一、多重聚合酶链式反应技术及其应用（论文文献综述）
钱佳婕[1]（2021）在《CRISPR/Cas12a系统在新冠病毒和金黄色葡萄球菌即时检测中的应用》文中提出严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus2,SARS-CoV-2）所造成的新型冠状病毒肺炎是一种持续的大流行病,对公共卫生和全球经济构成了严峻挑战。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是一种常见的食源性致病菌,易引起食物中毒,并对人类健康造成严重威胁。针对上述致病微生物的现有检测方法各有优势,但仍依赖于大型仪器设备和专业操作人员,极大地限制了其应用范围,也难以在条件相对落后、实验资源匮乏的地区普及。近年来,规律成簇的间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及 CRISPR 相关蛋白（CRISPR associated proteins,Cas）所构成的CRISPR/Cas系统引起了科学家们的广泛关注,其中CRISPR/Cas12a因其具有crRNA指导的靶DNA激发的非特异性ssDNA切割活性成为了体外诊断领域的研究热点;重组酶介导扩增技术（Recombinase aided amplification,RAA）突破了精密控温设备的限制,在恒定且温和的条件下即可快速完成目标核酸的指数扩增;此外,胶体金免疫层析技术具有快速、便携的特点,将其与CRISPR/Cas12a技术结合,有望克服现有致病微生物检测技术的缺陷,实现更灵敏、特异、快速、简便的检测。故本研究意在结合CRISPR/Cas12a系统、RAA等温扩增技术、荧光分析及胶体金试纸条信号输出方式,构建针对SARS-CoV-2和金黄色葡萄球菌的即时检测平台。首先本文建立了一种基于CRISPR/Cas12a系统和荧光分析技术的SARS-CoV-2检测平台,选择N基因作为检测靶标,并将人源RNaseP基因片段作为内参。对反应条件进行优化后,该技术的灵敏度达1 ×100 copies/μL,并在检测临床样本时表现出良好的准确性和特异性,整个检测流程仅需60min。因此,该检测技术平台具有灵敏度高、特异性强、快速高效的特点,具有良好的发展前景,对于COVID-19早期诊断和预防控制具有重要意义。此外,本文基于上述原理构建了一种金黄色葡萄球菌检测平台,选择金黄色葡萄球菌nuc基因和葡萄球菌属16S rDNA作为检测靶标。结合RAA等温扩增技术,该平台检测灵敏度为1×100 CFU/反应,检测人工污染牛奶样品的灵敏度为2×101CFU/mL,并在检测其他食品样品时也表现出良好的准确性,整个检测流程仅需70 min,可满足食品中金黄色葡萄球菌的检测需求。为更好地满足即时检测需求,本文在金黄色葡萄球菌CRISPR荧光检测体系的基础上引入了胶体金免疫层析技术,建立了 一种CRISPR-lateral flow strip（CRISPR-LF）检测平台,可通过裸眼观测或读数仪测定,各项检测参数与上述荧光检测体系相当,并将整个检测流程缩短至60min。该平台在实现目标细菌快速、灵敏、准确、特异检测的同时,提高了检测的便携性和用户友好度,更适合在经济落后、实验资源匮乏的地区使用。因此,CRISPR-LF检测平台在致病菌POCT检测领域具有良好的发展前景,对于食品安全监查、食源性疾病的预防和诊断具有重要意义。
吴翠[2]（2021）在《农产品病原体的核酸快速扩增和荧光检测系统研究》文中进行了进一步梳理核酸扩增检测技术具有灵敏度高、特异性强等优点,在农产品安全检测领域发挥着越来越重要的作用。目前基于核酸扩增检测技术的系统普遍以实验室应用为主,存在检测耗时、体积大、成本高等缺点,不宜用于现场检测,严重限制了该技术的推广应用。本文针对快速双温PCR技术、环介导等温扩增技术以及数字核酸扩增技术,研究开发了基于这三种新型技术的核酸快速扩增和荧光检测便携式系统,以两种典型的农产品病原体（大肠杆菌和柑橘黄龙病菌）为检测对象,实现目标物的快速检测。本文主要研究内容及结果如下:（1）为了实现农产品病原体的快速定性分析,研制了一套快速双温PCR可视化检测系统,包括一台快速双温核酸扩增装置和一台便携式温控荧光可视化检测装置。构建了单一电机驱动的摇杆式双温区自动切换装置实现核酸的快速扩增,使得每个PCR循环中待测样品在双温区之间的转移时间小于1 s。针对形态各异的商业化PCR扩增样品容器,设计了适用于常规0.2 m L PCR管、罗氏玻璃毛细管和柔性毛细管的样品固定盘,提高了双温PCR可视化检测系统的通用性。以0.2 m L PCR管和罗氏玻璃毛细管为例,通过理论模拟和实验验证的方法评估了这两种样品容器在高速运动下的快速热传导效果,选用具有良好导热性的罗氏玻璃毛细管作为后续实验样品容器,其管内试剂最大升降温速率可达30℃/s。研究开发了一个便携式温控荧光可视化检测装置,避免了核酸开盖检测造成气溶胶污染等问题。该系统可在4 min内完成大肠杆菌DNA的快速可视化检测,且检测限与传统三温PCR一致,均为10 fg/μL。结果表明,该系统在农产品病原体核酸快速检测中展现出一定的应用潜力。（2）为了进一步实现农产品病原体的现场相对定量分析,提高系统的便携性和检测准确性,构建了可用于现场的便携式核酸扩增及荧光检测系统,包括便携式核酸扩增及荧光检测仪器样机（IF-Device）、一个无源试剂存储盒和一套现场核酸提取设备。该系统具有无源试剂存储、现场核酸提取、精确等温扩增、实时荧光检测等功能。IF-Device具有较强的抗光干扰特性,在三种不同光强（室外太阳光直射、室内白天日光灯照射、室内黑盒子）环境中,荧光信号数值变异系数（CV）均小于1%;较高的检测灵敏度,与进口PCR仪器Quant Studio 3比对结果表明,两者对荧光素钠检测灵敏度相当（检测限为1 n M）;良好的控温精度,设定值为65℃时控温误差只有0.31%,确保适宜的扩增环境和荧光检测信号的稳定。开发的无源环保试剂存储盒在高温（35℃）环境下,内部试剂温度能持续保持在4℃以下长达8 h,确保现场检测的可靠性。与进口仪器Quant Studio 3对标结果表明,本系统对大肠杆菌DNA和柑橘黄龙病菌检测限分别是10 pg/μL和0.2 pg/μL。对柑橘叶片中黄龙病菌的现场检测性能进行评估,该系统从核酸提取至输出检测结果整个过程可在40min内完成。以40个叶片样本为评估对象,该系统的阳性检出率与Quant Studio 3结果一致。研究表明,该便携式系统可适用于农产品病原体的现场快速筛查。（3）为了更进一步实现多种农产品病原体的绝对定量分析,设计了集手动样本分配、核酸扩增和产物检测于一体的双重数字LAMP微流控芯片,实现目标物的快速绝对定量检测。所构建的PDMS-玻璃微流控芯片包括液滴生成区和液滴存储区,总计64个并行出口以提高液滴生成速率,25μL样品可在2 min内完成分配。该芯片对离散相（核酸样品）流速具有较高的鲁棒性,当流速从100μL/hr增加到900μL/hr时,得到液滴的直径均在88-90μm区间内,为手动分配样品提供可能,摆脱了传统样品分配过程对精密设备的依赖。为了实现双重数字LAMP检测,采用荧光探针法进行产物检测。以大肠杆菌为研究对象,在所设计的微流控芯片上可实现DNA浓度从19.8到1980 copies/μL的数字LAMP检测,检测限为19.8 copies/μL（2.5 pg/μL）。采用两种不同波长的荧光基团分别对大肠杆菌DNA和λ噬菌体DNA的LAMP引物FIP进行修饰,实现两者同时绝对定量检测;在不同浓度的大肠杆菌DNA存在的情况下,相同λ噬菌体DNA浓度的测量值几乎保持一致,CV仅为4.54%。研究表明,该微流控芯片可为研发简便快速的便携式数字核酸检测系统提供硬件支持。
吴迪[3]（2021）在《核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置的研究及应用》文中研究说明病原体引起的传染性疾病,是威胁人类身体健康以及造成社会恐慌的主要因素,因此,对病原体传染病监测和防治的工作意义重大。在面对突发的未知病原体疫情时,如何做到快速而准确的筛查、鉴定以及追踪传染源,为研制相应的药物、疫苗以及挽回患者生命争取宝贵的时间,是一个重要的公共卫生问题。近年来,聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）技术已经被广泛的应用于病原生物学的诊断中,此技术通过体外酶促合成特异性DNA实现生物体外的特异性DNA复制。这种可以将微量的DNA在短时间内大量复制的技术,具有特异性和灵敏度高、产率高、操作快速便捷以及重复性好等优势,被广泛应用于医疗检测、生物科研、食品安全监测、农产品检测等方面。传统的核酸检测流程,一般有采样、样本运输、实验室核酸提取、配制检测试剂、混入样本、送入核酸检测仪进行扩增、产物检测等多个步骤,整个流程耗时较长,且实验操作复杂,对环境及人员要求较高,难以满足病原体即时检测的需求。因此,开发体积小通量低的集成式一体化的PCR检测微装置,不仅可以防止交叉污染,还易于实验操作的进行,使得非专业人士也可以进行检测,从而不局限于专门的实验室和训练有素的实验室工作人员。本论文针对细菌等病原体的即时检测,通过研究了自压式气体扩散微泵、微腔式PCR扩增模块与连续流动式PCR扩增模块,提出了一种一体化PCR方法,并且设计了一种基于核酸提取扩增及检测一体化的PCR扩增新装置,将病原体遗传物质的提取、PCR扩增以及产物检测三部分集成为由程序控制的自动化体系,此方法免除了复杂的实验操作流程,节省了人力物力,提高了检测效率。本文主要开展了以下研究工作:对自压式气体扩散微泵进行了设计及实验研究,包括其三种末端模式,分别为基于材料透气性的自压式气体扩散微泵、基于毛细石英管流阻的自压式气体扩散微泵以及基于多倍拉伸毛细特氟龙管流阻的自压式气体扩散微泵。并且综合考虑流体管阻、芯片透气属性与流道几何形状之间的关系,基于菲克定律建立了自压式气体扩散微泵数学模型,为自压式气体扩散微泵实现流体在微管道内的长时间连续、稳定、匀速流动提供新型的控制机理,并实现了高温条件下的单相微流体在长管道中稳定传输与多相流体稳定传输控制。