过考证历代本草着作对商陆性味的记载,结合中药性味理论的发展演变过程,明晰了商陆性味的发展脉络和各个时期性味的内涵。由始载于《神农本草经》的“辛”,‘到《名医别录》的“酸”,到《本草经集注》的“辛,酸”,·到《中国药典》的“苦”,经历了由“单味”到“复合药味”再到“单味”,由“辛,平”、“辛、酸,平”、“辛、酸,寒”、“苦,寒”的发展演变过程。3.商陆性味物质基础的可拆分性研究。采用水煎煮、醇沉,萃取及大孔吸附树脂等提取分离技术的组合应用,将商陆水煎液拆分为成分之间互不交叉的多糖组分、脂肪油组分、皂苷组分、鞣质组分和酚酸组分等5个组分。该拆分方法符合全成分拆分、各组分成分之间互不交叉、尽量保持化学成分原型三大原则。4.商陆性味拆分组分的性味药理学研究。本文采用与商陆性味功效相关的利尿、泻下、抗炎、免疫增强、抗菌、抗病毒及抗肿瘤作用等复合药理学指标作为性味功效评价系统,对商陆性味拆分组分的生物学效应进行评价。本文证明：商陆具有利尿、泻下、抗炎、免疫增强、抗菌、抗病毒及抗肿瘤作用。其发挥利尿与泻下作用的物质基础为多糖组分和脂肪油组分；抗炎与免疫增强作用的物质基础为皂苷组分；抗菌、抗病毒及抗肿瘤作用的物质基础为酚酸组分与鞣质组分。在本文研究工作中,首次发现：（1）在利尿实验研究中,首次发现多糖组分、脂肪油组分具有明显的利尿作用。（2）在泻下实验研究中,首次发现多糖组分、脂肪油组分具有泻下作用。（3）在抗菌实验研究中,首次发现酚酸、鞣质组分具有抗菌与抗病毒作用。（4）在抗病毒实验研究中,首次发现酚酸、鞣质组分具有抗病毒作用。（5）在抗肿瘤实验研究中,首次发现酚酸、鞣质组分具有抗肿瘤作用。5.商陆性味拆分组分的归属研究。采用文献研究,结合数学方法,分别从传统中医药学研究方法和现代科学的角度对商陆拆分组分进行归属,结果表明：商陆的利尿及泻下作用为其“苦”味的作用,抗炎与免疫增强为其“辛”味的作用,抗菌、抗病毒与抗肿瘤作用为其“酸”味的作用。商陆的“苦”味的物质基础为多糖组分、脂肪油组分,“辛”味的物质基础为皂苷组分,“酸”味的物质基础为酚酸组分、鞣质组分。证实了中药性味的可拆分性,揭示了中药“一味一性”的客观存在,验证了“一药X味Y性（Y≤X）”的假说的客观性。6.商陆性味拆分组分的化学成分研究,通过弱阴弱阳离子交换串联树脂（Amberlite FPA90-Cl-+Amberlite IRC-84）、离子交换琼脂糖凝胶（DEAE-Sepharose F. F.）、离子交换纤维素（Cellulose DEAE-52）、丙烯葡聚糖凝胶Sephacryl S-400 HR等离子交换和分子筛柱色谱等对商陆拆分组分中的多糖进行分离和纯化得到7种均一多糖：PAP-1—PAP-7,并采用单糖组成分析、部分酸水解、Smith降解、高碘酸氧化、甲基化分析、红外光谱等化学和波谱学方法,分析商陆多糖的化学结构特征。此外,7.商陆多糖的抗肝损伤作用研究。通过小鼠CCl4肝损伤模型,证实商陆多糖具有很好的保肝作用,进一步通过体外抗氧化实验及H202致HepG2细胞损伤模型,发现多个均一多糖具有强的体外抗氧化能力及对H202损伤的HepG2细胞的保护作用,而其中PAP-3具有最强的体外抗氧化能力及细胞保护作用,提示PAP-3具有进一步开发成新药的可能。8.商陆皂苷组分对于结肠炎小鼠的治疗作用。通过硫酸葡聚糖钠（Dextran sulphate sodium, DSS）诱导的急性小鼠结肠炎模型证实商陆皂苷组分具有好的治疗作用,包括改善结肠炎小鼠的体重降低,缓解结肠炎小鼠的疾病活动指数（Disease activity index, DAI）,降低肠内TNF-α、IL-1β以及IL-6的蛋白表达,进一步通过实验证明商陆皂苷组分可能是通过抑制NF-κB的表达,进而抑制iNOS及COX-2的表达,来实现其治疗作用。本研究的创新性与特色：本文在中医药基本理论指导下,基于中药性味“一药X味Y性（Y<X）”的假说,以中药性味可拆分性、可组合性的研究思路,对传统中药商陆的性味及其物质基础、性味药理学等方面进行了新的探索和研究,获得了一些重要的研究结果,这些研究结果不仅有助于解决对商陆性味及功效等认识方面存在的一些问题,对商陆的临床应用、新药研制等具有重要的指导价值,同时,也为揭示中药一味一性的客观存在,验证“一药X味Y性（Y≤X）”的假说提供科学证明,进而为下一步揭示其药性（气）的科学内涵,同时也为发现并研究出能够治疗重大或疑难疾病需要的创新药物奠定前期基础。
吴曼丽[7]（2015）在《一种肺泡巨噬细胞靶向的多表位结核粘膜疫苗》文中研究说明结核病（tuberculosis, TB）是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）感染引起的以肺部慢性肉芽肿炎症病变为主的慢性传染病。结核菌经呼吸道传播,其自然感染率非常高,虽仅有5%的自然感染人群会产生活动性肺结核及后续缓慢发作的肺结核干酪杨坏死和空洞型肺结核,95%的感染人群处于潜伏感染状态,在免疫力下降或空气环境因素等变化,很容易进展为活动性肺结核,同时人群传播极快。肺结核是十九-二十世纪间发病广泛、传染迅速、病程漫长、严重损伤健康与劳动力的感染性疾病。1919年前后,法国细菌学家Calmette和Guerin受牛痘疫苗的启发,将牛型结核杆菌（Mycobacterium bovis）在培养基传代230次,获得一株毒力显着减弱的减毒牛型结核杆菌------卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin, BCG）是用于预防结核病的疫苗,经人体免疫试验,发现具有良好的预防肺结核功能。卡介苗的发明和全球接种使肺结核不再成为老百姓闻之色变的严重传染病。随后多种抗菌素的发现、利福平、异烟肼等化学抗菌药物的出现,使肺结核的治疗非常有效。然而上世纪80年代起,由于多重耐药结核菌株的出现导致一线抗结核化学药物失效、及卡介苗在控制肺结核疗效的不稳定甚至失效,人类免疫缺陷病毒（HIV）合并结核菌感染等问题的出现,肺结核重新成为再现（re-emerging）的严重传染病,并位居世界三大传染病之一。世界卫生组织（WHO）（（2014年全球结核病报告》显示,2013年全球900万人新染结核病,其中印度和中国分占24%和11%（100万）,150万人死亡,其中36万为艾滋病患者。虽然从1990～2013年间肺结核的患病率与死亡率已显着降低了41%和45%,但其发病总数提示肺结核仍未有效控制。由于卡介苗仅能预防儿童原发性结核和肺外结核,对于耐药及多耐药结核菌的控制仍无好的方法,全球人口流动持续增高,因此防控结核病的重心仍旧应当定位于预防性结核疫苗的改良、创新研制和全球接种。研制新型结核疫苗具有重要的意义。结核疫苗研制的最重要基础和最大障碍在于迄今对于天然抗结核免疫保护机制和疫苗抗结核免疫保护评价指标仍有不解和争议。与目前大多数成功抗感染疫苗的保护机制（如乙肝预防性疫苗）所显着不同的是,抗结核免疫保护的中心法则是主要依赖T细胞免疫而不是抗体。在T细胞免疫中,最初认为是分泌IFN-γ的CD4+Th1细胞,通过激活肺泡巨噬细胞吞噬小体成熟酸化及与溶酶体融合、自噬小体形成与有效降解、iNOS杀菌系统等机制充分杀灭结核分枝杆菌。然而关于IFN-γ的抗结核免疫保护功能近年产生很多争议,全血IFN-γ水平甚至是潜伏结核进展为活动性结核的危险因素；BCG人群免疫后评估发现外周血IFN-γ+Th细胞频率与免疫保护/肺结核进展没有相关性；IFN-γ还具有活化Treg和限制免疫应答规模的免疫调控作用。TNF-α被发现与IΦN协同激活巨噬细胞合成NO并可限制肉芽肿病理组织规模减少组织病理损伤,在临床发现具有阻止潜伏结核进展为活动性肺结核的作用。而IL-2是重要的 细胞生长因子。由此近年认为同时分泌IFN-γ、 IL-2、TNF-α的多功能T细胞（multi-functional CD4+Th）才是结核免疫保护的关键。此外,CD8+T （CTL）细胞通过多种杀伤机制诱导感染的巨噬细胞凋亡,可使隐匿的结核菌有效释放结核抗原激活特异性T细胞应答。关于B细胞和抗体应答在抗结核免疫保护的作用迄今争议较大。B细胞分泌抗体IgG经FcR调理、激活巨噬细胞等的吞噬杀伤功能、作为APC提呈结核抗原激活T细胞的功能发挥一定效应。近年随黏膜（局部）免疫与黏膜免疫器官的理论的提出和不断重视,黏膜局部免疫微环境的多种免疫细胞与免疫分子的平衡对于控制感染、疾病进展十分重要,如早期的肺泡局部嗜中粒细胞浸润、巨噬细胞激活、IFN-γ产生；早中期的Th1、Th17、CTL浸润和杀伤功能增强；后期的Treg、IFN-γ、TNF-α等免疫调控应答等。这些应答均有别于全身（脾脏）免疫应答。肺脏组织被认为是一种新的黏膜免疫组织,存在独特的支气管相关淋巴组织（BALT）,其中含有结构较为松散的T/B/DC等免疫细胞。Mtb感染肺泡巨噬细胞后,提呈抗原激活BALT中的Th细胞,进而激活特异性B细胞和CD8+T细胞,活化的效应B、T细胞通过趋化因子移动至黏膜效应局部,分泌SIgA,发挥T细胞效应,因此肺泡局部黏膜免疫很可能在抗结核免疫保护中发挥非常关键的作用。SIgA是人体黏膜部位的主要抗体类别,其为双体结构,中和活性显着高于单体IgG,SIgA不仅可中和胞外游离的黏膜体液中的病原体,还可以经pIgR受体主动转运至上皮细胞内,发挥胞内中和作用；胞内IgA病原复合物还可被TRIM21泛素化经由蛋白酶体降解。研究提示呼吸道支气管黏膜局部的SIgA对于中和胞外及胞内Mtb,及调节其他抗结核保护免疫具有重要的意义。肺结核的防治迄今仍面临很多未解的问题,从增强黏膜免疫角度出发,可从早期呼吸道及肺灌洗液SIgA的中和预防、肺黏膜局部多功能T细胞应答的增强,来显着克服常规疫苗不能诱导的肺脏局部抗结核免疫,从黏膜局部免疫的新角度来实现更好的免疫保护效果。综上,我们对于新型结核疫苗的设计理念聚焦于多特异性T细胞免疫和结核特异性黏膜免疫。为了诱导多抗原特异性T细胞免疫,我们将采用多表位核酸疫苗（poly-epitope vaccine）的策略,偶联多个具有免疫原性的结核T细胞表位,包括CD4+和CD8+T细胞表位,试图诱导多个结核抗原特异性的黏膜局部的T细胞应答,通过攻击结核菌多个靶抗原实现更好的免疫保护。为了诱导结核特异黏膜免疫,通过黏膜递送载体制备和组装一种易于通过黏膜、长效释放抗原的黏膜疫苗,并试图发展新的分子策略来增强黏膜的靶向性；在多表位核酸疫苗分子设计上,针对抗原表位免疫原性很弱,我们选择免疫原性非常强的蛋白作为载体支架,在其非功能结构域内插入多个T细胞表位,使T细胞表位获得一种良好的空间折叠与构象,这一设计理念也被称为“多表位蛋白支架疫苗（poly-epitope in protein scaffold, PEPS）"设计。这一设计的优点和创新在于：1）就抗原数目种类而言,偶联了多个蛋白及表位；2）蛋白本身的强免疫原性保留；3)表位由于良好的空间呈现,使得被APC吞噬后的酶类降解更为有效精准；4)多表位嵌合至蛋白中,可能产生很多新的B细胞表位和T细胞表位。蛋白载体的选择上,我们选择了来源于Mtb的热休克蛋白65 （heat-shock protein 65, HSP65）。HSP65是一种原核及真核生物的高度保守蛋白,是胞内分子伴侣,可携带运输抗原、使避免降解并正确,最终促进抗原的MHC提呈；最新研究表明HSP65可与APC如DC表面的TLR2/4作用,从而具有靶向DC并激活DC释放RANTES等细胞因子功能,被认为具有佐剂潜能。