一、染色质的结构和功能—SV40基因组的研究（论文文献综述）
潘宏[1]（2019）在《CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究》文中研究说明CRISPR系统已经成为生物研究中不可或缺的工具之一。至今为止,CRISPR-Cas9不再仅仅是一种基因编辑工具,它的应用领域范围扩展到基因调控、表观遗传编辑、染色质工程和成像等方面,已远远超过了野生型（WT）Cas9本身的基因编辑功能。CRISPR相关新技术的开发和应用将是未来研究的热点问题。本研究主要是应用CRISPR/Cas9系统相关新技术在小鼠细胞、胚胎及人的胚胎中对靶基因进行基因编辑,从而探讨这些新技术是否能安全、有效的应用于遗传疾病治疗。首先,本研究通过在小鼠细胞中比较CasRx系统抑制NHEJ途径重要因子Lig4并结合CRISPR/Cas9系统及Cas9-ORF52蛋白（Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52蛋白）共表达这两种策略对同源重组效率的影响,证明这两种方法均能显着的提高同源重组的效率,为在临床疾病治疗中实现需要定向碱基插入或靶向点突变的精确基因组编辑应用提供了新的策略。其次,应用BE3碱基编辑系统,即Crispr-stop新技术对小鼠体内3个基因单独或同时进行敲除,旨在可以在F0代中产生直接用于分析的单个或三个纯合突变小鼠,避免繁琐的小鼠繁殖过程并能使研究小鼠基因功能成为一种模式化操作。最后,将单碱基编辑系统,即BE3、ABE7.10分别与传统CRISPR相关技术进行基因编辑效率的比较,结果显示BE3和ABE7.10系统比传统CRISPR相关技术均更具优势。同时还应用BE3系统在人类胚胎中进行碱基编辑,证实BE3系统可在人类三核（3PN）受精卵中进行有效且精确的碱基编辑。主要研究结果如下:1.检测CasRx系统和共表达Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52蛋白在小鼠细胞中提高同源重组效率的相关研究为了提高HDR（homology-directedrepair,HDR）效率,以便能够插入精确的遗传修饰,本实验在小鼠N2A细胞的荧光报告系统中分析比较了两种策略:使用CasRx系统抑制NHEJ（Non-homologous end joining,NHEJ）途径中的关键分子DNA连接酶IV,以及Kaposi肉瘤相关的疱疹病毒（KSHV）ORF52蛋白与Cas9蛋白共表达这两种策略。结果发现CasRx系统对DNA连接酶IV的抑制策略使HDR效率提高了1.4倍。当与Cas9系统共表达时,ORF52将HDR效率提高了2.1倍,因此后者略更具优势。此外,使用Cas9-ORF52共表达的策略在小鼠N2A和E14细胞对ACTB和Tubb3基因进行靶向敲入,HDR效率提高了约24倍。Cas9-ORF52共表达策略能有效增强CRISPR/Cas9介导的HDR效率,这对未来涉及精确基因组编辑的相关研究提供了新的途径。2.应用BE3碱基编辑系统对小鼠体内进行多基因同时敲除的研究利用BE3系统进行基因敲除的方法称为Crispr-stop。以小鼠听觉器官耳蜗为实验对象,本实验完成了三个不同的类型的体内实验。首先,通过破坏Atoh1（一种对听觉毛细胞生成至关重要的基因）进行了原理验证测试。其次,单独敲除了三个听觉所必需且在人类耳聋患者中具有频繁的突变率的基因:vGlut3,Otoferlin和Prestin,在F0代直接获得单基因敲除的具有听觉障碍的小鼠模型。最后,成功地同时敲除了vGlut3,Otoferlin和Prestin,F0代直接获得多基因同时敲除的小鼠。研究数据表明Crispr-stop可以在F0产生可直接用于分析单个或三个纯合突变小鼠,缩短了基因敲除的世代间隔及繁琐的小鼠繁殖过程,同时使研究小鼠基因功能成为一种模式化操作。证明体内Crispr-stop是一种非常有效的适用于研究小鼠发育过程中的功能基因的方法。3.单碱基编辑系统与传统CRISPR相关技术编辑效率比较及BE3系统对人类胚胎碱基编辑效率的研究本实验中使用的单碱基编辑系统包括BE3及ABE7.10。首先,使用ABE7.10（TadA-TadA*7.10-nCas9）诱导Tyr基因的点突变产生突变小鼠,以期证明ABE7.10在小鼠胚胎中碱基编辑的潜力。在Tyr基因上设计了三个突变位点。通过微注射ABE7.10 mRNA和sgRNA在小鼠受精卵中进行碱基编辑。三个位点突变效率分别为75%、87.5%和75%,碱基编辑率较高。将ABE7.10系统与传统的CRISPR辅助ssODN介导的同源定向修复相比较,ABE7.10系统展示了高碱基编辑效率和低Indels（插入或缺失）率,因此ABE7.10系统在靶向点突变方面更具优势。同时,针对小鼠Tyr基因设计四个基因敲除靶位点,在小鼠胚胎中将BE3系统与CRISPR-Cas9系统进行比较。实验结果表明,当使用单个sgRNA靶向敲除小鼠Tyr基因时,两种方法均会产生一定比率的嵌合小鼠出现。而当使用多个sgRNA时,嵌合率降低或为零。虽然BE3系统与CRISPR-cas9系统对基因敲除都具有很高的效率,但BE3系统产生基因敲除小鼠的嵌合率更低,纯合率更高。综上所述,单碱基突变系统在靶向点突变方面及基因敲除方面比传统CRISPR-cas9技术更具优势。使用BE3和SaKKH-BE3在人类三核（3PN）受精卵中进行基因编辑研究,结果表明BE3和SaKKH-BE3B在HBB,FANCF和DNMT3B三个基因中均具有较高的碱基编辑效率,并且在基因编辑的人胚胎中没有观察到明显的脱靶效应,证明了应用碱基编辑系统纠正未来人类胚胎中的遗传缺陷是可行的。综上所述,通过应用CRISPR系统相关新技术在小鼠细胞、胚胎及人类胚胎中去探讨基因编辑的效率、安全性及可行性,为这些技术在未来用于进行构建动物疾病模型及人类疾病治疗的研究中提供了一定的科学依据。
沈丹[2]（2020）在《Tc1/mariner转座子挖掘、高活性成员鉴定及其在增强子捕获中的应用》文中进行了进一步梳理随着越来越多生物基因组测序工作的完成,科学界对转座子在生命科学的重要性的理解和认识也逐渐加深。已有研究表明转座子在生物界分布广泛,对基因和基因组进化发挥重要作用,并可能影响物种分化和品种（品系）形成。另外由于转座特性,一些DNA转座子被成功开发成遗传操作工具,如SB,PB和Tol2等,在转基因、基因治疗和功能基因组学研究领域中得到广泛应用,并取得重要进展。其中,Tc1/mariner超家族是一类广泛分布的DNA转座子。到目前为止,已经鉴定到了 10多个具有天然活性的Tc1/mariner转座子,但只有人工分子重构的SB转座子得到广泛应用。本研究对斑马鱼基因组的Tc1/mariner超家族进行了系统挖掘和高活性成员应用评估,并对Tc1/mariner超家族中的DD41D/VS家族的分布和传播等进化特性进行了系统研究,主要包括以下研究内容:1.重头挖掘了斑马鱼基因组中的Tc1/mariner转座子,并进行了系统分类、插入年龄分析、转座酶结构域预测等研究;2.DD41D/VS转座子家族的分布、插入年龄分析、横向传播规律等研究;3.ZB转座子在哺乳动物中的转座活性和特性分析;4.ZB转座子在斑马鱼增强子捕获中的应用研究,捕获增强子鉴定验证;5.ZB转座子介导鼠精子突变体库构建及增强子捕获研究。主要结果如下:1、对Tc1/mariner超家族中另一个家族DD41D（Visitor,VS）进化分析表明:VS转座子在动物中分布广泛,在140个非脊椎动物和30个脊椎动物（其中12个为哺乳动物,包括1个灵长类）和1个植物检测到VS分布。VS在脊椎动物和非脊椎动物中发生了多次横向传播。进化关系和序列相似性矩阵分析显示DD41D/VS与DD37D/maT和DD34D/mariner关系更近,而DD40D是源自DD41D家族,而非一个独立的进化分支。插入年龄分析表明脊椎动物中VS的插入年龄差异明显,鳍鱼类和蟾蜍为年轻插入,其次是蝙蝠和有袋动物,而无颚鱼类和蜥蜴中主要是古老的VS转座插入。细胞试验表明源自蝙蝠基因组中结构完整的VS转座子已经失去转座活性。2、通过斑马鱼基因组的Tc1/mariner超家族的系统挖掘,共鉴定到10个自主和77个非自主Tc1/mariner转座子,占5.41%（90.69 Mb）。进化关系分析显示:Tc1-1DR,Tc1-4DR,Tc1-8BDR,Mariner-6DR,Mariner-7DR,Mariner-13DR,Mariner-15DR和Tc1-21DR这八个转座子属于DD34E/Tc1家族,而Mariner-14DR属于DD37E/TRT家族,Mariner-18DR属于DD×D/pogo家族。这些转座酶都具有保守的DNA结合结构域（DBD）和催化结构域（DDE/D）。其中Tc1-8BDR（命名为ZB转座子）全长1597 bp,中间为1个可编码341 aa的转座酶基因,两侧是201 bp的TIRs,且目标位点重复序列（TSD）为“TA”。ZB转座子在斑马鱼基因组中有25个拷贝,其中能编码完整转座酶的拷贝有20个,同源性大于99%。插入年龄分析显示,ZB转座子最年轻,可能具有较高的活性。3、细胞实验表明高剂量时ZB活性显着高于其他三个常用转座子（SB、PB和Tol2）（p<0.05）,且ZB和SB、PB和Tol2一样也存在转座酶过量抑制现象,但存在细胞和剂量差别,在低剂量（10 ng）转座子转染HepG2细胞和高剂量（500 ng）转染Hela细胞时,四个转座子均出现了过量抑制,但是在高剂量（500ng）转染HepG2细胞时,ZB和Tol2没有出现抑制现象。ZB转座后留下“CA/TG”三碱基“足迹”,与SB和Frog Prince转座子相同。ZB插入偏好性分析表明,ZB转座子是非随机插入到基因组中,对基因调控序列有一定的偏好性,且偏好插入6个TA碱基短回文序列（ATATATAT）。4、设计构建了 ZB和Tol2转座子介导的斑马鱼增强子捕获载体,并通过显微注射,分别获得60和87个ZB和Tol2转座子介导的斑马鱼增强子捕获品系。经荧光显微镜检测,ZB介导的增强子捕获效率与Tol2相近,生殖系传递效率分别为55.56%（n=108）和55.77%（n=156）。且ZB比Tol2更倾向于产生单一GFP表达模式后代（p<0.05）,Tol2更倾向于产生多GFP表达模式的后代（表型数≥2）。通过Sp-PCR成功注解了 4个ZB（ZK32,ZK36,ZK47和ZK68）和2个Tol2（TK1和TK4）介导的增强子捕获品系。VISTA注解共获得13个潜在的增强子,并对其中的8个进行了增强子鉴定和活性验证。5、设计构建了鼠增强子捕获载体及ZB转座子介导鼠精子突变体库。通过显微注射,分别制备了 ZB转座子和转座酶的转基因鼠,并成功构建含转座子和转座酶的双转基因公鼠4只（精子突变体库）,与野生的母鼠杂交制备突变体。通过常规PCR和Linker-PCR对12窝,共135个后代小鼠检测,获得72只ZB转座子转基因阳性鼠,61个后代的插入位点与父本的转座子原插入位点一致,11个后代插入到了新位点,ZB转座子重新转座的效率为15.3%（11/72）,高于SB和PB（约10%）。并获得GFP阳性鼠3只（n15、n19和n111）,VISTA注解获得11个潜在的增强子。总体而言,本文系统揭示了Tc1/mariner转座子超家族中DD41D/VS家族在生物界的进化规律,及Tc1/mariner转座子在斑马鱼基因组上构成、种类、进化动力学等特性,成功挖掘了高活性ZB转座子,并系统评估了其转座活性和特性,构建了 ZB介导的鼠精子突变体库,在模式动物斑马鱼和鼠上进行增强子捕获应用研究。证实ZB能够高效介导基因转移,在转基因、基因治疗、功能基因组学等研究中具有很大应用潜力。
任艳萍[3]（2014）在《转PRL基因小鼠模型的构建与Stat5a的乳腺发育调控机理研究》文中指出催乳素（prolactin, PRL）是一种多肽类激素,具有促进乳腺发育、启动并维持泌乳的功能。PRL的生理功能主要通过PRLR-JAK/Stat5信号通路介导,而PRL、PRLR、Stat5a、Stat5b基因是介导乳腺发育及乳汁分泌信号通路所必须的因子。Stat5a和Stat5b均为PRL的胞内信号传导因子,两者间可形成同源或异源二聚体,调节靶基因的表达。研究发现,在PRL对乳腺的调控过程中,Stat5a是主要的胞内信号传导蛋白,参与调控乳腺细胞增殖与分化,但对其具体调控机制尚不清楚。为了探讨通过乳腺特异性表达外源PRL基因提高转基因水牛奶品质或奶产量的可行性,本研究首先构建并筛选了乳腺特异性表达PRL基因载体,建立了转PRL基因小鼠模型并对其进行了分析鉴定。同时,通过寻找转录因子Stat5a的靶基因,探讨了其调控乳腺细胞增殖与分化的作用机理。一、乳腺特异性表达PRL基因载体构建为筛选得到适用于体细胞核移植和原核注射的乳腺特异性表达PRL转基因载体,采用加有His标签和凝血酶识位点的特异性引物,通过RT-PCR方法从成年雌性水牛垂体组织中扩增得到不含信号肽的长804bp的PRL基因片段。以在KpnI和SacI位点插入有BCNpolyA序列的pMD18-T载体为骨架,依次连接插入PRL基因、酪蛋白（BCN）启动子（3.8BCN或5.2BCN）、标记或筛选基因元件（cmv-EGFP-SV40polyA-SV40polyA、cmv-EGFP-SV40 polyA-SV40-neo-SV40polyA或cmv-EGFP-IRES-neo-SV40 polyA）3个片段,构建获得5个乳腺特异性表达水牛PRL基因的载体。将5个载体分别瞬时转染Bcap37细胞,分析各载体在细胞水平上外源基因的表达情况。结果显示,除p3.8BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40polyA-SV40-neo-SV40 polyA载体外,其余4个载体均可在Bcap37细胞中表达外源PRL基因。细胞转染样品Western Blot分析发现,5.2BCN载体的PRL蛋白表达水平高于3.8BCN载体。考虑到不同转基因动物制备方法的需要,选择p5.2BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40 polyA载体备用于原核注射法生产转基因小鼠模型,选择适于细胞筛选的p5.2BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-IRES-neo-SV40polyA载体为核移植法用转基因载体结构。