一、Brdu与IdU诱发SCE的比较研究（论文文献综述）
杨亚娟[1]（2020）在《FANCI和FANCL基因在早发性卵巢功能不全发病中的作用及机制研究》文中研究指明第一章FANCI基因在POI发病中的作用及机制研究背景早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency,POI）是指女性40岁之前出现卵巢功能衰退,表现为月经紊乱,血清促性腺激素水平升高和雌激素缺乏。POI病因高度异质,包括遗传因素、免疫因素、感染和医源性因素等。其中,遗传因素在POI发病中具有重要作用,目前研究发现约20～25%的POI病因与遗传缺陷有关。近年来通过全外显子组测序（Whole exome sequencing,WES）等技术发现了许多新的POI致病基因,主要集中在DNA损伤修复、同源重组和减数分裂等过程,说明DNA损伤修复缺陷是导致POI发生的重要原因。尽管POI致病基因在不断增加,但这只是POI病因学的冰山一角,半数以上的POI患者病因仍不清楚,寻找新的致病基因并阐明致病机制一直是POI病因学研究的热点和难点。范可尼贫血（Fanconi anemia,FA）通路是经典的DNA损伤修复通路,参与DNA交联损伤（Interstrand cross-links,ICLs）修复和复制叉稳定性的维持。目前,以FA命名的基因有22个（FANCA-W）。多个FA基因缺陷小鼠出现POI样表型,且在 POI 患者中发现了FANCD1/BRCA2、FANCM和FANCU/XRCC2等基因的致病突变,表明FA家族基因可能在卵巢的发育和功能维持中具有重要作用。FANCI是FA通路的重要成员,E3泛素连接酶FANCL与泛素结合酶UBE2T相互协作,促进FANCI-FANCD2复合体的泛素化修饰是FA通路激活的关键节点事件。另外,大样本全基因组关联研究发现FANCI基因与自然绝经年龄、早绝经和POI均有明显相关性。因此,我们推测FANCI基因可能参与卵巢发生发育和功能维持,但其确切功能和作用机制还有待阐明。目的本研究利用Fanci基因敲除小鼠探究FANCI在卵巢发育和功能维持中的作用,借助POI患者WES数据筛查FANCI基因变异情况,并进一步分析变异对蛋白功能的影响,从动物模型和致病变异两方面阐明FNCI基因在POI发病中的作用和机制。方法通过CRISPR/Cas9技术在Fanci基因的第5外显子敲除98bp,造成移码突变和蛋白截短,构建Fanci基因敲除小鼠;通过雌鼠生育力测试、动情周期观察、血清性激素测定和卵巢组织学分析,明确Fanci基因敲除对卵巢功能的影响;通过胚胎性腺观察和生殖细胞计数,明确Fanci缺失对早期生殖细胞发生发育的影响。通过对原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC）凋亡、增殖、细胞周期、DNA损伤的检测,确定Fanci基因在PGC发育和基因组稳定性维持中的作用。在胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast,MEF）中探讨FANCI维持基因组稳定性的机制,使用丝裂霉素（Mitomycin,MMC）诱导ICLs,阿菲科林（Aphidicolin,APH）和羟基脲（Hydrouria,HU）诱导复制压力,Western blot检测细胞复制压力反应和DNA损伤的指标,DNA fiber assay检测复制叉的稳定性,彗星实验和微核形成率检测评估基因组的稳定性,从而阐明FANCI参与ICLs修复和维持基因组稳定性的机制。在特发性POI患者WES数据中筛选FANCI基因变异,用sanger测序和10 X genomics测序对变异位点及单倍型进行验证,并对变异位点的致病性进行生物信息学分析,明确FANCI基因突变在人POI发病中的作用。结果一、Fanci基因敲除导致小鼠原始生殖细胞发育异常基因型鉴定和蛋白水平验证Fanci基因敲除小鼠。Fanci-/-小鼠生长发育无明显改变,出生比例符合孟德尔遗传定律。成年Fanci-/-雌鼠生育力丧失,动情周期消失,血清FSH明显升高,卵巢萎缩无卵泡,出现POI样表型。3天龄Fanci-/-雌鼠卵巢中原始卵泡和雄鼠睾丸中精原细胞明显减少,提示胚胎期生殖细胞发育异常。进一步观察Fanci-/-胚胎性腺并计数PGC,发现Fanci-/-胚胎PGC在胚胎9.5天（E9.5）已有减少,E11.5时减少更为明显,PGC倍增时间明显延长。但是Fanci-/-胚胎PGC迁移不受影响,性腺中体细胞的发育未见明显异常。二、FANCI在原始生殖细胞发育中的作用机制研究E11.5Fanci-/-胚胎PGC中Cleaved PARP1阳性细胞比例升高,说明凋亡细胞比例增加;EdU掺入细胞比例明显降低,提示PGC增殖能力明显下降;Cyclin B1细胞浆强阳性细胞比例增加,提示PGC出现明显的G2期阻滞。Fanci-/-胚胎S期PGC中FANCD2 foci明显减少并且表达量降低,提示FA通路活化障碍。Fanci-/-胚胎 PGC 中 DNA 双链断裂标志物（Double strand break,DSB）γH2AX foci、53BP1 foci以及磷酸化p53阳性细胞比例明显升高,表明DNA损伤增加及p53激活,以上结果说明Fanci基因敲除造成胚胎PGC中FA通路失活和DNA损伤聚集。MMC和APH处理体外培养MEF诱导ICLs和复制压力后,Fanci--MEF中FANCD2泛素化修饰缺失且表达下降,γH2AX、磷酸化RPA2、磷酸化p53表达升高,53BP1阳性细胞明显增加,提示Fanci基因敲除造成FA通路激活障碍,ICLs修复异常和复制压力解除障碍,导致DNA损伤增加和p53激活。APH和HU诱导复制压力引起Fanci-/-MEF细胞中新生DNA链长度明显缩短,说明Fanci缺失引起复制叉不稳定,新生DNA链异常切除。同时,APH和HU处理后,Fanci-/-MEF细胞彗星尾显着延长,微核形成率升高,说明复制压力导致Fanci-/-MEF细胞基因组不稳定性增加。三、FANCI基因在POI患者中的突变分析在1030例中国汉族特发性POI患者中发现2例患者携带FANCI基因新发复合杂合突变 c.158-2A>G/c.959A>G（p.Q320R）和 c.97C>T（p.L33F）/c.1865C>T（p.S622L）。Minigene实验检测结果显示,c.158-2A>G突变导致剪切异常,造成移码和蛋白截短（p.S54Pfs*5）。生物信息学分析发现,4个突变位点的氨基酸在物种间均高度保守,并且位于FANCI的重要功能域上,多个功能预测软件综合分析4个突变位点均可能是致病变异,说明FANC1基因突变可能导致POI的发病。结论（1）FANCI参与ICLs修复和复制叉稳定性的维持,在卵巢发育和功能维持中具有重要作用。（2）FANCI缺失导致FA通路激活障碍,ICLs修复异常和复制叉不稳定,DNA损伤增加,引起PGC细胞周期异常和增殖降低,卵泡生成不足并过早耗竭。（3）FANCI基因突变可能是POI的发病原因。第二章FANCL基因突变在POI发病中的作用及机制研究背景DNA损伤修复相关基因缺陷在POI遗传学病因研究中受到越来越多的关注。FA通路是经典的DNA损伤修复通路,主要参与ICLs修复。最近研究表明FA基因变异参与POI的发病,提示FA通路对卵泡发生发育及卵巢功能维持具有重要作用。FANCI-D2复合体的单泛素化修饰是ICLs修复过程中的重要节点,E3泛素连接酶FANCL功能受损导致FANCI-D2不能发生泛素化修饰,FA通路将不能被激活。Fancl-/-小鼠胚胎期PGC增殖能力下降导致PGC数目减少,成年雌性小鼠卵泡明显减少,卵巢萎缩出现POI样表型。但是,FANCL基因突变是否与人类POI的发病相关尚不清楚。目的在中国汉族特发性POI患者中进行FANCL基因突变筛查,并对突变位点进行体外功能验证,阐明FANCL基因突变在POI发病中的作用及机制。方法募集200例中国汉族特发性POI患者和200例对照女性,对FANCL基因的14个外显子和外显子与内含子接头区域进行PCR扩增和Sanger测序,筛查突变位点。构建野生型和突变型FANCL质粒,转染野生型HEK293细胞,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光染色检测突变蛋白细胞定位。野生型和突变型质粒转染野生型、FANCL-/-HEK293细胞,MMC处理诱导ICLs,Western blot检测细胞FANCD2泛素化水平和yH2AX表达;在HEK293细胞中敲降FANCL,MMC处理诱导ICLs,Western blot检测细胞FANCD2泛素化水平和yH2AX表达。结果一、POI患者中发现FANCL基因2个新发杂合移码突变测序发现FANCL基因11个变异位点,其中位于第13外显子c.10481051delGTCT（p.Q350Vfs*18）和位于第 9 外显子 c.739dupA（p.M247Nfs*4）为新发杂合移码突变,在200例对照女性中均未发现相同变异,其余的9个位点均为单核苷酸变异（single-nucleotide polymorphisms,SNP）,所有SNP位点的基因型频率和等位基因频率在POI患者和对照组中均无统计学差异。二、突变型FANCL蛋白定位异常在HEK293细胞中过表达野生型和突变型FANCL,发现p.M247Nfs*4突变导致FANCL蛋白明显截短,分子量约35kDa,而p.Q350Vfs*18突变几乎不改变蛋白的分子量。免疫荧光染色结果显示,野生型FANCL主要定位于细胞核,但p.M247Nfs*4和p.Q350Vfs*18突变蛋白滞留于细胞浆,未见细胞核定位。三、突变导致FANCL蛋白泛素连接酶活性丧失和DNA损伤修复能力受损MMC处理后,转染野生型FANCL质粒的HEK293细胞中泛素化FANCD2表达明显增加,γH2AX表达快速下降,而对照组和转染突变型质粒的细胞中泛素化FANCD2的表达量无明显差异,γH2AX恢复延迟,说明突变影响FANCL蛋白泛素连接酶活性和DNA损伤修复能力。进一步在FANCL-/-HEK293细胞中转染FANCL质粒,MMC处理后,表达突变型FANCL蛋白组中均未检测到泛素化FANCD2表达,且yH2AX表达量增加,而过表达野生型FANCL可恢复FANCL--细胞中的FANCD2泛素化,并降低γH2AX表达,说明突变型FANCL蛋白泛素连接酶功能丧失且DNA损伤修复能力下降。此外,HEK293细胞敲降FANCL后,泛素化FANCD2表达量下降,γH2AX表达水平升高,提示FANCL基因单倍剂量不足引起细胞泛素连接酶活性和DNA损伤修复能力下降。结论POI患者携带FANCL基因的两个新发杂合移码突变p.Q350Vfs*18和p.M247Nfs*4,突变引起FANCL蛋白定位异常和泛素连接酶功能丧失,进而通过单倍剂量不足导致DNA损伤修复能力受损,引起POI的发生。