同时Mtb来源HSP65本身具有很强免疫原性和免疫保护特性。为此,我们选择结核来源HSP65作为疫苗骨架蛋白,将多个结核T细胞表位插入其非功能结构域,构建以HSP65为骨架的多表位核酸疫苗（poly-epitope in protein scaffold vaccine, PES）在黏膜递送载体选择上,我们首先选择脱乙酰壳聚糖（chitosan）这一具有无毒、缓释、促进黏膜吸附吸收等特性的天然阳离子多糖,其可与DNA共凝集形成纳米颗粒型复合物,不仅使抗原质粒得以在黏膜局部缓释,所形成的100-500nm大小的颗粒更易被黏膜局部的M细胞、巨噬细胞等进行吞噬,提高抗原摄取效率。运用这一载体技术,我们课题组前期曾成功制备了chitosan-DNA结核与病毒性心肌炎黏膜疫苗,均通过增强黏膜免疫提高了免疫保护。诱导肺黏膜特异性T细胞应答及SIgA分泌可能是增强抗结核免疫保护的新思路。为了诱导全面的肺局部黏膜免疫,本课题设计制备了一种以结核优势抗原HSP65为支架、嵌合多个结核抗原T细胞表位的多T表位嵌合的蛋白支架DNA疫苗（pPES）;在此基础上,为高效诱导肺泡局部黏膜免疫以发挥更有效抗结核保护,以天然阳离子多糖-脱乙酰壳聚糖（chitosan, CS）为黏膜递载体（佐剂）,经滴鼻免疫,诱导多抗原特异性肺黏膜免疫,并以大剂量BCG攻毒评估了其免疫保护效果。为进一步提高该疫苗的黏膜靶向和抗原释放效率,针对结核分枝杆菌感染肺泡巨噬细胞的特性,我们设计使用黏膜靶向分子---甘露糖,以甘露糖修饰的壳聚糖（mannosylated chitosan, MCS）组装DNA疫苗,进一步增强其黏膜免疫效果,以期接近甚至超过BCG的保护能力。本研究的创新性在于以诱导肺黏膜局部特异性免疫为目标的一种新型黏膜疫苗设计平台的建立。第一部分 多表位DNA疫苗的设计、构建、表达与免疫原性鉴定1、以HSP65为骨架的嵌合多T表位核酸疫苗pPES的分子设计根据文献我们选择了5个结核分枝杆菌毒株H37Rv来源的T细胞表位,其中4个CD4+Th1表位ESAT-61-20（BCG缺失）、Ag85B244-255、PPE25241-255、PE194-18,1个CD8+CTL表位,MTB10.43-11,根据相似蛋白二级结构相容的原则,我们在H37Rv株来源的HSP65蛋白的第146、151、157、395位氨基酸后分别插入ESAT-61-20、Ag85B241-255、MTB10.43-11、PPE25241-255-AAY-PE194-18串联表位。首先构建真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65,通过多次引物重叠延伸PCR,得到插入有5个T细胞表位的HSP65的PES基因片段,而后将其插入pcDNA3.1,得到pPES多表位结核疫苗质粒,经双酶切及DNA测序均证实构建成功。构建好的pPES序列经二级蛋白结构分析,对载体HSP65基本二级结构的影响很小。作为多表位嵌合设计的对照,我们构建了将表位直接串联插入至pcDNA3.1中的质粒p5pep,以及将表位串联后插入HSP65末端的质粒pHSP65-pep。2、HSP65蛋白的纯化表达构建pET32a HSP65质粒,转化BL21,IPTG诱导,并经包涵体纯化HSP65蛋白,纯化蛋白纯度大于90%,Western Blot鉴定和小鼠抗HSP65抗体特异结合。3、pPES质粒的真核表达效率为验证p-PES质粒的真核表达效率,将pPES转染293T细胞,Western Blot转膜并以抗HSP65抗体检测,证实pHSP65、pPES在体外真核细胞能够高效表达HSP65蛋白（65kD）及PES蛋白（75kD）4、pPES疫苗诱导的特异T细胞应答及与其他方式构建疫苗的比较为证实我们构建的嵌合有5个结核T细胞表位的HSP65载体多表位核酸疫苗的免疫原性,并比较这样的蛋白载体嵌合表达与非嵌合式串联表达、及无蛋白载体的表位串联的免疫原性的差异,以pcDNA3.1、pHSP65、pPES、p5pep、 pHSP65-pep DNA疫苗以肌肉注射方式,免疫雌性C57BL/6小鼠股四头肌,4次,间隔10天,每次50μg,总量200μg。末次免疫后10天取小鼠脾脏淋巴细胞,用灭活H37Rv、HSP65蛋白、5种单独表位多肽、5肽混合物分别进行刺激,进行IFN-γ的ELISPOT检测。结果显示：5种表位的简单串联（p5pep）几乎不能有效诱导特异性T细胞应答；pHSP65只能对载体HSP65产生高效T应答；5种表位串联于HSP65羧基端（pHSP65-pep）可产生一定的T细胞免疫,但是5种表位嵌入HSP65的pPES疫苗对5种结核肽及混合肽均有更显着增强的IFN-γ+T细胞免疫,且对BCG缺失的ESAT-61-20有良好反应,提示我们构建的pPES疫苗确实比表位的其他构建方式具有更好的诱导T细胞应答的优越性。5、pPES疫苗的免疫保护效果以1×107CFU BCG滴鼻攻毒4周,取小鼠肺石蜡切片行H&E染色发现：pcDNA3.1载体组与p5pep组肺部呈现严重的肺结核炎症,提示表位直接串联无保护效果；pHSP65免疫组肺泡间隔增厚程度降低,具一定的免疫保护性；pHSP65-pep组的肺泡结构与炎症较前3组均有显着降低；而pPES疫苗组显示相对最佳的炎症减轻的免疫保护效果。肺、脾脏菌落计数显示：pPES疫苗降低脏器细菌生长的效果最为显着,由106.5和105.5显着降至105.4和104.6,提示我们构建的以HSP65为骨架的多表位核酸疫苗pPES相对其他方式构建的多表位疫苗具有更好的免疫保护特性。第二部分脱乙酰壳聚糖组装的结核DNA疫苗诱导的黏膜免疫与保护效果1、CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性体液免疫为明确CS-pPES疫苗滴鼻免疫能否诱导载体蛋白HSP65特异性抗体,以CS-vector阴性对照,CS-pHSP65, CS-pPES分别滴鼻免疫,BCG皮下注射作为阳性对照,每只50μg DNA,隔周免疫4次。血清IgG水平方面：CS-vector对照组不能诱导血清IgG,其余各组均在6周起诱导,第8周达到峰值。CS-pPES滴鼻免疫诱导了显着高于对照组和CS-HSP65组的血清IgG,低于BCG组。提示在HSP65蛋白中插入5个结核表位并未显着影响HSP65载体蛋白诱导抗体应答的能力。为检测CS-pPES滴鼻免疫是否能诱生黏膜SIgA,取末次免疫后两周小鼠肺泡灌洗液（BAL）检测显示：CS-pPES疫苗滴鼻诱导了高水平的肺泡灌洗液SIgA,显着高于各组,与BCG组无显着差异。提示CS-pPES滴鼻免疫不仅可诱导血清IgG抗体,同时显着诱导了HSP65特异性黏膜SIgA。2、CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性全身（脾脏）T细胞免疫为了检测CS-pPES滴鼻免疫诱生的特异性T细胞免疫,取末次免疫后2周小鼠脾脏淋巴细胞悬液,体外H37Rv、HSP65蛋白、5种表位多肽及5肽混合物分别刺激培养40h,进行IFN-γ的ELISPOT检测发现：CS-pPES组脾脏淋巴细胞对所有结核抗原刺激均产生了较高水平IFN-γ+T细胞应答,均高于CS-pHSP65和对照组（p<0.05）,但略低于BCG组；此外,仅有CS-pPES免疫小鼠脾细胞对Mtb特有而BCG缺失的ESAT-61-20有良好反应。流式细胞术方法检测了脾脏分泌多种细胞因子的T细胞频率。经灭活H37Rv刺激结果显示：CS-pPES免疫小鼠脾细胞诱导了结核特异性分泌3种细胞因子的CD4+和CD8+T细胞应答,虽总体水平比BCG组略低,但均显着高于对照和CS-pHSP65载体组（p<0.05）。提示CS-pPES黏膜疫苗滴鼻免疫可显着诱导脾脏CD4+和CD8+多功能T细胞应答。3、CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性肺局部黏膜细胞免疫取末次免疫后2周小鼠肺脏淋巴细胞悬液,进行IFN-γ的ELISPOT检测发现：CS-pPES组肺脏淋巴细胞对几乎所有结核抗原（PPE25和PE19多肽较弱）刺激产生了较高水平IFN-γ+T细胞应答,均显着高于CS-pHSP65和对照组（p<0.05）；还对BCG缺失的ESAT-61-20有良好反应,提示CS-pPES滴鼻免疫诱导了肺脏黏膜局部多抗原特异性IFN-γ+T细胞应答,但略低于BCG效果。流式细胞术结果显示：CS-pPES免疫小鼠肺单核细胞诱导了结核特异性分泌3种细胞因子的CD4+和CD8+T细胞应答,总体水平显着高于BCG、及对照和CS-pHSP65载体组（p<0.05）。提示CS-pPES黏膜疫苗滴鼻免疫可显着诱导肺脏黏膜局部CD4+和CD8+多功能T细胞应答,且该应答显着高于阳性对照BCG。4、CS-pPES疫苗滴鼻免疫的抗结核免疫保护大剂量BCG滴鼻攻毒后4周,肺脏病理结果显示,BCG皮下免疫组显示了最好的免疫保护效果；而CS-PES滴鼻免疫组肺脏病理显着优于CS-pHSP65疫苗组和对照,虽仍有肺泡细胞壁增厚和少量炎症。攻毒后肺、脾细菌数由105.8、105.1显着降低为104.6、104.4,提示CS-pPES结核黏膜疫苗滴鼻免疫能部分保护小鼠,但总体效果低于BCG疫苗。综上,我们构建的含有5个结核T细胞表位的pPES多表位核酸疫苗,经chitosan组装后,经滴鼻免疫,显着增强了裸露DNA所不能诱导的肺灌洗液SIgA和肺脏IFN-γ+、IL-2+、TNF-α+T细胞应答,但在脾脏T细胞免疫强度和攻毒炎症保护方面效果略低于BCG疫苗。有待进一步优化和改进这一黏膜疫苗。第三部分甘露糖化壳聚糖增强DNA疫苗的黏膜免疫与保护效果为进一步增强结核特异性黏膜免疫,我们将黏膜递送载体壳聚糖进行甘露糖化修饰,而后与质粒DNA通过共凝聚法形成MCS-pPES复合物颗粒疫苗,研究其理化特性并在小鼠体内的检测其免疫原性和免疫保护特性。1、CS-DNA和MCS-DNA复合物的理化特性研究以壳聚糖（CS）及甘露糖化壳聚糖（MCS）溶液,分别与质粒pPES复合形成CS-DNA和MCS-DNA复合物颗粒。经扫描电镜证实复合物为均一的球形颗粒,MCS-DNA颗粒约250-400nm,略大于CS-DNA。CS和MCS包装DNA效率将近100%,并可有效保护DNA免受DNA酶的降解。2、MC-pPES疫苗滴鼻免疫诱生的特异性抗体免疫应答以MCS-pPES、CS-pPES、pPES、MC-vector、CS-vector结核黏膜基因疫苗于0、2、4、6周滴鼻免疫小鼠,每次50μg,共4次,BCG皮下注射为阳性对照。MCS-DNA诱导的血清IgG效价近1：4000,显着高于DNA组,高于CS-DNA组（1：2800）。MCS-DNA免疫诱导的肺灌洗液SIgA效价为1：1100,显着高于CS-DNA和BCG诱导SIgA（1：600,p<0.05）；提示对黏膜递送载体壳聚糖进行甘露糖化修饰可显着增强特异性黏膜抗体特别是SIgA应答。3、MCS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的全身（脾脏）特异性T细胞免疫ELISPOT显示,与CS-pPES相比,MCS-pPES滴鼻免疫显着增强了各表位及结核抗原特异性IFN-γ+T应答,且与BCG组相仿；同时对BCG缺失的ESAT-61-20抗原的应答水平显着高于BCG。