二、乳腺特异性表达PRL基因小鼠模型的建立与分析将p5.2BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40polyA载体进行线性化处理后,通过原核注射法将质粒注入到FVB小鼠受精卵内,共获得8只携带有外源基因的首建鼠。活体荧光及爪尖荧光检测结果显示,部分小鼠可观察到明显的绿色荧光信号。PRL和cmv片段的PCR扩增结果显示,部分小鼠可扩增得到长752 bp的PRL基因片段以及长599 bp的cmv启动子片段；Southern Blot进一步验证了PCR检测为阳性的小鼠基因组中整合有外源基因。繁殖的部分F2代小鼠,在长波UV灯下部分小鼠发出明显的绿色荧光。外源基因拷贝数的Q-PCR分析结果发现,UV灯下有明显绿色荧光的小鼠外源基因拷贝数达到十个以上,无明显荧光小鼠的拷贝数仅为2个。外源基因整合位点的Gene Walking检测结果显示,有明显绿色荧光小鼠的外源基因插入位点上下游20kb附近不存在其他基因。以上结果表明,采用原核注射法可生产转PRL基因的小鼠,且外源基因在转基因小鼠后代中可稳定地遗传。对转基因小鼠中外源PRL蛋白表达情况、表达PRL对转基因小鼠泌乳及安全性的影响进行了进一步分析。转基因小鼠主要脏器组织的WesternBlot分析发现,外源PRL蛋白仅在小鼠乳腺及乳汁中表达。ELISA分析结果显示,转基因小鼠乳汁中PRL蛋白含量为611.74-2773.96μIU/ml,是野生型小鼠的77.92～706.80%倍；平均含量为769.24μIU/ml,是野生型小鼠的223.73%倍。QRT-PCR分析发现,转基因小鼠乳腺中乳蛋白（CSN2）和乳糖（B4galtl）基因表达水平显着上升（P≤0.01）。ELISA法分析血清中PRL蛋白含量结果显示,泌乳期转基因小鼠血清中PRL蛋白含量显着高于野生型（≤0.01）,非泌乳期无显着差别。转基因小鼠平均产仔数与野生型相比不存在显着差异（P≥0.05）。以上结果表明,外源PRL基因仅在转基因小鼠乳腺特异性表达,其表达可在泌乳期促进乳腺中乳蛋白和乳糖相关基因的表达,且对转基因小鼠的生存和繁殖性能无不良影响。三、转录因子Stat5a靶基因的筛选与分析为寻找与小鼠乳腺发育相关转录因子Stat5a的靶基因,在利用QRT-PCR分析Stats在乳腺不同发育时期表达结果的基础上,采用ChIP-seq和RNA-seq方法对妊娠后期野生型小鼠（16天,G-NC）、妊娠后期转PRL基因小鼠（16天,G-PRL）和泌乳期转PRL基因小鼠（7天,L-PRL） 3个样本进行了深入分析,构建了G-NC VS G-PRL、G-PRL VS L-PRL 2个对比组。ChIP-seq数据中,3个样本均得到了25M以上的Reads,其中唯一定位的Reads有20M以上,占总Reads的78%以上。G-NC、G-PRL和L-PRL3个样本扫描分别得到218、234和160个Peaks,平均Peak长度约1 kb。GO分析发现,Peaks相关基因在生物过程方面主要与细胞过程、代谢过程、组织信号过程等关系最为紧密；在分子功能方面,主要与结合、催化活性、分子传导活性等关系密切。RNA-seq测序后,每个样本均得到11M以上的Reads,其中唯一定位的Reads有8M左右,数据分析发现测序量达到饱和、Reads覆盖度高、随机性好,得到了良好的RNA-seq数据。表达差异基因分析发现,与G-NC相比,G-PRL样本中有253个基因表达上调,414个基因表达下调；与G-PRL相比,L-PRL样本中有157个基因表达上调,2180个基因表达下调。对表达差异的基因进行GO分析发现,在生物过程方面,2个对比组表达差异的基因均主要与细胞过程、代谢过程、生物调控等关系最为紧密,在分子功能方面,均与结合、催化活性、分子传导活性等关系最为密切,该结果与ChIP-seq数据分析中Peaks相关基因的GO分析结果基本一致,由此说明,转录因子Stat5a的结合与其结合位点相关基因的表达水平密切相关。对ChIP-seq和RNA-seq数据进行联合分析,共发现10个受Stat5a调控的靶基因。G-PRL与L-PRL样本数据对比发现,Stat5a在小鼠妊娠后期与Erbb4、Tnfrsf13c、Gabrp、Arrdc4、Pvt1、AI848285基因的靶位点结合并上调这些基因的表达;Stat5a在妊娠后期与Lgr6、Ptprv基因的靶位点1结合,上调这些基因表达,在泌乳期与靶位点2结合,下调这2个基因表达。G-NC与G-PRL样本数据对比发现,妊娠后期,野生型小鼠的Stat5a与Ceacam2和Atp2b2基因的靶位点1结合,下调了基因的表达；外源PRL的表达使得Stat5a与其靶位点脱离,上调了这些基因的表达。这些结果表明,Stat5a在小鼠妊娠后期通过与Erbb4、Tnfrsfl3c和Lgr6等与细胞有丝分裂、细胞凋亡和细胞分化等功能相关基因的靶位点结合,上调这些基因的表达,并进而通过这些基因所参与的信号通路,包括Shc/Grb2/Soc-Rac-Raf-MPK、NF-KAPPA和Wnt等发挥调控乳腺细胞增殖与分化的功能。上述结果表明,通过乳腺特异性表达PRL基因可以提高转基因动物的奶品质或奶产量,PRL胞内信号因子Stat5a可通过调节Erbb4、Tnfrsfl3c和Lgr6等靶基因的表达参与调控乳腺细胞的增殖与分化。
王颖洁[4]（2020）在《gga-miR-31-5p调控鸡减数分裂和精子生成的机制解析》文中进行了进一步梳理精子发生（Spermatogenesis）是一个复杂而精细的调控过程,目前关于它的研究多集中在基因和药物水平,而对此过程中调控网络的系统研究却很少涉及。本研究旨在探索鸡精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSC）向精子发生过程中新的调控网络,通过对减数分裂关键基因Stra8上游miRNA（microRNA,miRNA）的研究,分析减数分裂过程中 TF（Transcription factors,TF）-miRNA-Stra8的调节机理以及 lncRNA（Long non-coding RNA,lncRNA）-miRNA-Stra8的竞争调节机制,以期深入解析鸡精子发生过程中TF、miRNA、lncRNA和Stra8的分子调控网络。基于此目标,本文以家鸡为研究对象,采用miRNA-seq技术对视黄酸（Retinoic acid,RA）诱导胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ESC）向雄性生殖细胞分化过程关键节点细胞的miRNA进行研究,筛选出参与ESC向SSC分化且可能调控Stra8的关键miRNA,并结合体内外实验验证该miRNA与Stra8及减数分裂的关系;最后对该miRNA的转录及调控机制（TF-miRNA-Stra8和lncRNA-miRNA-Stra8）进行了进一步的探究,以期为阐明精子发生机制以及ESC向精子定向分化诱导体系的建立提供理论和实验基础。研究结果如下:（1）为了探究RA诱导ESC分化的具体调控机制及该过程中受RA调控基因Stra8表达差异不显着的原因,对RA诱导过程中关键时间点的细胞、与其相同时间节点的自分化ESC和刚分离的ESC进行miRNAs测序,分析其中可能参与生殖细胞分化的关键 miRNAs,并利用 qRT-PCR分别对它们在0dESC（c0）、RA诱导第 4d/10d（R4/R10）、自分化第 4d/10d（z4/z10）、PGC（Primordial germ cell,PGC）和 SSC 中的表达量进行了检测。结果发现:gga-miR-146c-5p、gga-miR-148a-3p、gga-miR-21-5p 和 gga-miR-30d四个miRNAs在c0、R4、R10、z4和z10中均高表达,且它们的靶基因均与细胞分化相关,其中gga-miR-30d、gga-miR-21-5p和gga-miR-148a-3p的靶基因与雄性生殖细胞发育及分化相关,且富集到Notch、GnRH、MAPK和TGF-β等信号通路;对z4 vs c0 与 R4 vs c0 分析,发现包括 gga-miR-31-5p 在内的 55 个差异 miRNA,z10 vs c0与R10 vs c0相比,发现包括gga-miR-148a-3p在内的77个miRNAs,而对比R4 vs c0和z10 vs c0仅有两个共有的差异miRNA,且这两个miRNA对生殖细胞的形成具有重要作用;对比在PGC/SSC/SP（Spermatogonia,SP）中miRNA的测序结果,发现在RA诱导过程中,上述三种细胞中的包括gga-miR-30d在内差异miRNAs的表达趋势与RA诱导过程中基本一致;靶向Stra8的gga-miR-31-5p等也在RA诱导过程中也呈上调表达。以上结果表明gga-miR-31-5p等miRNA极有可能参与调控ESC向SSC分化并影响Stra8表达。（2）为了更好地探究调控Stra8基因表达的分子调控机制,本研究利用3’RACE技术扩增Stra8的3’UTR,利用生物信息学在线软件Targetscan和miRBase反向预测靶向鸡Stra8基因的miRNAs,分别构建了各miRNA的过表达载体及Stra8 3’UTR荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶活性报告系统和突变miRNA结合位点确定了靶向Stra8的关键miRNA,并构建其干扰载体;同时利用免疫法制备anti-Stra8血清;利用qRT-PCR对不同细胞中关键miRNA 和Stra8的表达谱进行检测;在体外,以过表达和干扰关键miRNA的方式处理SSC并结合RA诱导,通过流式细胞分析细胞倍型和qRT-PCR检测减数分裂相关基因表达变化;在体内,通过对性成熟的公鸡进行睾丸注射、测定精液量、精子密度、qRT-PCR检测减数分裂相关基因表达和睾丸组织HE染色。结果显示:成功构建各miRNA的过表达载体和Stra8 3’UTR双荧光素酶报告载体,以及gga-miR-31-5p突变位点的Stra8 3’UTR荧光素酶报告载体;双荧光素酶活性检测显示,gga-miR-31-5p对Stra8的抑制活性最佳,且突变位点后的双荧光素酶活性检测结果显示,gga-miR-31-5p直接可靶向Stra8;在细胞中过表达/干扰gga-miR-31-5p后,Stra8与gga-miR-31-5p表达方式呈相反状态;Elisa结果显示成功制备抗Stra8血清;体外流式细胞分析发现,过表达gga-miR-31-5p后,单倍体形成效率极显着下降（P<0.01）,qRT-PCR结果显示过表达gga-miR-31-5p可极显着下调Stra8等减数分裂相关基因的表达量（P<0.01）;体内实验表明,过表达gga-miR-31-5p使公鸡的精液量和精子密度极显着下降（P<0.01）,同时qRT-PCR结果显示Stra8等减数分裂相关基因表达量显着下调（P<0.05）,WB显示Stra8蛋白表达显着受到抑制,HE染色结果显示过表达gga-miR-3 1-5p使睾丸组织松散、管腔内精子含量较少。以上结果表明,gga-miR-3 1-5p靶向Stra8,通过抑制:Stra8表达调控精子形成。（3）为了系统有效地阐明在不同细胞中添加RA后gga-miR-31-5p的表达差异,本研究结合UCSC和NCBI数据库查询gga-miR-31-5p的pre-miRNA上游2180bp左右序列,扩增出全长,置换pEGFP-N1载体中的CMV启动子,构建重组载体pEGFP-miR-31-2180,转染至DF-1细胞中确定该片段是否有启动活性;通过构建gga-miR-31-5p启动子区域不同缺失片段,pGL3-584、pGL3-1344和pGL3-2180,转染DF-1后利用双荧光素酶报告系统,筛查出gga-miR-31-5p启动子区域可能存在的重要调控元件;分别将gga-miR-31-5p启动子与Stra8启动子转染DF-1/ESC/SSC细胞,经RA处理后,利用双荧光素酶报告系统检测RA对各启动子作用情况,同时将gga-miR-31-5p启动子与Stra8启动子进行共转染,经RA处理后,检测各自受RA调控情况;筛查仅作用于gga-miR-31-5p启动子且在ESC和SSC中差异表达的转录因子,并构建其结合位点缺失载体,同样以双荧光素酶报告系统检测过表达/干扰转录因子/缺失结合位点后对gga-miR-31-5p启动子活性的影响;最后分别用10-6MTSA和10-5MRA对转染gga-miR-31-5p启动子的DF-1细胞进行处理,双荧光素酶活性报告系统检测gga-miR-31-5p启动子活性变化,qRT-PCR检测经TSA和RA处理的ESC/SSC中gga-miR-31-5p的表达变化。测序结果表明成功构建了 pEGFP-miR-31-2180,且该载体转染DF-1细胞后能表达绿色荧光,说明其具有启动活性;启动子各缺失片段的测序结果也表明载体构建成功,双荧光素酶活性检测进一步确定了 gga-miR-31-5p启动子2180bp具有启动活性;发现仅在gga-miR-31-5p 启动子-2180bp～-1344bp 区域存在 RARa、c-Jun、HNF-4a、REV-ErbA、ER 和HNF-1等结合位点,其中RA可增强gga-miR-31-5p启动活性,且gga-miR-31-5p启动子与Stra8启动子竞争性结合RA;而且还发现转录因子c-jun抑制gga-miR-31-5p启动活性,当c-jun大量存在时,RA对gga-miR-31-5p的启动活性作用不明显;此外,还发现当添加TSA后,gga-miR-31-5p启动子活性受到显着抑制（P<0.05）,经TSA或TSA和RA联合处理后的ESC/SSC中gga-miR-31-5p表达极显着降低（P<0.01）,仅在ESC中经RA处理后可使gga-miR-31-5p表达上调。以上结果表明,c-jun对gga-miR-31-5p的启动子的抑制作用强于RA对gga-miR-31-5p的启动子激活作用,当组蛋白乙酰化发生时,抑制gga-miR-31-5p的转录。