一、用双抗体夹心ELISA法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究（论文文献综述）
曲立新,幸桂香,李峰,崔现兰,周方红[1]（1996）在《用双抗体夹心ELISA法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究》文中进行了进一步梳理应用鸡病毒性关节炎病毒Ｕ．ＣｏｎｎＳ１１３３株，建立了检测鸡病毒性关节炎病毒抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法。用该法检测三组接毒鸡的关节液，接毒后３天即可检出阳性，阳性率为５８．３％；发病严重的４～１１天阳性检出率达９５７％，１４天阳性率为５０％；１７天阳性率为３１．３％；２０天以后则全部为阴性。用该法对大肠杆菌（Ｅ．ＣｏＬｉ）、葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、败血支原体（ＭＧ）、滑膜支原体（ＭＳ）、新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、传染性脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）进行检测，结果均为阴性。试验表明，我们建立的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法，能早期、特异、敏感地检出鸡病毒性关节炎病毒抗原，从而解决了对该病早期诊断及类症鉴别带来的困难。
朱建中,董国雄,李俊宝[2]（1998）在《抗鸡关节炎病毒单克隆抗体介导间接ELISA的建立》文中提出利用淋巴细胞杂交瘤技术制备出抗鸡关节炎病毒特异的、具有群反应特性的单克隆抗体，挑选其中ＡＤ８株作为一抗建立检测抗原的间接ＥＬＩＳＡ，该法具有高度的特异性和敏感性，不仅适用于大面积检测的需要，而且可用于该病的早期诊断。
刘赫[3]（2019）在《鸡源呼肠孤病毒检测方法的建立及其σC蛋白单克隆抗体的制备》文中研究指明禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）属于呼肠孤病毒科（Reovirdae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）,主要引起肉鸡的病毒性关节炎和腱鞘炎。近年来,我国山东、江苏、河北、福建、浙江等地的肉种鸡场和商品肉鸡场先后发生该病疫情的报道,给肉鸡养殖业带来了严重损失。本研究针对ARV野毒株LY383建立了地高辛标记的核酸探针检测方法,同时对其主要抗原蛋白σC进行了原核表达,进而建立了ARV抗体的间接ELISA检测方法,并利用纯化的重组蛋白,制备了相应的单克隆抗体,为ARV的临床检测和后续研究提供了技术支持,具体研究内容如下:根据ARV S1基因序列,设计特异性的引物,通过RT-PCR扩增得到229bp的基因片段,将纯化后的胶回收产物利用地高辛进行标记,制备核酸探针,建立地高辛标记的核酸探针检测ARV的方法。特异性试验结果表明,H9亚型禽流感病毒（H9-AIV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、禽腺病毒（FAV）、新城疫病毒（NDV）的核酸无法与探针杂交显色,只有ARV与该探针杂交结果为阳性;敏感性试验结果表明,标记探针最低检出量为50pg/μL。对临床采集的13份疑似感染病料进行检测,与RT-PCR检测结果的符合率为100%。制备的探针保存在-20°C冰箱中90d后仍可继续用于检测,稳定性较好。以上结果表明所建立的ARV地高辛标记的核酸探针检测方法具有较好的特异性、敏感性和稳定性,操作简便,可大批量检测临床样本。设计一对特异性引物,经RT-PCR反应扩增出ARVσC基因片段,克隆至pMD18-T载体,将测序鉴定正确的重组载体σC-pMD18-T和表达载体pET-32a（+）分别进行双酶切反应后,构建σC-pET-32a重组表达质粒,转入E.coli BL21（DE3）表达菌。通过优化蛋白诱导表达的条件,表达融合蛋白,经过尿素梯度洗涤法初步纯化和镍柱再次纯化后,进行SDS-PAGE电泳,确定目的蛋白的表达形式为包涵体,Western blot鉴定结果显示,表达的融合蛋白具有良好的反应性。利用表达的重组蛋白建立检测ARV抗体的间接ELISA方法:棋盘稀释法确定目的蛋白的最佳包被稀释度为1:1000;血清最佳稀释度为1:10;最佳封闭液为5%脱脂奶粉;兔抗鸡IgG-HRP酶标二抗稀释度为1:500。该方法与其他病原体之间无阳性反应,板间和板内试验确定其变异系数为4.85%至7.93%,具有较好的重复性,可应用于大规模血清学调查和流行病学监测。将纯化后的σC重组蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经过筛选和亚克隆最终获得2株能稳定分泌σC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为A1S9、B2D9,通过抗体亚类试剂盒测定所获得的单抗为IgG1亚型、轻链为κ链。ELISA效价测定结果显示,上清效价为1:100,小鼠腹水的效价为1:128000和1:256000。Western blot和IFA鉴定结果显示制备的单抗可与ARV发生特异性反应。