舍雅莉,张秋菊,李亚玲,张立,张国欣,张磊,刘永琦,李长天[2]（2020）在《黄芪多糖对甲醛染毒人BMSCs染色体损伤的保护作用》文中研究指明目的:研究黄芪多糖（APS）对甲醛染毒人骨髓间充质干细胞（BMSCs）微核形成、姐妹染色单体互换（SCE）频率升高的保护作用及潜在的机制。方法:体外培养人BMSCs,随机分为空白组,甲醛组,APS 40,100,400 mg·L-1组。用120μmol·L-1甲醛染毒人BMSCs,染毒同时,APS 40,100,400 mg·L-1组分别加入40,100,400 mg·L-1APS共培养。利用倒置相差显微镜观察细胞形态,微核实验检测微核形成情况,姐妹染色单体互换实验检测SCE发生频率,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测增殖细胞核抗原（PCNA）,着色性干皮病基因B,D,F,G（XPB,XPD,XPF,XPG） mRNA和蛋白表达情况。结果:与空白组比较,甲醛染毒人BMSCs细胞数量明显减少,形态明显改变,APS40,100,400 mg·L-1作用后,细胞数量和形态均有所恢复。甲醛组微核形成及SCE发生频率较空白组显着升高（P <0. 01）,PCNA mRNA和蛋白表达明显降低（P <0. 05）,XPB,XPD,XPF和XPG mRNA和蛋白表达明显升高（P <0. 05,P <0. 01）;与甲醛组比较,APS 40,100,400 mg·L-1作用后,微核形成及SCE发生频率显着降低（P <0. 01）,PCNA,XPB,XPD,XPF和XPG mRNA和蛋白表达均明显升高（P <0. 05,P <0. 01）,其中APS 100 mg·L-1组效果最为明显。结论:APS可以保护甲醛染毒人BMSCs减少微核形成和SCE发生频率,100 mg·L-1APS保护作用最为明显,其机制可能与上调核苷酸切除修复通路PCNA,XPB,XPD,XPF和XPG基因表达,促进损伤修复有关。
王文娟,蔡小芳,唐洁,张喜荣,封棣[3]（2019）在《体外生物测定法在食品接触材料安全性评价中的应用研究进展》文中进行了进一步梳理体外生物测定法是利用酵母、细菌、细胞等进行的生物体外短期毒性实验,可以有效针对生物体某一特异性效应,评价测试物的危害性以及探索其毒性作用机制。由于体外生物测定法可以提供食品接触材料迁移物（混合物）整体实际危害的综合信息,因此,近年来被越来越多地应用于食品接触材料的危害评估,尤其集中在细胞毒性、遗传毒性和内分泌干扰这3类毒理学终点。本文重点综述了这3类体外生物测定方法的基本原理,以及近20年来其在食品接触材料提取物危害评价中的应用研究进展,以期为今后食品接触材料生物学安全性评价的相关研究提供理论参考。
边佩鲜[4]（2018）在《超小纳米团簇Au-MoS2对辐射氧化损伤的防护作用及辐射对RNAi NICD的MC3T3-E1细胞的影响》文中认为由于电离辐射产生许多活性氧,大量的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）如不能及时清除,就会攻击体内具有功能的生物大分子,如DNA、蛋白质和脂质,导致细胞产生氧化应激反应,使机体出现严重氧化损伤。因此,清除多余有害的ROS对辐射防护至关重要。近年来,催化纳米材料在抗氧化活性和辐射防护方面发挥了作用,且许多研究结果证明增强材料的催化性可以增强其辐射防护性能。事实上,近年来已经报道了许多掺杂金属原子增强材料催化活性的研究。据报道,Au-MnO2、Al2O3-Au、Au-Pt和Au-TiO2等杂化系统均显示出了催化活性的增强。先前研究发现,纳米材料MoS2具有一定的抗氧化性及辐射防护性。本研究采用溶剂热法,将纳米材料MoS2与金团簇进行杂交,形成具有更强催化活性的Au-MoS2。初步的电化学实验结果表明,与MoS2相比,Au-MoS2具有更强的催化H202分解的能力。进一步研究证明,相比MoS2,Au-MoS2具有更强清除辐射诱导产生ROS的性能。此外,与MoS2相比,Au-MoS2可以通过更显着提高DNA水平及增加股骨有核细胞的数量,从而更好保护对辐射高度敏感的骨髓造血系统产生的高能辐射损伤。这表明,催化材料Au-MoS2有望用于改善防治辐射诱导的损伤效应。利用RNA干扰抑制成骨细胞系MC3T3-E1细胞表达NICD的作用,探讨靶向抑制NICD表达对辐射损伤的MC3T3-E1细胞增殖和相关功能基因表达的影响。研究建立了抑制NICD表达的MC3T3-E1细胞株,利用RT-qPCR和Western Blot法检测其NICD的表达。MC3T3-E1细胞和NICD RNAi MC3T3-E1细胞经2 Gy照射后,用BrdU掺入法和RT-qPCR法检测这些细胞的增殖及相关功能基因表达。结果表明,RNAi技术可以靶向抑制MC3T3-E1细胞表达NICD,抑制NICD表达可干扰前体成骨细胞和成骨细胞的增殖。2 Gy照射后,前体成骨细胞和成骨细胞以及NICD RNAi的成骨细胞的增殖明显下降,各靶细胞的相关功能基因变化如下:①2 Gy辐照的前体成骨细胞Runx2表达上调,NICD RNAi的前体成骨细胞Runx2表达下调。②2 Gy辐照的前体成骨细胞和成骨细胞以及NICD RNAi的前体成骨细胞ALP表达上调,NICD RNAi的成骨细胞ALP表达下调。③2 Gy照射使前体成骨细胞RANKL表达下调,成骨细胞RANKL表达上调,而抑制NICD表达则发生相反变化。④2 Gy照射的前体成骨细胞和成骨细胞OPG表达下调,抑制NICD表达使前体成骨细胞OPG表达上调,成骨细胞OPG表达下调。⑤2 Gy照射使各靶细胞M-CSF表达变化趋势与RANKL表达变化情况一致。综上所述,在不同阶段的成骨细胞中抑制NICD表达对辐射损伤表现出的作用是不同的。抑制NICD表达:①可降低前体成骨细胞和成骨细胞的增殖,对辐射损伤后的前体成骨细胞的增殖有保护作用;②可通过调节Runx2从而明显抑制辐照后前体成骨细胞分化,减少骨质丢失;③辐照后各成骨细胞不会通过RANKL/OPG/RANK系统表现出对破骨细胞功能的调节作用;④成骨细胞经过调节M-CSF表现出对破骨细胞的功能抑制作用。
夏文龙[5]（2017）在《小鼠胚胎阶段大脑皮层神经发生过程的研究》文中指出在生命发育的过程中,中枢神经系统的正常有序的构建是形成高级生命所必须的[1-3]。以小鼠为模型,在胚胎时期,位于大脑皮层内侧侧脑室周围区域的神经干细胞通过不断的增殖,分化,迁移等过程以“inside-to-outside”的方式形成了包含6层不同类型神经元结构的高度复杂的初级大脑结构[4]。神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）被定义为能够生成神经组织或者是来源于神经系统中,可以自我更新的多能性干细胞,其在胚胎发育过程中产生多种类型的神经元和神经胶质细胞[5]。一些神经干细胞在成年脊椎动物的大脑中持续存在,在整个生命进程中持续产生新生的神经元[6]。干细胞区别于其他成体细胞的特征在于其分化成多种细胞类型的能力。干细胞经历对称或不对称细胞分裂成两个子细胞。在对称细胞分裂中,两个子细胞也是干细胞。在不对称分裂中,干细胞产生一个干细胞和一个走向分化方向的细胞。在发育的过程中,神经干细胞主要分化为神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。具体而言,在小鼠胚胎发育时期,神经干细胞主要位于皮层区域两个发生区域,侧脑室区域（Ventricular zone,VZ）和侧脑室下区域（Subventricular zone, SVZ）,而且处于不同位置的神经干细胞的种类是不一样的[7]。在侧脑室区域的放射状胶质细胞（Radial glial cells, RGs）通过对称分裂完成神经干细胞的自我更新,形成新的子代RGs,或者通过不对称分裂形成神经系统的中间祖细胞（Intermediate Progenitor cells,IPs）细胞:位于侧脑室下区域的IPs细胞通过对称分裂形成神经元,这些神经元沿着RG细胞的放射状突起不断地向上迁移成熟到达特定的区域形成完整的大脑皮层[8]。在这一系列的变化过程中,不同的转录因子按照时间和空间的先后顺序不断地激活（Pax6-Tbr2-Tbr 1 -Cux 1 -Satb2）,精确地调控神经干细胞的命运[9,10]。大脑皮层构建过程中的任何一个步骤发生问题都会导致严重的发育疾病,比如精神分裂症[11],自闭症[12]等。但是,目前我们对于神经干细胞增殖,分化,迁移的深入机制还不十分清楚,需要进一步地探究。在胚胎大脑皮层发育的过程中,各种形式的表观遗传调控发挥着重要的功能,比如组蛋白的甲基化[13],乙酰化[14],磷酸化[15]; DNA的甲基化[16];microRNA等等。在这些表观遗传修饰中,组蛋白变异体是一个很大的家族,包含H2A.Z,H2A.X, macroH2A,H3.3[17-19]等。在我们实验体系中,我们重点关注了 H3.3这种非常关键的组蛋白变异体[20]对神经发生过程的影响。真核生物的核小体由不同种类的组蛋白构成,包含H1,H2A,H2B, H3和H4[21]。在基因转录激活或是抑制的过程中核小体中的组蛋白构成会发生变化,比如在转录活化时,H2A.Z和H3.3会替换到核小体内,形成一种染色体活化的标志物,影响蛋白和DNA在染色质水平的可接近性,从而促进转录的进行[22]。组蛋白变异体在基因组中的特定区域发挥对基因的表达的调控功能[23,24]。对这些复杂的有组蛋白变异体参与的转录调控的研究有助于我们更深入了解基因的表达过程。同时,将对组蛋白变异体的探索引入到胚胎早期神经干细胞相关的研究中,可以帮助我们从一个新的角度揭示它们在发育过程中的重要作用。以往的研究表明H3.3可以通过替换H3来调控基因的转录[25],这时染色体处于一种转录活性状态。H3.3上包含丰富的表观遗传修饰位点,可以发生不同的表观遗传修饰,进一步调控不同生命发育过程[26]。在我们的研究结果表明H3.3在胚胎早期神经干细胞中有表达:在体内和体外,H3.3都会和神经干细胞的标志物共标,而且H3.3的表达在时间和位置上有一定的特异性。进一步体内胚胎电转的实验结果表明,H3.3敲降后会导致神经干细胞增殖的比例减少,分化的神经元的比例增加。