一、可溶性白细胞介素6受体β亚基拮抗IL-6信号的研究（论文文献综述）
罗启慧[1]（2005）在《猪IL-4和IL-6基因的克隆、表达及疫苗佐剂效应研究》文中指出疫苗接种一直是各个国家防治传染病的重要手段,因此疫苗接种不仅要增强机体的免疫应答能力,而且要安全,副作用降至最低。细胞因子是机体的自身物质,相比传统佐剂作为免疫增强剂具有更多优势。IL-4 对免疫应答的影响主要是抑制细胞免疫,促进体液免疫,特别是IgE 介导的免疫应答反应,是IgE 的特异性诱导剂。IL-6 是由多种细胞产生的具有多种生物功能的细胞因子,它能够刺激B细胞的分化和免疫球蛋白的产生,亦能刺激产生细胞毒型T 细胞。国内外对猪IL-4 和IL-6 在增强人畜共患的猪囊尾蚴病的免疫应答反应研究甚少,因此本实验进行了两个基因的克隆、表达及其疫苗佐剂效应研究。 首先,以植物血凝素（PHA）和脂多糖（LPS）共同刺激从猪脾脏和淋巴结分离的淋巴细胞,提取总RNA,采用反转录PCR（RT-PCR）技术扩增IL-4、IL-6 基因,将扩增到的基因分别与pGEM-T-easy 载体连接后进行酶、PCR 以及测序鉴定,结果表明:所克隆到的IL-4 基因,与NCBI/GenBank 上登载的序列进行对比,序列同源性达99%,序列全长416 bp,开放阅读框架（ORF）长为402 bp,编码133 个氨基酸残基的前体蛋白,分子量约为15 ku;克隆到的IL-6 与NCBI/GenBank 上登载的序列进行对比,序列同源性达99.7%,其ORF 长为639 bp,共编码212 个氨基酸残基的前体蛋白,分子量约为24 ku。 第二,根据克隆的IL-6 基因阅读框序列,去掉信号肽后,设计pIL-6 表达引物,以重组质粒pGEM-T-easy/IL-6 为模板进行扩增,扩增产物与pGEX-4T-1 进行连接后转化大肠杆菌,经酶切、PCR 和测序鉴定,表明IL-6 成功插入到pGEX-4T-1 中。用IPTG诱导融合蛋白表达,经RT-PCR 检测发现555 bp 的特异性条带,表明IL-6 基因在大肠杆菌中得到了正确转录。重组菌在42℃诱导后以包涵体形式表达了猪IL-6 蛋白,经SDS-PAGE 分析,在47 ku 处出现融合蛋白条带,占菌体蛋白33%。并对其进行分离、变性、纯化和复性,纯度达到90%以上。用包涵体复性蛋白注射小鼠,毒性和活性检测结果初步揭示该蛋白较安全,能提高小鼠的免疫抵抗力;通过改变诱导条件和培养温度,实现了IL-6 的可溶性表达,并用GST 纯化层析柱纯化,纯化率达到95%以上。用MTT法检测可溶性表达蛋白的生物活性,结果表明随蛋白浓度的增加其细胞增殖程度也相应增加,与对照组相比,差异显着。
张国强[2]（2019）在《阻断IL-6/IL-6Rα/STAT3信号通路在猪器官狒狒异种移植模型中的抗炎作用的研究》文中研究说明研究背景和目的:随着人口老龄化、环境恶化等因素,全球器官衰竭的患者发病率逐年上升。同种异体移植是终末期器官衰竭的最有效的治疗方法,但移植供体器官极度的短缺严重制约移植治疗的发展。随着异种移植基础理论的发展、新型基因编辑技术及免疫抑制剂的问世,异种移植（如猪来源的器官）将解决同种异体移植中器官极度短缺的这一关键问题。目前猪供体器官-灵长类动物移植的研究取得巨大的进步,猪器官移植物存活率及存活时间大大增加,进一步将猪器官异种移植推向临床治疗提供理论及实践依据,但仍存在许多问题,如炎症反应,导致移植物发生免疫排斥反应,甚至失功能。白细胞介素-6（IL-6）作为参与各种炎性疾病的发生发展的重要的促炎细胞因子。研究证实IL-6通过结合IL-6受体α（IL-6 Rα）及IL-6受体β（gp130）,进而激活信号转导和转录激活因子3磷酸化（p-STAT3）,从而将信号转导到细胞核中发挥促炎、细胞增殖、免疫细胞活化及排斥反应等作用。IL-6 Rα单克隆抗体tocilizumab已批准用于某些自身性免疫性疾病的临床治疗（如自身免疫性关节炎,多中心型Castleman病）。我们前期试验发现tocilizumab导致猪器官异种移植受体（狒狒）体内的IL-6的表达升高,且并未显示明显抑制猪移植物中炎症反应的效果;同时有研究报道tocilizumab不能抑制IL-6诱导猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达,因此我们假设异种移植中受体与猪器官移植物的IL-6 Rα存在物种差异性,tocilizumab不能封闭猪器官移植物中的猪源性IL-6 Rα,受体升高的IL-6持续激活猪器官移植物中的IL-6/猪源性IL-6 Rα/STAT3信号通路,导致猪器官移植物失功能。本研究主要探讨是（I）体内研究tocilizumab抑制IL-6激活IL-6/IL-6Rα/STAT3信号通路的机制;（II）体外研究tocilizumab抑制IL-6激活不同种属细胞的IL-6/IL-6 Rα/STAT3通路的机制;（III）寻找抑制人或猪源性IL-6/人或猪源性IL-6 Rα/STAT3信号通路激活最佳策略;（IV）体外研究IL-6诱导猪内皮细胞的下游相关基因表达的情况及相关抑制剂对IL-6诱导上述基因表达的抑制效果。方法:1、检测狒狒血清中的狒狒或猪源性IL-6的表达水平:23只接受猪器官移植的狒狒血清（其中14只为猪肾脏异种移植,另9只为猪心脏异种移植）,其中16只同时接受tocilizumab处理（其中14只为猪肾脏异种移植,另2只为猪心脏异种移植）,另7只未予tocilizumab处理;使用基于流式细胞仪的液相蛋白定量技术（CBA）检测23只狒狒的血清中狒狒源性IL-6的表达水平;使用ELISA检测14只接受猪肾脏异种移植及tocilizumab处理的狒狒的血清中的猪源性IL-6的表达水平。分析狒狒血清中狒狒源性IL-6的表达水平与tocilizumab处理的关系;观察同时接受猪肾脏异种移植及tocilizumab处理的狒狒体内猪源性IL-6的表达水平的变化。2、接受猪肾异种移植及tocilizumab处理的狒狒的肾移植物（n=10）及肝组织（n=7）,阴性对照（正常肾肝组织）及阳性对照（1只接受猪肾异种移植术后发生超急性排斥反应的狒狒的猪肾移植物及肝组织,另一为1只接受移植前免疫抑制诱导治疗时导致严重的毒性反应死亡的狒狒的肾及肝组织）,使用免疫组化检测肾移植物和肝组织中IL-6和p-STAT3的表达情况,分析两者在供体猪肾移植物及受体肝组织中的表达与tocilizumab处理的关系。3、利用不同浓度的重组人或猪源性IL-6,不同的时间刺激猪动脉内皮细胞及人动脉内皮细胞,利用流式细胞仪检测p-STAT3的表达,从而确定最佳的IL-6刺激浓度及时间。4、体外研究tocilizumab抑制IL-6/IL-6 Rα/STAT3信号通路的机制:利用不同浓度的tocilizumab封闭人、狒狒及猪外周血单核细胞的IL-6 Rα,利用流式细胞仪检测IL-6 Rα的表达水平及表达IL-6 Rα的相应细胞亚群,以评估tocilizumab封闭IL-6 Rα的效果及种属特异性;不同浓度的tocilizumab抑制重组人或猪源性IL-6（20ng/mL,15min）激活人或猪动脉内皮细胞的STAT3信号通路,利用流式细胞仪检测p-STAT3表达强度,从而评估tocilizumab抑制重组人或猪源性IL-6激活人或猪动脉内皮细胞的STAT3信号通路的效果;进一步验证不同浓度的tocilizumab抑制重组人或猪源性IL-6（20ng/mL,15min）激活人、狒狒及猪外周血单核细胞的STAT3信号通路,利用流式细胞仪检测p-STAT3的表达,从而评估tocilizumab抑制不同种属免疫细胞中STAT3信号通路的效果。5、体外研究siltuximab抑制IL-6/IL-6 Rα/STAT3信号通路的机制:利用不同浓度的siltuximab抑制重组人或猪源性IL-6（20ng/mL,15min）激活人或猪动脉内皮细胞的STAT3信号通路,利用流式细胞仪检测p-STAT3的表达,评估siltuximab中和重组人或猪源性的IL-6的效果及种属特异性;体外验证狒狒来源的IL-6是否可以激活猪动脉内皮细胞STAT3信号通路,同时CBA检测体外siltuxiamb中和狒狒源性IL-6的效果;不同浓度的siltuximab抑制重组人或猪源性IL-6（20ng/mL,15min）激活狒狒外周血单核细胞的STAT3信号通路,同样利用流式细胞仪检测p-STAT3表达强度,从而评估siltuxiamb抑制重组人或猪源性IL-6激活狒狒外周血单核细胞的STAT3信号通路的效果。6、体外研究雷帕霉素抑制IL-6/STAT3信号通路激活的机制:首先利用不同浓度雷帕霉素作用于人或猪动脉内皮细胞24小时后,然后使用重组人或猪源性IL-6（20ng/mL,15min）激活人或猪动脉内皮细胞的STAT3信号通路,最后利用流式细胞仪检测p-STAT3的表达,从而评估雷帕霉素抑制IL-6激活STAT3信号通路的效果。7、利用qPCR检测siltuximab或雷帕霉素对IL-6通过IL-6/IL-6 Rα/STAT3信号通路诱导猪内皮细胞的下游相关因子的mRNA表达的抑制作用。结果:1、23只接受猪肾或者心脏移植的狒狒血清中的狒狒源性IL-6的表达水平从免疫抑制诱导治疗后逐渐升高。进一步分析tocilizumab对接受猪器官异种移植的狒狒体内IL-6的表达水平的影响,数据显示在Day 0（移植前,但在免疫抑制诱导治疗后）接受tocilizumab处理的狒狒血清中狒狒源性IL-6的表达水平显着高于未接受tocilizumab处理的狒狒的IL-6的表达水平（255 vs 35 pg/mL,p<0.05）。由于猪肾移植组缺乏对照组,我们仅分析了猪心脏移植组,Day 1（移植术后第1天）时,接受tocilizumab处理的狒狒血清中狒狒源性IL-6的表达水平显着高于未接受tocilizumab处理的狒狒（183 vs 23 pg/mL,p<0.01）;同时数据也显示接受tocilizumab处理的猪肾移植组显着高于接受tocilizumab处理的猪心脏移植组（p<0.05）。在安乐死时（Euthanasia）,接受tocilizumab处理的猪肾移植组狒狒血清中狒狒源性IL-6的表达水平显着升高,但与Day 1时狒狒源性IL-6的表达水平无统计学差异。为了确定猪肾移植物是否产生猪源性IL-6,我们检测Day 0、Day 1及安乐死三个时间段狒狒血清中猪源性IL-6的含量,Day 0时狒狒血清中无法检测到猪源性IL-6,而在Day 1和安乐死时狒狒血清中均检测到了猪源性IL-6（均为p<0.05）,但Day 1与安乐死时猪源性IL-6的表达水平没有统计学差异。