一、鸭瘟病毒及其核酸的电镜观察（论文文献综述）
贺东生,赵善昌,苏丹萍[1]（1998）在《鸭瘟病毒及其核酸的电镜观察》文中研究说明对鸭瘟病毒及共核酸进行了电镜观察。纯化病毒经核酸酶降解杂核酸后，加入８５ｍｏｌ／Ｌ的尿素释放病毒核酸，经水相法展开后用碳膜铜网点样，再经染色和真空喷镀，于电镜下观察。鸭温病毒呈典型的疱疹病毒形状，其核酸分子量估算约为９１１×１０６道尔顿。
文明[2]（2005）在《DEV基因文库构建、核衣壳蛋白基因的发现及克隆与表达》文中提出鸭病毒性肠炎（Duck virus enteritis,DVE）,俗称鸭瘟（Duck plague,DP）是鸭、鹅和大雁等雁形目水禽的一种急性接触性传染病。感染后,患鸭主要表现为急性败血性过程,其特征是血管损伤、体腔出血、消化道出血（或炎症、坏死）、淋巴器官受损及实质器官退行性变化等,具有较高的发病率和死亡率,是目前水禽养殖业的重要传染病之一。本病病原为鸭病毒性肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）,俗称鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）,亦称鸭疱疹病毒1型（Anatid herpesvirus 1,AHV-1）,系疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科成员之一,是一种泛嗜性全身性感染的病毒。本研究以DEV CHv株为基本材料,对该毒株进行了提纯研究和基因组酶切分析;构建了DEV基因文库,经比对发现并克隆、鉴定了其核衣壳蛋白基因;利用该基因片段设计引物,建立了基于DEV核衣壳蛋白基因的一种PCR检测方法;同时将该基因克隆到原核表达载体pET32a中,对其进行了表达及其表达产物抗原性的研究。主要内容包括: 1.比较了四种方法对DEV Chv株的提纯效果,并对病毒结构蛋白进行了初步分析:将DEV CHv株经鸭胚和鸭胚成纤维细胞（DEF）进行培养增殖后,收集病毒液,采用沉淀法、层析法、差速离心法和蔗糖密度梯度离心法等4种方法对DEV进行了提纯比较,结果表明:通过DEF增殖、经不连续蔗糖密度梯度法提纯DEV,效果较好,电镜下能观察到纯净、多量的完整病毒粒子;病毒粒子由囊膜、衣壳和核芯等三个部分组成,直径为170nm～190nm;在囊膜与衣壳之间还存在一层较厚的皮层结构。用Bradford法测得纯化病毒液中的病毒含量为0.71mg/mL;经SDS—PAGE电泳发现,DEV结构蛋白主要由11种多肽组成,即VP1（190kD）、VP2（136kD）、VP3（106kD）、VP4（88kD）、VP5（75kD）、VP6（68kD）、VP7（56kD）、VP8（48kD）、VP9（42kD）、VP10（38kD）
郭宇飞[3]（2005）在《鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株部分生物学特性的研究及荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用》文中研究指明本论文对鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株（DEV-CHv）部分生物学特性及荧光实时定量PCR对其检测方法的建立和应用进行了研究,主要内容可归纳如下: 1.对DEV-CHv进行了适应在DEF上生长的研究。10日龄鸭胚经胰酶消化和机械分散后,其成纤维细胞在含10%小牛血清的MEM营养液中生长36h左右后成为致密的细胞单层。DEV-CHv人工感染成年健康鸭后,取病死鸭肝脏组织接种绒毛尿囊腔经10日龄鸭胚连续传代2次,然后取病毒致死鸭胚绒毛尿囊液接种DEF的方法可以使DEV-CHv开始适应在DEF上生长;而病死鸭肝脏组织中的DEV-CHv直接接种在DEF上不能生长。刚刚适应了在DEF上生长的DEV-CHv以细胞变圆,细胞折光度增强,细胞间隙有颗粒状缺失出现为主要病变特征;DEV-CHv经过连续传代6次适应了在DEF上生长以后,细胞病变以成纤维细胞的脱落和形成圆形蚀斑为主要病变特征。DEV-CHv接种DEF后通常30h左右出现细胞脱落,36h左右在细胞单层上形成明显的蚀斑,到48h时细胞病变可达80%以上。通过对飞片的染色镜检可以发现,DEV-CHv可在DEF中形成嗜酸性核内包涵体,可使DEF发生细胞融合而产生含有10多个细胞核的合胞体。 2.通过超薄切片和透射电子显微镜技术对DEV-CHv在DEF中的形态学和形态发生学进行了研究。其中形态学方面的研究结果表明:DEV-CHv病毒核酸呈圆形颗粒状,直径35nm—45nm,在胞核内常集中分布;病毒核衣壳呈圆形,直径90nm—100nm,在胞核和胞浆内都有分布;病毒核衣壳根据所含核酸形态的差异可分为空心核衣壳、内壁附有颗粒型核衣壳、同心圆形核衣壳和实心核衣壳,其中的内壁附有颗粒型核衣壳又可分为三角星形、四角星形、五角星形、六角星形核衣壳等多种类型;DEV-CHv成熟病毒粒子具有囊膜和皮层结构,呈圆形,直径150nm—300nm,常见位于胞浆空泡内;DEV-CHv在DEF中可形成胞浆内包涵体和胞核内包涵体结构;伴随子代病毒在细胞中的出现,胞浆内还出现了豆荚状、马
袁桂萍[4]（2007）在《鸭瘟强毒在实验感染鸭体内的致病与复制特征及dUTPase基因发现和初步鉴定》文中提出鸭瘟病毒（Duck plague virus，DPV）属于α-疱疹病毒，是一种泛嗜性全身性感染的病毒，可引起鸭、鹅、雁及其它雁形目禽类的一种急性、接触性、败血性传染病，是目前对养鸭业的一大危害。电子显微学技术是研究病毒形态结构、鉴定新病毒、阐明病毒的发育循环、研究感染宿主病理学的一个重要方法，它在病毒学研究中具有不可替代的作用。相对其它α-疱疹病毒而言，DPV研究的总体水平较低。本文通过人工感染DPV强毒复制鸭瘟（Duck Plague，DP）急性病例，对病毒的形态结构和病毒形态发生学以及病毒在体内的分布情况进行研究，同时观察病毒引起宿主细胞的超微结构变化和诱导宿主细胞凋亡情况，以期系统地了解DPV的入侵方式和复制机理，为阐明鸭瘟的发病机制提供关键的实验数据。dUTP焦磷酸酶是DNA合成中的一种重要的酶，病毒dUTPase在病毒DNA的合成及病毒的复制增殖起重要作用。疱疹病毒dUTPase常与病毒的毒力有关，尤其是与病毒的神经毒力和神经侵袭力以及病毒从潜伏感染状态活化的能力相关。本文在DPV基因文库的大量测序结果中发现一个1344bp的完整dUTPase基因，开展了该基因在DPV基因组的酶切图谱定位研究，并建立基于该基因的区分DPV强毒和弱毒的PCR方法。结果如下：1．鸭瘟强毒致实验感染鸭细胞超微结构变化用DPV CHv强毒株感染成年鸭复制鸭瘟急性病例，分别于接种后不同时间，取心、肝、肾、脾、胸腺、十二指肠、法氏囊、脑和胰组织，制作超薄切片。电镜观察结果表明：DPV感染宿主后，超微结构变化最早发生于肝和肾，而鸭死亡后以免疫器官和消化器官损伤最严重。各种细胞的变化主要为肿胀坏死，表现为细胞肿胀，染色质或浓缩、碎裂或溶解，线粒体肿胀，嵴断裂、溶解至呈空泡样结构，其它细胞器破坏；脾、胸腺、法氏囊以及小肠固有层中的淋巴细胞在感染24h后在出现细胞坏死的同时还出现较为明显的细胞凋亡变化。而鸭死亡后淋巴细胞主要表现为黑洞核样变化，整个细胞凝聚深染，染色质固缩，细胞浆均质深染，细胞膜模糊或不完整。2．鸭瘟强毒在实验感染宿主细胞内的形态发生学电镜观察病毒在宿主体内的分布和形态发生学结果表明：感染后12h在脾脏和法氏囊首先观察到少量的子代DPV出现，24h后在脾、胸腺和法氏囊以及死亡鸭的肝、肠中均观察到具有典型的疱疹病毒粒子及其核衣壳形态的DPV，而在胰腺和大脑组织中也观察到少量的病毒颗粒。DPV病毒核衣壳有空心型、致密核心型、双环型、拟核型和内壁附有颗粒型等多种形态。病毒核内核衣壳通过内外核膜进入胞浆，核内和胞浆内的核衣壳在细胞浆中获得皮层，然后在各种质膜上获得囊膜，最后成熟病毒通过细胞破裂或其他方式释放到细胞外。伴随着病毒的复制、装配和成熟，细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密颗粒、核内微管和中空短管等病毒相关结构。3．鸭瘟强毒致感染鸭淋巴细胞凋亡利用电镜技术观察DPV人工感染宿主细胞超微结构变化时，我们发现了典型的细胞凋亡现象：感染鸭脾、胸腺、法氏囊以及小肠固有层中的淋巴细胞在感染24h后在出现细胞坏死的同时还出现较为明显的细胞凋亡变化。疾病发生过程中，淋巴细胞凋亡数量明显增多。凋亡细胞的形态学变化表现为细胞体积缩小，细胞器结构正常，染色质初期浓集成团，聚集于核膜的周边，随后出现染色质凝聚，核碎裂，细胞膜上出现空泡，带有单位膜结构的凋亡小体形成，凋亡细胞和凋亡小体随即被临近细胞或巨噬细胞吞噬消化。没有被吞噬的凋亡细胞细胞膜逐渐皱缩、溶解。