常继涛[4]（2006）在《鸡病毒性关节炎病毒分离株S1基因的克隆与序列分析及RT-PCR检测方法的研究》文中研究说明本试验将鸡病毒性关节炎病毒（AVAV）内蒙古、天津地区分离株（B-98,C-98,G-98,T-98株）经SPF鸡胚增殖活化,进行总RNA的提取。参考GeneBank中ARV-S1133株S1基因序列设计一对测序引物,一对诊断引物。应用测序引物进行RT-PCR特异性地扩增病毒的S1基因。将S1基因cDNA克隆到pGEM-TEasy载体后进行测序。测序结果表明所扩增的cDNA片段长1643个核苷酸,包含了完整的S1基因的三个开放阅读框架（ORF1,ORF2和ORF3）和基因两端的非编码区,ORF1,ORF2和ORF3分别编码P10、P17和σ3蛋白。核苷酸序列比较分析结果表明:4株AVAV分离株之间在P10和P17蛋白基因上均没有核苷酸差异,在σ3蛋白基因上也只存在3个核苷酸差异;4株AVAV分离株与其它参考毒株除ARV-138和纳尔逊海湾病毒（Nelson Bay Virus,NBV）外,同源性都在95%以上。表明,鸡病毒性关节炎病毒我国分离株在S1基因上与参考毒株有很大的相关性。应用诊断引物一步法RT-PCR扩增病毒RNA,以建立RT-PCR诊断方法,同时检测其特异性和敏感性。特异性试验和敏感性试验结果表明,所建立的一步法RT-PCR方法可以检测到经鸡胚增殖的病毒标准株ARV–S11 33及地方分离株（B-98,C-98,G-98,T-98）的核酸,在琼脂糖凝胶电泳中出现了与预期大小一致的435bp的DNA片段,而其他对照病原（NDV,IBDV,IBV,ILTV,EDS76V）的检测结果均为阴性;该RT-PCR的最低检测量为0.5ng的ARV RNA,说明此方法对于禽呼肠孤病毒的检测是特异、敏感的。
黄梅清[5]（2006）在《禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗的制备和免疫效果的研究》文中指出1997年以来，在我国南方番鸭养殖地区爆发一种新发疫病——禽（番鸭）呼肠孤病毒感染，俗称番鸭“肝白点病”或“花肝病”，发病率20％～90％，死亡率10％～30％，应激或混合感染时高达90％以上。由于该病潜伏期短（3～11天），易感日龄小（1～10日龄），雏番鸭免疫系统发育未成熟，难以产生足够的抗体抵挡病毒的攻击，所以获得足够的母源抗体是防控该病的重要手段。本研究以此为出发点，试制了禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗，用于免疫接种种番鸭以产生母源抗体保护雏番鸭抵抗病毒的感染，为制定免疫程序防控该病提供重要的依据。 制备疫苗的种毒来源于本实验室分离保存的禽（番鸭）呼肠孤病毒YB分离株，该病毒株具有良好的抗原性和免疫原性。用番鸭胚成纤维细胞传代培养，获得病变集中、一致、病毒含量较高(TCID50为10-7.1934／0.1ml)的细胞毒，即为疫苗抗原液。疫苗抗原液经0.3％甲醛溶液灭活后，用油乳佐剂乳化制成疫苗。 建立间接ELISA方法以检测禽（番鸭）呼肠孤病毒抗体滴度。经二次差速离心、盐析法浓缩提纯细胞毒，获得浓度为0.7355mg／ml病毒抗原液。制备了阳性血清（琼扩效价为1：16）、阴性血清、二抗（兔抗番鸭）阳性血清（琼扩效价为1：128），提纯二抗并标记HRP酶，获得合格的酶标二抗。建立了间接ELISA检测方法：抗原稀释30倍，酶标二抗稀释50倍，血清稀释50倍，临界值为0.5。结果判定：以能产生阳性反应的血清最高稀释度为该血清的终点抗体滴度。 制备的疫苗为油包水型乳白色油状物，稳定性较好。经检验安全，番鸭无不良反应。疫苗放置4℃冰箱保存3个月，免疫效力不变。用试制的疫苗于产前10天免疫种番鸭，皮下注射，1ml／只。免疫后14天，阳转率达100％，抗体水平持续上升，至免疫后60天，抗体滴度约保持在1：700，此后抗体水平开始下降。取种番鸭免疫20天后产下的种蛋，孵出雏番鸭。3日龄雏番鸭母源抗体水平平均达到1：200，7日龄时下降至1：70，14日龄时检测不到母源抗体。 当免疫种番鸭抗体效价达到高峰（抗体滴度1：900）后，取其后代雏番鸭作为免疫组番鸭进行保护力实验，未免疫种番鸭的后代雏番鸭则作为空白组。在进行雏番鸭保护力实验前，预先攻毒一批雏番鸭，待其发病后，把感染发病的番鸭与免疫组、空白组番鸭同群饲喂，检测母源抗体对雏番鸭的保护效果。结果表明：当饲养同居群中感染发病鸭数量达到13％时，有母源抗体的雏番鸭存活率为60％。当饲养同居群中感染发病鸭数量超过40％时，母源抗体无法保护雏番鸭不发病。当攻毒剂量≤5×104.1934TCID50／羽时，则有70％以上的保护。而无母源抗体的雏番鸭在受到≥103.1934TCID50／羽毒量攻击或者饲养同居群中感染发病鸭数量大于13％时，死亡率达到50％以上。 选取不同地区的2个种番鸭养殖场进行田间试验，全场免疫试制的禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗，随机采集种番鸭血清，测定抗体滴度，结果均达到实验预期水平，跟踪其后代雏番鸭的生长，饲养良好，未发生禽（番鸭）呼肠孤病毒感染。
王丹[6]（2006）在《鸡病毒性关节炎》文中研究说明鸡病毒性关节炎（Avian viral arthritis,AVA）是由鸡病毒性关节炎病毒（Avian viral arthritis virus,AVAV）引起的鸡的一种传染病,以侵害胫跖关节、趾关节及其肌腱为特征。本病分布广泛,世界各地均有发生。在急性发病鸡群中,特别是种鸡群,常因
