一、猪瘟病毒反义cDNA片段的化学合成及克隆（论文文献综述）
余秋颖[1]（2018）在《靶向猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的理性设计及其应用》文中研究指明猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种高致病力、高死亡率的接触性传染病。该病在我国一直流行,且以地区散发性为主;尽管各大养殖场对CSF给予极大的关注,但由于不科学的免疫程序、参差不齐的疫苗质量及猪群不规范的饲养条件等,致使当前CSF仍然严重威胁着我国的养猪业。E0、E1及E2是CSFV的三个囊膜糖蛋白,其中E2是病毒最主要的抗原蛋白,同时E2也在CSFV与宿主细胞的相互识别及吸附过程中起重要介导作用;因此,E2蛋白的深入研究,对于探讨CSF的感染机制及新型疫苗的设计都具有重要意义。计算机辅助多肽设计技术的飞速发展,尤其是虚拟分子对接技术的广泛应用,为多肽筛选提供了高效的技术途径,也使得配体与受体之间相互作用的研究更加深入。基于分子对接技术的多肽虚拟筛选,不仅操作简单快捷、降低多肽筛选的强度及缩短研发周期,还大大地提升了筛选成功率。本研究借助虚拟分子对接技术,设计多条靶向CSFVE2蛋白的亲和肽,利用酶联免疫吸附试验（ELISA）及等离子体共振试验（SPR）鉴定其亲和性,之后通过体外抑制试验评价其抗CSFV感染的活性,为深入研究E2在病毒感染中的作用提供新思路;并通过多肽与磁珠偶联,初步建立快速纯化水稻表达E2蛋白的方法,为新型高效疫苗的研发提供可靠的技术支持。1猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的理性设计随着越来越多蛋白质晶体结构被解析,基于结构模型的计算机辅助多肽设计技术也呈现快速的发展。本研究借助分子模拟对接及虚拟筛选技术,组建一系列不同长度的随机多肽组合库,将库中的多肽与同源建模的CSFV E2蛋白上特定的位点实施分子对接,并通过MOLCAD模块分析复合物的相互作用力,最后利用软件评分系统对对接结果进行综合评定与分析,设计出一系列靶向CSFV E2的亲和性多肽,以期为后续的抗CSFV感染、新型疫苗设计等研究提供帮助。2猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的筛选及鉴定首先,本研究通过ELISA及SPR试验鉴定人工合成的多肽序列与CSFVE2蛋白相互作用的亲和性及特异性;结果显示57条多肽中有18条与E2存在不同程度的亲和性结合,其中P86、P88、P708、P704、P92、P90与E2具有较高亲和力,平衡解离常数（KD）值分别为 1.49nM、3.88nM、4.72nM、4.84nM、49.4nM 及 50.8nM,表明借助分子对接技术设计的靶向E2亲和肽是可行的,并为后期试验研究提供可靠的试验数据及材料。其次,将两种不同策略GalaxyPepDock及FlexX/SYBYL给出的多肽序列评分值与其KD值的相关性进行分析,以期验证全局搜索及局部搜索策略在蛋白与多肽配基对接中的重要性;结果显示,FlexX/SYBYL预测的Cscore值与多肽KD值之间的Kendall和Spearman相关系数分别为-0.637及-0.767,呈中等程度的相关性,表明实施分子对接时采用局部搜索且充分考虑多肽的柔性要优于全局搜索的对接策略。本试验数据为今后多肽配基的分子设计提供合理的参考,也为蛋白质功能解析提供有效的指导。3猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的抗病毒活性研究阻止病毒侵染宿主细胞是研究抗病毒感染的重要方式之一。本研究在前一章筛选到6条靶向CSFV E2高亲和肽的基础上,通过体外抑制试验进一步评价其抗CSFV感染的活性;病毒与多肽孵育后接种PK-15细胞,结果显示6条多肽在一定程度上均能抑制CSFV感染,其中P88、P86及P708的抑制率高达80%以上,抑制活性最好;同时,多肽封闭细胞后接种病毒,结果显示6条多肽抗CSFV感染的活性较差,表明靶向E2的亲和肽不能通过封闭受体而阻止CSFV入胞,进一步证实亲和肽的抗病毒靶点在病毒表面而不是细胞膜上。本试验结果可为进一步研究病毒受体及抗病毒药物设计提供线索及理论依据。4亲和肽在猪瘟新型疫苗前期研究中的应用作为CSFV的免疫优势蛋白,E2 一直是CSFV新型亚单位疫苗研制的重点。本研究在前期借助分子对接技术筛选到靶向E2亲和肽的基础上,将其固定在磁珠上,成功从粗提水稻蛋白中纯化到有效的E2蛋白,初步建立了快速纯化水稻表达E2蛋白的方法;小鼠免疫抗体评价显示,免疫剂量为l0μg和25μg的纯化E2蛋白组,在接种后第14天抗体就达到阳性水平,且随接种时间推移,呈逐渐增长的趋势,到接种后第42天抗体阻断率可高达86.18%和90.68%,刺激机体产生的免疫保护反应远远优于对照组,表明靶向E2的亲和肽纯化水稻表达E2蛋白是高效、可靠的。这种新的多肽设计方法为新型疫苗的设计及研发提供有力的技术支持也为蛋白多肽配基的筛选提供更为广阔的平台。
李维维[2]（2014）在《NS5B和整合素β3在猪瘟病毒复制增殖中的作用和分子机制研究》文中提出猪瘟（CSF）是一种具有高度传染性和致死性的传染病，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前我国控制猪瘟的方法主要是疫苗预防和扑杀患病动物，虽然收到了明显的防疫效果，但慢性猪瘟和非典型猪瘟在我国仍不断发生，给猪瘟的防疫带来了困难和新的问题。因此，探究猪瘟病毒复制增殖机制及其与宿主细胞的相互作用关系，将会为揭示猪瘟病毒的致病机制和探索有效防控方法提供理论依据。本研究围绕猪瘟病毒的非结构蛋白NS5B（依赖RNA的RNA聚合酶）和膜受体蛋白整合素β3展开研究，主要探究两者在猪瘟病毒感染及增殖中的作用及其调控机制，获得了以下几结果：1.猪瘟病毒NS5B在人293T细胞中表达并表现出RNA聚合酶活性。在没有其他猪瘟病毒蛋白和猪瘟病毒基因组存在的前提下，利用宿主细胞的模板RNA合成了RNA，该RNA可被RIG-I识别并致使细胞产生内源性免疫反应。体外表达的NS5B蛋白可以利用人工合成的异源RNA模板从头起始合成RNA。根据预测的猪瘟病毒NS5B的二级和三级结构，设计了8个猪瘟病毒活性区域的突变体，体外RNA合成试验证明，突变体K282R的RNA聚合酶活性增强，其他突变体K283R、R285K、I287V的RNA聚合酶活性减弱，K282A、K283A、R285A、I287A突变体的RNA聚合酶活性基本丧失。同时检测了100种化学合成药物对猪瘟病毒NS5B蛋白活性的影响，发现了两种可以抑制猪瘟病毒NS5B活性的药物，这为将来研究抗猪瘟病毒相关抗体或者药物的开发提供了理论依据。2.首次证明了猪瘟病毒衣壳蛋白Core可增强NS5B蛋白的RNA聚合酶活性。通过5BR试验在细胞中瞬时表达猪瘟病毒NS5B蛋白，进而合成短的RNA，并通过RIG-I介导的信号通路诱导报告基因的表达，以此在细胞水平检测NS5B的RNA聚合酶活性。同时观察到猪瘟病毒的Core蛋白和NS5B蛋白可以被共同免疫沉淀，免疫荧光显示两者共定位于细胞质。同时，在蛋白质水平证明了猪瘟病毒Core蛋白可以增强NS5B蛋白的RNA聚合酶活性，并且该增强作用具有种属及模板特异性。另外，证实Core蛋白不需要前端的21个氨基酸发挥其增强NS5B的聚合酶活性的功能，但前端1-53个氨基酸对Core蛋白在细胞内的正常表达或对蛋白的稳定性起到重要作用。针对Core蛋白具有自我组装的功能，我们利用雀麦花叶病毒（BMV）的RNA进行了体外病毒样粒子的组装，并且成功获得了具有猪瘟病毒样形态的VLP（病毒样粒子）。3.首次获得了猪瘟病毒NS5B的蛋白晶体。软件预测分析猪瘟病毒NS5B蛋白的二级和三级结构，比对已经发表的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、丙型肝炎病毒（HCV）和西尼罗病毒（WNV）的NS5B蛋白三级结构，发现它们在结构上具有相似性。同时，利用质谱分析的方法确定了猪瘟病毒NS5B的稳定蛋白核体。综合预测和质谱分析结果，成功构建了多个带不同标签的NS5B全长及截短型表达载体，并且纯化得到了高纯度的NS5B蛋白。通过对200种不同结晶条件的筛选，最终确定猪瘟病毒NS5B蛋白的结晶条件，并且首次获得了晶形良好的NS5B晶体。4.猪瘟病毒的感染与增殖需要整合素β3，整合素β3与猪瘟病毒的增殖量成正相关关系。整合素β3作为一个膜结合受体蛋白，已被证实是多种病毒的膜受体或者共受体。功能性阻断或者干扰掉整合素β3之后，猪瘟病毒的增殖量明显降低。这些结果表明整合素β3在猪瘟病毒的感染和增殖中扮演着类似受体的功能，因此可用于抗病毒靶点研究。5.发现let7家族的microRNA在调控猪瘟病毒增殖的同时，也可以调控整合素β3，并且整合素β3在细胞中的变化也能影响到let7家族中某些作用于猪瘟病毒的microRNA的表达量。