进一步用琼脂糖凝胶电泳（DNAladder）和原位末端标记（TUNEL）方法对DPV致宿主淋巴细胞的凋亡情况进行了检测，感染鸭的胸腺、法氏囊、脾脏出现典型的180-200bp的梯状条带（ladder），TUNEL染色也在这些组织切片中观察到了棕色的阳性细胞。研究结果表明，DPV感染造成宿主淋巴细胞的坏死和凋亡共同导致淋巴细胞的大量损耗，而淋巴细胞的这种变化可能在鸭瘟的发病机制中起着重要的作用。4．鸭瘟病毒dUTPase基因的发现及分子特征分析选取本实验室构建的DPV DNA基因文库中的一个重组质粒并测序后用NCBI的BLASTN和ORF Finder工具初步分析发现一个全长为1344bp完整ORF片段。通过NCBI的BLASTP分析，初步确定为dUTPase基因（在GenBank注册的登录号为DQ486149）。运用CLUSTALX、DNAstar、SignalP、TMHMM、NetPhos2.0和ESyPred3D等工具对该ORF1344编码蛋白进行了全面的生物信息学分析。结果显示，该基因编码一个447个氨基酸的多肽，没有信号肽切割位点，其分子量理论值约为49.7KD。通过CLUSTALX与Genbank中的dUTPase的氨基酸序列进行比较并构建系统进化树，结果表明：该基因编码的肽链与疱疹病毒的dUTPase有较高的同源性。通过进化树分析表明该肽链与α-疱疹病毒（禽疱疹病毒、马疱疹病毒、牛疱疹病毒和伪狂犬病毒等）编码的dUTPase在遗传上一致。ORF1344编码肽链具有dUTPase蛋白质家族保守区域，抗原性分析表明该肽链上存在多个抗原表位。该蛋白质为一种膜外蛋白，没有跨膜区存在。该蛋白有23个潜在的磷酸化位点，有3个潜在的N-糖基化位点，二级结构中存在5段主要的疏水区域。空间结构分析表明DPV dUTPase肽链中的两个区域的空间结构与Ⅰ型dUTPase的空间结构一致。蛋白质定位分析表明该蛋白主要定位于胞质和胞核中。本研究在国内外首次发现了鸭瘟病毒的dUTPase基因，为DPVdUTPase基因的克隆和后续的DPV分子生物学研究提供了基础数据。5．鸭瘟dUTPase基因克隆和在基因组中的定位研究根据测序和分析结果，设计一对引物DU1／DU2（扩增幅度为1344bp，含完整的DPV dUTPase基因）对DPV基因组DNA进行扩增并克隆到pGEM-T载体上，测序结果表明克隆片断的序列与预期一致。将DPVCHv株经鸭胚成纤维细胞进行培养增殖后，收集病毒液，病毒经初步提纯后提取DNA。采用HindⅢ和SacⅠ限制性内切酶对DPV CHv株基因组进行酶切消化，用标记有生物素的引物进行PCR扩增并获得的dUTPase基因探针，将dUTPase探针与DPV基因酶切条带杂交以进行dUTPase基因在酶切图谱上的定位分析，试验结果证实该基因存在于DPVCHv株基因组HindⅢ酶切的Ⅰ片段上和SacⅠ酶切的M片段上。6．基于dUTPase基因强弱毒PCR方法的建立和应用利用DPV dUTPase引物DU1／DU2，建立基于DPV dUTPase基因的PCR方法。对正常DEF细胞、尿囊液，DPVCHa弱毒株进行扩增，只能在DPV强毒株中能扩增特异性条带，而其它病原体（鸭病毒性肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒、鸭沙门氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、小鹅瘟病毒、马立克病毒和鸡传染性喉气管炎病毒）的核酸提取物不能扩增出任何条带。该对引物的灵敏度可达到10pg。应用该PCR方法对15份DPV感染病料进行PCR检测，均能扩增出与预期大小一致的特异性条带。结果表明该方法可应用于临床鸭瘟的诊断与检测和DPV强毒株和疫苗株的PCR鉴别诊断。
陈淑红[5]（2006）在《鸭肠炎病毒部分基因组序列的克隆与分析》文中认为鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）,又名鸭瘟（Duck plague, DP）,是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）引起的鸭、鹅及多种雁形目动物的一种急性、热性、败血性传染病。DEV系疱疹病毒科成员之一,其分子生物学方面的研究十分有限,相对落后于其它疱疹病毒,其基因组结构和物理图谱尚属未知。目前已知DEV TK、UL24和gH基因ORF,对于UL6、UL7和UL30基因仅已知部分核苷酸序列,其基因组90%以上属于未知,与此相关的基础研究,如病毒的基因功能以及病毒在机体细胞和组织中的复制机理、病毒感染过程以及机体抗病毒感染机制等多方面研究均有许多不明之处。同时,与此相关的预防、控制等措施以及基于基因组序列的基因工程疫苗的研究应受到重视。本实验研究主要以蚀斑纯化株DEV Clone-03的基因组未知序列为主要对象,以分子生物学技术为主要手段,提供病毒基因分子特性,为后续研究奠定基础。首先进行DEV的蚀斑纯化、增殖以及PCR检测;然后使用靶基因步行PCR（targeted gene walking PCR）方法扩增DEV基因组未知序列;之后进行病毒基因的ORF预测和序列分析;最后进行UL6基因的原核表达及融合蛋白兔体高免血清的制备。用CEF单层细胞对DEV疫苗株进行蚀斑纯化,将蚀斑纯化毒命名为DEV克隆疫苗（DEV Clone-03）株,将此毒通过绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚。根据GenBank发表的DEV LA（Lake Andes）株UL6基因部分核苷酸序列（登录号:AF043730）设计引物P1和P2;根据GenBank发表的DEV疫苗（DP-VAC）株UL30区域核苷酸序列（登录号:AF064639）设计引物P11和P12,用这两对引物对DEV Clone-03进行PCR检测。用P1和P2引物检测DEV Clone-03在鸡胚体内的分布,结果表明:接毒死亡鸡胚的尿囊膜、心、肝、脾、肺、肾和肌肉皮肤内均存在病毒;PCR敏感试验表明此方法可以检测到100μl尿囊液中提取的10-3稀释的病毒DNA。收取接毒死亡鸡胚尿囊液,磷钨酸负染电镜观察,可以见到典型的疱疹病毒粒子。Targeted gene walking PCR方法是以一段已知序列为出发点,采用特异性引物与非特异性引物相结合的方法扩增已知序列周围的未知序列部分,从而使已知序列不断延伸。本实验以DEV Clone-03基因组DNA为模板,用此方法扩增DEV Clone-03基因组未知序列,结果表明targeted gene walking PCR方法扩增DNA病毒基因组未知序列切实可行。选取两段核苷酸序列作为扩增起始点,其中一段是UL6区域的由引物P1和P2扩增的516 bp核苷酸序列（A）,另一段是UL30区域的由引物P11和P12扩增的234 bp核苷酸序列（B）。以A为起点扩增得到9 732 bp片段,从中预测到7个基因ORF,它们编码的多肽分别与单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus 1,HSV-1）的UL1、UL2、UL3、UL4、UL5、UL6和UL7蛋白具有同源性,将这7个基因分别命名为DEV Clone-03的UL1、UL2、UL3、UL4、UL5、UL6和UL7 HSV-1同源基因,各基因ORF大小依次为711 bp、474 bp、720 bp、714 bp、2 568 bp、2 373 bp和966 bp,编码氨基酸数量依次为236、157、239、237、855、790和321。以B为起点扩增得到17 841 bp的片段,从中预测到7个基因ORF,它们编码的多肽分别与HSV-1的UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29和UL30蛋白具有同源性,将这7个基因分