王全溪[7]（2004）在《番鸭呼肠孤病毒病诊断技术研究》文中认为番鸭呼肠孤病毒病主要发生于番鸭，夏季多发，发病日龄以4～45日龄为主，发病率达20％～90％，应激或混合感染下，死亡率可达90％以上。国内外未见有该病血清学诊断方法的报导。因此，临床上建立一种切实可行且快速的诊断方法越来越受到国内水禽养殖业的关注。本研究以此为出发点，建立了快速、简便、准确，而且能够在基层应用的间接ELISA检测病毒抗体和反向乳胶凝集试验检测病毒抗原两种血清学诊断方法。 本课题以本实验室分离鉴定保存的番鸭呼肠孤病毒B3分离株为研究材料，开展了番鸭呼肠孤病毒病间接ELISA和反向乳胶凝集试验两种血清学诊断方法的研究与应用工作。 1．采用番鸭胚成纤维细胞成功的培养了番鸭呼肠孤病毒，感染细胞产生了明显的CPE病变，并进行病毒的扩大培养，细胞培养物经二次差速离心和硫酸铵沉淀制备了所需的诊断抗原，病毒蛋白含量为5.628mg／ml。 2．采用细胞培养的番鸭呼肠孤病毒，按所设定的免疫程序免疫成年公番鸭，获得琼扩效价为1：16的阳性血清，经粗提和纯化获得了蛋白含量为4.242mg／ml的一抗IgG。同时采集健康番鸭的血清，纯化后获得IgG，按所设定的免疫程序免疫家兔，获得琼扩效价为1：8的兔抗番鸭二抗血清，并纯化得到蛋白含量为5.395mg／ml的二抗IgG。采用改良的过碘酸钠法成功地把HRP标记在纯化的二抗IgG上，结果表明，酶结合率=0.5312，标记率=0.6909，符合ELISA的要求。 3．用硫酸铵粗提的番鸭呼肠孤病毒作为包被抗原和HRP酶标记的兔抗番鸭二抗，成功地建立了检测番鸭呼肠孤病毒病抗体的间接ELISA法。试验结果表明，包被抗原1：80（0.0704mg／ml）稀释，待检血清1：40稀释，酶标二抗1：200稀释，是本方法最佳的工作浓度。应用研究结果表明，该法不与其它病原发生交叉反应，阻断效果明显，检测番鸭呼肠孤病毒抗体可达1：800比琼扩试验高50倍，ELISA测定临床采集的血清阳性率达70％，琼扩试验阳性率37.5％，两者符合率67.5％，批内批间重复结果稳定。因此，间接ELISA法检测番鸭呼肠病毒抗体特异性高、敏感性强、重复性好、质量稳定、结果可靠，适合于临床流行病调查。 4．用纯化的抗番鸭呼肠孤病毒抗体致敏乳胶成功地建立了反向乳胶凝集试验检测番鸭呼肠孤病毒抗原的方法。通过试验，确定了抗体致敏乳胶的最佳浓度为0.4242 mg／ml，最佳致敏温度37℃，最佳致敏时间2h。应用研究结果表明，抗体致敏乳胶无自凝性，特异性强，重复性好，质量可靠。人工攻毒雏番鸭，用本方法可于攻毒后的第三天粪便中检测到病毒抗原，直至攻毒鸭全部死亡都可从粪便中检测到病毒，可见在感染早期，病鸭即可从粪便排毒，且持续较长时间，及时无害化处理粪便对防制本病有重大意义。攻毒1日龄雏番鸭，剖检无菌采集取心、肝、脾按常规方法提取病毒抗原，检测结果表明，脾脏在攻毒后第4天3只中有2只结果阳性，第5天2只死亡鸭中有一只肝脏结果阳性，此后的病死鸭脾和肝番鸭呼肠孤病毒检测都阳性，而心脏处理物未见有阳性。
李传峰[8]（2010）在《鸭病毒性肿头出血症病毒感染特性及其免疫检测技术的研究》文中认为1998-2003年四川省、重庆市、贵州省和云南省等养鸭省份发生了一种以鸭头肿胀、眼结膜充血、出血,全身皮肤广泛性出血,肝肿胀呈土黄色,并伴有出血斑点,体温43℃以上,排草绿色稀粪等特征性的急性病毒性传染病。该病目前给养鸭业带来了巨大的经济损失。程安春等通过流行病学调查、临床症状和病理学变化观察、病理组织学检查、病原的分离鉴定、人工感染试验、电镜观察、防治试验,确诊为一种新的鸭病,并命名为“鸭病毒性肿头出血症（Duck viral swollen head hemorrhagic disease, DVSHD）”。国内其他学者也称之为“鸭传染性肿头症”或“鸭肿头败血症”。本病与鸭瘟在临床特征和尸检变化上有许多相似之处,鸭病毒性肿头出血症病毒（Duck swollen head hemorrhagic disease virus, DSHDV）是该病的病原。目前有关该病的研究资料报道较少,特别是有关DSHDV感染特性以及特异、敏感、快速的检测方法等更是缺乏深入研究。因此,本文对鸭病毒性肿头出血症病毒的对成年鸭和鸭胚感染特性以及相关的免疫检测技术进行了一系列的研究。本研究获得以下系列结果：1.鸭病毒性肿头出血症实验感染模型的建立：本实验用鸭病毒性肿头出血症病毒强毒（HY-99株）作为种毒,通过肌注、口服和滴鼻三种方式感染28日龄健康鸭,攻毒后每天观察临床症状和发病鸭及死亡鸭的剖检变化。结果显示,感染鸭出现以体温升高、头颈肿胀、眼结膜充血、出血、排灰白色或草绿色稀粪为主要特征的临床症状和肝脏肿大、出血呈土黄色、免疫器官和消化道严重充血、出血为主要特征剖检变化。结果表明,临床症状和剖检变化与自然感染鸭基本一致,本实验成功构建了鸭病毒性肿头出血症实验感染模型。2. DSHDV强毒人工感染鸭组织病理学发展规律研究：本研究对实验感染模型中感染鸭各个组织器官进行了动态组织病理学变化观察。结果表明,实验感染模型中三组鸭出现的组织病理学变化基本一致,但时间存在差异：肌注组鸭于感染后72h内、滴鼻组和口服组144h内组织病理学变化以充血、出血和炎性细胞浸润为主；肌注组鸭于感染72h后、滴鼻组和口服组144h后组织病理学变化以弥漫性出血、大小不等坏死灶或粘膜上皮细胞的坏死为主。免疫器官、消化腺、消化道、呼吸器官、心脏和肾脏等是主要的靶器官。这表明DSHDV是一种泛嗜性病毒,对全身各个组织器官具有严重破坏作用。3. DSHDV强毒在人工感染鸭宿主细胞内的形态发生学和超微病理学研究：电镜下,完整DSHDV粒子呈圆形或椭圆形,无囊膜,直径为70nm-85nm。病毒粒子仅出现在感染细胞的胞浆中。