一、Dot-ELISA检测减蛋综合征病毒的研究（论文文献综述）
肖妙[1]（2008）在《减蛋综合征病毒五邻体、纤维蛋白和六邻体的原核表达及抗原性分析》文中研究表明减蛋综合征（Egg Drop Syndrome,EDS-76）是由减蛋综合征病毒（EDSV）引起的一种以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋,产蛋率严重下降为主要特征的传染病,该病在世界范围内的发生和流行给养鸡业带来了巨大的经济损失。本研究以EDSV京911株为基础材料,经过鸭胚繁毒、提取DNA,并以此为模板,参考GenBank上发表的国际标准株AV-127的全基因序列（序列号AC000004）设计了8对特异性引物,PCR扩增出目的基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,转化到宿主菌TG1感受态细胞中,经质粒PCR、酶切鉴定以及测序证明,最终得到了该株病毒包含52/55k、Ⅲa、五邻体、pⅦ、pⅩ、pⅥ、六邻体、EP、100k、pⅧ和纤维蛋白的部分基因,共15715bp。将EDSV京911株与其它腺病毒进行核苷酸和氨基酸序列比对,结果显示EDSV京911株与AV-127株高度同源,除纤维蛋白和pⅧ外,其它蛋白的同源性都在99.00%以上,其中五邻体、六邻体、巯基内肽酶、PⅥ和PⅩ氨基酸序列完全一致,由此推论EDSV京911株与AV-127株可能为同一基因型。同时,根据序列比对结果绘制了五邻体、六邻体和巯基内肽酶系统发生树,结果显示EDSV与OAV287和BAdV-4遗传关系最近。根据已获得的京911株核苷酸序列,并参考AV-127株的五邻体、纤维蛋白和六邻体全基因序列,分别设计合成了带有酶切位点的特异性引物,最终克隆得到包括起始密码子和终止密码子在内的完整基因序列。将目的基因通过EcoRI和HindⅢ位点插入到表达载体pET-30a（+）,获得的阳性质粒分别命名为pET-30a-Penton、pET-30a-Fiber和pET-30a-Hexon,将阳性质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,结果显示分别得到了大小约54.0ku、69.7ku和110.0ku的重组蛋白,经Western-blotting、琼脂双扩散和Dot-ELISA检测,重组五邻体蛋白具有较好的抗原性。本研究成功克隆了EDSV京911株部分基因,为构建EDSV载体打下了良好的基础;同时利用原核表达系统成功表达了EDSV的三个主要结构蛋白,重组五邻体蛋白具有较好的抗原性,为进一步研究EDSV结构蛋白和建立新的EDSV检测方法奠定了基础。
董春娜[2]（2011）在《减蛋综合征病毒NE4株全基因组序列测定与分析和环介导等温扩增检测方法的建立》文中研究说明减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus, EDSV）主要引起鸡减蛋综合征,临床表现为产蛋鸡产薄壳蛋或无壳蛋,产蛋率严重下降。自1976年荷兰学者Van Eck首次报道以来,世界各地都分离到减蛋综合征病毒毒株。各毒株间毒力差异大,宿主范围广泛,可在机体内长期繁殖,与Ⅰ群和Ⅱ群禽腺病毒之间无交叉反应,具有独特的抗原性和生物学特性。我国是养禽大国,禽病的发生和流行影响着养禽业的发展,故了解EDSV基因组的结构特点和建立一种快速、特异的诊断技术显得尤为重要。本研究以EDSV NE4株为基础材料,经过鸭胚增毒、提取DNA,并以此为模板,用Premier5.0软件根据减蛋综合征病毒（EDSV-76）Duck adenovirus A株的全基因序列（GenBank序列号AC000004）,设计22对引物,用PCR方法对EDSV-76病毒中国株NE4株的全基因组进行了分段扩增、克隆和序列测定。用DNAStar分析软件对各片段的测序结果进行拼接,并将该序列与GenBank中已登录的相应的序列进行同源性比较分析,并用六邻体蛋白构建了进化树。结果显示,NE4株基因组序列全长33214bp,GC含量为43%,与国际标准株AV-127相比核苷酸序列同源性为99.6%。碱基的插入或缺失主要集中在非编码区,在100K蛋白编码区距羧基端十分之一处插入了一个碱基C,其ORF编码696个氨基酸,而AV-127株100K蛋白编码709个氨基酸,预计其发挥功能的基团在N端。蛋白同源性分析表明,EDSV NE4株主要蛋白与腺病毒OAV（Ovine adenovirus D）和BAV（Bovineadenovirus D）具有较高的同源性,有些蛋白与SAV（Snake adenovirus）腺病毒有较高的同源性,而与CELO的同源性较低,提示NE4株与禽腺病毒Ⅰ群在血清学以及基因结构上存在较大差异,进化分析也显示了此特性。此工作为进一步了解EDSV基因组的结构特点及其与其它腺病毒的同源关系,也为EDSV腺病毒的研究和载体的构建提供清晰的分子生物学背景目前,检测EDSV的方法主要有血凝抑制试验（HI）、琼脂扩散（AGP）试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、PCR和免疫胶体金等检测方法,随着分子生物学技术的不断发展和成熟,作为新生的分子生物学检测方法,环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）应运而生,并成为快速诊断EDSV的有力手段。本研究根据GenBank登录的EDSV-76六邻体基因的保守区设计三对LAMP引物,建立一种高效、快速、高特异性的EDSV LAMP检测方法。优化反应体系,并对其灵敏性、特异性进行验证。结果显示,LAMP检测方法扩增EDSV基因呈特征性梯状条带,显色反应呈绿色荧光。该方法检测EDSV灵敏度高,是普通PCR的10倍,可检测到60个拷贝的基因组DNA;特异性强,与鸡新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡胚致死孤儿病毒（CELO）无交叉反应。重复性好,稳定性高,可经济、有效地在基层和实验室中进行减蛋综合征病毒的检测。