对PCR扩增微装置进行了研究,主要分为微腔式PCR微装置和连续流动式PCR微装置。基于聚合酶链式反应中的变性-退火-延伸三个基本反应步骤,设计并构建包括基于油浴加热的微腔式PCR微装置、片上恒温单热源连续流动式PCR微装置以及片外恒温单热源连续流动式PCR微装置等满足多场景应用的聚合酶链式反应体系,为PCR仪的小型化与高度集成化奠定了基础。并且基于利用帕尔贴效应的片外恒温单热源连续流动式PCR扩增方法设计并搭建了一套PCR原理样机,该样机利用自压式气体扩散微泵实现单相流体在微管道内的长时间匀速稳定流动,并利用半导体制冷片的帕尔贴效应以及陶瓷的导热特性实现了单一恒温热源,达到了体积小、功耗低的目标。研究并设计了一体化核酸预处理扩增检测的PCR微装置。该装置体积小、便携化、成本低、操作简单,可实现病原体自动化、高特异、高灵敏检测。研发了基于Chelex-100和蛋白酶K的DNA提取方法,结合高温以缩短操作时间,确定了各成分配比与高温时间的最优化分配方案。为满足不同使用场景,结合微流控芯片技术,研究了片上式和片外式的病原体检测方法,开展了病原体检测系列实验,对提取细菌和人类毛发等核酸的性能进行评价,实现了“sample-in-answerout”的检测目标。此外,微装置中的微型凝胶电泳产物检测模块不仅可以应用于病原体核酸扩增后的产物检测,还可以后续应用于流行病序列分析、追踪传染源、基因测序等方面。综上所述,本文针对PCR装置中的微泵模块、扩增模块,以及病原体的核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置的研究,简化了样本检测步骤,降低了样本检测时间,为生命科学的研究提供了一种新的分析方法。
王芳芳[4]（2021）在《MicroRNAs及循环外泌体的高灵敏度分析》文中提出MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码的小RNA分子,可通过与靶基因mRNA结合抑制蛋白的翻译或诱导mRNA降解来调控基因的表达,在许多生物过程中起着重要调控作用。目前已有许多研究表明,miRNA在细胞中的表达水平与人类的许多疾病,尤其是癌症密切相关,可作为癌症诊断和预后分析的基因标志物。一般一种癌症的发生与多种miRNAs的表达异常相关,同时检测多种miRNAs可以大大提高癌症诊断的准确性。因此,建立一种高灵敏的多重检测miRNAs的方法,对癌症的诊断、治疗以及肿瘤发生机制的研究具有重要意义。外泌体是一种由脂质双分子层包裹的直径约为30 nm-200 nm的小囊泡,由各种类型的细胞在正常状态或病理状态下向胞外环境释放,存在于各种体液。外泌体携带着大量来源于亲本细胞的关键分子信息,是细胞间信息传递的良好载体,在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中具有重要作用。越来越多的证据表明,循环外泌体可以作为重要生物标志物用于疾病的早期诊断与治疗,因此,建立简单、可靠、高灵敏检测循环外泌体的方法是迫切需要的。本论文基于编码DNA探针在miRNA的cDNA文库中的延伸反应,建立了一种能高灵敏度多重检测miRNAs的方法。同时,结合单个微球分离技术与原位荧光成像分析,建立了高灵敏检测循环外泌体的方法。（1）我们首先通过增加酶切步骤去除过量的接头以避免接头二聚体的产生,从而改进了常规的miRNA cDNA文库构建方法,大大提高了 cDNA文库的构建效率。以文库中的cDNA作为模板,针对不同的miRNA靶标设计不同长度的延伸探针,使其特异性与目标cDNA的关键部位杂交,并进行单碱基延伸反应（Single Base Extension,SBE）,延伸不同荧光基团标记的ddNTPs。不同的miRNA产生具有唯一编码的SBE产物,利用毛细管电泳即可进行分离检测,由此建立了高灵敏多重检测miRNAs的方法。双重编码技术的应用提高了该方法检测miRNAs的通量,可实现17种miRNAs的同时检测;同时,通过SBE-DNA探针特异性设计,该方法具有很高的特异性,能够有效识别目标序列中单碱基差异。此外,利用本课题方法构建的包含所有miRNAs的cDNA文库,为同时检测任意miRNAs提供强大通量。（2）以单个微球作为反应的载体,首先在单个微球表面修饰外泌体CD63蛋白的核酸适配体,对样品中含CD63蛋白的外泌体（CD63-外泌体）进行特异性识别和富集。基于外泌体膜结构性质,胆甾醇标记的荧光探针可以自发嵌入外泌体的脂质膜对微球上的外泌体进行荧光标记。利用激光共聚焦荧光显微镜进行单微球荧光成像,监测单微球表面荧光强度,荧光的强弱与外泌体的含量正相关,从而建立了简单、灵敏的外泌体定量分析方法。该检测系统不需要其它信号扩增技术即可实现对外泌体的灵敏检测,可检测到低至4.9×104个/μL的外泌体。此外,该方法可成功应用于少量临床血浆样品中外泌体的直接检测。（3）肿瘤来源的外泌体携带着大量肿瘤特异性蛋白,作为理想的生物标志物可用于癌症的早期诊断与预后分析。我们以单个微球作为反应载体,在微球表面修饰外泌体普遍存在的膜蛋白的抗体（抗CD63和抗CD81）,对样品中所有外泌体进行有效富集。利用修饰在金纳米粒子（Gold Nanoparticles,AuNPs）上的核酸适配体进一步特异性识别并结合肿瘤特异性外泌体蛋白;同时,AuNPs可作为信号放大器,使一个目标蛋白捕获多个核酸适配体。每一个核酸适配体在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase,TdT）的催化作用下产生一个长的poly（dT）尾,杂交荧光标记的poly（dA）探针,使大量荧光分子在微球表面富集,实现高效信号放大。从而建立了超高灵敏度检测肿瘤特异性外泌体蛋白的方法。该方法可以检测到低至55个/μL的肿瘤特异性外泌体,并成功应用于血浆样品中肿瘤特异性外泌体蛋白的高灵敏检测。
秦盼柱[5]（2021）在《基于核酸扩增原理的常见肉源性成分快速鉴定研究》文中提出肉类食品是人类饮食的重要组成部分,肉制品安全与人们的身体健康和生命安全直接相关。近年来接连发生的肉制品安全事件使人们充分意识到建立准确、有效的肉品质量监管机制的重要性。然而,目前的检测方法仍以实验室分析为主,可用于快速、简单和现场检测肉源性成分的方法较少。针对肉制品检测的研究现状,本论文以聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等核酸扩增技术为基础,并与荧光分析、荧光偏振（FP）、侧向层析试纸（LFS）和表面增强拉曼光谱（SERS）等流行的传感技术相结合,旨在建立简单、快速和灵敏的常见肉源性成分检测新方法。主要内容如下:（1）基于功能化引物设计的PCR方法检测牛肉中的马肉成分。PCR引物的末端被设计成了独特的颈环结构,颈环结构上标记了荧光基团和淬灭基团。在初始条件下,颈环上的荧光基团和淬灭基团相互靠近,荧光信号很弱。当马肉成分存在时,功能化的引物会参与扩增过程,导致引物末端的颈环结构被打开并产生荧光信号的恢复。且马肉成分越多,收集的荧光信号越强。在最优条件下,该方法对牛肉中掺假马肉的检测限为0.04%（w/w）。此外,对加工牛肉样品的检测进一步证实了该方法的实际应用潜力。与传统PCR相比,该方法在检测效率上具有明显的优势,并充分突出了其快速检测和易于操作的特点。（2）基于单链结合蛋白增强的荧光偏振策略检测牛肉中的鸡肉成分。将传统PCR技术与FP技术相结合,提出了一种基于单链结合蛋白（SSB）增强的FP策略,可用于灵敏检测肉品中的鸡肉成分。基因组模板提取后,首先使用荧光基团标记的针对鸡肉特异的引物进行PCR扩增。然后在扩增产物中加入SSB,使单链引物与SSB充分结合。当没有鸡肉成分时,荧光基团标记的引物可以与后续添加的SSB牢固结合,荧光基团的运动被束缚,因此FP信号很高。当存在鸡肉成分时,荧光基团标记的引物在扩增过程中被消耗,不能与后续添加的SSB结合,导致FP信号降低。而且,鸡肉成分越多,测量的FP信号越低,进而建立起鸡肉掺假比例与FP信号的相关关系。在最优条件下,该方法对牛肉中掺假鸡肉的检测限为0.035%（w/w）。该方法强调了FP技术在PCR产物快速分析中的应用,突出了SSB对FP信号的增强作用。与基于电泳分析和荧光回收的传统检测方法相比,该方法具有设计简单、操作方便和检测快速的优点。（3）基于环介导等温扩增的荧光偏振方法快速检测牛肉中的猪肉成分。通过巧妙地将荧光基团标记的引物应用于LAMP的反应系统,构建了一种结合了LAMP技术的等温扩增优势和FP技术的快速检测优势的理想平台。荧光基团标记的引物分子量较小且旋转速率较快,因此显示的FP信号有限。当存在猪肉成分时,分子量较小的引物经过扩增被转变成大分子量的产物,导致荧光基团的旋转受到限制,因此FP信号显着增强。在最优条件下,该方法可以检测到牛肉中低至0.01%（w/w）的掺假猪肉。与需要复杂分析过程的传统检测方法相比,该策略具有简单、灵敏、快速和现场检测的优点。重要的是,这种独特的方法也适用于加工肉产品的检测。我们期望本研究能为食品安全检测方法的建立提供新的视角。（4）基于多重PCR的侧向层析试纸方法同时检测鸡肉、鸭肉和猪肉成分。把多重PCR和LFS技术相结合,开发了一种同时检测肉品中多种肉类成分的可视化方法。针对鸡肉、猪肉和鸭肉的三组引物末端分别连接了不同的核酸标签,因此获得的扩增产物两端也具有不同的核酸标签。使用LFS分析扩增产物时,扩增产物的一端可以与金纳米粒子（Au NPs）上的识别探针杂交,另一端可以与对应检测线上的捕获探针杂交,从而把Au NPs固定到对应的检测线上并使之变红。重要的是,每种掺假成分分别对应一条检测线,因此可以通过一次反应实现对三种掺假成分的同时和可视化检测。得益于PCR技术的高效率和LFS技术的简便性,该方法对鸡肉、鸭肉和猪肉的检测限分别为0.006%（w/w）、0.004%（w/w）和0.007%（w/w）。（5）基于重组酶聚合酶扩增的侧向层析试纸方法同时检测鸭肉、鸡肉和猪肉成分。把RPA技术与LFS技术相结合,建立了一种同时检测肉品中鸭肉、鸡肉和猪肉成分的可视化方法。在RPA的扩增体系中,我们引入了三组分别针对鸭肉、鸡肉和猪肉特异的末端功能化的引物,因此可以实现对三种目标基因的同时扩增。当掺假成分存在时,通过扩增可以获得两端标记的双链产物,借助双链产物的桥接作用即可把Au NPs固定到对应的检测线上并使之变红。该方法重点突出了RPA技术的等温扩增和多重放大优势,强调了RPA技术与LFS技术的联合使用在肉类掺假检测中的应用潜力。在最优条件下,该方法对鸡肉、鸭肉和猪肉的检测限分别为0.009%（w/w）、0.005%（w/w）和0.004%（w/w）。（6）基于表面增强拉曼光谱的侧向层析试纸方法同时检测牛肉中的多种肉类成分。以RPA的扩增产物为媒介,将SERS技术和LFS技术相结合,提出了一种检测肉品中多种肉类成分的新方法。为简化LFS的设计,采用三种拉曼信标作为三种肉类的标记物,只使用一条检测线同时捕获三种扩增产物。当检测线显色时即可证明样品中有目标成分存在,然后利用拉曼光谱分析肉品的具体成分。该方法是在（5）中研究的基础上发展出来的,重点强调了RPA技术、LFS技术和SERS技术在肉类成分检测中的联合应用。在最优条件下,该方法对鸡肉、鸭肉和猪肉的检测限分别为0.006%（w/w）、0.005%（w/w）和0.009%（w/w）。