许媛媛[6]（2010）在《鸭瘟的动态病理学研究和鸭CD4的克隆》文中进行了进一步梳理鸭瘟（Duck plague, DP）又名鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）,是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性败血性、接触性传染病,其发病率和死亡率都非常高,给全世界养鸭业带来了巨大的经济损失。本试验将108羽35日龄樱桃谷鸭随机分为两组：对照组36羽,试验组72羽,分别隔离饲养,试验组每羽腿部肌肉注射0.1mL病毒液,复制鸭瘟病理模型。对所建立的病理模型进行临床症状观察、病理组织学检查、超微结构变化观察,同时对11项血清生理生化指标ALT、AST、ALT/AST、LD、AMY、ALB、GLB、TP、A/G、ALP、CK及皮质醇（Cor）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）两项细胞因子等方法对所建立的病理模型进行动态变化。本研究同时克隆出樱桃谷鸭和麻鸭CD4 ORF基因序列,并对其进行分析,为进一步研究CD4+T淋巴细胞在阐明禽类疫病的免疫机理奠定基础。人工感染鸭瘟病毒的试验鸭临床症状表现为：感染后4d病鸭食欲减退,发生顽固性下痢,粪便呈绿色或灰白色,泄殖腔红肿,肛门外翻,病鸭眼角流出澄清透明的浆液性分泌物,眼周围呈现“泪斑”,鼻腔流出稀薄或黏稠的分泌物,呼吸困难,并开始出现死亡；感染5d后有的鸭头颈肿大,死亡率为48.6%。对人工感染鸭瘟病毒的试验鸭外周血生理生化指标的测定结果表明,病毒感染对外周血各项指标都有一定的影响,在感染后,感染组鸭血清中ALT、AST、LD、AMY的含量始终明显高于对照组；感染组鸭血清中ALT/AST、ALB、GLB、TP、A/G含量始终低于对照组；ALP、CK含量感染组较对照组比较先升高后下降；而TNF-α和Cor无明显差异。感染组鸭的组织学检查结果为：肝脏在感染初期肝细胞发生水泡变性、脂肪变性,感染后3d组织出现坏死,后期坏死进一步加剧；感染后黏膜上皮变薄甚至消失,随着病情的发展,组织发生充血、出血、坏死；肠道感染后2d肌层出现淋巴滤泡,5d时淋巴滤泡细胞数量减少,并在出现淋巴滤泡的地方发生出血、坏死；肾脏在感染后肾小管上皮细胞发生坏死,有的上皮细胞从基底膜脱落到管腔中,感染后期组织充血、出血,并伴有炎性细胞浸润；胰腺在感染后4d组织发生坏死,且随着病情的发展,坏死面积逐渐增大；动物感染后心肌的变化不十分明显,在感染后3d出现了少量的出血现象,并在感染后4d发生心内膜出血；脾脏、胸腺、法氏囊均在感染后出现淋巴细胞数量减少的现象,同时在感染后期,组织发生坏死。脾脏、胸腺超微结构观察结果：感染1d后,在感染鸭脾脏中观察到吞噬了异物的巨噬细胞,感染后2d内质网有的发生扩张,后期发现多个坏死的细胞,并在感染5d时观察到吞噬了坏死细胞的巨噬细胞；感染1d后,即在感染鸭胸腺胞质内发现病毒颗粒,感染后3d观察到异嗜性粒细胞正在伸出伪足吞噬坏死细胞残留的碎片,后期坏死细胞增多,并在细胞内、外均发现了病毒颗粒的存在。根据GeneBank中收录的北京鸭CD4基因序列（AF378701）设计合成一对特异性引物,分别对樱桃谷鸭和麻鸭CD4 ORF基因进行扩增,并测定其基因序列,将其登陆到GeneBank,登录号分别为FJ527911,FJ527912。应用BLAST和DNASTAR等生物学软件对三种鸭CD4基因序列进行比对,分析表明：樱桃谷鸭、麻鸭、北京鸭间CD4基因ORF序列之间的同源性均为99%。
贾仁勇[7]（2008）在《鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳特性和UL24基因的发现、原核表达及应用研究》文中研究说明鸭瘟（Duck Plague,DP）又称鸭病毒性肠炎（Duck Viral Enteritis,DVE）,是由鸭瘟病毒（Duck Plague Virus,DPV）引起的常见于鸭、鹅等雁行目禽类的一种急性败血性的接触性传染病,具有较高的发病率和死亡率,是目前水禽养殖业的重要传染病之一。本文通过超速离心获得高纯度的鸭瘟病毒粒子免疫动物制备高免血清,特异与二维电泳分离的病毒蛋白质组印迹而获得单一病毒蛋白,辅以高效液相色谱——四极杆串联电喷雾质谱解析多肽氨基酸序列,以此设计兼并引物扩增鸭瘟病毒基因组,扩增片段进一步杂交验证、分析为鸭瘟病毒UL24（DPV-UL24）基因。通过构建DPV-UL24原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化和免疫荧光检测人工感染DPV后UL24基因在体内的表达时相与蛋白定位分析、表达蛋白捕获DPV抗体和表达蛋白抗体捕获抗原ELISA方法的研究以及建立了基于DPV-UL24基因检测DPV的PCR方法,结果如下:1.鸭瘟病毒超微结构研究结果表明:病毒粒子具有疱疹病毒典型形态结构,剖面六角外观轮廓清楚,成熟病毒粒子直径约150～266nm,病毒囊膜、核衣壳和核心清晰可见;囊膜外层较内层着色略深,且可见尚未形成完整囊膜的柄状拖尾结构;多数病毒粒子以单核衣壳为主,一定数量的病毒粒子具有双核衣壳,偶见三核衣壳,核衣壳直径为100～150nm,呈现致密圆形、半圆形或马蹄形等类型;在核衣壳外和囊膜之间可见明显的亮晕;核心DNA电子染色较深,集中分布,直径40～65nm。并且以纯净的病毒粒子免疫成年鸭获得了抗鸭瘟病毒高免血清。2.鸭瘟病毒蛋白质组研究显示:样品经丙酮处理、30mMDTT水化浓度、pH5-8 IPG固相胶条、混合两性载体电解质、0.8mg的上样量,蛋白分离效果好,获1253个银染蛋白点或388个考染蛋白点,不同时期2-DE分离胶蛋白点匹配率达88%,建立鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳模型重复性好、稳定、可靠。以此进行蛋白免疫印迹,结果表明至少可以检测到32种免疫印迹蛋白多肽点,其中有5种非特异性蛋白多肽,在27种DPV蛋白多肽中,相对分子量主要集中在20KD～120KD之间,等电点主要位于pH5.30—pH7.50范围。对选择两个病毒蛋白点高效液相色谱——四极杆串联电喷雾质谱鉴定、解析多肽序列,与病毒蛋白库比对获得了七段可信氨基酸肽段序列。3.鸭瘟病毒UL24基因的发现、原核表达、产物纯化及其抗体制备:以鸭瘟病毒基因组为模板,氨基酸肽段设计的兼并引物能够扩增出两条（420bp、730bp）片段,其中730bp片段能够与不同限制性内切酶酶切DPV基因组电泳片段杂交,形成大小不等杂交条带,从而验证了该片段为鸭瘟病毒基因组片段;生物信息学分析,该片段与疱疹病毒基因序列同源性最高,表明了扩增基因片段为鸭瘟病毒UL24基因;进一步研究还表明该基因全序列为具有1230bp开放阅读框核酸序列,与26株同属疱疹病毒氨基酸序列具有较高的相似性,与MDV-1亲缘性最近,该基因编码409个氨基酸残基,有16个抗原决定簇,不含有信号肽,在第56位、284位、294位、325位和383位存在5个潜在的N-糖基化位点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白。根据DPV-UL24序列,设计一对特异性引物,从鸭瘟病毒基因组中扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭瘟病毒UL24基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的EcoRⅠ和XhoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a（+）/DPV-UL24。重组表达质粒pET32a（+）/DPV-UL24转化表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,能表达出了大小约为38kD的UL24重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a（+）/DPV-UL24的最佳诱导条件为0.2mmol/L IPTG、37℃条件下诱导5h。表达产物用镍柱亲和层析纯化、梯度透析复性后与等量弗氏佐剂混合制备UL24重组蛋白疫苗,四次免疫家兔,获得的兔抗UL24高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,High Q阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。4.鸭瘟病毒UL24基因原核表达产物免疫原性研究:制备的UL24重组蛋白疫苗免疫7日龄雏鸭,并在免疫后3、5、7、10、14、21、28、35、42、49、56、70、84、98d分别血清检测ELISA效价和中和效价,并于免疫后21d将其中一半进行保护试验。结果显示:在免疫后28d重组蛋白ELISA抗体效价OD450nm达到最高1:5120,弱毒疫苗组达1:10240,显着高于对照组（P≤0.05）,此后两个月抗体效价均维持较高水平,其消长规律一致。中和试验也表明在免疫后21～28d,重组蛋白组和弱毒免疫组中和效价分别可达1:128、1:256以上,其抗体消长规律与ELISA检测结果相似。重组蛋白免疫保护组发病率50%、死亡率30%,较对照组鸭的发病率100%、死亡率100%明显减少,与弱毒疫苗免疫组（发病率30%、死亡率10%）比较差异不显着。表明DPV-UL24重组蛋白对鸭瘟病毒强毒感染具有一定的保护能力。