我们利用免疫组化检测猪肾移植物及狒狒肝组织中的IL-6及p-STAT3表达,其中阴性对照的正常猪肾肝组织中IL-6及p-STAT3呈低表达或者不表达;两例阳性对照的肾肝组织中IL-6及p-STAT3的表达呈强阳性;10例接受猪肾移植及tocilizumab处理的狒狒的猪肾移植物中的IL-6及p-STAT3阳性表达率无统计学差异,其中IL-6阳性表达率90%,p-STAT3阳性表达率为60%;7例接受猪肾移植及tocilizumab处理的狒狒的肝组织中IL-6及p-STAT3表达的阳性率存在统计学差异（p<0.001）,其中IL-6阳性表达率高达85.7%,p-STAT3阳性表达率仅为28.6%。2、我们确定重组人或猪源性IL-6最佳的激活IL-6/IL-6 Rα/STAT3信号通路的浓度及时间（20ng/mL,15min）。Tocilizumab可以封闭人和狒狒外周血单核细胞IL-6 Rα（主要为CD3+T细胞和单核细胞）,却不能封闭猪外周血单核细胞的IL-6 Rα。Tocilizumab可以完全抑制重组人或猪源性IL-6诱导人动脉内皮细胞p-STAT3的表达（最佳浓度为12.5μg/mL）,但不能抑制重组人或猪源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞（无论是野生型还是GTKO/CD46）的p-STAT3的表达（即使最高浓度312.5μg/mL）。Tocilizumab同样可以抑制重组人或猪源性IL-6诱导人、狒狒外周血单核细胞中CD3+T细胞和单核细胞的p-STAT3的表达（浓度12.5μg/mL）,同样不能抑制重组人或猪源性IL-6诱导猪外周血单核细胞的p-STAT3的表达。3、Siltuximab可以完全中和重组人源性IL-6,从而抑制其诱导人或猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达（最佳浓度为12.5μg/mL）,但不能中和重组猪源性IL-6及抑制其诱导人或猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达（即使最高浓度312.5μg/mL）。同时数据显示siltuximab可以显着抑制狒狒源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞的p-STAT3的表达,尽管体外中和试验显示siltuximab不能完全中和狒狒源性IL-6。Siltuximab同样显示仅可以抑制重组人源性IL-6诱导狒狒外周血单核细胞中CD3+T细胞和单核细胞的p-STAT3的表达（浓度12.5μg/mL）,而不能抑制重组猪源性IL-6诱导狒狒外周血CD3+T细胞和单核细胞的p-STAT3的表达（即使最高浓度312.5μg/mL）。4、雷帕霉素（40ng/mL,24h）不仅可以抑制重组人源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达（p<0.01）,也可以抑制重组猪源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达（p<0.01）。我们发现雷帕霉素（40ng/mL,24h）同样可以抑制重组人或猪源性IL-6诱导人动脉内皮细胞p-STAT3的表达（p<0.05,p<0.01）。5、重组人或猪源性IL-6可以诱导猪动脉内皮细胞上调E-selectin、ICAM-1、VEGF及FGF2 mRNA表达水平,siltuximab可以有效的抑制重组人源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞的上述4种基因的上调,而雷帕霉素可以显着抑制重组人或猪源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞VEGF、FGF2 mRNA上调,但仅能轻度抑制或者不能抑制E-selectin、ICAM-1 mRNA上调。结论:1、在跨种属的异种移植中,IL-6和IL-6 Rα的存在种属差异性,导致IL-6/IL-6Rα/STAT3通路存在较大差异。2、Tocilizumab可以引起受体IL-6水平升高,同时tocilizumab不能阻断猪器官移植物中的猪源性IL-6 Rα,升高的IL-6持续激活猪器官移植物的IL-6/猪源性IL-6 Rα/STAT3信号通路,从而导致猪器官移植物失功能。3、在猪器官人或狒狒异种移植中,将siltuximab和雷帕霉素相结合的策略可有效抑制人或猪源性IL-6/人或猪源性IL-6 Rα/STAT3信号通路。4、在猪器官人或狒狒异种移植中,IL-6、IL-6 Rα存在种属差异性,开发兼顾人、狒狒及猪源性IL-6或者IL-6 Rα的单克隆抗体具有远大的前景。
马颂华[3]（2014）在《IL-6神经保护作用的钙离子通道机制及信号转导途径》文中研究说明白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）是目前发现的几十种细胞因子中的一种。过去认为IL-6主要与免疫系统和造血系统中细胞的诱导、生长和分化有关。但现在的研究发现，IL-6也存在于中枢神经系统（central nervous system, CNS）中，而且来源于脑细胞的内源性生成。尽管正常脑内IL-6水平较低，但在神经系统功能紊乱时，例如：脑损伤、神经变性、感染、缺血和多发性硬化等，IL-6浓度迅速及明显地增加，这提示IL-6与神经系统疾病关系密切。已有研究说明IL-6具有神经保护作用。我们实验室先前的研究也表明IL-6能够抑制谷氨酸或N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）诱发的细胞内钙超载，因而具有神经保护效应。然而，IL-6抑制细胞内钙超载继而产生神经保护作用的机制仍不清楚。为此，本研究利用膜片钳、钙成像、形态学和分子生物学等实验技术，从神经元膜上电压门控性钙通道（voltage-gated calcium channel, VGCC）和NMDA受体（NMDA receptor, NMDAR）通道的角度来研究IL-6抑制细胞内钙超载的机制，并进一步以IL-6信号转导途径与NMDAR离子通道的联系为切入点来探讨IL-6神经保护作用的机制。研究揭示了IL-6一方面经抑制L-型钙通道（L-type calcium channel, LCC）的活动减少细胞内钙超载，另一方面通过Janus激酶（Janus Kinases，JAKs）-信号转导和转录活化因子3（signaltransducer and activator of transcription3，STAT3）-钙调神经磷酸酶（calcineurin, CaN）的信号途径抑制NMDAR亚基NR2B和NR2C的活动减少了细胞内钙超载从而发挥神经保护作用。本研究可为IL-6在神经系统疾病中的作用及作用机制提供更多新的证据。第一部分IL-6经抑制L-型电压门控性钙通道的活动减少神经元内钙超载目的：说明IL-6抑制神经元内钙超载的细胞膜上VGCC的类型及机制。方法：1. IL-6（120ng/ml）预处理小脑颗粒神经元（cerebellar granule neurons, CGNs）24h，然后应用膜片钳技术，在全细胞记录模式下，观察IL-6对培养的CGNs全细胞钙通道电流和LCC电流的作用。2.钙离子荧光探针Fluo-3/AM标记CGNs，应用共聚焦激光扫描显微镜（confocallaser scanning microscope，CLSM）检测LCC拮抗剂nifedipine和IL-6+预处理对高K诱发的细胞内钙超载的影响。3. Western blot方法检测IL-6对培养的CGNs表达LCC亚基Cav1.2水平的影响。结果：1.将细胞钳制电压设为-80mV，在去极化电压至-20mV，-10mV，0mV和10mV四个阶跃电压下，IL-6预处理细胞的全细胞钙通道电流密度要低于对照组（未经IL-6预处理的细胞），表明IL-6可抑制全细胞钙通道电流。2.将细胞钳制电压设为-80mV，去极化电压至-10mV时，IL-6预处理细胞的全细胞LCC的电流密度要低于对照组，而全细胞非LCC的电流密度与对照细胞无明显差异。经Boltzmann方程拟合，IL-6预处理细胞与对照组细胞比较，电压激活曲线的半激活电压和斜率因子无统计学差异。这些结果说明IL-6抑制了LCC的钙电流，但未影响其通道的激活特征。3.+高K（KCl）诱发了明显的神经元内Ca2+浓度升高。神经元用LCC拮抗剂nifedipine++预处理后，高K激发的胞内钙超载被减弱，说明高K促使LCC的开放，导致Ca2+内流增加。4.神经元经IL-6+预处理后高K诱发的细胞内钙超载被抑制。并且，IL-6也明显2+抑制了神经元经LCC流入的Ca。5. IL-6预处理明显下调神经元LCC亚基Cav1.2的蛋白表达。结论：IL-6经下调神经元LCC亚基Cav1.2的水平抑制了LCC的活动，从而减少了经LCC2流入的Ca+，抑制了细胞内钙超载，这是IL-6发挥神经保护作用的一种机制。第二部分IL-6抑制NMDA诱导的神经元钙超载和凋亡的受体通道机制及信号转导途径目的：说明IL-6经神经元内JAK-STAT3-CaN的信号转导途径抑制了NMDAR亚基NR2B和NR2C的活动，从而减少NMDA诱导的神经元钙超载和凋亡而发挥神经保护作用。方法：1. IL-6（120ng/ml）预处理CGNs24h后，再分别用胞内钙库耗竭剂毒胡萝卜素（thapsigargin, TG），NMDAR亚基的拮抗剂NVP-AAM077、ifenprodil和PPDA，JAK-STAT3-CaN信号通路的抑制剂AG490和FK506处理神经元。2.用钙离子荧光探针Fluo-3/AM标记已用IL-6和上述各种药物处理后的神经元，利用CLSM观察神经元在NMDA（100μM）激发下，胞内钙荧光强度的动态变化。3.应用膜片钳技术，在全细胞记录模式下，观察IL-6及结合使用上述各种药物处理后的神经元对NMDA诱发电流的影响。4.利用JC-1试剂盒，检测神经元在用IL-6及上述各种药物处理后对NMDA刺激下的线粒体膜电位的影响。5.使用TUNEL荧光标记法，观察神经元在用IL-6及上述各种药物处理后对NMDA诱发的神经元凋亡的影响。6. Western blot方法分别检测IL-6及上述各种药物处理后，神经元在NMDA刺激下的NMDAR必需亚基NR1和调节亚基NR2A、NR2B、NR2C的表达水平及其磷酸化水平。7.通过比色法和Western blot方法分别检测CaN的活性水平和表达水平，观察神经元用IL-6和AG490处理后，在NMDA刺激下的CaN的活性水平和表达水平的变化。结果：1. NMDA激发神经元内钙荧光强度升高至基础水平的1.84倍。神经元用胞内钙+库耗竭剂TG预处理后，NMDA2仍可激发细胞内Ca水平升高，说明NMDA激活细胞膜上NMDAR离子通道使Ca2+内流增加。