通过进一步的探索,我们发现H3.3的减少会导致另一种组蛋白修饰H4K16ac的减少,而这是因为H3.3表达量的降低会减少其对H4K16位点特异性乙酰化转移酶的招募,从而降低了 H4K16ac的水平并且影响了基因的转录活化。这提示我们在神经干细胞发育的过程中H3.3和H4K16ac这两种组蛋白密码相互协同,调控神经干细胞的命运。通过转录组测序,我们发现在H3.3敲降影响了大量神经发生相关的生物过程。进一步分析数据后我们发现,GLI（GLI-Kruppel）家族的所有基因都是降低的,而其中GLI1减少的最多。通过进一步的Western和小鼠体内胚胎电转的实验证明GLI1是H3.3的下游基因,其在神经干细胞增殖分化的过程中发挥重要的功能。在大脑皮层发育的过程中谷氨酸是一种必不可少的氨基酸[27],发挥着重要的生物学功能[28]。在哺乳动物体内,谷氨酸的受体分为离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体[29]。代谢型谷氨酸受体被报道与神经疾病相关,是一些神经疾病的靶点,可以调控神经递质的释放和神经元的兴奋性[30]。不同的代谢型的谷氨酸受体主要因为其蛋白序列,功能,配体的不同被区分为3类。其中包括 Ⅰ （GRM1 and GRM5）,Ⅱ（GRM2 and GRM3）,和 Ⅲ （GRM4,GRM6,GRM7, and GRM8）。在分析了以往的报道后,我们发现代谢型谷氨酸受体7（GRM7）作为一种仅在神经元突触前膜上特异性表达的G蛋白偶联受体,在接收到谷氨酸的刺激时会产生抑制性的作用。而且有报道称GRM7可能与新生儿自闭症（Autism Spectrum,ASD ）和注意力缺陷（Attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）相关。但是GRM7是否会影响胚胎时期大脑皮层的发育还是未知的。在我们的实验中,我们通过在胎鼠大脑皮层内过表达和敲降GRM7的方法来研究GRM7在神经干细胞发育过程中的重要作用。结果发现,GRM7在神经干细胞中有表达:在体内或体外的染色结果都表明GRM7和神经干细胞的标志物共标,而且GRM7在不同发育时期的表达是动态的。进一步体内胚胎电转的实验结果表明,GRM7敲降会导致神经干细胞增殖的比例增加,而神经元分化的比例减少,而且神经元的形态发育也会受到影响。在机制上的研究表明,在GRM7 的表达受到影响后会改变 CREB （cAMP Responsive Element Binding Protein）蛋白的磷酸化水平,而p-CREB作为一种转录调控因子会影响下游基因的表达。后续的实验证明YAP （Yes Associated Protein）作为GRM7和p-CREB的下游发挥调控神经干细胞增殖和分化的功能。
彭瑾[6]（2018）在《三阴性乳腺癌细胞必需基因的筛选与机制探究》文中指出三阴性乳腺癌（TNBC,ER-/PR-/HER2-）恶性程度高,预后差,内分泌治疗及针对HER2的靶向治疗均不适合于这一亚群,因此化疗是目前针对三阴性乳腺癌唯一标准化的治疗方案,其精确的靶向治疗手段亟待开发。蛋白泛素化修饰在各种细胞生命过程,如细胞周期,细胞凋亡,受体下调以及基因转录中都具有重要调控作用。近些年来,探究肿瘤发生发展过程中泛素作用的分子机制研究也层出不穷,多个泛素系统成员与肿瘤之间的联系也逐步被揭示出来,并成为肿瘤潜在的治疗靶标。在本文的研究中,我们将近来发展迅猛的CRISPR/Cas9技术与文库筛选技术相结合,用于探寻三阴性乳腺癌细胞生长所必需的泛素修饰系统基因,一来以加深对泛素化修饰在三阴性乳腺癌发生发展中的作用研究,二来寻找三阴性乳腺癌新的治疗靶标。我们成功鉴定到了多种三阴性乳腺癌增殖必需基因,包括去泛素化酶USP28,以及凋亡相关基因BIRC6等,并选择去泛素酶USP28作为进一步研究的对象。免疫组化实验结果分析显示USP28在三阴性乳腺癌中高表达,USP28蛋白水平敲低能显着抑制多种类型三阴性乳腺癌细胞生长。分子机制研究发现USP28能够调节DNA解旋酶RecQL5的蛋白稳定性,而RecQL5蛋白敲低影响三阴性乳腺癌细胞的基因组稳定性,进而抑制细胞的增殖。我们的研究结果表明去泛素酶USP28以及DNA解旋酶RecQL5为三阴性乳腺癌细胞增殖所必需,是三阴性乳腺癌潜在的治疗靶标。
田玉华[7]（2017）在《miR-31在小肠干细胞、上皮再生和肿瘤发生中的功能与机制研究》文中指出肠道是哺乳动物主要的消化和营养物质吸收器官。肠道上皮具有快速自我更新的特征,而位于隐窝基部的肠道干细胞则是上皮细胞更新的动力源泉,因此肠道成为研究成体干细胞的理想模型之一。小肠干细胞通过快速的自我更新与分化保证了营养物质的正常吸收,同时在肠上皮损伤情况下也能够使损伤的上皮得到快速修复,而肠道干细胞的异常活化也是引发结直肠癌的重要因素。因此,研究肠道干细胞自我更新、增殖的分子机制对深入认识肠道上皮的稳态平衡、肠上皮损伤后修复和肠道肿瘤发生的机理具有重要的科学意义和潜在应用价值。肠道干细胞包含位于隐窝基底部的Lgr5+活跃态干细胞和位于+4位置的Hopx+静息态干细胞。肠道干细胞的自我更新及增殖受多种因素的调控,其中miRNAs（miRNAs）是一类20-24个核苷酸大小的非编码RNA,通过与靶基因的3’-UTR 区结合从而抑制靶基因的转录或翻译。MiRNA-31（miR-31）作为非编码RNA中的一员,在包括肌肉、间充质干细胞等多种成体干细胞的命运决定和状态维持以及肿瘤发生中均发挥重要调节作用,尤其在大部分肠炎及结肠癌患者中miR-31的表达异常高于正常组织。但是,目前关于miR-31与肠道干细胞的研究仍未见报道。因此,本课题旨在研究和探讨miR-31在肠道干细胞、肠上皮损伤修复和肠道肿瘤发生发展中的功能和作用机制。本研究首先利用 Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2和HOPX-CreERT2;Rosa26mTmG转基因小鼠,通过流式分选和qRT-PCR技术发现,miR-31在Lgr5+干细胞和+4位置Hopx+静息态干细胞中的表达相对较高。与正常肠道组织相比,12 Gy电离辐照处理和葡萄糖硫酸钠（DSS）诱导均能导致miR-31的表达水平显着上调。这些结果预示miR-31可能参与肠道干细胞的维持及肠道损伤修复过程。为了进一步研究miR-31的功能,本课题利用Tet-On、Cre-loxP系统及Case9技术分别构建了 Dox（Doxycycline）可诱导的 全身过表达小鼠（TRE-miR31）、miR-31全身敲除小鼠miR-31-/-及肠道上皮特异性敲除miR-31的条件敲除小鼠Vilin-Cre;miR-31fl/fl（cKO）。过表达miR-31引起小肠隐窝高度增加,增殖细胞数量增多,Lgr5+干细胞比例上调,数量显着增多。而全身敲除和条件性敲除miR-31后的小鼠表型与之相反,表现为细胞增殖受到抑制,Lgr5+干细胞数量减少,隐窝基部凋亡的Lgr5+细胞增多,表明在稳态情况下miR-31可以促进活跃态干细胞的增殖。当小肠受到电离辐照损伤后,miR-31过表达抑制隐窝基部Lgr5+干细胞的凋亡、促进新生隐窝的再生和增殖,加快损伤上皮的修复过程,显示其具有抗辐射的功能。同样在DSS诱导的肠炎模型中,miR-31能够减缓炎症造成的小鼠体重下降和生存率降低,同时加快损伤肠道的修复过程。这些结果表明当肠道处于压力条件下,miR-31在肠道上皮的损伤修复过程中发挥重要作用。在肠道肿瘤模型相关研究中,异种移植结果显示miR-31能够促进人结肠癌细胞（HCT116）成瘤生长;AOM/DSS诱导的结肠肿瘤模型中,miR-31-/-小鼠结肠远端肿瘤数量减少,体积减小;Villin-Cre;APC+/fl的肿瘤模型中,miR-31-/-小鼠小肠肿瘤的数量和体积也明显下降,这些结果表明在肠道中,miR-31作为促癌因子能够促进肿瘤的生长,从而使其可能成为治疗肠道肿瘤的潜在靶点。在分子机制上,通过双荧光素酶活性检测和CLIP-qPCR等实验证实miR-31通过直接靶向结合Dkk1、Axin1、Gsk3β而激活Wnt信号通路,同时通过靶向结合Smad3、Bmpr1a和Smad4抑制BMP/TGFβ信号通路活性,从而促进活跃态干细胞的增殖、静息态干细胞的激活和肿瘤的发展过程。而且.,本研究还发现miR-31能够通过调控Gsk3β和p38抑制干细胞细胞的凋亡过程。在miR-31上游调控机制上,辐照和DSS诱导激活了 STAT3和NF-tκB信号通路。ChIP-qPCR结果进一步证实p-Stat3和p65能够与miR-31的启动子区直接结合从而上调miR-31的表达。综上所述,本研究主要发现包括:1)发现miR-31是内源性的小肠干细胞激活信号,通过激活Wnt和抑制BMP/TGFβ促进干细胞增殖,通过抑制Gsk3β和p38保护小肠干细胞免于凋亡。2)在小肠上皮再生过程中,miR-31首先保护小肠干细胞免于凋亡,然后通过抑制BMP/TGFβ、激活Wnt信号促进存活的小肠干细胞进行快速增殖。3)鉴定出miR-31作为促癌基因,通过Stat3-miR-31-Wnt/BMP/TGFβ信号通路促进结肠癌发生发展。4)首次阐明了某种特异miRNA在小肠干细胞中的生理功能。因此,本研究表明miR-31是小肠干细胞的一个主要调节因子,同时也是肠道上皮再生紊乱、肿瘤等多种肠道疾病治疗的潜在靶标。