5.UL24基因在人工感染鸭瘟病毒鸭组织中的表达时相与定位:采用鸭瘟病毒强毒CHv株（DPV-CHv）人工方法感染28日龄鸭,攻毒后于不同时间采集脾脏、胰腺、哈氏腺、法氏囊、肝脏、肠道、肾脏、肺脏、心、脑等组织或器官,经建立的DPV-UL24基因表达蛋白抗体间接免疫组化方法,检测DPV-UL24基因在感染鸭体内的表达时相、侵染过程与定位分布。结果显示:感染后2h可在脾脏、胸腺、肝脏、十二指肠中检测到DPV-UL24基因编码蛋白抗原:攻毒4h时,哈氏腺、腺胃可检测到DPV-UL24基因表达蛋白,8h时在回肠、肺脏,12h在法氏囊和肾脏,24h时在胰腺和肠道各段均呈现阳性反应。通过对鸭瘟病毒蛋白与UL24基因编码蛋白的侵染过程与定位比较发现,免疫器官与肠道黏膜既是病毒,也是UL24基因编码蛋白的靶器官或靶组织,但UL24基因编码蛋白在脑组织嗜性低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。同时,建立的DPV-UL24基因表达蛋白抗体介导的间接免疫荧光方法,也对UL24基因在鸭体组织中的表达时相检测,并对该基因表达蛋白侵染与定位分布进行分析。结果显示:感染鸭瘟病毒强毒2h时,UL24基因即可在脾脏、胸腺、法氏囊、哈德氏腺等免疫器官和肝脏、肺脏、腺胃及大部分肠段编码蛋白,4h时,在脑、心肌和胰腺也检测出UL24基因编码蛋白,8h时在食道粘膜层表达蛋白荧光阳性反应。研究表明:脾脏、胸腺、法氏囊、哈氏腺免疫器官和肠道粘膜也是UL24基因编码蛋白主要的靶器官或靶组织,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性,对粘膜上皮细胞损害严重。26份鸭瘟组织检验,检出25份阳性,阳性率为96.1%（25/26）,表明免疫荧光检测石蜡切片中DPV-UL24基因编码蛋白的方法灵敏、特异性强。6.抗鸭瘟病毒UL24基因原核表达蛋白抗体介导的ELISA检测DPV抗原:通过包被兔抗鸭瘟病毒UL24基因原核表达蛋白抗体,以鸭抗DPV-UL24抗体作为夹心抗体,建立并优化DPV抗原捕获ELISA方法,结果表明:兔抗DPV-UL24抗体浓度为5.0μg/100μL,鸭抗DPV-UL24抗体浓度为9.0μg/100μL,酶标抗体浓度为1:2000时获得最适比例稀释度;对乙型肝炎病毒（DHBV）等非鸭瘟病毒感染其它鸭源病原体阳性血清检验均呈现阴性反应,酶标板板间、板内检测变异系数均小于10%,且可检测出46ng纯化的鸭瘟病毒含量,表明了AC-ELISA具有良好的特异、敏感、稳定性。对人工感染DPV强毒后,病毒在雏鸭肝、脾脏、脑、食道、肺、肾等各组织器官的分布与增殖检测与免疫组化、免疫荧光检测UL24基因编码蛋白结果相似。7.抗鸭瘟病毒UL24基因原核表达蛋白ELISA检测DP抗体:以包被重组DPV-UL24蛋白作为抗原检测DPV抗体研究表明:重组表达蛋白包被浓度为1:80（2.5μg/100μL）,被检血清稀稀释倍数为1:320,酶标二抗1:2000时为最适稀释比例,建立的间接ELISA方法检测鸭乙肝、鸭疫里默氏菌病等阳性血清均为阴性,板内或板间重复试验显示变异系数均小于7%,能检出经1:2560倍稀释的鸭瘟阳性血清,对127份鸭临床疫病血清检测,阳性检出率为77.2%,与包被全病毒检测DPV试剂盒相比,符合率为92.5%。8.基于鸭瘟病毒UL24基因PCR方法建立和应用:根据本研究获得的DPV-UL24基因序列设计一对引物（P1/P2）,对DPV基因组DNA进行扩增。结果显示:能扩增出与预期（585bp）大小一致的片段,对鸭病毒性肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒等病原体核酸提取物均不能扩增出任何条带;且DPV-UL24基因引物P1/P2对DPV基因组DNA检测灵敏度可达到1pg;对14份DPV强毒感染鸭病料进行检测,均扩增出大小一致的特异片段,5份未感染DPV鸭病料扩增结果均为阴性。结果表明,鸭瘟病毒UL24基因PCR方法可靠、灵敏,可应用于临床鸭瘟的诊断与监测。通过对建立的基于鸭瘟病毒UL24基因间接免疫组化、免疫荧光、AC-ELISA和PCR方法的特异性、敏感性和对鸭瘟病料检测结果的比较分析发现,四种方法对鸭瘟阳性病料检测为阳性,对未感染鸭瘟病毒病料、空白对照、山羊血清和鸭源性其它病原体检测均为阴性,说明了四种检测病毒抗原方法均具有良好的特异性;人工感染DPV后分别对鸭组织检测显示,感染4h在脾脏、胸腺、肝脏、十二指肠等部位均呈现阳性反应,而免疫组化方法在感染24h时几乎在全身组织中均有UL24基因蛋白表达,免疫荧光与PCR方法则需12h就呈现阳性反应;AC-ELISA在感染24h对所检测的11份样本均能检出,临床鸭瘟病料检测显示,免疫组化阳性检测率88.4%、免疫荧光阳性检测率96.1%、抗原捕获ELISA阳性检测率为84.6%,PCR阳性率则为100%。
杨承槐[8]（2014）在《鸭肠炎病毒及其致弱毒株基因组的分子特征和生物学特性》文中研究指明鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）,又名鸭瘟（Duck plague, DP）,是鸭、鹅及其它雁形目禽类的一种急性、接触性传染病,其特征是血管损伤、组织出血、消化道粘膜损伤、淋巴器官受损和实质性器官退行性病变,死亡率高,造成重大经济损失。该病的病原为鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）,又称为鸭瘟病毒,属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、马立克病毒属、鸭疱疹病毒1型。本研究利用鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast, CEF）,将我国鸭肠炎病毒强毒参考株（DEV CSC）进行连续传代致弱,分析了强、弱毒株的全基因组序列特征以及致弱毒株的生物学特性,以期揭示DEV在体外传代致弱的分子基础；构建出DEV gE和gI基因的缺失毒株,分析了gE和gI基因对病毒毒力的影响,旨在为揭示DEV的分子致病机理奠定基础以及为开发DEV基因缺失疫苗提供科学依据。利用454测序平台,对DEV CSC进行了全基因组序列测定。结果表明,DEV CSC基因组全长162,131bp,共78个ORF,编码76个蛋白。全基因组比较发现,DEV CSC与2000年四川分离的DEV CHv株同源性高达99.99%,只有21个核苷酸替换（15个非同义和6个同义）和52个核苷酸缺失或插入,除了在UL41中有3个核苷酸连续插入外,其余核苷酸缺失或插入均在非编码区内；大部分非同义突变（10/15）位于基因组的5’末端。DEV CSC与2005年德国分离的DEV2085株的同源性为98.92%,主要差异是DEV2085株的UL区的5’端连续缺失1,170bp。与DEV CSC相比,鸡胚传代致弱株DEV K p63基因组短4,040bp,在UL区的5’端利3’端分别缺失3,513bp和528bp;76个ORF中有63个ORF的核苷酸序列完全一致,2个ORF（UL56和US10）在C端有移框变异,UL2连续缺失176个氨基酸。将DEV CSC经CEF连续传80代,进行全基因组序列测定,分析了基因组和生物学特性的变化。结果表明,前4代无明显细胞病变,第5代出现少量蚀斑样细胞病变,随代次增加,出现细胞病变时间提前；第25代蚀斑面积显着减小（p<0.01）,随后蚀斑面积稳定,各代次间无明显差异；第80代毒（DEV p80）基因组全长为160,328bp。与亲本病毒DEV CSC基因组相比,DEV p80基因组的145,818-147,618nt连续缺失共1,801bp,导致US7（gI）基因3’端和US8（gE）基因5’端缺失,此外,还有12个点突变,其中8个位于预测的ORF内,导致LORF4、UL51、UL9、UL7、UL4和US3共6个蛋白存在单个氨基酸变异。经临床症状、体温、病毒血症、泄殖腔排毒、大体病变、组织学病变、免疫组化和荧光定量PCR检测,比较了传代前后DEV致病性的差异,结果显示,DEV p80接种鸭未出现体温明显升高或临床症状,对消化道和淋巴器官无明显病理学损伤,消化道和淋巴器官中病毒拷贝数明显下降,表明DEV p80对鸭无致病性。攻毒保护试验结果表明,DEV p80具有良好的免疫原性,鸭免疫后5d,即可100%抵抗致死性强毒的攻击。gI和gE基因是疱疹病毒重要的毒力决定因子。为了证实gI和gE基因对DEV毒力的影响,以DEV CSC为亲本病毒,应用同源重组技术,构建出一株缺失145,818～147,618nt的重组病毒DEV-△US78-GFP,并比较了重组病毒及其亲本病毒的体内体外生物学特性。结果表明,重组病毒DEV-△US78-GFP在DEF中产生的蚀斑明显小于亲本病毒（p<0.001）：一步生长曲线也有所不同,DEV-△US78-GFP在细胞和上清中病毒含量峰值均为亲本病毒1/80左右,且到达峰值的时间分别延迟了24h和36h；重组病毒DEV-AUS78-GFP接种4周龄鸭,未出现明显的临床症状和大体病变。这些结果表明,gI利/或gE对DEV在细胞间传播和细胞中的复制有重要影响,是DEV重要的毒力决定因子。综上所述,本研究完成了我国鸭肠炎病毒强毒参考株的全基因组序列测定与分析；发现DEV经鸡胚成纤维细胞连续传代可导致gI和gE基因的缺失,失去对鸭的致病力,并具有良好的免疫原性；构建了缺失gI和gE基因的DEV突变株,经体内、体外试验证实,与其他疱疹病毒一样,DEV gI和／或gE基因对病毒在细胞间传播和毒力具有重要影响。本研究结果为DEV的分子致病机理以及基因缺失疫苗开发提供了科学依据。