马泓思[3]（2014）在《白桦环阿齐醇合酶（CAS）基因RNAi载体构建及遗传转化初步研究》文中指出白桦三萜具有重要的抗肿瘤和艾滋病毒活性,而白桦三萜各种活性成分（白桦酯醇、齐墩果酸、达玛烯二醇等）和固醇（环阿齐醇）均来自MVA代谢途径中共同的前体物质2,3-氧化角鲨烯,分别经氧化鲨烯环化酶（OSCs）催化,合成不同的三萜类以及甾醇类物质。本研究依据白桦三萜代谢途径,拟克隆固醇合酶基因（BPX）,进行生物信息学分析,同时通过不同方法构建环阿齐醇合酶（CAS）基因RNAi表达载体,并遗传转化白桦无性系。探讨CAS基因抑制后白桦三萜组分合成、积累及三萜途径关键基因表达变化,以期明确固醇合成分支阻断后对白桦酯酸及齐墩果酸合成的调控效应及CAS基因在白桦三萜代谢网络中的调控作用。本研究的开展将为白桦三萜类物质代谢途径的遗传修饰及生物技术的利用奠定了基础。本研究结果如下:1.通过RT-PCR方法获得白桦（Betula Platyphlla suk.）环阿齐醇合酶（cycloartenol synthase）基因的cDNA序列,暂命名为BPX3。利用生物信息软件对该序列进行分子特征、理化性质、同源性及系统树进化分析,结果表明BPX3基因开放阅读框（ORF）的cDNA全长为2262 bp,编码753个氨基酸,包含一个特异的ISOPRENC2like超家族的保守序列（第97～736 aa位置）,编码的产物为亲水性蛋白,具有由a螺旋（alpha helix）、延伸链（extended strand）以及无规则卷曲（random coil）二级结构以及四个跨膜螺旋,并与日本白桦（Betulaplatyphylla var.japonica）、印度苦楝（Azadirachta indica）等物种的环阿齐醇合酶同源性达到78～96%。GO分析结果显示BPX3氨基酸序列在分子功能（molecular function）上具有环阿齐醇合酶活性、催化活性、异构酶活性及分子内转移酶活性,参与了甲基赤藓糖醇途径异戊烯基焦磷酸生物合成、叶绿素生物合成、类叶红素生物合成、类囊体膜组织、花粉发育、不饱和脂肪酸、五环三萜类化合物、甾醇、磷脂酰甘甘油及四环三萜类化合物的生物合成过程。细胞成分（cellular component）分析显示该蛋白质为整合膜蛋白,分布于液泡中。2.检测四年生、六年生及八年生白桦树各器官齐墩果酸和白桦酯醇的分布和含量。表明,不同树龄的白桦树的叶、茎外皮和根皮中都能检测出齐墩果酸和白桦酯醇含量,但主要集中在茎外皮中,叶片和根皮中含量极低,齐墩果酸和白桦酯醇含量分别以四年生和八年生白桦茎外皮中最高。通过荧光定量PCR分析,在生长季节内,叶片中BPX1（环阿齐醇合酶基因1）以及BPX2（环阿齐醇合酶基因2）两个基因在9月末表达量最高,而BPW（白桦酯醇合成关键酶基因）和BPY（齐墩果酸的合成关键酶基因）表达量均较低;茎皮中BPY基因在7月末和9月末分别出现了两个高峰期,其他三种OSCs基因的表达量都低于BPY基因,但BPX2和BPW基因表达量在6月末～9月末期,随着时间推移,表达量逐渐增强;根中BPY基因表现在7月末和10月末表达量较高,BPW基因在8月表达量最高,其次为9月末和10月末,BPX1在8月末出现高峰,但整体表达量较低。表明三萜基因的表达同三萜的积累和分布类似,显着受到季节的调控。3.根据BPX1、BPX2、BPX3基因全长序列,利用Yan等改造ihpRNA新型植物干扰载体,以RNAi使用要求和pRNAi-GG载体的要求为原则选取CAS基因不同干扰片段序列,进行引物设计,成功构建干扰载体BPX1-A（N1）和BPX1-B（N2）、BPX1和BPX2共干扰载体BPX123-C（N3）;同时利用化学合成法完成BPX2和BPX3同源区域的干扰载体p121-N4的构建。并利用三亲杂交法,将获得的干扰载体BPX1-A（N1）和BPX1-B（N2）、BPX123-C（N3）、BPX23-D（N4）由大肠杆菌成功转移至根癌农杆菌LBA4404中,获得可用于遗传转化的工程菌株4株,为下一步CAS基因RNAi转基因白桦获得奠定了基础。4.将成功构建的白桦环阿齐醇合酶基因p121-N4的RNAi载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法遗传转化白桦无性系,初步获得筛选植株35株,经NptII序列PCR鉴定以及Southern印迹鉴定验证,确定获得其中4株转基因白桦组培苗。同时对获得的4株转基因白桦苗,通过实时荧光定量PCR检测,结果显示其中2株（Y-12、B-6）BPX2基因的表达被显着抑制,表达量分别为对照的3%和48%。研究还发现转基因白桦苗Y-12和B-6中,BPX2被抑制后,BPY和BPW的基因相对表达量显着被提高,其中在Y-12转基因植株中BPY和BPW的相对表达量为对照组的2.95倍和2.89倍;而在B-6转基因植株中,除BPX2,其他基因均有所上调,BPY和BPW表达量分别提高到野生型的70.9倍和84.10倍。HPLC检测转基因愈伤组织中齐墩果酸和白桦酯酸含量显示,转基因植株Y-12和B-6愈伤组织中齐墩果酸含量分别为野生对照组的5.97倍和8.92倍,显着高于野生型;B-6中白桦酯酸的积累量显着升高,是对照组的2.10倍。表明在白桦中BPX2的RNAi能够显着下调BPX2表达量,可促使BPW和BPY基因显着上调,这显着促进了三萜前体物质2,3-氧化角鲨烯向下游途径目标三萜产物白桦酯醇和齐墩果酸的合成和积累。
单睿阳[4]（2012）在《烟草抗病防卫基因SGT1、RAR1的反义表达载体构建及功能的研究》文中研究说明植物受到病原菌或病毒感染后，局部的过敏反应（hypersensitive reaction，HR）会产生一些类别的信号分子，这些信号分子会诱发整个植物防卫基因的表达，使整个植物对更多的病原菌或病毒产生抵抗反应。RAR1、SGT1是较早报道的植物防卫信号蛋白，在一些植物的抗病途径中，发现了RAR1、SGT1的信号传导功能。烟草是一种十分重要的经济作物，在其生长的过程中常常受到多种病菌性病害的危害，通过对其防卫信号元件的研究，寻找控制烟草病害的途径。本研究构建了RAR1、SGT1这两个基因的反义表达载体，转化并获得烟草转基因植株，并对其抗TMV、抗赤星病的抗病性进行初步检测。主要的研究方法和结果如下：1.根据GenBank上已公布的RAR1、SGT1全长基因序列，分别设计其部分特异序列的PCR扩增引物。扩增出了RAR1的部分片段（273bp）、SGT1的部分片段（491bp）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、测序分析，表明片段反向接入了中间载体PupTn的启动子与终止子之间，并分别成功构建了反义表达载体。2.利用叶盘法转化烟草永定400号和红花大金元品种。通过PCR检测标记基因、GUS组织化学染色以及RT-PCR对抗性植株进行检测，获得了转RAR1、SGT1基因反向部分片段的T0代转基因阳性植株：RAR1转永定400号12株，RAR1转红花大金元10株，SGT1转永定400号14株，SGT1红花大金元12株。3.制备烟草TMV病毒、赤星病病毒，分别感染烟草后，测定叶绿素含量，表明转RAR1、SGT1基因反向部分片段的T0代转基因阳性植株相较于非转基因植株对TMV病毒抑制作用减弱，对赤星病的抗性表现为差异不显着。
李江南[5]（2011）在《RNA干扰途径抗猪瘟病毒研究》文中研究说明猪瘟（classic swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（classic swine fever virus, CSFV）引起的一种猪高度接触性传染病,以高热、出血、淋巴细胞减少和免疫抑制为主要特征,是国际兽医局（OIE）所列的疫病目录必须通报的传染病之一。猪瘟兔化弱毒疫苗对我国猪瘟病毒的防控做出了重大贡献,已经在很大程度上控制了该病在我国的大规模流行。近年来,猪瘟多呈温和、慢性、非典型、隐性感染和持续性感染等新特征,同时多种原因引起的疫苗免疫失败时有发生,这些对猪瘟的预防提出了严峻的考验。除了疫苗免疫之外,人们一直在探索其它的防治手段。RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术发现为人类对抗病毒病提供了新的途径,被认为是最有潜力和应用价值的抗病毒方法之一,已广泛应用于病毒学研究中。随着转基因技术的发展,可以把有利于改善动物性状的外源基因添加到动物的基因组中,不受传统育种方法的限制,可以培育出常规育种难以产生的优良性状动物。将RNAi和转基因克隆技术结合起来进行抗病毒转基因育种,可以培育出携带有抗病基因的转基因动物,减少病毒病给带来的经济损失。本研究将这两种技术结合进行体外和体内抗猪瘟病毒研究,探索新的抗猪瘟病毒方法,为抗猪瘟转基因育种研究奠定了基础。本研究应用RNAi技术进行体外和体内抗猪瘟病毒研究。首先针对猪瘟病毒Npr0、NS2和NS3基因设计并化学合成了6个干扰靶点,在PK-15细胞上筛选高效抑制猪瘟病毒复制和增殖的干扰靶点,获得了3个针对猪瘟病毒NS3基因的干扰靶点siNS3-1、siNS3-2和：siNS3-3,抑制率分别高达85.5%、95.1%和84.7%,其中siNS3-2抑制效率最高,将用于进一步研究。应用siNS3-2干扰靶点以及实验室前期筛选的干扰靶点siN1、siN2和siNS5B,选择H1启动子,构建针对以上干扰靶点的猪瘟病毒特异性siRNA表达盒,将特异性siRNA表达盒插入到目标载体PGKneotpAlox2和pLox-siN 1中,构建了猪瘟病毒特异性siRNA单表达猪瘟病毒抗性基因（pLox-siN2、pLox-siNS3-2、pLox-siNS5B）和双表达猪瘟病毒抗性基因（pLox-siN1N2、pLox-siN1NS5B、pLox-siN]NS3-2）。选择四个不同的启动子（hU6、hH1、mU6和h7SK）构建四个独立的表达盒,插入到目标载体PGKneotpAlox2中,构建了猪瘟病毒特异性siRNA四表达猪瘟病毒抗性基因（pLox-siRNA4）。构建报告基因系统验证多表达猪瘟病毒抗性基因每一个siRNA都能得到有效表达,然后在PK-15细胞上进行了抑制猪瘟病毒增殖的研究,结果显示猪瘟病毒抗性基因pLox-siN1、pLox-siN2、pLox-siNS3-2、pLox-siNS5B、pLox-siN1N2、pLox-siN1NS5B、pLox-siN1NS3-2和pLox-siRNA4均能有效抑制猪瘟病毒的增殖（P<0.01）,抑制率分别高达84.8%、87.9%、87.0%、83.2%、90.1%、94.0%、91.8%和96.8%,多表达猪瘟病毒抗性基因抑制效果强于单表达猪瘟病毒抗性基因,四表达猪瘟病毒抗性基因抑制猪瘟病毒增殖效果显着强于单表达猪瘟病毒抗性基因（P<0.05）,多表达猪瘟病毒抗性基因抑制效果出现累加作用。为了研究构建的猪瘟病毒抗性基因在体内对猪瘟病毒的抑制效果,探索体内抗病毒方法,加快抗猪瘟转基因育种研究,合作单位应用这些猪瘟病毒抗性基因去掉载体的原核部分后构建了转基因克隆猪,我们对这些克隆猪分离原代细胞进行体外抗猪瘟病毒研究。0101号、0103号和0107号转基因克隆猪为双表达猪瘟病毒抗性基因siN1N2构建,2019号转基因克隆猪为四表达猪瘟病毒抗性基因siRNA4构建。提取转基因克隆猪基因组,通过PCR的方法确定猪瘟病毒抗性基因稳定整合到转基因克隆猪细胞的基因组中。分离转基因克隆猪的脐静脉血管内皮细胞、猪尾成纤维细胞、外周血白细胞和原代肾细胞,进行了抑制猪瘟病毒增殖的研究。结果显示0101号不同组织中分离的原代细胞均有抗猪瘟病毒感染与增殖的能力,2019号脐静脉血管内皮细胞具有抗猪瘟病毒感染与增殖的能力,0103号和0107号部分组织分离的原代细胞具有抗猪瘟病毒感染与增殖的能力。RNAi不能完全抑制猪瘟病毒增殖,为了研究是否因为病毒靶位点突变而导致的脱靶效应,本研究构建了稳定表达单表达猪瘟病毒抗性基因的PK-15细胞系,接种猪瘟病毒传10代,对病毒靶位点区域进行扩增并测序分析,结果发现本研究四个靶点构建的猪瘟病毒抗性基因不会引起因猪瘟病毒核酸碱基突变而产生脱靶效应。本研究进行了RNAi途径抗猪瘟病毒研究,探索了新的抗猪瘟病毒的方法,为RNAi技术应用于猪瘟的防控奠定了基础,也为研制抗猪瘟的转基因克隆猪提供了参考数据。
