一、蛋白酪氨酸磷酸化水平与乳腺癌细胞株抗失巢凋亡特性的关系（论文文献综述）
陶鹏先[1]（2021）在《PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究》文中指出肝癌是世界排名第5的高致死性恶性肿瘤,因高侵袭性、高复发性而着称,其中肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占约90%以上。而作为与肿瘤浸润、转移密切相关的失巢凋亡（anoikis resistance,AR）抵抗在肝癌中的研究一直处于边缘领域。作为HCC发生发展中的重要凝血相关纤溶因子PAI-1既往证实与HCC的浸润转移密切相关,但其临床预后意义及与基础研究往往相左。是否PAI-1因子在HCC中发挥其浸润转移重要调控作用是通过引起肿瘤细胞AR表型引起,既往并无相关报道。目的 探索PAI-1在肝癌中的生物学意义及其是否调控肝癌细胞失巢凋亡抵抗表型和具体调控机制。方法 1、使用免疫组化（IHC）分析PAI-1在肝癌组织中表达情况,并结合临床基线资料统计其与肝癌患者临床预后（总体生存率,OS）结局;2、使用Western-blot,RT-PCR技术验证PAI-1在HCC细胞中的相对mRNA及蛋白表达水平;验证PAI-1调控HCC细胞中的凋亡蛋白表达水平（cleaved caspase-3）,EMT蛋白表达水平（E-cahdarin,N-cahdarin,Vimentin）;以及验证PAI-1调控HCC细胞AR的信号通路蛋白表达（PTEN,PI3K,p-85α,AKT及p-AKT）;3、使用慢病毒载体工具构建PAI-1 RNAi及Ovexpression HCC稳转细胞株进一步验证PAI-1调控HCC细胞mRNA及蛋白表达水平;4、使用流式Annexin V-FITC/PI法检测HCC细胞的anoikis表型以及PAI-1调控HCC anoikis表型;5、使用细胞划痕愈合实验、Transwell实验以及CCK-8实验验证PAI-1调控HCC细胞的增殖、浸润、转移表型;6、使用生物信息学技术分析在HCC中PAI-1调控PTEN/PI3K/AKT信号通路的下游蛋白分子及临床意义;7、通过构建体内HCC肝内转移模型,验证PAI-1在体内调控HCC浸润转移表型及相关调控机制。结果 1、通过本课题组分析统计174例肝癌患者临床资料及IHC结果,发现PAI-1表达与HCC患者生存预后呈正相关,PAI-表达越低,肝癌患者预后越差（Log-rank,p=0.027）;测量肝癌患者IHC切片Mean-IOD值,验证癌旁vs癌组织（p<0.000）,并且随着临床分期的升级,PAI-1表达呈明显下降趋势;使用COX单因素回归分析PAI-1表达（HR=1.662,95%CL=1.380-2.546,p=0.000）,多因素COX回归分析PAI-1表达（HR=2.303,95%CL=1.852-2.654,p=0.000）,提示相较其他因素,PAI-1可以作为独立的预后因子,低表达是高表达预测风险的1.662倍/2.303倍。2、PAI-1基因在蛋白及mRNA表达水平上基本一致（VS L02）在PLC/PRF/5、SMMC 7721以及MHCC-97H表达均为低表达;慢病毒构建稳转株:PAI-1高表达细胞组（Hep G2、Huh 7）共设三个敲减靶点,敲减效率最低达到80%以上（Hep G2 sh-PAI-1#53.3%,sh-PAI-2#84%,sh-PAI-3#23%;Huh sh-PAI-1#71%,sh-PAI-2#83.3%,sh-PAI-3#66.1%）,低表达组（SMMC 7721以及MHCC-97H）过表达效率达到70%以上（MHCC-97H 84%,SMMC 7721 76.2%）。高表达细胞系悬浮48h后PAI-1表达明显下降,而低表达组sus 48h却呈明显上升趋势（p<0.001,VS贴壁48h组）,对高表达细胞系敲减PAI-1基因后,细胞悬浮48h PAI-1表达明显下降（p<0.001,VS sh-NC sus 48h,悬浮sus（suspension））。而对低表达组过表达PAI-1基因后,细胞悬浮48h PAI-1表达明显上升（p<0.001,VS OV-NC sus 48h）;验证cleaved-caspase 3表达,在高表达细胞系中,敲减PAI-1细胞系sus 48h凋亡率明显下降（VS sus 48h sh-NC,p<0.001）,而在低表达细胞系中缺恰恰相反（VS sus 48h OV-NC,p<0.001）;探索EMT表型蛋白（N-cadherin,E-cadherin,Vimentin）表型蛋白变化,细胞悬浮48h后EMT,发现PAI-1表达越高,悬浮细胞浸润及转移能力越差,反之越强（VS sh-NC sus 48h/OV-NC sus48h,p<0.001）;分别对PTEN,PI3K,PI3K磷酸化蛋白p85α,AKT,AKT磷酸化蛋白p-akt表达水平分析,sh组细胞悬浮48h后,PTEN表达明显降低（VS sh-NC sus 48h,p<0.001,***）,而p85α和p-akt表达升高（VS sh-NC sus 48h,p<0.001,***）。相较sh-NC组,sh组细胞贴壁48h后,PTEN表达明显降低,p85α和p-akt表达升高,但相较悬浮组,细胞悬浮后信号通路下游蛋白激活更为明显;与之相反,相较OV-NC组,OV组细胞悬浮48h后,PTEN表达增高,p85α和p-akt表达降低（VS OV-NC sus 48h,p<0.001,***）,而贴壁48h PTEN表达虽然也有增高,p85α和p-akt表达降低趋势,变化趋势并不太明显（VS OV-NC sus 48h,p>0.05）,未磷酸化蛋白PI3K,AKT相较NC组却未发生明显改变。3、使用流式Annexin V-FITC/PI凋亡检测高表达细胞经过PAI-1基因敲除后,sus 48h凋亡率明显下降（sus 48h sh-NC-Hep G2 43.32%±4.23%VS sus 48h shPAI-1-Hep G2 15.38±1.68%、sus 48h sh-NC-Huh 7 53.7%±7.23%VS sus 48h sh-PAI-1-Huh 7 15.35.7%±3.33%,p<0.001）,而对于低表达细胞系,则恰恰相反（sus48h OV-NC-SMMC 7721 21.41%±3.36%VS sus 48h OV-PAI-1-SMMC 772144.41±4.35%、sus 48h OV-NC-MHCC-97H 17.21%±3.63%VS sus 48h OV-PAI-1-MHCC-97H 32.16%±3.88%,p<0.001）。4、划痕实验可见PAI-1高表达细胞,当PAI-1基因敲除后,相较sh-NC组,Hep G2划痕相对面积愈合速度明显加快（0.86 cm2±0.21 cm2 VS 0.14 cm2±0.06cm2,p<0.001）,Huh 7趋势同前（0.98 cm2±0.16 cm2 VS 0.57 cm2±0.21 cm2,p<0.001）;而对于PAI-1低表达细胞,相较OV-NC组,趋势则恰恰相反,MHCC-97H划痕相对面积愈合速度明显降低（0.12 cm2±0.02 cm2 VS 0.38 cm2±0.11 cm2,p<0.001）,SMMC 7721趋势同前（0.29 cm2±0.17 cm2 VS 0.74 cm2±0.18 cm2,p<0.001）。Transwell实验可见,PAI-1高表达细胞,当PAI-1基因敲除后,相较sh-NC组,Hep G2浸润及转移能力明显增强（invasion:32±4 VS 8±3,p<0.001;migration:22±2 VS 6±3,p<0.001）,Huh 7趋势同前（invasion:298±14 VS 78±13,p<0.001;migration:324±22 VS 85±16,p<0.001）;PAI-1低表达细胞,当过表达PAI-1基因后,相较OV-NC组,趋势则恰恰相反,MHCC-97H浸润及转移能力明显降低（invasion:23±5 VS 107±21,p<0.001;migration:21±4 VS 94±15,p<0.001）,SMMC 7721趋势同前（invasion:112±22 VS 198±13,p<0.001;migration:124±18VS 237±26,p<0.001）。使用cck-8检测HCC增殖率,细胞增殖表型基本相同NC组（OV-MHCC 97H VS OV-NC组,p=0.017;OV-SMMC 7721 VS OV-NC组,p=0.024）。5、根据各种在线生物信息学预测网站,我们预测AKT1作为PTEN及PAI-1主要调控蛋白,可能参与PAI-1激活/失活PTEN,调控PI3K/AKT信号通路。6、为构建PAI-1调控体内肝癌细胞转移瘤模型,我们对OV-NC及OV-PAI-1 MHCC-97H荷瘤NOD/SCID小鼠肝脏标本进行HE染色并对两组肝癌转移灶拍照比对。相较OV-PAI-1组,OV-NC组小鼠肝脏肝癌细胞转移灶明显增多,并且质地明显较硬。使用小动物成像技术显影小鼠CDX成瘤强度及分析其肿瘤平均ROIs值。可见OV-NC组显影强度明显高于OV-PAI-1组,相较OV-NC组,OV-PAI-1组ROIs显着降低（3648±457 VS 9874±688,p<0.001）。为验证体内PAI-1调控HCC预后,绘制Kaplan-Meier生存曲线,相较OV-NC组,OV-PAI-1组小鼠生存周期明显延长（VS OV-NC,p=0.0037）。使用western-blot验证OVNC及OV-PAI-1两组小鼠荷瘤组织蛋白中PAI-1,PTEN,PI3K,p-85α,AKT及p-AKT蛋白表达水平。相较OV-NC组,OV-PAI-1组PAI-1表达明显升高,PTEN蛋白表达升高,而p-85α及p-AKT蛋白表达降低（p<0.001）,而PI3K及AKT表达水平无明显变化。结论 本课题组通过临床、体内、体外三个层面对PAI-1在肝癌中调控作用做了系统的分析、验证,证实:1、PAI-1在HCC中普遍低表达,与患者预后呈正相关;2、PAI-1参与HCC的浸润、转移、增殖表型,从而与HCC的AR表型密切相关;3、PAI-1通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路介导了肝癌细胞AR表型发生,从而促进肝癌的浸润转移能力。