王文洁[9]（2008）在《鸭病毒性肠炎病毒gB基因主要抗原区域原核表达及其ELISA检测方法的建立》文中研究表明鸭病毒性肠炎（Duck virus enteritis,DVE）,俗称鸭瘟（Duck plague,DP）,是鸭、鹅、大雁等多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,由鸭病毒性肠炎病毒（Duckenteritis virus,DEV）引起。病毒基因组编码十几种糖蛋白,其中gB蛋白是病毒囊膜表面展示的主要蛋白之一,也是主要的免疫原蛋白。本试验使用鸡胚成纤维细胞培养鸭病毒性肠炎病毒,提纯病毒后提取病毒DNA作模板。根据GenBank获取DEV基因序列（登录号EF203709）,利用生物学软件DNAstar分析DEV gB蛋白氨基酸序列,筛选出其抗原性高、水溶性和表面展示概率高的2个区域(分别命名为gBaAsp113～Ala478;gBb Thr218～Val584),PCR扩增出这两段主要抗原区域并且克隆进入载体pMD18-T Vector,目的基因经PCR酶切鉴定后连接至原核表达载体pET-32a（+）。获得的重组质粒分别转化E coli BL21（DE3）感受态细胞,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下以包涵体的形式高效表达,Western-blotting分析及重组蛋白免疫小鼠实验中血清抗体ELISA检测结果表明表达产物具有良好的抗原性,具有DEV诊断抗原及亚单位疫苗的应用前景。表达重组蛋白pET-32a-gBa经过初步纯化之后用作包被抗原,建立了针对DEV血清抗体的间接ELISA检测方法。并且确定了最适抗原包被浓度为2.5μg/mL、最适血清稀释度为1:800、血清最适作用时间90min、最佳封闭条件为0.15%的BSA 4℃封闭24h、酶标抗体最适稀释度为1:1000,最适作用时间为30min,底物最适显色时间为37℃5min,判定标准为OD450≥0.446为阳性。应用该间接ELISA方法检测了实验室保存的DEV阳性血清。结果表明该诊断方法具有良好的特异性及敏感性,显示了良好的应用前景。本研究成功克隆表达了DEV gB基因的主要抗原区域,获得了可溶性表达的目的蛋白,为研究gB基因的功能奠定了良好的基础。利用表达的重组蛋白pET-32a-gBa成功建立了快速简便的ELISA诊断方法,为开发DEV商品化试剂盒,进行DEV流行病学调查及对其控制消灭提供了一定的技术支撑。
郭宇飞,程安春,汪铭书,周毅[10]（2008）在《鸭瘟病毒的纯化及电镜负染形态观察》文中研究表明先做切向超滤浓缩,再采用蔗糖垫底超速离心和蔗糖密度梯度超速离心的方法对鸭胚成纤维细胞培养物中的鸭瘟病毒进行纯化,并对纯化的病毒粒子用电镜进行了观察。结果显示,用切向超滤法将病毒培养物浓缩为原体积的1/5后,再采用300 g/L蔗糖垫底超速离心和300600 g/kg蔗糖密度梯度离心的方法进行纯化,可获得大量的纯化病毒粒子。电镜负染观察结果表明,病毒粒子呈圆形,多数直径为150 nm左右,只有1个核衣壳,少数病毒粒子直径可达300 nm,有2个或多个核衣壳。
二、鸭瘟病毒及其核酸的电镜观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸭瘟病毒及其核酸的电镜观察（论文提纲范文）
（2）DEV基因文库构建、核衣壳蛋白基因的发现及克隆与表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 文献综述 |
| 第一章 几种家禽疱疹病毒研究概况 |
| 第二章 病毒结构蛋白的功能及其体外表达优化策略 |
| 实验研究 |
| 第三章 DEV CHv株的增殖、提纯及其结构蛋白初步分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第四章 DEV CHv株基因组 DNA的限制性内切酶分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第五章 DEV基因文库构建及核衣壳蛋白基因的发现、克隆与鉴定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第六章 基于DEV核衣壳蛋白基因PCR方法的建立与应用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第七章 DEV核衣壳蛋白基因原核表达载体的构建 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第八章 DEV重组核衣壳蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及其抗原性初探 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 读书期间发表或参与发表论文情况 |
（3）鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株部分生物学特性的研究及荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用（论文提纲范文）
| 作者声明 |
| 目录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 本论文中常用的英文缩写词汇含义说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章． 鸭病毒性肠炎研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第二章． 鸭病毒性肠炎病毒 CH强毒株适应鸭胚成纤维细胞的研究 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章图示 |
| 第三章． 鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株在鸭胚成纤维细胞中形态结构和形态 |
| 发生学的研究 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章图示 |
| 第四章． 鸭病毒性肠炎病毒 CH强毒株致鸭胚成纤维细胞发生细胞凋亡作用的研究 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四章图示 |
| 第五章． TaqMan-MGB探针荧光实时定量 PCR检测鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株方法的建立和应用 |
| 材料方法 |
| 结果与讨论 |
| 小结 |
| 第六章． 从鸭胚成纤维细胞中分离纯化鸭病毒性肠炎病毒 CH强毒株方法的研究 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第七章． 鸭病毒性肠炎病毒 CH强毒株的结构蛋白分析 |
| 材料方法 |
| 结果与讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 附录 论文附表和附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介以及攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（4）鸭瘟强毒在实验感染鸭体内的致病与复制特征及dUTPase基因发现和初步鉴定（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 本论文中常用英文缩写词汇含义说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 疱疹病毒在感染宿主细胞内复制及致病特征 |