黄显明,张小飞,李春芬,廖俊伟,毛火云[3]（2008）在《Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立》文中研究说明根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ）A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的逆转录套式PCR方法（RT-nested-PCR）,采用该方法对DHV-ⅠA66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎（DVH）的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。
韩丽珍,曹蔚,吴彤[4]（2000）在《减蛋综合征贵州分离毒全基因组探针的制备及检测》文中进行了进一步梳理为准确检测鸡群中减蛋综合征病毒感染情况 ,从减蛋综合征病毒 （EDS）贵州分离毒株HS- 1中提纯病毒DNA后 ,用地高辛标记制备了全基因组探针。在Dot -blot中该探针不与正常鸭胚尿囊液核酸提取物及马立克氏病病毒 （MDV）DNA发生反应 ,只与 3株EDS病毒 （国际标准毒AV - 12 7、贵州分离毒HS - 1、南京分离毒GC2 ）DNA呈阳性反应 ,具有较高的特异性 ;可检测出 30pg的同源DNA ,具有较强的灵敏度。人工感染母鸡于 2 4h后即可用该探针从泄殖腔棉拭子中检测到病毒 ,能早期诊断该病的发生 ,检测阳性率为 88 89% ;并可检测到EDS病毒的隐性传播情况
杨华[5]（2010）在《减蛋综合症病毒结构蛋白六邻体优势抗原表位分析》文中进行了进一步梳理减蛋综合症（Egg Drop Syndrome,EDS-76）是由减蛋综合症病毒（EDSV）引起的一种以产蛋鸡产薄壳蛋或无壳蛋,产蛋率严重下降为主要特征的传染病,该病在世界范围内的发生和流行给养鸡业带来了巨大的经济损失。所以需要一种准确、简便的诊断方法来对该病做出诊断,也需要通过分析病毒的抗原成分筛选出合适的肽段作为亚单位疫苗用于本病的免疫预防,但这种诊断试剂和亚单位疫苗的研制,必须建立在病毒蛋白抗原结构的研究之上。本研究利用重组克隆载体pMD18-T-Hexon作为截短表达片段PCR扩增的模板,对EDSV Hexon蛋白的优势抗原表位进行筛选,从而对EDSV的抗原结构有了进一步的了解。为了分析减蛋综合症Hexon蛋白的优势抗原表位区,采用基因重叠分段表达技术,设计了6个覆盖整个减蛋综合症病毒Hexon蛋白的多肽片段,这些短肽长为150170个氨基酸,有1520个氨基酸重叠,将这些亚克隆的基因片段插入原核表达载体pET-30a中,分别进行融合表达,对表达的6个融合蛋白进行切胶纯化,应用EDSV阳性血清对表达的6个重组蛋白的抗原性进行了检测,经过Western blot分析表明,融合蛋白HB（153306）、HD（443618）和HE（598769）能被EDSV阳性血清所识别,鉴定表明153306、443618和598769为减蛋综合症病毒Hexon的优势抗原表位区。根据以上试验结果,进一步设计了6个覆盖HB（153306）的多肽片段,13个覆盖HDE（443769）的多肽片段,这些短肽长为3540个氨基酸,有15个氨基酸的重叠,将这些亚克隆的基因片段插入原核表达载体pET-32a中,分别进行融合表达及切胶纯化,经Western blot结果表明,表达的融合蛋白HB-3（193229）、HB-4（216255）、HDE-3（491530）、HDE-5（539577）、HDE-9（633671）和HDE-10（657696）能被EDSV阳性血清所识别。最后,我们进一步缩小Hexon蛋白优势抗原表位区的氨基酸数,设计了5个覆盖HB-3（193229）、3个覆盖HDE-3（491530）、3个覆盖HDE-5（539577）和5个覆盖HDE-910（633696）的多肽片段,每一个多肽片段合成一对寡聚核酸片段,经磷酸化退火后插入表达载体pET-32a进行融合表达及切胶纯化,经Western blot确定减蛋综合症病毒Hexon蛋白优势抗原表位区位于204219、227243、491506、550565、633648和656672氨基酸处。综合上述实验结果,减蛋综合症病毒Hexon蛋白优势抗原表位区位于204219、227243、491506、550565、633648和656672区域。在此基础上对减蛋综合症病毒Hexon蛋白抗原表位的分布进行分析,同时利用DNAMAN序列分析软件将EDSV Hexon的抗原表位区与其他腺病毒六邻体蛋白的氨基酸序列进行比对,为进一步了解EDSV抗原结构奠定了基础。
张春杰,王大军,吴庭才,李银聚,余祖华,程相朝[6]（2006）在《禽流感（H9N2亚型）酶标抗体的制备及双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立》文中认为采用AIV灭活油乳苗（H9N2）对AIV非免疫鸡进行接种并获取高免血清,取高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法,经过Sephadex G25层析柱提纯后可获得纯度很好的IgG。将IgG应用过碘酸钠法标记辣根过氧化酶（HRP）,制备禽流感酶标抗体（IgG-HRP）,利用所提取的AI-IgG和所制备的禽流感酶标抗体按照双抗夹心Dot-ELISA试验操作步骤,采用方阵法分别摸索包被抗原及酶标抗体的最佳浓度,以及各步反应时间等最佳反应条件,以建立一种优化的AIV双抗夹心Dot-ELISA检测法。结果表明,所制备的AI高免血清HI效价为10log2;AI酶标抗体克分子比值为2.45;优化的Dot-ELISA各条件为:包被AI-IgG最佳稀释倍数为1∶50;最佳封闭剂为1%牛血清白蛋白;AI酶标抗体最佳稀释倍数为1∶100;待检抗原与2种抗体的感作时间均为0.5h（37℃）。优化后的检测方法可在2.5h内诊断结果,制备好的包被膜在4℃下保存2个月不影响其效果。而且敏感性提高了3倍,与新城疫病毒液、传染性支气管炎及减蛋综合症病毒液无交叉反应。