余世龙[2]（2020）在《锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究》文中认为背景肺癌目前仍然是位居全球肿瘤发病率和死亡率首位的恶性肿瘤。组织类型上肺癌分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）,其中,NSCLC占肺癌总类型的80-85%,肺腺癌是NSCLC的主要病理类型。近年来尽管以EGFR-TKIs为代表的靶向治疗和以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫治疗将具有相应驱动基因的晚期NSCLC患者生存期提高到了25-30月,远远超越了传统化疗的8-10月,但因获益人群的局限性,以铂类抗癌药物为主的联合化疗仍然是大部分NSCLC患者首选的一线治疗方案,特别是不适合分子靶向治疗或免疫治疗的NSCLC患者、分子靶向治疗或免疫治疗失败的NSCLC患者以及术后需要辅助化疗的I-IIIa期NSCLC患者。顺铂（DDP）是铂类药物中最常用的化疗药物。顺铂对早期肺癌的抑制作用显着,但在短期缓解之后,几乎对顺铂治疗有效的患者都会相继出现多药耐药、复发和进一步转移等恶性进展,导致化疗失败,成为提高临床肺癌治疗效果的一大瓶颈。三十多年来,研究者对肺癌的顺铂耐药进行了大量研究并获得了重要成果,但顺铂诱导的肿瘤耐药表现出极其复杂的多因素性,其中一个严峻的现实是,针对目前已知的顺铂耐药机制研发的小分子药物并没有达到预期的临床抑癌效果。因此,进一步深入挖掘顺铂诱发的肺癌耐药机制是当前亟待解决的重要课题。为了进一步探讨NSCLC获得性耐药机制,本研究在前期成功建立人NSCLC耐药细胞A549/DDP的基础上开展相关研究,具体研究内容如下:1)NSCLC获得性多药耐药细胞A549/DDP鉴定;2)耐药相关基因的筛选和鉴定;3)ZNF300与NSCLC恶性进展;4)ZNF300促进NSCLC耐药和恶性进展的分子机制;5)淫羊藿苷和全反式维甲酸增强顺铂对肿瘤耐药细胞杀伤作用的机制。本研究将为寻找肿瘤耐药新靶点,逆转NSCLC耐药提供理论和实验依据。方法1)DDP处理A549和A549/DDP细胞后,采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位（MMP）,ATP试剂盒测定细胞内ATP含量以及DCFH-DA探针标记法检测细胞内氧自由基（ROS）,以比较DDP对两种细胞线粒体功能的影响,并用流式细胞术检测DDP诱导的细胞凋亡。采用CCK8药敏实验检测五种化疗药物对两组细胞的IC50值,鉴定NSCLC耐药细胞的多药耐药性。2)以差异倍数|FC|≥3为标准筛选基因表达谱芯片（A549/DDP vs.A549）中差异表达基因,并把该数据和DNA甲基化芯片数据进行整合,筛选候选基因,尔后采用RT-PCR验证潜在侯选基因表达情况。RT-PCR和WB进一步验证候选基因在五种肺癌细胞株及其耐药株中的表达水平。BSP法检测三株NSCLC细胞及其耐药株中ZNF300启动子甲基化水平,WB检测5-Azacitidine和Belinostat处理后各细胞中ZNF300水平。3)重组慢病毒过表达或沉默相应细胞中靶基因表达后,CCK-8试剂检测五种化疗药物对各种细胞IC50。流式细胞术检测不同浓度DDP诱导下各组细胞的凋亡情况。建立免疫缺陷鼠移植瘤模型,体内验证靶基因对NSCLC肿瘤细胞耐药性的影响。4)Transwell小室实验检测各组细胞侵袭能力,划痕愈合试验检测各组细胞迁移能力,失巢凋亡实验评估各组细胞集落形成能力和抗失巢凋亡能力,Ed U染色检测各组细胞增殖率,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期,鬼笔环肽染色激光共聚焦观察细胞骨架形态。从Oncomine、Betastasis和Biogps等生物信息数据平台下载靶基因表达数据,分析靶基因与NSCLC临床特征之间的相关性。免疫组化法检测靶基因在肺癌标本中的表达水平,并分析其临床特点相关性。5)GO、KEGG和GSEA确定表达谱芯片中与耐药细胞表型改变相关的信号通路（A549-ZNF300 vs.A549-ZNF300-NC）,WB验证相关通路核心蛋白表达。使用通路抑制剂和激动剂体外验证靶基因调控NSCLC耐药和恶性进展的分子机制。6)ICA、ATRA和DDP处理时,高内涵系统动态观察共培养细胞。WB检测药物处理后各组细胞的CD235a和CD61表达水平,SA-β-GAL染色检测药物处理后各组细胞衰老情况。RT-PCR检测DDP对衰老基因和SASP相关基因表达影响。结果1)DDP处理后,A549/DDP细胞MMP改变、ROS水平显着低于A549细胞（p<0.05）,而ATP含量显着高于A549细胞（p<0.05）。DDP诱导A549/DDP细胞的凋亡显着低于A549细胞（p<0.05）。顺铂、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、培美曲塞对A549/DDP细胞的IC50显着高于A549细胞（p<0.05）。2)A549/DDP和A549细胞的表达谱芯片数据和甲基化数据整合后,初步筛选出140个候选基因,其中包括77个启动子低甲基化上调表达基因和63个启动子高甲基化下调表达基因。RT-PCR结果显示,15个启动子低甲基化基因的表达上调,25个启动子高甲基化基因的表达下调。候选基因ZNF300在A549/DDP、H520/DDP和H1650/DDP细胞中的水平显着高于相应亲代细胞。5-Azacitidine处理后ZNF300在上述三种耐药细胞的亲代细胞中表达显着性升高。3)成功建立ZNF300过表达细胞（A549-ZNF300）和低表达细胞（A549/DDP-sh ZNF300）。五种化疗药物对ZNF300高表达细胞的IC50显着高于ZNF300低表达细胞（p<0.05）。顺铂诱导ZNF300高表达细胞的凋亡显着性低于ZNF300低表达细胞（p<0.01）。DDP处理后,ZNF300低表达细胞形成的皮下移植瘤比ZNF300高表达细胞的重量和体积显着缩小,证明ZNF300促进NSCLC肿瘤细胞耐药形成。4)体外实验表明,耐药细胞的侵袭、迁移、集落形成和抗失巢凋亡能力均显着强于药敏细胞（p<0.05）,耐药细胞的细胞增殖率显着低于药敏细胞（p<0.05）。相比药敏细胞,耐药细胞出现细胞周期阻滞（p<0.05）,且具有更明显的细胞伪足。生物学信息分析结果表明,ZNF300与NSCLC恶性进展有关。免疫组化结果提示,ZNF300高表达与NSCLC患者病理分级、临床分期、术前淋巴结转移、区域性转移和复发呈正相关,与患者OS呈负相关。5)与A549-ZNF300-NC细胞相比,A549-ZNF300细胞中大部分与生长分化因子和MAPK/ERK通路相关的基因（CD61,CD235a,p-ERK1/2,p-p38 MAPK）表达下调,而大部分与细胞周期和癌症干性相关的基因（PCNA,p15,Nanog,Oct-4）表达上调。AZD6244处理ZNF300低表达细胞后,p-ERK1/2、p-p38 MAPK和CD61下降,而p15和Nanog增加,细胞迁移、侵袭、抗凋亡和顺铂耐受性显着增强,细胞增殖减弱。而Hesperetin对ZNF300高表达细胞的作用相反。6)与药敏细胞相比,ICA和ATRA能上调耐药细胞中CD235a和CD61水平。细胞共培养发现,耐药细胞对顺铂联合ATRA或ICA的反应比药敏细胞更明显。ICA和ATRA作用下,耐药细胞被药敏细胞吞噬的比例显着高于药敏细胞被耐药细胞吞噬的比例。DDP、ICA和ATRA药物处理后,耐药细胞中SA-β-GAL阳染率明显高于药敏细胞,并且,耐药细胞中衰老相关基因和SASP相关基因的表达显着性高于药敏细胞。结论1)ZNF300是NSCLC耐药相关基因。2)ZNF300可促进肿瘤细胞恶性生长,其高表达预示NSCLC患者预后不良。3)ZNF300通过抑制MAPK/ERK信号通路调控耐药细胞缓慢周期表型和细胞分化。4)ZNF300通过抑制WEE1/MYT1和调控MYC/AURKA/BORA/PLK1信号轴激活CDK1从而调节耐药细胞的细胞周期。5)ICA和ATRA通过诱导细胞分化提高DDP对耐药细胞抑癌作用。