刘伟[6]（2010）在《分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制调节作用的研究》文中进行了进一步梳理分子伴侣（Molecular chaperones）是一类在进化上非常保守的蛋白质家族,同时也是协助细胞在正常和胁迫条件下保持细胞内稳态的重要蛋白组分,参与许多正常的细胞生理反应过程,对蛋白质功能的发挥具有重要意义。由于在进化过程中,病毒在自然选择压力的作用下,为了保持自身基因组足够小,许多真核、原核宿主的病毒可以直接利用宿主细胞中的分子伴侣或者借助宿主细胞编码病毒所需要的分子伴侣以及一些功能蛋白,来完成病毒增殖的许多相关过程。有研究表明,分子伴侣Jiv90在猪瘟病毒（CSFV）的感染过程中起着重要的作用,这种作用可能是通过Jiv90参与调节CSFV NS2-3蛋白的切割来实现的。为了进一步研究分子伴侣Jiv90在CSFV感染过程中对病毒增殖的调节作用,本研究构建了Jiv90基因真核表达载体和抑制Jiv90基因表达的shRNA干扰载体,为进一步研究分子伴侣Jiv90基因的功能奠定基础,期望为猪瘟的防控提供新的思路。本研究获得了以下结果:（1）根据Jiv90基因序列和真核表达载体pEGFP-C1设计引物,经RT-PCR扩增,成功克隆得到猪Jiv90基因,回收后与pEGFP-C1载体连接,构建重组真核表达载体pEGFP-C1-Jiv90,通过酶切鉴定和测序验证所插入基因片段的正确性。经序列比对发现猪Jiv90基因与牛Jiv90基因核酸水平同源性为95%,说明该分子伴侣在两个物种间同源性极高,可能具有类似的功能。（2）载体转化感受态细菌进行扩增并提取质粒,微量紫外/可见分光光度计检测质粒的浓度及质量,通过脂质体法将pEGFP-C1-Jiv90转染猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）,倒置荧光显微镜鉴定转染效率,经G418抗性筛选得到阳性克隆。Real-time PCR检测Jiv90基因mRNA水平表达上调程度,结果显示转染组较空质粒转染组Jiv90 mRNA表达量上调约16.35倍。细胞接种CSFV Shimen株72h结果表明表达Jiv90基因的SUVEC株细胞死亡率明显高于对照组。Real-time PCR检测接种CSFV 60h后,SUVEC-Jiv90细胞株CSFV RNA表达量相对于SUVEC组上调约4.26倍。（3）利用软件设计针对Jiv90基因4个不同位点的RNA干扰序列,通过化学合成的方法合成正向和反向的DNA oligo ,将其退火后连接shRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo,成功构建4个pGPU6/GFP/Neo-Jiv90 shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4干扰载体,并测序鉴定了各重组载体的正确性。使用脂质体转染方法将干扰载体转染SUVEC,同时转染针对看家基因GAPDH的干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-GAPDHshRNA作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒pGPU6/GFP/Neo-NC shRNA作为阴性对照。通过G418抗性筛选获得了转染干扰载体的阳性细胞,以及对照组阳性细胞。
张露露[7]（2012）在《猪瘟病毒E0蛋白单克隆抗体的制备及其胶体金免疫层析检测方法的初步探索》文中研究表明猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）,是危害我国养猪业的最重要的一种高度接触性烈性传染病之一,多年来被列为我国猪病防治研究的首要对象之一。世界上各国都采取了许多措施较好地控制了猪瘟的大规模爆发流行,但自上世纪70年代末以来,猪瘟的流行与发病特点发生了很大的变化,近年来我国猪瘟的发生又呈上升趋势,临床表现更为复杂,而且免疫猪群发生猪瘟越来越多。根据猪瘟病毒中国C株的全基因组序列,分别设计扩增该病毒主要结构蛋白基因E0全长的相应引物,利用RT-PCR技术对目的基因进行了扩增,获得了714bp的基因片段。再将目的基因与pET-28a载体连接,构建高效表达重组载体pET28a-C-E0.转化大肠杆菌BL21（DE3）,重组子经酶切和测序鉴定正确后进行诱导表达。IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳检测。结果表明融合蛋白在37℃下,1.0mmol/L的IPTG浓度诱导下能良好表达,并且,融合蛋白均以包涵体的形式存在。用镍柱纯化包涵体后能获得较纯的融合蛋白。用纯化的E0抗原免疫BALB/c小鼠,制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞系融合,获得2株能稳定分泌抗CSFV EO蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为E01,和E02,抗体亚类为IgG2bK,诱生腹水的抗体效价分别为1：128000、1：256000。间接ELISA检测特异性表明,2株单克隆抗体与其他2种猪类病毒无交叉反应。本实验为进一步研制CSFV中和单抗治疗剂和快速检测试剂盒奠定了基础。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFV EO单克隆抗体E01作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFV EO单克隆抗体E02和羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线和质控线,优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明阴性对照检测结果成立,检测粗提的CSFV,质控线明显显色,检测线显色较淡。
郭抗抗[8]（2010）在《猪瘟病毒的shRNA干扰、强弱毒鉴别及基因工程疫苗研究》文中指出猪瘟（Classical swine fever ,CSF）是严重危害养猪业的传染性疾病,病原为猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）。CSFV为单股正链RNA病毒,研究发现其3′非翻译区（3′-non-translation region,3′-NTR）在病毒的复制中有重要作用,为了研究CSFV Shimen株3′-NTR的不同位点在病毒复制中的作用,筛选3个靶位点设计了短发夹RNA（shRNA）,构建了针对shimen株CSFV 3′-NTR 3个靶位点的shRNA表达质粒;将重组质粒转染PK-15细胞,获得3株稳定靶向CSFV Shimen株3′-NTR 3个靶位点的干扰细胞株,接种CSFV后,检测干扰细胞株对病毒复制的影响。目前CSF防控上采取的是以疫苗免疫接种为主的策略,弱毒疫苗的大范围使用,使病毒变异、毒力返强的风险增高,当前临床上“非典型”CSF的大量出现,被怀疑与弱毒疫苗的大量使用有关,新型CSF疫苗的研制是防控CSF的需要;在分析国内外有关猪瘟基因工程疫苗研究进展的基础上,构建了表达CSFV Shimen株E2基因的“自杀性”DNA疫苗和同时表达CSFV Shimen株E0和E2基因的重组鸡痘病毒,对构建的疫苗进行了初步评价。CSF弱毒疫苗的大量使用,使在生产中难以有效地用血清学方法区分野毒感染猪和疫苗免疫猪,对生猪及其产品的贸易造成严重影响;针对这个问题,在借鉴已有研究的基础上,建立了区分CSFV强/弱毒株的RT-PCR方法,通过对临床病料的检测表明,该方法的特异性较强,可用于临床上对CSFV野毒感染和弱毒疫苗免疫猪的鉴别检测。本研究取得以下结果:1.通过对CSFV Shimen株3′-NTR核苷酸序列的分析,分别设计了靶向CSFV Shimen株3′-NTR 115～132位、137～154位和210～228位mRNA的短发夹RNA（shRNA）的单链核苷酸,经退火后形成双链shRNA,将其分别与siRNA表达质粒载体连接,构建了编码CSFV Shimen株3′-NTR 3个位点shRNA的表达质粒载体;转染细胞后筛选获得了稳定转录靶向CSFV Shimen株3′-NTR shRNA PK-15细胞株（P-1、P-2和P-3）;接毒试验表明,细胞株P-1、P-2及P-3在转录水平和蛋白表达水平上均可干扰CSFV Shimen株在感染细胞中的增殖（P<0.05）。2.建立了可鉴别CSFV强毒和弱毒的RT-PCR方法。在CSFV强毒中可扩增得到187 bp的片段,弱毒可获得492 bp的片段;在对PCV2、TGEV、PRRSV等猪源病毒的检测,均未有PCR产物出现,说明方法的特异性较高。对临床疑是CSF病料的检测证明,建立的方法可有效地区分CSFV野毒感染猪和弱毒疫苗免疫猪,本方法可用于临床上对CSFV强弱毒的鉴别检测。3.构建了CSFV E2基因“自杀性”DNA疫苗表达质粒载体PSCA1-E2。在转染细胞中可检测到E2蛋白的表达;免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖刺激指数（SI）在二免后10d与对照组差异显着（p<0.05）,20d和30d差异极显着（p<0.01）;试验猪二免后21d能检测到抗CSFV特异性血清抗体,说明构建的表达CSFV E2基因的“自杀性”DNA疫苗能诱导试验动物的免疫反应。4.将CSFV E0和E2基因及报告基因LacZ插入到鸡痘病毒FV282的复制非必需区,经同源重组构建了一株含CSFV E0和E2基因的重组鸡痘病毒（FV282-E0-E2）。用重组鸡痘病毒免疫接种试验小鼠和试验猪,检测发现,免疫动物均能产生特异性抗体,说明E0和E2基因在机体细胞内得以有效表达,并能激发机体产生免疫反应;对免疫猪的攻毒试验表明,重组鸡痘病毒免疫猪能获得部分的免疫保护,抵抗CSFV强毒的攻击,免疫保护率为75%（6/8）。