何如怡[6]（2021）在《基于Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的核酸检测方法研究》文中研究说明核酸检测是分子诊断的主要手段之一,在卫生保健、环境监测、生物安全以及食品分析等许多领域发挥了重要的作用,开发操作简单成本低的高灵敏度、高特异性核酸检测技术具有重要意义。近年来,基于CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system）系统发展的一系列高灵敏度和高专一性的核酸检测技术在临床诊断上取得了显着的进展,然而Cas效应蛋白需要使用RNA作为向导,并且依赖特殊序列,比如PAM（Protospacer adjacent motif）或者PFS（Protospacer flanking site）,来识别靶位点,这在一定程度上限制了其应用。与Cas效应蛋白类似,Argonaute（Ago）也是一类以核酸作为向导的核酸内切酶。PfAgo（Pyrococcus furiosus Argonaute）是一种来源于古生菌的原核Ago蛋白质,可以利用具有5’磷酸基团的单链DNA（大于15 nt）作为向导,从向导的5’端开始的第10和11个核苷酸之间的位点切割互补的单链DNA。本研究发现PfAgo切割产生的单链DNA能够作为向导引发新的酶切反应。基于此发现,我们建立了一种具有高灵敏度、高特异性和多重检测能力的核酸检测方法,通过对临床核酸样本的检测证明了该方法的可行性和应用潜力。随后,我们将该方法加以改进并用于SARS-CoV-2的核酸检测。同时,本研究利用向导的长度对PfAgo切割活性的影响,将极短PCR技术与PfAgo结合起来开发了另一种简单快速的核酸检测方法。综上,本研究通过深入探究PfAgo的酶学性质开发了三种高灵敏度、高特异性、高准确性的核酸检测技术,为分子诊断提供了新的方法选择,并为Ago蛋白的应用提供了新的思路。本论文的具体内容如下:1.PfAgo蛋白质的表达纯化及性质研究。根据PfAgo耐高温的性质,利用80°C水浴处理和Ni-NTA亲和纯化获得了高纯度PfAgo蛋白质。对PfAgo性质的进一步研究发现向导DNA（guide DNA,g DNA）与靶DNA（target DNA,t DNA）的单碱基不匹配会显着影响PfAgo对靶的切割效率。此外,g DNA 3’端的突出对PfAgo的切割活性没有影响,5’端突出会影响PfAgo的切割活性和切割位点。本研究发现PfAgo切割单链DNA产生的具有5’磷酸基团的单链DNA可以作为新的g DNA介导PfAgo靶向切割与之互补的单链DNA,表明PfAgo的切割反应可以传递。2.结合PfAgo切割反应可传递的特点和PCR技术开发基于PfAgo的核酸检测方法（PAND）。设计三条分别靶向待检测双链DNA不同位置的g DNAs（输入g DNAs）介导PfAgo切割双链DNA靶,并从中释放出一条单链DNA,作为新的g DNA（生成g DNA）与PfAgo蛋白结合,靶向切割互补的分子信标,从而产生荧光信号,实现检测的目的。该方法检测灵敏度可以达到1.6 a M、能够识别单碱基突变和实现五通道检测。对模拟样本和临床样本的检测结果表明该方法可以应用于16S r DNA、结核杆菌和乙肝病毒耐药性突变、BRAC1基因的单核苷酸位点多态性位点、循环肿瘤DNA以及人乳头瘤病毒（HPV）多亚型分型的检测。3.结合逆转录PCR技术和PfAgo切割反应开发了基于PfAgo的SARS-CoV-2检测（SARS-CoV-2 PAND）。通过筛选最佳的PfAgo/g DNA复合物,仅利用单条输入g DNA建立了高灵敏度、高专一性、高准确度的SARS-CoV-2核酸诊断方法,检测下限可以达到1拷贝每反应。该方法缩短了荧光定量PCR仪的使用时间,能够有效解决大规模检测时荧光定量PCR仪不足的问题。对44例新冠病毒疑似感染者的咽拭子核酸提取物的检测结果与荧光定量逆转录PCR（RT-q PCR）一致,同时对36例阳性样品进行了D614G突变检测,证明SARS-CoV-2 PAND可以用于SARS-CoV-2及其突变体的检测。4.基于PfAgo的切割活性只能由长度大于15 nt的g DNA触发的性质开发了结合极短PCR技术和PfAgo的核酸检测方法（USPCRP）。利用具有5’磷酸基团的短引物启动的极短PCR的扩增产物作为g DNA来介导PfAgo切割分子信标,进行DNA检测,该方法无需额外加入g DNA,具有100 a M的检测灵敏度和序列特异性。利用该方法成功对临床样本的HPV16E6基因和SARS-CoV-2 ORF1ab基因进行了检测,表明该方法能够用于临床诊断。
官昭瑛,李慧敏,何曼文,余展旺[7]（2021）在《多重PCR技术在快速检测中的应用》文中提出多重PCR技术是一种将常规PCR扩增体系改进后同时扩增多个目的片段的新型技术。多重PCR凭借高通量、低成本、特异性强的特点,迅速被应用于快速检测领域及科学研究领域。简要概述了多重PCR技术,综述了多重PCR技术在病毒检测、细菌检测、血清学检测的应用,并将其与常规技术进行比较,总结了这些方法的优缺点,为今后多重PCR技术在快速检测中的应用选择提供依据。
陈哲[8]（2020）在《基于DNA计算的可满足性问题的模型研究》文中认为可满足性问题是一个寿命很长且经典的数学问题,SAT问题一般被称为命题逻辑的可满足性问题。确定性算法和非确定性算法是解决SAT问题的两种算法,为布尔表达式分配适当的逻辑值可以使公式为True,则称该公式是可满足的。根据给定的公式就可以检测出布尔可满足性问题是否可满足。在计算机的各个领域这个决策问题都至关重要,包括计算机科学,算法,密码学,人工智能和复杂性理论。建模这种方法适用于大多数的可满足性问题,高容量的存储、结果具有较高的精准度、最关键的一点是拥有高度的并行性,这些都是DNA计算所具有的优点,这就使得DNA计算在解决可满足性问题上占尽优势。可满足性问题的计算模型是本文的研究重点,并且这些模型的设计都是为了使DNA计算更加简便快捷,检测结果更为直观。文章主要分为四个部分,第一部分介绍了实验中比较多见的DNA分子操作技术,并且简单叙述了 DNA计算的一些基础知识,为后面介绍DNA计算模型打下了基础。第二部分对可满足性问题的基本知识作了介绍,包括算法,国内外研究进展。第三、四部分为文章的主要工作部分,分别介绍了两种不同的DNA计算模型。最后为本文的总结陈述部分。第三、四部分为本文的主要工作内容,介绍了两种基于DNA计算的可满足性问题的模型。第一种建立了一个基于DNA链置换的可满足性问题的计算模型,可满足性问题的约束条件被映射成计算模型上的荧光颗粒个数,将可满足性问题中变量的两种取值（0和1）分别设计成不同的DNA链,通过DNA链置换反应,最后观察找出满足可满足性问题的可行解,可以通过观察反应后的计算模型上的荧光颗粒个数得出,因为DNA链置换反应条件简单、所得到的产物量高,因此该计算模型具有一定的可行性,而且最后的结果通过荧光检测来观察反应的结果,操作简单、结果准确。但该计算模型的不足之处是模型建构比较简单,无法适用于更一般,规模更大的可满足性问题。第二种计算模型为一种动态的DNA折纸结构,该结构由DNA折纸卡槽、双态DNA机器、DNA行走机器人三部分组装而成。折纸卡槽由一条DNA长链和若干短链折叠而成,DNA行走机器人是由7条单链折成的三手四足DNA折纸结构,其中双态DNA机器可以控制阀门打开或者关闭,其结果就是DNA机器是否携带荧光颗粒。DNA机器人的“手”通过与双态DNA机器发生链置换反应接收其携带的荧光颗粒,机器人的“脚”在链置换反应的驱动下以顺时针旋转120°方向在折纸卡槽和DNA双态机器组装而成的折纸基底上完成行走。根据可满足性问题的约束变量选择性的接收荧光颗粒,每一步对应于一个变量的取值,以荧光团的个数映射问题的条件,以荧光团的颜色映射问题的解。两种模型都有操作简单易于观察检测的特点,因而大大提高了模型的可行性和计算的准确性。图[27]参[51]