孙天宇[3]（2020）在《PC4通过FOXO1和FOXO3a降低肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制研究》文中指出目的1.探索转录辅助因子4（positive cofactor 4,PC4）在调控肺腺癌的生物学功能中的作用;2.阐释PC4对FOXO1和FOXO3a的调控作用以及PC4通过FOXO1和FOXO3a调控肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制;3.探究叉头框转录因子O1（forkhead O transcription factor 1,FOXO1）和叉头框转录因子O3a（forkhead O transcription factor3a,FOXO3a）在介导肺腺癌对顺铂的药物敏感性中的作用及机制,以及它们介导PI3K/Akt通路抑制剂LY294002协同增强顺铂细胞毒作用的机制。方法以肺腺癌A549、PC-9、H1299细胞为研究对象,采用慢病毒感染构建PC4、FOXO1、FOXO3a干扰或过表达的稳定细胞株,流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期,CCK-8检测细胞增殖,Transwell检测细胞侵袭,Western Blot检测相关蛋白表达,通过裸鼠皮下植瘤构建动物模型。结果在本研究中,我们发现干扰PC4表达后,PC-9细胞侵袭与自噬均减弱,经顺铂处理后细胞凋亡多于对照组,存活率低于对照组;过表达PC4后,H1299细胞侵袭能力与自噬均增强,经顺铂处理后细胞凋亡少于对照组,存活率高于对照组。动物实验发现过表达PC4后肿瘤对顺铂敏感性降低。此外,干扰PC4增加了肺癌细胞内FOXO1和FOXO3a蛋白表达,也增加了FOXO1和FOXO3a蛋白在细胞核内的分布;过表达PC4抑制了FOXO1和FOXO3a蛋白水平,也减少了细胞核内FOXO1和FOXO3a含量。FOXO蛋白抑制剂AS1842856削减了PC4干扰诱导的细胞对顺铂药物敏感性增加。PI3K/Akt通路抑制剂LY29402、蛋白酶体抑制剂硼替佐米、CBP/p300抑制剂A-485未能逆转PC4对FOXO1和FOXO3a的调控作用。免疫共沉淀结果显示PC4与FOXO3a蛋白质间有相互作用。另一方面,顺铂在早期增加了肺腺癌细胞中FOXO1和FOXO3a的表达和细胞核内含量。干扰FOXO1和FOXO3a表达在体外和体内均显着降低了细胞对顺铂的敏感性。FOXO1和FOXO3a调控顺铂诱导的细胞凋亡的机制不依赖于其下游促凋亡蛋白Bim。此外,LY294002通过增加FOXO1和FOXO3a的表达和细胞核内的分布,协同增加了顺铂的细胞毒性作用。干扰FOXO1和FOXO3a表达明显减弱了LY294002对顺铂细胞毒性作用的协同增强作用。结论1.PC4能增强肺腺癌细胞侵袭能力,促进自噬,并降低肺腺癌细胞对顺铂的药物敏感性。2.PC4通过抑制FOXO1和FOXO3a降低了肺腺癌对顺铂的药物敏感性,且PC4对FOXO1和FOXO3a蛋白的抑制作用不依赖于PI3K/Akt通路、蛋白酶体降解、CBP/p300乙酰化修饰。3.FOXO1和FOXO3a增加了肺腺癌对顺铂的敏感性,并介导了LY294002对顺铂的协同增强作用。
夏琼[4]（2020）在《切应力介导Cav-1表达水平上调与调控乳腺癌细胞抗失巢凋亡的分子机制研究》文中指出乳腺癌发病率极高,术后癌细胞易复发转移,癌细胞发生转移是乳腺癌治疗失败的主要原因之一。细胞发生转移时,从细胞基质上脱落下来进入脉管系统中,会触发程序性死亡,这种程序性死亡被叫做失巢凋亡,而抵抗失巢凋亡是乳腺癌细胞发生转移的前提。小窝蛋白1（Cav-1）是细胞膜上的主要成分之一,它作为一种力学感受器,它能够感受血液和组织液对肿瘤细胞产生的切应力,调控多种信号通路,在癌细胞的增殖,迁移,凋亡等过程中起着重要作用。但是切应力作用下,Cav-1对失巢凋亡的影响是未知的。且前期实验已发现,低切应力处理细胞后,Cav-1的表达水平会升高,但是对于低切应力如何使Cav-1的表达水平升高的机制是不明确的。因此本文想探究低切应力是如何使Cav-1表达水平升高,及在低切应力作用下,Cav-1表达水平升高将如何调控癌细胞的失巢凋亡。本文选择高转移性的乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象。首先通过Western Blot实验观察到低切应力（2 dyn/cm2）处理细胞后,悬浮培养48 h,Cav-1表达水平会升高。接着通过Cell Twitter实验、Calcein-PI双染实验及Western Blot实验比较沉默Cav-1与不沉默Cav-1的细胞中,加载切应力后细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达水平的变化,实验结果显示,在不沉默Cav-1的细胞组中,切应力处理细胞后,凋亡率下降,促凋亡蛋白Bax表达水平降低,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平升高。而在沉默Cav-1的细胞中,无论是否加载剪切力,凋亡率及相关凋亡蛋白的表达量均没有明显变化,且增殖率明显比不沉默Cav-1的细胞组低,凋亡率明显比不沉默Cav-1的细胞组高。这表明切应力是通过促进Cav-1表达,提高癌细胞抗失巢凋亡能力。随后探究了切应力是通过何种机制促进Cav-1表达,通过荧光显微镜实验及Western Blot实验发现活性氧（ROS）供体（H2O2与FeSO4）或一氧化氮（NO）供体（SNP与L-精氨酸）处理细胞后,细胞中Cav-1表达水平也会升高。且荧光显微镜实验及流式实验结果表明了切应力处理细胞后,细胞中的一氧化氮或活性氧的水平会增加。因此接着探究了切应力诱导生成的一氧化氮或活性氧是否会促进Cav-1的表达。Western Blot实验结果表明切应力诱导生成的一氧化氮或活性氧的确会促进Cav-1的表达。且清除切应力诱导生成的一氧化氮或活性氧后,细胞的凋亡率增加。这说明切应力能通过诱导一氧化氮或活性氧生成,促进Cav-1的表达,提高癌细胞抗失巢凋亡能力。最后探究了切应力诱导生成的一氧化氮或活性氧是通过什么途径影响Cav-1的表达,通过Western Blot实验及IP实验发现切应力诱导生成的一氧化氮或活性氧是通过抑制Cav-1的泛素化蛋白酶体降解途径,使细胞中Cav-1表达水平升高。综上所述:低切应力诱导生成的一氧化氮或活性氧能够抑制Cav-1的泛素化蛋白酶体降解途径,从而使细胞中Cav-1表达水平升高,进而使癌细胞产生抗失巢凋亡的能力。
闫欢[5]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中进行了进一步梳理研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
李琦玮[6]（2020）在《益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨》文中研究指明研究背景:乳腺癌居于全球女性癌症死亡原因的首位。三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一种亚型,其分子表型呈雌激素受体（ER）阴性、孕激素受体（PR）阴性以及人类表皮生长因子受体2（HER2）阴性,约占全部乳腺癌的10-20%。TNBC由于缺乏有效的治疗靶点,往往预后不佳。乙酰肝素酶（HPSE）是哺乳动物体内唯一一种用于切割硫酸乙酰肝素（HS）侧链的β-D-葡萄糖内切糖苷酶,通过切割HS侧链过程重塑细胞外基质（ECM）结构,释放具有生物活性的小分子物质,如生长因子、细胞因子等,协助肿瘤的侵袭与转移,促进肿瘤血管生成,有助于肿瘤的发展。HPSE在多种肿瘤组织中高表达,与肿瘤的恶性进展呈正相关。有研究发现,乙酰肝素酶具有调控细胞基础自噬过程的作用。自噬是一种进化保守的细胞通过溶酶体进行物质降解代谢的过程,一般认为,自噬在肿瘤的发生、发展过程中具有双刃剑的效果。在肿瘤产生之前,自噬可以清除损伤的细胞器或异常合成的蛋白质,减轻炎症反应,避免DNA损伤,预防肿瘤的发生;当体内出现肿瘤细胞时,自噬可以激活免疫细胞的抗原呈递功能,激活T细胞,增强免疫应答功能清除肿瘤细胞。然而肿瘤发生之后,肿瘤细胞可利用自噬作为其必要的生存机制,通过自噬过程为肿瘤细胞的生存和发展提供营养物质和能量支持,以此应对外周环境压力,获得增殖或转移的机会。由于TNBC目前仍然缺乏有效的治疗靶点,且易对治疗产生抵抗,寻找有效的辅助治疗手段提高TNBC的疗效十分重要。研究者对于包括传统中医药在内的补充替代治疗日益关注。千百年来,中药被广泛用于包括癌症在内的各种疾病的治疗。中药结合常规现代治疗有助于提高肿瘤疗效,减轻治疗毒副作用,改善肿瘤患者的生存质量。郁仁存教授、王笑民教授根据多年临证经验总结“益气活血解毒法”,并据此治则创立相关方剂,在临床上治疗各类恶性肿瘤取得了良好的疗效。基于益气活血解毒法,我们选择四种中药单体联合应用并评价其疗效。这些单体包括黄芪甲苷（提取自黄芪,代表“益气”）,龙葵碱（提取自植物龙葵,代表“解毒”）,莲心碱（提取自莲子,代表“解毒”）,川芎嗪（提取自川芎,代表“活血化瘀”）。我们将这四种单体组合简称“SANT”,并对其在肿瘤体内外模型中进行研究。研究目的:评价益气活血解毒中药单体组合SANT对MDA-MB-231 Hpa/Mock肿瘤的影响并分析相关机制。研究方法:在本研究中,我们首先利用数据库进行肝素酶表达与乳腺癌患者生存的相关性分析。利用MTS、trans-well和划痕实验评价SANT对肿瘤细胞增殖、迁移的影响。共聚焦实验用于观察SANT处理后231-Hpa细胞中GFP-RFP-LC3蛋白的变化。免疫印迹实验用于检测相关蛋白标志物表达。动物实验用于评价SANT在体内的疗效与安全性。最后我们采用人类自噬相关PCR微阵列和血管生成蛋白微阵列用于相关机制探索。研究结果:1.HPSE在多种癌症类型中高表达,乳腺癌中HPSE mRNA表达水平超过正常乳腺组织2倍以上。HPSE高表达的乳腺癌患者无复发生存期（P=1.7e-12）与总生存期（P=0.00016）都显着短于HPSE低表达的乳腺癌患者。TNBC患者的HPSE转录效率高于非三阴性乳腺癌患者。2.