IL-6可减少TG处理后NMDA激发的细2+2+胞内Ca升高，表明IL-6可抑制Ca经NMDAR离子通道的流入。2. NMDA的诱发电流可以被NMDAR拮抗剂MK-801所阻断，表明NMDA的诱发电流经NMDAR介导。经IL-6预处理的神经元，NMDA诱发电流的密度要明显低于未经IL-6处理的细胞，说明IL-6可抑制NMDAR介导的内向电流。3. NMDAR亚基NR2B的拮抗剂ifenprodil和NR2C的拮抗剂PPDA均显着抑制了NMDA诱发的细胞内钙超载，但NR2A的拮抗剂NVP-AAM077不能显着抑制NMDA诱发的细胞内钙超载，说明在NMDAR离子通道介导的Ca2+内流中，NR2B和NR2C起关键作用。IL-6预处理的神经元，ifenprodil和PPDA对NMDA诱发的胞+内Ca2升高的抑制率低于未用IL-6预处理的神经元，而NVP-AAM077并未表现出这种差异，表明IL-6主要抑制了NR2B和NR2C亚基的功能。4. IL-6预处理的神经元，ifenprodil和PPDA对NMDA诱发的内向电流的抑制率明显低于未用IL-6预处理的神经元，而NVP-AAM077并未表现出这种差异，进一步说明IL-6主要通过抑制NR2B和NR2C亚基的功能从而减少NMDA诱发的内向电流。5. IL-6预处理的神经元，ifenprodil和PPDA对NMDA诱发细胞凋亡的抑制率要明显低于未用IL-6预处理的神经元，表明IL-6经抑制NR2B和NR2C亚基的活动发挥抗凋亡作用。6. IL-6下调神经元的NR2B和NR2C的蛋白表达，也下调NR2C的磷酸化水平，但对NR2A的表达和磷酸化水平无明显作用。7. JAK-STAT3信号通路的抑制剂AG490和CaN的抑制剂FK506均可以阻断IL-6抑制NMDA诱发的神经元内钙超载。并且，AG490和FK506也阻断IL-6抑制NMDA诱发的内向电流。8. IL-6预处理神经元抑制了NMDA导致的线粒体膜电位下降，而AG490和FK506均阻断了IL-6的这种作用。9. IL-6预处理神经元显着抑制了NMDA诱发的细胞凋亡，AG490和FK506均阻断了IL-6的抗凋亡作用。10. IL-6预处理神经元上调了CaN β亚基蛋白的表达，同时拮抗了由NMDA诱导的CaN活性的降低。AG490阻断了IL-6的这种作用。结论：1. IL-6抑制神经元膜上NMDAR通道的活动，因此减少了由NMDA激发的胞2外Ca+经NMDAR通道流入细胞内。2. IL-6通过抑制神经元内NMDAR通道亚基NR2B和NR2C的表达及活动，从而减少NMDA诱发的胞内钙超载和神经元凋亡。。3. IL-6激活神经元内JAK-STAT3-CaN的信号通路，继而抑制神经元膜上NMDAR通道的活动，发挥神经保护作用。
倪长源,沈倍奋,黎燕,赖春宁,王建安,任蕴芳[4]（1996）在《可溶性白细胞介素6受体β亚基拮抗IL-6信号的研究》文中研究指明gp130是白细胞介素6（IL-6）受体的β亚基和信号转导子。IL-6介导的信号转导起始于gp130与IL-6、IL-6Ra形成的复合体。为了研究gp130胞外区的结构与功能,我们克隆并表达了其胞外区全长及氨基端304个氨基酸残基的片段,并在白血病R2细胞、杂交瘤细胞和肝癌细胞中观察其生物学效应。结果发现,两个片段均拮抗IL-6信号,从而,证明了含细胞因子结合区的可溶性小片段和大片段都能与膜结合型gp130竞争性结合IL-6、IL-6Ra,拮抗IL-6信号;它们与可溶性IL-6R α的效应正好相反。
章洪华[5]（2019）在《基于P38MAPK/PGC-1通路研究保元解毒汤调控线粒体功能改善癌因性肌肉萎缩机制》文中认为目的:以P38MAPK/PGC-1通路为切入点,研究保元解毒汤改善癌因性肌肉萎缩的线粒体机制。寻找其干预肌肉萎缩的作用靶点,为研制干预癌因性肌肉萎缩有效中药提供实验依据。方法:1采用HPLC方法,检测不同批次保元解毒汤中活性成分绿原酸、阿魏酸和乌头碱含量,评价保元解毒汤水煎液的稳定性;建立C26移植瘤癌性恶病质模型,保元解毒汤干预10 d后,观察动物一般情况及体重变化,腓肠肌称重并进行HE染色,评价保元解毒汤对肌肉萎缩的干预情况;RT-PCR和WB法检测P38MAPK、PGC-1α、Atrogin-1和MuRF-1 mRNA及蛋白变化,探讨保元解毒汤干预恶病质模型小鼠肌肉萎缩的作用机制;2癌因性肌管萎缩模型建立和评价。提取Lewis细胞上清液制备条件培养基,并分别用1:2,1:4,1:8剂量诱导C2C12细胞96 h,普通倒置显微镜动态观察C2C12细胞肌管变化,ELISA法检测TNF-α和IL-6含量变化,RT-PCR和WB法检测Atrogin-1和MuRF-1mRNA和蛋白表达,构建癌因性肌管萎缩模型并进行评价;3保元解毒汤改善癌因性肌管萎缩作用及机制研究:3.1保元解毒汤水煎液与条件培养基分别按1:8、1:16、1:32比例加入培养体系干预癌因性肌管萎缩模型,持续72 h。普通倒置显微镜动态观察C2C12细胞肌管变化;ELISA法检测TNF-α和IL-6含量变化;RT-PCR和WB法检测肌管分化标志物Myf6、MyoD和MYH3及肌管萎缩蛋白Atrogin-1、MuRF-1表达情况,评价保元解毒汤对癌因性肌管萎缩模型的作用,同时寻找改善肌管萎缩的最佳浓度;3.2用保元解毒汤、P38MAPK拮抗剂、PGC-1α激动剂分别干预癌因性肌管萎缩模型72 h,普通倒置显微镜动态观察C2C12细胞肌管变化,检测P38MAPK、PGC-1αmRNA及蛋白变化,评价保元解毒汤对P38MAPK/PGC-1α通路影响;3.3荧光显微镜观察线粒体NAO染色,观察保元解毒汤对线粒体数量的影响;检测mtDNA拷贝数、采用RT-PCR、Western blot检测NRF1、TFAM mRNA和蛋白表达情况,观察保元解毒汤对线粒体生成的影响;生化法检测ATP酶活性、RT-PCR检测ATP合成酶β亚基mRNA表达变化,采用RT-PCR、Western blot检测COXIV、Cytochrome C mRNA和蛋白表达水平,评价保元解毒汤对线粒体氧化磷酸化功能的影响;探讨保元解毒汤通过P38MAPK/PGC-1通路调控线粒体氧化磷酸化功能,改善癌因性肌管萎缩的机制。结果:1 HPLC成分分析发现,三个批次保元解毒汤中绿原酸含量约114.3114.5 ug/mL;阿魏酸含量约65.8966.01 ug/mL;乌头碱含量约14.6014.76 ug/mL,不同批次制备保元解毒汤质量稳定;与模型组比较,保元解毒汤能减缓动物体质量下降（P<0.05）,增加腓肠肌重量（P<0.05）、使肌纤维横径变粗;且明显抑制C26恶病质模型小鼠P38MAPK/PGC-1α通路蛋白表达（P<0.05）,明显抑制E3泛素连接酶Atrogin-1和MuRF-1表达（P<0.05）;2成功建立癌因性肌管萎缩模型。不同浓度Lewis肺腺癌细胞上清液诱导后,C2C12细胞肌管萌发延迟且数量明显减少,肌管横径明显变细,与作用时间和浓度呈现正相关,且随作用时间,各组间C2C12细胞肌管横径差异有统计学意义（P<0.05）,最佳作用时间96 h,最佳LCM干预浓度为1:2;3保元解毒汤可通过P38MAPK/PGC-1通路,改善线粒体功能,缓解癌因性肌管萎缩:3.1不同浓度浓度保元解毒汤均使肌管横径增加,与作用时间和药物浓度呈现正相关（P<0.05）。1:8浓度干预72 h效果最好;1:8保元解毒汤干预后,与模型组比较,细胞因子含量下降,MuRF-1、Atrogin-1 mRNA及其蛋白表达均明显降低（P<0.05）;MyoD、Myf6和MYH3 mRNA和蛋白表达明显增加（P<0.05）;3.2与模型组比较,保元解毒汤能抑制P38MAPKmRNA表达和蛋白质磷酸化,促进PGC-1αmRNA及其蛋白质表达,差异有统计学意义（P<0.05）;3.3与模型组比较,保元解毒汤可明显增加C2C12细胞内线粒体数量、增加mtDNA拷贝数（P<0.05）、促进线粒体生物合成关键蛋白NRF1、TFAM的表达（P<0.05）;同时明显促进ATP合成酶β亚基mRNA表达（P<0.05）,明显上调ATP酶活性,明显促进COXIV和Cytc表达（P<0.05）,改善线粒体氧化磷酸化功能。结论:体内实验表明,保元解毒汤能通过抑制P38MAPK/PGC-1通路,抑制肌肉萎缩蛋白表达而缓解肌肉萎缩的发生;体外研究表明,保元解毒汤改善癌因性肌肉萎缩的机制可能与降低细胞因子表达,抑制P38MAPK/PGC-1通路,促进线粒体生成,改善线粒体氧化磷酸化功能有关。
倪长源,黎燕,王建安,任蕴芳,沈倍奋[6]（1998）在《gp130胞外区近膜端缺失的突变体介导IL-6信号的研究》文中研究表明目的研究ｇｐ１３０胞外区远膜端和近膜端在ＩＬ－６信号转导中的作用。方法用分子克隆手段构建全长的膜结合型ｇｐ１３０分子和胞外区第３０１～５８２位氨基酸残基缺失的突变体分子，并通过阻滞电泳方法比较突变体与野生型分子在传导信号方面的差异。结果通过酶切鉴定、序列分析和表达检测，证明野生型和突变体ｃＤＮＡ表达载体构建正确，并有效表达；阻滞电泳结果表明，在ＳＫＯ－００７细胞和Ｍｏｌｔ－４细胞中，突变体分子与野生型ｇｐ１３０都能介导ＩＬ－６信号。结论ｇｐ１３０分子胞外区远膜端在ＩＬ－６信号转导中发挥重要作用；而近膜端并非ＩＬ－６信号转导所必需。