罗念[7]（2013）在《鸭减蛋综合征PCR检测方法建立及西南地区血清流行病学调查》文中研究指明减蛋综合征（Egg Drop Syndrome,EDS76）是由禽腺病毒Ⅲ群引起的能使蛋禽产蛋量严重下降的一种病毒性传染病。自1976年荷兰科学家Van Eck首次发现减蛋综合征病毒（Egg Drop Syndrome virus,EDSV）以来,许多国家也相继在鸡上分离出多株病毒。大多数学者认为该病易感动物是鸡,鸭只是病毒的贮藏宿主,但自从Bartha等1984年首次从表现产蛋下降和严重腹泻的鸭中分离到病毒以来,国内外对鸭减蛋综合征的研究愈来愈多,表明在一定条件下,鸭感染EDS76病毒后也可引起严重的产蛋下降。本试验从西南地区的云贵川三省的不同地区采集鸭血,通过对血清做血凝抑制试验检测EDSV抗体和白细胞层DNA做PCR试验检测EDSV抗原,旨在探讨西南地区鸭减蛋综合征的感染情况,为西南地区减蛋综合征病毒的预防监控、分子生物学研究与DNA疫苗的研制提供重要依据。1.鸭减蛋综合征PCR检测方法的建立本次研究参照GenBank中收录的鸭源减蛋综合征病毒127分离株（Y09598）的100k蛋白基因的保守区,设计一对理论跨幅为280bp的引物,通过对Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶浓度、模板量、变性温度、退火温度、延伸温度、循环次数进行优化,得到PCR的最佳反应模式：25μL反应体系分别加入：10×PCR Buffer2.5μL,25mmol/L MgCl22μL, dNTPs（2.5mmol/L）2μL,引物Ⅰ、引物Ⅱ（浓度均为10pmol/μL）均为1μL, Tap酶0.5μL,模板DNA2μL,再加ddH2O至25μL。反应程序为：94℃5min,94℃30s→55℃30s→72℃1min,运行31个循环,最后于72℃延伸7min。以鸭病毒性肝炎病毒（Duck Hepatitis Virus,DHV）、鸭源致病性大肠埃希氏菌（pathogenicity Escherichia coli, E.coli）、鸭源致病性沙门氏菌（pathogenicity Salmonella, Sal.）、鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）为对照的特异性实验以及对母鸭攻毒检测其组织带毒情况证明该检测方法确实有效,且有较高的特异性。敏感性实验结果显示该方法可以检测出的最低DNA模板浓度为14.25pg/mL,说明其敏感性很好,可用于鸭减蛋综合征病毒临床的快速检测并将此方法运用到西南地区鸭减蛋综合征抗原检测。通过对西南地区鸭血样进行PCR试验,结果为肉用型鸭和蛋用型鸭阳性率分别为18.1%和21.6%,说明阳性率较高,与鸭是EDSV的贮藏宿主这一理论基本一致,为西南地区鸭减蛋综合征的防御提供了数据参考和理论指导。将检测到的阳性样品按每个省随机选取一个,测序之后进行生物信息学分析其基因和氨基酸生物学特征,与100K蛋白的生物学特征基本一致,与鸭源减蛋综合征病毒127分离株（Y09598）进行比对,其同源性高达98%以上,说明EDSV的地域性不强。2.西南地区鸭减蛋综合征血清流行病学调查西南地区主要采集云、贵、川三省,每省均采集省会以及代表东南西北四个区域的五个点。每个点采集肉用型和蛋用型母鸭血各10份以上。总共采集16个地区的193例肉用型鸭血样和199例的蛋用型鸭血样。运用血凝抑制试验对这392份样品进行检测。结果显示肉用鸭和蛋用鸭阳性只数分别为22和29,阳性率分别为11.4%和14.6%。说明蛋用鸭比肉用鸭易感此病毒。其中三省阳性率对比得出蛋用型鸭四川地区阳性率最高,肉用型鸭云南地区阳性率最高,说明这三个省均应加强对此病的防疫工作,也给各个地区针对鸭减蛋综合征的防疫工作做了一定的数据指导。通过对母鸭进行攻毒之后不同时间的抗体和抗原检测,对母鸭感染EDSV之后抗体水平和组织带毒情况有了一定的了解,结果显示攻毒7天后HI抗体效价较高,到14天达到最高峰,21天时有一定的下降,HA试验显示除了心脏没有检测到抗原,其他组织HA试验滴度都较高,说明EDSV感染鸭后的7-21天为排毒高峰期,为临床上鸭减蛋综合征疫苗的研发和临床应用方面提供科学依据。
纪凤仙[8]（2014）在《鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗的研制及其免疫原性研究》文中研究表明以鸭胚尿囊腔途径增殖鸭腺病毒,24-120 h死亡鸭胚和120 h后未死亡鸭胚置4℃冰箱过夜,无菌操作分别收集尿囊液。对鸭腺病毒连续传代,选择传代稳定的鸭胚尿囊液作为种毒,种毒鸭胚半数感染量为10-751/0.2ml, HA价1：216。用种毒制备疫苗抗原,加0.3%甲醛、37℃灭活48 h,加蜂胶佐剂,制备鸭腺病毒蜂胶灭活苗,蜂胶最终含量10mg/ml,疫苗安全检验合格。建立了间接ELISA法检测鸭腺病毒抗体。ELISA最佳反应条件为：鸭腺病毒抗原包被浓度2.45μg/ml,血清稀释倍数1：100,作用时间90 min。HRP-羊抗鸭IgG稀释度为1:2000。用32份阴性血清测得临界值为0.2310。建立的ELISA方法重复性好,板内变异系数1.09%-2.67%,板间变异系数2.79-4.06%,均小于10%。建立的方法与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、沙门氏菌阳性血清无交叉反应,特异性好。