肿瘤细胞231-Hpa具有显着上调的肝素酶水平,231-Hpa细胞内LC3B-I/-Ⅱ转化率也显着高于231-Mock细胞（P=0.0003）。在乳腺癌原位移植瘤模型中,免疫荧光显示231-Hpa移植瘤HPSE表达显着升高;231-Hpa组肿瘤负荷（0.608g 与 0.437g,每组≥6 只,P=0.0242）,肺重（0.167g 与 0.148g,每组≥6只,P=0.0164）均显着高于对照组。231-Hpa组Ki-67染色与CD31染色均显着高于 231-Mock 组。3.体外实验:经过24小时处理,龙葵碱在0-64μM浓度范围将231-Mock细胞生存率降低近50%,231-Hpa细胞生存率降低约60%;经过48小时处理,龙葵碱对于231-Mock细胞抑制率为68.93%,对231-Hpa细胞抑制率为81.06%。甲基莲心碱（NEF）处理细胞24-48h后也达到60-80%的抑制率。黄芪甲苷和川芎嗪对肿瘤细胞增殖影响不明显。在Trans-well实验中,与对照组相比,SANT对231-Hpa细胞迁移的抑制率达79%,对231-Mock细胞迁移抑制率达72%。划痕实验也取得类似的结果,经过24小时SANT处理,231-Hpa细胞的划痕愈合面积下降了 51.5%,231-Mock细胞的划痕愈合面积下降了 40.6%。SANT在免疫印迹实验中可轻度降低活性形式HPSE的表达,对惰性形式HPSE的影响不明显。SANT和PI-88（肝素酶抑制剂）在体外均可轻微降低肝素酶活性带的表达。在荧光共聚焦观察实验中,转入GFP-RFP-LC3B标记的231-Hpa细胞经过SANT药物处理12h后,可以观察到大量LC3蛋白与溶酶体融合形成的黄色斑点,表示自噬过程的发生。Western实验可见,SANT处理细胞不同时间后引起了 LC3B-Ⅱ表达的升高,SANT与自噬抑制剂CQ联用可使LC3B-Ⅱ表达进一步升高,表明自噬流量的发生。4.体内实验中,SANT与PI-88均可以显着抑制肿瘤的生长（SANT与对照组,360.59 与 598.32mm3,P=0.0381;PI-88 与对照组,3 64.93 与 598.32mm3,P=0.0344）。SANT、PI-88组肿瘤重量较对照组也明显下降（SANT与对照组,0.29与 0.54g,P=0.0046;PI-88 与对照组,0.37 与 0.54g,P=0.0262）。肿瘤组织的免疫组化染色中,与对照组相比,SANT显着降低了 Ki-67表达（17.76±3.41%与7.52±2.02%,P<0.0001）,效果优于PI-88组。SANT明显抑制了微血管（MVD）（57%,P<0.0001）与血管生成拟态（VM）（33%,P=0.0019）的形成,但 PI-88抑制血管生成的效果更佳。安全性评价中,SANT在体内对小鼠的生化指标无明显影响。5.机制探索:对肿瘤组织进行人类自噬相关基因PCR微阵列检验结果显示,SANT处理显着上调了部分自噬过程相关基因,包括ATG10,ATG16L1,ATG16L2,ATG4B,ATG4D,ATG9A等,而PI-88处理组显着下调了一些自噬相关基因如AMBRA1,ATG16L1,ATG4D,BAD,BCL2L1等。肿瘤血管生成相关蛋白微阵列研究结果显示,SANT治疗组中HB-EGF,thrombospondin-2,amphiregulin,leptin,IGFBP-9,EGF,coagulation factor Ⅲ,MMP-9（前体及活性形式）表达上升,serpin E1,platelet factor 4表达下降。结论:肝素酶（HPSE）高表达常见于侵袭性乳腺癌患者中,与不良预后相关。HPSE促进肿瘤增殖,引起小鼠体内肺转移增多,在体外提高了肿瘤细胞自噬水平。体外研究中,SANT抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,并增强肿瘤细胞的自噬水平。体内实验中,SANT在小鼠体内抑制肿瘤生长与血管生成过程。SANT对自噬相关基因或血管生成相关蛋白表达具有调控作用,可能与其肿瘤抑制作用相关。SANT是一种具有前景的用于三阴性乳腺癌辅助治疗的药物,这种药物组合研究拓展了天然化合物的应用思路。
谷旭宇[7]（2020）在《长链非编码RNA LINC01207调控胃癌肝转移作用及机制研究》文中研究表明目的:胃癌是我国常见恶性肿瘤之一,其高发病率和高死亡率严重威胁人类的健康。根据2018年的最新癌症统计数据表明,胃癌（GC）在我国的发病率及死亡率均处于第二位。研究资料显示,肝转移是胃癌治疗失败的主要原因之一。出现肝转移后,患者的生存期很短,未治病例的生存仅为3月5月,从而给临床诊治带来较大的难度。因此,从分子水平早期发现癌细胞肝转移,并探讨其分子机制,将可能为胃癌肝转移预警预测、干预阻断提供新的分子标志或靶点,从而提高胃癌的综合诊疗水平。研究提示,自噬作为肿瘤发生发展中重要的影响因素,能够增强肿瘤的抗失巢凋亡能力,自噬受到相关分子的调控。研究发现,抗失巢凋亡是肿瘤细胞获得侵袭、转移能力的首要因素。课题组前期利用Human LncRNA Microarray建立胃癌肝转移相关LncRNAs表达谱,发现胃癌患者体内LncRNA LINC01207呈现高表达状态,但相关机制的研究并未获得突破性进展。方法:1.选择胃癌同时性和异时性肝转移胃癌患者各3例,采用高通量lncRNA芯片检测组织中癌及其配对的癌旁组织中lncRNAs的表达情况。从中选择高表达的lncRNA LINC01207进行研究。2.候选分子LINC01207临床意义研究:对150对胃癌及其癌旁配对正常组织进行检测,运用荧光实时定量PCR法,检测LINC01207、自噬相关分子LC3B、ATG7基因mRNA水平,分析LINC01207与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、Lauren分型、组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、肝转移数目、肝转移发生时间、TNM分期、幽门螺杆菌（HP）感染、CEA水平及自噬相关分子LC3B、ATG7基因相关性。3.LINC01207细胞水平研究:（1）检测正常胃细胞株GFS-1及常见胃癌细胞株,运用定量PCR法,确定LINC01207表达情况,选择AGS及BGC7901用于后续研究。（2）构建LINC01207小干扰RNA及过表达载体,脂质体转染法处理AGS、BGC7901细胞株,观察下调、上调对增殖、克隆、迁移、侵袭影响,并利用裸鼠模型,观察了对肝转移的影响。4.LINC0120分子机制研究:从自噬及失巢凋亡抵抗角度,探讨了LINC01207过表达促进胃癌肝脏转移的分子机制。结果:1.LncRNA芯片检测发现,与正常组织比较,LINC01207在胃癌中高表达,为36.1108±0.0005（P=0.0128）。2.对150例胃癌及其配对正常组织的检测结果,按照LINC01207表达情况,将标本平均分为两组。结果发现,LINC01207与肿瘤浸润深度（P=0.009）、淋巴结转移（P=0.001）、TNM分期（P=0.000）、肝转移个数（P=0.022）、胃癌术后肝转移发生时间（P=0.003）明显相关。还发现,LINC01207高表达与自噬相关分子ATG7表达水平（P=0.000）及LC3表达水平（P=0.002）密切相关,但与性别（P=0.403）、年龄（P=0.239）、肿瘤部位（P=0.134）、肿瘤直径（P=0.102）、Lauren分型（P=0.934）、分化程度（P=0.106）、癌胚抗原（CEA）（P=0.361）无明显相关。3.胃癌细胞不同于GES-1,LINC01207虽有所增高,但在不同细胞系中程度不同。后续应用AGS和SGC7901为细胞研究模型。4.分子表型研究显示:胃癌AGS和SGC7901细胞经siRNA转染处理后,与空白对照组及空载对照组比较,siRNA组癌细胞增殖明显减弱,克降数量大幅度减少,细胞迁移受到抑制,侵袭能力显着下降。而分子过表达组呈现相反现象,与空白对照组及空载对照组比较,LINC01207组癌细胞增殖明显,克隆数量大幅度增加,细胞迁移有所增强,侵袭能力显着提升。动物实验存在同样现象,LINC01207 siRNA组裸鼠肝转移灶减少,而过表达组肝转移灶增多。还发现,与对照组比较,LINC01207过表达对胃癌失巢细胞凋亡抵抗具有促进作用;LINC01207过表达组细胞自噬体明显增加,自噬相关分子LC3B、ATG7明显增加。5.分子机制研究发现,单纯转染过表达LINC01207组细胞失巢凋亡数明显减少,而LINC01207、ATG7 siRNA共转染组细胞失巢凋亡数升高。WB检测发现,单纯转染过表达LINC01207组LC3B、survivin蛋白明显升高,而共转染组LC3B、survivin蛋白明显降低。结论:1.体内外研究结果提示,LINC01207可能是胃癌肝转移的重要分子标志物之一。2.LINC01207可能通过激活自噬,后者促进失巢凋亡抵抗,从而促进胃癌肝转移。
