一、马传贫驴白细胞弱毒疫苗毒和驴强毒全基因核苷酸序列测定（论文文献综述）
刘影[1]（2017）在《马传染性贫血病毒EIAVYN的全基因组分析及囊膜蛋白免疫学特性分析》文中研究说明马传染性贫血病毒（EIAV,Equine infectious anemia virus）是马属动物传染病-马传染性贫血（EIA,Equine infectious anemia）的病原,其与人免疫缺陷病毒（HIV-1/2）、猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus,SIV）、牛免疫缺陷病毒（Bovine immunodeficiency virus,BIV）及猫免疫缺陷病毒（Feline immunodeficiency virus,FIV）等同属于逆转录病毒科慢病毒属成员。EIAV感染马属动物引发的马传染性贫血,严重危害马属动物健康,是世界范围内严格防控的马属动物疫病。全面、详细的流行病学数据,是有效执行疫病防控的重要科学依据。但到目前为止,世界范围内仅有4株EIAV野外分离株的全基因组序列完成测定,他们分别是EIAVWYO（美国）、EIAVLIA（中国）、EIAVIRE（爱尔兰）和EIAVMIY（日本）。有限的基因组信息,限制了对全球EIAV进化与流行规律的解析,需要完成更多现地分离毒株的基因序列测定,丰富EIAV的基因组信息。为此,本研究中,我们对保存于本实验室的采自于中国云南的EIAV感染血清阳性骡脾脏淋巴结病料中的EIAV前病毒DNA,完成了全序列测定与基因遗传变异分析。我们将该现地分离株命名为EIAVYN。经序列测定与分析,我们发现与已公布全基因组序列的EIAV参考毒株相比较,EIAVYN表现出较低的基因组同源率,平均为80%左右。其与分离自日本野马体内的EIAVMIY的相似性最高,也仅为82.5%。基于全基因组序列构建的遗传进化树分析显示,该毒株已形成了相对独立的分支,与参考毒株间均具有较远的遗传距离。进一步的Simplot分析,未发现该毒株基因组中重组有其他参考毒株的基因片段。同时,我们也通过聚类分析（alignment analysis）分别比较了EIAVYN与参考毒株在LTR、Gag、Pol和Env基因及预测的相应氨基酸序列间的差异。相对于参考毒株,在主要结构蛋白中,EIAVYN Env变异水平最高（35%左右）,而非结构蛋白中,S2的突变水平最高。基因突变会影响到病毒相应的生物学功能。已有研究显示,EIAV Env的变异,一方面表现出明显的免疫逃逸特征,主要是逃逸宿主中和抗体的中和作用;另一方面也可能影响到宿主天然免疫限制因子Tetherin限制EIAV病毒复制的作用。为确定EIAVYN Env变异对其逃逸中和抗体和拮抗宿主限制因子作用的影响,我们开展了以下两方面实验。一方面,对于逃逸中和抗体中和作用的能力,我们采用不同毒株的Env蛋白表达质粒（pVR1012-3-8-Env、pVR1012-LN-Env、pVR1012-UK-Env、pVR1012-YN-Env）、Pony8.1及UKGP共转293T细胞包装假病毒,将假病毒与疫苗免疫马（5#、8#）血清共孵育,之后感染稳定表达EIAV病毒受体ELR1的293T细胞系。通过检测细胞中荧光素酶活性,计算疫苗免疫马血清中和50%假病毒感染的血清稀释倍数。结果显示,疫苗免疫马血清可50%中和各毒株感染的血清稀释倍数从高到低依次是:pVR1012-3-8-Env>pVR1012-LN-Env>pVR1012-UK-Env>p VR1012-YN-Env。虽然疫苗血清仍然具有对EIAVYN毒株的中和作用,但相对于疫苗同源毒株,其仍表现出了对疫苗免疫马血清中和作用的部分逃逸。免疫血清中和不同毒株的能力,与不同毒株囊膜的变异间具有相关性（5#R2=0.99,8#R2=0.96）。另一方面,对于EIAVYN Env拮抗Tetherin分子限制病毒复制的作用,我们采用不同病毒囊膜蛋白表达质粒、VR-GP2及pcDNA3.1-Eq-Tetherin共转染293T细胞,比较EIAVYN与各参考毒株Env与马Tetherin分子间的相互作用差异。实验结果显示,Env对抗Tetherin限制作用的差异为:pVR1012--LN-Env>p VR1012-UK-Env>pVR1012-3-8-Env>pVR1012-YN-Env。EIAVYN拮抗Tetherin作用较弱的原因,可能源于马、骡二者Tetherin分子的遗传差异及病毒对骡体内长期复制的适应。综上,本研究完成了一株EIAV现地分离株的全基因序列测定及分析,其相对于已公布全基因序列的EIAV毒株表现出高水平变异,该发现进一步丰富了EIAV现地毒株的基因多样性水平。而通过揭示该毒株在逃逸免疫中和抗体和宿主天然免疫限制因子限制作用上的特点,促进了对EIAV自身变异与逃逸宿主免疫控制间关联性的研究,增进了对EIAV免疫机理的理解。
全滟平,赵立平,韩秀娥,沈楠,吕晓玲,沈荣显,相文华[2]（2007）在《马传染性贫血病毒第1 9、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA全基因序列分析》文中认为不同代次马传染性贫血驴胎皮肤细胞弱毒（Fetal donkey dermal virus,FDDV）的免疫保护效果各不相同,只有第10～15代驴胎皮肤细胞弱毒具有良好的免疫保护效果,可作为疫苗使用,继续传代则疫苗的保护率下降。为确定有、无免疫保护效果的FDDV在基因水平上的差异,本实验对无免疫保护效果的第19、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA进行了全基因序列测定,并与已测序的疫苗毒株进行序列比较。第19代和第26代FDDV全基因核苷酸序列同源性高达99.5%,与疫苗毒株全基因核苷酸序列的同源性分别为96.9%、96.7%。LTR是EIAV在细胞传代中变异最显着的区域,第19、26代FDDV的LTR与疫苗毒的LTR同源性仅为89.6%、89.3%。马传贫病毒的gag基因高度保守,第19、26代FDDV与疫苗毒株的gag基因推导氨基酸序列仅有2个氨基酸不同。第19、26代FDDV与疫苗毒株的pol基因、env基因的推导氨基酸序列的同源性分别为98.9%、98.8%、93.7%、93.6%。由序列比较结果可以推断,第19代、第26代FDDV不具有免疫保护效果的主要原因可能是由于LTR和env基因的变异,导致病毒复制能力下降或免疫原性丧失,不能诱导机体产生良好的免疫反应。
周涛[3]（2007）在《马传染性贫血病病毒的基因变异与生物学特性研究》文中研究表明马传染性贫血病病毒（EIAV），慢病毒属成员，主要引起马属动物慢性、终生感染，以周期性发热、病毒血症、贫血和血小板减少为特征。70年代，EIAV弱毒疫苗通过以下策略成功研制：首先，将马强毒EIAV-L经过驴体体内传代113次，获得了高毒力的驴强毒EIAV-DA；然后，将EIAV-DA经驴白细胞体外传125代，获得弱毒疫苗EIAV-DLA，该疫苗可保护马和驴免受同源和异源的野生型高毒力EIAV的攻击。中国EIAV的弱化过程可以为研究其他慢病毒疫苗提供有益借鉴，然而EIAV-L和EIAV-DLA的分子生物学特性还有待澄清。基于这个原因，本研究中将7匹试验马分别接种EIAV-DLA、vOK8266、vOK8266chltr或者空白对照，之后用EIAV-L对所有试验马进行攻击。vOK8266是EIAV-DLA的感染性分子克隆（命名为pOK8266）的衍生病毒。将pOK8266的5’和3’LTR替换成EIAV-L的5’和3’LTR得到嵌合感染性分子克隆（命名为pOK8266chltr），vOK8266chltr则是pOK8266chltr的衍生病毒。攻毒前后，对每种病毒的体内复制动力学以及抗gp45、p15、p26、p11和p9抗体进行定期监测。此外，对于EIAV两个重要的基因长末端重复序列（LTR）和表面糖蛋白（gp90）的基因型与表型的关系进行探讨。具体研究内容如下：1、免疫期和攻毒期观察试验马EIA疾病进展7匹血清抗EIAV抗体阴性马分别命名为1#、2#、4#、5#，6#、7#和8#。4#和5#接种克隆毒vOK8266，6#和7#接种嵌合毒vOK8266chltr，8#接种疫苗毒EIAV-DLA，1#和2#为接种对照。6个月后，对5匹接种马和2匹接种对照马以野生型强毒EIAV-L攻击。攻毒前后，每天观察各试验马直肠温度和临床症状。免疫期的6个月中，各试验马没有出现发热现象，表明各接种毒株对试验马是安全的，即使vOK8266chltr的LTR是来源于强毒EIAV-L的。攻毒后，1#、2#和7#出现典型的马传贫症状，经过数个发热期后死亡，其余各试验马在攻毒后13个月的观察期内没有出现任何发病症状。2、马体内EIAV的复制动力学为了研究每种病毒在试验马体内的复制情况，攻毒前后对各试验马血浆中病毒RNA载量和外周血单核细胞（PBMC）前病毒DNA载量进行了定期检测。进行检测之前，首先建立了用于检测EIAV基因组的realtime PCR和realtime RT-PCR的标准曲线。攻毒前的大多数时期，vOK8266chltr接种的试验马血浆RNA载量为每毫升血浆104到105拷贝，比vOK8266和EIAV-DLA接种的试验马在同时期的血浆RNA载量要高，后两者的RNA载量一般低于104拷贝。结果表明EIAV-L的LTR比EIAV-DLA在体内有更高的启动子活性。然而，并没有发现PBMC前病毒DNA载量有类似的差异。攻毒后，与未发病马相比，发病马血浆在发热期含有高得多的病毒RNA载量（高于每毫升106拷贝），而在发热间歇期，病毒RNA载量也高于每毫升血浆105拷贝。结果表明高水平的病毒复制可促进疾病进展。攻毒3个月后，多数未发病马检测不到血浆病毒RNA，表明在这些未发病马体内病毒复制受到抑制。然而，攻毒前后的任何采样时期，在发病马和未发病马体内都能检测到前病毒DNA。体内前病毒DNA的持续存在对EIAV持续感染的作用有待于进一步研究。3、抗体反应为了评价感染动物对疫苗毒和强毒的免疫反应，攻毒前后，利用ELISA方法定期检测所有试验马针对病毒gp45、p15、p26、p11和p9的特异性抗体。免疫后，4#和5#体内的抗gp45、p15和p26的抗体早于或高于其它试验马，可能是由于vOK8266chltr在马体内的复制水平高于vok8266和EIAV-DLA。攻毒后，发病的1#和7#体内抗gp45，p15和p26的抗体很快达到峰值并一直维持在高水平，而2#在大多数抗体产生前死亡。与之不同的是，除6#外，其余未发病马体内抗gp45，p15，p26，p11和p9的抗体水平在攻毒后一直不高。攻毒前后，未发病的6#与发病的7#有着相似的抗体水平，这可能是由于它们都接种vOK8266并都用EIAV-L攻击所致。以上结果表明，高的抗体水平与试验马的保护之间没有必然联系。