电镜下,可观察到病毒粒子于感染4h后吸附于法氏囊靶细胞表面,并通过细胞的内吞作用进入细胞后,在胞浆内脱去双层衣壳,随后在胞浆内复制并合成病毒相关蛋白。这些合成结构蛋白、非结构蛋白及成熟或不成熟的病毒粒子在胞浆内聚集成圆形、椭圆形或不规则形的包涵体结构。感染后24h-72h,病毒核酸在这些基质上组装和成熟形成完整的病毒粒子。感染144h后,成熟病毒通过细胞的崩解而释放到细胞间隙。DSHDV强毒人工感染成年鸭后能够引起宿主细胞明显的超微结构变化（坏死和凋亡）。该病毒的主要靶器官包括法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏、消化道和肾脏等器官。病毒侵染靶细胞主要有：淋巴细胞、肝细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、上皮性网状细胞、粘膜上皮细胞、肠腺细胞等。4. DSHDV强毒致人工感染鸭和鸭胚宿主细胞凋亡的研究：通过TEM法观察发现,DSHDV经尿囊腔感染10日龄鸭胚后尿囊膜上皮细胞、肝细胞、肠道上皮细胞和心肌细胞发生凋亡。凋亡细胞时间分布在感染后24h-96h,同时在部分宿主细胞的胞浆内发现少量病毒粒子。本研究利用HE染色法、TEM法和TUNEL法三种方法均观察到DSHDV感染诱导鸭宿主细胞的凋亡。发生凋亡的器官包括法氏囊、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、心脏、食管、腺胃和肠道。宿主细胞的凋亡指数从感染后2h到72h逐渐增加,72h达到最高值。感染72h后,濒死鸭和死亡鸭宿主细胞死亡以典型坏死为主。DSHDV感染诱导的细胞凋亡在DVSHD的致病机制中起到重要作用。5.免疫酶组织化学检测DSHDV抗原方法的建立和应用：本研究以兔抗DSHDVIgG作为一抗、HRP-羊抗兔IgG作为二抗建立并优化了在石蜡切片中检测DSHDV抗原的间接免疫酶SP法,研究证实本方法具有较高的特异性和敏感性。该方法的应用研究揭示,三组鸭感染DSHDV后,肌注组（4h）、滴鼻组（12h）和口服组（24h）依次首先从法氏囊组织中检测阳性信号,随后抗原在多个组织中检出,包括免疫器官、消化腺、消化道、肾脏、心脏、肺脏和气管等。DSHDV侵染的靶细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、网状细胞、粘膜上皮细胞、肝细胞、间质细胞、腺泡细胞、肠腺细胞、肾小管上皮细胞、心肌细胞和柱状上皮细胞等。6.间接ELISA检测鸭病毒性肿头出血症抗体方法的建立和应用：本研究以浓缩纯化的DSHDV作为包被抗原,建立了检测DSHDV抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。试验最佳反应条件为：抗原最佳稀释度为1：40,高免血清为1：80稀释,最佳反应时间为60min；酶标抗体为1：2000稀释,最佳反应时间为60min；封闭液为1%BSA-PBST,封闭时间为60min；包被抗原最佳工作条件为37℃孵育1h后过夜；底物的最佳反应时间为37℃孵育15min。本实验建立的方法可成功应用于临床样品的检测和鸭免疫后抗体水平的评估。因此,本方法具有良好的特异性、稳定性、可重复性和较高的敏感性,可用于DVSHD抗体的检测。
魏战勇[9]（2001）在《鸡病毒性关节炎油乳剂灭活苗的研究》文中研究表明本文比较研究了鸡病毒性关节炎病毒地方分离株B、C、G、T四个毒株在鸡胚、鸡胚成纤维细胞、仓鼠肾传代细胞上的增殖特性，研究结果表明，AVAV地方分离株均能较快适应鸡胚和鸡胚成纤维细胞，其中鸡胚成纤维细胞产毒量高，且易观察细胞病变。四株地方分离株盲传7代均未适应仓鼠肾传代细胞。应用甲醛、二乙烯亚胺对分离毒株进行灭活试验，结果表明，2‰甲醛灭活效果良好，而1%BEI不能完全灭活AVAV。选用上述四株病毒作为种毒，研制了AVA油乳剂灭活苗；经检验该疫苗的物理性状和无菌性均合格，以lml/只注射10日龄雏鸡未见不良反应，安全可靠。对雏鸡免疫后15天、30天的攻毒试验结果表明，疫苗免疫雏鸡的攻毒保护率分别为85%和90%；疫苗免疫种鸡后，对其后裔雏鸡在5日龄、20日龄时攻毒，保护率分别为80%和53.3%。
郑玉姝[10]（2006）在《免疫抑制性病毒感染对SPF鸡脾细胞IFN-γ产生的影响》文中研究表明多种病毒感染都可能引起禽类的免疫抑制。如马立克氏病病毒（MDV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽J亚群白血病病毒（ALV-J）、鸡传染性贫血病病毒（CAV）、禽呼肠孤病毒（ARV）、新城疫病毒（NDV）和传染性法氏囊病病毒（IBDV）等。流行病学调查表明,免疫抑制性病毒感染在鸡群中相当普遍,而且这些病毒造成的二重感染及多重感染可能导致更为严重的免疫抑制。免疫抑制病给我国集约化养禽业带来了很大危害。但迄今为止,对上述病毒诱发免疫抑制的机理,特别是细胞因子在免疫抑制性病毒感染、发病及免疫反应中发挥的作用还不清楚。有研究表明,一些病原引起的免疫抑制可能与细胞因子的分泌水平和表达异常有关。其中对于免疫应答的重要调节因子——γ-干扰素（IFN-γ）通常采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）在mRNA水平上进行检测,但这种方法只能间接反映病毒感染对脾白细胞分泌IFN-γ的影响。本研究则是采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）对REV、MDV、CAV和ARV感染SPF鸡的脾白细胞分泌的IFN-γ水平进行了直接定量研究。