流式细胞术显示：MCS-pPES滴鼻免疫诱导的H37Rv特异性脾脏三细胞因子多功能T细胞应答强度（IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD8+T、TNF-α+CD4+T）均比CS-pPES疫苗效果显着增强,略低于BCG。5肽特异性脾脏多功能T应答（IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T）在MCS-pPES均显着性高于CS-pPES （p<0.05） TNF-α,+T显着高于BCG组（p<0.05）,提示MCS-pPES滴鼻免疫显着增强H37Rv、5肽特异性脾脏多功能T细胞应答。4、MCS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的肺黏膜局部特异性T细胞免疫ELISPOT显示：MCS-pPES疫苗又显着增强了CS-pPES及裸露DNA诱导的肺脏单核细胞IFN-γ+T应答；且对5肽和HSP65蛋白的应答均显着高于BCG组（p<0.05）流式细胞术显示：MCS-pPES组诱导的H37Rv特异性肺脏多功能T应答（IFN-γ+CD4+/CD8+T、TNF-α+CD4+T）均显着高于CS-pPES组及对照组（p<0.05）,与BCG组近似。MC-pPES诱导的5肽特异性肺脏IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD4+T、 TNF-α+CD4+/CD8+T应答均显着高于CS-pPES,且高于BCG组（p<0.05）,提示甘露糖化壳聚糖组装的pPES疫苗显着增强5肽特异性肺黏膜多功能T细胞应答,不仅优于CS-pPES,且优于BCG疫苗。5、抗结核免疫保护效果裸露DNA疫苗滴鼻免疫的保护效果有限：MCS-pPES黏膜疫苗的肺结核免疫保护效果与CS-pPES相比显着增强,肺脏炎症浸润灶及炎症程度显着减少,肺脏细菌载量显着降低,与BCG效果相仿。综上,为提高壳聚糖递送的多表位结合疫苗的免疫原性和免疫保护,使用修饰的甘露糖化壳聚糖作为黏膜递送载体,发现在特异性血清IgG、肺灌洗液SIgA、脾脏和肺脏IFN-γ+T细胞应答均显着高于壳聚糖疫苗效果,其中,肺灌洗液SIgA、肺脏单核细胞5肽特异性IFN-γ+T应答、肺脏5肽特异性IFN-γ+CD4+/CD8+T、 IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T应答均显着高于CS-pPES及BCG组,提示诱导肺脏黏膜免疫的能力得以显着提高。最终的免疫保护效果也得以显着提高。第四部分甘露糖化壳聚糖特异靶向肺泡巨噬细胞的机制研究为了探讨甘露糖化壳聚糖增强黏膜免疫应答的机制,我们通过几种报告抗原的原位组织染色及免疫组化方法检测了疫苗在肺脏的表达效率,并通过双荧光共聚焦评估了两种黏膜疫苗的肺泡靶向特性。1、原位组化检测MCS-DNA的肺脏表达效率为了在体内验证壳聚糖和甘露糖化壳聚糖对于DNA疫苗的递送与表达效率,β-半乳糖苷酶为报告抗原：以含50ug质粒DNA的CS-pLacZ及MCS-pLacZ滴鼻免疫小鼠。2天后取小鼠肺脏X-gal染色发现：裸露质粒无法在肺脏有效表达；CS-p-LacZ质粒在肺泡间质有少量表达：而MCS-pLacZ滴鼻小鼠肺泡间质及肺泡细胞内LacZ的表达量和表达区域显着高于其余两组,提示壳聚糖与甘露糖化壳聚糖均可增强外源DNA在肺部的原位表达,且甘露糖化壳聚糖增强抗原黏膜表达的能力最强。HSP65为报告抗原,48小时小鼠肺脏冰冻切片经HSP65特异性抗体染色发现：CS-pHSP65显着提高肺脏间质和细胞内HSP65抗原表达,而MCS-pHSP65的增强效果更为广泛和强烈,提示壳聚糖和甘露糖化壳聚糖均可显着增强DNA在肺部的原位表达,以后者的增强效果更为显着。2、FITC示踪MCS-DNA的肺脏巨噬细胞靶向情况为了检测甘露糖化壳聚糖是否可以有效靶向肺泡巨噬细胞,分别以FITC标记壳聚糖和甘露糖化壳聚糖,而后以含50ugDNA的FITC-CS-DNA及FITC-MCS-DNA通过气管灌注小鼠肺脏,取24小时肺脏冰冻切片,以抗小鼠单核+巨噬细胞抗体（MOMA-2）进行特异染色,DAPI衬染,以共聚焦荧光显微镜观察,结果显示：小鼠肺泡巨噬细胞附近有一定的CS-DNA的荧光强度,而经MCS-DNA免疫后,肺泡局部绿色荧光的数目和强度均有显着提高,提示MCS-DNA比CS-DNA更能有效地到达肺泡巨噬细胞,即靶向性显着增强。3、FITC示踪MCS-DNA的巨噬细胞摄取能力为进一步探究甘露糖化壳聚糖递送系统指引下的肺泡巨噬细胞靶向后,对巨噬细胞的抗原摄取能力是否有影响,体外Raw264.7细胞,加入含2μg质粒DNA的FITC标记的CS-pPES及MCS-pPES,孵育0.5小时后共聚焦激光显微镜检显示：巨噬细胞细胞对于CS-pPES的摄取能力有限,而MCS-pPES对抗原的摄取能力显着增强,提示经甘露糖修饰的壳聚糖递送系统可增强巨噬细胞对疫苗复合物的摄取能力。综上,我们创新性设计并构建了多结核T表位嵌合的蛋白支架DNA疫苗pPES,并证实该表位嵌合构建方式的免疫效果显着优于表位简单串联、表位串联后与HSP65串联。为诱导结核特异性黏膜免疫,增强早期肺黏膜局部的SIgA（?）黏膜T细胞免疫,以壳聚糖作为黏膜递送载体对多表位DNA疫苗予以组装。CS-pPES疫苗经滴鼻免疫,显着增强了裸露DNA所不能诱导的肺灌洗液SIgA和肺单核细胞IFN-γ+T细胞应答：而整体T细胞应答强度和抗结核保护效果仍低于BCG。为进一步增强黏膜免疫,对壳聚糖进行甘露糖化修饰而后制备MCS-pPES黏膜结核疫苗。证实其滴鼻免疫诱导的各项全身免疫和黏膜免疫显着高于CS-pPES疫苗：不仅如此,在肺灌洗液SIgA、肺脏单核细胞5肽特异性IFN-γ+T应答、IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T应答均显着高于BCG组,提示诱导肺脏黏膜免疫的能力得以显着提高。最终的免疫保护效果也得以显着提高。经体外机制的探讨,证实对递送载体甘露糖化的设计的确显着增强了肺泡巨噬细胞靶向、肺泡抗原表达和巨噬细胞摄取。这一黏膜靶向性载体（佐剂）设计策略兼顾了黏膜靶向和黏膜APC功能增强功能,预期在增加我们的结核疫苗的表位种类和组合基础上（目前仅5个表位,偏少）,可实现更为有效可观的结核疫苗保护效果。本研究为多表位结核疫苗的分子设计及新型结核黏膜疫苗设计提供了新思路,为肺结核的免疫保护机制提供了有关肺脏黏膜SIgA和黏膜T细胞应答的有益补充。制备的两种结核黏膜疫苗在进一步增加优势抗原表位组合基础上,有望获得更为高效的黏膜免疫与结核保护效果。
黄超宾[8]（2014）在《TGF-β1在流感病毒引起的睾丸免疫反应中的调节作用》文中认为睾丸是一种具有免疫豁免特权的器官,睾丸中的免疫细胞（如巨噬细胞,T细胞,树突状细胞等）与睾丸间质细胞（LC细胞）紧密相邻,都位于间质区域,暗示它们之间存在着功能间的相互作用。LC细胞除了产生雄激素,也产生许多细胞因子,如TGF-β1, IL-6, IL-1α。这些细胞因子能够直接影响与其相邻的免疫细胞。尽管睾丸是具有免疫豁免的器官,它仍然能被许多病原体感染,而且许多男性生殖道感染是无症状或未被确诊的。甲型流感病毒（IAV）是季节性流感及流感大流行的病原体,它所造成的的某些原因不明的严重症状表明,流感病毒可能在人类中引起更为复杂的疾病。流感病毒已经被假设能够引起睾丸炎,但早期的病例报道时间非常久远,并且当时的技术水平还没有从睾丸中分离出流感病毒,因此没有直接证据支持这一假说。本研究使用甲型流感病毒感染小鼠和雪貂作为动物模型,研究其所引起的睾丸炎及其恢复机理。结果表明甲型流感病毒（WSN,2009H1N1,2009H5N1, H3N2和H7N9）通过直接感染小鼠及雪貂的LC细胞引起一过性睾丸炎。流感病毒受体SA-a2,3-半乳糖-和SA-a2,6-半乳糖-唾液酸主要定位于睾丸LC表面,但是两种流感病毒受体在睾丸间质细胞干细胞（SLC）中都不表达,因此流感病毒侵入睾丸后,LC细胞被感染破坏,SLC则不会受到感染,由于LC细胞是睾丸TGF-β1的主要来源,它受到破坏引起TGF-β1表达量降低,低水平的TGF-β1引起SLC启动自我更新及分化,补充受到破坏的LC细胞,新生无病毒的LC细胞,使血清睾酮水平恢复到正常范围,同时TGF-β1表达量恢复到正常水平,从而引起调节性T细胞（Treg）数量的上升,并最终使睾丸恢复到正常状态。二氢睾酮预处理使小鼠组织中Treg水平升高,能够削弱机体过激的免疫反应,减轻小鼠的发病率和死亡率,并能够阻止睾丸炎的发生。另外,106例流感时期病人（H3N2-,2009-H1N1-和2013-H7N9-病例）的血清学分析表明,睾酮水平在急性感染期显着下降,恢复期逐渐恢复到正常值,人睾丸穿刺切片也检测到流感病毒受体的表达,说明其具有广谱性。本研究表明,TGF-β1在调控SLC的活化,Treg细胞的诱导,以及维持睾丸稳态和睾丸免疫豁免过程中发挥着极其重要的作用,另外,本研究提出将雄激素受体作为预防和治疗甲型流感病毒感染的潜在研究靶标。
刘建[9]（2014）在《干扰素作为免疫调节剂在商品肉鸡上的应用研究》文中提出禽流感是由A型流感病毒引起的禽类传染病,H9亚型禽流感为低致病力禽流感,能引起少量死亡或不死亡,表现为生长障碍和产蛋量下降。新城疫是由副粘病毒引起的重要禽类传染病,在我国饲养的各类家禽中时有发生。干扰素是一类重要的细胞因子,具有广泛生物学活性的,是由机体细胞受到病毒或其它诱生剂的作用而产生的一种分泌性糖蛋白,具有免疫调节、抗细胞增殖、抗病毒等多种生物学活,是生物体防御系统的重要组成部分。本文调查了健康商品肉鸡场鸡新城疫和禽流感H9病毒的感染情况,同时研究了混饮低剂量鸡α-干扰素（ChIFN-α）,人α-干扰素（IFN-α）对健康肉鸡新城疫（NDV）、禽流感（AIV）疫苗免疫效果的影响。本论文主要进行以下内容的试验项目：1、商品肉鸡场鸡新城疫和禽流感H9病毒流行病学研究：通过从商品肉鸡场中健康肉鸡中分离新城疫和禽流感H9病毒,分析在健康肉鸡中是否存在病毒的隐性感染。通过对分析样品处理,尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚分离病毒,PCR和胶体金等方法检测新城疫和禽流感H9病毒。结果表明,所检鸡群无H9禽流感和新城疫病毒。2、鸡重组干扰素对疫苗的免疫调节作用：在常规免疫的肉鸡群中,11日龄肉鸡连续混饮1头份剂量的ChIFN-α。分别在混饮后14d,32d翼静脉采取血样,检测新城疫、禽流感血凝抑制抗体、双夹心ELISA法测定血清中新城疫和禽流感H9中和抗体水平。结果显示18日龄,试验组新城疫比对照组的平均值多0.3个滴度、禽流感血凝抑制抗体比对照组的平均值多0.22个滴度,试验组个体之间的均匀度优于对照组；28日龄,试验组新城疫比对照组的平均值多1个滴度、禽流感血凝抑制抗体比对照组的平均值多1.1个滴度,试验组个体之间的均匀度优于对照组；42日龄ND抗体水平,试验组比对照组的平均值多0.34个滴度,抗体离散度差异大,试验组个体之间的均匀度优于对照组,两组之间无差异。25日龄,试验组新城疫和禽流感H9抗体比对照组的平均值多0.25和0.370D。3、不同种属干扰素对疫苗的免疫调节作用：11日龄肉鸡分别混饮鸡重组干扰素ChIFN-α和人重组干扰素HuIFN-α。免疫14d后检测对肉鸡体液免疫水平的影响。结果显示使用鸡或人重组干扰素的鸡群新城疫、禽流感抗体均显着高于对照组,平均抗体滴相差达2个滴度以上,试验组A和B之间无显着差异。说明人用和鸡用干扰素均可显着提高新城疫、禽流感疫苗抗体水平。4、混饮ChIFN-α后对肉鸡免疫器官的影响。混饮鸡用干扰素从组织学上观察能提高免疫细胞的数量。5、混饮ChIFN-α后对肉鸡生长发育的影响。于42日龄各组分别称重,以组为单位计算各处理组的平均日增重。结果显示,混饮ChIFN-α后对肉鸡生长发育影响不显着。