舍雅莉[8]（2014）在《甲醛对BM-MSCs的毒性作用及相关机制研究》文中研究说明研究背景和目的：甲醛（formaldehyde）是A1类致癌物质，可以导致白血病的发生，但是生物学证据不足。已有研究证实甲醛对骨髓中的造血干细胞具有毒性影响，然而对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）的毒性作用，还未见报道。BM-MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞，不仅具有多向分化潜能，还能调节造血干细胞的正常增殖和分化。因此，BM-MSCs一旦受损，就会影响骨髓的正常造血，从而导致白血病的发生。本研究检测甲醛对BM-MSCs的细胞毒性、遗传毒性、细胞周期和凋亡影响，并试图阐明其分子机制，从而为甲醛导致白血病的发生提供生物学依据。方法：本研究采用噻唑蓝比色法[3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-2-y1）-2,5-diphenytetrazo-liumromide, MTT]研究甲醛对BM-MSCs的增殖活性影响；用彗星（comet assay）、KCl-SDS沉淀、姐妹染色单体互换（Sister chromatid exchange,SCE）、微核（Micronucleus, MN）实验检测甲醛对BM-MSCs的DNA损伤效应；并应用RT2profiler PCR array分析DNA损伤信号通路重要基因的表达改变情况；采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察鬼笔环肽（phalloidine）/hoechst33258双染细胞的结果，分析甲醛对BM-MSCs细胞周期和凋亡的影响，并用蛋白免疫印迹（westernblot）法检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达情况。结果：（1）75200μmol/L甲醛可以抑制BM-MSCs的增殖（P<0.01），并呈剂量依赖关系，而无明显的时间依赖关系。（2）标准的碱性彗星实验结果显示，75200μmol/L甲醛诱导BM-MSCsDNA断裂效应呈现先增高后降低趋势，在125μmol/L时，达到峰值，其中75150μmol/L甲醛作用与对照组比有统计学意义（P<0.01）；蛋白酶K修饰的彗星实验结果显示，75200μmol/L甲醛诱导DNA断裂效应逐渐上升呈剂量依赖关系（P<0.01）。另外，蛋白酶K修饰的彗星实验OTM值比标准彗星实验的OTM值高，且在大于125μmol/L时，差异具有统计学意义（P<0.01）。（3）甲醛在≥125μmol/L时可以明显引起BM-MSCs DNA-蛋白交联（DNA-protein crosslinks, DPCs）、SCE，在≥150μmol/L时可以明显引起MN的形成，与对照组相比，P值均<0.01。（4）NER修复通路上的Xpa和Xpc，HR修复通路上的Brca2，Rad51和Xrcc2基因在75和125μmol/L甲醛作用时，与对照组相比，表达上调2倍以上，然而这些基因在175μmol/L甲醛作用时表达却均下调2倍以上。还有细胞周期调控基因Chk1和Hus1在75，125和175μmol/L甲醛作用时表达一致，均上调超过2倍。（5）随着甲醛浓度的增高，G2期细胞百分数逐渐增加，在≥125μmol/L时，与对照组相比，有统计学意义（P<0.01）。（6）随着甲醛浓度的增高，BM-MSCs细胞体积逐渐缩小，细胞骨架排列出现紊乱，细胞核浓缩、深染并出现分裂，形成凋亡小体，在≥125μmol/L时，凋亡率明显增高（P<0.01）。（7）P53、ERK1/2蛋白在75，125，175μmol/L甲醛作用时，相对光密度值与对照组相比无明显差别（P>0.05）； p-P53、Chk1和Bax蛋白在75，125，175μmol/L甲醛作用时，相对光密度值呈逐渐升高趋势，且与对照组相比有显着差别（P<0.05）；p-ERK1/2蛋白在75，125，175μmol/L甲醛作用时，Bcl-2蛋白在125，175μmol/L甲醛作用时，相对光密度值呈下降趋势，与对照组比差异有统计学意义（P<0.05）。结论：（1）甲醛对BM-MSCs具有细胞毒性和遗传毒性，为研究甲醛导致白血病的发生提供了生物学依据。（2）甲醛可以诱导BM-MSCs DNA链发生断裂，并且呈剂量依赖关系；还可以诱导DPCs、SCE、MN的形成。（3）甲醛使BM-MSCs细胞周期阻滞在G2期；并在较高浓度时（≥125μmol/L）引起BM-MSCs凋亡。（4）NER通路上的Xpa，Xpc；HR通路上的Brca2，Rad51，Xrcc2可能参与了甲醛诱导的BM-MSCs DNA损伤的修复。（5）P53、Chk1、ERK1/2、Bax和Bcl-2共同参与了甲醛诱导BM-MSCs的G2期周期阻滞和细胞凋亡。（6）蛋白酶K修饰的彗星实验可作为一种更为敏感的方法来检测甲醛导致的DNA链断裂效应。
刘金祥[9]（2014）在《液态介质中溶剂化电子动力学行为的理论模拟研究》文中研究指明体相液体介质中过剩电子的溶剂化动力学及其化学反应活性的研究涉及到物理、化学和生命科学等领域的众多基本现象,因此一直以来备受关注。在液态环境中,溶剂分子局部空间结构的调整,可以稳定溶剂化电子的结构,从而实现溶剂化电子的定域化。定域态的溶剂化电子在生物化学反应和大气化学领域发挥了重要的作用。因此,人们对溶剂化电子进行了大量的研究,并取得了许多阶段性的成果。但是,目前还不能详细揭示溶剂化电子参与物理化学过程的微观信息,认识上存在一定的不足。在本文工作中,我们采用从头算分子动力学模拟的方法研究了几种液态介质中有关的溶剂化电子问题,并详细讨论了溶剂化电子的结构形态、动力学演化及其反应活性等问题。主要的结论及创新点简述如下：1)液态水环境中存在着诸多溶剂化电子现象,因此表征溶剂化电子的结构以及阐述电子的状态和时间演化动力学非常重要。从头算分子动力学模拟的研究结果表明葡萄糖水溶液中的过剩电子比纯水溶液中的过剩电子更能肴效地形成空腔笼定域态。与纯水溶液中的定域时间（-1.5ps）相比,0.56M、1.12M和2.87M三种葡萄糖溶液中过剩电子的定域时间缩短为～0.7-1.2ps。虽然过剩电子回旋半径的平均值均为2.6A,但是葡萄糖溶液中80%的过剩电子定域在空腔中,而水溶液中空腔笼内只分布了～40-60%过剩电子,偶尔会达到80%。这是由于葡萄糖分子改变了溶液中的氢键网络结构,产生了较多的空腔,从而促进了电子的定域过程,并稳定了定域态结构。该工作揭示了葡萄糖生理介质中溶剂化电子的详细信息,并为实现溶剂化电子的快速定域化和探索有关的生命过程提供了重要的理论支撑。2)常温碱基水溶液和玻璃态碱基水溶液中过剩电子定域过程的从头算分子动力学模拟研究。在常温碱基溶液中,过剩电子向T、C、A和G碱基分子的定域时间分别为0、160fs、600fs和900fs,并形成T和C-共价阴离子以及Aδ-和Gδ-类共价阴离子；而在玻璃态温度下定域过程有不同程度的延缓。结果表明过剩电子的定域过程主要受碱基的亲电子能力控制,并受溶剂的热涨落影响。该工作阐述了水溶液环境中过剩电子向碱基定域的动力学过程,为探索生物体低温抗辐射机理提供一定的借鉴。3)从头算分子动力学模拟研究过剩电子诱发的辐射敏感药物5-卤化尿嘧啶核苷分子的去卤化反应机理。在水溶液环境中,预溶剂化态的过剩电子可以定域在卤化尿嘧啶核苷分子上,形成共价阴离子。FdU-和CldU-阴离子在动力学过程中稳定存在,而BrdU-和IdU-阴离子解离成（Xδ-…dUδ-）态。X-C5键长的势能面扫描结果表明IdU为最有效的辐射敏感剂。该研究表明卤化尿嘧啶核苷的辐射敏感机制为xdU-→（Xδ-...dUδ-）→X-+dU·,这为揭示放射治疗过程辐射敏感药物增强DNA损伤和癌细胞的死亡机理有重要意义。4)采用从头算分子动力学模拟研究乙腈溶液中过剩电子的溶剂化动力学行为,并观测到了四种溶剂化态：弥散态、单核心定域态、类双核心定域态和双核心定域态。三种核心定域态中只有部分过剩电子定域在核心分子上,因此没有形成阴离子结构。类双核心定域态中,过剩电子被一个乙腈分子的π*轨道和另一个乙腈分子的里德堡轨道共同束缚。在5-10ps的动力学演化过程中,我们没有观测到标准的二聚体阴离子态和空腔笼溶剂化态,主要是由于两种溶剂化结构的形成需要很长的时间。电子云体积演化和垂直电子解离能演化表明动力学过程由呼吸振动周期和核转移过程构成,并由类双核心定域态和弥散态主导,单核和双核定域态在核转移过程中出现；动力学过程主要由核心乙腈分子的弯曲振动和溶剂涨落控制。5)从头算分子动力学模拟研究单重态双电子和三重态双电子在氯化吡啶离子液中的溶剂化动力学。与水和液氨溶液不同,离子液体中的双电子没有形成空腔笼结构,而是分布在多个阳离子上。动力学结果表明双电子在演化过程中以弥散态为主,定域态的寿命较短；三重态为能量的基态,单重态为能量稍高的激发态；双电子非同步地进行演化,并伴有弥散态和定域态之间的转变,表现出动态双极子的特征。该工作首次详细揭示了离子液体中双电子的结构及其动力学演化过程。
衣昕[10]（2014）在《成年大鼠创伤性脑损伤后的皮质与海马内源性神经发生研究》文中认为第一部分成年大鼠创伤性脑损伤后皮质的内源性神经发生目的：探讨成年大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）后大脑皮质内源性的神经发生及其影响因素。方法：Ⅰ、体内实验1. SD大鼠分为假手术（SHAM）组和TBI组，SHAM组大鼠只开颅，不制备脑损伤模型；TBI组大鼠采用颅脑液压损伤装置，制备创伤性脑损伤模型。2. SD大鼠TBI后连续7d腹腔注射BrdU以标记新生的神经细胞。3. TBI后1、3、7、14、28d应用免疫荧光法检测大鼠损伤区皮质nestin+/sox-2+神经前体细胞（neural progenitor cells, NPCs）、GFAP+/sox-2+放射状胶质样细胞、DCX+/BrdU+神经元前体细胞、MAP-2+/BrdU+新生神经元、NeuN+/BrdU+新生成熟神经元、GFAP+/BrdU+新生星形胶质细胞、CNP+/BrdU+新生少突胶质细胞的发生情况。4. TBI后1、3、7、14、28d应用TUNEL/BrdU双标记技术检测大鼠损伤区皮质新生细胞的凋亡情况。5. TBI后1、3、7、14、28d应用ELISA法检测大鼠损伤区皮质基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1, SDF-1）的表达水平。6. TBI后1、3、7、14、28d应用高效液相色谱法（high performance liquidchromatography, HPLC）检测大鼠脑脊液中谷氨酸含量。Ⅱ、体外实验1.分离培养大鼠TBI后损伤区皮质内源性NSCs（neural stem cells, NSCs）并进行鉴定，BrdU/Nestin免疫荧光检测其胚源性及增殖能力，MAP-2、GFAP、CNP免疫荧光检测其多向分化潜能。2.传至第二代的NSCs行谷氨酸受体NMDA主要功能亚基NR1免疫荧光标记，流式细胞分析NR1阳性细胞百分比。3.传至第二代的NSCs分空白对照组（Control）、谷氨酸组（Glu）、Glu+MK-801（0h）组、Glu+MK-801（24h）组4组分化培养：Control组用DMEM/F12无血清培养基培养；Glu组在DMEM/F12无血清培养基中加入谷氨酸（5μM）培养；Glu+MK-801（0h）组在DMEM/F12无血清培养基中加入谷氨酸（5μM）培养同时加入NMDA受体拮抗剂MK-801（10μM）；Glu+MK-801（24h）组在DMEM/F12无血清培养基中加入谷氨酸（5μM）培养24h后加MK-801（10μM）继续培养；培养1、3、7、14d后行DCX、MAP-2免疫荧光检测NSCs向神经元分化情况，TUNEL法检测细胞凋亡情况。