| 第二章 脱氧尿苷焦磷酸酶研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 鸭瘟强毒致实验感染鸭宿主细胞超微结构变化研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 鸭瘟强毒在实验感染鸭宿主细胞内的形态发生学研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 鸭瘟强毒致感染鸭宿主细胞凋亡的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 鸭瘟病毒dUTPase基因的发现及其分子特征分析 |
| 1 序列相似性搜索 |
| 2 ORF预测 |
| 3 采用NCBI的BLASTP对该1344bp的ORF进行分析 |
| 4 ORF编码蛋白(即dUTPase)的生物信息学分析 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第七章 鸭瘟强毒dUTPase基因克隆和在基因组中的定位研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第八章 基于dUTPase基因鉴别鸭瘟强弱毒PCR方法的建立和应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介以及攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）鸭肠炎病毒部分基因组序列的克隆与分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 引言 |
| 1.1 疱疹病毒分类 |
| 1.2 疱疹病毒形态结构 |
| 1.3 疱疹病毒基因组结构 |
| 1.4 疱疹病毒基因及其编码产物 |
| 1.5 鸭病毒性肠炎的国内外研究进展 |
| 1.5.1 鸭病毒性肠炎简介 |
| 1.5.2 鸭肠炎病毒简介 |
| 1.5.3 鸭肠炎病毒形态发生 |
| 1.5.4 鸭病毒性肠炎的诊断 |
| 1.5.5 鸭病毒性肠炎的防制 |
| 1.5.6 鸭肠炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.6 鸭病毒性肠炎存在的问题与展望 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 1.8 研究内容和方法 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、鸡胚和鸡胚成纤维细胞 |
| 2.1.2 载体与受体菌 |
| 2.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鸭肠炎病毒的纯化 |
| 2.2.2 病毒的鉴定 |
| 2.2.3 PCR 检测病毒在鸡胚体内的分布 |
| 2.2.4 PCR 敏感性测定 |
| 2.2.5 Targeted gene walking PCR 扩增DEV Clone-03 未知基因 |
| 2.2.6 PCR 产物的克隆和序列测定 |
| 2.2.7 病毒基因的ORF 预测和序列分析 |
| 2.2.8 分段进行DEV Clone-03 UL6 基因的原核表达 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 DEV 的纯化、增殖与鉴定 |
| 3.1.1 DEV 引起的细胞和鸡胚病变 |
| 3.1.2 PCR 鉴定产物及电镜观察 |
| 3.1.3 引物P1/P2 PCR 扩增产物的核苷酸序列 |
| 3.1.4 引物P11/P12 PCR 扩增产物的核苷酸序列 |
| 3.1.5 PCR 检测病毒在鸡胚体内的分布 |
| 3.1.6 PCR 检测的敏感性 |
| 3.2 DEV Clone-03 基因的扩增 |
| 3.2.1 DEV Clone-03 UL1～UL7 基因区和UL25～UL30 基因区 |
| 3.2.2 UL1 基因序列分析 |
| 3.2.3 UL2 基因序列分析 |
| 3.2.4 UL3 基因序列分析 |
| 3.2.5 UL4 基因序列分析 |
| 3.2.6 UL5 基因序列分析 |
| 3.2.7 UL6 基因序列分析 |
| 3.2.8 UL7 基因序列分析 |
| 3.2.9 UL25 基因序列分析 |
| 3.2.10 UL26 基因序列分析 |
| 3.2.11 UL26.5 基因序列分析 |
| 3.2.12 UL27 基因序列分析 |
| 3.2.13 UL28 基因序列分析 |
| 3.2.14 UL29 基因序列分析 |
| 3.2.15 UL30 基因序列分析 |
| 3.3 DEV Clone-03 UL6 基因的分段表达 |
| 3.3.1 表达载体pET-UL6-1 的构建 |
| 3.3.2 表达载体pET-UL6-2 的构建 |
| 3.3.3 表达产物的SDS-PAGE 分析 |
| 3.3.4 Western-blot 鉴定免疫后血清效价 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 DEV 的蚀斑纯化、增殖和检测 |
| 4.2 DEV UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的扩增和序列分析 |
| 4.2.1 Targeted gene walking PCR 方法扩增DEV 基因 |
| 4.2.2 DEV Clone-03 UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的排列 |
| 4.2.3 DEV Clone-03 UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的起始密码子 |
| 4.2.4 DEV Clone-03 UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的特征 |
| 4.3 DEV Clone-03 UL6 基因的原核表达 |
| 4.4 实验创新 |
| 5. 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）鸭瘟的动态病理学研究和鸭CD4的克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 鸭瘟概况 |
| 1.1 鸭瘟的发展历史及流行情况 |
| 1.2 鸭瘟病毒的形态及其理化特性 |
| 1.3 鸭瘟的症状及病理变化 |
| 1.4 鸭瘟发病机制的研究概况 |
| 2 CD4分子的研究概况 |
| 2.1 CD4的分子结构 |
| 2.2 CD4分子的功能 |
| 2.3 CD4抗体的应用 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体及菌株 |
| 1.2 试验动物及病毒 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.3.1 抗生素类 |
| 1.3.2 细菌培养基 |
| 1.3.3 RNA提取相关溶液 |
| 1.3.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳相关溶液 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸭瘟的病理学变化观察 |
| 2.1.1 毒株的准备 |
| 2.1.2 动物感染 |
| 2.1.3 临床症状观察 |
| 2.1.4 生理生化指标及细胞因子的测定 |
| 2.1.5 组织病理学变化观察 |
| 2.1.6 免疫器官透射电镜观察 |
| 2.2 麻鸭和樱桃谷鸭CD4 ORF基因序列的测定和分析 |
| 2.2.1 动物性材料RNA的提取 |
| 2.2.2 引物的设计 |
| 2.2.3 麻鸭及樱桃谷鸭CD4序列的扩增 |
| 2.2.4 PCR产物的回收与纯化 |
| 2.2.5 目的基因与克隆载体pMD-18T的连接 |
| 2.2.6 E.coil DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 连接产物的转化 |
| 2.2.8 阳性菌的鉴定及序列测定 |
| 2.2.9 麻鸭和樱桃谷鸭CD4 ORF的序列分析 |
| 结果与分析 |
| 1 鸭瘟的病理学变化观察 |
| 1.1 感染组鸭临床症状观察 |
| 1.2 感染组鸭剖检病理变化 |
| 1.3 生理生化指标及细胞因子的测定结果 |