p11和p9抗体只有在攻毒后的发病马体内能被检测到，提示这两种抗体的产生可能预示着EIA的疾病进展。4、体内和体外前病毒gp90的变异趋势病毒gp90和LTR是EIAV基因组变异最大的区域，两者对病毒致病性都起着重要作用。了解这两个基因的变异趋势对研究EIAV控制策略是至关重要的。攻毒前后从定期采集自1#，4#（或5#），7#和8#的白细胞样品中提取总DNA，巢式PCR扩增包含前病毒gp90基因高变区2（V2）到高变区5（V5）的片段。对免疫期获得的序列进行比较分析，结果表明EIAV-DLA的gp90是一个准种，而在EIAV-DLA接种马体后它会变为一个更为复杂的准种。在8#体内，EIAV-DLA序列有向EIAV-L突变的趋势，提示我们可能存在EIAV-DLA毒力返强的危险。免疫了vOK8266和vOK8266chltr的试验马体内病毒gp90也有类似的变化。所有试验马用EIAV-L攻击后，只有EIAV-L的序列被克隆到。发病马体内病毒gp90发生了高度的序列变异，且变异比较集中于V3区，而未发病马体内的gp90只有中等程度的变异。新的发热期伴随着新gp90准种的出现，新准种带有大量的PND变异，提示PND的突变可能对病毒逃避宿主免疫系统的监视起重要作用，免疫逃避可以造成EIAV持续性感染和促进疾病进展。病毒gp90序列的ds／dn值表明机体对病毒的免疫选择压力在发病马的慢性感染期是强阳性的，但是未发病马的免疫选择压力一直较弱。此外，只有在未发病马体内获得了大量gp90缺陷突变体，这可能是使病毒复制水平降低而使感染马存活的原因之一。突变产生的终止密码子多数位于V4区的缺陷“热点”。5、体内和体外前病毒LTR的变异趋势分别从感染EIAV-DA或EIAV-DLA的体外培养驴MDM、感染EIAV-L的马PBMC、定期采集的试验马1#，4#和8#的PBMC等样品中半巢式PCR扩增前病毒LTR。从EIAV-L、EIAV-DA和EIAV-DLA中分别获得11、10和14个LTR序列，比较结果表明LTR-L和LTR-DA都为单一序列，而LTR-DLA则是一个由不同序列构成的准种，提示我们病毒在体外传代弱化的过程是LTR-DLA复杂准种形成的主要原因。在LTR-DLA的U3和R区分别定义了两个高变区。有意思的是LTR-DLA准种接种8#后，LTR-DLA12被迅速选择为优势序列并且此后高度保守。从1#和4#获得的序列也表明LTR在病毒的体内感染过程中是高度保守的。6、不同EIAV毒株LTR的启动子活性研究为了阐明LTR-DLA的高变区A和B的突变对LTR功能的影响，分别从EIAV-L、EIAV-DA和EIAV-DLA中选择1个或2个具有代表性的LTR序列，构建pLTR／CAT系列质粒。通过EIAV-L的LTR R区替换EIAV-DLA的R区获得了2个嵌合pLTR／CAT质粒。在加或不加EIAV-L Tat表达质粒的情况下，pLTR／CAT质粒转染马单核巨噬细胞。结果表明，在体外培养细胞中，所有LTR的基础转录活性都很低，并且它们之间的差异不显着。在共转染Tat表达质粒时，LTR-DLA较EIAV-L和EIAV-DA有更高的LTR启动子增强活性。强弱毒LTR的嵌合体pLTR／CAT质粒的转染结果表明，强弱毒LTR之间启动子活性差异主要是由R区的序列差异造成的，与U3区序列关系不大。特别是LTR TAR起始位置从强毒到弱毒的突变（A到G）改变了TAR的二级结构，这可能会影响Tat与TAR的相互作用。此外，在U3-R交界处发生的核苷酸变异可能会对病毒RNA的合成产生影响。
全滟平[4]（2007）在《中国马传染性贫血病毒LTR启动子活性及EIAVFDD弱毒株生物学特性研究》文中研究表明我国研制成功的马传染性贫血驴白细胞弱毒(equine infectious anemia virus donkey leukocyteattenuated，EIAVDLA)疫苗成功控制了马传染性贫血病在我国的流行。该疫苗具有良好的安全性和有效性，成为研究包括人艾滋病病毒在内的慢病毒疫苗的良好自然动物模型。EIAV弱毒疫苗研制成功的路线是：将一株来源于马体的EIAV强毒（辽毒株、EIAVL）经过驴体连续传代100余代使病毒毒力增强后获得了驴强毒株（EIAVD，对马和驴90％致死率），然后将驴强毒株通过驴白细胞体外连续培养驯化120代，使病毒毒力丧失的同时保持了良好的免疫原性，最终培育成功了EIAV驴白细胞弱毒疫苗(EIAVDLA)。将驴白细胞弱毒疫苗进一步通过驴胎皮肤细胞继代，又获得比驴白细胞弱毒疫苗免疫保护效果更好的驴胎皮肤细胞（fetal donkey dermal cells，FDD）弱毒疫苗。前病毒DNA基因组两端是长末端重复序列（long terminal repeat，LTR），LTR含有控制病毒RNA转录的启动子和增强子。LTR是基因组变异率最高的区域。本研究对驴白细胞弱毒疫苗株(EIAVDLA)及其在驴胎皮肤细胞上传代获得的各代次驴胎皮肤细胞弱毒(第1-26代EIAVFDD)LTR进行测序分析及LTR的启动子功能比较。EIAV以准种形式存在，EIAVDLA、EIAVFDD LTR存在多种类型，一些类型占主要优势。EIAVDLA LTR按负调节区（NRE）序列不同可分为四种类型：NREⅠ型与强毒株NRE区长度相同但存在点突变现象，占EIAVDLALTR的1/3；NREⅢ型的NRE有17nt插入、10nt缺失，占EIAVDLALTR的2/3，而只插入17nt的NREⅡ型、只缺失10nt的NREⅣ型每种类型只检测到1个克隆。增强子区部分克隆有一段16nt的插入序列，其中包含1个PU.1细胞转录因子结合位点。EIAVDLA LTR转录起始位点分为GGTC、AAAC、AGAC和GAAC等四种类型，在所测序的21个克隆中所占比例分别为23.8％、47.6％、14.3％和14.3％。强毒株的转录起始位点为GGAC。启动子活性比较实验说明负调节区的插入序列对LTR的启动子活性有一定抑制作用，增强子区插入序列对LTR的启动子活性有一定增强作用，但均未达到显着性差异。转录起始位点对LTR启动子活性大小的影响顺序为：GGTC＞AAAC＞AGAC＞GGAC，但差异不显着。第13、26代EIAVFDD LTR的启动子活性在马巨噬细胞和驴胎皮肤细胞中显着高于EIAVDLA、EIAVD LTR的启动子活性，EIAVD LTR的活性最低。疫苗培育过程中不同阶段EIAV随着病毒毒力的降低，LTR的启动子活性逐渐增加。实验表明LTR是EIAV细胞嗜性及毒力的影响因素之一。EIAVDLA在驴胎皮肤细胞传代过程中LTR负调节区也发生了明显变异。第10代EIAVFDDLTR开始出现11nt的插入序列（GATGACTAGCT）；第13代插入序列发生突变（CCCTTATGA CTAGCT），但不占主要优势，在第23代含有这段插入序列的LTR序列成为绝对优势的类型；第21代EIAVFDD LTR 49nt后缺失了CTCTCA。第23代LTR序列的第24-63nt有10个A→G的突变，在第23、26代LTR序列中占主要优势。由于大量点突变的出现，使第23代LTR的第54-68nt与第70-83nt形成不完全重复。LTR的启动子活性比较实验说明：随着EIAVDLA在驴胎皮肤细胞中传代次数的增加，EIAVFDD LTR的启动子活性逐渐增强，但差异不显着（P＞0.05）。病毒感染细胞提供Tat，LTR启动子的激活活性是基础活性的1.5-2.7倍。EIAVDLA LTR启动子活性在皮肤细胞中显着低于EIAVFDD LTR，P＜0.01。用PCR方法对第19、26代EIAVFDD前病毒全基因进行分段克隆与测序。对无免疫保护性的第19、26代EIAVFDD全基因序列与四个参考毒株比较分析发现，gag只有1个氨基酸与四个参考毒株不同，但与国外毒株1369株相应位置氨基酸相同；pol复制酶发生8处氨基酸变异，有3处氨基酸变异导致疏水性改变。env基因发生了多处稳定性点突变，Env的gp90缺失了2个N-连接糖基化位点，主要中和决定区有1个氨基酸突变，但亲水性没有改变。gp45与EIAVFDD疫苗株一样有TM截短现象。S1基因编码的Tat蛋白氨基酸序列未发生变异。S2蛋白氨基酸序列无变异。S3编码的Rev发生3处突变，有两处氨基酸的突变，其中1个氨基酸突变位点位于Rev功能的基本区，基本区前还出现一段26个氨基酸缺失，这3个突变位点对Rev的功能及病毒毒力的影响有待于进一步研究。将第26代EIAVFDD弱毒接种马体后，病毒载量处于极低水平，接近检测下限，诱导的抗体反应微弱，接种后6个月内未检测到LTR序列的变异。
王雪峰[5]（2007）在《中国马传染性贫血病毒驴强毒株与驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组序列分析》文中研究指明马传染性贫血病毒是反转录病毒科慢病毒属的重要成员,是马传染性贫血的病原体。在上世纪七十年代我国成功研制的马传染性贫血白细胞弱毒疫苗,为我国成功控制了马传染性贫血的流行。马传然性贫血白细胞弱毒疫苗的致弱机理将为其他慢病毒疫苗的开发提供借鉴。本文为阐明马传染性贫血弱毒疫苗的致弱机制和免疫保护机理,结合准株理论,利用LA-PCR技术对马传染性贫血病毒驴强毒株（DV）和驴白细胞弱毒疫苗株（DLV）的前病毒DNA分两段进行扩增,挑取多个克隆测序。最后获得10个DLV前病毒序列,4个DV前病毒DNA序列,21个DLV的LTR,19个DV的LTR,并构建了DV的全长克隆。通过分析比较得出,DV前病毒基因组与DLV前病毒基因组的平均差异率是2.8%。其中S2、LTR和env基因差异较大,核苷酸序列差异率分别是4.1%、3.9%和3.1%;S2、S3和env推导的氨基酸的差异率较大,分别是10.4%、5.6%和4.8%。与国外毒株相比,中国马传染性贫血病毒属于独特的一个支系。本实验首次发现体外培养的DLV株的至少有5种类型的LTR混合存在。gp90推导的氨基酸序列上中国EIAV强毒株比弱毒株多2个N-糖基化位点,其中强毒株有3个特有的N-糖基化位点;弱毒株有1个。总之,本文结合准株理论对中国马传贫驴强毒株和白细胞弱毒疫苗株前病毒基因组核苷酸进行分析,对中国马传贫病毒强弱毒株间的一致性变化进行了讨论,并成功构建了DV株的全长基因组克隆,为进一步研究EIAV毒力的变化和免疫保护的分子机制奠定了基础。