用制备的鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫实验鸭,以间接ELISA和血凝抑制试验监测免疫鸭抗体消长规律。ELISA结果显示：一次免疫组种鸭免疫后第3d就可在血清中检测到血清呈阳性,第14d时抗体达到峰值（OD=0.628）随后缓慢下降,到免疫后56天仍为阳性；二次免疫组种鸭首免后第7d免疫第二次,共免疫2次,21d到达峰值（0.759）。结果显示：同时间点所测二次免疫组的OD450值显着高于一次免疫组（P<0.05）,经过二次免疫种鸭的抗体水平更高。免疫组的抗体水平显着高于对照组（P<0.05）。血凝抑制试验结果显示：一免后第3d时可以检测到抗体效价,值为23.83。在免疫后的3 d-14 d抗体上升的最快,并达到最大值211.52,然后开始缓慢下降,到免疫后56 d抗体效价任保持在29.38的较高水平。在首免后第7d进行二次免疫,结果显示,在首免后第21d达到峰值,效价高达216。以后缓慢下降,56 d时的抗体效价为21330。在测定的整个过程,同时间点二次免疫组的抗体水平都高于一次免疫组,两个实验组的抗体水平都显着高于生理盐水对照组。ELISA法的敏感性高于血凝抑制试验方法,两者呈平行关系。用制备的鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫实验鸭,以MTT法和白细胞吞噬试验监测免疫鸭细胞免疫应答。MTT法检测鸭外周血淋巴细胞转化活性结果显示：一次免疫组在免疫后第3 d检测发现T淋巴细胞对ConA反应增强,且显着高于对照组（P<0.05）。到第10d到达峰值,然后快速下降。二次免疫组在首免后10-14 d,T淋巴细胞转化活性最高,随后逐渐下降。在本实验的整个测定过程中,在首免后第10d、 14d、21d、28d二次免疫组的转化率显着高于一次免疫组（P<0.05）和对照组（P<0.05）,在42 d时两个试验组和对照组差异均不显着。白细胞吞噬试验结果显示：一次免疫组白细胞吞噬指数在免疫后21d达到最大值,吞噬指数为3.03,然后快速下降。二次免疫组白细胞吞噬指数一直大于一次免疫组和对照组,并且在首免后21 d到达最大值。
姜平,陈溥言,何琴娟,朱琴亚[9]（1994）在《鸭源新城疫病毒和减蛋综合征病毒在同一鸭胚中增殖的观察》文中进行了进一步梳理用鸭源新城疫病毒（ＮＤ）Ｄ１０株和减蛋综合征（ＥＤＳ—７６）病毒ＧＣ２株同时在同一鸭胚中复制增殖．结果表明：（１）两种病毒同时感染同一鸭胚后，鸭胚平均死亡时间（ＭＤＴ）７３．６ｈ，死亡率８８．２％（１５／１７）．胚体皮肤出血、淤血，绒毛尿囊膜水肿、增厚，尿囊液能凝集人和鸡红细胞．（２）尿囊液感染鸡胚成纤维（ＣＥＦ）细胞，致细胞病变（ＣＰＥ），证实尿囊液中存在ＮＤＶ．用间接法Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ检测ＥＤＳ—７６病毒抗原，结果为阳性．（３）电镜观察经提纯浓缩后的尿囊液，可见到两种病毒粒子：ＮＤＶ形态不一，多数直径约１２０～１３０ｎｍ或更大．有囊膜；ＥＤＳ—７６病毒呈圆形，直径约７０ｎｍ，有囊膜．（４）用血凝试验（ＨＡ）测定两种病毒．其生长规律与单独接种时一致．（５）接种灭活的含毒尿囊液的雏鸡，在血清中出现抗两种病毒的ＨＩ抗体及抗ＥＤＳ－７６病毒的中和抗体，对ＮＤＶ强毒攻击有坚强的免疫力。
王雪敏,郑明球,蔡宝祥,陈溥言[10]（1998）在《Dot-ELISA检测减蛋综合征病毒的研究》文中认为将辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）直接标记到ＭｃＡｂ（ＩｇＧ）上，建立了检测减蛋综合征（ＥＤＳ７６）病毒的ＤｏｔＥＬＩＳＡ方法，可敏感、特异、及早、快速地检测细胞培养物和实验感染鸡样品中的病毒抗原，某发病鸡场的泄殖腔拭子样品的阳性率为４３３３％（１３／３０）。
二、Dot-ELISA检测减蛋综合征病毒的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Dot-ELISA检测减蛋综合征病毒的研究（论文提纲范文）
（1）减蛋综合征病毒五邻体、纤维蛋白和六邻体的原核表达及抗原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 历史及分布 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 病原的基本生物学特性 |
| 1.4 病原的分类地位 |
| 1.5 病原的基因组特点 |
| 1.5.1 末端倒置重复序列（ITR） |
| 1.5.2 E1 区 |
| 1.5.3 E2 区 |
| 1.5.4 E3 区和E4 区 |
| 1.5.5 L 区 |
| 1.6 EDSV 载体的研究进展 |
| 1.6.1 人腺病毒载体的研究发展 |
| 1.6.2 EDSV 载体的研究进展 |
| 1.7 EDSV 分子生物学诊断方法的研究进展 |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、宿主菌、质粒载体和血清 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 工具酶与试剂盒 |
| 2.1.4 仪器和设备 |
| 2.1.5 主要试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的增殖 |
| 2.2.2 兔抗EDSV 多克隆血清的制备 |
| 2.2.3 核酸的提取 |
| 2.2.4 EDSV 部分基因的克隆 |
| 2.2.5 五邻体、纤维蛋白和六邻体的原核表达 |
| 2.2.6 重组蛋白的抗原性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因克隆 |