分别在REV、MDV、CAV和ARV单独感染和共感染鸡后的不同时间,采集脾脏制备脾白细胞,并进行培养,并比较在脾白细胞中IFN-γ的分泌水平,以此阐明IFN-γ在REV、MDV、CAV和ARV感染引起的免疫抑制过程中可能发挥的作用。采用生物素-链霉亲和素系统放大的双抗体夹心酶联免疫吸附方法,以鼠抗鸡IFN-γ单克隆抗体（mAb）为包被抗体,以针对不同抗原表位的生物素化mAb作为检测抗体对IFN-γ进行定量测定,并对ELISA试验影响因素进行了探讨。结果表明,在10-1000 pg/mL的浓度范围内,IFN-γ标准品浓度与吸光度值线性关系良好,相关系数为r=0.9921。以pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）为包被液包被12 h,以1%牛血清白蛋白（BSA）为封闭液,室温封闭2 h,并以含1% BSA的PBS-Tween（PBST）为样品稀释液,降低了非特异性吸附,提高了灵敏度。正常情况下,IFN基因表达处于抑制状态,在诱生剂的诱导作用下可以进行表达。因此,本研究采用双抗体夹心ELISA对培养的不同种类细胞在不同诱生剂作用下IFN-γ的分泌水平进行了定量检测,并对影响IFN-γ产量的条件进行了优化。结果表明:在刀豆蛋白A（ConA）、植物凝集素（PHA）和ARV这3种诱生剂中,ARV诱生能力最强,
二、用双抗体夹心ELISA法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用双抗体夹心ELISA法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究（论文提纲范文）
（3）鸡源呼肠孤病毒检测方法的建立及其σC蛋白单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒感染的研究现状 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 致病性 |
| 1.1.4 防控措施 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒诊断方法的研究进展 |
| 1.2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.2.2 血清学诊断方法 |
| 1.2.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、细胞、载体、血清及实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ARV地高辛核酸探针检测方法的建立 |
| 2.2.2 ARVσC蛋白的原核表达 |
| 2.2.3 检测ARV抗体间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.4 ARVσC蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 ARV核酸探针的制备 |
| 3.1.1 PCR扩增 |
| 3.1.2 敏感性试验 |
| 3.1.3 特异性试验 |
| 3.1.4 稳定性试验 |
| 3.1.5 临床样品的初步检测 |
| 3.2 ARVσC基因的原核表达 |
| 3.2.1 目的基因的扩增 |
| 3.2.2 重组表达载体σC-pET32a的双酶切鉴定 |
| 3.2.3 重组蛋白最佳表达条件的优化 |
| 3.2.4 重组蛋白的纯化及表达形式的确定 |
| 3.2.5 Western-blot分析鉴定 |
| 3.2.6 蛋白浓度的确定 |
| 3.3 检测ARV抗体的间接ELISA方法建立 |
| 3.3.1 抗原最佳包被浓度与血清稀释度的确定 |
| 3.3.2 抗原最佳包被条件的确定 |
| 3.3.3 最佳封闭液的确定 |
| 3.3.4 兔抗鸡IgG-HRP酶标抗体最佳稀释度的确定 |
| 3.3.5 阴阳性临界值的确定 |
| 3.3.6 特异性试验 |
| 3.3.7 与商品化试剂盒的比较 |
| 3.3.8 重复性试验 |
| 3.3.9 临床样品的检测 |
| 3.4 ARVσC单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.4.1 免疫小鼠血清抗体效价的测定 |
| 3.4.2 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.4.3 单克隆抗体亚类的测定 |
| 3.4.4 单克隆抗体效价的测定 |
| 3.4.5 单克隆抗体反应性鉴定 |
| 3.4.6 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.4.7 稳定性试验 |
| 3.4.8 腹水纯化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 核酸探针的制备 |
| 4.2 ARV σC 蛋白的原核表达 |
| 4.3 检测 ARV 抗体间接 ELISA 方法的建立 |
| 4.4 ARV σC 单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（4）鸡病毒性关节炎病毒分离株S1基因的克隆与序列分析及RT-PCR检测方法的研究（论文提纲范文）