张文雅[9]（2020）在《基于免酶等温信号放大技术的诺如病毒核酸检测方法研究》文中研究说明诺如病毒作为引起非细菌性食物中毒的主要致病原之一,通常栖息于贝类和浆果等食物上,具有极强的感染性,被称为“肠道流感”。近年来由食源性诺如病毒引起的疫情呈快速增长趋势,因此发展对其快速有效的检测方法至关重要。靶向核酸的分子生物学技术如PCR等是病毒检测中非常重要的一类检测方法,等温信号放大技术具有与PCR方法相当的高灵敏度且无需变温循环过程、不依赖温度控制设备,随之发展的免酶等温信号放大技术具有操作简单、反应高效的优点,近些年引起研究者广泛关注,被应用于食品安全、环境监控、医疗诊断等领域的生物传感器构建。本论文以GⅡ型诺如病毒保守序列作为检测目标核酸序列,构建了两种新型的免酶等温信号放大方法。首先构建了一种基于翘板门循环等温信号放大技术（SGA）的核酸检测方法;其次,利用银簇作为免标记信号输出,使用催化发夹自组装扩增（CHA）技术和磁球分离,构建了基于磁分离和CHA的核酸检测方法。本论文的主要研究内容如下:1.建立了基于翘板门循环的等温信号放大技术（SGA）,该技术基于足点介导的链置换反应,通过类似于跷跷板的反应,实现荧光信号的循环放大。在此基础上,建立了高灵敏的免酶核酸检测方法,此法序列设计较为简洁、体系较为简单、操作方式较为简易。在对反应体系中的序列浓度、反应温度和反应时间进行优化后,可在常温（25°C）下实现对目标序列的快速检测,荧光信号和目标序列DNA在0.01-10 nmol/L的浓度范围内呈现良好的线性相关（IF=0.94x+1.45,R2=0.9934）,最低检测限为9.8 pmol/L。对于目标序列RNA的灵敏度检测也表现较好的线性关系（IF=0.75x+1.18,R2=0.9810）,其检测限为83 pmol/L。2.考察不同的表面连接方式,选用较为稳定的生物素-亲和素体系作为磁球上连接捕捉探针H1的固定化技术。基于CHA技术和磁球分离,使用免共价标记的DNA银簇作为信号输出,发展了病毒核酸的免酶荧光检测方法。该方法的银簇合成独立于核酸识别过程,且在磁球的快速富集分离作用下,可以有效避免由非特异性杂交引起的荧光增强这一假阳性,具有背景信号低的优势。在优化的反应条件下（H1浓度为3μM,H2浓度为3.5μM,反应时间3 h）,本方法在1-100 nmol/L的目标序列浓度范围内呈现良好的线性关系（y=766.3x+30.9,R2=0.9664）,检测限为0.82 nmol/L。同时,在与碱基错配序列的对照实验和以血清为基质的回收率考察中,此法选择性和重复性表现良好。3.在基于磁分离和CHA的核酸检测方法研究中,发现生物素-亲和素偶联体系对银簇的荧光具有强淬灭作用（淬灭90%）,并开展了相关的验证研究。调整生物素标记的H1其3’端T碱基个数（3T-20T）,研究该体系就间隔距离对银簇荧光强度的影响,发现间隔距离为7T时淬灭程度最低（淬灭60%）,进一步选取4条不同的银簇合成模板序列,验证该体系对所合成的DNA银簇均具有荧光淬灭效果。
石维平[10]（2020）在《基于信号放大的电化学传感器构建及在黄体酮检测中的应用》文中研究说明黄体酮（progesterone,Pro）是一种主要由黄体分泌的21碳类固醇激素,对乳腺组织的发育和妊娠的维持至关重要,其失衡可导致生殖系统畸形、不孕不育、乳腺癌、肺癌,甚至引发严重的环境问题。通过将高灵敏的电化学分析方法与高亲和力的核酸适配体相结合而构建的电化学分析模式,具有响应速度快、灵敏度高、成本低廉等优点,已成为检测生物分子的主要分析方法之一。为提高电化学检测灵敏度,信号放大技术在电化学传感器的构建中至关重要。本文旨在结合电化学传感技术和分子生物放大、酶催化底物放大及目标物循环放大等信号放大策略,构建几种新型电化学适配体传感分析模式,以实现对黄体酮的高灵敏检测。本文主要研究内容如下:第一章:首先对检测黄体酮的重要性及其研究现状进行简单概述,然后对电化学生物传感器的原理、分类进行详细介绍,并重点介绍几种信号放大技术。最后,简要介绍本论文的主要研究目的及内容。第二章:构建了一种基于杂交链式反应（hybridization chain reaction,HCR）放大策略的电化学适配体传感器。以金纳米颗粒功能化的玻碳电极（glassy carbon electrode,GCE）为基底固载黄体酮适配体（TDNA）形成传感捕获界面,结合HCR反应及氯高铁血红素（hemin）与富-G碱基部分的结合作用形成具有过氧化物酶特性的hemin/G-四聚体串联体（DNAzyme）。DNAzyme在过氧化氢存在下能对邻苯二胺催化产生电化学信号。当目标物Pro存在时,Pro与TDNA结合形成Pro-TDNA复合物,促使DNAzyme串联体的释放,进而降低检测信号。在实验条件优化下,基于电化学活性物质产生的电流峰值与Pro的浓度成反比关系,且电流峰值与Pro浓度的对数在0.5～15 ng/m L范围内具有很好的线性相关,检出限为0.36 ng/m L。检测结果与HPLC法的测定结果相比较,数据表明本传感器较HPLC法具有更高的灵敏性和较低的检测限,体现出所构建电化学传感分析模式在Pro检测中巨大的应用潜力。第三章:基于三重信号放大策略,提出一种简单、无标记、灵敏的适配体传感分析模式。利用HCR反应形成串联体结构（第一重放大）,联合hemin特异性结合富-G碱基部分形成hemin/G-四聚体吸附大量信号指示剂亚甲蓝（MB）（第二重放大）构建传感界面。当目标黄体酮与适配体（TDNA）杂交形成Pro-TDNA复合体,刺激电极表面串联体复合物的释放,进而阻碍MB和电极间的电子转移。核酸酶I（Exo I）特异性识别并剪切Pro-TDNA双链结构中的TDNA,随之释放Pro。被释放的目标物继续与电极表面串联体复合物竞争TDNA,如此循环,实现信号的第三重放大。实验结果表明,基于电化学活性物质亚甲蓝产生的电流峰值与Pro浓度在1～40 ng/m L范围内呈现良好的线性关系,检测限为0.1 ng/m L。与此同时,所构建传感分析模式可用于实际新生牛血清样品的加标检测。第四章:利用hemin/G-四聚体的类过氧化物酶特性,结合核酸酶辅助循环信号放大策略构建一种无标记、便捷的均相电化学分析模式。黄体酮适配体（TDNA）竞争结合“Ω”型DNA结构（Ω-DNA）中的DNA2形成TDNA/DNA2双链结构并释放DNA1（富G链）。被释放的DNA1与hemin相互作用形成DNAzyme。DNAzyme在过氧化氢存在下对邻苯二胺催化产生电化学信号。核酸外切酶III特异性识别TDNA/DNA2双链结构中的DNA2进行剪切,释放TDNA继续竞争结合DNA2,如此循环,增加DNAzyme的生成量,提高信号响应。目标物（Pro）与TDNA倾向于形成稳定的TDNA/Pro复合物,导致自由TDNA的量减少,相应DNAzyme生成量减少,电化学信号减弱。研究结果表明,电活性物质产生的电流峰值与Pro浓度的对数在1 pg/m L～10 ng/m L范围内具有很好的线性相关性,检测限可达0.3pg/m L。
二、多重聚合酶链式反应技术及其应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、多重聚合酶链式反应技术及其应用（论文提纲范文）
（1）CRISPR/Cas12a系统在新冠病毒和金黄色葡萄球菌即时检测中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 致病微生物的危害与现状 |
| 1.1.1 传染性病毒简介 |
| 1.1.2 食源性致病细菌简介 |
| 1.2 致病微生物的检测技术 |
| 1.2.1 SARS-CoV-2 |
| 1.2.2 金黄色葡萄球菌 |
| 1.3 即时检测 |
| 1.3.1 即时检测概述 |
| 1.3.2 即时检测技术分类 |
| 1.4 基于CRISPR/Cas检测技术简介 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas系统简介 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas检测技术 |
| 1.5 论文的研究意义及内容 |
| 2 基于CRISPR/Cas12a技术的SARS-CoV-2荧光检测平台 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要病毒株 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.2.3 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 样品处理及病毒RNA提取 |
| 2.3.2 检测靶标的选择、引物的设计 |
| 2.3.3 crRNA的设计与转录 |
| 2.3.4 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 2.3.5 CRISPR/Cas12a检测反应体系的优化 |
| 2.3.6 CRISPR/Cas12a检测的可行性研究及最优检测位点的选择 |
| 2.3.7 SARS-CoV-2 CRISPR-fluorescence检测方法的建立与灵敏度表征 |
| 2.3.8 临床样本的CRISPR-fluorescence检测 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 2.4.2 CRISPR/Cas12a检测反应体系的优化 |
| 2.4.3 CRISPR/Cas12a检测体系最优检测位点的选择 |
| 2.4.4 SARS-CoV-2 CRISPR-fluorescence检测方法的建立与灵敏度表征 |
| 2.4.5 临床样本的CRISPR-fluorescence检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 基于CRISPR/Cas12a技术的金黄色葡萄球菌荧光检测平台 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要菌株 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.2.3 主要培养基 |
| 3.2.4 主要药品和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌种保藏、活化和培养 |
| 3.3.2 金黄色葡萄球菌计数方法 |
| 3.3.3 样品处理 |
| 3.3.4 特异性靶标的选择、引物的设计 |
| 3.3.5 crRNA的设计与转录 |
| 3.3.6 CRISPR/Cas12a的顺式切割活性验证 |
| 3.3.7 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 3.3.8 基于PCR的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.3.9 基于RAA的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.3.10 金黄色葡萄球菌CRISPR-fluorescence检测系统灵敏度试验 |
| 3.3.11 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的检测系统构建及灵敏度表征 |