4. Control组、Glu+MK-801（24h）组培养1、3、7、14d后，应用实时PCR检测NR1的mRNA表达情况，Western blot检测NR1的蛋白表达情况。5.传至第二代的NSCs接种于Transwell培养体系的上室，分为空白对照（Control）组、TBI脑组织提取液（Extract）组、SDF-1组3组培养：Control组下室加入DMEM/F12无血清培养基；Extract组下室加入含有20μl/ml TBI脑损伤组织提取液的DMEM/F12无血清培养基；SDF-1组下室加入含有200ng/ml SDF-1的DMEM/F12无血清培养基。培养3d后行Hoechst33342染色检测细胞迁移情况，免疫荧光技术检测迁移细胞的趋化因子受体4（chemokine receptor4, CXCR4）表达情况。结果：Ⅰ、体内实验1.免疫荧光技术检测损伤区皮质神经发生结果：TBI后1、3、7、14d损伤区周围皮质出现nestin+/sox-2+NPCs以及GFAP+/sox-2+放射状胶质样细胞，并在3d时达到高峰而后下降，在相应时间点GFAP+/sox-2+放射状胶质样细胞数量少于nestin+/sox-2+NPCs。伤后1、3、7d观察到nestin+/sox-2+NPCs从室周带后区（posteriorperiventricular area, PPv）沿胼胝体向损伤区迁移；伤后3、7、14d损伤区皮质观察到DCX+/BrdU+神经元前体细胞，7d时达到高峰而后下降；仅在TBI后7、14d损伤区皮质观察到少量的MAP-2+/BrdU+新生神经元，在TBI后1、3、7、14、28d损伤区皮质均未观察到NeuN+/BrdU+新生成熟神经元；TBI后1、3、7、14、28d损伤区皮质均观察到GFAP+/BrdU+新生星形胶质细胞，7d时达到高峰并一直保持在较高水平；TBI后1、3、7、14、28d损伤区皮质均未观察到CNP+/BrdU+新生少突胶质细胞；在相应时间点，BrdU+细胞中星形胶质细胞多于NPCs和新生神经元。2. TUNEL/BrdU双标记技术检测新生细胞的凋亡结果：TBI后1、3、7、14d损伤区周围皮质出现TUNEL+/BrdU+凋亡的新生细胞，TBI后7、14d时凋亡的新生细胞数量多于伤后1、3d，高峰在伤后7d，28d时几乎未见凋亡的新生细胞。3. ELISA法检测损伤区皮质SDF-1的表达水平结果：TBI后1d大鼠损伤区皮质SDF-1表达开始升高，3d时达到高峰，而后逐渐下降，14、28d时已接近SHAM组水平。4. HPLC检测脑脊液谷氨酸含量水平结果：TBI组大鼠脑脊液内谷氨酸的含量伤后1d即达到高峰，而后逐渐下降，14d时已接近SHAM组水平。Ⅱ、体外实验1.成年大鼠TBI后损伤区皮质内源性NSCs鉴定结果：损伤区皮质内分离培养出NSCs球为BrdU+/Nestin+，并能扩增传代，可以分化为MAP-2+神经元、GFAP+星形胶质细胞以及CNP+少突胶质细胞。2.流式细胞分析NSCs的NR1表达结果：成年大鼠TBI后损伤区皮质内源性NSCs中，43±1.06%细胞的谷氨酸受体NMDA主要功能亚基NR1阳性。3.谷氨酸对NSCs向神经元分化影响结果：培养1d时Glu组、Glu+MK-801（24h）组的DCX+神经元前体细胞明显多于Control、Glu+MK-801（0h）组；3d时Glu+MK-801（24h）组DCX+神经元前体细胞最多，Glu组DCX+神经元前体细胞数量有所下降，但多于Control、Glu+MK-801（0h）组；至7d时Glu+MK-801（24h）组DCX+神经元前体细胞仍较多，Glu组DCX+神经元前体细胞与Control、Glu+MK-801（0h）组比较差异无统计学意义；14d时4组几乎未见DCX+神经元前体细胞，MAP-2免疫荧光检测显示Glu+MK-801（24h）组MAP-2+神经元明显多于其它3组；TUNEL法检测结果显示，体外培养1d后,4组可见少量凋亡细胞，3、7、14d时Control、Glu+MK-801（0h）、Glu+MK-801（24h）组凋亡细胞数量与1d时比较几乎无变化，而Glu组TUNEL+凋亡细胞数量3d时达到高峰，7d、14d时略有下降但多于其它3组。4.实时PCR检测NR1的mRNA表达情况结果：Glu+MK-801（24h）组NR1的mRNA相对表达量呈逐渐升高趋势，7d时达到高峰，除7、14d外，其它时间点两两比较差异有统计学意义；Control组NR1的mRNA相对表达量较低，各时间点差异无统计学意义；在相应时间点Glu+MK-801（24h）组NR1的mRNA相对表达量均高于Control组，差异均有统计学意义。5. Western blot检测NR1的蛋白表达情况结果：Glu+MK-801（24h）组NR1的蛋白相对表达量呈逐渐升高趋势，7d时达到高峰，除7、14d外，其它时间点两两比较差异有统计学意义；Control组NR1的蛋白相对表达量较低，各时间点差异无统计学意义；在相应时间点Glu+MK-801（24h）组NR1的蛋白相对表达量均高于Control组，差异均有统计学意义。6. Transwell迁移实验检测脑损伤组织提取液及SDF-1对细胞迁移影响的结果：Extract组和SDF-1组迁移的细胞数量明显高于Control组，差异有统计学意义；Extract组和SDF-1组迁移的细胞数量差异无统计学意义；3组迁移的细胞大部分呈现CXCR4阳性。结论：成年SD大鼠TBI后，损伤区皮质内出现NPCs，其一部分来源于局部激活的放射状胶质样细胞，也有部分从PPv区沿胼胝体迁移而来，TBI后损伤区内高表达的SDF-1对其迁移起到了一定的作用；这些NPCs能够向神经元及星形胶质细胞分化，但前者未能最终发育为成熟的神经元，伤后损伤区内谷氨酸表达水平的增高既可以促进NPCs向神经元分化，但也可以促进分化过程中的神经元凋亡，后者与神经元在发育过程中NMDA受体表达的逐渐升高有关。第二部分奥拉西坦对成年大鼠创伤性脑损伤后海马内源性神经发生的影响目的：探讨奥拉西坦对成年大鼠TBI后海马内源性神经发生的影响及其机制。方法：Ⅰ、体内实验:1.经水迷宫训练筛选出达标大鼠，分为空白对照组（Control）、生理盐水组（NS）、奥拉西坦组（Oxiracetam）3组：Control组只开颅，不制备脑损伤模型；NS组采用颅脑液压损伤装置制备TBI模型，TBI后连续14d定时每天一次尾静脉注射无菌生理盐水1ml；Oxiracetam组采用颅脑液压损伤装置制备TBI模型，TBI后连续14d定时每天一次尾静脉注射含有奥拉西坦（200mg/kg）的无菌生理盐水1ml。2. TBI后第15d进行连续4d的定位巡航试验，第19d进行空间探索试验；3. TBI后第20d应用DCX免疫荧光检测海马新生神经元情况，ChAT免疫荧光检测隔区及Meynert基底核胆碱能神经元情况。4. TBI后第20d应用ATP检测试剂盒检测海马ATP含量。5. TBI后第20d应用ELISA法检测海马乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）含量。Ⅱ、体外实验：1.从大鼠胚脑海马中分离培养NSCs并进行扩增，将传至第二代的NSCs接种于包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板内，分为空白对照组（Control）、生理盐水组（NS）、奥拉西坦组（Oxiracetam）3组： Control组加入DMEM/F12无血清培养基培养；NS组加入含有10μl/ml生理盐水的DMEM/F12无血清培养基培养；Oxiracetam组加入含有4mg/ml奥拉西坦的DMEM/F12无血清培养基培养，培养3d后行DCX免疫荧光检测NSCs向神经元分化情况,并收集细胞应用ATP检测试剂盒检测细胞内ATP含量。2.取大鼠胚基底前脑原基制成单细胞悬液，在Transwell培养体系中分为空白对照组（Control）、胆碱能神经元组（Cholinergic neuron）、生理盐水+胆碱能神经元组（NS+Cholinergic neuron）、奥拉西坦+胆碱能神经元组（Oxiracetam+Cholinergicneuron）培养： Control组下室不接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液，只加入DMEM/F12无血清培养基；Cholinergic neuron组下室接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液并加入DMEM/F12无血清培养基培养；NS+Cholinergic neuron组下室接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液并加入含10μl/ml生理盐水的DMEM/F12无血清培养基培养；Oxiracetam+Cholinergic neuron组下室接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液并加入含有4mg/ml奥拉西坦的DMEM/F12无血清培养基培养；将从大鼠胚脑海马中分离扩增的NSCs接种于Transwell培养体系的上室，共培养3d后，行ChAT免疫荧光检测下室胆碱能神经元分化情况、DCX免疫荧光检测上室海马NSCs向神经元分化情况，收集各组培养液用ELISA法检测ACh含量。3.取大鼠胚基底前脑原基制成单细胞悬液，接种于包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板内，分为空白对照组（Control）、生理盐水+TBI脑组织提取液组（NS+Extract）、奥拉西坦+TBI脑组织提取液组（Oxiracetam+Extract），开始各组均用DMEM/F12无血清培养基培养。第4d换培养液时，Control组继续加入DMEM/F12无血清培养基；NS组加入含有20μl/ml脑损伤皮质提取液、10μl/ml生理盐水的DMEM/F12无血清培养基；Oxiracetam+Extract组加入含有20μl/ml脑损伤皮质提取液及4mg/ml奥拉西坦的DMEM/F12无血清培养基，再培养3d，然后行TUNEL法检测凋亡细胞。结果：Ⅰ、体内实验1.定位巡航试验结果：Oxiracetam组和Control组大鼠逃避潜伏期少于NS组，差异有统计学意义。