| 1 引言 |
| 1.1 鸡病毒性关节炎概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 病毒特征 |
| 1.2.2 生物学特性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 病理变化 |
| 1.6 鸡病毒性关节炎诊断 |
| 1.7 鸡病毒性关节炎防制 |
| 1.8 鸡病毒性关节炎疫苗 |
| 1.9 研究新进展 |
| 1.10 本论文研究依据及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验毒株 |
| 2.1.2 鸡胚 |
| 2.1.3 菌株及质粒 |
| 2.1.4 酶和生物试剂 |
| 2.1.5 培养基和抗生素 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.1.7 引物的设计与合成 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的增殖 |
| 2.2.2 处理病料 |
| 2.2.3 RNA 的提取 |
| 2.2.4 鸡病毒性关节炎病毒 51 基因的克隆与序列分析 |
| 2.2.5 一步法 RT-PCR 检测 ARV |
| 3 试验结果 |
| 3.1 目的基因的 PCR 扩增 |
| 3.2 重组pGEM-T/51 质粒的 PCR 鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒测序结果 |
| 3.4 AVAV 51 基因序列比较分析 |
| 3.4.1 P10 蛋白基因序列比较分析 |
| 3.4.2 P17 蛋白基因序列比较分析 |
| 3.4.3 σ3 蛋白基因序列比较分析 |
| 3.5 一步法 RT-PCR 检测试验结果 |
| 3.5.1 一步法 RT-PCR 检测特异性试验结果 |
| 3.5.2 一步法 RT-PCR 检测敏感性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗的制备和免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 综述 |
| 1.禽呼肠孤病毒研究现状 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒简介 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒历史 |
| 1.3 禽呼肠孤病毒特征 |
| 1.4 禽呼肠孤病毒的诊断 |
| 1.5 防治方法的研究 |
| 2.酶联免疫吸附试验概述 |
| 2.1 酶免疫技术简介 |
| 2.2 酶免疫技术的发展 |
| 2.3 酶联免疫吸附试验的原理 |
| 2.4 酶联免疫吸附试验的类型 |
| 2.5 用的酶及显色底物 |
| 2.6 酶标记物的制备 |
| 3.兽用疫苗研究现状 |
| 3.1 兽用生物制品简介 |
| 3.2 兽用疫苗研究现状 |
| 材料与方法 |
| 1.抗原抗体及酶标二抗的制备 |
| 2.间接ELISA检测番鸭呼肠孤病毒抗体方法的建立 |
| 3.禽(番鸭)呼肠孤病毒灭活疫苗的制备 |
| 4.禽(番鸭)呼肠孤病毒油乳剂灭活苗的质量检验 |
| 实验结果 |
| 1.抗原抗体制备与二抗的酶标 |
| 2.间接ELISA检测禽(番鸭)呼肠孤病毒抗体方法的建立 |
| 3.禽(番鸭)呼肠孤病毒病油乳剂灭活苗的制备 |
| 4.试制疫苗的质量检验 |
| 分析与讨论 |
| 1.对实验方法与操作的讨论 |
| 2.对实验结果的讨论 |
| 3.实验的创新之处 |
| 4.实验存在的问题 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）番鸭呼肠孤病毒病诊断技术研究（论文提纲范文）
| 1 封面 |
| 2 目录 |
| 3 中文摘要 |
| 4 英方摘要 |
| 5 正文 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 综述 |
| 5.2.1 呼肠孤病毒的研究现状 |
| 5.2.2 免疫酶技术的研究进展 |
| 5.2.3 乳胶凝集试验的研究进展 |
| 5.3 抗原与抗体的制备和二抗的酶标 |
| 5.3.1 抗原的制备 |
| 5.3.2 血清的制备及酶的标记 |
| 5.3.3 小结 |
| 5.4 间接ELISA检测番鸭呼肠孤病毒抗体方法的建立 |
| 5.4.1 材料与方法 |
| 5.4.2 结果 |
| 5.4.3 小结 |
| 5.5 反向乳胶凝集试验检测番鸭呼肠孤病毒抗原方法的建立 |
| 5.5.1 材料与方法 |
| 5.5.2 结果 |
| 5.5.3 小结 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 结论 |
| 5.8 参考文献 |
| 5.9 附录 |
| 6 致谢 |
（8）鸭病毒性肿头出血症病毒感染特性及其免疫检测技术的研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 鸭主要病毒性传染病病原的感染特性 |
| 1 概况 |
| 2 鸭病毒性传染病流行特点 |
| 3 鸭主要病毒性传染病病原的感染特性 |
| 3.1 鸭病毒性肠炎病原的感染特性 |
| 3.2 鸭病毒性肝炎病原的感染特性 |