| 3.3.12 其他人工污染食品检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 CRISPR/Cas12a的顺式切割活性验证 |
| 3.4.2 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 3.4.3 基于PCR的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.4.4 基于RAA的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.4.5 金黄色葡萄球菌CRISPR-fluorescence检测系统灵敏度试验 |
| 3.4.6 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的检测系统构建及灵敏度表征 |
| 3.4.7 其他人工污染食品的CRISPR-fluorescence检测 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 基于CRISPR/Cas12a技术的金黄色葡萄球菌POCT检测平台 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要菌株 |
| 4.2.2 实验仪器与设备 |
| 4.2.3 主要培养基 |
| 4.2.4 主要药品和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌种保藏、活化和培养 |
| 4.3.2 金黄色葡萄球菌计数方法 |
| 4.3.3 样品处理 |
| 4.3.4 特异性靶标的选择、引物的设计 |
| 4.3.5 crRNA的设计与转录 |
| 4.3.6 胶体金试纸条的反应条件优化 |
| 4.3.7 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 4.3.8 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的特异性表征 |
| 4.3.9 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的CRISPR-LF检测系统构建及灵敏度表征 |
| 4.3.10 其他人工污染食品检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 胶体金试纸条反应条件的优化 |
| 4.4.2 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 4.4.3 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的特异性表征 |
| 4.4.4 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的CRISPR-LF检测系统构建及灵敏度表征 |
| 4.4.5 其他人工污染食品的CRISPR-LF检测 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者攻读硕士学位期间发表论文 |
（2）农产品病原体的核酸快速扩增和荧光检测系统研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 食源性致病菌及其检测技术 |
| 1.1.2 柑橘黄龙病菌及其检测技术 |
| 1.2 核酸扩增检测技术 |
| 1.2.1 快速双温PCR技术 |
| 1.2.2 环介导等温扩增技术 |
| 1.2.3 数字核酸扩增技术 |
| 1.3 核酸扩增和荧光检测系统的研究 |
| 1.3.1 核酸扩增和荧光检测系统概述 |
| 1.3.2 商业化核酸扩增检测系统 |
| 1.3.3 核酸扩增检测系统的国内外研究进展 |
| 1.4 国内外研究中尚存在的问题 |
| 1.4.1 快速PCR系统 |
| 1.4.2 便携式实时等温核酸检测系统 |
| 1.4.3 数字LAMP检测系统 |
| 1.5 研究目的、内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究目的和内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 快速双温PCR系统及荧光可视化检测方法建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 系统功能 |
| 2.3 系统设计 |
| 2.3.1 系统结构设计 |
| 2.3.2 系统硬件设计 |
| 2.3.3 系统软件设计 |
| 2.4 实验材料、试剂、仪器和方法 |
| 2.4.1 材料和试剂 |
| 2.4.2 仪器设备 |
| 2.4.3 实验方法 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 快速双温PCR装置性能评估 |
| 2.5.2 可视化荧光检测装置可行性评估 |
| 2.5.3 快速双温PCR扩增及可视化系统在大肠杆菌检测中的应用 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 单重实时荧光便携式等温检测系统研究及其应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 检测系统功能 |
| 3.3 检测系统设计 |
| 3.3.1 系统硬件设计 |
| 3.3.2 系统软件设计 |
| 3.3.3 系统外观设计 |
| 3.4 实验材料、试剂、仪器和方法 |
| 3.4.1 材料和试剂 |
| 3.4.2 仪器设备 |
| 3.4.3 系统性能评估方法 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 便携式系统性能评估 |
| 3.5.2 柑橘黄龙病Las型实际样品测量评估 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 双重数字等温扩增微流控芯片研究及其应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 微流控芯片研发 |
| 4.2.1 双重数字LAMP芯片功能 |
| 4.2.2 双重数字LAMP芯片设计 |
| 4.3 实验材料、试剂、仪器和方法 |
| 4.3.1 材料和试剂 |
| 4.3.2 仪器设备 |
| 4.3.3 芯片制作 |
| 4.3.4 系统评估方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 数字微流控芯片性能评估 |
| 4.4.2 数字LAMP检测体系的优化 |
| 4.4.3 双重数字LAMP微流控芯片在大肠杆菌检测中的应用 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（3）核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置的研究及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.1.1 PCR技术的发展 |
| 1.1.2 微流控技术的发展 |
| 1.2 研究进展及现状分析 |
| 1.2.1 微流体控制技术 |
| 1.2.2 集成式PCR方法 |
| 1.2.3 核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置 |
| 1.3 本论文主要研究内容 |
| 1.4 本论文章节安排 |
| 第2章 PCR技术中的流体自发传输 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 自压式气体扩散微泵的流体传输原理 |
| 2.2.1 基于材料透气性的微泵流体传输原理 |
| 2.2.2 基于毛细管流阻的微泵流体传输原理 |
| 2.3 自压式气体扩散微泵的设计与搭建 |
| 2.3.1 基于材料透气性的自压式气体扩散微泵 |
| 2.3.2 基于毛细管流阻的自压式气体扩散微泵 |
| 2.4 实验设计及操作 |
| 2.4.1 基于材料透气性的微泵搭建 |
| 2.4.2 基于毛细管流阻的微泵搭建 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 基于材料透气性的微泵流体传输性能 |
| 2.5.2 基于毛细石英管流阻的微泵流体传输性能 |
| 2.5.3 基于多倍拉伸毛细特氟龙管流阻的微泵流体传输性能 |
| 2.5.4 微液滴的自动生成与传输 |
| 2.5.5 高温下微流体长距离稳定传输 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 基于油浴控温的微腔式PCR微装置设计 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 微装置的结构及设计 |
| 3.2.1 微装置的搭建 |
| 3.2.2 微装置操作流程 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 实验设备 |
| 3.3.2 实验试剂与耗材 |
| 3.3.3 实验方案 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 PCR微装置的温度控制 |
| 3.4.2 PCR质粒检测 |
| 3.4.3 PCR细菌检测 |
| 3.4.4 不同管径PCR检测效率 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 恒温单热源连续流动PCR微装置设计 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 微装置的控温原理及操作 |