耿庆华[6]（2006）在《我国马传染性贫血弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立及标记疫苗的研究》文中研究表明本研究用PCR方法对马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株（Agen-EIAV）感染马外周血白细胞的前病毒DNA进行了分段扩增,克隆和序列测定,并参考Genbank已经发表的马传染性贫血病毒核苷酸序列,应用基因分析软件拼接出Agen-EIAV全基因核苷酸序列。经分析Agen-EIAV株前病毒基因组全长为8227bp,与我国马传贫辽宁强毒株（LN）、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株（DLV）及美国代表毒株（AF028232）核苷酸序列比较,同源率分别为65%、65%和75%。与AF028232株gag、pol和env、gp90和gp45基因核苷酸同源率分别为99%、99%、75.6%、69.4%和80.4%;而与我国DLV的同源率分别为79.7%,82.3%,72.8%,65.2%和78.6%。Agen-EIAV株gag和gp90推导氨基酸序列与美国4个毒株的氨基酸序列高度同源,而与我国4个毒株却存在很大的差异。 本研究对接种Agen-EIAV的试验马（16#）出现的四个发热期（23d、40d、51d和70d）的外周血单核细胞前病毒DNAgag和gp90的核苷酸序列进行了监测,结果发现四个发热期中前病毒gag核苷酸序列变化不明显,变异率在1%之内。gp90核苷酸序列变化较大,变异率在8～10%之间,可划分出A1、A2、A3和A4四个高变区。其中A1、A3和A4在马体发病的整个过程中均发生一次变异,而A2区在第三个发热期发生变异后,在第四个发热期又回复了突变。结果表明,gag在马传染性贫血病毒与宿主细胞基因组整合之后非常稳定,可以选择此区域设计鉴别诊断的引物。从gp90推导的氨基酸序列可划分为5个可变区,都与N-连接的糖基化位点有关系,进一步证明马传贫病毒囊膜糖基化位点的变化与毒力相关。 本研究在对马传染性贫血病毒美洲等流行毒株和我国弱毒疫苗株全基因序列比较分析的基础上,共设计了11条引物,用于在病毒接种驴白细胞培养物上进行PCR鉴别诊断引物的筛选,通过试验筛选确定选用在gag区设计的6条引物。通过对2匹健康马（2#和31#）,9匹分别接种我国DLV（1#、9#和10#）、Agen-EIAV（16#、45#和46#）和美国代表毒株（Wyoming-EIAV）（3#、4#和44#）试验马的检测及PCR反应条件的进一步优化,而确定鉴别马传贫病毒美洲流行毒株和我国弱毒疫苗株的套式多重PCR方法。试验结果表明当用引物C1/C2n/C3n进行第二轮PCR扩增时,从我国DLV接种马外周血白细胞中可扩增出与设计相符的两个片段,分别为675bp和400bp,而美洲流行毒株接种马外周血白细胞只能扩增一条675bp的片段;当用引物C1/AF2n/C3n进行扩增时,从我国DLV接种马外周血白细胞中可扩增出一条675bp的片段,而美洲流行毒株接种马外周血白细胞却能扩增出两个片段,分别为675bp和400bp。而健康马外周血白细胞扩增不任何条带。本试验同时对3匹疫苗免疫马、2匹美洲流行毒株慢性传贫马（45#和46#）和4匹急性传贫马（16#、3#、4#和44#）进行了长时间的跟踪检测,分别可在接毒后最早第7-30天从外周血中检出病毒,至接种后12个月大都可以检出。结果表明本试验建立的PCR鉴别诊断方法具有很好的稳定性和可重复性。本试验还用real-time PCR的方法检验本试验建立的PCR鉴别诊断方法的敏感性,结果表明套式多重PCR可以检出我国DLV免疫马最低病
左咏梅[7]（2006）在《马传染性贫血病毒LTR关键点突变对DLV致弱机理的研究》文中研究指明马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus,EIAV）可以引起马属动物的一种急性烈性传染病,以贫血、持续感染、反复发热为特征,终生持续感染,是马属动物最重要的传染病之一。EIAV与人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）同属逆转录病毒科、慢病毒属成员,两者在抗原特性、基因组结构等方面极为相似,以及从经济与安全性角度上考虑,EIAV将是研究HIV乃至慢病毒的最理想的动物模型。沈荣显等科学家于20世纪70年代通过体外细胞传代致弱路线研制成功了马传贫驴白细胞弱毒疫苗,是迄今世界上唯一大规模成功应用的慢病毒疫苗,揭示该疫苗的免疫保护机制,可为研究HIV等其它慢病毒疫苗提供有价值的借鉴。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,利用我国马传染性贫血病毒疫苗培育系统（由强毒到弱毒的不同代次病毒）,对EIAV弱毒疫苗致弱过程中不同代次EIAV毒株非编码区LTR序列分析,发现病毒致弱的基因变异规律性位点,即LTR R区序列呈现规律性变化:TAR结构起始位置碱基在59代之前多数为A,而64代之后均为G;poly（A）附加位点在45代之后（除55代外）一致表现为AA,提示这些突变引起的位点或结构变化很可能与病毒毒力减弱有直接关系。因此基于EIA代次毒株LTR序列分析结果,选取EIAV基因非编码区LTR R区作为研究对象,以驴胎皮肤弱毒疫苗感染性分子克隆pLGFD3-8为父本操作系统进行基因的定点突变,即LTR R区的TAR结构起始碱基由弱毒株的G变为强毒株特征A,poly（A）附加位点碱基由弱毒株的AA变为强毒株特征CA,形成具有四处点突变型强弱嵌合感染性的分子克隆。构建EIAV非编码区强弱毒嵌合的全基因分子克隆,将阳性重组质粒命名为pLGFD-M。将该嵌合克隆体外转染驴胎皮肤细胞（FDD）并进行FDD传代,通过逆转录酶活性试验、前病毒DNA PCR扩增、RT-PCR方法及实时定量RT-PCR等试验验证其转染结果。结果显示,LTR嵌合克隆衍生病毒感染FDD出现明显的细胞病变,电镜下可见大量典型的EIAV颗粒,将其病毒命名为vpLGFD-M;细胞培养上清可检测到RT酶活性;前病毒DNA PCR扩增和RT-PCR均为阳性。在细胞水平上对该嵌合克隆衍生毒及其亲本感染性分子克隆毒株复制能力进行了检测,发现此嵌合克隆衍生病毒比其父本克隆衍生病毒的复制水平略高些,保持了亲本皮肤弱毒疫苗感染分子克隆的复制特点和细胞嗜性。本研究在分子生物学方面的新发现是——明确了EIAV LTR反转录时,病毒RNA是先由5’LTR的R-U5与3’LTR U3重组形成前病毒基因组一端的长末端重复序列“新”3’LTR,在新形成的3’LTR上的启动子和转录基因的指导下,进行EIAV的复制与蛋白质的合成。本项研究对进一步在分子水平上阐明我国EIAV疫苗株的复制机制和减毒机理具有极其重要的意义,为进一步确定我国马传贫弱毒疫苗株毒力致弱及免疫保护的分子机制奠定了重要的分子生物学基础,并将为其它人和动物慢病毒的免疫预防研究提供试验依据。
涂亚斌[8]（2005）在《马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用》文中研究表明马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus,EIAV）属反转录病毒科慢病毒属,是马传染性贫血（EIA,简称马传贫）的病原体。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗,是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗,该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行,是研究慢病毒免疫预防非常有价值的模型。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列（LTR）对病毒复制有重要的调控作用,影响到病毒的繁殖动力学、组织嗜性、致病力等方面。反转录病毒的囊膜蛋白,由于其基因的高度变异性,受到病毒学研究的普遍关注,通过对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒与其亲本强毒L株前病毒全基因组核苷酸序列的比较分析,发现二者的LTR和env基因（尤其是gp90编码区）差异较大。 为了研究env基因gp90在我国EIAV-DLA致弱过程中的作用,我们以EIAV强毒辽宁株（L株）接种健康马,从不同时期发热期马血清中以RT-PCR扩增包含完整S2基因和gp90基因片段;同时以EIAV-DLA接种健康驴白细胞并用RT-PCR扩增相同的基因片段,将所得的强弱毒共30个env基因gp90进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,强弱毒gp90序列存在着多个位点高度的一致性变异,所推导的氨基酸也存在19个位点极其一致性变异,这些变异包括氨基酸的点突变和插入或缺失,其中,氨基酸在极性与非极性之间的变换及氨基酸的插入和缺失造成糖基化数量非常一致的变化。在对其它慢病毒（如HIV、SIV）研究过程中发现,糖基化对病毒的细胞嗜性、毒力以及病毒逃避中和抗体的能力起到了致关重要的作用。经过序列及氨基酸的比较后发现,gp90基因V3到V5区在强毒和弱毒之间差异显着,而在各自内部相对保守,变异较小。对27个S2基因进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,S2基因中也存在着3个非常一致的点突变,没有碱基的插入或缺失。 在对我国强毒EIAV-L和弱毒EIAV-DLA env基因变异研究的基础上,我们将马传贫强、弱毒gp90全长及部分（V3-V5区）分别连接到逆转录病毒载体pBABE-puro,通过转染将马传贫强、弱毒env基因整合到包装细胞系PA317中,利用抗性筛选到稳定表达细胞系;然后将马传贫强、弱毒gp90全长及V3-V5区分别连接到高效真核表达载体pcDNA3.1（+）,转染293T细胞系并经抗性筛选及亚克隆后获得高效稳定表达马传贫强弱毒gp9及V3-V5区基因的细胞系,为研究gp90及V3-V5区结构与功能打下了良好的基础。然而,我们至今对弱毒疫苗的致弱机理尚不清楚。对以HIV为主的慢病毒研究表明LTR和env基因中N-连接糖基化与病毒的嗜性、感染性和抗体中和作用密切相关。我国马传染性贫血病毒强弱毒env基因之间N-连接糖基化存在明显的区别;根据强弱毒env基因变异的分析结果,构建了一系列N-连接糖基化突变分子克隆,力图对N-连接糖基化在我国马传染性贫血病毒致弱过程中的作用进行阐述,通过转染驴白细胞并盲传10代后仍未获得N-连接糖基化突变病毒,我们推测可能的原因是由于N-连接糖基化的突变均位于env基因的V3-V5区,影响了在驴白细胞上的细胞嗜性。 为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,我们在已构建EIAV-DLA株感染性分子克隆和EIAV-L株前病毒DNA全基因组分子克隆的基础上,用EIAV-L株的LTR和gp90编码区分别替换EIAV-DLA株感染性分子克降的相应片段,