王铁东[9]（2009）在《抗猪瘟病毒转基因猪的构建及初步研究》文中提出猪瘟是一种传染性极强的急性、热性、高致死性传染病,发病率和死亡率很高,是威胁养猪业最重要的传染病,建立新的抗病毒方法,加快抗猪瘟动物育种研究,控制猪瘟的流行具有重要的现实意义。RNA干扰是广泛存在于生物体内,由双链RNA引发的转录后基因沉默机制,随着RNAi机制的逐步阐明及其应用技术的不断发展,现已成为最有潜力和应用价值的抗病毒感染方法之一。为了获得抗猪瘟病毒的新品种,本研究通过将RNAi技术和转基因猪制备技术相结合,培育出了稳定表达针对猪瘟病毒的shRNA的转基因克隆猪。首先根据RNAi的技术原理,基于载体PGKneotpAlox2,设计并构建了针对猪瘟病毒Npro基因的shRNA表达载体PGKneotlaAlox2-shRNA-N1N2和阴性干扰shRNA表达载体PGKneotpAlox2-shRNA-N1N2-Ctrl,转染原代猪胚胎成纤维细胞,经G-418筛选,获得猪瘟病毒特异性siRNA稳定表达细胞株28株,阴性对照siRNA克隆稳定表达细胞株30株,感染猪瘟病毒72h的间接免疫荧光和病毒滴度测定结果显示,所得克隆中PEF-N1N2-6,PEF-N1N2-11,PEF-N1N2-15,PEF-N1N2-21,PEF-N1N2-25对猪瘟病毒复制的抑制率超过90%。分别以获得的上述抑制率超过90%的细胞株为核供体细胞,通过细胞核移植技术制备转基因克隆猪,共获得到15头克隆猪,分离培养转基因仔猪细胞和同品种仔猪细胞,扩大培养后感染猪瘟病毒Shimen株,间接免疫荧光实验和病毒滴度测定实验表明,与同日出生的同品种非转基因仔猪相比,所构建的转基因克隆猪细胞上猪瘟病毒的增殖受到明显抑制。上述研究成果为研制抗猪瘟病毒的转基因克隆猪奠定了基础,并为建立抗其它病毒的转基因动物育种提供了参考数据。
李凤岚[10]（2009）在《红豆杉紫杉烷13α-，14β-羟基化酶基因调控及茉莉酸甲酯诱导下的蛋白表达》文中提出紫杉醇（taxol）是Wall等首次从短叶红豆杉（Taxus Brevifolia）树皮中分离得到的一种重要的次生代谢产物,是迄今为止最具抗癌活性的天然化合物之一。本论文围绕紫杉醇的生物合成过程展开了以下研究：1、紫杉烷13α-,14β-羟基化酶基因调控研究紫杉醇生物合成全过程约20步酶促反应。其中,紫杉烷13a-羟基化酶（简称130H）是紫杉醇生物合成途径的关键羟化酶。而紫杉烷14p-羟基化酶（简称140H）存在于包括紫杉醇在内的各种C-13氧取代的紫杉烷生物合成分支途径中。如果能够抑制紫杉醇生物合成的分支途径,则有可能提高该物质的生物合成产量。应用本试验室构建好的紫杉烷13α-羟基化酶基因正向表达载体、14-p羟基化酶基因反义RNA表达载体、14-p羟基化酶基因RNAi表达载体和几种可能对紫杉醇生物合成产生影响的miRNA表达载体,以曼地亚红豆杉（Taxusxmedia）愈伤组织细胞为材料进行了转化实验,并运用southern blot. RT-PCR、HPLC等技术进行了分析,结果如下：（1）建立了一套将转基因方法应用于红豆杉培养细胞的高效、完整的转化体系,对红豆杉愈伤组织细胞的转化成功率达到了100%。并探讨了几种影响转化效率的因素。（2）利用14-β羟基化酶基因RNAi表达载体（pZ14aRNAi、pZ14bRNAi）以及14-p羟基化酶基因反义RNA表达载体（pZl4c）进行了转化红豆杉细胞实验。Southern检测初步证实外源基因已经整合到了植物基因组中；RT-PCR分析结果表明,内参基因β-actin在转基因和非转基因细胞中表达水平基本一致,而140H基因在转基因细胞系中的表达水平相对非转基因细胞系显着下降。HPLC结果分析显示,转基因的红豆杉细胞与对照相比三种C-14氧取代紫杉烷（yunnanxane, sinenxan A, sinenxan C）的含量发生了较大的改变。其中主要的紫杉烷Sinenxan A含量明显下降,三种紫杉烷在转基因红豆杉细胞中的总含量呈显着下降趋势。（3）利用pC130H载体转化红豆杉细胞实验。GUS检测,荧光观察及southern blot分析初步证明pC130H载体（13α-羟基化酶基因正向表达载体）成功转化红豆杉细胞。RT-PCR结果表明,内参基因β-act in在转基因和非转基因细胞中表达水平一致,而13OH基因在转基因细胞系中的表达水平显着,却在对照中未表达。HPLC检测三种C-14氧取代紫杉烷类化合物的总量在转基因细胞中均略微有所下降。（4）其他转化红豆杉细胞的实验。本研究还进行了pC13OH、pZ14a共转化,pC13OH、pZ14b共转化,pC13OH、pZ14c共转化,pC130H、pCO169d共转化,pC13OH、pE415共转化红豆杉细胞的实验.另外，利用构建的几种miRNA表达载体如169d、pROK2-JERFs也对曼地亚红豆杉细胞进行了转化。对转化后的样品进行分析显示,共转化试验及几种niRNA表达载体均未对紫杉醇生物合成途径产生较大影响。2、茉莉酸甲酯诱导下红豆杉细胞中蛋白质的表达已有的研究表明采用茉莉酸甲酯（MJ）诱导可以有效的提高紫杉醇及紫杉烷类物质在红豆杉细胞中的含量。研究该物质诱导的作用机制,可以更全面了解茉莉酸甲酯对红豆杉细胞基因表达的影响,找到可能与紫杉醇生物合成相关的重要基因或转录因子。本试验利用茉莉酸甲酯诱导中国红豆杉（Taxus chinensis）愈伤组织细胞,采用双向电泳技术、质谱技术对茉莉酸甲酯诱导15天后细胞中的蛋白质变化进行了分析,找到22个差异表达的蛋白。经过肽质量指纹分析、数据库查询,初步断定CK（对照组）中的219号、231号、156号、127号蛋白分别与actin2（一种细胞骨架蛋白）、enolase（烯醇酶,一种参与糖酵解系统的酶,催化2-磷酸甘油酸失水而生成磷酸烯醇丙酮酸反应的酶）、F1-ATP酶α亚单位、maturase K（一种成熟酶）具有同源性。经过茉莉酸甲酯诱导后,该四种蛋白的表达量均有不同程度的降低。这可能与茉莉酸甲酯诱导引起红豆杉细胞的凋亡有关。另外,有10个蛋白与数据库中所有蛋白的同源性都很低,可能代表了中国红豆杉中与茉莉酸甲酯诱导相关的未知蛋白。3、抗凋亡抑制剂DEVD-Capaselll对紫杉醇生物合成的影响DEVD-Capaselll是一种抗细胞凋亡抑制剂,在红豆杉细胞培养基加入该物质则有可能抑制细胞的凋亡从而达到提高紫杉醇生物合成产量的目的。以曼地亚红豆杉愈伤组织作为实验材料,采用添加200μMMj（茉莉酸甲酯）的6,7-V作为培养基,试验组加入501μM的Ac-DEVD-CMK,分别在继代9天和21天后取样,观察细胞的颜色、生长情况等,并运用HPLC方法对细胞中的紫杉烷成分的种类及含量进行分析。结果发现：MJ诱导后并未在曼地亚红豆杉细胞中检测到紫杉醇的变化,说明本试验中细胞的凋亡并不是主要由于紫杉醇的积累而是由于MJ引发的反应；在细胞生长周期的早期阶段加入Ac-DEVD-CMK,不能阻止Caspase的活性,未能抑制愈伤组织细胞的凋亡。4、未知化合物的鉴定无论是在转基因还是MJ诱导试验过程中,我们均检测到了一种未知化合物,并对该化合物进行了纯化试验。该物质在HPLC色谱图上的保留时间比紫杉醇的保留时间延迟了大约0.4min。将该物质的二级质谱图与分子量类似的已知化合物的谱图进行比对,没有发现完全吻合的质谱特征。经过HPLC-HRMS分析得到该未知化合物分子量为851.39747,在Xcalibur version2.2软件中计算得到最可能是C46H55O10N6等化合物中的一种。结论：（1）本实验建立了一套高效转基因体系,并应用转基因技术成功地抑制了曼地亚红豆杉细胞系中14OH基因的表达,C-14位氧化紫杉烷类含量在转基因细胞系中均有所下降；（2）在采用茉莉酸甲酯（MJ）诱导中国红豆杉愈伤组织细胞的试验中,鉴定了四种并发现了10个可能与茉莉酸甲酯诱导有关的蛋白；（3）抗凋亡抑制剂DEVD-CapaseⅢ未对紫杉醇生物合成产生较大的影响；（4）在实验过程中检测到了一种有可能是未报道的化合物,并进行了初步的纯化和分析。
二、猪瘟病毒反义cDNA片段的化学合成及克隆（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪瘟病毒反义cDNA片段的化学合成及克隆（论文提纲范文）
（1）靶向猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的理性设计及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪瘟病毒 |
| 1.1 猪瘟的流行及危害 |
| 1.2 猪瘟病毒粒子结构 |
| 1.3 猪瘟病毒结构蛋白及其功能 |
| 2 多肽 |
| 2.1 多肽的概况 |
| 2.2 多肽的应用 |
| 3 亲和性多肽配基的理性设计 |
| 3.1 亲和性多肽配基 |
| 3.2 亲和性多肽配基的筛选技术 |
| 3.3 计算机辅助设计亲和性多肽配基 |
| 第二章 猪瘟病毒E2蛋白高亲和性多肽的理性设计 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 仪器与设备 |
| 2.2 多肽库的准备 |
| 2.3 CSFV E2晶体结构的准备 |
| 2.4 对接活性口袋 |
| 2.5 分子对接 |