林诠彬[10]（2014）在《微粉化板蓝根对鸡冠状病毒（IBV）作用的基础研究》文中认为实验目的：通过干式研磨粉碎法制备微粉化板蓝根颗粒,在原代鸡胚肾细胞模型上比较不同粒径大小的板蓝根颗粒对鸡传染性支气管炎病毒的抑制作用,探讨微粉化对板蓝根活性成分药效的影响。在体外模型实验的基础上,选择最适粒径的板蓝根微粉作为研究对象,通过在鸡胚模型和雏鸡模型比对微粉化后的板蓝根颗粒和没有经过处理的普通板蓝根水提物对鸡传染性支气管炎病毒复制的影响,进一步阐述微粉化处理能提高板蓝根药效,为传统中药开发提供一个新的策略。实验方法：利用简单的干式研磨法对板蓝根药材进行分步粉碎,利用不同孔径的药筛进行分级筛分,以筛分后各不相同粒径的板蓝根颗粒作为研究对象。采用透射电子显微镜法检对所获得的板蓝根微粉粒径的大小进行确证。在体外实验中,选用胰酶冷消化法制备原代鸡胚肾细胞作为体外实验的细胞模型。首先用MTT法检测不同粒径的板蓝根在原代鸡胚肾细胞上的毒性作用,并根据毒性结果作为后续实验的参考浓度。最后在原代鸡胚肾细胞上利用间接免疫荧光法检测不同粒径的板蓝根颗粒对鸡传染性支气管炎病毒M41型在原代鸡胚肾细胞上复制的影响和利用逆转录PCR法检测不同粒径板蓝根颗粒对病毒基因在原代鸡胚肾细胞上复制表达的影响,通过实验探讨微粉化后的板蓝根有效成分随其粒径的变化而发生药效上的变化。在体内实验中,参考体外实验结果选出最佳粒径的板蓝根微粒作为体内药效的评价对象。在体内实验中的鸡胚模型上通过比对未经处理过的板蓝根与微粉化后板蓝根提取物对感染鸡传染性支气管炎病毒鸡胚上的死亡保护实验,以探讨微粉化后板蓝根提取物其有效成分更优于未经处理的板蓝根。在后续实验中,以感染M41型鸡传染性支气管炎病毒的1日龄雏鸡作为实验对象,用未经处理的板蓝根的提取物和经过微粉化后的板蓝根提取物治疗7天,期间观察各组间雏鸡死亡例数计算药物治疗下雏鸡死亡保护率探讨微粉化后板蓝根颗粒与未处理板蓝根间药效区别。通过记录各组间雏鸡动态体重的变化、病理程度、临床症状以及血清中IFN-γ水平对微粉化板蓝根药效进行综合性的评价。实验结果：经过分步粉碎及粉筛可成功获得粒径为550μm、250μm以及100μm大小的微粉化板蓝根颗粒。根据样品获得重量与投料重量比值,550μ m板蓝根和粒径250μm、粒径100μm的板蓝根微粉的获得率分别为12%、20.5%和17.8%。经透射电子显微镜法验证受试样品的粒径大小及其结构的完整性,可见各受试样品呈完整的圆球状,适用于后续体外抗冠状病毒实验。利用胰酶冷消化法可以获得存活率达85-88%的原代鸡胚肾细胞。原代鸡胚肾细胞在复苏后经过贴壁12小时候后呈典型上皮样形状,形态正常、边缘整齐适用于后续体外抗病毒药效试验。在各待测样品对原代鸡胚肾细胞的毒性浓度测定的实验中发现,粒径为550μ m、250u m以及100μ m的板蓝根微粉在最大实验浓度200mg/ml浓度上对原代鸡胚肾细胞的破坏率分别为35.7%、18.75%和22.32%。经过对数据进行处理和分析发现,板蓝根体外毒性作用的大小与粒径的大小呈负相关。但粒径550μ m和250u m间经组间比较其P值大于0.05,提示其毒性作用相当（P>0.05）,无统计学意义。而粒径100μ m板蓝根颗粒组间比较其P值小于0.05,提示具有统计学意义。利用间接免疫荧光染色法测定M41型鸡传染性支气管炎病毒在原代鸡胚肾细胞上的感染复数M0I为10-5.54/0.2ml。用moi=5的病毒悬液感染原代鸡胚肾细胞,并将不同粒径大小的板蓝根颗粒加入培养基中观察不同粒径板蓝根微粉在不同浓度下对病毒粒子复制的影响。经初步发现粒径在550u m的板蓝根微粉在最大实验浓度100mg/ml浓度下对病毒粒子复制有42.77%的抑制作用,而粒径为250u m的板蓝根在100mg/ml浓度下对病毒粒子复制有39.16%抑制率,经组间比对两者间无统计学意义（P<0.05）。但粒径为100μ m的板蓝根颗粒在同等浓度下（100mg/ml）对病毒粒子复制的抑制率高达63.25%,经统计分析其具有统计学意义和量效关系。而在观察不同粒径板蓝根微粉在不同浓度下对病毒基因表达实验中发现：粒径在550u m的板蓝根在100mg/ml浓度下对病毒基因的抑制率仅为31.66%（<50%）,其最小实验浓度25mg/ml浓度对病毒基因无抑制作用。粒径在250u m的板蓝根颗粒在100mg/ml浓度下对病毒S基因的抑制作用最强,其抑制率可达65.82%,随着实验浓度的降低,其对病毒基因的抑制率下降至49.41%（50mg/ml）、35.21mg/ml（25mg/ml）。粒径在100μ m的板蓝根颗粒在100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml浓度下起抑制率分别为67.9%、30.1%、36.6%,说明随着板蓝根粒径的减小其体外对冠状病毒抑制的能力越强。在体内实验中,根据体外实验结果选择最佳粒径为100μ m的板蓝根颗粒作为研究对象。比较未经处理过的板蓝根和微粉化后的板蓝根在体内对鸡传染性支气管炎病毒M41型的抑制作用,进一步阐明微粉化对板蓝根药效的影响。在鸡胚模型上观察到未处理的板蓝根治疗组和微粉化板蓝根治疗组均能延迟鸡胚死亡的高峰期（与病毒对照组相比,可推迟2天）,但微粉化板蓝根对鸡胚的死亡保护作用明显优于未经处理的板蓝根治疗组。病毒对照组在无任何药物治疗下其鸡胚死亡率高达70%；阳性药物利巴韦林对照组的死亡率仅有10%。在微粉化板蓝根治疗下,感染IBV的雏鸡只发生30%的死亡率,远比普通板蓝根组的死亡率低。（普通板蓝根组为50%,低20%）提示微粉化后的板蓝根对IBV感染的雏鸡具有更强的保护作用,能大大降低雏鸡在感染IBV病毒后的死亡率。对感染IBV各组间的雏鸡做动态体重记录总发现病毒对照组体重增加的曲线最为平缓,位于各组曲线之下,提示病毒感染组雏鸡体重增长缓慢。而阳性药物利巴韦林组与正常对照组相当,S100板蓝根对组虽然在前期体重增长较为平缓,但在药物治疗第7天后其增重迅速,可在第10天达到与正常组持平水平。普通板蓝根组中雏鸡体重增加稍弱于S100板蓝根组,后期体重增加较为平缓。通过此图可推断微粉化后的板蓝根能改善雏鸡感染病毒后体重减轻的病情,与普通板蓝根对照组相比具有更强的疗效。在实验结束后对存活雏鸡进行病理解剖发现经过药物治疗后雏鸡其鼻腔、气管等渗出物明显比病毒对照组少（或者无渗出物）、气囊清晰透亮、肾脏上偶见微小出血点等,其症状明显比病毒对照组轻微。提示在药物治疗下感染IBV病毒雏鸡的病理状况明显减轻,而S100板蓝根对照组作用比普通板蓝根明显。在后续实验中,通过观察未经处理的板蓝根治疗组和微粉化后板蓝根治疗组治疗感染IBV雏鸡对雏鸡临床病症的影响中发现：在给予药物治疗下,阳性药物利巴韦林对照组对感染IBV雏鸡呼吸道症状明显减轻（P<0.05）。与病毒对照组相比,普通板蓝根治疗组和S100微粉化板蓝根药物组对IBV感染雏鸡呼吸道症状均有较好的缓解作用（P<0.05）。但与普通板蓝根药物组相比,微粉化板蓝根治疗组仅在流涕及呼吸困难两个方面的作用优于普通板蓝根治疗组（P<0.05）,其他两种临床症状无明显差别（P>0.05）。但有趣的是在检测感染IBV病毒雏鸡血液中IFN-y因子水平时,与病毒对照组相比,药物治疗组中的阳性药物利巴韦林与普通板蓝根治疗组均能降低雏鸡血清中的IFN-r因子水平,分别下降的水平为16.42%、16.52%,（P<0.05）；相反微粉化板蓝根颗粒仅能降低雏鸡体内9.46%IFN-r因子水平（P>0.05）。结果间接提示在对感染IBV鸡传染性支气管炎病毒的雏鸡血清中IFN-r因子的作用上,普通板蓝根治疗的效果更强。因此推断微粉化后的板蓝根或许由于在制备过程中容易造成某些活性成分的流失、也或许由于其粒径太小活性成分容易被胃肠道中酶破坏而降低其治疗结果。微粉化能改变中药的机理?结论：经过初步实验获知,通过干式研磨法对板蓝根药材进行分步细化粉碎步骤,结合过滤筛分可获得粒径550μm、250μm和100pm的板蓝根微粉颗粒。其工艺简洁、成本低、效率高、易于操作。微粉化后的板蓝根在体外实验中其毒性作用均降低,但对病毒的抑制能力随着粒径的减小而增强,以粒径为100μ m的板蓝根最为显着。在体内实验中,与未经处理的板蓝根治疗组相比,微粉化的板蓝根在抑制M41型鸡传染性支气管炎作用上具有更强的疗效,表现在：延长鸡胚死亡高峰期、降低鸡胚死亡率、减轻感染雏鸡病理程度、缓解雏鸡临床感染症状等各方面。但对雏鸡血清中IFN-γ的影响作用不如未经处理的板蓝根治疗组,因此推断微粉化或许能改变板蓝根抗病毒的机制,为传统中药的开发提供一个全新的方向和策略。针对于此现象,应在今后进行更深的探索,以阐明其中可能存在的机理。
二、硫酸链霉素滴鼻液的制备与疗效观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、硫酸链霉素滴鼻液的制备与疗效观察（论文提纲范文）
（1）蝎黄解痉治哮颗粒影响NF-κB和HIF-1α信号传导通路治疗哮喘的调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 文献综述一 支气管哮喘的中西医研究概况 |
| 1 病名与症状的研究 |
| 2 病因病机 |
| 3 古今医家论治支气管哮喘 |
| 4 支气管哮喘发病机制的中医研究 |
| 5 现代医学对于支气管哮喘的研究 |
| 6 小结 |
| 文献综述二 哮喘模型动物的选择与建立 |
| 1 实验动物的选择 |
| 2 小鼠哮喘模型的致敏剂与剂量 |
| 3 不同病理改变的哮喘模型小鼠 |
| 4 特殊种类哮喘的鼠类模型 |
| 5 细胞模型 |
| 6 小结 |
| 实验研究 |
| 第一章 蝎黄解痉治哮颗粒通过抑制MAPKs/NF-κB通路改善急性哮喘气道炎症 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 蝎黄解痉治哮颗粒通过抑制MAPKs和AKT/HIF-1α通路改善哮喘气道重塑 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间科研成果 |
| 个人简历 |
（2）以岗梅为主的银蒿解热合剂质量标准及药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 银蒿解热合剂及其主药岗梅的研究概况 |
| 1.1 主药岗梅的研究概况 |
| 1.1.1 岗梅的药理作用 |
| 1.1.1.1 抗炎作用 |
| 1.1.1.2 镇痛作用 |
| 1.1.1.3 镇咳作用 |
| 1.1.1.4 抗菌作用 |
| 1.1.1.5 抗病毒作用 |
| 1.1.1.6 抗肿瘤作用 |
| 1.1.1.7 免疫功能调节作用 |
| 1.1.1.8 对心血管的影响 |
| 1.1.1.9 对脂肪肝的干预作用 |
| 1.1.1.10 急性毒性 |
| 1.1.2 临床应用 |
| 1.1.2.1 治疗冠心病 |