（4）为了探究是否存在lncRNA-gga-miR-31-5p-Stra8 ceRNA机制,本研究结合RA诱导ESC分化过程中的lncRNA测序,对lncRNA-miRNA进行联合分析,筛选与gga-miR-31-5p互作的lncRNA,并构建其过表达载体,将lncRNA、gga-miR-31-5p和Stra83’UTR荧光素酶报告载体共转染DF-1,利用双荧光素酶报告系统检测与Stra8竞争结合gga-miR-31-5p的lncRNA;构建该lncRNA的gga-miR-31-5p结合位点突变载体,进一步确认其竞争关系;同时,针对关键lncRNA设计4个干扰靶点,并构建其干扰载体,通过荧光定量及双荧光素酶活性检测确定最佳干扰活性载体;在体外,分别过表达和干扰lncRNA-IMS,并设立lncRNA与gga-miR-31-5p共转染组,并结合RA诱导,采用流式细胞分析细胞倍型,qRT-PCR检测减数分裂相关基因表达变化;在体内,通过对性成熟的公鸡进行睾丸注射,对精液量和精子密度检测,以及qRT-PCR检测减数分裂相关基因,睾丸组织HE染色,以确定关键lncRNA对精子形成的作用。结果显示成功构建3个lncRNA的过表达载体、lncRNA-IMS的gga-miR-31-5p结合位点突变载体以及lncRNA-IMS的4个干扰载体,双荧光素酶报告检测显示,lncRNA-IMS为关键lncRNA,且与Stra8竞争性结合gga-miR-31-5p,通过qRT-PCR及双荧光素酶活性报告系统确定了最佳干扰载体为shIMS-2;体外实验表明,过表达lncRNA-IMS使单倍体形成效率显着上升（P<0.01）,Stra8等减数分裂相关基因表达量显着下调（P<0.01）,而干扰后则呈现完全相反的结果。而gga-miR-31-5p表达水平均未发生变化;同时过表达lncRNA-IMS和gga-miR-31-5p,无论是细胞倍型或是减数分裂相关基因均未发生改变,仅gga-miR-31-5p表达上调;体内实验表明,过表达LncRNA-IMS使公鸡的精子密度极显着上升（P<0.01）,且Stra8等减数分裂相关基因表达量极显着上调（P<0.01）,HE染色结果显示,过表达LncRNA-IMS后睾丸组织结构完整,各级精细胞排列整密,管腔内精子含量较多;而干扰后则使精液量和精子密度极显着下降（P<0.01）、Stra8等减数分裂相关基因表达极显着下调（P<0.01）,睾丸组织结构松散,各级精细胞较少,管腔较大,腔内精子含量较少;同时过表达LncRNA-IMS和gga-miR-31-5p,精液量和精子密度,减数分裂相关基因均未发生变化（P>0.05）,睾丸组织结构完整,管腔内精子含量较多。表明LncRNA-IMS通过与Stra8竞争结合gga-miR-31-5p,减少gga-miR-31-5p对Stra8的抑制作用,从而促进机体内的精子发生。以上研究显示,在调控减数分裂的过程中组蛋白乙酰化、c-jun和RA共同调控gga-miR-31-5p的表达,从而影响Stra8的表达,同时细胞中所存在的LncRNA-IMS竞争性结合gga-miR-31-5p,继而阻止gga-miR-31-5p对Stra8的抑制作用,促进雄性生殖细胞发生减数分裂,提高精子生成数量。
龙定沛[5]（2015）在《家蚕安全高效转基因技术体系的研究 ——家蚕定点转基因体系的建立及应用》文中认为转基因技术（Transgenic technology）是进行基因功能研究和生物遗传改良的重要工具。从20世纪70年代初被建立以来,经过近半个世纪的发展,转基因技术已经日臻成熟。近年来,转基因技术在功能基因组研究、定向遗传育种、建立人类疾病模型和生物反应器开发等方面都发挥了巨大的作用。但转基因技术自诞生之日起,科学界和社会公众对转基因生物（Genetically modified organisms, GMOs）安全性的担忧就一直存在,对转基因生物是否安全的争论也从未停止。目前,人们对转基因生物安全问题的考虑主要包括转基因操作技术安全问题与转基因产品（Genetically modified products, GMPs）安全问题这两个方面。转基因操作技术安全问题主要体现在转入的外源基因是否会对受体动植物生长产生不良影响以及是否会对生态环境造成破坏。转基因产品安全问题则主要体现在转基因食品（主要指农作物）以及利用转基因生物反应器生产的抗体、疫苗等医药制品或经其他基因工程下游技术生产的生物类制品是否会对人类健康造成潜在危害。因此,如何利用并结合不同的遗传操作手段,解决转基因生物中潜在的安全隐患,进而消除公众对转基因生物安全性的担心,已经成为转基因生物新品种培育、推广和产业化开发应用中必须解决的关键问题。家蚕（Bombyx mori）是人工饲养和驯化的重要经济昆虫,利用家蚕生产丝蛋白已有超过5000年的历史。自2000年第一例利用piggyBac转座子实现转基因家蚕建立的报道以来,该转基因技术已经被广泛应用于家蚕基因功能鉴定、生物反应器开发和创制具有特定基因差异的家蚕材料。但利用目前公认最有效的piggyBac转座子建立的转基因家蚕,仍旧存在由于转座子在基因组整合的随机性和不稳定性,以及筛选标记基因在基因组的保留等缺陷所导致的安全问题。家蚕转基因安全问题主要体现在转基因操作技术安全方面,其主要包含以下几个问题：（1）筛选标记基因和转座子骨架序列等非目的基因序列在转基因家蚕基因组的保留所带来的潜在安全隐患：（2）piggyBac转座子随机整合所引起的位置效应和插入突变,会严重影响外源基因的表达,并可能会对转基因个体的生长造成危害；（3）piggyBac转座子介导外源基因在家蚕基因组整合的不稳定现象,可能会导致转基因在传代过程中的丢失或者通过水平转移逃逸至其他生物物种,从而对生态环境造成破坏。此外,利用piggyBac转座子建立的转基因家蚕还会对基因功能研究造成影响,例如保留在基因组中的筛选标记基因或载体骨架序列可能会影响转基因的正常表达,单纯利用piggyBac转座子也无法实现不同外源基因在基因组相同插入位点功能的比较研究。近年来,转基因家蚕安全问题已经成为了阻碍转基因家蚕实现产业化开发和实际大规模应用的关键问题,但是由于目前业内对家蚕转基因安全性问题的研究还显得较为薄弱,上述问题至今仍未得到有效解决。为了有效克服转基因家蚕可能带来的上述生物安全问题,本论文首先建立了基于FLP/FRT位点特异性重组系统的家蚕转基因定点删除技术,利用该技术可实现对转基因家蚕基因组中筛选标记基因的高效、可诱导的定点删除,从而有效克服筛选标记基因的保留所带来的潜在生物安全隐患；随后建立了基于phiC31整合酶介导的盒式交换（phiC31-RMCE）系统的家蚕转基因定点整合技术,利用该技术可实现不同外源基因在转基因家蚕基因组预先建立靶位点的定点整合,从而有效消除转座子随机整合位置效应对外源基因表达的影响；最后联合位点特异性重组系统及改造的复合型piggyBac转座载体,开发了一项通用且有效的转基因在家蚕基因组稳定整合、表达以及可精确替换的策略,并利用该策略成功地建立了一种稳定、可置换型高效转基因家蚕丝腺表达系统。论文获得的主要研究结果如下：1.家蚕转基因定点删除技术的建立通过胚胎显微注射,首先筛选并建立了1个FLP/FRT系统转基因靶品系（Transgenic target strain, TTS）。分子鉴定结果显示,TTS家蚕基因组中含有单拷贝的被FRT位点锚定的A3-EGFP-SV40表达框。通过胚胎显微注射FLP基因mRNA或重组酶瞬时表达载体pSLA3-FLP的方式引入FLP重组酶的表达,在TTS家蚕后代蛾圈中成功筛选到了A3-EGFP-SV40表达框被定点删除的位点特异性重组品系（Site-specific recombination strain, SSRS）家蚕个体。统计结果显示,通过注射mRNA获得含有SSRS家蚕的阳性蛾圈的概率（13.3%）要明显高于注射pSLA3-FLP获得阳性蛾圈的概率（2.38%）。随后同样通过胚胎显微注射,分别筛选并建立了1个利用家蚕肌动蛋白Actin3基因启动子调控FLP重组酶表达（A3-FLP）的重组酶表达辅助品系（H-A-1）和1个利用果蝇hsp70基因启动子调控FLP重组酶表达（Hsp70-FLP）的重组酶表达辅助品系（H-H-1）,期望通过将TTS家蚕与H-A-1家蚕杂交的方式,在TTS&H-A-1双转基因家蚕体内引入FLP重组酶的表达,以实现A3-EGFP-SV40表达框住TTS&H-A-1家蚕后代的高效删除；期望通过将TTS家蚕与H-H-1家蚕杂交并进行42℃热激处理（Heat shock treatment, HST）的方式,在TTS&H-H-1双转基因家蚕体内引入FLP重组酶的表达,以实现A3-EGFP-SV40表达框在TTS&H-H-1家蚕后代的可诱导删除。在进行杂交实验之前,首先检查了FLP重组酶在H-A-1和H-H-1家蚕体内的表达情况。RT-PCR和qRT-PCR结果显示,FLP重组酶在H-A-1家蚕的脂肪体、中肠、丝腺、精巢、卵巢和胚胎等组织中均能高效表达；而通过42℃热激处理能够使FLP重组酶在H-H-1家蚕上述各组织中的表达水平显着上调,其中在精巢、卵巢和胚胎中的表达水平上调了58.2%-72.3%。统计分析结果显示,通过有性杂交引入FLP重组酶的方式,在TTS&H-A-1家蚕后代蛾圈中筛选获得含有SSRS家蚕的阳性蛾圈的概率达到了97.01%-100%；经热激处理的TTS&H-H-1家蚕后代蛾圈中的阳性蛾圈概率（32.14%-36.67%）要显着高于未经热激处理的TTS&H-H-1家蚕后代蛾圈中的阳性蛾圈概率（2.63%-6.67%）。随后,分别提取TTS家蚕和SSRS家蚕的基因组进行分子鉴定,鉴定结果显示位点特异性重组事件精确地发生于TTS家蚕基因组2个FRT位点之间,重组反应没有引起任何的突变或染色体结构变异。利用上述研究的策略和方法,可实现对转基因家蚕筛选标记基因的高效、可诱导的定点删除,从而有效地消除筛选标记基因在转基因家蚕基因组的保留对基因功能研究带来的影响及潜在的生物安全隐患。2.家蚕转基因定点整合技术的建立通过胚胎显微注射,首先分别筛选并建立了1个基因组中含有attPlattP位点对的G1代phiC31/att系统转基因靶品系TTS1-P和1个基因组中含有attBlattB位点对的G1代phiC31/att系统转基因靶品系TTS1-B。分子鉴定结果显示,TTS1-P和TTS1-B家蚕基因组中分别含有单拷贝的attPlattP和attBlattB位点对,插入位点分别定位于第20号（常染色体）和第1号（Z染色体）染色体。通过先回交再自交的制种方式,将TTS1-P和TTS1-B家蚕连续培养7代,最终获得了纯合的G8代TTS8-P雄蛾与雌蛾（基因型分别为+A+Ad和+A+A（?）,字母“A”表示转基因,下同）,以及纯合的G8代TTS8-B雄蛾（ZAZA8）与杂合的G8代TTS8-B雌蛾(ZAW（?）。通过显微注射将phiC31整合酶mRNA或整合酶瞬时表达载体pSLA3-Int以及相应的含有被attB位点或attP位点锚定的3×P3-EGFP表达框的供体质粒（pSl{attB1-3×p3-EGFP-SV40-attB2}或pSL{attp1-3×P3-EGFP-SV40-attp2}）导入TTS9-P或TTS9-B家蚕胚胎,在TTSIO蛾圈中筛选获得含有位点特异性整合品系（Site-specific integration strain, SSIS）家蚕（SSIS1-P或SSIS1-B）的阳性蛾圈的概率为3.84%-7.01%。分子鉴定结果显示,3xP3-EGFP表达框在筛选到的所有SSIS1-P和SSIS1-B家蚕中,均是通过RMCE反应整合至基因组靶位点。统计结果显示,转基因蚕染色体上的attPlattP靶位点对和供体质粒上的attBlattB位点对之间的RMCE效率,比转基因蚕染色体上的attBlattB靶位点对和供体质粒上的attPlattP位点对之间的RMCE效率高。荧光筛选和分子检测结果证实,位点特异性整合的转基因在SSIS家蚕后代基因组中能够稳定的遗传和表达。利用本研究建立的phiC31-RMCE系统可介导外源基因在转基因家蚕基因组预先建立的靶位点的定点整合,从而有效克服转座子介导外源基因随机整合位置效应对转基因表达及基因功能研究带来的影响。3. 一种稳定、可置换的安全高效家蚕转基因操作技术的建立构建含有4个转座子臂序列（L1、L2、R1和R2）、转座酶基因表达框（Hsp70-PBase-SV40）、筛选标记基因（3×P3-DsRed和3×P3-EGFP）及被attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框的复合型piggyBac转座载体PB-TP。通过显微注射将PB-TP与转座酶表达辅助载体pHA3PIG共同导入非滞育的871品系GO代家蚕受精卵,筛选并建立了4个同时含有3种不同荧光表型（3×P3-DsRed,用R表示；FibH-EGFP,用g表示；3×P3-EGFP,用G表示）的G1代转基因品系TS1-RgG1-TS1-RgG4。分子鉴定结果显示,TS1-RgG1和TS1-RgG2家蚕基因组中均含有单拷贝的4个完整转座子臂结构及被attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框序列,其中TS1-RgG2家蚕茧丝中的外源蛋白表达量最高,纯EGFP蛋白占茧丝总蛋白含量（w／w）的16%以上。将TS1-RgG2蚕蛾与871蚕蛾回交产生的G2代蚕卵分为3组,1“组正常饲养用作对照,剩下2组分别在胚胎发育阶段（2#组）和幼虫发育阶段（3#组）进行42℃热激处理。从成活的G2代蚕蛾中筛选同时含有3种荧光表型的TS2-RgG2转基因蚕蛾,将其与871回交产生G3代蚕卵,在G3代幼虫中筛选仅含有FibH-EGFP荧光表型（g表型）的TS3-g2家蚕个体,并统计含有TS3-g2家蚕的阳性蛾圈的概率。统计结果显示,从2#组和3#组中筛选到含有TS3-g2家蚕的阳性蛾圈的概率分别为16.22%（6／37）和2.22%（1／45）,而在未经热激处理的1“组中并没有筛选到含有TS3-g2 家蚕的阳性蛾圈。分子鉴定结果显示,TS3-g2家蚕基因组中保留了完整的被attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框序列,而不再含有任何的转座子元件序列。piggyBac转座子的再转座没有引起切除的TTAA位点或attP位点附近的DNA序列发生任何突变或染色体结构变异。为了鉴定创制不含有转座元件的转基因家蚕的最优热激处理条件,将1头含有FibH-EGFP和3×P3-EGFP荧光表型的杂合TS3-gG2雄蛾（基因组中含有Hsp70-PBase-SV40表达框）与3头871雌蛾回交产生3个不同的G4代蛾圈,随后将每个蛾罔中的家蚕分成3组,按照与之前研究相同的条件进行热激处理,并将各组中成活的TS4-gG2蚕蛾与871蚕蛾回交产生G5代蛾罔,最后筛选并统计G5代蛾圈中含有TS5-g2家蚕（仅具有g表型）的阳性蛾罔的概率。