| 2.6 对接结果的分子表面分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 CSFV E2三维结构的同源建模 |
| 3.2 对接活性口袋设定 |
| 3.3 对接结果评价 |
| 3.4 多肽与CSFV E2之间亲和力分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 猪瘟病毒E2蛋白高亲和性多肽的筛选及鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂与设备 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 目的基因扩增 |
| 2.4 pET-32a-E2表达载体构建 |
| 2.5 E2蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 2.6 多肽与E2蛋白的ELISA检测 |
| 2.7 SPR检测E2蛋白与多肽的亲和力 |
| 2.8 对接程序预测的评分值与多肽KD值之间的相关性评估 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 重组质粒pET-32a-E2双酶切鉴定 |
| 3.3 E2蛋白的表达纯化及鉴定 |
| 3.4 多肽与E2蛋白的亲和性及特异性鉴定 |
| 3.5 多肽与E2蛋白的亲和力测定 |
| 3.6 多肽-蛋白不同对接策略评分值与KD值之间相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 第四章 猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的抗病毒活性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 病毒、细胞及质粒 |
| 2.2 试剂与设备 |
| 2.3 CSFV增殖规律的摸索 |
| 2.4 细胞毒性试验 |
| 2.5 阻断ELISA试验 |
| 2.6 多肽抑制病毒感染试验 |
| 2.7 IPMA试验 |
| 2.8 引物设计 |
| 2.9 病毒基因组RNA提取及cDNA合成 |
| 2.10 qRT-PCR试验 |
| 2.11 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 CSFV在PK-15细胞上的增殖变化规律 |
| 3.2 亲合肽细胞毒性评价 |
| 3.3 多肽与E2相互作用的阻断ELISA鉴定结果 |
| 3.4 E2亲和肽抑制CSFV感染的qRT-PCR鉴定结果 |
| 3.5 E2亲和肽抑制CSFV感染的IPMA鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 亲和肽在猪瘟新型疫苗前期研究中的应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验动物及种子 |
| 2.2 试剂与设备 |
| 2.3 种子去壳 |
| 2.4 水稻E2蛋白的提取 |
| 2.5 多肽与水稻E2蛋白相互作用的筛选及鉴定 |
| 2.6 多肽与磁珠的偶联 |
| 2.7 水稻E2蛋白的纯化、洗脱条件摸索及活性鉴定 |
| 2.8 动物免疫评价 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 粗提水稻E2蛋白的鉴定 |
| 3.2 多肽与粗提水稻E2蛋白相互作用的ELISA鉴定 |
| 3.3 多肽与磁珠偶联的鉴定 |
| 3.4 多肽纯化水稻E2蛋白效果的鉴定 |
| 3.5 水稻E2蛋白纯化后的免疫评价结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）NS5B和整合素β3在猪瘟病毒复制增殖中的作用和分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 NS5B 和整合素Β3 在猪瘟病毒复制增殖中的作用研究进展 |
| 1.1 猪瘟病毒概述 |
| 1.1.1 CSFV 基因结构与功能 |
| 1.2 NS5B |
| 1.2.1 NS5B 的作用机制 |
| 1.2.2 NS5B 作用研究进展 |
| 1.3 整合素 |
| 1.3.1 整合素的结构和功能 |
| 1.3.2 整合素研究进展 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪瘟病毒 NS5B 蛋白的 RNA 聚合酶功能研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 pUNO-NS5B 及 pUNO-NS5B~(GAA)载体构建与鉴定 |
| 2.2.2 细胞转染及 NS5B RNA 聚合酶活性的细胞水平检测 |
| 2.2.3 猪瘟病毒 NS5B 氨基酸序列亲疏水性预测分析 |
| 2.2.4 pet21b-NS5B |
| 24 表达载体构建与鉴定 |
| 2.2.5 猪瘟病毒 NS5B |
| 24 蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.6 猪瘟病毒 NS5B~(mut). 蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.7 蛋白水平检测猪瘟病毒 NS5B 的聚合酶活性 |
| 2.2.8 猪瘟病毒 NS5B~(mut).蛋白体外 RNA 聚合酶活性检测 |
| 2.2.9 抑制猪瘟病毒 NS5B 聚合酶活性的药物筛选 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 猪瘟病毒衣壳蛋白（CORE）对 NS5B 聚合酶功能影响的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料和试剂 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重叠延伸 PCR 方法构建 pUNO-Core Eystrup 株及石门株载体 |
| 3.2.2 5BR 试验证明猪瘟病毒 Core 可增强 NS5B 的 RNA 聚合酶活性 |
| 3.2.3 Co-IP 证明猪瘟病毒 NS5B 可与 Core 免疫共沉淀 |
| 3.2.4 免疫荧光试验证明猪瘟病毒 NS5B 与 Core 共定位于细胞质 |
| 3.2.5 猪瘟病毒 Core 蛋白二级和三级结构预测结果图 |
| 3.2.6 pUNO-Core、Pet21b-Core 及其截短型基因载体构建及三级结构分析 |
| 3.2.7 猪瘟病毒 Core 蛋白表达纯化结果 |
| 3.2.8 猪瘟病毒 Core 蛋白可促进 NS5B 的 RNA 聚合酶活性 |
| 3.2.9 猪瘟病毒 Core 增强 NS5B 的 RNA 聚合酶活性的特性具有种属特异性 |
| 3.2.10 猪瘟病毒 Core 可以与 HCV 病毒蛋白共定位 |
| 3.2.11 DSF 证实猪瘟病毒 NS5B 与 Core 蛋白存在空间构象上的相互作用 |
| 3.2.12 Core 不依赖其前端 21 个氨基酸来增强 NS5B 的 RNA 聚合酶活性 |
| 3.2.13 电镜观察猪瘟病毒 Core 蛋白体外包装成猪瘟病毒样粒子 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 猪瘟病毒 NS5B 晶体学研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料和试剂 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 NS5B 表达载体的构建 |
| 4.2.2 猪瘟病毒 pet21b-NS5B 无标签蛋白的纯化 |
| 4.2.3 猪瘟病毒 pet21b-NS5B |
| 24 无标签蛋白纯化 |
| 4.2.4 psumo-NS5B |
| 24 蛋白纯化 |
| 4.2.5 pet21b-NS5B-71-679 无标签蛋白的纯化 |
| 4.2.6 不同病毒中 NS5B 氨基酸序列比对图 |
| 4.2.7 猪瘟病毒 NS5B 二级和三级结构预测图 |
| 4.2.8 猪瘟病毒 NS5B 蛋白稳定区的确定 |
| 4.2.9 猪瘟病毒 NS5B 蛋白 DLS 分析 |
| 4.2.10 猪瘟病毒 NS5B 结晶条件筛选 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 整合素在猪瘟病毒复制增殖中的作用研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料和试剂 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 一步法实时荧光定量 PCR 方法的建立 |
| 5.2.2 一步法及两步法实时荧光定量 PCR 检测猪瘟病毒增殖情况 |
| 5.2.3 免疫荧光和免疫细胞化学测定四种细胞中猪瘟病毒增殖情况 |
| 5.2.4 免疫荧光和免疫细胞化学测定 4 种细胞中猪瘟病毒增殖情况 |
| 5.2.5 细胞消化试验测定细胞的黏附能力 |
| 5.2.6 细胞黏附和细胞增殖试验 |
| 5.2.7 抗体阻断整合素β3 降低了猪瘟病毒的增殖量 |
| 5.2.8 整合素干扰载体瞬时转染及干扰效果鉴定 |
| 5.2.9 稳定表达干扰载体的细胞筛选及病毒增殖情况测定 |
| 5.2.10 细胞转染 let7 模拟物或者 let7 抑制物之后猪瘟病毒增殖情况测定 |
| 5.2.11 细胞转染 let7 模拟物或者 let7 抑制物之后整合素β3 含量的测定 |
| 5.2.12 猪瘟病毒感染细胞后测定细胞内 let7a、let7c、let7f 和 let7i 的表达量 |