| 1.1.2.2 治疗上呼吸道疾病 |
| 1.1.2.3 防治各种感染 |
| 1.1.2.4 其他疾病 |
| 1.2 主药岗梅的复方制剂研究概况 |
| 1.2.1 临床常用剂型及其制备工艺 |
| 1.2.1.1 以岗梅为主药的合剂 |
| 1.2.1.2 以岗梅为主药的颗粒剂 |
| 1.2.1.3 以岗梅为主药的片剂 |
| 1.2.1.4 以岗梅为主药的口服液 |
| 1.2.1.5 以岗梅为主药的丸剂 |
| 1.2.2 质量标准 |
| 1.2.2.1 以岗梅为主的合剂 |
| 1.2.2.2 以岗梅为主药的颗粒剂 |
| 1.2.2.3 含岗梅的片剂与胶囊 |
| 1.2.2.4 其他剂型 |
| 1.2.3 临床常用剂型的适应证及应用 |
| 1.2.4 讨论 |
| 1.3 银蒿解热合剂的研究概况 |
| 1.3.1 银蒿解热合剂工艺优化研究 |
| 1.3.1.1 实验方法与结果 |
| 1.3.1.2 讨论 |
| 1.3.2 银蒿解热合剂已有质量标准研究 |
| 1.3.3 银蒿解热合剂治疗外感发热的临床研究报告 |
| 1.3.3.1 资料与方法 |
| 1.3.3.2 讨论 |
| 第二章 银蒿解热合剂的质量标准研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 药品和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 岗梅的薄层鉴别 |
| 2.2.1.1 三氯甲烷方法 |
| 2.2.1.2 乙酸乙酯方法 |
| 2.2.1.3 结果 |
| 2.2.1.4 方法学考察 |
| 2.2.2 金银花的薄层鉴别 |
| 2.2.2.1 甲醇静置方法 |
| 2.2.2.2 绿原酸点样量的考察 |
| 2.2.2.3 结果 |
| 2.2.2.4 点样量的考察 |
| 2.2.2.5 方法学考察 |
| 2.2.3 连翘的薄层鉴别 |
| 2.2.3.1 甲醇提取方法 |
| 2.2.3.2 连翘苷点样量的考察 |
| 2.2.3.3 结果 |
| 2.2.3.4 桑叶的薄层鉴定 |
| 2.2.3.5 方法学考察 |
| 2.2.4 桑叶的薄层鉴定 |
| 2.2.4.1 乙醇超声方法 |
| 2.2.4.2 改良后的乙醇超声方法 |
| 2.2.4.3 结果 |
| 2.2.4.4 方法学考察 |
| 2.2.5 柴胡的薄层鉴定 |
| 2.2.5.1 甲醇超声方法 |
| 2.2.5.2 正丁醇方法 |
| 2.2.5.3 结果 |
| 2.2.5.4 方法学考察 |
| 2.2.6 绵马贯众的薄层鉴定 |
| 2.2.6.1 环己烷超声方法 |
| 2.2.6.2 盐酸酸化乙醚提取方法 |
| 2.2.6.3 结果 |
| 2.2.6.4 方法学考察 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 银蒿解热合剂的药效学研究 |
| 3.1 银蒿解热合剂的抗炎实验研究 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 实验仪器 |
| 3.1.1.2 动物 |
| 3.1.1.3 药物、药品及试剂 |
| 3.1.2 药液的制备 |
| 3.1.3 统计结果处理 |
| 3.1.4 实验方法与结果 |
| 3.1.4.1 醋酸致小鼠毛血管通透性增高实验 |
| 3.1.4.2 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验 |
| 3.1.4.3 灭菌棉球致大鼠蹊部肉芽组织增生实验 |
| 3.1.5 讨论与小结 |
| 3.2 银蒿解热合剂的镇痛实验研究 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 实验仪器 |
| 3.2.1.2 动物 |
| 3.2.1.3 药物、药品及试剂 |
| 3.2.2 药液的制备 |
| 3.2.3 统计结果处理 |
| 3.2.4 实验方法与结果 |
| 3.2.4.1 热板致小鼠疼痛实验 |
| 3.2.4.2 醋酸致小鼠扭体实验 |
| 3.2.5 讨论与小结 |
| 3.3 银蒿解热合剂与岗梅药材的解热实验研究 |
| 3.3.1 材料 |
| 3.3.1.1 实验仪器 |
| 3.3.1.2 动物 |
| 3.3.1.3 药物、药品及试剂 |
| 3.3.2 药液的制备 |
| 3.3.3 统计结果处理 |
| 3.3.4 实验方法与结果 |
| 3.3.4.1 干酵母致大鼠发热实验 |
| 3.3.5 讨论与小结 |
| 第四章 结语 |
| 4.1 实验方法讨论与结论 |
| 4.1.1 实验方法讨论 |
| 4.1.2 实验结论 |
| 4.1.2.1 质量标准提高实验 |
| 4.1.2.2 药效学研究 |
| 4.2 展望与结语 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 发表论文 |
| 参编着作 |
| 参与课题 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（3）抗甲型流感病毒卵黄抗体的制备、活性评价及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表（Abbreviations） |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 流感的危害及其流行病学 |
| 1.2 甲型流感病毒概述 |
| 1.2.1 流感病毒的分类和命名 |
| 1.2.2 甲型流感病毒的形态及基因组成 |
| 1.2.3 甲型流感病毒主要抗原及其特点 |
| 1.2.4 甲型流感病毒遗传变异规律 |
| 1.2.5 甲型流感病毒的增殖周期 |
| 1.2.6 甲型H1N1流感病毒 |
| 1.2.7 甲型流感病毒的检测 |
| 1.2.8 甲型流感病毒预防与治疗研究进展 |
| 1.3 卵黄抗体研究进展 |
| 1.3.1 IgY的结构特点及其生物学特性 |
| 1.3.2 IgY的稳定性研究 |
| 1.3.3 IgY的提取与分离纯化 |
| 1.3.4 IgY的应用 |
| 1.4 研究意义和主要工作 |
| 第二章 抗甲型流感病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 实验溶液配制 |
| 2.5.2 甲型H1N1流感病毒的培养与鉴定 |
| 2.5.3 抗原制备及动物免疫 |
| 2.5.4 IgY提取与纯化 |
| 2.5.5 SDS-PAGE |
| 2.5.6 IgY蛋白含量测定 |
| 2.5.7 抗体效价检测 |
| 2.5.8 IgY特异性检测 |
| 2.5.9 数据处理及统计分析 |
| 2.6 结果与分析 |
| 2.6.1 病毒的培养与鉴定 |
| 2.6.2 IgY产率 |
| 2.6.3 分离纯化各部分纯度分析 |
| 2.6.4 IgY蛋白含量测定 |
| 2.6.5 抗体效价随时间的变化 |
| 2.6.6 IgY特异性检测结果 |
| 2.7 讨论 |
| 2.7.1 IgY特点及其与血清抗体之间的关系 |
| 2.7.2 IgY的分离纯化 |
| 2.8 本章小结 |
| 第三章 抗甲型H1N1流感病毒卵黄抗体的活性评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试剂与仪器 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 琼脂扩散试验 |
| 3.3.2 免疫荧光实验 |
| 3.3.3 免疫印迹试验 |
| 3.3.4 血凝抑制试验 |
| 3.3.5 抗H732 IgY对MDCK细胞毒性测定 |
| 3.3.6 抗H732 IgY体外细胞水平的抗病毒活性评价 |
| 3.3.7 抗H732 IgY稳定性试验 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 抗H732 IgY对病毒的免疫沉淀作用 |
| 3.4.2 抗H732 IgY免疫荧光检测 |
| 3.4.3 抗H732 IgY对病毒膜蛋白的特异性结合作用 |
| 3.4.4 抗H732 IgY的血凝抑制作用 |
| 3.4.5 对MDCK细胞最大无毒浓度 |
| 3.4.6 不同添加方式的空斑减数率 |
| 3.4.7 抗H732 IgY稳定性试验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 抗甲型H1N1流感病毒卵黄抗体小鼠体内的抗病毒活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试剂与仪器 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 H732病毒感染BALB/C小鼠半数致死量测定(LD50) |
| 4.3.2 抗H732 IgY对H732感染小鼠的死亡保护作用 |
| 4.3.3 抗H732 IgY对H732感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 H732病毒毒力的测定 |
| 4.4.2 抗H732 IgY对H732感染小鼠的死亡保护作用 |
| 4.4.3 抗H732 IgY对H732感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 甲型H1N1流感病毒表面增强拉曼光谱免疫分析方法的建立与应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.1.1 拉曼光谱和表面增强拉曼光谱简介 |
| 5.1.2 表面增强拉曼光谱技术应用于标记免疫分析的原理 |
| 5.1.3 本章技术路线 |
| 5.2 试剂 |
| 5.3 仪器设备 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 溶液的配制及保存 |
| 5.4.2 金溶胶的制备 |
| 5.4.3 4,4’-联吡啶标记免疫金溶胶的制备 |
| 5.4.4 用烷基化(APES)处理,醛基化(GA)修饰的固相基底的制备 |
| 5.4.5 基于H1N1流感病毒的“三明治”结构的组装及SERS检测 |
| 5.5 结果及分析 |
| 5.5.1 金溶胶溶液中金颗粒的电镜检测结果 |
| 5.5.2 紫外光谱表征金溶胶及标记金溶胶特性 |
| 5.5.3 SERS光谱表征4,4’-联吡啶标记量的影响 |
| 5.5.4 抗H732 IgY标记免疫金溶胶的SERS光谱 |
| 5.5.5 SERS标记免疫检测H732流感病毒 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）鼻嗅御感方对FM1-6-E2流感病毒的防护及其免疫调节作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分、鼻嗅御感方体外抗FM1-6-E2流感病毒效果观察 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1、FM1-6-E2血凝效价测定 |