统计分析结果显示,在胚胎发育阶段进行42℃热激处理的实验组中筛选获得含有TS5-g2家蚕的阳性蛾圈的概率最高,达到了70%-80%。该结果证实,在转基因家蚕胚胎发育阶段,利用42℃进行持续且反复多次的热激处理,是实现转座子序列在其后代家蚕基因组中删除的最有效方法。分别筛选杂合的TS4-g2、纯合的TS4-g2以及杂合的TS4-gG2蚕蛾与871蚕蛾回交产生G5代蛾圈,鉴定并统计各个G5代蛾圈中具有g表型的TS5家蚕的比例。统计分析结果显示,杂合的TS4-g2蚕蛾与871蚕蛾回交产生的各个G5代蛾圈中含有g表型的TS5家蚕的比例几乎都为50%,与理论值（50%）没有显着性差异；纯合的TS4-g2蚕蛾与871蚕蛾回交产生的各个G5代蛾圈中含有g表型的TS5家蚕的比例均为100%,与理论值（100%）完全相符；杂合的TS4-gG2蚕蛾与871蚕蛾回交产生的各个G5代蛾圈中含有g表型的TS5家蚕的比例几乎都为50%,同样与理论值（50%）没有显着性差异。此外,利用荧光显微镜观察到EGFP蛋白在TS7-g2家蚕丝腺和茧丝中均能稳定且特异性地高效表达。基因组PCR鉴定结果显示,FibH-EGFP表达框在TS3-g2家蚕后代基因组的整合和遗传具有稳定性。上述所有结果共同证实,无论转基因家蚕体内是否含有转座酶（PBase）, FibH-EGFP表达框均能在TS3家蚕后代基因组中稳定遗传,而且EGFP蛋白在TS3家蚕后代体内及茧丝中均能稳定、均一和高效地表达。本研究首先利用复合型piggyBac转座系统筛选并建立能够高效表达外源蛋白的G1代转基因家蚕系,随后通过热激处理的方式诱导PBase在G2代转基因家蚕体内的表达,最终在G3代家蚕中成功筛选到了基因组中仅保留被attP位点锚定的目的基因表达框序列而不含有任何转座子元件序列的转基因个体。利用上述方法不但能够有效消除piggyBac转座子介导外源基因在家蚕基因组整合的不稳定现象和筛选标记基因、转座子骨架序列保留所带来的生物安全隐患,而且还能够利用位于目的基因表达框两端的2个同向排列的attP位点,通过phiC31-RMCE反应实现不同的待研究外源基因在相同整合位点的定点整合,从而有效克服随机整合位置效应对转基因表达和基因功能研究的影响。此外,本研究建立稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的策略,也同样适用于其他种类鳞翅目昆虫,可应用于提高转基因昆虫生态安全的生物防控研究领域。
邹云龙[6]（2017）在《调控区定点整合骨骼肌特异增强子上调Igf1基因表达的研究》文中认为制作转基因动物的传统的方法是通过随机插入的方式将表达单元整合入基因组中。尽管这种方式简便、直接,但是存在着固有的缺陷,表达单元的拷贝数和整合位点都无法准确地控制,容易造成外源基因表达的不稳定及影响内源基因的表达。为了克服随机插入的局限,近年来科学家们广泛采用定点插入的方式,通过同源重组的方法,使外源基因以单拷贝形式整合于基因组中特定的位点。然而,对于基因组序列非常长的基因而言,实现其基因组序列的定点插入存在很大的难度。虽然可以选择用cDNA替代其基因组DNA序列,进行打靶载体的构建,但与基因组DNA序列相比,cDNA序列可能缺少某些存在于内含子中的、尚未发现的、却发挥着重要功能的调控元件,因此大多数情况下,cDNA的使用并不利于目的基因的高水平表达。Igf1是调控肌肉生长和发育的关键基因,肌肉组织特异地过表达IGF1能够促进肌肉肥大。Igf1的基因组DNA序列大于70 Kb,目前尚无利用Igf1基因组DNA序列实现其过表达的报道。现有的Igf1转基因小鼠模型多采用随机整合编码IGF1前肽及成熟肽的cDNA的方式。本研究将Igf1基因作为一个例子,来验证能否通过在其转录起始位点上游定点整合增强子,上调IGF1的表达水平,从而获得预期的表型。在本研究中,我首先利用荧光素酶报告系统,评估了候选的MLC（Myosin light chain）增强子、MCK（Muscle creatine kinase）增强子对于Igf1启动子的增强效果。在分化的肌管中,与阴性对照载体相比,含有MCK增强子的荧光素酶载体的表达活性仅有少量提高（MCK增强子以3’-5’方向连入时,P<0.05;MCK增强子以5’-3’方向连入时,P>0.05）,而含有MLC增强子的荧光素酶报告载体的活性为阴性对照的12-20倍（MLC增强子以3’-5’方向连入时,P<0.01;MLC增强子以5’-3’方向连入时,P<0.05）。因此,本研究选择了 MLC增强子用于后续实验。为了选取合适的增强子插入位点,尽量减少对Igf1转录起始位点上游内源的重要调控元件的破坏,本研究通过phastCons分值评估了Igf1转录起始位点上游100 Kb的区域的保守性,并选取了具有最低phastCons平均值的三个区域,或者说在进化上极不保守的三个区域,以此避开在进化上具有保守性功能的顺式调控元件。我将这三个候选位点命名为site1、site2、site3,它们分别距离转录起始位点约1.5 Kb、6 Kb、20 Kb。为了客观地评估各个候选插入位点的有效性,本研究利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术,筛选得到了三个候选插入位点分别整合MLC增强子序列的C2C12细胞单克隆,并检测了各系列的单克隆分化的肌管中的Igf1的表达量。结果显示,site1、site3系列单克隆分化的肌管中Igf1 mRNA的表达水平均发生下调,site2系列单克隆分化的肌管中无论Igf1 mRNA还是IGF1蛋白的表达水平均显着上调。由此可见,site2位点能够支持整合于此的MLC增强子发挥增强Igf1启动子的活性的作用,因此本研究选取了 site2位点作为增强子的插入位点用于制备基因修饰小鼠。通过将针对site2位点的sgRNA,Cas9 mRNA及同源重组载体共注射小鼠的受精卵,制作了site2位点整合MLC增强子的基因修饰小鼠。获得的基因定点修饰小鼠生长发育正常。与同性别同窝野生型小鼠相比,无论基因修饰的公鼠还是母鼠肌肉中的Igf1的mRNA（P<0.0001）及蛋白水平均发生显着上调（P<0.000001）。但值得注意的是,基因修饰母鼠肌肉中IGFI蛋白的水平为野生型的12.4倍,而基因修饰公鼠肌肉中IGF1蛋白的水平为野生型的4.6倍。基因修饰母鼠表现出明显的肌肉肥大的表型,基因修饰公鼠也表现出肌肉重增加及肌肉肥大的趋势,但在统计学上不显着（P>0.05）。与同窝野生型对照相比,基因修饰小鼠的血液中的IGF1水平未发生显着变化（P>0.05）,心脏未出现肥大及病理的表型,胫骨长度未发生显着变化（P>0.05）。综上所述,本研究证明了通过在非编码区定点整合增强子,上调目的基因表达,并获得具有预期表型的动物的可行性。同时,本研究为未来在家畜大动物中利用类似方法改良相关生产性状提供了新策略。
王伟[7]（2019）在《let-7 microRNA调控家蚕丝腺发育的分子机制》文中研究指明家蚕是由野桑蚕驯化而来的重要的经济昆虫,通过对丝蛋白基因表达调控、丝蛋白组装机制、丝腺生长发育机理的研究,有望在提高蚕丝产量、获得特殊性能蚕丝纤维、拓展丝腺生物反应器应用等方面取得突破。let-7是一个极其保守的microRNA（miRNA）,在不同物种中都以let-7簇（let-7 cluster,let-7C）的形式存在,在时序性发育、肿瘤的发生与发展、细胞多能性维持等方面发挥重要的转录后调控功能,但let-7在家蚕丝腺中的功能目前尚不清楚。本研究利用基因编辑手段,在丝腺的不同部位实现let-7和let-7C敲除,验证了它们对中部丝腺和后部丝腺生长的影响;利用转录组测序探索了let-7调控丝腺生长的分子机理;筛选得到let-7调控丝腺生长的靶基因,并对靶基因功能进行了研究。研究结果如下:1.家蚕丝腺miRNA研究方法探索为研究丝腺中miRNA的功能,我们试用不同方法来改变miRNA在丝腺中的表达量,以找到最适合丝腺miRNA功能研究的方法。首先以丝腺特异性表达的miR-274为研究对象,合成miR-274 mimic和miR-274 antagomir,注射到家蚕五龄幼虫体内,但它们并不能进入丝腺细胞发挥作用;设计、合成miR-274 sponge序列,构建转基因载体,获得miR-274 sponge转基因家蚕个体,发现miR-274 sponge能特异性的下调丝腺中miR-274,效率约20%;扩增miR-274前体序列,构建转基因过表达载体,分别在中部丝腺和后部丝腺过表达miR-274;设计、合成用于miR-274敲除的一对gRNA,构建双gRNA载体,获得双gRNA转基因表达品系,与后部丝腺Cas9表达品系杂交,得到miR-274后部丝腺敲除品系。检测结果表明miR-274所在基因组序列表现出不同形式的碱基缺失,miR-274在后部丝腺表达量下调了54%左右。这些结果表明,miRNA转基因过表达是家蚕丝腺miRNA获得性功能研究首先方法;组织特异性的miRNA敲除比miRNA sponge是更有效的缺失性功能研究方法。2.let-7C miRNAs时空表达及基本功能分析通过qRT-PCR检测let-7C miRNAs（let-7-5p、let-7-3p、miR-100和miR-2795）在家蚕不同发育阶段和五龄第3天不同组织中的表达情况,发现let-7C miRNAs在丝腺中低量表达。在五龄幼虫丝腺生长过程中,let-7C miRNAs在五龄前期低量表达,随着丝腺的生长,表达量逐渐升高;家蚕完成吐丝后,丝腺细胞进入程序性死亡过程,let-7C miRNAs表达量开始下降,这种表达模式暗示let-7C miRNAs可能与丝腺细胞核内复制有关。化学合成let-7C miRNAs模拟物（mimic）和拮抗剂（antagomir）,在家蚕BmE和BmNs细胞系中上调或下调let-7C miRNAs的表达,初步探索了它们在家蚕细胞中的功能。在BmE细胞中,上调let-7-5p对细胞增殖有明显的抑制作用,上调let-7-3p、miR-100和miR-2795不影响细胞增殖;在BmNs细胞中,上调let-7-5p、let-7-3p、miR-100和miR-2795都能抑制细胞增殖,下调则促进细胞增殖。细胞增殖结果表明,let-7C miRNAs在家蚕细胞增殖过程中可能发挥协同调控作用。3.敲除let-7和let-7C促进中部丝腺生长为了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除丝腺中的let-7和let-7C,我们成构建了家蚕个体双gRNA转基因表达品系:let-7-2gRNA和let-7C-2gRNA,将它们分别与中部丝腺Cas9表达品系（MSG-Cas9）进行杂交,通过荧光筛选、敲除位点测序鉴定和表达量检测获得let-7中部丝腺敲除个体△let-7-MSG和let-7C中部丝腺敲除个体△let-7C-MSG。与对照相比,△let-7-MSG中部丝腺后区增粗、变长,表面平滑;△let-7C-MSG中部丝腺中区和后区与对照相比均有增粗,表面呈串珠状。上述结果表明中部丝腺敲除let-7和let-7C均能显着促进五龄期幼虫中部丝腺的生长,但两者之间存在明显的表型差异。△let-7-MSG和△let-7C-MSG在五龄3天开始出现异常表型,五龄前3天是丝腺细胞核内复制增加、细胞体积变大的关键时期。△let-7-MSG和△let-7C-MSG中部丝腺后区DNA总量分别增加170%和120%,为DNA大量合成提供能量的ATP含量也升高了8-10倍,这表明敲除品系丝腺细胞核内复制显着增强。家蚕幼虫完成吐丝之后,预蛹期家蚕丝腺腔中的丝蛋白全部被组装成丝纤维,而△let-7-MSG和△let-7C-MSG中部丝腺后部则残留大量丝蛋白,导致两种突变体家蚕茧重和茧沉率都显着下降,因此△let-7-MSG和△let-7C-MSG突变体家蚕可以作为研究蚕丝纤维组装的新品种使用。4.let-7作为关键负调控因子参与调控后部丝腺生长为了检测let-7和let-7C敲除是否能促进后部丝腺生长并提高家蚕产丝量,将let-7-2gRNA和let-7C-2gRNA品系与后部丝腺Cas9表达品系（PSG-Cas9）杂交;基于胚胎眼色筛选,获得let-7后部丝腺敲除个体△let-7-PSG和let-7C后部丝腺敲除个体△let-7C-PSG。解剖五龄幼虫,观察表型,△let-7-PSG后部丝腺明显增粗、变长,表面平滑;上簇期的后部丝腺自然悬垂长度增加80%,重量增加150%,茧壳重增加12%。△let-7C-PSG后部丝腺明显增粗、变长,表面呈串珠状,无规则卷曲增加;上簇期△let-7C-PSG后部丝腺长度增加60%,重量增加150%,茧壳重增加12%。let-7和let-7C敲除都能促进后部丝腺生长并提高家蚕产丝量,但两者表型有差异,与中部丝腺表型差异类似。对后部丝腺细胞进行phalloidin及DAPI染色,发现△let-7-PSG和△let-7C-PSG后部丝腺细胞变大、核内复制增加,而△let-7C-PSG部分后部丝腺细胞萎缩发育是造成let-7和let-7C敲除表型差异的主要原因。分别构建后部丝腺let-7和miR-1002795的转基因过表达品系:let-7-OE-PSG和miR-1002795-OE-PSG。于G1代五龄期解剖观察,发现let-7过表达强烈抑制后部丝腺的生长,后部丝腺细胞萎缩、排列无序;let-7-OE-PSG后部丝腺DNA总量降低75%,茧壳重量降低50%,表明let-7过表达抑制后部丝腺细胞核内复制并抑制丝素蛋白的合成。而miR-100和miR-2795同时过表达并不影响后部丝腺生长。由此可见,在let-7C中只有let-7才是调控丝腺生长的关键miRNA。由于后部丝腺生长受阻,造成let-7-OE-PSG茧壳变薄、易碎,类似于Nd-s突变体的丝胶茧。经过统计发现let-7-OE-PSG蚕丝中丝素含量与对照相比降低55%,miR-1002795-OE-PSG也降低10%,表明miR-100和miR-2795也参与调控丝素蛋白的合成与分泌,但let-7是丝腺生长的关键负调控因子。5.转录组测序分析let-7调控丝腺生长的分子机制为了揭示let-7调控丝腺生长和功能的分子机制,我们对五龄3天△let-7-MSG中部丝腺和△let-7-PSG后部丝腺共12个样品进行转录组测序分析,在中部丝腺筛选到184个上调表达差异基因和99个下调表达差异基因,在后部丝腺筛选到271个上调表达差异基因和277个下调表达差异基因;在中、后部丝腺同时发生表达变化的基因共有36个。