| 3.3 鸭流感病原的感染特性 |
| 3.4 鸭病毒性肿头出血症病原的感染特性 |
| 4 存在的问题和研究方向 |
| 第二章 免疫酶技术在病毒病研究中的应用 |
| 1 免疫酶技术基本原理 |
| 2 免疫酶技术发展简史 |
| 3 酶标技术的研究进展 |
| 3.1 标记酶的特点 |
| 3.2 标记酶的种类 |
| 3.3 标记酶底物的种类 |
| 3.4 酶标记技术的种类 |
| 4 免疫酶技术的研究就进展 |
| 4.1 免疫酶组化技术研究进展 |
| 4.2 免疫酶测定法的研究进展 |
| 5 免疫酶组化在病毒病研究中的应用 |
| 5.1 免疫酶组化技术在家畜病毒病研究中的应用 |
| 5.2 免疫酶组化技术在家禽病毒病研究中的应用 |
| 6 酶联免疫吸附测定法在病毒病研究中的应用 |
| 6.1 ELISA在家畜病毒病研究中的应用 |
| 6.2 ELISA在家禽病毒病研究中的应用 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 DSHDV强毒人工感染鸭实验模型构建及组织病理学发展规律研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验鸭分组及人工感染 |
| 2.2 临床症状及病理剖检 |
| 2.3 病理切片的制备和观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 剖检变化 |
| 3.3 组织病理学变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DVSHD病理学模型构建及其特征 |
| 4.2 DVSHD与鸭常见传染病的临床症状及剖检变化的异同 |
| 4.3 DVSHD与鸭常见传染病的组织学变化的异同 |
| 4.4 病理学变化的特征及意义 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第四章 DSHDV强毒在人工感染鸭宿主细胞内的形态发生学和超微病理学研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 人工复制病例 |
| 2.2 透射电镜样品制备及观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 DSHDV的形态特征 |
| 3.2 DSHDV分布及形态发生特点 |
| 3.3 宿主细胞的超微结构变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DSHDV病毒粒子在感染鸭体内形态特征与形态发生学过程 |
| 4.2 DSHDV致感染鸭的超微结构变化及意义 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第五章 DSHDV强毒人工感染鸭和鸭胚致宿主细胞凋亡研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器及设备 |
| 1.5 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸭胚的人工感染 |
| 2.2 实验鸭的人工感染及样品的采集 |
| 2.3 HE染色法观察 |
| 2.4 透射电镜法观察 |
| 2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 3 结果 |
| 3.1 DSHDV在鸭胚上的培养特性 |
| 3.2 DSHDV致鸭胚宿主细胞凋亡的观察 |
| 3.3 DSHDV致鸭宿主细胞凋亡的观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞凋亡的基本特征 |
| 4.2 细胞凋亡的检测方法 |
| 4.3 DSHDV感染与宿主细胞凋亡 |
| 4.4 DSHDV致宿主细胞凋亡的规律 |
| 4.5 DSHDV致宿主细胞凋亡机制的探讨 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第六章 免疫组化检测DSHDV方法的建立和在检测病毒侵染规律研究中的应用 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要试剂及配制 |
| 1.5 主要仪器及设备 |
| 1.6 器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 人工复制病例 |
| 2.2 实验鸭的人工感染及样品采集 |
| 2.3 兔抗DSHDV高免血清IgG的提取和纯化 |
| 2.4 载玻片和盖玻片的处理 |
| 2.5 免疫组化检测材料的固定、包埋和切片 |
| 2.6 免疫组化检测鸭病毒性肿头出血症病毒方法的建立及优化 |
| 2.7 间接免疫酶法检测DSHDV在鸭体中的侵染规律 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔抗DSHDV高免血清效价及IgG纯化 |
| 3.2 免疫组化SP染色方法的建立和优化 |
| 3.3 特异性实验结果 |
| 3.4 重复性和稳定性实验结果 |
| 3.5 间接免疫酶法检测组织中DSHDV在鸭体中的侵染规律 |
| 4 讨论 |
| 4.1 检测DSHDV抗原的间接免疫酶法的建立与优化 |