魏丽丽[9]（2005）在《马传染性贫血病毒LTR嵌合克隆生物学特性的研究》文中提出马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus, EIAV）是反转录病毒科慢病毒属成员之一,在基因组结构和抗原性上与人艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）十分相似,可以引起马属动物的一种急性烈性传染病,以贫血、持续感染、反复发热为特征,终生持续感染,是马属动物最重要的传染病之一。二十世纪七十年代沈荣显等通过体外细胞传代致弱路线研制成功了马传贫驴白细胞弱毒疫苗,并以此成功控制了马传贫在中国的流行,是迄今为止世界上唯一大规模应用的慢病毒疫苗。该疫苗具有良好的安全性和有效性,成为研究包括艾滋病毒在内的慢病毒疫苗的良好模型。马传贫弱毒疫苗致弱路线是:将一株来源于马体的EIAV 超强毒力的辽毒株（LN）经过驴体连续传代100 余代使病毒毒力增强后获得了驴强毒株（DV）（对马和驴均100%致死）,然后将DV 株连续通过驴白细胞进行体外培养驯化,使其病毒毒力完全丧失,而保持了良好的免疫原性,最终培育成功EIAV 驴白细胞弱毒疫苗（DLA）（沈荣显等,1979）,DLA进一步通过驴胎皮肤细胞培养驯化,又获得了皮肤细胞弱毒疫苗株（FD）。为了揭示我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱及免疫保护的分子机制,为人免疫缺陷病毒及其它慢病毒的免疫预防提供借鉴,利用我国拥有的马传染性贫血病毒疫苗培育系统（由强毒到弱毒的不同代次病毒）,对EIAV 弱毒疫苗致弱过程中EIAV 非编码区LTR 进行了序列分析,将病毒致弱的基因变异位点锁定在有限范围之内。本试验基于代次毒分析结果,选取LTR 变异率较高的U3 区,以驴胎皮肤弱毒疫苗感染性分子克隆株pLGFD3-8 和驴强毒株感染性分子克隆株为父本操作系统进行基因替换,构建EIAV 非编码区强弱毒嵌合的全基因分子克隆,将阳性重组质粒命名为pLGFD9-12。将该嵌合克隆体外转染驴胎皮肤细胞（FDD）并以驴白细胞（DL）传代,通过逆转录酶活性试验、前病毒DNA PCR 扩增、RT-PCR 方法及实时定量RT-PCR 等试验验证其转染结果。结果显示,LTR 嵌合克隆衍生病毒感染FDD 和DL 细胞均出现明显的细胞病变,电镜下可见大量典型的EIAV 颗粒,将其病毒命名为vLGFD9-12;细胞培养上清可检测到RT 酶活性;前病毒DNA PCR 扩增和RT-PCR 均为阳性。在细胞水平上对该嵌合克隆衍生毒及其亲本感染性分子克隆毒株复制能力进行了检测,发现此嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒具有相似的复制水平,此嵌合克隆衍生病毒在DL 细胞上复制水平略高于FDD 细胞,保持了亲本皮肤弱毒疫苗感染分子克隆的复制特点和细胞嗜性。同时也说明E-box 基序和GATA 基序的改变并没有引起LTR 对病毒复制和细胞嗜性的影响。将5 匹EIAV 阴性健康马分为3 组,第1 组（2#马）作为非接种健康对照组,第2 组（15#和17#马）接种驴胎皮肤弱毒疫苗感染性分子克隆衍生毒pLGFD3-8,第3 组（20#和30#马）接种LTR 嵌合克隆衍生毒vLGFD9-12。接种剂量均为每匹马5ml×105TCID50,接种途径均为皮下。接种后,每日观察试验动物体温和临床症状、定期采集试验动物肝素抗凝外周血,分析其血液学变化、病毒在接种动物外周血中的拷贝数水平及不同时间诱导动物体特异性淋巴细胞增殖水平、特异性细胞毒性T 淋巴细胞杀伤反应,明确LTR 与毒力的相关性及该嵌合克隆毒株与其父本弱毒疫苗株在马体复制和分布的情况。在150 天观察期内,各组试验动物均未见体温升高,仅15#马在第47 天有一次短暂的一过性发热,达39.1℃,但为一过性发热。
袁秀芳[10]（2004）在《马传染性贫血病驴白细胞弱毒感染性分子克隆及其衍生毒的生物学和分子生物学特性分析》文中进行了进一步梳理为了阐明马传贫驴白细胞弱毒疫苗（DLA-EIAV）致弱及免疫保护的分子机制，给其它慢病毒的免疫预防提供借鉴，本实验室构建了DLA-EIAV感染性分子克隆（命名为pOK8266）并获得其衍生病毒（命名为vOK8226），同时对我国马传染性贫血病毒强弱毒株进行了序列分析。在此基础上，以pOK8226为骨架，构建了马传染性贫血病毒强／弱LTR嵌合毒感染性分子克隆（命名为pOKVltr），并获得了其衍生病毒（命名为vOKVltr）。本研究对vOK8226、vOKVltr和DLA-EIAV进行了动物接种试验，通过对临床和病理组织学变化、各结构蛋白抗体、感染马体内病毒载量的监测以及LTR及env基因在感染马体内的变异规律进行了研究。 将7匹EIAV阴性健康马分为4组，第1组（4#和5#马）接5ml×10-5TCID50嵌合毒（pOKVltr），第2组（6#和7#马）接种5ml×105TCID50克隆毒（vOK8226），第3组（8#）接种5ml×105TCID50疫苗毒（DLA-EIAV），同时设第4组（1#和2#马）作为非接种对照组。接种后第220天，除了2#马攻毒剂量为3ml×10-4血清稀释度外，其它所有马均用3ml×10-5血清稀释度EIAV强毒辽宁株（L-EIAV）进行攻击。攻毒前后对每匹马进行体温监测，发现在接种后，所有试验马未见体温升高现象，说明我们所用的毒株接种后对马是很安全的，用L-EIAV LTR置换vOK8226的LTR得到的嵌合病毒对马也没有表现出临床致病性；攻毒后，非接种对照组1#和2#马体温均出现典型的稽留热，并分别于攻毒后第134天和19天死亡，病理剖检发现死亡马呈现典型的马传贫的病理组织学变化。第1组和第3组（嵌合毒接种组和疫苗毒接种组）在攻毒后未见任何临床变化。证明嵌合毒和疫苗毒接种马得到了免疫保护。第2组（克隆毒接种组）中的6#马在攻毒后没有异常变化，而7#马却经历6次发热期，最终于攻毒后第185天死亡，但开始发热和死亡的时间均比对照组明显滞后，病理剖检发现发病死亡马具有典型的马传贫的病理组织学变化。在攻毒后第450天剖杀所有存活马，并进行病理组织学检查，结果表明所有免疫保护马均未见任何异常变化。 在试验过程中，我们利用ELISA方法对不同试验马攻毒前后血清中针对EIAV结构蛋白p15、p11、p26、p9以及gp45的抗体进行了检测。攻毒前各接种马抗p9、p11和p15抗体水平极低或检测不到，p26抗体上升后又逐渐下降，gp45抗体缓慢上升后并持续在较高水平。攻毒后发病马（1#，2#，7#）体内抗p9、p11、p15、p26和gp45抗体均显着升高。并持续至死亡，6#和8#马体内抗p15、p26和gp45抗体也有升高外。攻毒后，嵌合病毒免疫马（4#和5#）体内抗这五种结构蛋白抗体和攻毒前没有明显变化，表明攻毒后没有回忆反应，表明其免疫效果可能优于其它各接种组。抗gp45抗体变化在发病马和未发病马间无明显差异，提示gp45抗体变化与疾病进程没有直接的关系。 利用实时定量PCR技术对攻毒前后马外周血白细胞中EIAV前病毒DNA及马血浆中病毒RNA的载量进行了监测，发现感染马体内前病毒DNA载量与p15和p26抗体水平有一定的相关性，血浆中病毒RNA的载量与p9和p11抗体水平成正相关。发病马血浆病毒RNA超过106拷贝／ml血浆，而免疫保护马血浆中病毒RNA载量较低(100-5拷贝／ml血浆)。免疫保护马在攻毒后3个月血浆病毒RNA降到很低水平，用实时定量PCR方法检测不到。但在整个试验过程中，在中国农业科学院博卜论文摘要各试验马外周血白细胞中均能检测到EIAV前病毒ONA，说明马传染性贫血病毒以前病毒形式长期潜伏存在。 由于EIAV基因组具有高度变异性，特别是LTR和env基因的变异可能与病毒的致病性及免疫保护性有着密切的关系。因此，本实验对攻毒前后马外周血白细胞中EIAV前病毒的LTR（包括U3和R区）和。nv（包括c4，V3，CS，V4，C6，VS在内的580个核营酸）基因进行了序列测定和分析，发现LTR和env在马体内存在3种序列类型，即强毒型（序列与L-EIAV一致）、弱毒型 （序列与OLA一EIAV一致）和中间型（L一EIAV和OLA一EIAV的混合序列）。对EIAV弱毒感染性分子克隆及其衍生毒免疫后攻毒马长时间跟踪，并采血样进行LTR和env基因序列分析，结果发现马体内同时存在强毒型和弱毒型的序列以及少量的强弱毒衍化的中间型序列。当强毒型LTR和env基因序列占绝对优势时，马表现临床发病。对LTR各基序分析表明，强毒型LTR在增强子高变区没有E一box基序，而在U3一R结合处有1个E一box基序，而弱毒LTR在增强子高变区有2个E一box基序，在U3一R结合处没有该基序。推测该基序的变化对病毒的致病性可能有一定的关系。对env序列分析发现，在攻毒后获得免疫保护的马体内存在着大量的带有强毒特征，但在其中发生移码突变和域出现终止密码的env基因序列，这些缺陷型前病毒的大量存在可能与免疫保护存在一定的关系。在我们所测的175个氨基酸中，强毒型env序列比弱毒型env序列多4个糖基化位点，而中间型位于二者之间，由于糖基化位点可以屏蔽抗原位点，使病毒逃避免疫系统的监视，因此糖基化的数目和位置对病毒致病性有着一定的影响。
二、马传贫驴白细胞弱毒疫苗毒和驴强毒全基因核苷酸序列测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、马传贫驴白细胞弱毒疫苗毒和驴强毒全基因核苷酸序列测定（论文提纲范文）
（1）马传染性贫血病毒EIAVYN的全基因组分析及囊膜蛋白免疫学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 马传染性贫血病(EIA)概述 |
| 1.2 马传染性贫血病(EIA)流行病学 |
| 1.2.1 中国马传染性贫血病(EIA)的流行情况 |
| 1.2.2 世界马传染性贫血病的流行现状 |
| 1.2.3 马传染性贫血病毒的分子流行病学现状 |
| 1.3 马传染性贫血病毒(EIAV)概述 |
| 1.3.1 马传染性贫血病毒(EIAV)的历史及分类地位 |
| 1.3.2 马传染性贫血病毒(EIAV)的形态结构 |
| 1.3.3 马传染性贫血病毒(EIAV)的理化特性 |
| 1.3.4 马传染性贫血病毒(EIAV)的细胞嗜性 |
| 1.3.5 马传染性贫血病毒(EIAV)的基因组特征 |
| 1.3.6 马传染性贫血病毒(EIAV)的主要蛋白及其结构功能 |
| 1.4 EIAV中和抗体研究进展 |
| 1.4.1 EIAV中和抗体的发现 |
| 1.4.2 EIAV基因组结构的中和抗原表位区 |
| 1.4.3 EIAV被中和抗体中和的机制 |
| 1.4.4 EIAV中和抗原表位变异特点 |
| 1.5 TETHERIN的抗病毒作用及相关机制研究进展 |