差异基因GO分类分析显示,中部丝腺差异基因主要在氧化还原反应和脂肪酸生物合成途径中富集,后部丝腺差异表达基因在新陈代谢和糖类转运过程中富集。KEGG pathway富集分析表明,中部丝腺差异表达基因在新陈代谢、过氧化物酶脂肪酸代谢和三羧酸循环等多个通路被富集,而后部丝腺差异表达基因只在叶酸“一碳”代谢途径显着富集。中部丝腺和后部丝腺差异表达基因被富集到完全不同的通路中,表明let-7调控中部丝腺和后部丝腺生长的分子机制不同。6.let-7调控丝腺生长的靶基因鉴定提取家蚕转录本的3’UTR,利用RNAhybrid、miRanda和TargetScan对let-7的靶基因进行预测,共有504个潜在靶基因同时被三种软件预测。与△let-7-MSG和△let-7-PSG转录组测序筛选到的455个上调差异表达基因求交集,筛选出22个靶基因,其中10个基因在△let-7-MSG中部丝腺上调表达,12个基因在△let-7-PSG后部丝腺上调表达。利用qRT-PCR检测let-7表型相关靶基因在丝腺生长中的表达模式,筛选出9个与let-7表达呈相反趋势的基因。用3’RACE扩增了其中6个基因的3’UTR,并将它们克隆到psiCHECKTM-2双荧光素酶报告基因载体上,将融合靶基因3’UTR的重组载体与let-7 mimic共转染至HEK-293FT细胞中,检测结果显示,丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase,PC）、蜕皮激素22激酶（ecdysteroid22-kinase,EcK）和卵母细胞锌指蛋白（oocyte zinc finger protein XLCOF6,XLCOF6）三个基因的荧光素酶活性显着降低,表明PC、EcK和XLCOF6基因的3’UTR上具有let-7的靶位点,它们是let-7的直接靶基因。PC和EcK在中部丝腺上调表达,XLCOF6在后部丝腺上调表达。经靶位点突变实验证实,let-7在PC 3’UTR上存在两个靶位点。通过双荧光素酶体外验证实验证明果蝇的PC基因也let-7靶基因。7.PC在丝腺生长中的功能研究PC是糖代谢通路中的重要基因,丙酮酸羧化酶是糖异生途径的限速酶。为了证实PC是let-7调控丝腺生长的靶基因,我们构建了中部丝腺和后部丝腺PC转基因过表达载体,获得了中部丝腺的PC过表达品系PC-OE-MSG。解剖PC-OE-MSG品系的上簇期幼虫丝腺,发现中部丝腺中区长度增加了25%,DNA总量增加了77%。PC过表达促进了中部丝腺生长和中部丝腺细胞核内复制,与let-7敲除后的表型一致,证明PC是let-7调控中部丝腺生长的靶基因。将PC的gRNA转基因品系与中部丝腺和后部丝腺Cas9表达品系分别杂交,筛选得到PC中部丝腺敲除品系△PC-MSG和PC后部丝腺敲除品系△PC-PSG。测序结果表明,在PC mRNA第二个外显子上存在不同形式的碱基缺失,范围从4 bp到64 bp,PC成功被敲除,但PC的敲除并不影响中部丝腺和后部丝腺的生长,这可能与细胞内的补救途径有关。综上所述,本论文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术、miRNA转基因过表达和转录组测序等手段,系统的研究了let-7和let-7C在中部丝腺和后部丝腺中的功能。证明let-7是let-7C中调控丝腺生长的主要miRNA,敲除let-7能促进丝腺的生长并提高家蚕产丝量。PC、EcK和XLCOF6是let-7的直接靶基因,PC是let-7调控中部丝腺生长的靶基因。不同的gRNA转基因表达品系、let-7和let-7C敲除品系、let-7过表达品系等,为研究丝腺生长发育、丝蛋白基因表达和丝纤维组装提供了丰富的家蚕素材。
徐钤[8]（1983）在《染色质的结构和功能—SV40基因组的研究》文中提出 所谓“活性”染色质是指含有正在转录的基因的染色质。活性染色质具有“开放”的构象,而“非活性染色质”则含有不表达的基因,具有比较稳定的构象。真核细胞中活性基因的数量约仅占基因总数的10～20%。 SV40是属于乳多泡病毒（papovavirus）的一种DNA肿瘤病毒。在受溶细胞性感染（lytic infection）的细胞中,SV40的DNA是和宿主细胞的组蛋白结合在一起的,形成串
徐焕洲[9]（2017）在《人细小病毒B19类染色质结构调控基因组复制及RNA加工》文中认为人类细小病毒B19（B19V）属于细小病毒科的嗜红细胞属,基因组为单链DNA,全长5.6kb。B19V和人博卡病毒是现今可以感染人类的仅有的两种细小病毒科的病毒。B19V感染主要引起传染性红斑、急性再生障碍性贫血、关节炎等,感染孕妇后可导致胎儿水肿,流产或者死胎。B19V基因组内有两个polyA信号,位于3’端的称为（pA）d,位于第二个内含子内的称为（pA）p。（pA）p直接抑制病毒转录出全长pre-mRNA,在转录后水平与第二个内含子的剪切相互竞争抑制病毒结构蛋白mRNA的生成,而病毒的复制利于启动子通读过（pA）p位点,使用（pA）d位点。病毒基因组的复制和第二个内含子的剪切都影响（pA）p的使用,但是复制如何影响（pA）p的使用还不清楚。细小病毒MVM和腺相关病毒AAV感染敏感细胞后,可以和组蛋白结合,形成类染色质结构,但是类染色质结构有哪些功能还没有相关报道。因此,本研究主要目的是探讨B19V基因组是否可以在细胞内形成类染色质结构,研究B19V基因组甲基化修饰以及类染色质结构对基因复制和RNA加工的影响,进一步揭示基因组复制影响（pA）p使用的分子机制。为了研究B19V基因组DNA是否形成类染色质结构,转染B19V DNA到HEK293T细胞内,分别在12、24、36和48小时提取细胞核,微球菌核酸酶消化后用苯酚-氯仿抽提,同时在这四个时间段提取Hirt DNA,Southern blot检测。结果证实B19V基因组DNA可以在细胞内形成类染色质结构,且类染色质结构的形成早于复制。为了研究病毒染色质的修饰是否影响病毒的复制、转录或转录后加工,我们应用甲基转移酶抑制剂5-Aza-2’-deoxycytidine（DAC）处理转染B19V基因组DNA后的HEK293T细胞,48小时后提取小分子量DNA（Hirt DNA）,利用DpnI消化,用甲基化检测试剂盒处理后进行PCR扩增反应,通过测序我们发现,DAC处理后基因组上特定位点的甲基化修饰被抑制,表明在B19V基因组内存在甲基化修饰位点。用终浓度为20μM的DAC处理转染后的293T细胞,48h后分别提取细胞核、Hirt DNA和总RNA,并用Southern blot和RNA酶保护实验进行检测。结果发现,与DMSO处理组和未处理组比较,DAC明显抑制B19V类染色质结构的形成及基因组的复制。RPA实验证实DAC抑制第二个内含子的剪切,促进（pA）p的使用。为了研究B19V基因组复制影响（pA）p使用的具体机制,分别利用IRES2-eGFP和pBluescript KS II载体构建了基因组5’和3’端一半基因的复制型和非复制型克隆,并在此基础上获得了敲除D1和D2剪切位点的克隆,转染HEK293T细胞,48小时后提取总RNA,RNA酶保护实验进行检测。结果发现B19V基因组的复制主要通过影响第二个内含子的剪切影响（pA）p的使用。本研究证实B19V基因组上存在甲基化修饰,DAC可以使基因组去甲基化,抑制类染色质结构的形成和复制,导致基因组第二个内含子的剪切被抑制,进而影响（pA）p的使用。本研究首次报道了B19V基因组甲基化修饰和类染色质结构影响基因组的复制和RNA转录后加工,揭示了B19V基因组中央poly位点选择性使用的分子调控机制,为B19V的防治提供了理论依据。
刘倩,李春燕[10]（2020）在《增强子的鉴定及其在肿瘤研究中的应用》文中提出增强子是一类增强靶基因转录活性的DNA顺式作用元件。但是增强子与靶基因的方向和距离不确定,大大增加了研究增强子调控的靶基因及其作用机制的困难。已有大量研究显示,增强子的突变或功能异常与疾病发生发展相关;仅有少量研究报道增强子通过促进靶基因的表达,引发癌症或产生抗药性。目前与癌症发生发展和在癌症治疗过程中抗药性产生相关的增强子尚未得到充分鉴定,这些增强子的调控机制也未得到充分解析。本文对目前可在全基因组水平上预测和鉴定增强子以及解析增强子调控机制的方法进行总结和对比,并对近几年增强子在肿瘤诊断、治疗和发生发展机制中的研究进展进行综述。期望本文为筛选与癌症发生发展相关的增强子和解析这些增强子的调控机制提供参考,为提高癌症的诊断和制定癌症的治疗策略提供新的视角。
二、染色质的结构和功能—SV40基因组的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、染色质的结构和功能—SV40基因组的研究（论文提纲范文）
（1）CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.1 基因组编辑技术的发展 |
| 1.2 基因组编辑相关的靶向核酸酶的发展 |
| 1.3 CRISPR作为基因组编辑技术的兴起 |
| 1.4 不同的CRISPR系统及其在基因组编辑中的应用 |
| 1.5 CRISPR-Cas9 系统应用的再开发 |
| 1.6 CRISPR-Cas9 系统功能的开发应用 |
| 1.6.1 第二代CRISPR基因编辑工具的发展 |
| 1.6.2 CRISPR介导的基因表达调控 |
| 1.6.3 CRISPR介导的表观基因组编辑的发展与应用 |
| 1.6.4 CRISPR介导的活细胞染色质成像技术的发展 |
| 1.6.5 大规模遗传和表观遗传学的CRISPR筛选技术发展 |
| 1.7 CRISPR新技术未来发展方向 |
| 1.8 本课题的目的、研究意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 利用CasRx系统和共表达Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52 蛋白在小鼠细胞中提高同源重组效率的相关研究 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.2 主要实验材料、器材及仪器 |
| 2.2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2.1.1 细胞实验 |
| 2.2.1.2 分子克隆 |
| 2.2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 相关载体的构建 |
| 2.3.2 相关g RNA靶序列的设计和载体的构建 |
| 2.3.3 构建小鼠N2A细胞Rosa26EGFP+稳转细胞系 |
| 2.3.4 应用CasRX系统敲低瞬转的红色荧光 |
| 2.3.5 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因 |
| 2.3.6 应用CasRX系统抑制小鼠内源的Lig4 基因提高同源重组效率 |
| 2.3.7 通过共转ORF52 蛋白提高同源重组效率 |
| 2.3.8 通过共转ORF52 蛋白提高小鼠内源基因的同源重组效率 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 载体的构建 |
| 2.4.2 gRNA靶序列的设计和载体的构建 |
| 2.4.3 小鼠N2A细胞Rosa26EGFP+稳转细胞系产生及鉴定 |
| 2.4.4 应用CasRX系统敲低瞬转的红色荧光 |
| 2.4.5 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因 |
| 2.4.6 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因提高同源重组效率 |
| 2.4.7 通过共转Cas9与ORF52 蛋白提高同源重组效率 |
| 2.4.8 通过共转Cas9与ORF52 蛋白提高小鼠内源基因的同源重组效率 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第二章 应用BE3碱基编辑系统对小鼠体内进行多基因同时敲除的研究 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.2.1 胚胎培养实验 |
| 3.1.2.2 分子克隆试剂 |
| 3.1.2.3 主要仪器设备 |
| 3.1.2.4 主要使用抗体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 single-guide RNAs(sgRNAs)的设计 |
| 3.2.2 体外转录PCR模板准备 |
| 3.2.3 sgRNA体外转录与纯化 |
| 3.2.4 BE3 的体外转录与纯化 |
| 3.2.5 sgRNA优化,小鼠内耳/尾基因分型,靶向深度测序和TA克隆测序 |
| 3.2.6 样品处理,组织学和免疫荧光 |
| 3.2.7 全基因组测序和脱靶分析 |
| 3.2.8 听觉脑干诱发电位(ABR)测量 |
| 3.2.9 制备外毛细胞膜片钳的方法 |
| 3.2.10 内毛细胞膜片钳和电容测量 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 使用CRISPR-stop对小鼠中的Tyr基因进行碱基编辑 |
| 3.3.2 小鼠耳蜗中CRISPR-STOP的原理验证测试 |
| 3.3.3 CRISPR-STOP可有效产生不同程度耳聋的小鼠模型 |
| 3.3.4 Prestin和 otoferlin基因敲除小鼠也具有听力缺陷的电生理学特性 |
| 3.3.5 CRISPR-STOP技术可同时敲除多基因 |
| 3.3.6 在v Glut3,otoferlin和 prestin三敲小鼠中未观察到脱靶效应 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第三章 碱基编辑系统与传统CRISPR相关技术编辑效率的比较及BE3系统对人类3PN胚胎的碱基编辑效率的研究 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.2.1 胚胎培养实验 |
| 4.1.2.2 分子克隆试剂 |