王猛[8]（2020）在《shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究》文中认为目的:1、研究肌动蛋白丝相关蛋白1相似蛋白1（AFAP1L1）在非小细胞肺癌（NSCLC）表达的临床意义。2、探讨shRNA沉默AFAP1L1对肺腺癌A549细胞增殖、细胞周期、凋亡和侵袭的影响,并初步探讨AFAP1L1参与调控肺癌发生进展的分子机制。3、通过构建慢病毒表达载体介导shRNA沉默AFAP1L1基因,观察其对肺癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,为肺癌的基因治疗提供实验依据。方法:1、应用Max Vision免疫组化技术分别检测84例癌组织和69例正常组织中AFAP1L1蛋白的表达水平,分析AFAP1L1蛋白在癌组织和正常组织的表达差异及其与患者临床病理特征、病理分期的关系。2、利用shRNA干扰技术敲减肺腺癌细胞株A549中的AFAP1L1基因,抑制其在细胞内的转录翻译水平。随后使用Celigo图像细胞仪检测细胞增殖,应用流式细胞术评估细胞周期,以Annexin V（锚定蛋白）作为标记,测定细胞凋亡水平。通过Transwell实验研究AFAP1L1敲减肺腺癌细胞侵袭能力。进一步通过Path Scan细胞内信号转导阵列分析AFAP1L1敲减A549细胞的下游癌症信号蛋白。3、构建重组AFAP1L1基因的shRNA慢病毒表达载体。通过裸鼠成瘤实验体内验证AFAP1L1敲减对肺腺癌细胞增殖侵袭能力的影响。结果:1、通过Max Vision免疫组化法我们在84例NSCLC癌组织中检测62例AFAP1L1的不同程度表达（73.8%）,而在69例正常组织中仅检测到16例（23.2%）。AFAP1L1在NSCLC癌组织中高表达,在正常组织中低或无表达（χ2=38.84且P<0.005）,具有显着统计学差异。2、进一步分析发现,AFAP1L1的表达与肺癌病理分期相关。在I期、II期NSCLC患者组织标本中分别检测到53.8%和65.6%存在AFAP1L1的表达,而在III期+IV期NSCLC病人中AFAP1L1的表达率为88.5%。具有明显统计学差异（χ2=5.596且P<0.05）。3、AFAP1L1的表达水平与肺癌淋巴结转移、胸膜侵犯和脉管浸润相关。存在淋巴结转移的患者标本的AFAP1L1表达阳性率为85.1%,而不存在淋巴结转移的患者标本的AFAP1L1表达阳性率为62.2%。组间对比结果为χ2=4.653且P<0.05,存在统计学差异。有胸膜侵犯组和无胸膜侵犯组的阳性率分别为82.5%和61.4%,差异有统计学意义（χ2=4.416,P<0.05）。有脉管浸润组和无脉管浸润组的阳性率分别为82.1%和57.1%,有统计学差异（χ2=4.811,P<0.05）。此外,AFAP1L1蛋白的表达水平与患者的病理类型、性别、年龄无统计学差异（P>0.05）。4、成功构建AFAP1L1-shRNA慢病毒表达载体。研究发现敲低肺腺癌A549细胞AFAP1L1基因后明显抑制其增殖和侵袭能力;在细胞周期方面研究发现敲低AFAP1L1基因促进细胞周期向G1和G2/M期转变,G1和G2/M期细胞比例增加;与阴性对照的shRNA转染细胞相比,细胞凋亡在AFAP1L1-shRNA转染的细胞中的增加。Transwell测定结果显示,与空白对照组和质粒对照组相比,干扰实验组穿膜的细胞数明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。使用Path Scan细胞内信号转导阵列分析,我们发现AFAP1L1的下调显着激活了P38和caspase3,并抑制PRAS40活化。5、利用活体成像技术通过裸鼠成瘤实验对移植瘤的生长情况分析显示,空白对照组、实验组肿瘤体积分别为:619.80±278.97mm3、289.50±47.07mm3,差异有显着性差异。空白对照组、实验组肿瘤重量分别为:0.966±0.185g、0.583±0.057g,实验组肿瘤重量明显低于空白对照组。此外,通过对实验组和空白对照组进行活体成像,结果显示相比空白对照组,实验组荧光表达量降低（P<0.05）。结论:1、AFAP1L1蛋白表达水平在NSCLC癌组织中显着高于正常组织,并且与NSCLC的病理分期、胸膜侵犯、淋巴结转移、脉管浸润密切相关,与性别、年龄、肿瘤类型无统计学意义。2、AFAP1L1加速肺腺癌细胞周期进程,抑制肺癌细胞凋亡,促进肺癌细胞的侵袭。3、RNA干扰作为一种高效基因编辑技术,可以沉默肺癌细胞目的基因的表达。构建稳定表达靶基因RNA干扰的慢病毒载体（shRNA-AFAP1L1-LVs）进行后续实验发现,于在体内外特异地抑制人肺癌细胞系中AFAP1L1基因的表达,可以抑制人肺腺癌细胞A549细胞株的生长增殖侵袭能力。利用活体成像技术,验证了沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞生物学行为的影响。为进一步研究肺癌细胞的恶性行为奠定基础,为揭示肺癌发生发展的分子机制提供更多证据,AFAP1L1有成为肺癌基因疗法中作用靶点的潜力。
李宜儒[9]（2020）在《MIST1在人类黑色素瘤中与失巢凋亡的关系作用及机制研究》文中提出研究背景:恶性黑色素瘤在近十年来该发病率急速的攀升增长,我国黑色素瘤多原发于皮肤（60%70%）和粘膜（22.6%）,其中皮肤恶性黑色素瘤（CMM）为恶性黑色素瘤中最常出现的类型,占皮肤恶性肿瘤中的排名第三名,是来源于黑素细胞,恶性程度较高的恶性肿瘤。其中澳大利亚的发病率明显是最高的。目前已知的危险因素有:1.阳光辐射:是CMM最重要的的病因。一般多聚集在皮肤长期曝光部位,以发病部位的比例而言,男性大多是以躯干部为主,其中以上背部为较常见的好发部位。而女性的部分,除了上背部之外,其中反而较常见的好发部位是小腿的位置。2.性激素及性别的差异:男性病患的生存率低于女性病患。有研究报告指出,雌激素及雌激素前体其受体,经由性激素可影响皮肤恶性黑色素瘤。3.遗传相关因素:有超过一半以上患者亲属也成为患有皮肤恶性黑色素瘤的病患,透过基因检测,可发现其中抑癌基因P16明显的突变。4.肤色种族差异因素:在发病患者中可发现,一些明显的特征发病率高于其它人,其中最显而易见的就是白种人的发病率远高于其它肤色的人种,尤其是与黑人相比。5.其它可能因素:内分泌的严重失调,任何因素导致的免疫功能低落,摩擦部位的不当刺激,病毒感染刺激等。根据之前一些研究报告中提示,在疾病发展过程中,抵抗失巢凋亡是肿瘤细胞转移的关键步骤。因为肿瘤细胞对失巢凋亡的不敏感,肿瘤细胞可以通过失巢凋亡逃逸在血管和淋巴中得以存活,最终在远端组织中形成克隆。近年来,随着黑色素瘤相关基因突变和详细深入研究的发现,靶向治疗为恶性黑色素瘤带来了新的方向。研究目的:明确MIST1与失巢凋亡是否具有相应的关联性,探讨人类正常细胞和黑色素瘤细胞中MIST1和SNAI1之间具体的关联性;并通过各种细胞学实验探讨MIST1和SNAI1是否有助于人类黑色素瘤细胞脱离细胞外基质并绕过失巢凋亡,进而造成其促进或抑制远端转移的形成;并试阐述MIST1和SNAI1降低人类黑色素瘤细胞对失巢凋亡敏感性的分子机制。研究方法:1.首先使用人类黑素瘤细胞系A375和MV3及人体正常细胞HUVEC和NHEM进行细胞培养,通过细胞学实验进行细胞黏附测定,提取蛋白进行Western blot,及RNA分离和PCR等实验方法来检测MIST1和SNAI1在人类黑色素瘤细胞和正常细胞中的表达水平。2.使用293T细胞慢病毒包装系统,然后使用此系统转染HUVEC和NHEM以内源性表达MIST1和SNAI1,促使MIST1和SNAI1过度表达,通过Wesrern blot确认其过表达,后藉由细胞行为实验检测MIST1和SNAI1过度表达后细胞粘附力及其细胞凋亡水平的粘附力与失巢凋亡的关系。3.采用sh RNA降低A375和MV3人类黑素瘤细胞中MIST1和SNAI1的表达,为通过免疫印迹分别检测MIST1及SNAI1的敲除,并进行纤连蛋白粘附检测细胞学实验以确认MIST1及SNAI1对ECM附着的影响。4.藉由MIST1及SNAI1在HUVEC和NHEM细胞中异位过度表达,及在A375和MV3中的个别载体敲除以确定MIST1及SNAI1这两者之间的相关性及其表达与对失巢凋亡的影响。5.为研究降低其失巢凋亡敏感性的分子机制,检测了PI3K的下游底物Akt激酶的活化。采用LY294002竞争性抑制剂,抑制AKT磷酸化（Ser473）后,通过相应的Wesrern blot检测及细胞学实验来检验MIST1对失巢凋亡敏感性。6.MIST1在A375和MV3中的载体敲除,检测PTEN在人类黑素瘤细胞系A375和MV3中的表达及p-AKT（Ser473）水平,接着靶向PTEN的sh RNA用于降低PTEN表达,检测p-AKT（Ser473）水平及其对由MIST1敲除引起的失巢凋亡的影响。7.为检测MIST1刺激SNAI1的表达的具体机制,根据JASPAR数据库预测,MIST1结合基序存在于ENCODE数据库预测的结合序列中。采用ChIP测定法来检测是否与PCR方法结果相同,来证实MIST1可调控SNAI1表达具体机制。研究结果:1.人类黑素瘤细胞系A375和MV3中,MIST1和SNAI1在RNA和蛋白质中高度表达。正常细胞和肿瘤细胞,在具有低附着表面的培养皿中培养24小时后,MIST1和SNAI1的表达均显着增加,保留基质可刺激细胞表达MIST1和SNAI1。2.使用293T细胞慢病毒包装系统转染HUVEC和NHEM以内源性表达MIST1和SNAI1使其过表达后,皆导致正常人HUVEC和NHEM对纤连蛋白的粘附力降低已及失巢凋亡的抗性明显提高。3.内源性MIST1和SNAI1的敲除抑制人类黑素瘤细胞的锚定非依赖性并提高了其对失巢凋亡的敏感性。4.在正常细胞中MIST1过度表达能促使SNAI1表达增加,但反之则不成立。在增强MIST1或SNAI1的表达后,失巢凋亡抗性明显提高。在人类黑色素瘤细胞MIST1的敲除降低A375和MV3中SNAI1的表达,但SNAI1的敲除不影响MIST1水平。在敲除MIST1或SNAI1后,对失巢凋亡的抗性明显降低。MIST1的变化改变SNAIL1,而非相反。5.正常人HUVEC细胞系中MIST1过度表达后,Ser473残基处的AKT磷酸化明显增强。MIST1和SNAI1对PTEN的下调作用。