| 4.2.1 温度控制方案 |
| 4.2.2 进样方法 |
| 4.3 微装置的搭建 |
| 4.3.1 片上式单一热源分区加热CF-PCR微装置 |
| 4.3.2 片外式单一热源CF-PCR微装置 |
| 4.3.3 基于帕尔贴效应的片外式CF-PCR微装置 |
| 4.4 材料与方法 |
| 4.4.1 实验设备、试剂与耗材与引物设计 |
| 4.4.2 实验样品准备 |
| 4.4.3 PCR反应实验与产物检测 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 片上式CF-PCR微装置病原体检测 |
| 4.5.2 基于PDMS传热的片外式CF-PCR微装置病原体检测 |
| 4.5.3 基于帕尔贴效应CF-PCR微装置温度控制及病原体检测 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置设计 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 微装置的方案选择 |
| 5.2.1 基于Chelex-100 法核酸预处理方法 |
| 5.2.2 产物检测微型电泳模块的搭建 |
| 5.2.3 片上式一体化PCR微装置 |
| 5.2.4 片外式一体化PCR微装置 |
| 5.3 材料与方法 |
| 5.3.1 实验设备 |
| 5.3.2 实验试剂与耗材 |
| 5.3.3 实验样品准备 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 Chelex-100 法预处理结果 |
| 5.4.2 片上式一体化PCR微装置病原体检测 |
| 5.4.3 片外式一体化PCR微装置病原体检测 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 论文工作总结 |
| 6.2 论文创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）MicroRNAs及循环外泌体的高灵敏度分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 miRNA的概述 |
| 2.1.1 miRNA的形成及调控机制 |
| 2.1.2 miRNA的生物学功能 |
| 2.1.3 miRNA的分析方法研究 |
| 2.1.4 miRNA的高通量测序技术 |
| 2.2 外泌体的概述 |
| 2.2.1 外泌体的生成过程和来源 |
| 2.2.2 外泌体的组成 |
| 2.2.3 外泌体的生物功能 |
| 2.2.4 外泌体的分离方法 |
| 2.2.5 外泌体的分析检测方法 |
| 2.3 磁性微球在生化分析中的应用 |
| 2.3.1 基于磁性微球的免疫检测 |
| 2.3.2 基于磁性微球的核酸分析 |
| 2.3.3 基于磁性微球的外泌体分离与分析 |
| 2.3.4 基于单个磁性微球的生化分析方法 |
| 2.4 本论文研究内容及创新性 |
| 3 基于编码探针在miRNA cDNA文库中的延伸反应的超灵敏多重miRNAs检测 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 实验原理 |
| 3.3.2 酶消化步骤验证 |
| 3.3.3 SBE反应模板的选择 |
| 3.3.4 传统建库方法用于多重miRNAs检测 |
| 3.3.5 多重miRNAs检测方法的特异性研究 |
| 3.3.6 多重miRNAs检测的灵敏度 |
| 3.3.7 实际生物样本中miRNA的多重检测 |
| 3.3.8 实际生物样品中的多重miRNAs分析的准确性研究 |
| 3.3.9 标准RT-PCR方法验证方法准确性 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 基于单个微球信号富集机制高灵敏度检测外泌体 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 实验原理 |
| 4.3.2 外泌体的表征 |
| 4.3.3 方法的可行性 |
| 4.3.4 FAM-Chol探针浓度的优化 |
| 4.3.5 FAM-Chol探针与外泌体反应时间的优化 |
| 4.3.6 SMFA体系定量检测外泌体 |
| 4.3.7 SMFA体系的通用性 |
| 4.3.8 SMFA体系的实际应用性 |
| 4.3.9 SMFA体系对外泌体检测的准确性 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 基于单微球结合末端脱氧核苷酸转移酶引发DNA扩增的肿瘤特异性外泌体蛋白的超灵敏分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 实验原理 |
| 5.3.2 外泌体的表征 |
| 5.3.3 SMTA分析的可行性研究 |
| 5.3.4 AuNPs-aptamer与Exo-EpCAM反应时间的优化 |
| 5.3.5 AuNPs-aptamer用量的优化 |
| 5.3.6 AuNPs-aptamer延伸时间的优化 |
| 5.3.7 SMTA体系定量检测Exo-EpCAM |
| 5.3.8 SMTA体系应用于实际样品的检测 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学研究成果 |
| 学位论文数据集 |
（5）基于核酸扩增原理的常见肉源性成分快速鉴定研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 立题背景 |
| 1.2 检测方法研究现状 |
| 1.2.1 感官分析 |
| 1.2.2 光谱分析 |
| 1.2.3 色谱和质谱分析 |
| 1.2.4 电泳分析 |
| 1.2.5 免疫分析 |
| 1.2.6 基于聚合酶链式反应的分析 |
| 1.2.7 基于等温扩增的分析 |
| 1.3 本论文的研究目的及意义 |
| 1.4 本论文的研究内容 |
| 第二章 基于功能化引物设计的PCR方法检测牛肉中的马肉成分 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 肉样品准备 |
| 2.3.2 肉样品DNA提取 |
| 2.3.3 PCR扩增及分析 |
| 2.3.4 方法可行性验证 |
| 2.3.5 扩增条件优化 |
| 2.3.6 不同循环数时方法的灵敏度 |
| 2.3.7 特异性验证 |
| 2.3.8 加工肉制品检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 实验原理 |
| 2.4.2 方法可行性验证 |
| 2.4.3 扩增条件优化 |
| 2.4.4 不同循环数时的灵敏度分析 |
| 2.4.5 特异性验证 |
| 2.4.6 加工肉制品检测 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 基于单链结合蛋白增强的荧光偏振策略检测牛肉中的鸡肉成分 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 肉样品准备及DNA提取 |
| 3.3.2 PCR扩增 |
| 3.3.3 荧光偏振分析 |
| 3.3.4 方法可行性验证 |
| 3.3.5 实验条件优化 |
| 3.3.6 灵敏度分析 |
| 3.3.7 特异性验证 |
| 3.3.8 实际样品检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 实验原理 |
| 3.4.2 方法可行性验证 |
| 3.4.3 实验条件优化 |
| 3.4.4 灵敏度分析 |
| 3.4.5 特异性验证 |
| 3.4.6 加工肉制品检测 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 基于环介导等温扩增的荧光偏振方法快速检测牛肉中的猪肉成分 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 肉样品准备及DNA提取 |
| 4.3.2 LAMP扩增及分析 |
| 4.3.3 q PCR扩增 |
| 4.3.4 FITC标记引物的选择 |
| 4.3.5 反应条件优化 |
| 4.3.6 灵敏度检测 |
| 4.3.7 特异性验证 |
| 4.3.8 重复性验证 |
| 4.3.9 实际样品检测 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 实验原理 |
| 4.4.2 FITC标记引物的选择 |
| 4.4.3 反应条件优化 |
| 4.4.4 灵敏度分析 |
| 4.4.5 特异性验证 |
| 4.4.6 重复性验证 |
| 4.4.7 实际样品检测 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 基于多重PCR的侧向层析试纸方法同时检测鸡肉、鸭肉和猪肉成分 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 金纳米粒子(AuNPs)的制备 |
| 5.3.2 金-探针偶联物(AuNP-RP)的制备 |
| 5.3.3 LFS的构建 |
| 5.3.4 肉样品准备及DNA提取 |
| 5.3.5 PCR扩增 |
| 5.3.6 LFS检测 |
| 5.3.7 qPCR扩增 |
| 5.3.8 NAT标记引物的验证 |
| 5.3.9 可行性验证 |
| 5.3.10 扩增条件优化 |
| 5.3.11 LFS参数优化 |
| 5.3.12 灵敏度分析 |
| 5.3.13 特异性验证 |
| 5.3.14 实际样品检测 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 实验原理 |