| 4.1.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 single-guide RNAs(sgRNAs)的设计 |
| 4.2.2 体外转录PCR模板准备 |
| 4.2.3 sgRNA体外转录与纯化 |
| 4.2.4 Cas9、ABE7.10和BE3 or SaKKH-Be3 的体外转录与纯化 |
| 4.2.5 人类胚胎的收集 |
| 4.2.6 胚胎注射 |
| 4.2.7 胚胎鉴定与靶位点深度测序 |
| 4.2.8 单个卵裂球测序分析 |
| 4.2.9 全基因组测序和脱靶分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 与CRISPR-Cas9 系统相比,使用ABE在小鼠胚胎中的Tyr基因中进行更有效的碱基编辑 |
| 4.3.2 在小鼠胚胎中BE3 系统比CRISPR-Cas9 系统进行更有效的基因敲除 |
| 4.3.3 人类3PN受精卵中的高效碱基编辑 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）Tc1/mariner转座子挖掘、高活性成员鉴定及其在增强子捕获中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 转座子 |
| 1.1.1 转座子的分类 |
| 1.1.2 DNA转座子的分类 |
| 1.1.3 Tc1/mariner转座子超家族的分类和进化 |
| 1.1.4 转座子的开发应用 |
| 1.2 目前脊椎动物中应用最广泛的转座子 |
| 1.2.1 SB转座子 |
| 1.2.2 PB转座子 |
| 1.2.3 Tol2转座子 |
| 1.3 转座子作为高效增强子捕获基因捕获工具 |
| 1.3.1 增强子的概念 |
| 1.3.2 增强子注释的方法 |
| 1.3.3 转座子作为脊椎动物ET的工具 |
| 1.3.4 三种捕获载体(增强子捕获载体,启动子捕获载体和基因捕获载体) |
| 1.4 本论文研究的目的及意义 |
| 第2章 Tc1/mariner超家族中DD41D家族Visitor(VS)的进化分析 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 数据挖掘 |
| 2.1.2 序列和系统发育分析 |
| 2.1.3 VS转座活性分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 VS转座子广泛分布在生物界 |
| 2.2.2 VS的进化动力学分析 |
| 2.2.3 VS转座子的结构特征 |
| 2.2.4 蝙蝠VS的转座活性评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 脊椎动物和哺乳动物中DNA转座子的入侵 |
| 2.3.2 脊椎动物和哺乳动物中DNA转座子的活性 |
| 2.3.3 VS与Tc1/mariner其他家族关系比较 |
| 第3章 斑马鱼基因组转座子的挖掘及进化分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 斑马鱼基因组中转座子组成和占比的获得 |
| 3.1.2 进化树的构建 |
| 3.1.3 转座子和转座酶各个结构的预测 |
| 3.1.4 转座子年龄的估计 |
| 3.1.5 转座子拷贝数的统计 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 斑马鱼基因组中转座子的分布及含量 |
| 3.2.2 斑马鱼Tc1/mariner自主转座子的分析 |
| 3.2.3 活性斑马鱼转座子ZB |
| 3.3. 讨论 |
| 3.3.1 斑马鱼基因组中转座子的高丰度 |
| 3.3.2 斑马鱼转座子的多样性 |
| 3.3.3 斑马鱼转座子进化动力学比较 |
| 第4章 ZB转座子在哺乳动物细胞中的转座特性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 ZB转座子和转座酶载体的构建 |
| 4.1.2 细胞培养 |
| 4.1.3 高剂量转座子浓度下,不同转座子转座活性的比较 |
| 4.1.4 低剂量转座子浓度下,不同转座子的转座活性比较 |
| 4.1.5 ZB转座子的转座“足迹” |
| 4.1.6 制备ZB转座子文库及Illumina sequencing |
| 4.1.7 插入位点分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 ZB转座子与SB,PB,Tol2转座子的转座效率比较 |
| 4.2.2 ZB和SB转座子的交互作用 |
| 4.2.3 ZB转座子通过“剪切和粘贴”机制进人类基因组 |
| 4.2.4 ZB转座子的插入偏好 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 ZB转座子在人细胞中的高活性 |
| 4.3.2 转座酶越多,转座效率越低 |
| 4.3.3 ZB转座后留下足迹 |
| 4.3.4 ZB转座子的整合偏好 |
| 第5章 ZB转座子在斑马鱼中的增强子捕获应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物及试剂 |
| 5.1.2 斑马鱼增强子捕获载体的构建 |
| 5.1.3 斑马鱼显微注射 |
| 5.1.4 转座子在斑马鱼基因组中整合位点的鉴定 |
| 5.1.5 斑马鱼增强子的预测 |
| 5.1.6 克隆潜在增强子至增强子验证载体 |
| 5.1.7 斑马鱼整胚原位杂交(WISH)及潜在增强子的转录分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 ZB和Tol2介导的增强子捕获效率比较 |
| 5.2.2 ZB介导的斑马鱼增强子捕获品系的注解 |
| 5.2.3 Tol2介导的斑马鱼增强子捕获品系的注解 |
| 5.2.4 潜在增强子的转录活性检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 转座子在转基因斑马鱼中的应用 |
| 5.3.2 ZB转座子可产生转基因斑马鱼 |
| 5.3.3 ZB倾向产生单一表型的斑马鱼后代 |
| 5.3.4 ZK系斑马鱼潜在增强子的注解 |
| 5.3.5 潜在增强子的实验验证 |
| 5.3.6 增强子可以转录出增强子RNA(eRNA) |
| 第6章 ZB转座子在小鼠增强子捕获中的应用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验动物及饲养 |
| 6.1.2 小鼠增强子捕获载体和SB转座子介导的ZB转座酶表达载体的构建 |
| 6.1.3 sp-PCR鉴定小鼠插入位点 |
| 6.1.4 双转基因公鼠(突变体库)的制备 |
| 6.1.5 小鼠潜在增强子的预测 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 ZB转座子制备转基因小鼠 |
| 6.2.2 ZB转座子用于精子突变体库的构建 |
| 6.2.3 增强子捕获小鼠品系的注解 |
| 6.2.4 荧光小鼠的增强子注解 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 ZB转座子可产生转基因小鼠 |
| 6.3.2 小鼠后代中可产生突变小鼠 |
| 6.3.3 荧光小鼠的增强子预测 |
| 全文结论 |
| 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 VS在生物界中的分布汇总 |
| 附录二 斑马鱼中自主和非自主转座子汇总 |
| 攻读学位期间获得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）转PRL基因小鼠模型的构建与Stat5a的乳腺发育调控机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 催乳素的研究现状 |
| 1.1.1 催乳素的结构 |
| 1.1.2 PRL的信号通路 |
| 1.1.2.1 PRL诱导PRLR二聚化 |
| 1.1.2.2 JAK2酪氨酸磷酸化 |
| 1.1.2.3 JAK2的活化 |
| 1.1.2.4 PRLR的磷酸化 |
| 1.1.2.5 Stat二聚化诱导靶基因 |
| 1.1.3 催乳素的功能 |
| 1.1.4 催乳素与乳腺癌的关系 |
| 1.2 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 1.2.1 ChIP的基本原理与步骤 |
| 1.2.1.1 交联 |
| 1.2.1.2 染色质片段化 |
| 1.2.1.3 杂交 |
| 1.2.2 ChIP结果的检测 |
| 1.2.3 ChIP-seq数据分析 |
| 1.2.3.1 获得Clean Reads |
| 1.2.3.2 Peaks扫描 |
| 1.2.3.3 生物信息学分析 |
| 1.2.4 ChIP-seq和RNA-seq联合分析 |
| 第二章 乳腺特异性转PRL基因载体的构建与检测 |
| 摘要 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 分子克隆试剂 |
| 2.1.3 细胞转染与检测试剂 |
| 2.2 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PRL基因的克隆 |
| 2.3.2 乳腺特异表达载体的构建 |
| 2.3.3 Bcap-37细胞转染与检测 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 PRL基因的克隆 |
| 2.4.2 乳腺特异表达水牛PRL基因载体的构建 |
| 2.4.2.1 PRL片段插入 |
| 2.4.2.2 BCN启动子的插入 |
| 2.4.2.3 标记基因表达元件的插入 |
| 2.4.3 PRL转基因载体转染Bcap-37细胞与检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 乳腺特异性表达PRL基因小鼠模型的建立与分析 |
| 摘要 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 转基因载体的纯化与转基因小鼠的制备 |
| 3.3.2 转基因小鼠PCR鉴定 |
| 3.3.3 Southern Blot分析 |
| 3.3.4 EGFP表达荧光检测 |
| 3.3.5 转基因小鼠的扩繁 |
| 3.3.6 外源基因拷贝数分析 |
| 3.3.7 外源基因整合位点检测 |
| 3.3.8 Western Blot检测外源PRL基因的表达 |
| 3.3.9 ELISA检测外源PRL基因的表达 |
| 3.3.10 QRT-PCR检测外源PRL表达对乳汁分泌相关基因的影响 |
| 3.3.11 外源PRL基因的表达对转基因小鼠生殖情况的影响 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 转PRL基因小鼠的制备 |
| 3.4.2 转基因小鼠的鉴定 |
| 3.4.2.1 F0代小鼠鉴定 |
| 3.4.2.2 F0代小鼠荧光检测 |
| 3.4.2.3 子代转基因小鼠的检测 |
| 3.4.2.4 转基因小鼠外源基因拷贝数分析 |
| 3.4.2.5 转基因小鼠外源基因整合位点分析 |
| 3.4.3 转基因小鼠的分析 |
| 3.4.3.1 转基因小鼠组织中PRL基因的表达 |
| 3.4.3.2 转基因小鼠乳汁中PRL蛋白表达分析 |
| 3.4.3.3 转基因小鼠乳汁中PRL蛋白含量测定 |
| 3.4.4 外源PRL蛋白表达对乳汁生成相关基因表达的影响 |
| 3.4.5 转基因小鼠的安全性检测 |
| 3.4.5.1 外源PRL蛋白表达对转基因小鼠血清中PRL含量的影响 |
| 3.4.5.2 外源PRL蛋白表达对转基因小鼠产仔数的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 转录因子Stat5a靶基因的筛选与分析 |
| 摘要 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.2 仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 QRT-PCR检测Stats基因的表达情况 |
| 4.3.2 乳腺组织样本的准备 |
| 4.3.3 小鼠乳腺组织ChP |
| 4.3.4 小鼠RNA-seq样本的制备与测序 |
| 4.3.5 数据分析 |
| 4.3.6 QRT-PCR验证RNA-seq数据准确性 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 乳腺不同发育阶段Stats的表达分析 |
| 4.4.2 ChIP-seq数据分析 |
| 4.4.2.1 Reads数据统计 |
| 4.4.2.2 Reads覆盖深度 |
| 4.4.2.3 Peaks数据统计 |
| 4.4.2.4 Peaks在基因组中的分布 |
| 4.4.2.5 样本间Peaks差异分析 |
| 4.4.2.6 Peaks相关基因差异分析 |
| 4.4.2.7 Peaks相关基因GO聚类分析 |
| 4.4.3 RNA-seq数据分析 |
| 4.4.3.1 Reads数据的统计 |
| 4.4.3.2 测序结果可靠性分析 |
| 4.4.3.3 基因覆盖度分析 |
| 4.4.3.4 基因表达差异分析 |
| 4.4.3.5 RNA-seq数据分析中表达差异基因的验证 |
| 4.4.3.6 表达差异基因的GO聚类分析 |
| 4.4.4 ChIP-seq联合RNA-seq数据分析 |
| 4.4.4.1 Stat5a在靶位点的结合对靶基因表达的影响 |
| 4.4.4.2 转录因子Stat5a在乳腺细胞分化中的作用分析 |