宋刚[7]（2006）在《运动性白细胞介素-6上升参与大鼠脂肪水解调节的研究》文中研究表明1研究目的观察长时间运动过程中大鼠血液、肌肉和脂肪组织的白细胞介素-6及受体系统和脂肪水解相关指标的变化,分析血清白细胞介素-6和脂肪与肌肉中激素敏感性脂肪酶之间的关系,探讨运动性白细胞介素-6上升参与脂肪水解可能的机制。2研究方法以雄性Sprague—Dawley大鼠为研究对象,按随机原则,分为正常（肌）糖原组和低（肌）糖原组（运动+不同含糖饮食处理恢复24小时造成）,进行长时间运动。其运动方案是坡度零,速度18米/分,时长90分钟的跑台运动,再调整跑速为30米/分钟,时长30分钟的跑台运动。同时设置完全不运动的空白对照组大鼠一组。分别在运动前、运动30分钟、运动120分钟、运动后3小时和运动后6小时宰杀大鼠,取血液、脂肪组织和股四头肌进行分析。测定血清白细胞介素-6、白细胞介素-6可溶性受体、甘油、游离脂肪酸、胰岛素、生长激素、瘦素和血浆去甲肾上腺素和肾上腺素;肌肉组织白细胞介素-6受体基因表达和激素敏感性脂肪酶基因表达与活性;脂肪组织白细胞介素-6受体基因表达和激素敏感性脂肪酶基因表达与活性。3研究结果1)在整个运动过程中,血清白细胞介素-6及白细胞介素-6可溶性受体水平呈先上升后下降的变化,峰值都出现在运动120分钟,在运动30分钟（P<0.05）、运动120分钟（P<0.01）,白细胞介素-6在低糖原组（非常）显着高于正常糖原组。血清甘油水平呈先升后降的变化,在运动30分钟,血清甘油水平低糖原组要显着高于正常糖原组（P<0.05）,在运动120分钟和运动后3小时,血清甘油水平低糖原组要非常显着高于正常糖原组（P<0.01）。血清游离脂肪酸水平呈先升后降的变化趋势,其峰值出现在运动120分钟。2)脂肪组织白细胞介素-6受体mRNA表达大体呈上升至平缓的变化,运动前白细胞介素-6受体mRNA正常糖原组显着高于低糖原组（P<0.05）,但运动后6小时低糖原组非常显着高于正常糖原组（P<0.01）3)脂肪组织激素敏感性脂肪酶mRNA表达呈先升后降的变化,峰值出现在运动120分钟,脂肪组织激素敏感性脂肪酶活性变化趋势类似于激素敏感性脂肪酶mRNA表达变化,运动30分钟、运动120分钟激素敏感性脂肪酶活性低糖原组显着高于正常糖原组（P<0.05）,和运动后3小时低糖原组非常显着高于正常糖原组（P<0.01）。4)肌肉组织白细胞介素-6受体mRNA表达呈上升至平缓的变化,在运动120分钟,低糖原组白细胞介素-6受体mRNA显着高于正常糖原组（P<0.05）。5)肌肉组织激素敏感性脂肪酶mRNA表达先升后降,峰值在运动120分钟,激素敏感性脂肪酶mRNA表达在运动后3小时低糖原组显着高于正常糖原组（P<0.05）。肌肉激素敏感性脂肪酶活性变化类似于肌肉激素敏感性脂肪酶mRNA表达的变化,于运动120分钟和运动后3小时低糖原组非常显着高于正常糖原组（P<0.01）。6)将血清胰岛素、生长激素、瘦素和血浆去甲肾上腺素和肾上腺素作为控制变量,对白细胞介素-6和脂肪、肌肉组织激素敏感性脂肪酶进行偏相关分析,结果:血清白细胞介素-6水平与脂肪组织激素敏感性脂肪酶mRNA表达之间相关性不显着（P>0.05）;运动120分钟血清白细胞介素-6水平与脂肪组织激素敏感性脂肪酶活性具有显着正相关（P<0.05）,而其它时刻血清白细胞介素-6与激素敏感性脂肪酶活性偏相关系数并不具有显着性意义（P>0.05）。运动120分钟和运动后6小时血清白细胞介素-6水平与肌肉中激素敏感性脂肪酶mRNA偏相关系数具有（非常）显着性意义（P<0.05或P<0.01）,而在其它时刻,血清白细胞介素-6水平和肌肉中激素敏感性脂肪酶mRNA的偏相关系数不具有显着性意义（P>0.05）;血清白细胞介素-6水平与肌肉激素敏感性脂肪酶活性相关系数并不显着（P>0.05）。4结论本研究表明,运动具有上调血液白细胞介素-6及其可溶性受体水平的作用,并引起全身性的脂肪水解增加。同时运动中脂肪和肌肉组织的白细胞介素-6受体mRNA表达上升并维持在较高的水平,这提示细胞膜上白细胞介素-6受体含量的增加。这表明白细胞介素-6通过与血液中白细胞介素-6可溶性受体结合,激活了IL-6下游的信号传导途径的级联反应,从而参与了脂肪和肌肉生物功能的调节。脂肪和肌肉激素敏感性脂肪酶mRNA表达增加和活性上升是全身性脂肪水解增加的主要原因。偏相关分析结果表明白细胞介素-6可能直接参与脂肪水解的调节,在脂肪组织中可能调节的是激素敏感性脂肪酶的活力,肌肉组织中可能调节的是激素敏感性脂肪酶的基因表达。而偏相关系数具有显着性意义的时刻大都是白细胞介素-6水平的峰值,这可能是因为白细胞介素-6水平需要超过一定的阈值才参与脂肪水解的调节。
贾春翠[8]（2019）在《报告基因法检测重组人sgp130-Fc融合蛋白生物学活性》文中研究说明重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白（sgp130-Fc）是一种用于治疗溃疡性结肠炎的选择性IL-6反式信号传导抑制剂和抗炎生物药。目前其生物学活性测定方法是BAF3/gp130细胞增殖抑制法,此方法耗时较长、操作复杂,并且BAF3/gp130细胞对IL-6/sIL-6Rα复合物只是部分依赖性增殖（细胞培养密度过大会丧失这种依赖性）,细胞培养的不确定性导致了活性检测的不稳定性,容易引起实验结果变异度大、重复性差。而基于药物作用机制的报告基因法（reporter gene assay,RGA）由于其简便性、特异性、高灵敏度和低变异度,在药物生物学活性检测领域得到越来越广泛的应用。本课题的目的是建立一种快速测定sgp130-Fc生物学活性的报告基因测活方法。根据sgp130-Fc的作用机制（特异性抑制IL-6反式信号通路）,选择包含JAK/STAT3特异的DNA反应元件SIE、萤光素酶基因和潮霉素筛选标记基因的质粒载体,转染CHO-K1细胞并筛选对sgp130-Fc反应性好、可稳定传代的单克隆细胞株,建立报告基因测活方法并进行条件优化和方法学验证。本研究成功构建了报告基因细胞株CHO/SIE-Luc,并利用一种新型的数字PCR技术对基因修饰的稳定性进行了评价,结果显示,低、中、高代次细胞的萤光素酶基因相对拷贝数基本一致（0.0930.095拷贝/拷贝GAPDH）。Sgp130-Fc可有效抑制IL-6/sIL-Rα复合物引起的CHO/SIE-Luc细胞中萤光素酶基因的表达,量效曲线符合四参数方程,R2大于0.98。经验证,该方法仅针对IL-6反式信号传导通路;IC50的日内和日间变异度均小于10%;回收率在94.1%-106.2%之间;相对生物学活性的测量值和真实值线性拟合的R2大于0.99;不同代次细胞的量效曲线基本平行;与BAF3/gp130细胞增殖抑制法的检测结果具有较好的一致性（p=0.4960,t test,n=6）。本研究所建方法特异性好、准确稳定、快速简便,可用于sgp130-Fc的活性测定,为sgp130-Fc相关产品的开发和质量控制提供了重要参考。
于彭城,刘梦,徐寒梅,胡加亮[9]（2019）在《类风湿关节炎相关细胞因子及药物研究进展》文中认为类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种导致关节破坏的慢性系统性自身免疫炎症性疾病,在关节滑膜中的免疫调节破坏、关节的进行性破坏、导致软骨和骨侵蚀的严重损伤是这种疾病的主要特征。细胞因子在其发病机制中起关键作用,细胞因子网络的不平衡可能诱导和维持炎症以及相应的组织损伤,从而提供治疗的靶点。RA中涉及许多细胞因子,文章综述了一些关键细胞因子,包括肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素家族（IL-6、IL-1、IL-17和IL-35）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。靶向TNF-α和IL-6都是公认的RA治疗方法,并且不断有新的生物制剂正在进入市场。IL-1是细胞因子网络中复杂的细胞因子,IL-1受体拮抗剂的临床治疗效果不如TNF-α抑制剂。IL-17、GM-CSF和IL-35是代表新靶标的细胞因子,其抑制剂作为RA治疗开发的第二代生物制剂。
李雨轩[10]（2019）在《白介素-35对成骨细胞生物学功能的影响及机制研究》文中研究说明目的:类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种常见的全身性自身免疫疾病,但其发病原因不明。其特征主要是慢性、对称性、进行性的多关节炎。由RA的慢性炎症导致的骨量丢失是最严重的的并发症之一。有研究表明,在新诊断的RA患者中,高达25%的患者在治疗前就已经发生了骨量流失,有11%的患者已发展为骨质疏松症。还有研究表明,骨量丢失与细胞因子具有密切的相关性。细胞因子调节着破骨细胞、成骨细胞和免疫系统细胞之间的相互作用,最终维持着骨代谢的平衡。白细胞介素（Interleukin,IL）-35是IL-12家族的新成员,由Epstein-Barr病毒诱导基因3（Epstein-Barr virus-inducible gene 3,Ebi3）亚基和p35（IL-12α）亚基组成。2007年,Vignali的研究组发现IL-35由调节性T细胞（regular T cells,Tregs）分泌并能抑制效应性T细胞的功能。我们课题组在之前研究中还发现,在小鼠胶原诱导性关节炎的成纤维样滑膜细胞中,IL-35可上调骨保护素（osteoprotegerin,OPG）,并下调核因子κB受体激活剂配体（receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL）的表达,表明其在RA中具有潜在的骨保护作用。然而IL-35对RA骨量丢失的具体机制尚未明确,且研究甚少。为了更好的研究IL-35在RA骨量丢失中的作用,本研究将分析IL-35与RA患者骨量丢失相关指标的相关性,并进一步探讨IL-35对成骨细胞生物学功能的影响以及相关机制,为IL-35可能成为RA合并骨量丢失新的治疗靶点提供理论实验依据。研究方法:在第一部分的研究中,选取76名患有RA的绝经后妇女作为病例组和53名健康的绝经后妇女作为健康对照组。通过酶联免疫吸附测定法检测血清IL-35水平。使用双能X射线吸收测定法测量腰椎（L1-L4）和全髋骨的骨矿物质密度。通过免疫比浊法测定骨转换标志物,包括碱性磷酸酶（alkaline phosphates,ALP）,I型胶原羧基β端肽特殊序列（cross-linked C-terminal telopeptid of type I Collagen I,β-CTX）和25-（OH）VitD3。在第二部分研究中,选取小鼠前成骨细胞MC3T3E1细胞系为研究对象。拟用TNF-α刺激诱导MC3T3E1细胞系模拟成骨细胞在RA中的炎性环境。用CCK-8和流式细胞术检测IL-35对MC3T3E1细胞系增殖和凋亡的影响。用pNPP偶氮法检测ALP的活性。用RT-PCR和Western-blot检测MC3T3E1细胞中OPG和RANKL的表达水平。用茜素红染色检测MC3T3E1细胞系体外的矿化能力。在第三部分研究中,加入外源性Dkk-1阻断Wnt/β-catenin通路,探讨IL-35影响成骨细胞生物学功能的可能性机制。结果:在第一部分研究中:1.绝经后RA女性的血清IL-35水平高于健康对照组（P<0.0001）。2.与骨质减少和骨质疏松症患者相比,骨量正常的患者血清IL-35水平显着升高（分别为P<0.0001,P<0.0001）。3.血清IL-35水平与腰椎（L1-L4）骨密度（r=0.64,P<0.0001）和全髋关节骨密度为（r=0.43,P=0.0001）呈正相关。4.血清IL-35水平与β-CTX呈负相关（r=-0.35,P=0.0017）。血清IL-35水平与ALP无关（r=0.2,P=0.077）。但ALP组增加组的血清IL-35水平高于正常ALP组（P=0.0006）。5.血清IL-35水平与25（OH）VitD3呈正相关（r=0.37,P=0.0011）。6.在多因素线性回归模型中,IL-35在腰椎（L1-L4）和全髋的BMD中保持显着相关性（OR=0.463,P=0.026;OR=0.254,P=0.025）。