| 1.3.1 生理生化指标检测结果比较分析 |
| 1.3.2 细胞因子检测结果比较分析 |
| 1.4 人工感染鸭瘟病毒后鸭各器官的病理学变化 |
| 1.5 人工感染鸭瘟病毒后鸭免疫器官透射电镜的观察 |
| 1.5.1 脾脏透射电镜的观察 |
| 1.5.2 胸腺透射电镜的观察 |
| 2 麻鸭和樱桃谷鸭CD4 ORF基因序列的测定和分析 |
| 2.1 麻鸭和樱桃谷鸭胸腺RNA提取结果 |
| 2.2 麻鸭和樱桃谷鸭CD4 ORF基因扩增 |
| 2.3 麻鸭和樱桃谷鸭CD4 ORF基因的克隆与鉴定 |
| 2.4 麻鸭和樱桃谷鸭CD4 ORF基因的序列测定与分析 |
| 讨论 |
| 1 鸭瘟的病理学变化观察 |
| 1.1 感染组鸭临床症状及剖检变化 |
| 1.2 鸭瘟病毒感染后生理生化指标的变化与组织病理学变化之间的关系 |
| 1.2.1 AST、ALT、ALT/AST、ALB、GLB、TP、A/G、ALP的变化与肝组织病理学变化之间的关系 |
| 1.2.2 CK、LD的变化与心肌组织病理学变化之间的关系 |
| 1.2.3 AMY的变化与胰腺组织病理学变化之间的关系 |
| 1.3 鸭瘟病毒感染与免疫器官损伤 |
| 1.4 鸭瘟病毒感染后其它各组织器官组织病理学变化 |
| 1.5 鸭瘟发病机制探讨 |
| 2 樱桃谷鸭和麻鸭CD4 ORF序列测定及对比分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳特性和UL24基因的发现、原核表达及应用研究（论文提纲范文）
| 本论文创新性工作 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写词汇含义说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 蛋白质组学及主要病毒蛋白质组学的研究进展 |
| 摘要 |
| 1.蛋白质组学的产生 |
| 2.蛋白质组学的研究技术 |
| 3.病毒蛋白质组的研究概况 |
| 4.蛋白质研究技术中尚存在的问题 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 鸭瘟病毒的纯化及其超微结构研究 |
| 摘要 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 病毒增殖 |
| 2.2 病毒纯化 |
| 2.3 电镜观察 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 病毒的增殖与纯化 |
| 3.2 病毒粒子的电镜观察 |
| 4.分析与讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳特性 |
| 摘要 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 抗DPV高免血清的制备与纯化 |
| 2.2 鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳模型的建立与优化 |
| 2.3 鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳分离与免疫印迹分析 |
| 2.4 鸭瘟病毒免疫原性蛋白质谱鉴定与分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 抗DPV抗体IgG纯化结果及鸭瘟病毒蛋白质组样品含量 |
| 3.2 DPV感染DEF蛋白质组2-DE模型建立与优化 |
| 3.3 鸭瘟病毒蛋白质组2-DE分离与免疫印迹分析 |
| 3.4 鸭瘟病毒免疫原性蛋白质质谱鉴定与分析 |
| 4.分析与讨论 |
| 5.小结 |
| 第四章 鸭瘟病毒UL24基因的发现、克隆及分子特性分析 |
| 摘要 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 质谱解析蛋白序列扩增鸭瘟病毒基因与分析 |
| 2.2 兼并引物扩增获取测序基因片段杂交验证 |
| 2.3 DPV-UL24全基因的扩增及其生物信息学分析 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 质谱蛋白序列部分基因的扩增、测序及其分析 |
| 3.2 鸭瘟病毒UL24基因的扩增与测序 |
| 3.3 扩增核酸序列生物信息学分析 |
| 4.讨论与分析 |
| 5.小结 |
| 第五章 鸭瘟病毒UL24基因原核表达、产物纯化及其抗体制备 |
| 摘要 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 pET32a(+)/DPV-UL24原核表达质粒构建与诱导表达 |
| 2.2 重组质粒pET32a(+)/DPV-UL24原核表达产物纯化与蛋白复性 |
| 2.3 兔抗融合表达蛋白pET32a(+)/DPV-UL24抗体的制备与纯化 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 DPV-UL24基因片段扩增结果 |
| 3.2 原核表达质粒pET32a(+)/DPV-UL24的构建与鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒pET32a(+)/DPV-UL24的诱导表达及其优化结果 |
| 3.4 融合表达蛋白pET32a(+)/DPV-UL24的纯化结果 |
| 3.5 兔抗DPV-UL24血清制备结果 |
| 4.分析与讨论 |
| 5.小结 |
| 第六章 鸭瘟病毒UL24基因原核表达产物免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 试验动物分组与免疫 |
| 2.2 攻毒保护试验 |
| 2.3 血清抗体检测试验 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 人工感染鸭不同时间血清ELISA抗体效价 |
| 3.2 鸭抗DPV-UL24血清中和抗体效价消长变化 |
| 3.3 攻毒保护试验结果 |
| 4.分析与讨论 |
| 5.小结 |
| 第七章 DPV-UL24蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染鸭瘟病毒后UL24基因在鸭组织中的表达时相与定位研究 |
| 摘要 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 试验动物人工感染DPV及样品采集 |
| 2.2 样品组织包埋及切片 |
| 2.3 间接免疫组化检测DPV-UL24基因编码蛋白方法的建立与优化 |
| 2.4 间接免疫组化检测DPV-UL24基因编码蛋白方法的临床应用 |
| 2.5 人工感染DPV后DPV-UL24基因在鸭组织蛋白表达时相、侵染过程与定位分布 |
| 2.6 结果判定 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 免疫组化检测人工感染后鸭组织DPV-UL24基因编码蛋白方法的建立与优化 |
| 3.2 免疫组化检测DPV-UL24基因编码蛋白方法的临床应用 |
| 3.3 免疫组化方法检测在人工感染DPV后DPV-UL24基因在鸭组织蛋白表达时相、侵染过程与定位分布 |
| 4.分析与讨论 |
| 5.小结 |
| 第八章 DPV-UL24蛋白抗体介导的免疫荧光检测人工感染鸭瘟病毒后UL24基因在鸭组织中的表达时相与定位研究 |
| 摘要 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 动物人工感染DPV及采样、组织包埋及切片 |
| 2.2 间接免疫荧光检测DPV-UL24基因编码蛋白方法的建立与优化 |
| 2.3 间接免疫荧光检测DPV-UL24基因编码蛋白方法的临床应用 |
| 2.4 免疫荧光方法检测人工感染DPV后DPV-UL24基因在鸭组织蛋白表达时相、侵染过程与定位分布 |
| 2.5 结果判定 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 免疫荧光检测人工感染鸭瘟病毒后鸭组织DPV-UL24基因编码蛋白方法的建立与优化 |
| 3.2 间接免疫荧光检测DPV-UL24基因编码蛋白方法的临床应用 |
| 3.3 免疫荧光检测在人工感染DPV后DPV-UL24基因在鸭组织蛋白表达时相、侵染过程与定位分布 |
| 4.分析与讨论 |
| 5.小结 |