| 4.4.4.3 外源PRL基因表达对Stat5a靶基因的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）gga-miR-31-5p调控鸡减数分裂和精子生成的机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 视黄酸调控细胞生长与分化的研究进展 |
| 1.1.1 视黄酸的分类与功能概述 |
| 1.1.2 视黄酸与胚胎干细胞分化 |
| 1.1.3 视黄酸与精原干细胞分化 |
| 1.1.4 视黄酸与其它细胞的分化 |
| 1.1.5 视黄酸与肢体发育 |
| 1.1.6 视黄酸与睾丸生殖细胞的分化 |
| 1.2 miRNA调控细胞分化与生殖细胞发育的研究进展 |
| 1.2.1 miRNA的发生与功能概述 |
| 1.2.2 miRNA调控细胞分化研究进展 |
| 1.3 生殖特异基因与表观遗传因素调控减数分裂的研究进展 |
| 1.3.1 生殖特异基因调控减数分裂 |
| 1.3.2 miRNAs调控减数分裂 |
| 1.3.3 lncRNA调控减数分裂 |
| 1.3.4 组蛋白修饰与减数分裂 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第2章 RA诱导ESC向SSC分化过程中关键miRNAs的筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.1.4 RA诱导ESC分化 |
| 2.1.5 5种类型的文库建立与测序 |
| 2.1.6 靶基因预测、GO和KEGG分析 |
| 2.1.7 qRT-PCR检测Stra8及miRNAs表达变化 |
| 2.1.8 数据分析 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 miRNAs测序与鉴定 |
| 2.2.2 成熟miRNAs的富集性 |
| 2.2.3 差异表达的miRNAs及其靶基因的分析 |
| 2.2.4 PGC/SSC差异miRNAs在RA诱导ESC后表达模式变化 |
| 2.2.5 靶向Stra8的miRNAs表达差异检测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 靶向Stra8的关键miRNA筛选及其功能验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.1.4 克隆Stra8 3'UTR序列 |
| 3.1.5 靶向Stra8的miRNAs预测与鉴定 |
| 3.1.6 anti-STRA8多克隆抗体制备 |
| 3.1.7 gga-miR-31-5p功能验证 |
| 3.1.8 数据分析 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 靶向鸡:Stra8基因的miRNA预测及鉴定 |
| 3.2.2 gga-miR-31-5p靶向Stra8调控减数分裂 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 影响gga-miR-31-5p转录调控因素的探究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与设备 |
| 4.1.4 gga-miR-31-5p启动子区域预测与生物学分析 |
| 4.1.5 基因组DNA的提取 |
| 4.1.6 pEGFP-miR-31-promoter重组质粒载体构建与定性分析 |
| 4.1.7 gga-miR-31-5p启动子核心区域鉴定 |
| 4.1.8 gga-miR-31-5p启动子与Stra8启动子竞争性结合RA |
| 4.1.9 转录因子c-jun对gga-miR-31-5p启动活性的影响 |
| 4.1.10 TSA对gga-miR-31-5p转录的影响 |
| 4.1.11 数据分析 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 确认gga-miR-31-5p的启动子区域 |
| 4.2.2 gga-miR-31-5p与Stra8的启动子竞争性结合RA |
| 4.2.3 转录因子c-jun对gga-miR-31-5p启动活性的影响 |
| 4.2.4 组蛋白乙酰化抑制剂TSA调控gga-miR-31-5p的转录 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 LncRNA-IMS与Stra8竞争性结合gga-miR-31-5p促进精子形成 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与设备 |
| 5.1.4 gga-miR-31-5p互作lncRNA分析 |
| 5.1.5 各lncRNA过表达载体构建 |
| 5.1.6 各lncRNA与gga-miR-31-5p-Stra8竞争关系验证 |
| 5.1.7 LncRNA-IMS突变载体构建及活性验证 |
| 5.1.8 sh-LncRNA-IMS重组质粒构建及活性验证 |
| 5.1.9 LncRNA-IMS功能验证 |
| 5.1.10 数据分析 |
| 5.2 实验结果与分析 |
| 5.2.1 分析预测lncRNA-gga-miR-31-5p |
| 5.2.2 OE-lncRNA重组质粒构建 |
| 5.2.3 双荧光检测lncRNA与Stra8及gga-miR-31-5p竞争关系 |
| 5.2.4 sh-LncRNA-IMS重组质粒构建及活性验证 |
| 5.2.5 LncRNA-IMS体外影响减数分裂的功能验证 |
| 5.2.6 LncRNA-IMS体内影响精子形成的功能验证 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 全文结论与创新 |
| 论文有待改进之处及下一步计划 |
| 待改进之处 |
| 下一步计划 |
| 附录 |
| 附录一:常用试剂配制 |
| 附录二:附表 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）家蚕安全高效转基因技术体系的研究 ——家蚕定点转基因体系的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 基因工程研究中的转基因表达差异现象 |
| 1.2.1 转基因表达差异现象及原因 |
| 1.2.2 位置效应引起的外源基因表达差异 |
| 1.3 转座子介导的整合位置效应及其影响 |
| 1.3.1 piggyBac转座子概述 |
| 1.3.2 piggyBac转座子介导的转基因整合位置效应 |
| 1.4 基于转座子建立的转基因生物的安全问题 |
| 1.5 克服转座子介导的转基因整合位置效应和安全隐患的方法 |
| 1.5.1 克服位置效应的策略 |
| 1.5.2 消除转基因潜在安全隐患的策略 |
| 1.6 利用位点特异性重组技术和改进的piggyBac转座系统克服转基因位置效应及消除转基因安全隐患的研究进展 |
| 1.6.1 位点特异性重组技术概述 |
| 1.6.2 利用位点特异性重组系统实现筛选标记删除及消除整合位置效应影响 |
| 1.6.3 利用改进的piggyBac转座系统实现转基因稳定整合及筛选标记删除 |
| 1.6.4 位点特异性重组系统和改进的piggyBac转座系统的联合应用 |
| 1.7 不同基因组操作技术联合使用的应用前景 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的和意义 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.4 研究路线 |
| 第三章 基于FLP/FRT系统实现的家蚕个体水平转基因高效、可诱导的定点删除研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器与试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 重组载体的获得 |
| 3.2.2 FLP/FRT系统转基因靶品系和FLP重组酶表达辅助品系的建立 |
| 3.2.3 显微注射FLP重组酶mRNA或表达载体产生阳性转基因重组家蚕 |
| 3.2.4 FLP基因在H-A-1和H-H-1家蚕体内的表达检测 |
| 3.2.5 靶基因在TTS&H-A-1转基因后代的高效删除 |
| 3.2.6 热激诱导实现靶基因在TTS&H-H-1转基因后代的删除 |
| 3.2.7 位点特异性重组事件的分子鉴定 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 基于phiC31-RMCE系统实现的家蚕个体水平转基因定点整合研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 重组载体的获得 |
| 4.2.2 phiC31/att系统转基因靶品系的建立 |
| 4.2.3 利用瞬时表达载体作为phiC31整合酶来源产生阳性位点特异性整合家蚕 |
| 4.2.4 发生于TTS家蚕基因组染色体attB/attB靶位点的位点特异性整合事件 |
| 4.2.5 利用体外合成mRNA作为phiC31整合酶来源产生阳性位点特异性整合家蚕 |
| 4.2.6 检测转基因整合在SSIS家蚕后代基因组中的遗传稳定性 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 一种稳定、可置换的安全高效家蚕转基因操作技术的建立 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 重组载体获得及实验方案设计 |
| 5.2.2 筛选转基因高效表达的TS1-RgG家蚕 |
| 5.2.3 创制不含有转座元件及筛选标记基因的转基因家蚕 |
| 5.2.4 鉴定创制不含有转座元件的转基因家蚕的最优热激处理条件 |
| 5.2.5 检测FibH-EGFP表达框在TS3家蚕后代基因组中的遗传稳定性 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 综合与结论 |
| 论文创新点 |
| 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章、申请专利、参加会议及参研课题 |
| 致谢 |
（6）调控区定点整合骨骼肌特异增强子上调Igf1基因表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 基因修饰动物研究进展 |
| 1.1.1 基因修饰动物的发展历程 |
| 1.1.2 基因修饰动物的展望 |
| 1.2 骨骼肌的发育 |
| 1.2.1 骨骼肌的发生 |
| 1.2.2 骨骼肌的调控 |
| 1.2.3 卫星细胞 |
| 1.3 Igf1的研究进展 |
| 1.3.1 Igf1基因结构及转录本 |
| 1.3.2 IGF1前肽及成熟肽 |
| 1.3.3 IGF1对于生长发育的作用 |
| 1.3.4 IGFBP |
| 1.3.5 骨骼肌中IGF1的信号通路 |
| 1.3.6 IGF1的过表达能够抵抗肌萎缩 |
| 1.3.7 IGF1促进肌肉损伤修复 |
| 1.3.8 IGF1对于心肌的作用 |
| 1.3.9 IGF1肌肉特异过表达小鼠模型 |
| 1.4 增强子的研究进展 |
| 1.4.1 顺式调控元件 |
| 1.4.2 增强子 |
| 1.4.3 非编码区的改变影响基因的表达量 |
| 1.4.4 骨骼肌特异的增强子 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 细胞系和实验动物 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 实验耗材 |
| 2.2.5 常用试剂及抗体 |
| 2.2.6 常用培养基及溶液配制 |
| 2.2.7 实验分析软件和网站 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞和组织基因组提取 |
| 2.3.2 质粒DNA的提取 |
| 2.3.3 PCR反应的体系与条件 |
| 2.3.4 酶切产物及PCR产物的纯化、回收 |
| 2.3.5 PCR产物及酶切片段的连接 |
| 2.3.6 感受态细胞的制备与转化 |
| 2.3.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.3.8 Gibson片段融合 |
| 2.3.9 组织及细胞总RNA的提取 |
| 2.3.10 RNA反转录为cDNA |
| 2.3.11 荧光实时定量PCR (Real-time PCR) |
| 2.3.12 Southern blot |
| 2.3.13 细胞及组织总蛋白的提取 |
| 2.3.14 总蛋白浓度的测定 |
| 2.3.15 Western blot |
| 2.3.16 ELISA测定IGF1含量 |
| 2.3.17 肌肉组织的H&E染色 |
| 2.3.18 免疫荧光染分化肌管的MyHC |
| 2.3.19 细胞的转染 |
| 2.3.20 双荧光素酶活性检测 |
| 2.3.21 CRISPR-Cas9载体的构建 |
| 2.3.22 sgRNA切割效率的检测 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 利用荧光素酶报告系统评估候选肌肉特异增强子的活性 |
| 3.1.1 荧光素酶报告载体的构建 |
| 3.1.2 转染条件的优化 |
| 3.1.3 荧光素酶报告载体的检测结果 |
| 3.1.4 结果分析与讨论 |
| 3.2 寻找Igf1转录起始位点上游的增强子插入位点 |
| 3.2.1 利用phastCons分值评估获得增强子的候选插入位点 |
| 3.2.2 靶向候选插入位点的sgRNA的设计及其切割效率的验证 |
| 3.2.3 同源重组载体的构建 |
| 3.2.4 site1、site2、site3位点分别定点整合MLC增强子的C2C12单克隆的筛选 |
| 3.2.5 利用Southern blot检测C2C12细胞中site2位点同源重组的发生 |