| 2、FM1-6-E2 TCID_(50)测定 |
| 3、药物对MDCK细胞毒性作用的测定 |
| 4、鼻嗅御感方对FM1-6-E2流感病毒的预防作用 |
| 5、鼻嗅御感方对FM1-6-E2流感病毒的直接灭活作用 |
| 四、小结 |
| 第二部分、鼻嗅御感方体内防治流感效果观察 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1、流感模型小鼠染毒剂量摸索 |
| 2、鼻嗅御感方对流感模型小鼠行为及体质量的影响 |
| 3、鼻嗅御感方对流感模型小鼠的死亡保护作用 |
| 四、小结 |
| 第三部分、鼻嗅御感方对流感模型小鼠免疫功能的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1、鼻嗅御感方对流感模型小鼠肺指数及肺指数抑制率的影响 |
| 2、鼻嗅御感方对流感模型小鼠胸腺指数及脾指数的影响 |
| 3、鼻嗅御感方对流感模型小鼠外周血NK细胞杀伤活性的影响 |
| 4、鼻嗅御感方对流感模型小鼠外周血T细胞亚群表达的影响 |
| 5、鼻嗅御感方对流感模型小鼠脾组织NK细胞杀伤活性的影响 |
| 6、鼻嗅御感方对流感模型小鼠脾组织T细胞亚群表达的影响 |
| 7、鼻嗅御感方对流感模型小鼠呼吸道SIg-A分泌的影响 |
| 8、鼻嗅御感方对流感模型小鼠血清SIg-A表达的影响 |
| 9、鼻嗅御感方对流感模型小鼠血清INF-γ表达的影响 |
| 四、小结 |
| 第四部分、讨论 |
| 一、国内外防治流感研究现状 |
| 二、中医对流感的认识 |
| 三、课题研究思路 |
| 四、课题特点 |
| 五、展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录：文献综述 中医药防治流感研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录：在校期间发表学术论文着作及参与科研工作 |
| 致谢 |
（5）甘露糖受体介导的多糖重组抗原铜绿假单胞菌疫苗的研制及其免疫分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 甘露糖受体靶向传递系统的研究进展 |
| 1.1 甘露糖受体概况 |
| 1.1.1 甘露糖受体类型 |
| 1.1.2 甘露糖受体的多聚化和亲和力 |
| 1.2 甘露糖受体对抗原的摄取与递呈 |
| 1.3 甘露糖受体的免疫激活 |
| 1.4 甘露糖受体的靶向疫苗相关研究 |
| 第二章 生物降解材料简述 |
| 2.1 壳聚糖 |
| 2.1.1 壳聚糖基本性质 |
| 2.1.2 离子凝聚法制备壳聚糖微球 |
| 2.2 PLGA |
| 2.2.1 PLGA 基本性质 |
| 2.2.2 PLGA 疫苗相关研究 |
| 2.3 壳聚糖和 PLGA 的吸附静电作用 |
| 第三章 鼻黏膜免疫微球载体疫苗 |
| 3.1 鼻黏膜免疫的特点 |
| 3.1.1 鼻黏膜免疫的优点 |
| 3.1.2 鼻黏膜免疫的缺点 |
| 3.2 鼻黏膜免疫壳聚糖载体疫苗近期研究进展 |
| 3.3 黏膜免疫甘露糖修饰的壳聚糖载体疫苗近期研究进展 |
| 第四章 铜绿假单胞菌疫苗研究进展 |
| 4.1 脂多糖（LPS）和 O-多糖疫苗 |
| 4.2 粘液胞外多糖疫苗 |
| 4.3 鞭毛疫苗 |
| 4.4 菌毛疫苗 |
| 4.5 外膜蛋白疫苗 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 重组抗原铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprF190–342-OprI21–83基因克隆、表达及生物信息学分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和表达载体 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 仪器和设备 |
| 1.1.4 试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprF190–342-OprI21–83基因克隆表达与鉴定 |
| 1.2.2 铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprF190–342-OprI21–83核酸及蛋白序列的生物信息学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprF190–342-OprI21–83基因克隆表达与鉴定 |
| 1.3.2 铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprF190–342-OprI21–83基因及蛋白序列生物信息学分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 生物可降解多糖微球载体疫苗的制备及体外评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要药品和试剂 |
| 2.1.2 仪器和设备 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 甘露糖修饰的壳聚糖衍生物的制备 |
| 2.2.2 壳聚糖和甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗的制备及体外评价 |
| 2.2.3 壳聚糖和甘露糖修饰的壳聚糖包衣的 PLGA 微球载体疫苗的制备及体外评价 |
| 2.2.4 数据的统计与分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 甘露糖修饰的壳聚糖衍生物的获得 |
| 2.3.2 壳聚糖和甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗的表征 |
| 2.3.3 壳聚糖和甘露糖修饰的壳聚糖包衣的 PLGA 微球载体疫苗的表征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 生物可降解多糖微球载体疫苗在巨噬细胞中的摄取及其靶向性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验细胞株和动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 仪器和设备 |
| 3.1.4 试剂的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 生物可降解多糖微球载体疫苗在巨噬细胞中的摄取 |
| 3.2.2 FI-MCS-MPs 和 FI-MCP-MPs 靶向巨噬细胞甘露糖受体研究 |
| 3.2.3 数据的统计与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 生物可降解多糖微球载体疫苗在巨噬细胞中的摄取 |
| 3.3.2 FI-MCS-MPs 和 FI-MCP-MPs 靶向巨噬细胞甘露糖受体研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 巨噬细胞甘露糖受体介导甘露糖修饰的多糖微球载体疫苗促进 MAPK 和 NF-κB 信号通路的活化 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验细胞株 |
| 4.1.2 主要药品和试剂 |
| 4.1.3 仪器和设备 |
| 4.1.4 试剂的配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 小鼠巨噬细胞 RAW264.7 的培养 |
| 4.2.2 MTT 方法检测生物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠巨噬细胞 RAW264.7 的毒性作用 |
| 4.2.3 巨噬细胞分泌细胞因子的测定 |
| 4.2.4 信号通路细胞蛋白的提取及 Western blot 检测 |
| 4.2.5 信号通路蛋白 Western blot 检测 |
| 4.2.6 数据的统计与分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 生物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠巨噬细胞 RAW264.7的毒性作用 |
| 4.3.2 生物可降解多糖微球载体疫苗对巨噬细胞细胞因子分泌的影响 |
| 4.3.3 生物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠巨噬细胞 RAW264.7NF-κB 信号转导通路的影响 |
| 4.3.4 物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠巨噬细胞 RAW264.7MAPK 信号转导通路的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 生物可降解多糖微球载体疫苗在小鼠中的黏膜免疫效果评价及安全性效力评价 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 主要药品和试剂 |
| 5.1.3 仪器和设备 |
| 5.1.4 试剂的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 实验动物免疫程序 |
| 5.2.2 黏膜和系统体液免疫应答的影响 |
| 5.2.3 黏膜和系统中 T 淋巴细胞亚群水平的影响 |
| 5.2.4 肺脏脾脏 T 淋巴细胞培养上清 IFN-γ和 IL-4 细胞因子测定 |
| 5.2.5 生物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠攻毒保护效果研究 |
| 5.2.6 数据的统计与分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 黏膜和系统体液免疫应答的影响 |
| 5.3.2 黏膜和系统中 T 淋巴细胞亚群水平的影响 |
| 5.3.3 肺脏脾脏淋巴细胞培养上清 IFN-γ和 IL-4 细胞因子测定 |
| 5.3.4 生物可降解多糖微球载体疫苗对小鼠攻毒保护效果研究 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 生物可降解多糖微球载体疫苗在水貂中的黏膜免疫效果评价及安全性效力评价 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 实验动物和菌株 |
| 6.1.2 主要药品和试剂 |
| 6.1.3 仪器和设备 |