| 1.5.1 Tetherin的发现 |
| 1.5.2 Tetherin结构及定位特征 |
| 1.5.3 Tetherin的抗病毒机制 |
| 1.5.4 病毒拮抗Tetherin的机制 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 EIAV_(YN)毒株的全基因组测序及基因组特征分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病料和毒株 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 前病毒DNA提取 |
| 2.1.6 TA克隆 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 EIAV_(YN)全基因组序列分析 |
| 2.2.2 EIAV_(YN) LTR及结构基因特征分析 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 病毒ENV变异对其逃逸宿主免疫的影响 |
| 3.1 EIAV_(YN) ENV逃逸疫苗免疫马血清中和作用的实验研究 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.2 EIAV_(YN) ENV拮抗TETHERIN限制作用的实验研究 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）马传染性贫血病毒第1 9、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA全基因序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 驴胎皮肤细胞(FDD)的制备、培养 |
| 1.4 EIAV前病毒DNA的提取 |
| 1.5 第19、26代驴胎皮肤细胞毒(FDDV)全基因序列的扩增 |
| 1.6 PCR产物的克隆与测序 |
| 2 结果 |
| 2.1 全基因PCR扩增结果 |
| 2.2 第19、26代FDDV LTR序列比较分析 |
| 2.3 第19、26代FDDV gag基因序列比较分析 |
| 2.4 第19、26代FDDV pol基因序列比较分析 |
| 2.5 第19、26代FDDV env基因序列比较分析 |
| 3 讨论 |
（3）马传染性贫血病病毒的基因变异与生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 马传染性贫血病病毒概述 |
| 1.1.1 慢病毒属的构成 |
| 1.1.2 EIAV的历史及分类地位 |
| 1.1.3 EIAV的形态和理化特性 |
| 1.1.4 EIAV的血凝性 |
| 1.1.5 EIAV的细胞嗜性和体外培养 |
| 1.1.6 EIAV的致病性 |
| 1.1.7 EIAV检测技术的发展 |
| 1.2 EIAV的分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 EIAV的基因组结构概述 |
| 1.2.2 表面糖蛋白gp90 |
| 1.2.3 穿膜蛋白gp45 |
| 1.2.4 EIAV gp90和gp45的变异 |
| 1.2.5 机体针对gp90和gp45的免疫应答 |
| 1.2.6 EIAV gag蛋白概述 |
| 1.2.7 机体针对gag的免疫应答 |
| 1.2.8 非编码区LTR的序列特征 |
| 1.2.9 LTR与细胞因子的相互作用 |
| 1.2.10 LTR影响病毒的细胞嗜性 |
| 1.2.11 LTR对病毒致病性影响的研究 |
| 1.2.12 Tat蛋白对LTR启动子活性的影响 |
| 1.3 反向遗传操作研究EIAV |
| 1.4 慢病毒疫苗的研究进展 |
| 第2章 研究目的与意义 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 质粒与菌株 |
| 3.1.5 细胞培养用试剂 |
| 3.1.6 细菌培养用试剂 |
| 3.1.7 大肠杆菌感受态制备用试剂 |
| 3.1.8 操作核酸用试剂 |
| 3.1.9 寡核苷酸引物与探针 |
| 3.1.10 ELISA缓冲液和包被蛋白 |
| 3.1.11 β-gal和CAT定量检测试剂盒 |
| 3.1.12 其他试剂 |
| 3.1.13 仪器与器材 |
| 3.1.14 生物软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 细胞的制备与培养 |
| 3.2.2 EIAV接种细胞 |
| 3.2.3 EIAV接种试验马 |
| 3.2.4 监测试验马临床症状 |
| 3.2.5 定期采集试验马血液样品 |
| 3.2.6 建立realtime PCR标准曲线 |
| 3.2.7 建立realtime RT-PCR标准曲线 |
| 3.2.8 测定EIAV前病毒DNA载量 |
| 3.2.9 测定EIAV病毒RNA载量 |
| 3.2.10 血清抗体检测 |
| 3.2.11 测定EIAV前病毒gp90和LTR序列 |
| 3.2.12 EIAV gp90和LTR的序列分析 |
| 3.2.13 pLTR/CAT系列质粒的构建 |
| 3.2.14 LTR启动子活性研究 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 EIAV的免疫与攻毒 |
| 4.1.1 免疫和攻毒期间的临床观察 |
| 4.2 免疫和攻毒期间的病毒复制特性研究 |
| 4.2.1 Realtime PCR标准曲线的建立 |
| 4.2.2 免疫期和攻毒期试验马PBMC前病毒DNA载量的变化 |
| 4.2.3 Realtime RT-PCR标准曲线的建立 |
| 4.2.4 免疫期和攻毒期试验马血浆病毒RNA载量的变化 |
| 4.3 免疫和攻毒期间试验马的体液免疫反应 |
| 4.3.1 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV gp45抗原的抗体变化 |
| 4.3.2 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p26抗原的抗体变化 |
| 4.3.3 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p15抗原的抗体变化 |
| 4.3.4 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p11抗原的抗体变化 |
| 4.3.5 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p9抗原的抗体变化 |
| 4.4 免疫期和攻毒期EIAV gp90的进化分析 |
| 4.4.1 PBMC前病毒gp90的扩增与克隆 |
| 4.4.2 免疫期试验马体内gp90的变异分析 |
| 4.4.3 攻毒期试验马体内gp90的变异分析 |
| 4.4.4 攻毒期gp90种群的演化分析 |
| 4.4.5 攻毒后不同时期gp90nt和aa的变异规律 |
| 4.4.6 分析攻毒期间机体对病毒gp90的选择作用 |
| 4.5 体内和体外感染过程中EIAV LTR的变异趋势 |
| 4.5.1 体内或体外感染EIAV的细胞中前病毒LTR的扩增与克隆 |
| 4.5.2 体内传代导致的EIAV LTR的序列变异 |
| 4.5.3 体外传代导致的EIAV LTR的序列变异 |
| 4.5.4 分析EIAV-L与其体内和体外衍生毒株之间的LTR进化关系 |
| 4.5.5 EIAV-DLA LTR在动物体内感染过程中的种群纯化趋势 |
| 4.5.6 攻毒前后未发病马PBMC前病毒LTR的序列分析 |
| 4.5.7 攻毒后发病马PBMC前病毒LTR的序列分析 |
| 4.6 LTR启动子活性的研究 |
| 4.6.1 EIAV LTR启动CAT表达的质粒的构建 |
| 4.6.2 不同LTR启动子在eMDM上启动活性的比较研究 |
| 第5章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 EIAV的复制动力学 |
| 5.1.2 EIAV LTR的序列与启动子活性研究 |
| 5.1.3 EIAV感染中病毒gp90的变异趋势 |
| 5.1.4 感染EIAV后的机体反应 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）中国马传染性贫血病毒LTR启动子活性及EIAVFDD弱毒株生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 EIAV认知历史和现状 |
| 1.2 EIAV形态结构和理化特性 |
| 1.3 EIAV的生物学特性 |
| 1.3.1 EIAV的血凝性 |
| 1.3.2 EIAV的细胞嗜性 |
| 1.3.3 EIAV的致病性 |
| 1.4 EIAV的分子生物学 |
| 1.4.1 EIAV基因组结构 |
| 1.4.2 EIAV的基因及其编码蛋白 |
| 1.5 EIAV基因非编码区LTR相关研究进展 |
| 1.5.1 EIAV LTR的结构和生物学功能 |
| 1.5.2 LTR增强子区与细胞嗜性密切相关 |
| 1.5.3 与病毒致病性相关的LTR转录因子基序 |
| 1.5.4 LTR转录因子基序及其变异对病毒复制的影响 |
| 1.5.5 体外细胞培养过程中LTR的变异 |
| 1.5.6 在中国EIAV弱毒疫苗致弱过程中LTR的变化 |
| 1.6 本试验的目的和意义 |
| 第二章 马传染性贫血病毒驴胎皮肤细胞株不同代次毒LTR的序列分析及启动子活性比较 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 驴胎皮肤细胞的制备与培养 |
| 2.2.2 EIAV_(FDD)病毒培养及前病毒DNA提取 |
| 2.2.3 EIAV_(FDD)前病毒DNA LTR PCR扩增与克隆 |
| 2.2.4 pCAT-LTR质粒构建 |
| 2.2.5 转染用质粒纯化 |
| 2.2.6 转染 |
| 2.2.7 CAT含量测定 |
| 2.2.8 β-galactosidase活性测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 驴胎皮肤细胞毒株前病毒LTR的扩增及克隆测序 |