| 5.2.13 干扰掉整合素β3 后测定细胞内 let7a、let7c、let7f 和 let7i 的表达量 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 主要缩略词和中英文对照表（ABBREVIATION INDEX） |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 已发表或接收的文章 |
| 参与的基金项目和课题 |
（3）白桦环阿齐醇合酶（CAS）基因RNAi载体构建及遗传转化初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.2 国内外研究动态 |
| 1.2.1 白桦三萜化合物 |
| 1.2.2 三萜化合物合成途径 |
| 1.2.3 植物次级代谢途径的调控 |
| 1.2.4 RNAi技术概述 |
| 1.2.5 基因的生物信息学分析 |
| 2. 白桦固醇基因BPX克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 BPX基因全长序列克隆 |
| 2.2.2 BPX3全长基因生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 白桦植株中BPX基因表达特征分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要酶及化学试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同树龄白桦植株中白桦酯醇和齐墩果酸含量与分布 |
| 3.2.2 RNA纯度和完整性检测 |
| 3.2.3 植株中白桦三萜基因表达组织特异性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 白桦CAS基因干扰载体的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 白桦BPX1基因干扰片段的选择与引物的设计 |
| 4.2.2 BPX1干扰片段的获得以及pGG-BPX1干扰载体的构建 |
| 4.2.3 pGG-BPX1干扰载体转化农杆菌的鉴定 |
| 4.2.4 化学合成法获得BPX2 RNAi表达载体 |
| 4.2.6 干扰载体转化农杆菌的鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 白桦BPX2 RNAi遗传转化及对三萜途径关键酶基因表达的影响 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 白桦组培苗的诱导 |
| 5.2.2 农杆菌侵染白桦组培苗 |
| 5.2.3 转基因植株DNA的提取(Tris-CTAB法) |
| 5.2.4 转基因白桦的PCR鉴定 |
| 5.2.5 转基因白桦的Southern印迹鉴定 |
| 5.2.6 野生型以及转基因白桦组培苗RNA的提取及反转录cDNA |
| 5.2.7 实时荧光定量PCR检测三萜合成基因的表达 |
| 5.2.8 三萜合成关键酶基因表达量的计算 |
| 5.2.9 HPLC检测转基因愈伤中三萜化合物含量 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 白桦遗传转化 |
| 5.3.2 转基因白桦植株的鉴定 |
| 5.3.3 转基因白桦的Southern印迹鉴定 |
| 5.3.4 实时荧光定量PCR检测三萜合成基因的表达 |
| 5.3.5 HPLC检测转基因愈伤中三萜化合物含量 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）烟草抗病防卫基因SGT1、RAR1的反义表达载体构建及功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一 文献综述 |
| 1 烟草的价值及抗病研究现状 |
| 1.1 烟草的价值 |
| 1.1.1 烟草的文化价值 |
| 1.1.2 烟草的经济价值 |
| 1.1.3 烟草的药用价值 |
| 1.2 烟草的病害研究现状 |
| 1.2.1 烟草的常见病害 |
| 1.2.2 烟草抗病毒病害基因工程的研究进展 |
| 2 植物抗病蛋白(R)防卫反应及研究进展 |
| 2.1 植物防卫反应 |
| 2.1.1 预存性的防卫反应 |
| 2.1.2 诱导性的防卫反应 |
| 2.2 植物抗病蛋白(R)防卫反应的信号元件 |
| 2.2.1 信号元件 EDS1、NDR1 |
| 2.2.2 信号元件 NPR1 |
| 2.2.3 信号元件 RAR1、SGT1 |
| 3 反义核酸技术及研究进展 |
| 3.1 反义核酸的作用机理 |
| 3.2 反义核酸技术的应用 |
| 3.2.1 反义核酸技术在植物上的应用 |
| 3.2.2 反义核酸技术在细菌、病毒上的应用 |
| 3.3 反义核酸的发展前景 |
| 4 本研究的目的意义 |
| 二 材料与方法 |
| 1 烟草 SGT1 、RAR1 反义表达载体的构建及转化烟草 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 供试的植物材料 |
| 1.1.2 供试的菌株及载体 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验设计 |
| 1.2.2 目的片段的获得 |
| 1.2.3 植物反义表达载体 pCAMBIA1301-SGT1 的构建 |
| 1.2.4 植物反义表达载体 pCAMBIA1301-RAR1 的构建 |
| 1.2.5 反义表达载体转化农杆菌 LBA4404 |
| 1.2.6 叶盘法转化烟草无菌苗及分化 |
| 2 烟草阳性植株的鉴定 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 供试的植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 抗性苗分子鉴定 |
| 2.2.2 GUS 的组织化学染色检测 |
| 2.2.3 RT-PCR 检测阳性株 |
| 3 转基因烟草植株的抗病功能检测 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 试验设计 |
| 3.2.2 汁液摩擦接种诱发 |
| 3.2.3 叶绿素的提取及测定 |
| 三 结果与分析 |
| 1 目的片段的扩增 |
| 2 植物反义表达载体 pCAMBIA1301-SGT1 的构建 |
| 2.1 中间载体 PupTn-SGT1 的构建 |
| 2.2 反义表达载体 pCAMBIA1301-SGT1 的构建 |
| 2.3 反义表达载体 pCAMBIA1301-SGT1 的测序比对图 |
| 3 植物反义表达载体 pCAMBIA13 01-RAR1 的构建 |
| 3.1 中间载体 PupTn-RAR1 的构建 |
| 3.2 反义表达载体 pCAMBIA1301-RAR1 的构建 |
| 3.3 反义表达载体 pCAMBIA1301-RAR1 的测序比对图 |
| 4 标记基因 HptII 检测阳性株 |
| 5 GUS 的组织化学染色检测 |
| 6 RT-PCR 检测阳性植株 |
| 6.1 烟草总 RNA 的提取与电泳检测 |
| 6.2 总 RNA 反转录后不同植株的表达情况 |
| 7 转基因阳性植株的获得 |
| 8 转基因烟草植株的抗病毒检测 |
| 8.1 接种普通烟草花叶病病毒（TMV） |
| 8.2 接种烟草赤星病 |
| 8.3 叶绿素的提取及检测 |
| 9 讨论 |
| 四 本研究的主要结论 |
| 1.烟草反义表达载体的构建 |
| 2.转基因阳性烟草植株的获得 |
| 3.T0代转基因烟草植株的抗病性鉴定 |
| 参考文献 |
| 附录 1部分试剂配方 |
| 附录 2 缩略词 |
| 附录 3 转基因烟草照片 |
| 附录 4 载体构建图谱 |
| 致谢 |
（5）RNA干扰途径抗猪瘟病毒研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 RNAI及其在抗病毒研究中的应用 |
| 1.1 RNAi的发现 |
| 1.2 RNAi的作用机制 |
| 1.3 植物病毒的基因沉默 |
| 1.4 人和其它动物病毒的RNAi |
| 1.5 RNAi抗病毒感染药物 |
| 1.6 病毒逃逸RNAi |
| 1.7 展望 |
| 第2章 猪瘟病毒分子生物学及致病机制研究进展 |
| 2.1 猪瘟病毒基因组结构 |
| 2.2 猪瘟病毒基因组非编码区 |
| 2.3 猪瘟病毒基因组结构蛋白 |
| 2.4 猪瘟病毒基因组非结构蛋白 |
| 2.5 猪瘟病毒在感染宿主体内分布 |
| 2.6 猪瘟病毒的致病机制 |
| 2.7 结语 |
| 第3章 转基因动物研究概述 |
| 3.1 原核注射和基因打靶构建转基因小鼠 |
| 3.2 可诱导系统构建转基因动物 |
| 3.3 构建转基因动物最新的研究进展 |
| 3.4 非哺乳类脊椎动物和无脊椎动物转基因动物构建 |
| 3.5 RNAi介导的基因敲减 |
| 3.6 转基因动物分析方法 |
| 3.7 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 猪瘟病毒N~(PRO)、NS2和NS3基因干扰靶点的筛选 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 构建单表达和多表达猪瘟病毒抗性基因 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 转基因克隆猪抗病毒初步研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 RNAI压力下病毒靶位点突变的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（6）分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制调节作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 猪瘟病毒研究进展 |