| 3.2.6 检测切割site2位点的sgRNA igf1-9的脱靶效应 |
| 3.2.7 检测site1、site2、site3三个位点的系列阳性单克隆的肌管中Igf1的表达量 |
| 3.2.8 利用ELISA,检测site2系列阳性单克隆中IGF1的蛋白含量 |
| 3.2.9 site2系列阳性单克隆中Akt通路发生了激活 |
| 3.2.10 site2系列阳性单克隆分化产生的肌管出现肥大表型 |
| 3.2.11 结果分析与讨论 |
| 3.3 site2位点整合MLC增强子的基因修饰小鼠的制备 |
| 3.3.1 F0代基因修饰小鼠的制备及鉴定 |
| 3.3.2 F0代的基因修饰阳性小鼠均具有生殖系嵌合 |
| 3.3.3 结果分析与讨论 |
| 3.4 site2位点整合MLC增强子的小鼠肌肉中Igf1的表达发生上调 |
| 3.4.1 site2位点整合MLC增强子的小鼠肌肉中的Igf1 mRNA水平发生上调 |
| 3.4.2 site2位点整合MLC增强子的小鼠肌肉中的IGF1蛋白水平发生上调 |
| 3.4.3 一月龄基因修饰小鼠肌肉中的Akt通路发生激活 |
| 3.4.4 成年基因修饰小鼠肌肉中Akt通路未检测到明显激活 |
| 3.4.5 基因修饰母鼠体重及胴体重显着增加 |
| 3.4.6 基因修饰母鼠的肌肉发生肥大 |
| 3.4.7 结果分析与讨论 |
| 3.5 骨骼肌中IGF1的上调对其他组织的影响 |
| 3.5.1 基因修饰小鼠血液中的IGF1表达未发生变化 |
| 3.5.2 基因修饰小鼠心脏未发生肥大及病理性变化 |
| 3.5.3 肌肉中上调的IGF1并未造成胫骨长度的变化 |
| 3.5.4 结果分析与讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（7）let-7 microRNA调控家蚕丝腺发育的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 丝腺发育与丝蛋白表达调控 |
| 1.2.1 丝腺发育 |
| 1.2.2 丝蛋白合成与分泌 |
| 1.3 非编码RNA研究进展 |
| 1.3.1 非编码RNA分类及主要功能 |
| 1.3.2 miRNA的产生与作用机制 |
| 1.3.3 miRNA Cluster |
| 1.3.4 家蚕非编码RNA研究进展 |
| 1.4 let-7 研究进展 |
| 1.4.1 let-7 在发育中的调控作用 |
| 1.4.2 let-7 在癌症中的调控作用 |
| 1.4.3 let-7 在细胞周期调控中的作用 |
| 1.5 miRNA功能研究方法 |
| 1.5.1 基于大数据的miRNA研究方法 |
| 1.5.2 基于化学合成和转基因技术的miRNA研究方法 |
| 1.5.3 基于基因编辑技术的miRNA研究方法 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 科学问题及主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 家蚕丝腺miRNA研究方法探索 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要仪器与试剂 |
| 3.1.3 实验方法与步骤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 功能试剂注射及效果检测 |
| 3.2.2 miR-274 sponge特异性下调miR-274 |
| 3.2.3 miR-274转基因过表达 |
| 3.2.4 利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除miR-274 |
| 3.3 总结与讨论 |
| 第四章 家蚕let-7C miRNA抑制家蚕细胞增殖 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 实验方法与步骤 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 let-7C miRNAs的在不同发育时期的家蚕个体和组织中的表达谱分析 |
| 4.2.2 let-7C miRNAs在五龄幼虫丝腺中的时序表达 |
| 4.2.3 let-7C miRNAs对家蚕Bm E细胞增殖的影响 |
| 4.2.4 let-7C miRNAs对家蚕Bm Ns细胞增殖的影响 |
| 4.3 总结与讨论 |
| 第五章 let-7C miRNA敲除对中部丝腺生长的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要仪器与试剂 |
| 5.1.3 实验方法与步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 敲除let-7和let-7C双gRNA表达品系 |
| 5.2.2 中部丝腺let-7和let-7C敲除个体 |
| 5.2.3 let-7及let-7C敲除促进中部丝腺生长 |
| 5.2.4 中部丝腺敲除let-7和let-7C后的表型差异 |
| 5.2.5 中部丝腺敲除let-7和let-7C对家蚕吐丝的影响 |
| 5.3 总结与讨论 |
| 第六章 let-7C miRNA对后部丝腺生长的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 主要仪器与试剂 |
| 6.1.3 实验方法与步骤 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 let-7和let-7C后部丝腺敲除个体获取 |
| 6.2.2 let-7 敲除对后部丝腺生长的影响 |
| 6.2.3 let-7C敲除对后部丝腺生长的影响 |
| 6.2.4 敲除后部丝腺let-7和let-7C产生的表型差异 |
| 6.2.5 let-7和let-7C敲除促进后部丝腺细胞核内复制 |
| 6.2.6 过表达let-7C miRNA对丝腺生长的影响 |
| 6.3 总结与讨论 |
| 第七章 let-7 调控丝腺生长的分子机理初探 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 主要仪器与试剂 |
| 7.1.3 实验方法与步骤 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 丝腺RNA提取及质量检测 |
| 7.2.2 测序数据质量评估 |
| 7.2.3 基因表达分析 |
| 7.2.4 差异表达基因聚类分析 |
| 7.2.5 差异表达基因GO和 Pathway富集分析 |
| 7.3 总结与讨论 |
| 第八章 let-7 靶基因鉴定及功能研究 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 主要仪器与试剂 |
| 8.1.3 实验方法与步骤 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 let-7 靶基因预测 |
| 8.2.2 let-7 表型相关靶基因筛选 |
| 8.2.3 表型相关靶基因表达分析、3’UTR及双荧光素酶报告系统 |
| 8.2.4 let-7 靶基因验证 |
| 8.2.5 靶位点有效性验证 |
| 8.2.6 过表达PC对丝腺生长的影响 |
| 8.2.7 敲除PC对丝腺生长的影响 |
| 8.3 总结与讨论 |
| 第九章 综合与结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表文章和参研课题 |
| 致谢 |
（9）人细小病毒B19类染色质结构调控基因组复制及RNA加工（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 人细小病毒B19概述 |
| 1.2 B19V病原学特性 |
| 1.2.1 B19V结构和基因组特点 |
| 1.2.2 B19V基因编码蛋白的功能 |
| 1.2.2.1 非结构蛋白NS1 |
| 1.2.2.2 衣壳蛋白（VP1/VP2） |
| 1.2.2.3 11kDa蛋白和 7.5kDa蛋白 |
| 1.2.3 B19V生物学特性 |
| 1.2.4 B19V的流行病学 |
| 1.2.5 B19V的致病机制 |
| 1.2.6 B19V感染的临床表现 |
| 1.2.6.1 红细胞再生障碍性贫血 |
| 1.2.6.2 传染性红斑 |
| 1.2.6.3 关节病 |
| 1.2.6.4 肢端瘀斑综合征 |
| 1.2.6.5 血管性紫癜 |
| 1.2.6.6 孕妇感染B19V |
| 1.2.6.7 其他疾病 |
| 1.2.7 B19V感染的诊断 |
| 1.2.8 治疗 |
| 1.3 染色质（体） |
| 1.3.1 染色体与染色质 |
| 1.3.1.1 真核生物染色质结构 |
| 1.3.1.2 病毒染色质结构 |
| 1.3.2 染色质结构的功能 |
| 1.3.2.1 染色质结构与病毒感染 |
| 1.3.2.2 染色质结构与基因表达 |
| 1.3.2.3 染色质与mRNA可变剪切 |
| 1.3.3 细小病毒类染色质结构 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 本研究的主要内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、细胞系 |
| 2.1.2 质粒、载体 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要工作液的配制 |
| 2.4 主要仪器 |
| 2.5 主要实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.2 RNA酶保护实验相关质粒的制备 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 质粒的构建 |
| 3.1.1 核酸酶保护实验探针制备 |
| 3.1.2 B19V复制型质粒的构建 |
| 3.2 B19V基因组可以在HEK293T细胞内复制和转录 |
| 3.2.1 B19V基因组的制备 |
| 3.2.2 B19V感染性克隆可以在HEK293T细胞内复制和转录 |
| 3.3 B19V基因组可以在HEK293T细胞内形成类染色质结构 |
| 3.4 B19V基因组DNA类染色质结构形成早于复制 |
| 3.5 B19V基因组DNA存在甲基化位点 |
| 3.6 B19基因组DNA染色质状态调控基因的表达 |
| 3.6.1 MTT检测 5-Aza-2’-deoxycytidine（DAC）对细胞的毒性 |
| 3.6.2 DAC影响B19V类染色质结构的形成 |
| 3.6.3 DAC影响B19V基因组的复制 |
| 3.7 B19基因组DNA的复制间接影响(pA)p的使用 |
| 3.7.1 B19V复制通过影响内含子的剪切而影响(pA)p的使用 |
| 3.7.2 B19V复制间接影响(pA)p的使用 |
| 3.8 DAC影响B19V RNA的转录后加工 |
| 3.9 DAC影响B19V (pA)p的使用 |
| 第4章 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 本文所用的引物信息 |
| 作者简历 |
（10）增强子的鉴定及其在肿瘤研究中的应用（论文提纲范文）
| 1 增强子及其特性 |
| 2 超级增强子及其特性 |
| 3 增强子的研究方法 |
| 3.1 基于ChIP-Seq技术鉴定增强子 |
| 3.1.1 基于转录因子和转录辅助因子结合位点鉴定增强子 |
| 3.1.2 基于组蛋白修饰鉴定增强子 |
| 3.2 基于DNA甲基化检测技术鉴定有活性的增强子 |
| 3.3 基于DNase-Seq、ATAC-Seq、RNA-Seq技术鉴定有活性的增强子 |
| 3.4 基于基因编辑技术研究增强子 |
| 3.4.1 CRISPR-Cas9系统在增强子研究中的应用 |
| 3.4.2 CRISPR-d Cas9系统在增强子研究中的应用 |
| 4 超级增强子的研究方法 |
| 5 增强子的应用方向 |
| 5.1 增强子在肿瘤诊断治疗上的应用潜力 |
| 5.2 eRNA在肿瘤诊断治疗上的应用潜力 |
| 5.3 超级增强子在肿瘤研究中的进展 |
| 5.3.1 超级增强子与肿瘤的关系 |
| 5.3.2 超级增强子在肿瘤治疗中的应用潜力 |
| 6 结语与展望 |
四、染色质的结构和功能—SV40基因组的研究（论文参考文献）
- [1]CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究[D]. 潘宏. 广西大学, 2019(06)
- [2]Tc1/mariner转座子挖掘、高活性成员鉴定及其在增强子捕获中的应用[D]. 沈丹. 扬州大学, 2020(01)
- [3]转PRL基因小鼠模型的构建与Stat5a的乳腺发育调控机理研究[D]. 任艳萍. 广西大学, 2014(01)
- [4]gga-miR-31-5p调控鸡减数分裂和精子生成的机制解析[D]. 王颖洁. 扬州大学, 2020
- [5]家蚕安全高效转基因技术体系的研究 ——家蚕定点转基因体系的建立及应用[D]. 龙定沛. 西南大学, 2015(11)
- [6]调控区定点整合骨骼肌特异增强子上调Igf1基因表达的研究[D]. 邹云龙. 中国农业大学, 2017(05)
- [7]let-7 microRNA调控家蚕丝腺发育的分子机制[D]. 王伟. 西南大学, 2019(05)
- [8]染色质的结构和功能—SV40基因组的研究[J]. 徐钤. 第一军医大学学报, 1983(S1)
- [9]人细小病毒B19类染色质结构调控基因组复制及RNA加工[D]. 徐焕洲. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2017(09)
- [10]增强子的鉴定及其在肿瘤研究中的应用[J]. 刘倩,李春燕. 遗传, 2020(09)