LY294002作为PI3K的竞争性抑制剂,通常用于抑制p-AKT（Ser473）,本研究中采用10μM浓度以抑制p-AKT（Ser473）。在抑制AKT磷酸化（Ser473）后,MIST1引起的对失巢凋亡敏感性降低能力得以恢复。敲除MIST-1后,PTEN在人类黑素瘤细胞系A375和MV3中的表达增加。相应地,p-AKT（Ser473）水平明显降低。靶向PTEN的shRNA用于降低PTEN表达,这消除MIST1敲除导致的p-AKT（Ser473）水平的降低。此外,PTEN的敲除同时抑制由MIST1敲除引起的失巢凋亡增加。6.根据JASPAR数据库预测,MIST1结合基序存在于ENCODE数据库预测的结合序列中。采用ChIP测定法证实MIST1可直接调节SNAI1。选择靠近转录起始位点的七个区域。运用蛋白G PLUS-琼脂糖与MIST1抗体的结合,提取DNA结合片段。采用Ch IP测定法,利用MIST1在HUVEC和NHEM中过度表达,SNAI1启动子上R5片段的扩增强度显着高于其它DNA片段的扩增强度,这与PCR方法证实的一致。用荧光素酶报告载体转染高度表达MIST1的A375和MV3。含有-1,199至-753bp片段的载体显示荧光素酶报告信号增强。研究结论:1.在正常和黑色素瘤细胞中,MIST1表达与SNAI1存在正相关,MIST1和SNAI1可以帮助细胞在丧失固定到其物理环境后绕过失巢凋亡。2.MIST1和SNAI1能够促进正常人细胞的锚定非依赖性。失去锚定后,MIST1和SNAI1保护细胞免于失巢凋亡。3.MIST1和SNAI1有助于人类黑素瘤细胞从ECM分离并绕过失巢凋亡,这可能导致发生远处转移。4.MIST1是SNAI1的上游基因,MIST1可通过调节SNAI1促进细胞的锚定非依赖性。5.PTEN/Akt信号通路参与MIST1和SNAI1介导人类黑素瘤细胞抵抗失巢凋亡的机制。6.MIST1通过结合其启动子调节SNAI1的表达,最终赋予人类黑素瘤细胞对失巢凋亡抗性。
张文思[10]（2019）在《DLC-1、FAK在结肠癌、结肠腺瘤中的表达及意义》文中研究表明目的:本研究宗旨为联合检测DLC-1与FAK基因在正常结肠黏膜、结肠腺瘤及结肠癌三种组织中的表达水平,探讨二者在结肠粘膜癌变过程中的相互关系及临床意义,为结肠恶性肿瘤的早期诊断提供一定的标记物,为结肠癌的治疗提供一定的理论基础。方法:1实验分组:本实验分三组,正常对照组为30例,结肠腺瘤组为30例,结肠癌组为30例。2标本收集:收集时间范围为2017年12月-2018年10月;所有标本采集均来自就诊于内蒙古包钢医院（内蒙古医科大学第三临床医学院）消化科的消化系统疾病患者,行结肠镜检查或者治疗时于镜下取得的结肠黏膜标本,结合病理诊断进行分组,分别为正常结肠、结肠腺瘤以及结肠癌3种组织学类型。3实验方法:本实验采用Real-Time PCR技术检测DLC-1与FAK在上述三种组织类型中的表达水平。结果:1 DLC-1 mRNA在正常结肠粘膜组、结肠腺瘤组及结肠癌组中的相对表达量分别为0.889±0.090、0.614±0.071、0.216±0.059,呈逐渐下降趋向,具有非常显着差异性（P<0.001）;2 FAK mRNA在正常结肠黏膜组、结肠腺瘤组及结肠癌组中的相对表达量分别为0.674±0.219、1.329±0.375、3.136±0.454,呈逐渐上升趋向,具有非常显着差异性（P<0.001）;3在结肠正常组,DLC-1与FAK mRNA的表达呈显着地负相关（r=-0.394,P<0.05）;在结肠腺瘤组,DLC-1与FAK mRNA的表达呈非常显着负相关（r=-0.672,P<0.001）;在结肠癌组,DLC-1与FAK mRNA的表达呈非常显着负相关（r=-0.812,P<0.001）。结论:1 DLC-1 mRNA在正常组、腺瘤组及腺癌组中表达呈逐渐下降趋向,表明该基因表达异常与结肠腺瘤癌变过程具有相关性,可能发挥一定的抑癌作用,提示DLC-1的表达水平在一定程度上可反映出结肠腺瘤发生癌变的风险性,可作为结肠癌早期诊断的主要参考指标之一。2 FAK mRNA在正常组、腺瘤组及腺癌组中表达呈逐渐上升趋向,提示该基因过表达可能促进结肠腺瘤癌变过程,因此,我们可通过干扰该基因的表达进一步阻碍或延缓结肠腺瘤发展为结肠癌,对结肠癌的早期诊断及治疗有重要意义。3 DLC-1与FAK在结肠腺瘤癌变过程中发挥作用,且二者关系呈负相关,提示DLC-1可能直接或间接地下调FAK的表达,二者共同影响结肠腺瘤癌变过程,通过联合检测DLC-1与FAK mRNA的表达可能有助于结肠癌的早期诊断,为治疗提供新的方向及思路。
二、蛋白酪氨酸磷酸化水平与乳腺癌细胞株抗失巢凋亡特性的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白酪氨酸磷酸化水平与乳腺癌细胞株抗失巢凋亡特性的关系（论文提纲范文）
（1）PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 PAI-1在肝癌中的临床意义 |
| 1.实验材料及方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 1.3 S-P(streptavidin-perosidase)法免疫组织化学技术 |
| 1.4 IHC切片定性及定量方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 生物信息学分析PAI-1在肝癌组织中m RNA水平表达 |
| 2.2 生物信息学分析PAI-1在肝癌患者预后 |
| 2.3 IHC检测PAI-1在临床HCC患者中的表达情况及生存预后 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三章 PAI-1在肝癌细胞系中的作用及介导anoikis现象的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要试剂溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 构建悬浮细胞模型 |
| 2.2 细胞培养、传代、冻存 |
| 2.3 RT-PCR(适时定量聚合酶链扩增反应) |
| 2.4 Western Blot(蛋白印迹)检测 |
| 2.5 RNAi慢病毒构建与过表达慢病毒构建 |
| 2.6 流式Annexin V-FITC/PI法检测HCC细胞系anoikis表型 |
| 2.7 划痕实验验证PAI-1在HCC细胞系中的增殖、迁移表型 |
| 2.8 Transwell实验验证PAI-1在HCC细胞系中的浸润、转移表型 |
| 2.9 CCK8测定PAI-1在HCC细胞中增殖表型以及筛选PAI-1抑制剂IC50 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 PAI-1在肝癌细胞系中表达水平 |
| 3.2 验证待遴选肝癌细胞系悬浮表型 |
| 3.3 PAI-1在遴选细胞系中敲减/过表达细胞悬浮后蛋白表达水平 |
| 3.4 PAI-1调控HCC细胞系的anoikis表型 |
| 3.5 PAI-1调控HCC细胞的浸润转移表型 |
| 3.6 PAI-1抑制剂回复HCC细胞的浸润转移表型 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第四章 PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控HCC细胞AR及生物信息学工具预测PAI-1调控相关蛋白的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要试剂溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 PAI-1通过激活PTEN调控PI3K/AKT信号通路来调控HCC细胞AR表型 |
| 3.2 PTEN特异性抑制剂(bpV(HOpic))回复PAI-1调控PTEN蛋白来激活/失活PI3K/AKT信号通路来调控HCC细胞AR表型 |
| 3.3 生物信息学工具预测PAI-1在HCC调控互作蛋白 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第五章 体内验证PAI-1调控HCC细胞AR表型 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验器械 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物蛋白提取 |
| 2.2 构建肝癌细胞肝内转移模型及标本处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 构建PAI-1调控体内肝癌细胞转移瘤(cell-line-derived xenograft,CDX)模型 |
| 3.2 体内验证PAI-1表达影响肝癌细胞转移瘤(cell-line-derived xenograft,CDX)模型的小鼠生存周期 |