2.空间探索试验结果：Oxiracetam组和Control组大鼠平台跨越次数高于NS组，差异有统计学意义。3. DCX免疫荧光检测海马齿状回神经元前体细胞结果：Oxiracetam组损伤侧齿状回内DCX+神经元前体细胞最多，NS组次之，Control组仅见到少量的DCX+的神经元前体细胞，差异有统计学意义。4. ChAT免疫荧光检测隔区及Meynert基底核胆碱能神经元结果： Control组可见到较多的ChAT+胆碱能神经元，Oxiracetam组损伤侧隔区及Meynert基底核ChAT+胆碱能神经元虽有减少但多于NS组，差异有统计学意义。5.海马ACh含量检测结果：Oxiracetam组海马ACh含量低于Control组，但高于NS组，差异有统计学意义。6.海马ATP含量检测结果：Oxiracetam组海马ATP含量低于Control组，但高于NS组，差异有统计学意义。Ⅱ、体外实验1. DCX免疫荧光标记检测奥拉西坦对海马NSCs向神经元分化结果：Control组、NS组、Oxiracetam组均可见少量DCX+神经元前体细胞，各组间DCX+神经元前体细胞数量差异无统计学意义。2. ATP检测试剂盒检测细胞ATP含量结果：Oxiracetam组ATP含量高于Control组和NS组，差异有统计学意义。3. ChAT免疫荧光检测胆碱能神经元原代培养结果： Cholinergic neuron组、NS+Cholinergic neuron组、Oxiracetam+Cholinergic neuron组均可见较多的ChAT+胆碱能神经元，3组间胆碱能神经元数量差异无统计学意义，Oxiracetam+Cholinergic neuron组ChAT免疫荧光强度较强；Control组未见ChAT+细胞。4. DCX免疫荧光检测胆碱能神经元对海马NSCs向神经元分化结果：Oxiracetam+Cholinergic neuron组的DCX+神经元前体细胞最多，Cholinergic neuron组、NS+Cholinergic neuron组的DCX+神经元前体细胞多于Control组，除Cholinergicneuron组和NS+Cholinergic neuron组外，其余两两比较均有统计学意义。5. ELISA法检测培养液中ACh含量检测结果： Cholinergic neuron组、NS+Cholinergic neuron组、Oxiracetam+Cholinergic neuron组培养中均能检测到ACh，Oxiracetam+Cholinergic neuron组培养液中ACh含量高于其它2组；Control组未检测到ACh。6. TUNEL试剂盒检测奥拉西坦对胆碱能神经元免于凋亡的保护作用结果：NS+Extract组可见到较多的凋亡细胞，Control组和Oxiracetam+Extract组只见到少量凋亡细胞，3组间凋亡细胞数量两两比较差异均有统计学意义。结论：奥拉西坦能够促进成年大鼠TBI后海马内源性的神经发生，明显改善TBI大鼠学习记忆认知功能障碍；奥拉西坦可以保护基底前脑胆碱能神经系统，促进胆碱能神经元ACh的分泌从而促进海马神经发生；此外，奥拉西坦还可以促进海马细胞ATP的产生，利于神经的发生。
二、Brdu与IdU诱发SCE的比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Brdu与IdU诱发SCE的比较研究（论文提纲范文）
（1）FANCI和FANCL基因在早发性卵巢功能不全发病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文纲要 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 FANCI基因在POI发病中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 Fanci基因敲除导致小鼠原始生殖细胞发育异常 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第二节 FANCI在原始生殖细胞发育中的作用及机制研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第三节 FANCI基因在POI患者中的突变分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图和附表 |
| 第二章 FANCL基因突变在POI发病中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图和附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（2）黄芪多糖对甲醛染毒人BMSCs染色体损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 药物与试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养及分组 |
| 2.2 微核实验 |
| 2.3 姐妹染色单体互换实验(SCE) |
| 2.4 Real-time PCR检测PCNA,XPB,XPD,XPF和XPG mRNA表达情况 |
| 2.5 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PCNA,XPB,XPD,XPF和XPG蛋白表达情况 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 对甲醛染毒BMSCs细胞形态的影响 |
| 3.2 对甲醛染毒BMSCs微核的影响 |
| 3.3 对甲醛染毒BMSCs SCE的影响 |
| 3.4 对甲醛染毒BMSCs PCNA,XPB,XPD,XPF和XPG mRNA表达的影响 |
| 3.5 对甲醛染毒BMSCs PCNA,XPB,XPD,XPF和XPG蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
（3）体外生物测定法在食品接触材料安全性评价中的应用研究进展（论文提纲范文）
| 1 细胞毒性 |
| 1.1 细胞通透性的改变 |
| 1.2 细胞增殖的破坏 |
| 1.3 RNA合成的抑制 |
| 1.4 测试方法的联用 |
| 2 遗传毒性 |
| 2.1 致突变 |
| 2.2 DNA原始损伤 |
| 2.2.1 彗星实验（Comet实验） |
| 2.2.2 BlueScreen HC测定法 |
| 2.3 染色体和染色体组畸变 |
| 2.3.1 微核实验 |
| 2.3.2 姐妹染色单体交换实验 |
| 2.3.3 染色体畸变实验 |
| 2.4 测试方法的联用 |
| 3 内分泌干扰效应 |
| 3.1 E-Screen实验 |
| 3.2 报告基因测试 |
| 3.2.1 酵母菌雌（雄）激素筛选实验 |
| 3.2.2 荧光素酶报告基因实验 |
| 3.3 测试方法的联用 |
| 4 结语 |
（4）超小纳米团簇Au-MoS2对辐射氧化损伤的防护作用及辐射对RNAi NICD的MC3T3-E1细胞的影响（论文提纲范文）
| 第一部分 超小纳米团簇Au-MoS_2对辐射氧化损伤的防护作用 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Au-MoS_2团簇的合成 |
| 2.2 用Au-MoS_2团簇进行修饰电极的制备 |
| 2.3 Au-MoS_2团簇的物理性质表征、电催化实验 |
| 2.4 Au-MoS_2团簇的体外防护实验 |
| 2.5 Au-MoS_2团簇的体内防护实验 |
| 2.6 Au-MoS_2团簇的体内毒性实验 |
| 2.7 数据统计分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 超小纳米团簇Au-MoS_2的物理表征 |
| 3.2 超小纳米团簇Au-MoS_2对CHO细胞辐射氧化损伤的防护作用 |
| 3.3 超小纳米团簇Au-MoS_2的体内防护作用 |
| 3.4 超小纳米团簇Au-MoS_2体内毒理学研究 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 辐射对RNAiNICD低表达的MC3T3-E1细胞的增殖及相关功能基因表达的影响 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 构建稳定抑制NICD表达的MC3T3-E1细胞株模型 |
| 2.2 细胞增殖实验 |
| 2.3 细胞相关功能基因表达检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 构建NICD RNAi的MC3T3-E1稳定转染细胞株 |
| 3.2 辐射对NICD RNAi的MC3T3-E1细胞增殖的影响 |
| 3.3 辐射对NICD RNAi的MC3T3-E1细胞相关功能基因表达的影响 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 硕士在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）小鼠胚胎阶段大脑皮层神经发生过程的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论(大脑皮层的结构和发育研究进展) |
| 1.1 引言:胚胎早期大脑皮层的发育过程 |
| 1.2 表观遗传学简介 |
| 1.3 神经干细胞的鉴定 |
| 1.4 蛋白变异体在皮层发育中的研究及意义 |
| 1.5 GRM7的研究进展及其在神经发育过程中功能的研究意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验耗材 |
| 2.1.1 实验动物饲养和孕期命名方法 |
| 2.1.2 实验仪器和耗材 |
| 2.1.3 引物列表 |
| 2.1.4 细胞实验用培养基 |
| 2.1.5 质粒提取方法 |
| 2.1.6 RNA提取过程 |
| 2.1.7 胚胎电转实验 |
| 2.1.8 细胞实验步骤 |
| 2.1.9 生化分子实验 |
| 2.1.10 冰冻切片和脑片染色 |
| 2.1.11 染色质免疫共沉淀CHIP |
| 第三章 结果 |
| 3.1 第一部分结果 |