| 3.1.1 基因片段PCR 扩增结果 |
| 3.1.2 阳性重组克隆质粒的鉴定 |
| 3.1.3 基因测序及序列分析 |
| 3.2 五邻体、六邻体和纤维蛋白的原核表达 |
| 3.2.1 目的基因的扩增 |
| 3.2.2 目的片段的克隆及鉴定 |
| 3.2.3 阳性重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.4 蛋白表达检测和纯化 |
| 3.3 重组蛋白的抗原性分析 |
| 3.3.1 Western-blotting 检测 |
| 3.3.2 琼脂双扩散 |
| 3.3.3 Dot-ELISA |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（2）减蛋综合征病毒NE4株全基因组序列测定与分析和环介导等温扩增检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 第一章 减蛋综合症病毒综述 |
| 1.1 减蛋综合症病毒分子生物学研究进展 |
| 1.1.1 减蛋综合症病毒的分类和流行病学 |
| 1.1.2 减蛋综合症病毒的基本生物学特性 |
| 1.1.3 减蛋综合症毒基因组的基本结构与功能 |
| 1.2 减蛋综合症病毒诊断方法的研究进展 |
| 1.3 环介导等温扩增技术（LAMP）及应用 |
| 1.3.1 环介导等温扩增技术（LAMP）的特点 |
| 1.3.2 LAMP 反应原理 |
| 1.3.3 LAMP 反应的应用 |
| 第二章 减蛋综合征病毒NE4 株全基因组序列测定与分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 病毒 |
| 2.2.2 试验用仪器和试剂 |
| 2.2.3 主要试剂配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 减蛋综合症病毒的增殖 |
| 2.3.2 减蛋综合症病毒DNA 的提取 |
| 2.3.3 EDSV NE4 株基因的克隆与鉴定 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 基因组分段PCR 扩增结果 |
| 2.4.2 全基因组测序结果与分析 |
| 2.4.3 EDSV NE4 株主要蛋白同源性比较与分析 |
| 2.4.4 EDSV NE4 株六邻体蛋白的系统进化分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 减蛋综合症病毒环介导等温扩增方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 病毒 |
| 3.2.2 试验用仪器和试剂 |
| 3.2.3 引物设计与合成 |
| 3.2.4 减蛋综合症病毒的增殖 |
| 3.2.5 减蛋综合症病毒DNA 的提取 |
| 3.2.6 LAMP 检测方法反应体系的优化 |
| 3.2.7 EDSV LAMP 检测 |
| 3.2.8 LAMP 灵敏度验证 |
| 3.2.9 LAMP 特异性验证 |
| 3.2.10 重复性和稳定性检测 |
| 3.2.11 临床样本检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 LAMP 检测方法反应条件优化结果 |
| 3.3.2 优化反应条件后建立的LAMP 检测EDSV 基因组DNA 方法 |
| 3.3.3 LAMP 检测EDSV 灵敏度结果 |
| 3.3.4 LAMP 检测EDSV 的特异性结果 |
| 3.3.5 重复性和稳定性检测 |
| 3.3.6 LAMP 对临床样本的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 英文缩写词表 |
（3）Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 参考毒 (菌) 株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 病毒核酸的提取 |
| 1.4 细菌核酸的抽提 |
| 1.5 引物的设计与合成 |
| 1.6 RT-PCR方法的建立 |
| 1.6.1 逆转录 |
| 1.6.2 第1次PCR扩增 |
| 1.6.3 套式PCR |
| 1.6.4 特异性试验 |
| 1.6.5 敏感性测定 |
| 1.7 临床应用 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 套式RT-PCR的特异性 |
| 2.2 套式RT-PCR的敏感性 |
| 2.3 临床样品的检测 |
| 3 讨论 |
（4）减蛋综合征贵州分离毒全基因组探针的制备及检测（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 EDS病毒的提纯 |
| 1.2.2 病毒核酸的纯化及浓缩 |
| 1.2.3 病毒DNA的鉴定 |
| 1.2.4 随机引物法制备地高辛标记全基因组探针 |
| 1.2.5 Dot-Blot测定探针的特异性 |
| 1.2.5.1 点样 |
| 1.2.5.2 杂交 |
| 1.2.5.3 检测过程 |
| 1.2.6 标记探针灵敏度的测定 |
| 1.2.7 人工感染EDS病毒试验 |
| 2 结 果 |
| 2.1 DNA的纯度和浓度 |
| 2.2 探针的特异性 |
| 2.3 灵敏度测定 |
| 2.4 对人工感染鸡输卵管的检测结果 |
| 2.5 对人工感染鸡泄殖腔棉拭子的检测结果 |
| 2.6 几何平均效价的测定 |
| 3 讨 论 |