| 第九章 抗鸭瘟病毒UL24基因原核表达蛋白抗体介导的ELISA检测DPV抗原的研究和应用 |
| 摘要 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 兔抗DPV-UL24抗体和鸭抗DPV-UL24抗体的制备与纯化 |
| 2.2 样品的处理 |
| 2.3 抗DPV-UL24蛋白抗体介导的抗原捕获-ELISA方法的建立 |
| 2.4 抗DPV-UL24蛋白抗体介导的抗原捕获-ELISA方法的优化 |
| 2.5 AC-ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 2.6 抗原捕获ELISA方法性能评价 |
| 2.7 抗DPV-UL24蛋白抗体介导的抗原捕获ELISA方法的应用 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 抗原捕获ELISA检测DPV方法的建立与优化 |
| 3.2 AC-ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 3.3 抗原捕获ELISA方法性能评价 |
| 3.4 抗原捕获ELISA检测DPV方法的应用 |
| 4.分析与讨论 |
| 5.小结 |
| 第十章 鸭瘟病毒UL24基因原核表达蛋白作为包备抗原ELISA检测DPV抗体的研究和应用 |
| 摘要 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 DPV-UL24基因原核表达蛋白的获得与纯化 |
| 2.2 DPV-UL24基因原核表达蛋白作为包被抗原ELISA方法的建立 |
| 2.3 间接ELISA方法检测DPV抗体的应用 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 DPV-UL24表达蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.2 临床血清样品检测结果 |
| 4.分析与讨论 |
| 5.小结 |
| 第十一章 基于鸭瘟病毒UL24基因PCR方法的建立和应用 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 核酸DNA的提取 |
| 2.2 DPV-UL24基因PCR检测DPV方法的建立与优化 |
| 2.3 DPV-UL24基因PCR方法对病料组织的检测 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 引物对DPV强毒株核酸进行PCR扩增的结果 |
| 3.2 DPV-UL24基因PCR检测DPV方法灵敏性试验 |
| 3.3 DPV-UL24基因PCR检测DPV方法的特异性试验 |
| 4.分析与讨论 |
| 5.小结 |
| 第十二章 建立基于鸭瘟病毒UL24基因的免疫组化、免疫荧光和抗原捕获ELISA、PCR检测DPV方法的比较 |
| 1.试验材料与方法 |
| 2.试验结果 |
| 2.1 建立基于DPV-UL24基因检测方法的特异性 |
| 2.2 建立基于DPV-UL24基因检测方法的敏感性 |
| 2.3 建立基于DPV-UL24基因检测方法对临床鸭瘟病料检测结果 |
| 3.讨论与分析 |
| 4.小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 第五部分 致谢 |
| 作者简介 |
| 附表 |
| 附图 |
| 附图 1——免疫组化版图 |
| 附图 2——免疫荧光版图 |
| 附图 3——基因测序图 |
（8）鸭肠炎病毒及其致弱毒株基因组的分子特征和生物学特性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图与附表清单 |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 国内外研究现状 |
| 1.2 研究的目的和意义 |
| 1.3 研究内容和技术路线 |
| 1.4 研究目标 |
| 第二章 鸭肠炎病毒强毒参考株全基因组序列测定与分析 |
| 摘要 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸭肠炎病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传代及基因组变异分析 |
| 摘要 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 鸭肠炎病毒传代致弱毒株的致病性与免疫原性分析 |
| 摘要 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 鸭肠炎病毒gE和gI基因缺失株的构建与致病性分析 |
| 摘要 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 第七章 创新点 |
| 第八章 文献综述 |
| 8.1 历史 |
| 8.2 病原学 |
| 8.3 分子生物学 |
| 8.4 流行病学 |
| 8.5 病理学 |
| 8.6 诊断 |
| 8.7 预防和控制 |
| 8.8 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）鸭病毒性肠炎病毒gB基因主要抗原区域原核表达及其ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鸭病毒性肠炎研究进展 |
| 2 鸭病毒性肠炎病毒囊膜糖蛋白gB研究进展 |
| 3 实验研究目的和意义 |
| 4 研究内容和方法 |
| 参考文献 |
| 研究内容 |
| 第二章 鸭病毒性肠炎gB基因主要抗原区域原核表达及其产物的抗原性分析 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第三章 鸭病毒性肠炎病毒重组抗原间接ELISA诊断方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）鸭瘟病毒的纯化及电镜负染形态观察（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 鸭胚成纤维细胞 (DEF) |
| 1.3 DPV毒株 |
| 1.4 病毒接种细胞方法 |
| 1.5 病毒的超滤浓缩 |
| 1.6 蔗糖密度梯度超速离心纯化 |
| 1.7 纯化病毒的电镜负染观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 蔗糖密度梯度离心 |
| 2.2 纯化病毒的负染电镜观察 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于DPV的纯化 |
| 3.2 关于DPV纯化病毒的电镜负染形态观察 |
四、鸭瘟病毒及其核酸的电镜观察（论文参考文献）
- [1]鸭瘟病毒及其核酸的电镜观察[J]. 贺东生,赵善昌,苏丹萍. 中国畜禽传染病, 1998(01)
- [2]DEV基因文库构建、核衣壳蛋白基因的发现及克隆与表达[D]. 文明. 四川农业大学, 2005(08)
- [3]鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株部分生物学特性的研究及荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用[D]. 郭宇飞. 四川农业大学, 2005(08)
- [4]鸭瘟强毒在实验感染鸭体内的致病与复制特征及dUTPase基因发现和初步鉴定[D]. 袁桂萍. 四川农业大学, 2007(02)
- [5]鸭肠炎病毒部分基因组序列的克隆与分析[D]. 陈淑红. 东北农业大学, 2006(02)
- [6]鸭瘟的动态病理学研究和鸭CD4的克隆[D]. 许媛媛. 华中农业大学, 2010(06)
- [7]鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳特性和UL24基因的发现、原核表达及应用研究[D]. 贾仁勇. 四川农业大学, 2008(01)
- [8]鸭肠炎病毒及其致弱毒株基因组的分子特征和生物学特性[D]. 杨承槐. 中国农业大学, 2014(08)
- [9]鸭病毒性肠炎病毒gB基因主要抗原区域原核表达及其ELISA检测方法的建立[D]. 王文洁. 南京农业大学, 2008(08)
- [10]鸭瘟病毒的纯化及电镜负染形态观察[J]. 郭宇飞,程安春,汪铭书,周毅. 中国兽医科学, 2008(05)