| 3.1.1 H3.3在大脑发育过程中的表达研究 |
| 3.1.2 H3.3在体外培养的神经干细胞中的表达研究 |
| 3.1.3 构建特异性针对于H3.3的敲和过表达质粒,并验证效率 |
| 3.1.4 体外Western验证H3.3敲降对于神经干细胞增殖分化的影响 |
| 3.1.5 H3.3影响神经干细胞增殖分化的研究 |
| 3.1.6 H3不能恢复H3.3敲降导致的神经发生异常 |
| 3.1.7 H3.3影响神经干细胞分化的研究 |
| 3.1.8 H3.3影响神经元形态发育的研究 |
| 3.1.9 H3.3的表达量影响H4K16位点的乙酰化 |
| 3.1.10 H3.3与MOF协同调控H4K16位点的乙酰化水平 |
| 3.1.11 H3.1不能与MOF 一起协同促进H4K16位点的乙酰化 |
| 3.1.12 H3.3K36位点和H4K16位点在调控H4K16ac的水平上发挥重要的功能 |
| 3.1.13 H3.3敲降会导致神经干细胞在转录水平发生变化 |
| 3.1.14 H3.3敲降会抑制GLI1的表达 |
| 3.1.15 GLI1参与神经干细胞增殖分化的调控过程 |
| 3.2 第二部分结果 |
| 3.2.1 GRM7在大脑发育过程中的表达研究 |
| 3.2.2 敲降GRM7影响神经干细胞的增殖 |
| 3.2.3 敲降GRM7影响神经干细胞的分化 |
| 3.2.4 敲降GRM7影响神经元形态发育 |
| 3.2.5 GRM7通过调控CREB和YAP,从而调控神经干细胞的分化过程 |
| 结论与讨论 |
| 4.1 组蛋白变异体H3.3对神经干细胞发育的影响 |
| 4.2 GRM7对于胚胎神经干细胞的影响 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（6）三阴性乳腺癌细胞必需基因的筛选与机制探究（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| Abstract |
| 第一章 节引言 |
| 1.1 基因编辑技术 |
| 1.1.1 基因编辑定义 |
| 1.1.2 基因编辑技术发展史 |
| 1.1.3 ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9三大基因编辑技术 |
| 1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因功能研究中的应用 |
| 1.2.1 基因功能研究技术 |
| 1.2.2 高通量文库功能筛选策略 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9在高通量功能基因组学中的应用 |
| 1.3 必需基因 |
| 1.3.1 必需基因含义 |
| 1.3.2 肿瘤必需基因研究进展 |
| 1.4 泛素-蛋白酶体系统与癌症治疗 |
| 1.4.1 泛素化修饰 |
| 1.4.2 泛素化修饰调控肿瘤发生发展 |
| 1.5 三阴性乳腺癌研究进展与意义 |
| 1.5.1 乳腺癌分型 |
| 1.5.2 三阴性乳腺癌特征 |
| 1.5.3 三阴性乳腺癌治疗手段发展现状 |
| 1.6 去泛素化酶USP28研究进展 |
| 1.6.1 USP28调控MYC稳定性 |
| 1.6.2 USP28调节53BP1稳定性 |
| 1.7 DNA解旋酶RecQ家族与肿瘤 |
| 1.7.1 RecQ解旋酶结构与功能研究进展 |
| 1.7.2 RecQL5调控基因组稳定性 |
| 1.8 DNA损伤反应(DDR) |
| 1.8.1 不同类型DNA损伤以及相应修复机制 |
| 1.8.2 DNA损伤修复通路 |
| 1.8.3 DNA损伤反应在肿瘤发生中的作用 |
| 1.8.4 DNA损伤反应在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.9 活性氧与肿瘤 |
| 1.9.1 活性氧含义 |
| 1.9.2 活性氧水平调控 |
| 1.10 复制压力与肿瘤 |
| 1.10.1 复制压力定义 |
| 1.10.2 复制压力下DNA损伤修复通路 |
| 1.10.3 复制压力在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.11 本研究的目的与应用价值 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子生物学实验方法 |
| 2.2.2 细胞生物学实验方法 |
| 2.2.3 遗传学实验方法 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 实验结果 |
| 3.1 E3/DUBs CRISPR功能筛选与结果验证 |
| 3.1.1 E3/DUBs CRISPR文库筛选获得候选的三阴性乳腺癌生长必需基因 |
| 3.1.2 鉴定候选基因生长必需性 |
| 3.1.3 去泛素化酶USP28和泛素连接酶TRIM24敲除抑制三阴性乳腺癌细胞HCC1937正常生长 |
| 3.2 USP28是三阴性乳腺癌细胞增殖必需基因 |
| 3.2.1 USP28在三阴性乳腺癌病人中高表达 |
| 3.2.2 USP28蛋白水平敲低抑制三阴性乳腺癌细胞增殖 |
| 3.3 USP28调控RecQL5蛋白水平 |
| 3.3.1 USP28敲低影响RecQ解旋酶蛋白水平 |
| 3.3.2 USP28与RecQL5存在相互作用 |
| 3.3.3 USP28调控RecQL5蛋白的泛素化水平 |
| 3.3.4 USP28能够稳定RecQL5蛋白 |
| 3.4 RecQL5是三阴性乳腺癌必需基因 |
| 3.4.1 RecQL5对三阴性乳腺癌细胞增殖是必需的 |
| 3.4.2 RecQL5敲低影响三阴性乳腺癌细胞周期正常进行 |
| 3.4.3 敲低RecQL5诱发细胞走向衰老 |
| 3.4.4 三阴性乳腺癌累积更多内源性DNA损伤 |
| 3.4.5 三阴性乳腺癌承受更高的复制压力 |
| 3.4.6 三阴性乳腺癌细胞系ROS水平较高 |
| 3.4.7 抑制RecQL5蛋白水平影响三阴性乳腺癌细胞ssDNA形成 |
| 3.4.8 RecQL5敲低影响复制叉重新启动 |
| 3.4.9 敲低RecQL5促使三阴性乳腺癌细胞累积更多内源性DNA损伤 |
| 3.4.10 RecQL5敲低影响三阴性乳腺癌细胞基因组稳定性 |
| 3.4.11 敲低RecQL5使非三阴性乳腺癌细胞对外源复制压力更加敏感 |
| 3.4.12 RecQL5基因表达水平与TNBC患者生存期呈负相关 |
| 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 常用名词缩写对照表 |
| 引物序列 |
| 试剂配置 |
| 致谢 |
| 在校期间所取得的科研成果 |
（7）miR-31在小肠干细胞、上皮再生和肿瘤发生中的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物肠道上皮 |
| 1.1.1 肠道的胚胎期发育 |
| 1.1.2 肠道上皮的分化细胞 |
| 1.1.3 小肠干细胞 |
| 1.1.4 小肠上皮的损伤 |
| 1.1.5 肠道干细胞命运调控的信号 |
| 1.2 miRNA的研究进展 |
| 1.2.1 miRNA的发现 |
| 1.2.2 miRNA的生物起源和作用机制 |
| 1.2.3 miRNA的生物学功能 |
| 1.2.4 miRNA与压力应激 |
| 1.3 miRNA-31的研究进展 |
| 1.3.1 miR-31与干细胞 |
| 1.3.2 miR-31与肠炎及肠道肿瘤 |
| 1.3.3 miR-31与凋亡 |
| 1.3.4 miR-31与其它肿瘤 |
| 1.4 研究的目和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞株 |
| 2.1.3 载体及菌株 |
| 2.1.4 miR-31 mimics和miR-31 inhibitor及引物合成 |
| 2.1.5 试剂及耗材 |
| 2.1.6 常用试剂配制 |
| 2.1.7 主要仪器设备 |
| 2.1.8 主要分析工具软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 转基因小鼠的获得及杂交 |
| 2.2.2 基因组的提取及基因型的鉴定 |
| 2.2.3 RNA的提取、反转录及定量 |
| 2.2.4 蛋白质的提取及Western Blot |
| 2.2.5 载体构建 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告基因载体构建及相关细胞实验 |
| 2.2.7 小鼠小肠上皮细胞的分离及其相关实验 |
| 2.2.8 小鼠肠道上皮组织石蜡包埋块的制作 |
| 2.2.9 小鼠肠道上皮组织H&E分析 |
| 2.2.10 免疫组化染色 |
| 2.2.11 免疫荧光染色 |
| 2.2.12 miR-31原位杂交 |
| 2.2.13 X-gal染色 |
| 2.2.14 BrdU、EdU标记实验 |
| 2.2.15 染色质免疫沉淀技术(ChIP技术) |
| 2.2.16 CLIP-qPCR实验 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 miR-31在小鼠小肠上皮中的表达模式 |
| 3.1.1 正常状态下小鼠小肠上皮中miR-31的表达模式 |
| 3.1.2 压力条件下小鼠肠道上皮中miR-31的表达模式 |
| 3.2 可诱导的miR-31过表达转基因小鼠、miR-31全身敲除小鼠和miR-31小肠上皮特异敲除小鼠的构建 |
| 3.2.1 miR-31过表达转基因小鼠构建策略及效果检测 |
| 3.2.2 miR-31全身敲除小鼠(miR-31~(-/-))构建策略及效果检测 |
| 3.2.3 miR-31小肠上皮特异性敲除小鼠构建及效果检测 |
| 3.3 过表达miR-31促进小肠隐窝增高、上皮细胞增殖和干细胞增多 |
| 3.3.1 miR-31促进小肠隐窝增高 |
| 3.3.2 miR-31促进小肠上皮细胞增殖,并影响上皮细胞分化及凋亡 |
| 3.3.3 miR-31促进小肠上皮Lgr5~+干细胞的增殖 |
| 3.3.4 miR-31促进体外培养隐窝的生长 |