| 1.1 猪瘟病毒概述 |
| 1.1.1 CSFV 的形态和理化特性 |
| 1.1.2 CSFV 在感染宿主体内的分布 |
| 1.1.3 CSFV 的培养细胞 |
| 1.2 猪瘟病毒基因组结构及其功能 |
| 1.2.1 CSFV 的5′-UTR 和3′-UTR |
| 1.2.2 CSFV 的结构蛋白及其功能 |
| 1.2.3 CSFV 的非结构蛋白及其功能 |
| 1.3 猪瘟病毒与分子伴侣的关系 |
| 1.3.1 分子伴侣定义 |
| 1.3.2 分子伴侣的分类和功能 |
| 1.3.3 分子伴侣的抗病毒作用 |
| 1.3.4 分子伴侣Jiv90 与瘟病毒属成员的相互作用 |
| 第二章 RNAI 及其在抗病毒中的应用 |
| 2.1 RNA 干扰的发现 |
| 2.2 RNAI 的作用机制 |
| 2.2.1 转录后水平基因沉默 |
| 2.2.2 转录水平基因沉默 |
| 2.3 RNAI 研究的一般策略 |
| 2.3.1 siRNA 序列的设计原则 |
| 2.3.2 mRNA 靶位点对RNA 干扰效率的影响 |
| 2.3.3 siRNA 常用制备方法 |
| 2.4 RNAI 技术在抗病毒研究中的应用 |
| 试验研究 |
| 第三章 分子伴侣JIV90 基因的克隆和真核表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 材料和常用试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.2 方法与步骤 |
| 3.2.1 猪Jiv90 基因的克隆 |
| 3.2.2 真核表达载体pEGFP-C1-Jiv90 的构建及鉴定 |
| 3.2.3 稳定表达Jiv90 细胞株的获得 |
| 3.2.4 Real-time PCR 检测转染后Jiv90m RNA 的表达情况 |
| 3.2.5 细胞接毒试验 |
| 3.2.6 Real-time PCR 检测病毒RNA 的表达情况 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 总RNA 质量检测 |
| 3.3.2 RT - PCR 扩增结果 |
| 3.3.3 真核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.3.4 转染结果的观察 |
| 3.3.5 表达Jiv90 SUVEC 株的获得 |
| 3.3.6 表达Jiv90 SUVEC 中Jiv90 基因mRNA 的相对定量结果 |
| 3.3.7 细胞接毒实验结果 |
| 3.3.8 表达Jiv90 SUVEC 中病毒RNA 的相对定量结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 抑制JIV90 基因表达SHRNA 干扰载体的构建和细胞株的筛选 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 材料和常用试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 相关试剂的配制 |
| 4.2 方法与步骤 |
| 4.2.1 J iv90 基因的序列分析及四个靶点shRNA 的设计 |
| 4.2.2 shRNA 干扰载体的构建 |
| 4.2.3 干扰载体转染猪血管内皮细胞 |
| 4.2.4 G418 筛选及阳性细胞的获得 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 干扰序列设计结果 |
| 4.3.2 实验合成的DNA 序列 |
| 4.3.3 酶切鉴定结果 |
| 4.3.4 测序结果 |
| 4.3.5 G418 筛选获得的细胞株 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）猪瘟病毒E0蛋白单克隆抗体的制备及其胶体金免疫层析检测方法的初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 猪瘟病毒研究进展 |
| 1.1 猪瘟流行病学进展 |
| 1.2 猪瘟病毒的特征 |
| 2 实验室四种常规诊断技术 |
| 2.1 病毒分离鉴定 |
| 2.2 荧光抗体法(Fluorescent antibody test,FAT) |
| 2.3 反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR) |
| 2.4 酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked-Immunosorbnent Assay；ELISA) |
| 3 免疫胶体金技术(IMMUNE COLLOIDAL GOLD TECHNIQUE,ICG) |
| 3.1 免疫胶体金技术背景 |
| 3.2 免疫胶体金技术的基本原理 |
| 3.3 免疫胶体金快速检测技术 |
| 3.4 免疫胶体金技术在免疫学中的应用 |
| 3.5 免疫胶体金技术在兽医检验中的应用 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 猪瘟病毒E0基因在大肠杆菌中的表达 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒pET-C-E0的鉴定 |
| 2.3 表达产物的检测 |
| 2.4 重组蛋白的检测 |
| 3 讨论 |
| 第二章 猪瘟病毒EO重组蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.2 腹水的纯化 |
| 2.4 单抗腹水的制备及抗体效价 |
| 2.5 抗体稳定性测定 |
| 2.6 单抗特异性试验 |
| 3 讨论 |
| 第三章 猪瘟免疫层析胶体金方法的初步探索 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 胶体金溶液的制备 |
| 2.2 免疫胶体金的制备 |
| 2.3 胶体金试纸条的组装与检测 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（8）猪瘟病毒的shRNA干扰、强弱毒鉴别及基因工程疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪瘟及猪瘟病毒研究进展 |
| 1.1 猪瘟研究进展 |
| 1.1.1 猪瘟概述 |
| 1.1.2 猪瘟的病原 |
| 1.1.3 猪瘟的临床症状 |
| 1.1.4 猪瘟的流行病学 |
| 1.1.5 猪瘟的致病机理 |
| 1.1.6 猪瘟的诊断 |
| 1.1.7 猪瘟的防控 |
| 1.2 猪瘟病毒研究进展 |
| 1.2.1 猪瘟病毒的基本形态和理化特性 |
| 1.2.2 病毒的基因型 |
| 1.2.3 猪瘟病毒基因组结构 |
| 1.2.4 病毒主要基因的功能 |
| 1.3 猪瘟疫苗研究进展 |
| 1.3.1 传统的CSF 疫苗 |
| 1.3.2 猪瘟基因工程疫苗 |
| 试验研究 |
| 第二章 干扰猪瘟病毒shimen 株3′-NTR shRNA 表达载体的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要工具酶及试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 靶向CSFV 3′-NTR 区段小干扰RNA（siRNA）序列的选取及设计 |
| 2.2.2 编码短发夹RNA（shRNA）序列的DNA 单链设计与合成 |
| 2.2.3 重组表达质粒的构建 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组质粒构建模式图 |
| 2.3.2 重组质粒的测序 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 转录靶向CSFV Shimen 株3′-NTR shRNA 细胞株的建立及对CSFV 增殖干扰研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、毒株、菌株和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组pGenesil-1 表达质粒的纯化 |
| 3.2.2 重组干扰表达载体转染PK-15 细胞 |
| 3.2.3 稳定转录靶向CSFV Shimen 株3′-NTR shRNA PK-15 细胞株的获得 |
| 3.2.4 阳性细胞株CSFV 增殖的干扰 |
| 3.2.5 CSFV 增殖干扰效果的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组干扰载体的纯化 |
| 3.3.2 G418 最佳筛选浓度 |
| 3.3.3 G418 筛选及阳性细胞克隆的获得 |
| 3.3.4 转录靶向CSFV Shimen 株3′-NTR shRNA PK-15 细胞株的获得 |
| 3.3.5 PCR 扩增条件的优化 |
| 3.3.6 CSFV NS3 基因半定量 RT-PCR 检测 |
| 3.3.7 CSFV 病毒粒子的ELISA 检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 猪瘟病毒强弱毒株RT-PCR 快速鉴别检测方法研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株、质粒和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂和酶 |