| 5.4.2 NAT标记引物的验证 |
| 5.4.3 方法可行性验证 |
| 5.4.4 扩增条件优化 |
| 5.4.5 LFS参数优化 |
| 5.4.6 灵敏度检测 |
| 5.4.7 特异性验证 |
| 5.4.8 实际样品检测 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 基于重组酶聚合酶扩增的侧向层析试纸方法同时检测鸭肉、鸡肉和猪肉成分 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 AuNPs的制备 |
| 6.3.2 AuNPs与FITC抗体偶联物(AuNP-Ab)的制备 |
| 6.3.3 LFS的制备 |
| 6.3.4 肉样品准备及DNA提取 |
| 6.3.5 mRPA扩增 |
| 6.3.6 LFS检测 |
| 6.3.7 qPCR扩增 |
| 6.3.8 引物浓度优化 |
| 6.3.9 方法可行性验证 |
| 6.3.10 单组分检测 |
| 6.3.11 相同趋势的多组分检测 |
| 6.3.12 不同趋势的多组分检测 |
| 6.3.13 特异性验证 |
| 6.3.14 稳定性检测 |
| 6.3.15 实际样品检测 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 实验原理 |
| 6.4.2 引物浓度优化 |
| 6.4.3 方法可行性验证 |
| 6.4.4 单组分检测 |
| 6.4.5 相同趋势的多组分检测 |
| 6.4.6 不同趋势的多组分检测 |
| 6.4.7 特异性验证 |
| 6.4.8 稳定性验证 |
| 6.4.9 实际样品检测 |
| 6.5 结论 |
| 第七章 基于表面增强拉曼的侧向层析试纸方法同时检测牛肉中的多种肉类成分 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料与仪器 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验仪器 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 AuNPs的制备 |
| 7.3.2 拉曼信标的制备 |
| 7.3.3 拉曼信标与探针的偶联 |
| 7.3.4 LFS的制备 |
| 7.3.5 肉样品准备及DNA提取 |
| 7.3.6 mRPA扩增 |
| 7.3.7 LFS检测 |
| 7.3.8 qPCR扩增 |
| 7.3.9 可行性验证 |
| 7.3.10 信号分子浓度优化 |
| 7.3.11 单组分检测 |
| 7.3.12 相同趋势的多组分检测 |
| 7.3.13 不同趋势的多组分检测 |
| 7.3.14 特异性验证 |
| 7.3.15 实际样品检测 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 实验原理 |
| 7.4.2 材料表征结果 |
| 7.4.3 信号分子浓度优化 |
| 7.4.4 可行性研究 |
| 7.4.5 单组分掺假样品的检测 |
| 7.4.6 多组分掺假样品的检测 |
| 7.4.7 特异性验证 |
| 7.4.8 实际样品检测 |
| 7.5 结论 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果清单 |
（6）基于Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的核酸检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 核酸检测应用简介 |
| 1.2 核酸扩增技术 |
| 1.2.1 聚合酶链式反应技术 |
| 1.2.2 等温扩增技术 |
| 1.2.3 小结 |
| 1.3 核酸杂交技术 |
| 1.4 高通量测序 |
| 1.5 可编程核酸酶技术 |
| 1.5.1 基于CRISPR/Cas9 的核酸检测方法 |
| 1.5.2 基于CRISPR/Cas13 的核酸检测方法 |
| 1.5.3 基于 CRISPR/Cas12 的核酸检测方法 |
| 1.5.4 基于 CRISPR/Cas14 的核酸检测方法 |
| 1.5.5 小结 |
| 1.6 原核Argonaute |
| 1.6.1 原核Argonaute简介 |
| 1.6.2 原核Argonaute的体外应用 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 1.7.1 研究目的 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第2章 Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的表达纯化及性质研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 寡核苷酸 |
| 2.2.4 本实验所用的培养基 |
| 2.2.5 主要缓冲液 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 重组PfAgo蛋白质表达载体的构建 |
| 2.3.2 大肠杆菌常规转化 |
| 2.3.3 重组PfAgo蛋白质的表达与纯化 |
| 2.3.4 考马斯亮蓝G250 法测定蛋白质浓度 |
| 2.3.5 SDS-PAGE电泳实验 |
| 2.3.6 TBE-PAGE电泳实验 |
| 2.3.7 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 2.3.8 PfAgo切割单链DNA的实验 |
| 2.3.9 不同长度的g DNA介导PfAgo切割单链DNA靶的实验 |
| 2.3.10 不同匹配区的g DNA介导PfAgo切割单链DNA靶的实验 |
| 2.3.11 PfAgo单碱基专一性探究的实验 |
| 2.3.12 验证PfAgo切割产生的ss DNA也能介导PfAgo酶切的实验 |
| 2.4 实验结果和分析 |
| 2.4.1 PfAgo基因的优化与合成 |
| 2.4.2 PfAgo的表达与纯化 |
| 2.4.3 PfAgo切割活性验证 |
| 2.4.4 g DNA与靶 DNA 的互补区域对PfAgo切割靶 DNA 的影响 |
| 2.4.5 g DNA与靶DNA的单碱基不匹配对PfAgo切割效率的影响 |
| 2.4.6 PfAgo切割信号传递活性验证实验 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 基于PfAgo的核酸检测方法 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 双链DNA |
| 3.2.4 寡核苷酸 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 待检测模拟靶DNA的制备 |
| 3.3.2 TBE-PAGE电泳实验 |
| 3.3.3 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 3.3.4 PfAgo切割单链DNA的实验 |
| 3.3.5 DNA扩增反应 |
| 3.3.6 PfAgo介导的核酸检测(PAND)实验 |
| 3.3.7 反应产物的荧光值测定实验 |
| 3.3.8 HEK293T细胞的培养和基因组DNA提取 |
| 3.3.9 PfAgo介导的核酸检测(PAND)的灵敏度验证实验 |
| 3.3.10 数据统计分析 |
| 3.3.11 临床样品来源 |
| 3.4 实验结果和分析 |
| 3.4.1 探究不同商品化的PCR Mix体系对PfAgo切割靶DNA的影响 |
| 3.4.2 PfAgo介导的核酸检测方法的原理验证 |
| 3.4.3 输入gDNAs与PfAgo的摩尔比对 PAND 的影响 |
| 3.4.4 gn的序列对PfAgo介导的核酸检测的影响 |
| 3.4.5 PfAgo介导的核酸检测的灵敏度探究 |
| 3.4.6 PfAgo介导的核酸检测的专一性探究 |
| 3.4.7 PfAgo介导的核酸检测的应用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 PfAgo介导的新型冠状病毒核酸检测 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 主要缓冲液 |
| 4.2.3 寡核苷酸 |
| 4.2.4 TBE-PAGE电泳实验 |
| 4.2.5 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 4.2.6 最佳输入gDNA的筛选 |
| 4.2.7 构建模拟靶质粒 |
| 4.2.8 筛选检测D614G突变的gDNAs |
| 4.2.9 SARS-CoV-2 PAND检测方法的构建 |
| 4.2.10 RT-qPCR实验 |
| 4.2.11 验证SARS-CoV-2 PAND的检测下限 |
| 4.2.12 临床样品来源 |
| 4.3 实验结果和分析 |
| 4.3.1 输入g DNA的优化和SARS-CoV-2 PAND的建立 |
| 4.3.2 SARS-CoV-2 PAND的优化 |
| 4.3.3 探究SARS-CoV-2 PAND的检测灵敏度 |
| 4.3.4 SARS-CoV-2 PAND对实际样本的检测 |
| 4.3.5 SARS-CoV-2 D614G突变体的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结合极短PCR和 PfAgo的核酸检测技术 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 主要试剂和仪器 |
| 5.2.2 主要缓冲液 |