| 4.2 DSHDV抗原的定位和DSHDV的侵染规律 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第七章 间接ELISA检测鸭病毒性肿头出血症抗体方法的建立和应用 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 1.6 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗原的制备与纯化 |
| 2.2 鸭病毒性肿头出血症阳性、阴性血清的制备 |
| 2.3 间接ELISA的基本操作程序 |
| 2.4 间接ELISA最佳工作条件的确定 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 敏感性试验 |
| 2.7 重复性试验 |
| 2.8 临床血清样品的检测 |
| 2.9 免疫鸭特异性抗体的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒抗原的含量和阳性血清效价 |
| 3.2 间接ELISA法最佳工作条件的选择 |
| 3.3 特异性试验 |
| 3.4 敏感性试验 |
| 3.5 重复性试验 |
| 3.6 临床血清样品的检测结果 |
| 3.7 免疫鸭特异性抗体的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 间接ELISA技术参数的选择 |
| 4.2 间接ELISA特异性和敏感性 |
| 4.3 间接ELISA试验质量控制 |
| 4.4 间接ELISA在临床上的应用 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 第五部分 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）鸡病毒性关节炎油乳剂灭活苗的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡病毒性关节炎病毒的增殖结果 |
| 2.2 VAV病毒效果检验结果 |
| 2.3 油乳剂灭活苗的研制结果 |
| 2.4 油乳剂灭活苗的物理性状、无菌及安全性检验结果 |
| 2.5 油乳剂灭活苗的免疫试验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）免疫抑制性病毒感染对SPF鸡脾细胞IFN-γ产生的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 细胞因子的检测 |
| 1.2 鸡病毒性免疫抑制病中细胞因子的检测 |
| 1.3 小结 |
| 第一部分 双抗体夹心ELISA 检测鸡 IFN-γ及其条件优化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 鸡IFN-γ的诱生及其条件优化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 鸡免疫抑制性病毒感染SPF 鸡对脾白细胞中 IFN-γ产生的影响 |
| 试验一 禽网状内皮组织增生病病毒和马立克氏病病毒感染 SPF 鸡对 IFN-γ产生的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验二 禽网状内皮组织增生病病毒和呼肠孤病毒感染 SPF 鸡对 IFN-γ产生的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验三 禽网状内皮组织增生病病毒和鸡传染性贫血病病毒感染SPF 鸡对IFN-γ产生的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
四、用双抗体夹心ELISA法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究（论文参考文献）
- [1]用双抗体夹心ELISA法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究[J]. 曲立新,幸桂香,李峰,崔现兰,周方红. 中国畜禽传染病, 1996(01)
- [2]抗鸡关节炎病毒单克隆抗体介导间接ELISA的建立[J]. 朱建中,董国雄,李俊宝. 江苏农学院学报, 1998(03)
- [3]鸡源呼肠孤病毒检测方法的建立及其σC蛋白单克隆抗体的制备[D]. 刘赫. 山东农业大学, 2019(01)
- [4]鸡病毒性关节炎病毒分离株S1基因的克隆与序列分析及RT-PCR检测方法的研究[D]. 常继涛. 内蒙古农业大学, 2006(10)
- [5]禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗的制备和免疫效果的研究[D]. 黄梅清. 福建农林大学, 2006(12)
- [6]鸡病毒性关节炎[J]. 王丹. 郑州牧业工程高等专科学校学报, 2006(02)
- [7]番鸭呼肠孤病毒病诊断技术研究[D]. 王全溪. 福建农林大学, 2004(04)
- [8]鸭病毒性肿头出血症病毒感染特性及其免疫检测技术的研究[D]. 李传峰. 四川农业大学, 2010(12)
- [9]鸡病毒性关节炎油乳剂灭活苗的研究[D]. 魏战勇. 内蒙古农业大学, 2001(01)
- [10]免疫抑制性病毒感染对SPF鸡脾细胞IFN-γ产生的影响[D]. 郑玉姝. 山东农业大学, 2006(12)