（5）减蛋综合症病毒结构蛋白六邻体优势抗原表位分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 减蛋综合症病毒概述 |
| 1.1.1 EDSV 的分类地位 |
| 1.1.2 EDSV 的形态结构和理化特性 |
| 1.1.3 EDSV 的宿主范围和培养特性 |
| 1.2 EDSV 分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 EDSV 基因组结构 |
| 1.2.2 EDSV 基因组的转录与复制 |
| 1.2.3 末端倒置重复序列(ITR) |
| 1.2.4 E1 区 |
| 1.2.5 E2 区 |
| 1.2.6 E3 区和E4 区 |
| 1.2.7 EDSV 基因组编码蛋白 |
| 1.3 减蛋综合症 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 症状及病变 |
| 1.3.3 减蛋综合症诊断技术研究进展 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌种与载体 |
| 2.1.2 酶类及标记物 |
| 2.1.3 分子生物学试剂 |
| 2.1.4 阳性血清 |
| 2.1.5 生化试剂 |
| 2.1.6 仪器和设备 |
| 2.1.7 主要试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 减蛋综合症病毒Hexon 蛋白抗原优势区域的初步筛选 |
| 2.2.2 减蛋综合症病毒Hexon 蛋白抗原优势区域的第二轮筛选 |
| 2.2.3 减蛋综合症病毒 Hexon 蛋白优势抗原表位的第二轮筛选 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 减蛋综合症病毒Hexon 蛋白抗原优势区域的初步筛选 |
| 3.1.1 HA~HF 基因的PCR 扩增结果 |
| 3.1.2 重组克隆载体质粒pMD18-T-HA~HF 的构建 |
| 3.1.3 重组表达载体质粒pET-30a-HA~HF 的构建 |
| 3.1.4 HA~HF 基因在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 |
| 3.1.5 HA~HF 表达蛋白的Western blot 分析 |
| 3.2 减蛋综合症病毒Hexon 蛋白抗原优势区域的第二轮筛选 |
| 3.2.1 HB-1~6 和HDE-1~13 基因的PCR 扩增结果 |
| 3.2.2 重组表达载体质粒pET-32a-HB-1~HDE-13 的构建 |
| 3.2.3 HB-1~6 和HDE-1~13 基因在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 |
| 3.2.4 HB-1~6 和HDE-1~13 表达蛋白的Western blot 分析 |
| 3.3 减蛋综合症病毒Hexon 蛋白抗原优势区域的第三轮筛选 |
| 3.3.1 重组表达载体质粒pET-32a-HB-34-1~HDE-910-5 的构建 |
| 3.3.2 HB-34-1~ HDE-910-5 基因在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 |
| 3.3.3 HB-34-1~ HDE-910-5 表达蛋白的Western blot 分析 |
| 3.4 减蛋综合症病毒Hexon 蛋白优势抗原表位的分布 |
| 3.5 减蛋综合症病毒Hexon 蛋白优势抗原表位的分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 选择减蛋综合症病毒Hexon 蛋白作为筛选目的蛋白的依据 |
| 4.2 抗原优势表位鉴定方法的选择 |
| 4.3 短肽基因的克隆策略 |
| 4.4 减蛋综合症病毒Hexon 蛋白优势抗原表位的筛选 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（6）禽流感（H9N2亚型）酶标抗体的制备及双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 AI病毒H9N2型毒株 |
| 1.1.2 主要试剂与材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 AI酶标抗体的制备 |
| 1.2.1.1 AI高免血清的制备 |
| 1.2.1.2 AI-IgG的分离与提纯 |
| 1.2.1.3 AI酶标抗体的制备 |
| 1.2.2 Dot-ELISA试验条件的筛选 |
| 1.2.3 Dot-ELISA敏感性试验 |
| 1.2.4 Dot-ELISA特异性的检测 |
| 1.2.5 包被膜保存期的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 AI酶标抗体的制备 |
| 2.2 Dot-ELISA条件的筛选 |
| 2.3 优化的Dot-ELISA操作程序 |
| 2.3.1 压迹 |
| 2.3.2 点样 |
| 2.3.3 封闭 |
| 2.3.4 与被检抗原反应 |
| 2.3.5 与酶标抗体反应 |
| 2.3.6 显色 |
| 2.3.7 终止反应 |
| 2.3.8 结果判定 |
| 2.4 敏感性的测定 |
| 2.5 特异性的测定 |
| 2.6 包被膜保存期的测定 |
| 3 讨论 |
（7）鸭减蛋综合征PCR检测方法建立及西南地区血清流行病学调查（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 减蛋综合征病毒分类 |
| 2 流行病学特点 |
| 3 EDSV病原特性 |
| 4 EDSV100K蛋白结构与功能 |