在第二部分研究中:1.CCK-8结果显示,经过IL-35处理的第1天、第3天、第5天和第7天,与空白对照组比较（IL-35为0ng/mL）,IL-35促进MC3T3E1细胞的增殖（P<0.05）。在经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,IL-35也促进MC3T3E1细胞的增殖（P<0.05）,说明IL-35对MC3T3E1和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的增殖具有促进作用。2.流式细胞术结果显示,经过不同浓度的IL-35（25、50、100ng/mL）处理后,与空白对照组比较（IL-35为0ng/mL）,MC3T3E1细胞的凋亡降低（P<0.05）,说明IL-35对MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的凋亡具有抑制作用。3.pNPP偶氮法结果显示,在MC3T3E1细胞系和经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,经过第3天、第5天、第7天和第9天,经过IL-35（50ng/mL）处理后,与空白对照组比较（IL-35为0ng/mL）,MC3T3E1细胞的ALP活性显着增强（P<0.05）,说明IL-35促进MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的ALP的活性。4.RT-PCR和Western-blot结果显示,MC3T3E1和经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,与空白组（IL-35为0ng/mL）比较,IL-35显着升高OPG的表达（P<0.05）,显着降低RANKL的表达（P<0.05）。另外,我们的研究还发现,经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞的OPG、RANKL的表达比未经TNF-α处理的MC3T3E1细胞的OPG、RANKL的表达也是显着升高的（P<0.05）。5.茜素红染色结果显示,在MC3T3E1和经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,经过矿化液诱导的第20天,与空白对照组比较（IL-35为0ng/mL）,MC3T3E1细胞的体外矿化能力显着增强（P<0.05）,说明IL-35对MC3T3E1细胞系的体外矿化能力具有促进作用。在第三部分研究中:1.加入外源性Dkk-1后,IL-35诱导的MC3T3E1细胞增殖显着下降（P<0.05）。2.IL-35诱导的MC3T3E1的细胞凋亡显着升高（P<0.05）。3.IL-35诱导的ALP活性显着下降（P<0.05）。4.体外矿化能力也显着下降（P<0.05）。5.MC3T3E1细胞表达的OPG和RANKL也显着下调（P<0.05）。结论:在第一部分研究中:血清IL-35水平与绝经后RA患者的BMD,骨代谢指标和维生素D水平相关,提示IL-35在RA骨丢失的发生发展中具有重要的作用。在第二部分研究中:1.IL-35促进MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的增殖。2.IL-35抑制MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的凋亡。3.IL-35增加MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的ALP活性。4.IL-35增加MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系OPG mRNA和蛋白的表达,降低RANKL mRNA和蛋白的表达。5.IL-35促进MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系体外矿化的能力。在第三部分研究中:1.IL-35通过Wnt/β-catenin途径促进TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的增殖。2.IL-35通过Wnt/β-catenin途径抑制TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的凋亡。3.IL-35通过Wnt/β-catenin途径促进TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的ALP活性。4.IL-35通过Wnt/β-catenin途径促进TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系外矿化能力。5.IL-35通过Wnt/β-catenin途径上调TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的OPG表达,同时下调RANKL的表达。
二、可溶性白细胞介素6受体β亚基拮抗IL-6信号的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、可溶性白细胞介素6受体β亚基拮抗IL-6信号的研究（论文提纲范文）
（1）猪IL-4和IL-6基因的克隆、表达及疫苗佐剂效应研究（论文提纲范文）
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 细胞因子研究概况 |
| 1.1 细胞因子的研究进展 |
| 1.1.1 细胞因子的转录调控 |
| 1.1.2 细胞因子作用特点 |
| 1.1.3 白细胞介素研究进展 |
| 第二章 IL-4 和 IL-6 研究概况 |
| 2.1 IL-4 的研究进展 |
| 2.1.1 IL-4 的产生 |
| 2.1.2 IL-4 结构特点及与功能关系 |
| 2.1.3 IL-4 受体研究进展 |
| 2.1.4 IL-4 的生物学功能 |
| 2.1.5 IL-4 与疾病关系 |
| 2.2 IL-6 研究进展 |
| 2.2.1 IL-6 的结构特点和功能关系 |
| 2.2.2 IL-6 的受体的研究 |
| 2.2.3 IL-6R 介导的信号转导 |
| 2.2.4 IL-6 的生物学功能 |
| 2.2.5 IL-6 与疾病关系 |
| 第三章 细胞因子免疫佐剂效应的研究 |
| 3.1 免疫增强剂的发展简史 |
| 3.2 细胞因子类基因佐剂的优越性 |
| 3.3 细胞因子类基因佐剂的作用机制 |
| 3.4 细胞因子作为佐剂的应用原则 |
| 3.5 IL-4 的免疫佐剂效应 |
| 3.6 IL-6 的免疫佐剂效应 |
| 3.7 结语 |
| 第二部分 猪 IL-4 和 IL-6 基因的克隆 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物、菌种和载体 |
| 2.1.2 酶和试剂 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.3.1 IL-6 克隆引物 |
| 2.1.3.2 IL-4 克隆引物 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 溶液 |
| 2.1.6 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pIL-6 基因的克隆 |
| 2.2.1.1 猪脾细胞和淋巴细胞的分离与培养 |
| 2.2.1.2 淋巴细胞的刺激诱导 |
| 2.2.1.3 总 RNA 的提取 |
| 2.2.1.4 RT-PCR 扩增目的片段 |
| 2.2.1.5 PCR 产物的回收与纯化 |
| 2.2.1.6 目的基因的克隆 |
| 2.2.1.7 重组质粒的提取与鉴定 |
| 2.2.2 pIL-4 基因的克隆 |
| 2.2.2.1 猪脾淋巴细胞的分离与培养 |
| 2.2.2.2 淋巴细胞的刺激诱导 |
| 2.2.2.3 总 RNA 的提取 |
| 2.2.2.4 RT-PCR 扩增目的片段 |
| 2.2.2.5 PCR 产物的回收与纯化 |
| 2.2.2.6 目的基因的克隆 |
| 2.2.2.7 重组质粒的提取与鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 pIL-6 基因的克隆 |
| 2.3.1.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.3.1.2 RT-PCR 扩增pIL-6 cDNA 结果 |
| 2.3.1.3 重组质粒的酶切及 PCR 鉴定 |
| 2.3.1.4 序列分析与同源性比较 |
| 2.3.2 pIL-4 基因的克隆 |
| 2.3.2.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.3.2.2 RT-PCR 扩增pIL-4 cDNA 结果 |
| 2.3.2.3 重组质粒的酶切及 PCR 鉴定 |
| 2.3.2.4 序列分析与同源性比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 重组猪 IL-6 的原核表达与活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物、菌种和载体 |
| 3.1.2 酶和试剂 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 溶液 |
| 3.1.6 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组表达载体的构建 |
| 3.2.1.1 目的片段的扩增 |
| 3.2.1.2 目的片段与pGEX-4T-1载体的酶切回收 |
| 3.2.1.3 目的片段与表达载体的连接转化 |
| 3.2.1.4 重组表达质粒的提取与鉴定 |
| 3.2.2 以 RT-PCR检测重组子在诱导条件下的转录情况 |
| 3.2.3 重组菌的小量诱导表达 |
| 3.2.3.1 高温诱导 |
| 3.2.3.2 低温诱导 |
| 3.2.4 表达产物鉴定分析 |
| 3.2.4.1 SDS-PAGE 电泳 |
| 3.2.4.2 蛋白含量的初步测定 |
| 3.2.5 大量诱导表达重组 IL-6 蛋白 |
| 3.2.5.1 高温诱导 |
| 3.2.5.2 低温诱导 |