| 6.1.4 试剂的配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 实验动物免疫程序 |
| 6.2.2 血清中 FI 特异性抗体的检测 |
| 6.2.3 生物可降解多糖微球载体疫苗对水貂攻毒保护效果研究 |
| 6.2.4 数据的统计与分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 血清中 FI 特异性抗体的检测 |
| 6.3.2 生物可降解多糖微球载体疫苗对水貂攻毒保护效果研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 个人简介 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）商陆的性味研究（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 中药性味理论的研究 |
| 1.1.1 中药性味理论的发展与演变 |
| 1.1.2 五味的发展与演变 |
| 1.1.3 四气的发展与演变 |
| 1.1.4 四气与五味的关系 |
| 1.2 中药性味理论的研究现状 |
| 1.2.1 五味理论的研究现状 |
| 1.2.2 四气(性)理论的研究现状 |
| 1.2.3 近年具有代表性的中药性味相关学术理论研究 |
| 1.2.4 中药性味理论假说 |
| 1.2.5 中药性(气)味科学内涵的新假说 |
| 1.3 商陆的研究概况 |
| 1.3.1 商陆药用品种的考证 |
| 1.3.2 商陆化学成分的研究 |
| 1.3.3 药理与毒副作用研究 |
| 1.3.4 临床应用研究 |
| 第2章 商陆的性味考证 |
| 2.1 性味的考证 |
| 2.1.1 味的考证 |
| 2.1.2 味“辛”的考证 |
| 2.1.3 味“酸”的考证 |
| 2.1.4 味“苦”的考证 |
| 2.2 性的考证 |
| 2.3 小结 |
| 第3章 商陆性味物质基础的拆分研究 |
| 3.1 仪器与药品 |
| 3.1.1 药材 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 商陆性味物质基础的拆分方法 |
| 3.2.2 商陆拆分组分化学特征研究 |
| 3.2.3 商陆各拆分组分的化学成分互不交叉性研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 商陆性味物质基础的拆分 |
| 3.3.2 商陆性味物质基础的化学特征研究 |
| 3.3.3 商陆性味拆分组分的化学成分互不交叉性研究 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 3.4.1 商陆药材品种和产地的确定 |
| 3.4.2 商陆性味物质基础拆分方法的建立 |
| 3.4.3 商陆性味拆分组分化学特征的一般研究 |
| 第4章 商陆化学拆分组分的性味药理学评价研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 动物 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.1.3 试剂与药物 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 商陆性味拆分组分的利尿作用研究 |
| 4.2.2 商陆性味拆分组分的促进肠蠕动作用研究 |
| 4.2.3 商陆性味拆分组分的抗炎作用研究 |
| 4.2.4 商陆性味拆分组分的免疫调节活性研究 |
| 4.2.5 商陆性味拆分组分的抗肿瘤活性研究 |
| 4.2.6 商陆性味拆分组分的抗菌活性研究 |
| 4.2.7 商陆性味拆分组分的抗病毒活性研究 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 商陆拆分组分的利尿作用 |
| 4.3.2 商陆拆分组分的促进肠蠕动作用 |
| 4.3.3 商陆拆分组分的抗炎作用 |
| 4.3.4 商陆拆分组分的免疫调节作用 |
| 4.3.5 商陆拆分组分的抗肿瘤作用 |
| 4.3.6 商陆拆分组分的抗菌与抗病毒作用 |
| 第5章 商陆性味拆分组分的归属研究 |
| 5.1 从现代科学角度对商陆性味进行归属研究 |
| 5.1.1 基于文献数据库分析相关药理作用与性味的关系 |
| 5.1.2 讨论 |
| 5.2 从传统中医药学角度对商陆性味进行归属研究 |
| 5.2.1 商陆的利尿作用是其“苦”味的功能体现 |
| 5.2.2 商陆的泻下作用是其“苦”味的功能体现 |
| 5.2.3 商陆的抗炎作用是其“辛”味的功能体现 |
| 5.2.4 商陆的免疫调节作用是其“辛”味的功能体现 |
| 5.2.5 商陆的抗肿瘤作用是其“酸”味的功能体现 |
| 5.2.6 商陆的抗菌与抗病毒作用是其“辛”味的功能体现 |
| 5.3 基于药理实验结果对商陆化学拆分组分的药味归属 |
| 第6章 商陆多糖的提取分离及结构研究 |
| 6.1 商陆粗多糖提取 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.1.3 结果与讨论 |
| 6.2 商陆多糖的分离纯化 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.2.3 结果与讨论 |
| 6.3 商陆均多糖的化学结构研究 |
| 6.3.1 实验材料 |
| 6.3.2 实验方法 |
| 6.3.3 结果与讨论 |
| 第7章 商陆多糖的抗肝损伤作用研究 |
| 7.1 商陆粗多糖的的抗肝损伤作用研究 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验方法 |
| 7.1.3 实验结果与讨论 |
| 7.2 商陆均多糖的抗氧化活性研究 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验方法 |
| 7.2.3 结果与讨论 |
| 第8章 基于抗炎作用的商陆皂苷对结肠炎的作用 |
| 8.1 商陆皂苷的提取及初步鉴定 |
| 8.1.1 实验方法 |
| 8.1.2 实验结果 |
| 8.2 DSS模型的建立 |
| 8.2.1 实验材料 |
| 8.2.2 实验方法 |
| 8.2.3 结果与讨论 |
| 8.3 商陆皂苷对DSS致小鼠结肠炎的治疗作用 |
| 8.3.1 实验材料 |
| 8.3.2 实验方法 |
| 8.3.3 结果与讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
（7）一种肺泡巨噬细胞靶向的多表位结核粘膜疫苗（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 结核病现状与结核疫苗研制现状 |
| 2. 抗结核免疫保护机制 |
| 3. 黏膜局部免疫对于抗结核免疫保护的作用 |
| 4. 本课题的新型结核疫苗设计理念：多表位蛋白支架疫苗 |
| 5. 黏膜递送载体 |
| 第一部分 多表位DNA疫苗的设计、构建、表达与免疫原性鉴定 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 以HSP65为骨架的嵌合多表位核酸疫苗PES的分子设计 |
| 3.2 真核质粒pPES、pHSP65、p5pep、pHSP65-pep的构建和鉴定 |
| 3.3 重组HSP65蛋白的原核表达纯化 |
| 3.4 pPES质粒的体外真核表达 |
| 3.5 pPES疫苗的免疫原性及嵌合蛋白载体表达的优越性 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 脱乙酰壳聚糖组装的结核DNA疫苗诱导的黏膜免疫与保护效果 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 chitosan-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性体液免疫应答 |
| 3.2 CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性全身(脾脏)细胞免疫 |
| 3.3 CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性肺局部黏膜细胞免疫 |
| 3.4 CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的抗结核免疫保护 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 甘露糖化壳聚糖增强DNA疫苗的黏膜免疫与保护效果 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料和方法 |
| 2.1 试剂材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 CS-DNA和MCS-DNA复合物的理化特性 |
| 3.2 MCS-pPES疫苗滴鼻免疫诱生的特异性抗体免疫应答 |
| 3.3 MCS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的全身(脾脏)特异性T细胞免疫 |
| 3.4 MCS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的肺黏膜局部特异性T细胞免疫 |
| 3.5 MCS-pPES黏膜疫苗滴鼻免疫诱导的免疫保护 |
| 4. 讨论 |
| 第四部分 MCS-PPES增强黏膜免疫应答的机制探讨 |
| 1. 引言 |
| 2. 试验材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 β-半乳糖苷酶为报告抗原原位组化检测MCS-DNA的肺脏表达效率 |
| 3.2. HSP65为报告抗原原位免疫组化检测MCS-DNA的肺脏表达效率 |
| 3.3 以FITC示踪MCS-DNA的肺脏巨噬细胞靶向情况 |
| 3.4 以FITC示踪MCS-DNA的巨噬细胞摄取能力 |
| 4. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（8）TGF-β1在流感病毒引起的睾丸免疫反应中的调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 睾丸炎及其研究进展 |
| 1.1.1 睾丸的解剖结构和组织结构 |
| 1.1.2 睾丸炎症 |
| 1.1.3 睾丸炎症的免疫生理及病理 |
| 1.2 流感与睾丸炎 |
| 1.2.1 流感病毒 |
| 1.2.2 流感病毒感染与睾丸炎 |
| 1.3 旨要解决的问题 |
| 第二章 研究内容 |