| 4.1.3 临床待检样品 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 引物设计与合成 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病毒RNA 的提取和cDNA 合成 |
| 4.2.2 PCR |
| 4.2.3 特异性试验与PCR 产物鉴定 |
| 4.2.4 临床样品的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 RT-PCR 扩增CSFV 反应条件的确定 |
| 4.3.2 RT-PCR 对CSFV 强弱毒株的扩增 |
| 4.3.3 PCR 产物鉴定 |
| 4.3.4 对其他猪源病毒和疑似猪瘟病料的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 猪瘟病毒E2 基因“自杀性”DNA 疫苗的构建及动物免疫试验 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株、质粒与细胞株 |
| 5.1.2 主要试剂和工具酶 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.1.5 引物设计和PCR 扩增 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 CSFV Shimen 株E2 基因的克隆与鉴定 |
| 5.2.2 重组自杀性DNA 疫苗表达载体的构建 |
| 5.2.3 重组质粒的细胞转染与E2 蛋白体外表达 |
| 5.2.4 重组质粒免疫小鼠T 细胞增殖检测 |
| 5.2.5 本动物免疫及抗体测定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 猪瘟病毒Shimen 株E2 基因的克隆及鉴定 |
| 5.3.2 以表达引物的PCR 扩增 |
| 5.3.3 E2 基因重组表达质粒的鉴定 |
| 5.3.4 重组表达质粒体外转染的检测 |
| 5.3.5 免疫小鼠T 细胞增殖检测 |
| 5.3.6 免疫猪特异性抗体的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 表达CSFV Shimen 株E0 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 毒株、菌株和质粒 |
| 6.1.2 主要试剂和工具酶 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 鸡胚和试验动物 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 引物设计与合成 |
| 6.2.2 含CSFV E0 和E2 基因的鸡痘病毒转移载体的构建 |
| 6.2.3 重组病毒的获得与纯化 |
| 6.2.4 重组鸡痘病毒FV282-E0-E2 的鉴定 |
| 6.2.5 重组鸡痘病毒FV282-E0-E2 诱导小鼠的免疫应答 |
| 6.2.6 重组鸡痘病毒对试验猪的免疫保护试验 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 CSFV E0、E2 基因的扩增 |
| 6.3.2 含CSFV E0-E2 基因的鸡痘病毒转移载体的鉴定 |
| 6.3.3 重组鸡痘病毒FV282-E0-E2 的筛选与纯化 |
| 6.3.4 重组鸡痘病毒FV282-E0-E2 的PCR 鉴定 |
| 6.3.5 FV282-E0-E2 免疫小鼠抗猪瘟血清抗体的检测 |
| 6.3.6 免疫试验猪的结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）抗猪瘟病毒转基因猪的构建及初步研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 RNAi及其在抗病毒病及转基因动物中的应用 |
| 1.1 RNA沉默的发现 |
| 1.2 RNAi的作用机制 |
| 1.3 RNAi研究的一般策略 |
| 1.4 RNAi的应用 |
| 第2章 转基因动物研究概述 |
| 2.1 转基因动物的制作方法 |
| 2.2 转基因动物的应用 |
| 2.3 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 针对猪瘟病毒N~(pro)基因shRNA表达载体的构建 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 稳定表达猪瘟病毒特异性shRNA猪胚胎成纤维细胞的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 抗猪瘟病毒shRNA转基因猪的初步研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
（10）红豆杉紫杉烷13α-，14β-羟基化酶基因调控及茉莉酸甲酯诱导下的蛋白表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 紫杉烷13α-,14β-羟基化酶基因调控研究 |
| 一 引言 |
| 1 紫杉醇生物合成的研究现状 |
| 2 紫杉醇代谢的研究 |
| 3 转基因技术在紫杉醇生物合成中的应用 |
| 4 小RNA与RNA干扰技术在植物转基因工程中的应用 |
| 5 立论依据和研究意义 |
| 6 研究的主要内容 |
| 7 技术路线 |
| 二 材料与方法 |
| 1 紫杉烷1 3α-羟基化酶基因正向表达载体的构建 |
| 2 14-β羟基化酶基因反义RNA表达载体的构建 |
| 3 14-β羟基化酶基因RNAi表达载体的构建 |
| 4 几种miRNA表达载体的构建 |
| 5 高效转基因体系的建立 |
| 6 转基因材料的检测 |
| 三 结果与分析 |
| 1 影响转基因体系的几种因素 |
| 2 利用pZ14aRNAi载体转化红豆杉细胞 |
| 3 利用pZ14bRNAi载体转化红豆杉细胞 |
| 4 利用pZ14 c反义RNA载体转化红豆杉细胞 |
| 5 利用pC13OH载体转化红豆杉细胞 |
| 6 利用pE415载体转化红豆杉细胞 |
| 7 其他转化红豆杉细胞的实验 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 六 参考文献 |
| 第二章 茉莉酸甲酯诱导下红豆杉细胞中蛋白质的表达 |
| 一 引言 |
| 1 蛋白质组学的研究进展 |
| 2 茉莉酸甲酯的生理学特性及应用 |
| 3 立论依据和研究意义 |
| 4 研究目标和主要内容 |
| 5 技术路线 |
| 二 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 三 结果与分析 |
| 1 茉莉酸甲酯诱导中国红豆杉愈伤组织细胞的生长情况 |
| 2 蛋白质浓度测定 |
| 3 单向凝胶电泳结果 |
| 4 双向电泳的重复性 |
| 5 蛋白质表达的差异分析 |
| 6 差异蛋白的肽指纹图谱分析 |
| 7 质谱分析 |
| 四 讨论 |
| 五结论 |
| 六 参考文献 |
| 第三章 抗凋亡抑制剂DEVD-CapaseⅢ对紫杉醇生物合成的影响 |
| 一 引言 |
| 1 细胞凋亡的研究概述 |
| 2 研究意义 |
| 3 研究目标和主要内容 |
| 4 技术路线 |
| 二 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 三 结果与分析 |
| 1. 红豆杉愈伤组织细胞的生长情况 |
| 2. HPLC分析实验样品中的紫杉烷种类及含量的变化 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 六 参考文献 |
| 第四章 未知化合物的鉴定 |
| 一 电喷雾离子阱二级质谱法(LC-ESI-MS/MS)分析 |
| 二 HPLC-HRMS分析 |
| 三 HPLC二极管阵列检测器(DAD)检测分析 |
| 四 对未知成分的纯化 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验仪器 |
| 3 方法 |
| 五 结果与讨论 |
| 1 结果 |
| 2 讨论 |
| 六 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、猪瘟病毒反义cDNA片段的化学合成及克隆（论文参考文献）
- [1]靶向猪瘟病毒E2蛋白亲和肽的理性设计及其应用[D]. 余秋颖. 四川农业大学, 2018(02)
- [2]NS5B和整合素β3在猪瘟病毒复制增殖中的作用和分子机制研究[D]. 李维维. 西北农林科技大学, 2014(03)
- [3]白桦环阿齐醇合酶（CAS）基因RNAi载体构建及遗传转化初步研究[D]. 马泓思. 东北林业大学, 2014(05)
- [4]烟草抗病防卫基因SGT1、RAR1的反义表达载体构建及功能的研究[D]. 单睿阳. 福建农林大学, 2012(11)
- [5]RNA干扰途径抗猪瘟病毒研究[D]. 李江南. 吉林大学, 2011(10)
- [6]分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制调节作用的研究[D]. 刘伟. 西北农林科技大学, 2010(11)
- [7]猪瘟病毒E0蛋白单克隆抗体的制备及其胶体金免疫层析检测方法的初步探索[D]. 张露露. 南京农业大学, 2012(01)
- [8]猪瘟病毒的shRNA干扰、强弱毒鉴别及基因工程疫苗研究[D]. 郭抗抗. 西北农林科技大学, 2010(10)
- [9]抗猪瘟病毒转基因猪的构建及初步研究[D]. 王铁东. 吉林大学, 2009(07)
- [10]红豆杉紫杉烷13α-，14β-羟基化酶基因调控及茉莉酸甲酯诱导下的蛋白表达[D]. 李凤岚. 北京协和医学院, 2009(12)