| 3.2.6 重组蛋白的活性分析 |
| 3.2.6.1 IL-6 重组蛋白的剂量和毒性试验 |
| 3.2.6.2 IL-6 可溶性蛋白的活性检测(MTT 法) |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 表达引物 PCR 扩增产物 |
| 3.3.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.3.3 RT-PCR 检测转录情况 |
| 3.3.4 重组菌的小量诱导表达 |
| 3.3.4.1 高温诱导结果 |
| 3.3.4.2 低温诱导结果 |
| 3.3.5 重组菌的大量诱导表达 |
| 3.3.6 纯化蛋白的检测 |
| 3.3.6.1 IL-6 重组蛋白对小鼠毒性检测结果 |
| 3.3.6.2 IL-6 重组蛋白对小鼠脾淋巴细胞生物学活性检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四部分 pIL-6 真核表达载体的构建及其疫苗佐剂效应 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物、菌种和载体 |
| 4.1.2 酶和试剂 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 培养基及溶液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 猪IL-6 真核表达载体pcDNA3.1 的构建、转化及鉴定 |
| 4.2.2 重组真核表达载体pcDNA3.1 质粒提取及纯化 |
| 4.2.2.1 质粒的大量提取 |
| 4.2.2.2 质粒 DNA 的纯化 |
| 4.2.3 猪囊尾蚴全虫抗原的制备 |
| 4.2.4 动物免疫 |
| 4.2.5 抗体水平检测 |
| 4.2.6 IL-4 的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 猪 IL-6 真核表达载体pcDNA3.1 的构建 |
| 4.3.2 重组真核表达载体pcDNA3.1 质粒提取及纯化 |
| 4.3.3 猪囊尾蚴全虫抗原的制备 |
| 4.3.4 动物免疫抗体测定结果 |
| 4.3.5 IL-4 的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 作者简介 |
（2）阻断IL-6/IL-6Rα/STAT3信号通路在猪器官狒狒异种移植模型中的抗炎作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 前言 |
| 第1章 体内研究tocilizumab抑制IL-6 激活IL-6/IL-6 Rα/STAT3 信号通路的机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2.流式细胞微珠阵列法(CBA) |
| 3.酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 4.免疫组化 |
| 5.数据分析及统计方法 |
| 结果 |
| 1.狒狒血清中IL-6 的表达与tocilizumab处理的关系 |
| 2.接受猪肾移植及tocilizumab处理的狒狒的血清中的猪源性IL-6 的表达 |
| 3.接受猪肾移植及tocilizumab处理的狒狒的猪肾移植物及肝组织中IL-及p-STAT3 的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第2章 体外研究tocilizumab抑制IL-6 激活IL-6/IL-6 Rα/STAT3 信号通路的机制 |
| 引言 |
| 第一节 体外研究tocilizumab对不同物种(人、狒狒、猪)的外周血单核细胞IL-6 Rα结合封闭效果 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.外周血单核细胞的分离 |
| 3.IL-6 Rα检测 |
| 4.数据统计分析 |
| 结果 |
| 1.Tocilizumab结合封闭人源性PBMCs的表面IL-6 Rα的效果 |
| 2.Tocilizumab结合封闭狒狒源性PBMCs的表面IL-6 Rα的效果 |
| 3.Tocilizumab结合封闭猪源性PBMCs的表面IL-6 Rα的效果 |
| 第二节 Tocilizumab抑制IL-6 激活不同种属细胞的IL-6/IL-6 Rα/STAT3 通路的效果 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.猪胸主动脉内皮原代细胞分离及冻存 |
| 3.细胞培养 |
| 4.流式细胞仪检测tocilizumab抑制IL-6 诱导人及猪动脉内皮细胞p-STAT的表达 |
| 5.流式细胞仪检测tocilizumab抑制IL-6 诱导人、狒狒、猪源性PBMCs的p-STAT3 的表达 |
| 6.数据分析及统计方法 |
| 结果 |
| 1.筛选出最佳重组人及猪源性IL-6 激活猪或人动脉内皮细胞STAT3 信号通路的浓度及刺激时间 |
| 2.Tocilizumab抑制IL-6 激活动脉内皮细胞及PBMCs的 STAT3 信号通路的效果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第3章 体外研究Siltuximab联合雷帕霉素抑制IL-6 激活IL-6/IL-6 Rα/STAT3信号通路的机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2.动脉内皮细胞培养和PBMCs的分离 |
| 3.流式细胞仪检测siltuximab抑制IL-6 诱导人及猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达 |
| 4.CBA测试siltuximab对狒狒血清中狒狒源性IL-6 的中和实验 |
| 5.流式细胞仪检测siltuximab抑制IL-6 诱导狒狒PBMCs的 p-STAT3 的表达 |
| 6.流式细胞仪检测雷帕霉素抑制IL-6 诱导人、猪动脉内皮细胞p-STAT3 的表达 |
| 7.数据分析及统计方法 |
| 结果 |
| 1.Siltuximab抑制IL-6 激活人或猪动脉内皮细胞的STAT3 信号通路的效果 |
| 2.Siltuximab抑制IL-6 激活狒狒PBMCs的 STAT3 信号通路的效果 |
| 3.雷帕霉素抑制IL-6 激活人及猪源性动脉内皮细胞的STAT3 信号通路的效果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第4章 体外研究IL-6诱导猪内皮细胞下游基因的表达及siltuximab联合雷帕霉素的抑制效果 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 2.RNA提取、逆转录及qPCR |
| 3.数据分析统计 |
| 结果 |
| 1.IL-6 激活IL-6/IL-6 Rα/STAT3 信号通路诱导下游相关基因的表达情况 |
| 2.Siltuximab及雷帕霉素抑制IL-6 诱导E-selectin、ICAM-1、VEGF及FGF2 mRNA的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果及荣誉 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（3）IL-6神经保护作用的钙离子通道机制及信号转导途径（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 IL-6经抑制L-型电压门控性钙通道的活动减少神经元内钙超载 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IL-6抑制NMDA诱导的神经元钙超载和凋亡的受体通道机制及信号转导途径 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中枢神经系统中白介素-6的作用及作用机制 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表（Abbreviation） |
| 博士期间完成的论文 |
| 博士期间学术交流情况 |
| 博士期间承担科研项目情况 |
| 致谢 |
（5）基于P38MAPK/PGC-1通路研究保元解毒汤调控线粒体功能改善癌因性肌肉萎缩机制（论文提纲范文）
| 提要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 保元解毒汤对癌性恶病质动物肌肉萎缩的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 试剂的配制 |
| 2.2 保元解毒汤水煎液的制备及质控分析 |
| 2.3 造模及分组干预 |
| 2.4 动物一般情况及体重变化 |
| 2.5 腓肠肌重量及HE染色 |
| 2.6 P38MAPK/PGC-1α通路蛋白检测 |
| 2.7 肌肉萎缩相关蛋白检测 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同批次保元解毒汤质量评价 |
| 3.2 保元解毒汤对恶病质模型小鼠体重的影响 |
| 3.3 保元解毒汤对恶病质模型小鼠腓肠肌的影响 |
| 3.4 保元解毒汤对恶病质模型小鼠P38MAPK、PGC-1αmRNA的影响 |
| 3.5 保元解毒汤对恶病质模型小鼠P38MAPK/PGC-1α通路蛋白的影响 |
| 3.6 保元解毒汤对恶病质模型小鼠Atrogin-1、Mu RF-1m RNA的影响 |
| 3.7 保元解毒汤对恶病质模型小鼠Atrogin-1、Mu RF-1 的影响 |
| 4 小结 |
| 第二部分 癌因性肌管萎缩模型的建立与评价 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 试剂的配制 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 条件培养基制备 |
| 2.4 癌因性肌管萎缩模型的构建及分组干预 |
| 2.5 普通倒置显微镜动态观察肌管形态变化 |
| 2.6 酶联免疫吸附(ELISA)法检测TNF-α、IL-6 含量 |