| 3.3 体内验证PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控HCC浸润转移表型 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 PAI-1在肿瘤浸润转移中作用的研究 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 NSCLC获得性多药耐药细胞A549/DDP鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 NSCLC耐药相关基因的筛选及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ZNF300与NSCLC恶性进展 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ZNF300促进NSCLC耐药和恶性进展的分子机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 淫羊藿苷和全反式维甲酸增强顺铂对NSCLC肿瘤耐药细胞杀伤作用的机制探讨 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料和方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 肿瘤化疗耐药机制的研究现况 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 锌指蛋白家族的结构与功能以及ZNF300的研究现况 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的成果 |
| 致谢 |
（3）PC4通过FOXO1和FOXO3a降低肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 略缩词表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 转录辅助因子4对肺腺癌的恶性表型和顺铂敏感性的影响 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 FOXO1和FOXO3a在肺腺癌细胞对顺铂药物敏感性中的调控作用及机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 PC4 通过FOXO1和FOXO3a调控肺腺癌细胞对顺铂药物敏感性的机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 重新评估FOXO蛋白在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（4）切应力介导Cav-1表达水平上调与调控乳腺癌细胞抗失巢凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 失巢凋亡 |
| 1.1.1 癌细胞转移 |
| 1.1.2 失巢凋亡 |
| 1.1.3 抗失巢凋亡 |
| 1.2 Caveolin-1、ROS/NO与肿瘤的发生发展 |
| 1.2.1 Caveolin-1 与肿瘤细胞 |
| 1.2.2 NO与肿瘤细胞 |
| 1.2.3 ROS与肿瘤细胞 |
| 1.3 肿瘤微环境与切应力 |
| 1.3.1 肿瘤微环境 |
| 1.3.2 流体切应力 |
| 1.3.3 流体切应力与Caveolin-1 |
| 1.3.4 流体切应力与ROS和NO |
| 1.3.5 流体切应力与细胞凋亡 |
| 1.4 本课题的研究目标与研究内容研究 |
| 第二章 低切应力通过上调Cav-1的表达调控乳腺癌细胞的失巢凋亡 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 主要溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞悬浮培养 |
| 2.3.3 Cell Twitter测细胞增殖 |
| 2.3.4 Calcein与 PI染色实验 |
| 2.3.5 免疫印迹(Western Blot) |
| 2.3.6 软件及统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 切应力通过上调Cav-1的表达促进乳腺癌细胞增殖 |
| 2.4.2 切应力通过上调Cav-1表达抵抗失巢凋亡 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 低切应力通过诱导生成NO或 ROS介导Cav-1 表达上调 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Cell Twitter测细胞增殖 |
| 3.3.2 Calcein与 PI染色实验 |
| 3.3.3 免疫印迹(Western Blot) |
| 3.3.4 检测一氧化氮 |
| 3.3.5 检测活性氧 |
| 3.3.6 免疫沉淀(immunoprecipitation) |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 切应力通过诱导ROS的生成促进Cav-1 表达水平上调 |
| 3.4.2 ROS通过影响Cav-1 蛋白酶体途径影响其表达 |
| 3.4.3 切应力通过诱导NO的产生促进Cav-1表达水平上调 |
| 3.4.4 NO通过影响Cav-1蛋白酶体途径影响其表达 |
| 3.4.5 NO与 ROS都是通过影响Cav-1 泛素化水平影响其表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 后期展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（5）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（6）益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述一 天然药物调控自噬治疗肿瘤及基于益气活血解毒理论的应用 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 自噬影响肿瘤发生与转移的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 肝素酶与血管生成相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述四 三阴性乳腺癌肿瘤异质性与治疗研究进展 |
| 辨文献 |
| 第二部分 乙酰肝素酶对MDA-MB-231乳腺癌肿瘤生长、自噬、血管生成的干预作用 |
| 实验一 乙酰肝素酶对乳腺癌患者生存情况的影响分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 乙酰肝素酶对MDA-MB-231细胞自噬水平的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 MDA-MB-231乳腺癌乳垫原位移植瘤模型建立以及乙酰肝素酶表达水平对体内肿瘤生长及血管生成的干预作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 益气活血解毒中药对HPSE高表达乳腺癌体内外的干预作用及自噬及血管生成方面的机制研究 |
| 实验一 SANT对乳腺癌细胞生长的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 SANT对乳腺癌细胞迁移的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 SANT对乳腺癌细胞肝素酶表达及自噬的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验四 SANT对小鼠肿瘤生长的抑制作用及安全性评价 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验五 SANT对肿瘤血管生成的干预作用及机制分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验六 SANT对肿瘤组织自噬相关基因表达的影响及分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）长链非编码RNA LINC01207调控胃癌肝转移作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 胃癌的流行病学及诊疗现状 |
| 1.2 胃癌肝转移 |
| 1.2.1 胃癌肝转移的诊断和治疗 |
| 1.2.2 胃癌肝转移的生物学过程 |
| 1.3 LncRNA在胃癌肝转移中的研究 |
| 1.3.1 LncRNA的生物学特性 |
| 1.3.2 LncRNA参与胃癌的发生发展 |
| 1.3.3 LncRNA通过EMT调节胃癌肝转移 |
| 1.4 失巢凋亡抵抗:胃癌肝转移的必要前提 |
| 1.4.1 整合素和失巢凋亡抵抗 |
| 1.4.2 EMT和失巢凋亡抵抗 |
| 1.4.3 生长因子受体和失巢凋亡抵抗 |
| 1.5 自噬与胃癌肝转移 |
| 1.6 本研究目的、思路与内容 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究思路及内容 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病例来源及临床病理资料 |
| 2.1.2 组织样本 |
| 2.1.3 胃癌细胞株 |
| 2.1.4 主要试剂及缓冲液 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织总RNA抽提 |