| 3.4 辐照后miR-31促进小肠上皮的再生 |
| 3.4.1 miR-31促进辐照处理后小肠隐窝再生 |
| 3.4.2 辐照后miR-31抑制Lgr5~+细胞的凋亡 |
| 3.5 miR-31促进炎症损伤肠道上皮的恢复 |
| 3.6 miR-31促进肠道肿瘤生长 |
| 3.7 miR-31激活Wnt、抑制BMP/TGFβ信号通路 |
| 3.7.1 miR-31激活Wnt信号通路 |
| 3.7.2 miR-31抑制BMP/TGFβ信号通路活性 |
| 3.8 miR-31通过p38和Gsk3β抑制细胞凋亡 |
| 3.9 miR-31直接作用的靶基因 |
| 3.10 STAT3和NF-κB通路介导辐照和炎症反应中miR-31的诱导表达 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 miR-31是ISCs本身固有的微环境信号调节因子 |
| 4.2 miR-31保护ISCs对抗凋亡 |
| 4.3 miR-31促进辐照损伤后肠道上皮的再生 |
| 4.4 miR-31在肠炎中的功能 |
| 4.5 STAT3和NF-κB调控miR-31的表达 |
| 4.6 miR-31促进肠道肿瘤进展 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 引物序列 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）甲醛对BM-MSCs的毒性作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Summary |
| 第一篇 文献综述 甲醛的毒性作用及修复机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 甲醛对 BM-MSCs 的细胞毒性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞增殖活性检测 |
| 1.2.3 细胞形态学观察 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 甲醛对 BM-MSCs 增殖活性的影响 |
| 2.2 甲醛对 BM-MSCs 形态的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 甲醛对 BM-MSCs 的遗传毒性及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养和处理 |
| 1.2.2 彗星实验（Comet Assay） |
| 1.2.3 KCl-SDS 沉淀实验 |
| 1.2.4 姐妹染色单体互换实验（Sister chromatid exchange test，SCE） |
| 1.2.5 微核实验（Micronucleus test，MN） |
| 1.2.6 RT2Profiler PCR Array 分析实验 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 甲醛对 BM-MSCs DNA 断裂的影响 |
| 2.2 甲醛对 BM-MSCs DPCs 的影响 |
| 2.3 甲醛对 BM-MSCs SCE 的影响 |
| 2.4 甲醛对 BM-MSCs MN 的影响 |
| 2.5 甲醛对 BM-MSCs DNA 损伤修复通路相关基因表达的影响 |
| 2.5.1 提取总 RNA 的质量检测结果 |
| 2.5.2 DNA 损伤应答基因表达的改变情况 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 甲醛对 BM-MSCs 细胞周期和凋亡的影响及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养和处理 |
| 1.2.2 流式细胞术检测细胞周期 |
| 1.2.3 鬼笔环肽（phalloidine）/hoechst33258 双染检测细胞凋亡 |
| 1.2.4 western blot 检测凋亡相关蛋白的表达情况 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 甲醛对 BM-MSCs 细胞周期的影响 |
| 2.2 甲醛对 BM-MSCs 凋亡的影响 |
| 2.3 甲醛对细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（9）液态介质中溶剂化电子动力学行为的理论模拟研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 溶剂化电子的研究现状 |
| 1.2 本文开展的主要工作 |
| 1.3 从头算分子动力学方法 |
| 参考文献 |
| 第2章 葡萄糖溶液中过剩电子的溶剂化动力学研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 计算与模拟细节 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 水化电子的溶剂化动力学行为 |
| 2.3.2 葡萄糖溶液中溶剂化电子的结构 |
| 2.3.3 葡萄糖溶液中溶剂化电子的动力学演化 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第3章 常温碱基溶液和玻璃态碱基溶液中过剩电子的溶剂化动力学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 计算与模拟细节 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 碱基溶液中过剩电子的预溶剂化结构 |
| 3.3.2 室温碱基溶液中过剩电子的动力学行为 |
| 3.3.3 玻璃态碱基溶液中过剩电子的动力学行为 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第4章 卤代尿嘧啶核苷溶液中过剩电子诱导的去卤化反应机理 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 计算与模拟细节 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 气相和PCM溶剂条件下4种XdU分子的轨道特征 |
| 4.3.2 水溶液环境中过剩电子与XdU分子的反应动力学 |
| 4.3.3 势能面扫面 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第5章 乙腈溶液中过剩电子的溶剂化动力学研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 计算与模拟细节 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 乙腈分子簇体系中过剩电子的结构 |
| 5.3.2 乙腈溶液中过剩电子的溶剂化行为 |
| 5.3.3 方法和尺寸效应对模拟结果的影响 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第6章 室温离子液体中过剩双电子的溶剂化动力学研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 计算与模拟细节 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 中性离子液体的轨道特征 |
| 6.3.2 溶剂化双电子的动力学演化 |
| 6.3.3 模拟方法和尺寸效应对结果的影响 |
| 6.4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附件 |
（10）成年大鼠创伤性脑损伤后的皮质与海马内源性神经发生研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 成年大鼠创伤性脑损伤后皮质的内源性神经发生 |
| 体内实验 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 体外实验 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 奥拉西坦对成年大鼠创伤性脑损伤后海马内源性神经发生的影响 |
| 体内实验 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 体外实验 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 博士生期间发表的论文 |
| 博士生期间承担科研项目及获奖情况 |
| 致谢 |
四、Brdu与IdU诱发SCE的比较研究（论文参考文献）
- [1]FANCI和FANCL基因在早发性卵巢功能不全发病中的作用及机制研究[D]. 杨亚娟. 山东大学, 2020(08)
- [2]黄芪多糖对甲醛染毒人BMSCs染色体损伤的保护作用[J]. 舍雅莉,张秋菊,李亚玲,张立,张国欣,张磊,刘永琦,李长天. 中国实验方剂学杂志, 2020(02)
- [3]体外生物测定法在食品接触材料安全性评价中的应用研究进展[J]. 王文娟,蔡小芳,唐洁,张喜荣,封棣. 食品科学, 2019(15)
- [4]超小纳米团簇Au-MoS2对辐射氧化损伤的防护作用及辐射对RNAi NICD的MC3T3-E1细胞的影响[D]. 边佩鲜. 北京协和医学院, 2018(02)
- [5]小鼠胚胎阶段大脑皮层神经发生过程的研究[D]. 夏文龙. 中国科学技术大学, 2017(02)
- [6]三阴性乳腺癌细胞必需基因的筛选与机制探究[D]. 彭瑾. 华东师范大学, 2018(07)
- [7]miR-31在小肠干细胞、上皮再生和肿瘤发生中的功能与机制研究[D]. 田玉华. 中国农业大学, 2017(05)
- [8]甲醛对BM-MSCs的毒性作用及相关机制研究[D]. 舍雅莉. 甘肃农业大学, 2014(05)
- [9]液态介质中溶剂化电子动力学行为的理论模拟研究[D]. 刘金祥. 山东大学, 2014(10)
- [10]成年大鼠创伤性脑损伤后的皮质与海马内源性神经发生研究[D]. 衣昕. 苏州大学, 2014(10)