| 2.7 肌肉萎缩相关蛋白检测 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同浓度LCM培养不同时间对肌管形成的影响 |
| 3.2 上清液中TNF-α和 IL-6 水平测定 |
| 3.3 不同浓度LCM对肌管萎缩相关因子m RNA和蛋白表达的影响 |
| 4 小结 |
| 第三部分 保元解毒汤通过P38MAPK/PGC-1 通路调控线粒体功能干预癌因性肌管萎缩模型机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 试剂的配制 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 保元解毒汤干预时间和浓度测定 |
| 2.4 分组干预 |
| 2.5 肌管分化及萎缩相关蛋白m RNA及蛋白检测 |
| 2.6 细胞因子含量检测 |
| 2.7 P38MAPK/PGC-1 通路相关因子检测 |
| 2.8 线粒体数量检测 |
| 2.9 线粒体mt DNA拷贝数 |
| 2.10 线粒体TFAM、NRF-1、Cytc及 COXIV mRNA和蛋白检测 |
| 2.11 生物化学法检测ATP酶活性 |
| 2.12 线粒体ATP合成酶β亚基检测 |
| 2.13 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同浓度保元解毒汤对癌因性肌管萎缩的影响 |
| 3.2 不同浓度保元解毒汤对C2C12 细胞上清液TNF-α和 IL-6 含量的影响 |
| 3.3 保元解毒汤对MYH3、Myf6、Myo D、Atrogin-1和Mu RF-1 的影响 |
| 3.4 保元解毒汤对P38MAPK/PGC-1 通路相关因子的影响 |
| 3.5 保元解毒汤对线粒体数量的影响 |
| 3.6 保元解毒汤对线粒体mt DNA拷贝数、ATP合成酶β亚基的影响 |
| 3.7 保元解毒汤对线粒体NRF-1、TFAM、COXIV和 Cyt C的影响 |
| 3.8 保元解毒汤对线粒体ATP酶活性的影响 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 癌性恶病质肌肉萎缩研究概述 |
| 1.1 现代医学对癌性恶病质肌肉萎缩发病机制的研究 |
| 1.1.1 癌性恶病质肌肉萎缩相关细胞因子 |
| 1.1.2 线粒体功能失调与癌性恶病质肌肉萎缩 |
| 1.1.3 癌性恶病质骨骼肌降解增多的机制 |
| 1.2 传统中医对癌性恶病质肌肉萎缩病因病机的研究 |
| 1.3 癌性恶病质肌肉萎缩的治疗现状 |
| 2 保元解毒汤干预癌性恶病质肌肉萎缩的研究 |
| 2.1 保元解毒汤组方依据 |
| 2.2 保元解毒汤主要药效活性成分及现代药理学研究 |
| 2.3 保元解毒汤效用 |
| 2.4 保元解毒汤质控分析 |
| 2.5 癌因性肌管萎缩模型的建立及评价 |
| 2.6 保元解毒汤干预癌因性肌管萎缩模型最佳浓度最佳时间研究 |
| 2.7 保元解毒汤对癌因性肌管萎缩模型P38MAPK/PGC-1 通路的影响 |
| 2.8 保元解毒汤对癌因性肌管萎缩模型线粒体功能的影响 |
| 2.9 保元解毒汤对恶病质模型小鼠肌肉萎缩的影响 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 主要英文缩略词 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 发表论文 |
（7）运动性白细胞介素-6上升参与大鼠脂肪水解调节的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 IL-6 生物学知识概述 |
| 1.2.1 IL－6 受体系统和细胞内信号转导途径 |
| 1.3 运动性白细胞介素-6 上升的来源及调控因素 |
| 1.3.1 运动性白细胞介素-6 上升的肌源性证据 |
| 1.3.2 运动前肌糖原贮备与运动性IL-6 上升的相关研究 |
| 1.4 运动性白细胞介素-6 上升对机体的影响 |
| 1.4.1 运动中的白细胞介素-6 受体 |
| 1.4.2 白细胞介素-6 影响脂肪水解的实验证据 |
| 1.4.2.1 动物试验 |
| 1.4.2.2 人体试验 |
| 1.4.2.3 运动中脂肪组织产生的IL-6 参与脂肪水解 |
| 1.5 脂肪水解概述 |
| 1.5.1 脂肪动员 |
| 1.5.2 脂肪组织脂肪水解及运输 |
| 1.5.3 肌内甘油三酯 |
| 1.6 激素敏感性脂肪酶 |
| 1.6.1 脂肪组织的研究 |
| 1.6.2 肌肉的研究 |
| 1.6.3 大鼠肌肉研究 |
| 1.6.4 人体肌肉研究 |
| 1.7 影响脂肪水解的某些激素介绍 |
| 1.8 肌源性IL-6 与安静状态下IL-6 的生物学效应的区别 |
| 2 选题依据、研究内容和假设及技术路线图 |
| 2.1 选题依据 |
| 2.2 研究假设 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.4 研究示意图 |
| 3 预实验工作的介绍及分析讨论 |
| 4 研究一 肌糖原贮备不同、长时间运动大鼠血液 IL-6、sIL-6R 与甘油、FFA 和脂肪组织IL-6RmRNA 与HSLmRNA 和活性的变化 |
| 4.1 研究对象 |
| 4.2 运动大鼠分组及运动方案 |
| 4.3 大鼠的宰杀和测试样本的采集 |
| 4.4 测试指标和方法 |
| 4.4.1 肌糖原 |
| 4.4.2 白细胞介素-6 |
| 4.4.3 血清IL-6 可溶性受体（sIL-6R） |
| 4.4.4 甘油 |
| 4.4.5 游离脂肪酸 |
| 4.4.6 脂肪组织总RNA 提取 |
| 4.4.7 脂肪组织总RNA 浓度、纯度和完整性检测 |
| 4.4.8 cDNA 第一链合成 |
| 4.4.9 引物设计 |
| 4.4.10 基因表达的real time PCR 测定 |
| 4.4.11 脂肪组织HSL 活性的测定 |
| 4.5 统计方法 |
| 4.6 实验结果 |
| 4.6.1 肌糖原含量 |
| 4.6.2 血清白细胞介素-6 浓度 |
| 4.6.3 血清白细胞介素-6 可溶受体浓度 |
| 4.6.4 脂肪组织白细胞介素-6 受体基因表达量 |
| 4.6.5 脂肪组织HSL 基因表达 |
| 4.6.6 脂肪组织HSL 活性 |
| 4.6.7 血清甘油浓度 |
| 4.6.8 血清游离脂肪酸浓度 |
| 4.7 分析与讨论 |
| 4.7.1 肌糖原的变化 |
| 4.7.2 血清IL-6 的变化 |
| 4.7.3 血清sIL-6R 变化 |
| 4.7.4 脂肪IL-6RmRNA 变化 |
| 4.7.5 甘油和FFA 变化 |
| 4.7.6 脂肪组织HSLmRNA 变化 |
| 4.7.7 脂肪组织HSL 活性变化 |
| 4.8 小结 |
| 5 研究二 肌糖原贮备不同、长时间运动大鼠血液 IL-6、sIL-6R 与甘油、FFA 和肌肉组织IL-6RmRNA 与HSLmRNA 和活性的变化 |
| 5.1 研究对象 |
| 5.2 运动大鼠分组及运动方案 |
| 5.3 大鼠的宰杀和测试样本的采集 |
| 5.4 测试指标与方法 |
| 5.4.1 肌肉组织总RNA 提取 |
| 5.4.2 肌肉组织RNA 浓度、纯度和完整性检测 |
| 5.5 统计方法 |
| 5.6 实验结果 |
| 5.6.1 肌肉中白细胞介素-6 受体基因表达量 |
| 5.6.2 肌肉HSL 基因表达 |
| 5.6.3 肌肉HSL 活性 |
| 5.7 分析与讨论 |
| 5.7.1 肌肉IL-6RmRNA 的变化 |
| 5.7.2 肌肉HSLmRNA 表达的变化 |
| 5.7.3 肌肉HSL 活性的变化 |
| 5.8 小结 |
| 6 研究三 HSL 变化与血IL-6 及某些调节脂肪水解激素关系的研究 |
| 6.1 研究对象 |
| 6.2 运动大鼠分组及运动方案 |
| 6.3 大鼠的宰杀和测试样本的采集 |
| 6.4 测试指标和方法 |
| 6.5 统计方法 |
| 6.6 研究结果 |
| 6.6.1 血清胰岛素浓度变化 |
| 6.6.3 血清去甲肾上腺素变化 |
| 6.6.4 血清肾上腺素变化 |
| 6.6.5 血清瘦素浓度变化 |
| 6.6.6 血清IL-6 与脂肪组织HSL 基因表达及活性的相关分析 |
| 6.6.7 血清IL-6 与肌肉组织HSLmRNA 表达与HSL 活性的相关分析 |
| 6.7 分析与讨论 |
| 6.7.1 血清胰岛素的变化 |
| 6.7.2 血清生长激素的变化 |
| 6.7.3 血清儿茶酚胺激素的变化 |
| 6.7.4 血清瘦素的变化 |
| 6.7.5 IL-6 参与脂肪水解的偏相关分析 |
| 6.8 小结 |
| 7 全文总结和创新点 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 8 致谢 |
| 9 参考文献 |
（8）报告基因法检测重组人sgp130-Fc融合蛋白生物学活性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、报告基因细胞株的构建 |
| 1.1 试剂材料和仪器 |
| 1.1.1 试剂与材料 |
| 1.1.2 试剂配制 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 质粒制备 |
| 1.2.2 细胞复苏、培养、传代和冻存 |
| 1.2.3 潮霉素B筛选浓度的确定 |
| 1.2.4 转染 |
| 1.2.5 单克隆细胞分离 |
| 1.2.6 萤光素酶检测 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 质粒制备 |
| 1.3.2 抗生素筛选浓度 |
| 1.3.3 瞬时转染及检测 |
| 1.3.4 稳定转染及检测 |
| 1.3.5 单克隆分离培养及筛选 |
| 1.4 讨论 |
| 二、数字PCR法评价细胞株的萤光素酶基因修饰稳定性 |
| 2.1 试剂材料和仪器 |
| 2.1.1 试剂与材料 |
| 2.1.2 试剂配制 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.2 DNA胶回收 |
| 2.2.3 提取细胞基因组DNA |
| 2.2.4 荧光定量PCR |
| 2.2.5 PCR产物鉴定 |
| 2.2.6 数字PCR测萤光素酶基因拷贝数 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 基因组DNA制备 |