| 2.2.2 RNA质量检测 |
| 2.2.3 LncRNA芯片杂交 |
| 2.2.4 芯片洗涤与扫描 |
| 2.2.5 芯片数据的采集及分析 |
| 2.2.6 组织lncRNA qRT-PCR检测 |
| 2.2.7 LINC01207 对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 2.2.8 统计 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 胃组织总RNA的提取和质控 |
| 3.2 LncRNA芯片初筛结果 |
| 3.3 LncRNA芯片检测结果 |
| 3.4 LINC01207 定量PCR体系的构建 |
| 3.5 LINC01207 在胃癌组织中表达及临床意义 |
| 3.6 LINC01207 在正常胃细胞株及不同胃癌细胞系中表达 |
| 3.7 LINC01207 对胃癌增殖的影响 |
| 3.8 LINC01207 对胃癌细胞克隆形成的影响 |
| 3.9 LINC01207 对胃癌细胞迁移的影响 |
| 3.10 LINC01207 对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 3.11 LINC01207 过表达胃癌细胞肝转移及自噬相关基因ATG7 的影响 |
| 3.12 LINC01207 对胃癌细胞失巢凋亡的影响 |
| 3.13 LINC01207 升高或降低对胃癌细胞自噬的影响 |
| 3.14 LINC01207 通过自噬促进胃癌细胞失巢凋亡抵抗 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 胃癌肝转移的预后 |
| 4.2 LncRNA芯片筛选-LINC01207 临床意义 |
| 4.3 LncRNA LINC01207 在胃癌中的表达及临床意义 |
| 4.4 LINC01207 对胃癌增殖、侵袭、迁移的影响 |
| 4.5 分子机制方面的讨论 |
| 4.5.1 LINC01207 与自噬 |
| 4.5.2 LINC01207 与失巢凋亡抵抗 |
| 4.5.3 LINC01207 促进胃癌生物学行为的机制 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的学术论文及其他科研成果 |
（8）shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、AFAP1L1 在 NSCLC 中的表达及临床意义 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 AFAP1L1在NSCLC组和正常肺组织组中的表达 |
| 1.2.2 AFAP1L1 表达与 NSCLC 患者临床病理特征及病理分期的关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、shRNA 沉默 AFAP1L1 对肺癌细胞功能影响的体外研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 AFAP1L1基因在肺癌细胞系中的表达 |
| 2.2.2 shRNA靶点设计和AFAP1L1 基因慢病毒载体构建 |
| 2.2.3 RT-PCT检测AFAP1L1 m RNA表达 |
| 2.2.4 Western Blot检测AFAP1L1 的蛋白表达 |
| 2.2.5 shRNA沉默AFAP1L1 导致A549 细胞增殖降低 |
| 2.2.6 shRNA沉默AFAP1L1 抑制A549 细胞周期进程 |
| 2.2.7 shRNA沉默AFAP1L1 促进A549 细胞凋亡 |
| 2.2.8 shRNA沉默AFAP1L1对A549 细胞侵袭能力的影响 |
| 2.2.9 Path Scan细胞内信号转导阵列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 AFAP1L1的结构与功能 |
| 2.3.2 RNA干扰及对AFAP1L1 基因的沉默作用 |
| 2.3.3 慢病毒载体介导的 RNA 干扰 AFAP1L1 表达对肺癌细胞 A549 生物学功能的影响 |
| 2.3.4 AFAP1L1抑制肿瘤生长的作用机制探讨 |
| 2.4 小结 |
| 三、AFAP1L1抑制肺腺癌细胞生长的体内试验研究 |
| 3.1 对象及方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 慢病毒转染A549细胞 |
| 3.2.2 MTT 检验细胞增殖能力 |
| 3.2.3 移植瘤的生长情况及活体成像情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 裸鼠移植瘤模型的建立 |
| 3.3.2 慢病毒载体及其介导的RNA干扰应用 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 APAP家族:结构、功能及在肿瘤中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）MIST1在人类黑色素瘤中与失巢凋亡的关系作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.引言 |
| 1.1 失巢凋亡 |
| 1.2 MIST1 |
| 1.3 转录因子SNAI1 |
| 1.4 皮肤恶性黑色素瘤转移侵袭的理论发展 |
| 1.5 蛋白的调控机制 |
| 1.6 PI3K/AKT 信号通路 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 设备 |
| 2.3 研究步骤与方法 |
| 2.3.1 细胞复苏,培养,传代及冻存 |
| 2.3.2 细胞粘附测定 |
| 2.3.3 ELISA检测细胞凋亡水平 |
| 2.3.4 RNA分离和聚合酶链反应(PCR)分析 |
| 2.3.5 蛋白提取 Western blot |
| 2.3.6 过表达构建和载体敲除 |
| 2.3.7 染色质免疫沉淀(ChIP)测定 |
| 2.3.8 荧光素酶报告基因技术 |
| 2.3.9 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 在人体正常细胞和黑素瘤细胞中,MIST1与SNAI1 的表达及其影响 |
| 3.2 MIST1和SNAI1 过度表达后及其对失巢凋亡的影响 |
| 3.3 MIST1 和SNAI1 的敲除对人类黑色素瘤细胞及其对失巢凋亡的影响 |
| 3.4 MIST1 与SNAI1 之间的关系及失巢凋亡抗性影响 |
| 3.5 PTEN/ AKT信号通路对MIST1和SNAI1 及失巢凋亡的影响 |
| 3.6 MIST1调控SNAI1表达的具体机制 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 7.附录 |
| 7.1 个人简历 |
| 7.2 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
| 综述 抑制黑色素瘤细胞的侵袭和转移相关研究进展 |
| 参考文献 |
（10）DLC-1、FAK在结肠癌、结肠腺瘤中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、蛋白酪氨酸磷酸化水平与乳腺癌细胞株抗失巢凋亡特性的关系（论文参考文献）
- [1]PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究[D]. 陶鹏先. 兰州大学, 2021(09)
- [2]锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究[D]. 余世龙. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [3]PC4通过FOXO1和FOXO3a降低肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制研究[D]. 孙天宇. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [4]切应力介导Cav-1表达水平上调与调控乳腺癌细胞抗失巢凋亡的分子机制研究[D]. 夏琼. 电子科技大学, 2020(01)
- [5]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
- [6]益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨[D]. 李琦玮. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]长链非编码RNA LINC01207调控胃癌肝转移作用及机制研究[D]. 谷旭宇. 江苏大学, 2020
- [8]shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究[D]. 王猛. 天津医科大学, 2020(06)
- [9]MIST1在人类黑色素瘤中与失巢凋亡的关系作用及机制研究[D]. 李宜儒. 安徽医科大学, 2020(01)
- [10]DLC-1、FAK在结肠癌、结肠腺瘤中的表达及意义[D]. 张文思. 内蒙古医科大学, 2019(03)