| 2.3.2 pCAT-LTR质粒的酶切鉴定 |
| 2.3.3 EIAV_(FDD)前病毒LTR序列分析 |
| 2.3.3.1 前病毒LTR负调节区基因变异 |
| 2.3.3.2 前病毒LTR增强子区基因变异 |
| 2.3.3.3 前病毒LTR转录起始位点变异 |
| 2.3.4 病毒传代过程中准种的LTR进化分析 |
| 2.3.5 EIAV_(DLA)、EIAV_(FDD) LTR的启动子活性比较 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 马传染性贫血病毒不同代次毒株LTR启动子活性比较 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 马巨噬细胞培养 |
| 3.2.2 驴胎皮肤细胞的制备与培养 |
| 3.2.3 驴白细胞培养及病毒繁殖 |
| 3.2.4 EIAV_(DLA)前病毒LTR PCR扩增与克隆 |
| 3.2.5 pGL-LTR质粒构建 |
| 3.2.6 pGL-DL25突变质粒构建 |
| 3.2.7 转染用LTR质粒的选择 |
| 3.2.8 转染驴胎皮肤细胞比较不同代次毒LTR启动子活性 |
| 3.2.9 转染马巨噬细胞比较不同代次毒LTR启动子活性 |
| 3.2.10 荧光素酶活性检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 EIAV_(DLA) LTR测序及比较分析 |
| 3.3.2 EIAV强毒株、驴白细胞毒株LTR负调节区序列变异 |
| 3.3.3 驴白细胞弱毒疫苗株LTR多样性分析 |
| 3.3.4 不同代次毒株LTR启动子活性比较 |
| 3.3.4.1 驴白细胞弱毒疫苗株不同类型LTR启动子活性比较 |
| 3.3.4.2 EIAV_D,EIAV_(DL),EIAV_(DLA)和EIAV_(FDD) LTR启动子活性比较 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 高代次EIAV_(FDD)弱毒株的全基因序列分析及生物学特性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 驴胎皮肤细胞(FDD)的制备与培养 |
| 4.2.2 EIAV_(FDD)前病毒DNA提取 |
| 4.2.3 第19、26代驴胎皮肤细胞毒(EIAV_(FDD))全基因序列扩增 |
| 4.2.4 PCR产物的克隆与测序 |
| 4.2.5 试验马分组及病料采集 |
| 4.2.6 试验马血清p26抗体检测 |
| 4.2.7 试验马外周血白细胞制备 |
| 4.2.8 Real-time RT-PCR标准曲线建立 |
| 4.2.8.1 PCR扩增EIAV gag基因片段及克隆 |
| 4.2.8.2 体外转录 |
| 4.2.8.3 转录产物纯化 |
| 4.2.8.4 RNA标准品制备 |
| 4.2.8.5 Real-time RT-PCR标准曲线建立 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 全基因PCR扩增结果 |
| 4.3.2 第19、26代EIAV_(FDD) LTR序列比较分析 |
| 4.3.3 第19、26代EIAV_(FDD) gag基因序列比较分析 |
| 4.3.4 第19、26代EIAV_(FDD) pol基因序列比较分析 |
| 4.3.5 第19、26代EIAV_(FDD) env基因序列比较分析 |
| 4.3.6 第19、26代EIAV_(FDD) S1蛋白序列比较分析 |
| 4.3.7 第19、26代EIAV_(FDD) S2蛋白序列比较分析 |
| 4.3.8 第19、26代EIAV_(FDD) S3蛋白序列比较分析 |
| 4.3.9 攻毒后各试验马抗p26抗体的变化 |
| 4.3.10 Real-time RT-PCR标准曲线建立 |
| 4.3.11 试验马血浆病毒RNA载量检测 |
| 4.3.12 试验马外周血白细胞LTR序列分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 马传染性贫血驴胎皮肤细胞弱毒第19代EIAV_(FDD)前病毒全基因序列 |
| 附录2 马传染性贫血驴胎皮肤细胞弱毒第26代EIAV_(FDD)前病毒全基因序列 |
| 附录3 第19、26代EIAV_(FDD)与中国EIAV强毒株EIAV_L、EIAV_D和弱毒疫苗株EIAV_(DLV)、EIAV_(FDD)全基因序列比较结果 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）中国马传染性贫血病毒驴强毒株与驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 马传染性贫血病毒概述 |
| 1.1.1 EIAV 形态结构和理化特性 |
| 1.1.2 EIAV 的细胞嗜性 |
| 1.1.3 EIAV 的致病性 |
| 1.1.4 国内外 EIAV 毒株及特性 |
| 1.2 马传染性贫血病毒的分子生物学特性别 |
| 1.2.1 EIAV 基因组结构 |
| 1.2.2 EIAV 的基因及其编码蛋白 |
| 1.2.3 EIAV 的非编码区——LTR |
| 1.3 准株理论与 LA-PCR 技术 |
| 1.3.1 准株理论 |
| 1.3.2 LA-PCR 技术及其优势 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 质粒和菌株 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 驴白细胞的分离与培养 |
| 2.2.2 前病毒 DNA 的提取 |
| 2.2.3 EIAV 前病毒 DNA 分段两段扩增和基因克隆 |
| 2.2.4 EIAV 全基因克隆的构建 |
| 2.2.5 测序结果分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 EIAV 前病毒DNA PCR 扩增及不同片段克隆质粒的鉴定 |
| 3.2 DV117 全基因克隆的构建 |
| 3.3 低拷贝载体 PLGW 的构建 |
| 3.4 DV117 和DLV122 前病毒核苷酸全序列和各基因及其编码的氨基酸序列 |
| 3.4.1 LTR 的比较结果 |
| 3.4.2 gag 及其编码氨基酸序列的比较 |
| 3.4.3 pol 基因及其氨基酸序列比较 |
| 3.4.4 env 基因及其氨基酸序列 |
| 3.4.5 S1 基因及其编码的蛋白 Tat |
| 3.4.6 S2 基因及其编码氨基酸序列 |
| 3.4.7 S3 及其编码的rev 蛋白 |
| 4 讨论 |
| 4.1 强弱毒株 LTR 的变异分析 |
| 4.1.1 LTR 序列变异性 |
| 4.1.2 LTR 细胞转录因子结合位点的变化 |
| 4.2 env 的变异及其生物学意义 |
| 4.3 其他基因的变异和生物学意义 |
| 4.4 准株理论与 EIAV 的研究 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）我国马传染性贫血弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立及标记疫苗的研究（论文提纲范文）
| 第一章 绪论 |
| 1.1 EIAV的概述 |
| 1.2 EIAV主要基因的变异研究进展 |
| 1.3 EIAV非结构蛋白的研究概况 |
| 1.4 本试验的目的和意义 |
| 第二章 马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒全基因序列测定与分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.1.5 质粒的小量提取 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试验动物的接种 |
| 2.2.2 马外周血单核细胞的制备 |
| 2.2.3 前病毒DNA的提取 |
| 2.2.4 前病毒全基因的分段扩增 |
| 2.2.5 前病毒各基因片段PCR产物的克隆与测序 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 前病毒全基因的分段扩增 |
| 2.3.2 各段基因的克隆与鉴定 |
| 2.3.3 Agen-EIAV株各基因片段的序列测定及全基因序列的拼接 |
| 2.3.4 Agen-EIAV株与DLV、LN和AF028232株各基因核苷酸序列比较 |
| 2.3.5 Agen-EIAV株与DLV、LN和AF028232，AF033820，AF016316，M16575株gag核苷酸及其编码蛋白的比较 |
| 2.3.6 Agen-EIAV株与DLV、LN和AF028232，AF033820，AF016316，M16575株gp90核苷酸及其编码蛋白的比较 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒gag和gp90在马体内的变异分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 四个发热期马外周血的采集、PBMC的制备及 DNA的提取 |
| 3.2.2 四个发热期gag和gp90核苷酸序列的扩增 |
| 3.2.3 四个发热期gag和gp90PCR产物的克隆与测序 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 四个发热期gag和gp90的PCR扩增 |
| 3.3.2 四个发热期gag和gp90的克隆与鉴定 |
| 3.3.3 四个发热期gag和gp90不同克隆的序列测定 |
| 3.3.4 四个发热期gag核苷酸序列比较 |
| 3.3.5 四个发热期gp90核苷酸序列及氨基酸比较 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 我国马传染性贫血病弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株 |
| 4.1.2 试验动物 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病毒培养 |
| 4.2.2 马外周血单核细胞的制备 |
| 4.2.3 引物的设计与合成 |
| 4.2.4 模板的制备 |