| 2.3.2 荧光定量PCR扩增萤光素酶基因和GAPDH基因 |
| 2.3.3 数字PCR测萤光素酶基因拷贝数 |
| 2.3.4 数字PCR法评价不同代次细胞基因修饰稳定性 |
| 2.4 讨论 |
| 三、RGA法方法建立及优化 |
| 3.1 试剂材料和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 萤光素酶检测方法步骤 |
| 3.2.2 方法优化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 RGA方法建立 |
| 3.3.2 RGA优化结果 |
| 3.4 讨论 |
| 四、RGA法方法学验证 |
| 4.1 试剂材料和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 专属性 |
| 4.2.2 精密度 |
| 4.2.3 准确度 |
| 4.2.4 线性 |
| 4.2.5 RGA法与细胞增殖抑制法的比较 |
| 4.2.6 细胞功能稳定性 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 专属性 |
| 4.3.2 精密度 |
| 4.3.3 准确度 |
| 4.3.4 线性 |
| 4.3.5 RGA法与细胞增殖抑制法的比较 |
| 4.3.6 细胞功能稳定性 |
| 4.4 讨论 |
| 五、总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
（9）类风湿关节炎相关细胞因子及药物研究进展（论文提纲范文）
| 1 肿瘤坏死因子 (TNF-α) 及其抑制剂 |
| 1.1 TNF-α与RA |
| 1.2 靶向TNF-α药物 |
| 2 白细胞介素家族及其抑制剂 |
| 2.1 IL-6与RA |
| 2.2 IL-1与RA |
| 2.3 IL-17与RA |
| 2.4 IL-35与RA |
| 2.5 靶向白介素家族药物 |
| 3 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 及其抑制剂 |
| 3.1 GM-CSF与RA |
| 3.2 靶向GM-CSF药物 |
| 4 临床靶向细胞因子的药物 |
| 5 结语 |
（10）白介素-35对成骨细胞生物学功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:白细胞介素-35 与类风湿关节炎骨量丢失的相关性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 临床资料 |
| 2.3 ELISA检测RA患者IL-35 的外周血水平 |
| 2.3.1 收集RA患者和健康对照组的外周血 |
| 2.3.2 ELISA检测IL-35 外周血水平 |
| 2.4 骨密度(BMD)的检测 |
| 2.5 骨转化指标(BTMs)和维生素D3的检测 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 IL-35 在RA患者和健康对照组外周血中的水平 |
| 3.2 RA患者IL-35 的血清水平与BMD的相关性分析 |
| 3.3 RA患者IL-35 的血清水平与BTMs的相关性分析 |
| 3.4 RA患者IL-35 的血清水平与维生素D的相关性分析 |
| 3.5 RA患者IL-35 的血清水平与骨代谢指标的多因素分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:白细胞介素-35 对成骨细胞生物学功能的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 MC3T3E1细胞系的培养、冻存及建立 |
| 2.2.1 MC3T3E1细胞系的培养条件 |
| 2.2.2 MC3T3E1细胞系的冻存 |
| 2.2.3 MC3T3E1细胞系的建立 |
| 2.2.4 MC3T3E1细胞的计数 |
| 2.3 IL-35 对MC3T3E1细胞系增殖的影响 |
| 2.4 IL-35 对MC3T3E1细胞系凋亡的影响 |
| 2.5 IL-35 对MC3T3E1细胞系ALP活性的影响 |
| 2.6 RT-PCR检测IL-35 对MC3T3E1细胞系分化指标m RNA的影响 |
| 2.6.1 MC3T3E1细胞系的接种与培养 |
| 2.6.2 IL-35 处理MC3T3E1细胞系 |
| 2.6.3 成骨细胞总RNA提取 |
| 2.6.4 逆转录合成c DNA |
| 2.6.5 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.7 Western-blot检测IL-35 对MC3T3E1细胞系分化指标蛋白的影响 |
| 2.7.1 IL-35 处理MC3T3E1细胞系 |
| 2.7.2 提取MCET3E1细胞的总蛋白 |
| 2.7.3 检测MCET3E1细胞的蛋白浓度(BCA法) |
| 2.7.4 配制SDS-PAGE |
| 2.7.5 Western blot(湿转法) |
| 2.7.6 抗原抗体结合 |
| 2.7.7 显色 |
| 2.8 茜素红染色检测IL-35 对MC3T3E1细胞系体外矿化结节的影响 |
| 2.9 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 MC3T3E1细胞系的体外培养及鉴定 |
| 3.2 IL-35 促进MC3T3E1细胞系的增殖 |
| 3.3 IL-35 抑制MC3T3E1细胞系的凋亡 |
| 3.4 IL-35 促进MC3T3E1细胞系ALP的活性 |
| 3.5 IL-35 对MC3T3E1细胞系中OPG、RANKL m RNA表达的影响 |
| 3.6 IL-35 对MC3T3E1细胞系分化指标蛋白表达的影响 |
| 3.7 IL-35 对MC3T3E1细胞系体外矿化能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:白细胞介素-35 通过Wnt/β-catenin途径影响成骨细胞的生物学功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 MC3T3E1 细胞系的培养、冻存及建立 |
| 2.2.1 MC3T3E1 细胞系的培养条件 |
| 2.2.2 MC3T3E1 细胞系的冻存 |
| 2.2.3 MC3T3E1 细胞系的建立 |
| 2.2.4 MC3T3E1 细胞的计数 |
| 2.3 IL-35 对MC3T3E1 细胞系增殖的影响 |
| 2.4 IL-35 对MC3T3E1 细胞系凋亡的影响 |
| 2.5 IL-35 对MC3T3E1 细胞系ALP活性的影响 |
| 2.6 RT-PCR检测IL-35 对MC3T3E1 细胞系分化指标m RNA的影响 |
| 2.6.1 MC3T3E1 细胞系的接种与培养 |
| 2.6.2 IL-35 处理MC3T3E1 细胞系 |
| 2.6.3 成骨细胞总RNA提取 |
| 2.6.4 逆转录合成c DNA |
| 2.6.5 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.7 Western-blot检测IL-35 对MC3T3E1 细胞系分化指标蛋白的影响 |
| 2.7.1 IL-35 处理MC3T3E1 细胞系 |
| 2.7.2 提取MC3ET3E1 细胞的总蛋白 |
| 2.7.3 检测MCET3E1 细胞的蛋白浓度(BCA法) |
| 2.7.4 配制SDS-PAGE |
| 2.7.5 Western blot(湿转法) |
| 2.7.6 抗原抗体结合 |
| 2.7.7 显色 |
| 2.8 茜素红染色检测IL-35 对MC3T3E1 细胞系体外矿化结节的影响 |
| 2.9 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 IL-35 通过Wnt/β-catenin途径促进MC3T3E1 细胞系的增殖 |
| 3.2 IL-35 通过Wnt/β-catenin途径抑制MC3T3E1 细胞系的凋亡 |
| 3.3 IL-35 通过Wnt/β-catenin途径促进ALP的活性 |
| 3.4 IL-35 通过Wnt/β-catenin途径促进成骨细胞的分化 |
| 3.5 IL-35 通过Wnt/β-catenin途径促进成骨细胞体外矿化能力 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究结果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、可溶性白细胞介素6受体β亚基拮抗IL-6信号的研究（论文参考文献）
- [1]猪IL-4和IL-6基因的克隆、表达及疫苗佐剂效应研究[D]. 罗启慧. 西北农林科技大学, 2005(02)
- [2]阻断IL-6/IL-6Rα/STAT3信号通路在猪器官狒狒异种移植模型中的抗炎作用的研究[D]. 张国强. 南昌大学, 2019(01)
- [3]IL-6神经保护作用的钙离子通道机制及信号转导途径[D]. 马颂华. 苏州大学, 2014(10)
- [4]可溶性白细胞介素6受体β亚基拮抗IL-6信号的研究[J]. 倪长源,沈倍奋,黎燕,赖春宁,王建安,任蕴芳. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996(04)
- [5]基于P38MAPK/PGC-1通路研究保元解毒汤调控线粒体功能改善癌因性肌肉萎缩机制[D]. 章洪华. 山东中医药大学, 2019(05)
- [6]gp130胞外区近膜端缺失的突变体介导IL-6信号的研究[J]. 倪长源,黎燕,王建安,任蕴芳,沈倍奋. 中华微生物学和免疫学杂志, 1998(04)
- [7]运动性白细胞介素-6上升参与大鼠脂肪水解调节的研究[D]. 宋刚. 北京体育大学, 2006(03)
- [8]报告基因法检测重组人sgp130-Fc融合蛋白生物学活性[D]. 贾春翠. 中国食品药品检定研究院, 2019(09)
- [9]类风湿关节炎相关细胞因子及药物研究进展[J]. 于彭城,刘梦,徐寒梅,胡加亮. 药物生物技术, 2019(02)
- [10]白介素-35对成骨细胞生物学功能的影响及机制研究[D]. 李雨轩. 中国医科大学, 2019(01)