| 5.2.3 TBE-PAGE电泳实验 |
| 5.2.4 寡核苷酸 |
| 5.2.5 构建含有VP72 基因和HPV16E6 基因的质粒 |
| 5.2.6 USPCRP核酸检测方法的初步验证实验 |
| 5.2.7 USPCRP核酸检测条件的优化 |
| 5.2.8 USPCRP检测灵敏度探究的实验 |
| 5.2.9 USPCRP检测特异性验证实验 |
| 5.2.10 USPCRP检测RNA的实验 |
| 5.2.11 USPCRP临床样品检测实验 |
| 5.3 实验结果和分析 |
| 5.3.1 USPCRP核酸检测方法的初步验证 |
| 5.3.2 USPCRP核酸检测条件的优化 |
| 5.3.3 USPCRP检测灵敏度探究 |
| 5.3.4 USPCRP检测特异性验证 |
| 5.3.5 USPCRP检测模拟的DNA病毒基因 |
| 5.3.6 USPCRP检测临床样品 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 总结和展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）多重PCR技术在快速检测中的应用（论文提纲范文）
| 1 多重PCR原理 |
| 2 多重PCR技术在快速检测中的应用 |
| 2.1 在病毒检测中的应用 |
| 2.2 在细菌检测中的应用 |
| 2.3 在血清学检测中的应用 |
| 3 多重PCR在快速检测中的优势 |
| 4 结论与展望 |
（8）基于DNA计算的可满足性问题的模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 绪论 |
| 1.1 DNA计算的研究现状及意义 |
| 1.2 DNA计算中频繁出现的技术手段 |
| 1.2.1 DNA链置换 |
| 1.2.2 杂交链式反应 |
| 1.2.3 DNA折纸术 |
| 1.2.4 连接酶链式反应 |
| 1.2.5 凝胶电泳技术 |
| 1.2.6 聚合酶链式反应 |
| 1.2.7 DNA链的内切与外切 |
| 1.3 本文的主要研究内容 |
| 2 可满足性问题 |
| 2.1 可满足性问题的基本概念 |
| 2.2 可满足性问题应用的领域 |
| 2.3 可满足性问题的研究成果 |
| 3 基于DNA计算的可满足性问题模型 |
| 3.1 基于可满足性问题算法的实验步骤 |
| 3.2 基于DNA链置换的可满足性问题计算模型 |
| 3.2.1 模拟生物步骤 |
| 3.2.2 实例分析 |
| 3.2.3 小结 |
| 4 基于DNA折纸术的动态DNA折纸计算模型 |
| 4.1 可满足性问题的基本算法 |
| 4.2 基于DNA折纸术的动态DNA折纸计算模型 |
| 4.2.1 实例分析 |
| 4.2.2 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者读研期间主要研究成果 |
（9）基于免酶等温信号放大技术的诺如病毒核酸检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 等温信号放大技术 |
| 1.1.1 酶辅等温信号放大技术 |
| 1.1.2 免酶等温信号放大技术 |
| 1.2 DNA银纳米簇及其应用 |
| 1.3 诺如病毒概述及检测方法研究 |
| 1.3.1 诺如病毒生物学特性 |
| 1.3.2 诺如病毒检测方法 |
| 1.4 立题背景和意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA储备液配制 |
| 2.2.2 翘板门反应 |
| 2.2.3 链霉亲和素免疫磁珠的活化和定量 |
| 2.2.4 链霉亲和素免疫磁珠上的CHA反应 |
| 2.2.5 银簇的合成 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.7 血清样品制备 |
| 2.2.8 荧光测定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 基于翘板门循环的等温信号放大技术检测方法 |
| 3.1.1 翘板门方法的原理 |
| 3.1.2 翘板门方案可行性分析 |
| 3.1.3 实验条件的选择 |
| 3.1.4 翘板门方法的检测范围及线性 |
| 3.1.5 翘板门方法的选择性 |
| 3.1.6 翘板门方法的回收率 |
| 3.2 基于磁球分离和CHA技术的免标记检测方法 |
| 3.2.1 基于磁球分离和CHA技术的免标记检测方法的原理 |
| 3.2.2 基于磁球分离和CHA技术的免标记检测方法的可行性分析 |
| 3.2.3 实验条件的选择 |
| 3.2.4 基于磁球分离和CHA技术的免标记检测方法的检测范围及线性 |
| 3.2.5 基于磁球分离和CHA技术的免标记检测方法的选择性 |
| 3.2.6 基于磁球分离和CHA技术的免标记检测方法的回收率 |
| 3.3 亲和素-生物素体系对银簇淬灭现象的验证和影响条件研究 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读硕士研究生学位期间发表的论文及成果 |
（10）基于信号放大的电化学传感器构建及在黄体酮检测中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 .黄体酮简介 |
| 1.2 .电化学生物传感器 |
| 1.2.1 .电化学生物传感器原理 |
| 1.2.2 .电化学生物传感器的分类 |
| 1.3 .传感器信号放大技术 |
| 1.3.1 .基于纳米材料的信号放大策略 |
| 1.3.2 .酶催化放大策略 |
| 1.3.3 .目标物循环放大策略 |
| 1.3.4 .DNA等温扩增放大策略 |
| 1.4 .本论文的选题思路及主要工作 |
| 第二章 基于杂交链式反应放大技术黄体酮适配体传感器的构建 |
| 2.1 .前言 |
| 2.2 .实验部分 |
| 2.2.1 .实验试剂 |
| 2.2.2 .实验仪器 |
| 2.2.3 .修饰电极的制备 |
| 2.2.4 .黄体酮的检测 |
| 2.2.5 .聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3 .结果与讨论 |
| 2.3.1 .适配体传感器组建过程表征 |
| 2.3.2 .不同修饰电极的电化学行为研究 |
| 2.3.3 .实验条件优化 |
| 2.3.4 .传感器的检测性能 |
| 2.3.5 .传感器的选择性、重现性评估 |
| 2.3.6 .实际样品的分析 |
| 2.4 .本章小结 |
| 第三章 基于亚甲蓝-DNA串联体作为信号放大的电化学传感器探索及对黄体酮的检测 |
| 3.1 .前言 |
| 3.2 .实验部分 |
| 3.2.1 .实验试剂 |
| 3.2.2 .实验仪器 |
| 3.2.3 .电极表面修饰金纳米颗粒的制备 |
| 3.2.4 .电化学适配体传感器的制备 |
| 3.2.5 .目标黄体酮的检测 |
| 3.3 .结果与讨论 |
| 3.3.1 .传感器组装表征 |
| 3.3.2 .传感器的信号放大性能对比 |
| 3.3.3 .实验条件优化 |
| 3.3.4 .传感器的的性能评估 |
| 3.3.5 .传感器的特异性、重现性分析 |
| 3.3.6 .传感器的实际应用 |
| 3.4 .本章小结 |
| 第四章 基于信号放大的均相电化学传感器构建及在黄体酮检测中的应用 |
| 4.1 .前言 |
| 4.2 .实验部分 |
| 4.2.1 .实验试剂 |
| 4.2.2 .实验仪器 |
| 4.2.3 .Ω-DNA纳米结构的制备 |
| 4.2.4 .Exo III辅助的黄体酮检测 |
| 4.2.5 .聚丙烯酰胺凝胶电泳实验 |
| 4.3 .结果与讨论 |
| 4.3.1 .电化学传感器的可行性探究 |
| 4.3.2 .传感器的放大性能对比 |
| 4.3.3 .实验条件优化 |
| 4.3.4 .传感器的检测性能 |
| 4.3.5 .传感器的特异性、重现性分析 |
| 4.3.6 .传感器的实际应用 |
| 4.4 .本章小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录2 攻读硕士学位期间申请的专利 |
| 附录3 攻读硕士学位期间参加的科研项目 |
四、多重聚合酶链式反应技术及其应用（论文参考文献）
- [1]CRISPR/Cas12a系统在新冠病毒和金黄色葡萄球菌即时检测中的应用[D]. 钱佳婕. 浙江大学, 2021(02)
- [2]农产品病原体的核酸快速扩增和荧光检测系统研究[D]. 吴翠. 浙江大学, 2021(01)
- [3]核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置的研究及应用[D]. 吴迪. 中国科学院大学(中国科学院长春光学精密机械与物理研究所), 2021(08)
- [4]MicroRNAs及循环外泌体的高灵敏度分析[D]. 王芳芳. 北京科技大学, 2021(08)
- [5]基于核酸扩增原理的常见肉源性成分快速鉴定研究[D]. 秦盼柱. 合肥工业大学, 2021(02)
- [6]基于Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的核酸检测方法研究[D]. 何如怡. 湖北大学, 2021(01)
- [7]多重PCR技术在快速检测中的应用[J]. 官昭瑛,李慧敏,何曼文,余展旺. 山东化工, 2021(03)
- [8]基于DNA计算的可满足性问题的模型研究[D]. 陈哲. 安徽理工大学, 2020(04)
- [9]基于免酶等温信号放大技术的诺如病毒核酸检测方法研究[D]. 张文雅. 江南大学, 2020(01)
- [10]基于信号放大的电化学传感器构建及在黄体酮检测中的应用[D]. 石维平. 贵州大学, 2020(02)
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