| 5 减蛋综合征的诊断和检测技术 |
| 5.1 临床诊断 |
| 5.2 剖检诊断 |
| 5.3 实验室诊断 |
| 5.3.1 病原分离和鉴定 |
| 5.3.2 清学诊断 |
| 5.3.3 分子生物学诊断 |
| 6 以EDSV作为基因工程载体的研究 |
| 研究目的与意义 |
| 第一章 鸭减蛋综合征PCR检测方法的建立及对样品的检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株、菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 试验耗材及主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.5.1 生理盐水的配制 |
| 1.5.2 pH 7.20.01 mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS) |
| 1.5.3 6×上样缓冲液 |
| 1.5.4 50×TAE |
| 1.6 样品采集 |
| 1.6.1 采集地选取 |
| 1.6.2 血样处理 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 病毒增殖 |
| 2.3 病毒DNA抽提 |
| 2.4 病毒DNA浓度和纯度测定 |
| 2.5 PCR反应条件的优化 |
| 2.6 PCR产物的鉴定 |
| 2.6.1 电泳鉴定 |
| 2.6.2 测序鉴定 |
| 2.7 PCR特异性试验 |
| 2.7.1 检测其他抗原 |
| 2.7.2 实验感染母鸭各脏器的PCR检测 |
| 2.8 PCR敏感性试验 |
| 2.9 将建立的PCR检测方法用于血样检测 |
| 2.9.1 凝块白细胞层DNA的提取 |
| 2.9.2 样品DNA的PCR检测 |
| 2.10 阳性样品测序并进行生物信息学分析 |
| 2.10.1 核苷酸序列分析 |
| 2.10.2 氨基酸序列分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 PCR反应条件优化结果 |
| 3.2 PCR产物的鉴定 |
| 3.3 PCR特异性试验 |
| 3.3.1 检测其他抗原 |
| 3.3.2 实验感染母鸭各脏器的PCR检测 |
| 3.4 PCR敏感性试验 |
| 3.5 样品PCR检测结果 |
| 3.6 阳性样品测序并进行生物信息学分析 |
| 3.6.1 阳性样品测序结果 |
| 3.6.2 核苷酸序列分析 |
| 3.6.3 氨基酸序列分析 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 西南地区鸭减蛋综合征血清学调查 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 标准抗原、阳性血清 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试验耗材及主要仪器 |
| 1.4 溶液的配制 |
| 1.4.1 生理盐水的配制 |
| 1.4.2 血细胞保护液(阿氏液) |
| 1.4.3 1%鸡红细胞悬液的配制 |
| 1.4.4 pH7.20.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS) |
| 1.5 样品采集 |
| 1.5.1 采集地选取 |
| 1.6.2 样处理 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 抗原凝集效价测定 |
| 2.2 配制抗原工作液 |
| 2.3 血凝抑制试验 |
| 2.4 结果判定 |
| 2.4.1 当对照出现下列结果时试验成立 |
| 2.4.2 判定标准 |
| 2.5 人工感染母鸭组织带毒检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 血凝抑制试验结果 |
| 3.2 人工感染母鸭组织带毒检测 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 主要参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表论文 |
（8）鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗的研制及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鸭腺病毒研究现状 |
| 1.1 鸭腺病毒在腺病毒中的分类地位 |
| 1.2 鸭腺病毒的形态结构 |
| 1.3 鸭腺病毒基因组结构和功能 |
| 1.4 鸭腺病毒理化性质 |
| 1.5 鸭腺病毒感染禽类引起的疾病 |
| 1.5.1 鸡减蛋综合征 |
| 1.5.2 鸭腺病毒病 |
| 1.6 检测鸭腺病毒感染的方法 |
| 1.6.1 病原分离鉴定 |
| 1.6.2 血清学方法 |
| 1.6.3 分子生物学方法 |
| 2 蜂胶及其应用 |
| 2.1 蜂胶 |
| 2.1.1 蜂胶的免疫佐剂作用 |
| 2.1.2 蜂胶佐剂提高体液免疫功能 |
| 2.1.3 蜂胶佐剂提高细胞免疫功能 |
| 2.1.4 蜂胶对免疫器官的作用 |
| 2.1.5 蜂胶的安全性 |
| 2.2 蜂胶佐剂的应用 |
| 3 选题目的 |
| 第二章 鸭腺病毒蜂胶灭活苗的研制及其免疫原性研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 参考毒(菌)株 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 主要试验试剂及配方 |