| 2.1 流感病毒WSN感染小鼠引起一过性睾丸炎 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.2 流感病毒直接作用引起睾丸炎 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.3 流感病毒感染所引起的睾丸炎具有广谱性 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 材料与方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.4 人类相关疾病研究 |
| 2.4.1 引言 |
| 2.4.2 材料与方法 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 2.4.4 讨论 |
| 2.5 一过性睾丸炎恢复机理 |
| 2.5.1 引言 |
| 2.5.2 材料与方法 |
| 2.5.3 实验结果 |
| 2.5.4 讨论 |
| 第三章 讨论,结论与展望 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 结论 |
| 3.3 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）干扰素作为免疫调节剂在商品肉鸡上的应用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡新城疫(ND)概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 NDV的基因组与结构蛋白特征 |
| 1.1.2.1 NDV的基因组结构 |
| 1.1.2.2 NDV的结构蛋白特征 |
| 1.1.3 新城疫的流行特点 |
| 1.1.4 新城疫的临床症状 |
| 1.1.5 新城疫的病理变化 |
| 1.1.6 新城疫的诊断及检测方法 |
| 1.1.7 防制 |
| 1.1.7.1 加强饲养管理 |
| 1.1.7.2 做好消毒工作 |
| 1.1.7.3 免疫接种 |
| 1.1.8 发生新城疫的紧急措施 |
| 1.2 禽流感(Avain Influenza,AI)概述 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流感病毒的遗传变异 |
| 1.2.2.1 抗原性变异 |
| 1.2.2.2 病毒基因组变异 |
| 1.2.3 禽流感流行特点 |
| 1.2.4 禽流感病的症状 |
| 1.2.5 禽流感在中国的流行 |
| 1.2.6 流感病毒传播 |
| 1.2.7 禽流感的防制 |
| 1.3 干扰素的概述 |
| 1.3.1 IFN的来源 |
| 1.3.2 IFN的特点 |
| 1.3.3 IFN的分类 |
| 1.3.4 IFN的作用 |
| 1.3.4.1 免疫调节作用 |
| 1.3.4.2 抗增生作用 |
| 1.3.4.3 抗病毒作用 |
| 1.3.4.4 抗纤维化作用 |
| 1.3.5 干扰素的其他应用 |
| 1.3.5.1 作为免疫佐剂对疫苗的免疫增效作用 |
| 1.3.5.2 重组鸡干扰素-γ(rChIFN-γ) |
| 1.3.5.3 干扰素的兽医临床应用 |
| 1.3.5.4 口腔黏膜途径给予IFN-α应用情况 |
| 1.4 胶体金检测技术 |
| 1.4.1 胶体金检测技术的原理 |
| 1.4.2 胶体金检测技术的功能 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品与鸡胚 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试验试剂及耗材 |
| 2.1.4 质粒及受体菌 |
| 2.1.5 试验所用溶液及其配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验动物及实验场 |
| 2.2.2 试验动物分组 |
| 2.2.3 新城疫病毒的分离与增值 |
| 2.2.3.1 新城疫病毒的分离 |
| 2.2.3.2 新城疫病毒的增值 |
| 2.2.3.3 新城疫病毒效价的检测 |
| 2.2.4 RT-PCR技术检测样本中新城疫病毒 |
| 2.2.4.1 引物设计 |
| 2.2.4.2 样品中新城疫病毒mRNA的提取 |
| 2.2.4.3 新城疫病毒部分片段的RT-PCR扩增 |
| 2.2.4.4 ND部分片段PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.4.5 目的基因的连接转化及鉴定 |
| 2.2.4.5.1 目的基因与pMD18-T载体的连接体系 |
| 2.2.4.5.2 大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5 α)的制备 |
| 2.2.4.5.3 连接产物转化 |
| 2.2.4.5.4 重组质粒DNA的提取 |
| 2.2.4.5.5 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.4.5.6 阳性克隆序列的测序 |
| 2.2.5 新城疫病毒胶体金快速检测试验 |
| 2.2.5.1 测试步骤 |
| 2.2.5.2 检测流程图 |
| 2.2.6 禽流感H9病毒的分离与增值 |
| 2.2.6.1 禽流感H9病毒的分离 |
| 2.2.6.2 禽流感H9病毒的增值 |
| 2.2.6.3 禽流感H9病毒效价的检测 |
| 2.2.7 RT-PCR技术检测样本中禽流感H9病毒 |
| 2.2.7.1 引物设计 |
| 2.2.7.2 样品中禽流感H9病毒mRNA的提取 |
| 2.2.7.3 禽流感H9病毒部分片段的RT-PCR扩增 |
| 2.2.7.4 禽流感H9病毒部分片段PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.7.5 目的基因的连接转化及鉴定 |
| 2.2.7.5.1 目的基因与pMD18-T载体的连接体系 |
| 2.2.7.5.2 连接产物转化 |
| 2.2.7.5.3 重组质粒DNA的提取 |
| 2.2.7.5.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.7.5.5 阳性克隆序列的测序 |
| 2.2.8 禽流感病毒胶体金快速检测试验 |
| 2.2.8.1 测试步骤 |
| 2.2.8.2 检测流程图 |
| 2.2.9 干扰素免疫调节活性的检测 |
| 2.2.9.1 样品采集 |
| 2.2.9.2 新城疫和禽流感H9病毒在18、28、42日龄鸡体内的抗体水平的检测 |
| 2.2.9.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测样本中新城疫抗体的浓度 |
| 2.2.9.3.1 标准曲线的建立 |
| 2.2.9.3.2 样本的测定 |
| 2.2.9.4 免疫器官组织切片 |
| 2.2.9.5 肉鸡称重 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 新城疫病毒的分离 |
| 3.2 新城疫病毒PCR检测结果 |
| 3.3 新城疫病毒胶体金试纸卡检测结果 |
| 3.4 禽流感H9病毒的分离 |
| 3.5 禽流感H9病毒PCR检测结果 |
| 3.6 禽流感H9病毒胶体金试纸卡检测结果 |
| 3.7 鸡用干扰素对商品肉鸡新城疫疫苗和禽流感疫苗抗体水平的影响 |
| 3.7.1 18、28、42日龄新城疫、禽流感血凝抑制抗体检测结果 |
| 3.7.2 不同种属干扰素对商品肉鸡新城疫疫苗和禽流感疫苗抗体水平的影响 |
| 3.8 酶联免疫吸附试验结果 |
| 3.8.1 鸡用干扰素在新城疫疫苗使用过程中免疫调节作用的检测 |
| 3.8.2 鸡用干扰素在禽流感H9病毒疫苗使用过程中免疫调节作用的检测 |
| 3.9 鸡用干扰素对肉鸡免疫器官的影响 |
| 3.9.1 鸡用干扰素对法氏囊组织的影响 |
| 3.9.2 鸡用干扰素对脾脏组织的影响 |
| 3.9.3 鸡用干扰素对胸腺组织的影响 |
| 3.10 肉鸡增重结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士研究生期间发表的文章 |
（10）微粉化板蓝根对鸡冠状病毒（IBV）作用的基础研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 一 冠状病毒研究进展 |
| (一) 冠状病毒的流行病学及危害 |
| (二) 冠状病毒病原学研究 |
| 二 冠状病毒的药物治疗 |
| (一) 冠状病毒的西医治疗 |
| (二) 冠状病毒的中医治疗 |
| 三 中药微粉化研究 |
| (一) 中药微粉化的方法 |
| (二) 中药微粉化的应用 |
| 第二章 实验研究 |
| 一 微粉化板蓝根颗粒的制备 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验步骤 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 实验结论 |
| 二 微粉化板蓝根对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的作用 |
| (一) 微米化板蓝根颗粒在原代鸡胚细胞上毒性的测定 |
| (二) 微粉化板蓝根对鸡传染性支气管炎病毒的影响 |
| (三) 小结 |
| 三 微粉化板蓝根体内对IBV药效筛选 |
| (一) 微粉化板蓝根在鸡胚上对鸡胚的影响 |
| (二) 微粉化板蓝根颗粒在雏鸡上对鸡传染性支气管炎病毒所致炎症的抑制作用 |
| (三) 小结 |
| 四 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 相关英文缩写词 |
| 附录2 相关公式 |
| 附录3 相关图片及表格 |
| 致谢 |
四、硫酸链霉素滴鼻液的制备与疗效观察（论文参考文献）
- [1]蝎黄解痉治哮颗粒影响NF-κB和HIF-1α信号传导通路治疗哮喘的调控机制[D]. 洪天一. 长春中医药大学, 2020(01)
- [2]以岗梅为主的银蒿解热合剂质量标准及药效研究[D]. 辛晓芳. 广州中医药大学, 2016(07)
- [3]抗甲型流感病毒卵黄抗体的制备、活性评价及其应用研究[D]. 阳元娥. 广东工业大学, 2016(08)
- [4]鼻嗅御感方对FM1-6-E2流感病毒的防护及其免疫调节作用研究[D]. 戚秀中. 第二军医大学, 2016(05)
- [5]甘露糖受体介导的多糖重组抗原铜绿假单胞菌疫苗的研制及其免疫分子机制[D]. 崔子寅. 吉林大学, 2015(08)
- [6]商陆的性味研究[D]. 王鹏程. 黑龙江中医药大学, 2015(01)
- [7]一种肺泡巨噬细胞靶向的多表位结核粘膜疫苗[D]. 吴曼丽. 苏州大学, 2015(02)
- [8]TGF-β1在流感病毒引起的睾丸免疫反应中的调节作用[D]. 黄超宾. 中国农业大学, 2014(08)
- [9]干扰素作为免疫调节剂在商品肉鸡上的应用研究[D]. 刘建. 山东农业大学, 2014(01)
- [10]微粉化板蓝根对鸡冠状病毒（IBV）作用的基础研究[D]. 林诠彬. 广州中医药大学, 2014(01)