| 4.2.5 β-actin克隆及序列测定 |
| 4.2.6 每个 DNA样本质量的检测 |
| 4.2.7 病毒培养物 PCR检测条件的摸索 |
| 4.2.8 套式多重 PCR鉴别诊断方法的建立 |
| 4.2.9 试验动物样品的检测 |
| 4.2.10 扩增目的条带的克隆及序列测定 |
| 4.2.11 敏感性试验 |
| 4.2.12 稳定性和重复性试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 β-actin基因的扩增 |
| 4.3.2 β-actin基因克隆的序列测定 |
| 4.3.3 病毒接种细胞培养物套式多重PCR鉴别诊断方法的初步建立 |
| 4.3.4 扩增目的条带的克隆及序列测定 |
| 4.3.5 试验动物 PCR检测条件的优化及样本的检测 |
| 4.3.6 PCR检测的敏感性试验 |
| 4.3.7 稳定性和重复性试验 |
| 4.3.8 动物试验PCR检测结果 |
| 4.3.9 动物试验 PCR检测与琼脂扩散试验检测结果的比较 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 马传染性贫血病标记疫苗的研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 引物 |
| 5.1.4 质粒的小量提取 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 驴胎皮肤细胞的制备、培养 |
| 5.2.2 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2的构建 |
| 5.2.3 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2突变序列的测定 |
| 5.2.4 质粒的提取和纯化 |
| 5.2.5 质粒在细胞培养中的转染和传代 |
| 5.2.6 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2突变序列的测定 |
| 5.2.7 嵌合病毒复制动力学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2的构建及鉴定 |
| 5.3.2 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2突变序列的测定 |
| 5.3.3 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2的转染 |
| 5.3.4 衍生病毒在 FDD细胞培养的生物学特性研究 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）马传染性贫血病毒LTR关键点突变对DLV致弱机理的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 马传染性贫血病毒概述 |
| 1.1.1 EIAV 认知历史和现状 |
| 1.1.2 EIAV 形态结构和理化特性 |
| 1.1.3 EIAV 的生物学特性 |
| 1.1.4 EIAV 的致病性 |
| 1.2 马传染性贫血病毒的分子生物学 |
| 1.2.1 EIAV 基因组结构 |
| 1.2.2 EIAV 的基因及其编码蛋白 |
| 1.3 EIAV 基因非编码区LTR 相关研究进展 |
| 1.3.1 EIAV LTR 的结构和生物学功能 |
| 1.3.2 LTR 增强子区与细胞嗜性密切相关 |
| 1.3.3 LTR 存在特异性转录因子基序与病毒致病性密切相关 |
| 1.3.4 LTR 转录因子基序及其变异对病毒复制的影响 |
| 1.3.5 LTR 在中国EIAV 弱毒疫苗致弱过程中的变化 |
| 1.3.6 LTR 在反向遗传学中的应用 |
| 1.4 EIAV 疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 EIAV 疫苗在国外的研究进展 |
| 1.4.2 中国EIAV 疫苗的研究 |
| 1.5 本研究背景、内容和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 质粒和菌株 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 驴胎皮肤细胞FDD 的制备、培养 |
| 2.2.2 EIAV LTR 强弱毒点突变型嵌和病毒的构建 |
| 2.2.3 质粒的提取和纯化 |
| 2.2.4 质粒在细胞培养中的转染和传代 |
| 2.2.5 转染传代后细胞培养物中EIAV 的检查 |
| 2.2.6 点突变型嵌和病毒复制动力学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 EIAV LTR 强弱毒点突变型嵌合克隆的构建 |
| 3.2 衍生病毒收获及体外感染性分析 |
| 3.3 pLGFD-M 点突变型嵌合病毒复制动力学分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 点突变区域的选择及其生物学意义 |
| 4.2 感染性克隆的构建 |
| 4.3 EIAV LTR 点突变型嵌合克隆构建的意义 |
| 4.4 EIAV LTR 点突变型嵌合克隆复制特性和细胞嗜性 |
| 4.5 EIAV LTR 点突变型嵌合克隆对病毒的沉默的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（8）马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用（论文提纲范文）
| 引言 |
| 一、马传染性贫血病病毒概述 |
| 1 国内外EIAV毒株及特性 |
| 2 gag基因及其编码蛋白 |
| 3 pol基因及其编码产物 |
| 4 env基因及其编码产物 |
| 4.1 表面蛋白(SU／gp90) |
| 4.2 跨膜蛋白(TM／gp45) |
| 5 调节蛋白及其编码区 |
| 5.1 Tat蛋白及其作用元件TAR |
| 5.2 S2开放阅读框架(ORF) |
| 5.3 S3开放阅读框架和Rev蛋白 |
| 5.4 EIAV的非编码区——LTR |
| 二、慢病毒与糖基化 |
| 1 SIV与糖基化 |
| 2 HIV与糖基化 |
| 三、本研究的主要内容和意义 |
| 研究报告 |
| 实验一 EIAV-DLA株与其亲本强毒EIAV-L株env基因及S2基因变异分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 质粒和菌株 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 质粒的小量提取 |
| 2 方法 |
| 2.1 驴白细胞的培养 |
| 2.2 EIAV病毒RNA的提取 |
| 2.3 强、弱毒包含完整S2和gp90基因的扩增 |
| 2.4 强、弱毒代表性gp90部分基因的原核表达载休克隆的构建 |
| 2.5 强、弱毒部分gp90蛋白的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 包含完整S2和gp90基因的克隆与鉴定 |
| 3.2 EIAV-DLA及EIAV-L株gp90核苷酸和氨基酸序列比较 |
| 3.3 从EIAV-L株到DLA后gp90氨基酸比较 |
| 3.4 从EIAV-L株到DLA后gp90氨基酸点突变 |
| 3.5 EIAV-DLA及EIAV-L株S2基因核苷酸和氨基酸序列比较 |
| 3.6 EIAV-DLA及EIAV-L株S2基因氨基酸变异分析 |
| 3.7 强弱毒代表性gp90部分基因的原核表达 |
| 实验二 马传染性贫血强、弱毒gp90在真核细胞系中的稳定表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及细胞系 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 细胞培养用试剂 |
| 1.4.1 Hank's液 |
| 1.4.2 0.25％胰酶 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组逆转录病毒载体的构建 |
| 2.2 重组真核表达载体的构建 |
| 2.3 转染用质粒的纯化 |
| 2.4 重组逆转录病毒的产生 |
| 2.5 表达EIAV gp90的SP20的产生 |
| 2.6 RT-PCR检测EIAV gp90在SP-20中的表达 |
| 2.7 表达EIAV gp90的293T细胞系的产生 |
| 2.8 免疫荧光检测EIAV gp90在293T细胞系的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 包含强、弱毒gp90重组逆转录病毒载体的构建 |
| 3.2 包含强、弱毒gp90重组真核表达载体的构建 |
| 3.3 强、弱毒gp90重组逆转录病毒的制备 |
| 3.4 强、弱毒gp90在SP-20中的表达 |
| 3.5 表达强、弱毒gp90真核细胞系293T的筛选 |
| 实验三 EIAV一系列N-连接糖基化突变克隆和嵌合感染性分子克隆的构建及生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物的合成和克隆或者亚克隆片段的序列测定 |
| 1.4 驴白细胞的分离培养及FDD细胞、EFK细胞的培养 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 质粒的提取与纯化 |
| 1.6.1 质粒的小量提取 |
| 1.6.2 质粒的大量提取和纯化 |
| 2 方法 |
| 2.1 pOK-LTR-DLA／L、pOK-env-DLA／L和pOK-LTRenv-DLA／L嵌合分子克隆的构建 |
| 2.2 N-连接糖基化突变分子克隆的构建 |
| 2.2.1 N-191，N-236，N-246突变分子克隆的构建 |
| 2.2.2 N-191+N-236，N-191+N-246，N-236+N-246突变分子克隆的构建 |
| 2.2.3 N-191+N-236+N-246突变分子克隆的构建 |
| 2.3 转染 |
| 2.4 转录酶(RT)活性的测定 |
| 2.5 电镜观察 |
| 2.6 嵌合病毒前病毒基因组的提取 |
| 2.7 嵌合病毒前病毒基因组LTR的扩增及测序 |