| 1.4.1 血凝及血凝抑制试验试剂 |
| 1.4.2 ELISA试验试剂 |
| 1.4.3 MTT试验试剂 |
| 1.5 试验仪器 |
| 1.6 其他试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 研制鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗 |
| 2.1.1 制备种毒 |
| 2.1.2 制备蜂胶灭活苗 |
| 2.2 检测鸭腺病毒抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.1 抗原的制备与纯化 |
| 2.2.2 阴性血清制备 |
| 2.2.3 阴性鸭IgG的提取 |
| 2.2.4 酶标二抗最佳稀释度的确定 |
| 2.2.5 抗原和血清最佳稀释度的确定 |
| 2.2.6 血清最佳作用时间的确定 |
| 2.2.7 鸭腺病毒阴性血清临界值的确定 |
| 2.2.8 间接ELISA操作程序 |
| 2.2.9 特异性试验 |
| 2.2.10 敏感性试验 |
| 2.2.11 重复性试验 |
| 2.3 鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫种鸭及免疫应答监测 |
| 2.3.1 鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫种鸭 |
| 2.3.2 鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫实验鸭的抗体监测 |
| 2.3.3 鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫实验鸭的细胞免疫监测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 研制鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗 |
| 3.1.1 测定半数感染量(EID_(50)) |
| 3.1.2 种毒检验 |
| 3.1.3 蜂胶含量测定 |
| 3.1.4 疫苗性状、疫苗的无菌检验和安全性检验 |
| 3.2 检测鸭腺病毒抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 3.2.1 抗原制备与纯化 |
| 3.2.2 阴性血清制备 |
| 3.2.3 阴性鸭IgG的提取 |
| 3.2.4 HRP-羊抗鸭IgG最佳稀释度 |
| 3.2.5 抗原和血清最佳稀释度 |
| 3.2.6 血清最佳作用时间 |
| 3.2.7 鸭腺病毒阴性血清临界值 |
| 3.2.8 特异性试验结果 |
| 3.2.9 敏感性试验结果 |
| 3.2.10 重复性试验结果 |
| 3.3 鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗免疫种鸭及免疫应答监测 |
| 3.3.1 种鸭免疫后血清抗体ELISA效价测定 |
| 3.3.2 种鸭免疫后血清抗体血凝抑制(HI)效价测定 |
| 3.3.3 鸭淋巴细胞转化试验结果 |
| 3.3.4 白细胞吞噬试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 疫苗的研制 |
| 4.2 间接ELISA方法的建立 |
| 4.2.1 抗原的纯化 |
| 4.2.2 抗原和血清稀释度 |
| 4.2.3 酶标二抗浓度的确定 |
| 4.2.4 临界值的确定 |
| 4.3 疫苗对种鸭体液免疫的影响 |
| 4.3.1 间接ELISA试验 |
| 4.3.2 血凝试验和血凝抑制试验 |
| 4.4 疫苗对种鸭细胞免疫的影响 |
| 4.4.1 疫苗对鸭外周血T淋巴细胞转化效果的影响(MTT法) |
| 4.4.2 白细胞吞噬试验 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
四、Dot-ELISA检测减蛋综合征病毒的研究（论文参考文献）
- [1]减蛋综合征病毒五邻体、纤维蛋白和六邻体的原核表达及抗原性分析[D]. 肖妙. 东北农业大学, 2008(03)
- [2]减蛋综合征病毒NE4株全基因组序列测定与分析和环介导等温扩增检测方法的建立[D]. 董春娜. 甘肃农业大学, 2011(05)
- [3]Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立[J]. 黄显明,张小飞,李春芬,廖俊伟,毛火云. 中国兽医科学, 2008(01)
- [4]减蛋综合征贵州分离毒全基因组探针的制备及检测[J]. 韩丽珍,曹蔚,吴彤. 山地农业生物学报, 2000(03)
- [5]减蛋综合症病毒结构蛋白六邻体优势抗原表位分析[D]. 杨华. 东北农业大学, 2010(05)
- [6]禽流感（H9N2亚型）酶标抗体的制备及双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立[J]. 张春杰,王大军,吴庭才,李银聚,余祖华,程相朝. 河南农业科学, 2006(10)
- [7]鸭减蛋综合征PCR检测方法建立及西南地区血清流行病学调查[D]. 罗念. 四川农业大学, 2013(03)
- [8]鸭腺病毒蜂胶灭活疫苗的研制及其免疫原性研究[D]. 纪凤仙. 四川农业大学, 2014(07)
- [9]鸭源新城疫病毒和减蛋综合征病毒在同一鸭胚中增殖的观察[J]. 姜平,陈溥言,何琴娟,朱琴亚. 南京农业大学学报, 1994(02)
- [10]Dot-ELISA检测减蛋综合征病毒的研究[J]. 王雪敏,郑明球,蔡宝祥,陈溥言. 中国畜禽传染病, 1998(01)