| 2.8 动物试验 |
| 2.9 血清抗体的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒pOK-LTR-DLA／L的构建 |
| 3.2 重组质粒pOK-env-DLA／L的构建 |
| 3.3 重组质粒pOK-LTRenv-DLA／L的构建 |
| 3.4 N-191，N-236，N-246突变分子克隆的获得 |
| 3.5 N-191+N-236，N-191+N-246，N-236+N-246突变分子克隆的获得 |
| 3.6 N-191+N-236+N-246突变分子克隆的获得 |
| 3.7 马传染性贫血病毒感染性分子克隆衍生病毒的获得 |
| 3.8 嵌合病毒LTR的扩增及鉴定 |
| 3.9 人工感染马临床表现及血清学检测 |
| 讨论 |
| 1 EIAV env及S2基因变异及其生物学意义 |
| 2 LTR变异对EIAV毒力及细胞嗜性的影响 |
| 3 EIAV env基因点突变对病毒的复制影响及其它结构蛋白特异性抗体对试验马致病性的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）马传染性贫血病毒LTR嵌合克隆生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 马传染性贫血病毒概述 |
| 1.1.1 EIAV 认知历史和现状 |
| 1.1.2 EIAV 形态结构和理化特性 |
| 1.1.3 EIAV 的生物学特性 |
| 1.1.4 EIAV 的致病性 |
| 1.2 马传染性贫血病毒的分子生物学 |
| 1.2.1 EIAV 基因组结构 |
| 1.2.2 EIAV 的基因及其编码蛋白 |
| 1.3 EIAV 基因非编码区LTR 相关研究进展 |
| 1.3.1 EIAV LTR 的结构和生物学功能 |
| 1.3.2 LTR 增强子区与细胞嗜性密切相关 |
| 1.3.3 LTR 存在特异性转录因子基序与病毒致病性密切相关 |
| 1.3.4 LTR 转录因子基序及其变异对病毒复制的影响 |
| 1.3.5 LTR 在中国EIAV 弱毒疫苗致弱过程中的变化 |
| 1.3.6 LTR 在反向遗传学中的应用 |
| 1.4 本研究背景、内容和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 质粒和菌株 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 EIAV LTR 强弱毒嵌合病毒的构建 |
| 2.2.3 质粒的提取和纯化 |
| 2.2.4 质粒在细胞培养中的转染和传代 |
| 2.2.5 转染传代后细胞培养物中EIAV 的检查 |
| 2.2.6 嵌合病毒复制动力学分析 |
| 2.2.7 动物感染试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 EIAV LTR 强弱毒嵌合克隆的构建 |
| 3.2 转染及感染性 |
| 3.3 嵌合病毒复制动力学分析 |
| 3.4 动物感染性试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 替换区域的选择及其生物学意义 |
| 4.2 感染性克隆的构建 |
| 4.3 EIAV LTR 嵌合克隆构建的意义 |
| 4.4 EIAV LTR 嵌合克隆复制特性和细胞嗜性 |
| 4.5 LTR 对病毒毒力的影响 |
| 4.6 马淋巴细胞增殖功能及细胞毒性T 淋巴细胞杀伤功能检测方法的建立 |
| 4.7 EIAV 免疫保护反应 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
（10）马传染性贫血病驴白细胞弱毒感染性分子克隆及其衍生毒的生物学和分子生物学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 一、 EIA的分子生物学研究进展 |
| 1 囊膜糖蛋白Env的变异与机体体液免疫的成熟 |
| 1.1 Env基因是高度变异的 |
| 1.2 Env蛋白的糖基化 |
| 1.3 机体体液免疫的成熟 |
| 2 基质蛋白Gag的CTL表位与机体的细胞免疫 |
| 2.1 Gag基因及其编码的蛋白 |
| 2.2 基质蛋白Gag的CTL表位 |
| 2.3 EIAV刺激机体所产生的细胞免疫 |
| 3 EIAV非编码区LTR的高度变异性与细胞因子的关系 |
| 3.1 LTR的变异性 |
| 3.2 LTR与细胞因子的相互作用 |
| 3.3 LTR与Tat的相互作用 |
| 二、 慢病毒疫苗研究进展与展望 |
| 三、 小结 |
| 研究报告 |
| 实验一 EIAV克隆毒和嵌合病毒免疫马攻毒前后体内各结构蛋白抗体水平及病理组织学的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验分组及病料采集 |
| 2.2 血清抗体的检测 |
| 2.3 各试验马解剖学变化 |
| 2.4 各试验马各脏器病理组织学检测 |
| 2.5 吞铁试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 接种及攻毒后各匹马的临床反应 |
| 3.2 攻毒前后各结构蛋白抗体的变异 |
| 实验二 利用REAL-TIME PCR和REAL-TIME RT-PCR对外周血白细胞EIAV前病毒及血浆中病毒RNA含量的测定 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 质粒 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 细胞培养用试剂 |
| 1.6 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验分组及病料的采集 |
| 2.2 马外周血白细胞的制备 |
| 2.3 马血浆的处理 |
| 2.4 前病毒DNA的提取 |
| 2.5 病毒RNA的提取 |
| 2.6 Real-time PCR引物的设计 |
| 2.7 Real-time PCR标准曲线的建立 |
| 2.8 Real-time RT-PCR标准曲线的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 Real-time PCR标准曲线的建立 |
| 3.2 Real-time RT-PCR标准曲线的建立 |
| 3.3 病毒DNA检测结果 |
| 3.4 病毒RNA检测结果 |
| 实验三 EIAV嵌合病毒接种马攻毒前后马外周血白细胞中EIAV前病毒LTR及ENV序列的测定及分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验分组及病料的采集 |
| 2.2 接种和攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒DNA的提取 |
| 2.3 半套式PCR扩增各试验马不同时期外周血白细胞前病毒LTR |
| 2.4 套式PCR扩增各试验马不同时期外周血白细胞前病毒env基因 |
| 2.5 PCR产物的克隆测序 |
| 2.6 序列的分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒LTR的扩增及克隆 |
| 3.2 免疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒env基因的扩增及克隆 |
| 3.3 免疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒LTR的序列比较分析 |
| 3.4 免疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒LTR序列变化规律 |
| 3.5 免疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒env的序列分析 |
| 3.6 免疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒部分ENV翻译终止情况 |
| 3.7 免疫及攻毒后7#马囊膜糖蛋白PND变异情况 |
| 3.8 免疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒ENV序列变异规律 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、马传贫驴白细胞弱毒疫苗毒和驴强毒全基因核苷酸序列测定（论文参考文献）
- [1]马传染性贫血病毒EIAVYN的全基因组分析及囊膜蛋白免疫学特性分析[D]. 刘影. 中国农业科学院, 2017(05)
- [2]马传染性贫血病毒第1 9、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA全基因序列分析[J]. 全滟平,赵立平,韩秀娥,沈楠,吕晓玲,沈荣显,相文华. 中国预防兽医学报, 2007(07)
- [3]马传染性贫血病病毒的基因变异与生物学特性研究[D]. 周涛. 华中农业大学, 2007(02)
- [4]中国马传染性贫血病毒LTR启动子活性及EIAVFDD弱毒株生物学特性研究[D]. 全滟平. 中国农业科学院, 2007(05)
- [5]中国马传染性贫血病毒驴强毒株与驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组序列分析[D]. 王雪峰. 内蒙古农业大学, 2007(03)
- [6]我国马传染性贫血弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立及标记疫苗的研究[D]. 耿庆华. 中国农业科学院, 2006(10)
- [7]马传染性贫血病毒LTR关键点突变对DLV致弱机理的研究[D]. 左咏梅. 东北农业大学, 2006(01)
- [8]马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用[D]. 涂亚斌. 中国农业科学院, 2005(07)
- [9]马传染性贫血病毒LTR嵌合克隆生物学特性的研究[D]. 魏丽丽. 东北农业大学, 2005(08)
- [10]马传染性贫血病驴白细胞弱毒感染性分子克隆及其衍生毒的生物学和分子生物学特性分析[D]. 袁秀芳. 中国农业科学院, 2004(04)