一、鸡传染性喉气管炎、传染性支气管炎和新城疫病毒对10个家系BWEL-SPF鸡或鸡胚的感染试验（论文文献综述）
胡晓苗,盛豪,郑忠毅,卞希一,张丹俊,周继勇,廖敏,潘孝成[1]（2021）在《鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株S1基因序列及致病性分析》文中进行了进一步梳理从安徽合肥一养殖户送检的临床样品中分离到一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为HF200702。分离株在鸡胚盲传3代过程中可引起典型的侏儒胚现象;基于分离株S1基因序列对毒株进行分型结果显示,分离株属于目前流行的QX型,与H120、M41、4/91、QX等疫苗株的同源性分别为76.1%、75.6%、78.3%、95.0%;用分离株第10代鸡胚尿囊液感染1日龄SPF雏鸡,对雏鸡的致死率为41.6%,感染鸡出现精神沉郁、张口呼吸、气管啰音等临床症状以及气管纤毛摆动停滞、肾脏肿大、尿酸盐沉积等病理变化。感染鸡从感染后第2 d开始持续向外界排毒直至感染后28 d。该研究数据表明,从安徽合肥某养鸡场疑似发生传染性支气管炎的鸡群中分离到QX型的IBV,该毒株对雏鸡有较强的致病作用,研究结果为了解该地区IBV的流行情况提供了参考数据。
文开[2]（2021）在《鸡新城疫的病原学、流行病学及综合防控措施》文中提出鸡新城疫是由新城疫病毒引起的急性、高度接触性、败血性传染病,任何品种、日龄的鸡均可感染新城疫病毒,且患病鸡只日龄越小病死率越高,严重影响雏鸡成活率,对养鸡业有非常大的危害。本文介绍鸡新城疫的病原学、流行病学、临床症状、诊断方法及综合防控措施,意在帮助更多的养鸡场管理人员正确认识这一疾病,并科学地进行综合防控。
林志娴[3]（2021）在《鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的研究及S蛋白表达与单抗制备》文中认为鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的急性、高度接触性病毒性传染病。主要引起雏鸡死亡,肉鸡饲料报酬低,产蛋鸡产蛋下降。由于其病原易于突变、并可重组产生新的基因型导致该病防控难度加大。国内目前还没有IBV抗原抗体标准参考品,有关S蛋白的生物学特性研究还不深入。该病主要通过接种疫苗进行防控,但由于疫苗交叉保护性差导致该病在免疫鸡群中仍时有发生。本研究通过扩增IBV经典毒株IBV-M41株以及当下流行毒株IBV-CK/CH/2014/FJ14株的尿囊液作为备用抗原,将病毒接种14日龄雏鸡制备多抗血清作为备用抗体。上述制备的抗原抗体通过一系列标定后研制了IBV抗原抗体参考品。同时,通过真核载体表达系统表达了 IBV-CK/CH/2014/FJ14株的S蛋白,利用杂交瘤技术研制获得3株单克隆抗体,以期为该病的防控与诊断提供相应的生物材料。1.鸡传染性支管炎病毒抗原抗体参考品的制备本研究通过SPF鸡胚尿囊腔接种IBV-M41株和IBV-CK/CH/2014/FJ14株扩增病毒。对收集的尿囊液通过接种鸡胚、气管环和细胞等进行定值,结果显示IBV-M41株和 IBV-CK/CH/2014/FJ14 株 EID50 值为 105.8EID50/mL。IBV-M4 1 株 TOC-ID50 值为105.25TOC-ID50/mL,TCID50 值为 104.5TCID50/mL。IBV-CK/CH/2014/FJ14 株病毒 TOC-ID50值为105.5TOC-ID50/mL,TCID50值为104.75TCID50/mL。特异性鉴定结果表明,制备的抗原不含禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）、小鹅瘟病毒（Gooseparvoviruses,GPV）、传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）、禽传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）、马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）、禽网状内皮组织增生病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）、鸡传染性贫血病病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）等外源病毒。所制备的样品经无菌检验和支原体检测,结果均为阴性。经分析备用抗原的物理性状、装量差异、均一性、稳定性、长期保存性等结果均良好,因此制备的抗原可以作为IBV抗原标准参考品。使用制备的IBV-M41株、IBV-CK/CH/2014/FJ14株病毒分别免疫14日龄SPF鸡,之后每间隔7天加强免疫一次,并检测抗体效价,直至第三次免疫28天后采集血清,进行抗体相关特性定值。结果:IBV-M41株多抗血清经测定,间接免疫荧光（IFA）效价为1:800,中和效价为1:1722,酶联免疫吸附试验（ELISA）效价为1:1600,血凝抑制（HI）效价为1:27。IBV-CK/CH/2014/FJ14株多抗血清经测定,IFA效价为1:800,中和效价为1:1488,ELISA效价为1:1600。进一步特异性鉴定表明该批次获得的多抗血清未检测到REV、MDV、ALV、AIV等禽类传染病病毒的抗体。分装冻干后进行无菌检测和支原体检测表明该抗体血清中细菌、霉菌和支原体均为阴性。经分析多抗血清的物理性状、装量差异、均一性、稳定性、长期保存性等结果均良好,即制备的抗体血清可作为IBV抗体标准参考品。2.鸡传染性支气管炎病毒S蛋白在真核系统中的表达本研究首先通过PCR扩增IBV-CK/CH/2014/FJ14株病毒S基因胞外域,并克隆到pFast-Bac-HTA载体中进行酶切和测序鉴定,鉴定后转座到大肠杆菌DH1OBacTM感受态细胞中,构建重组杆粒rBacmid-FJ14-S,再通过脂质体介导转染到Sf9细胞中,获得重组杆状病毒rBac-FJ14-S。IFA鉴定表明重组病毒能与IBV阳性鸡血清反应,Western blot分析发现在140 kDa附近有一条目的条带,与预期大小一致,证明IBVS蛋白胞外域获得成功表达。与此同时,将构建好的pCAGGS-FJ14SI-IgGFc真核表达载体转染到293T细胞中,通过IFA鉴定证明,融合蛋白能与IBV阳性鸡血清发生特异性反应。通过Proten G纯化柱纯化,获得纯化融合蛋白FJ14Sl-IgGFc,SDSA-PAGE、Western blot分析结果表明,纯化蛋白大小符合预期,SI融合蛋白得以正确表达。3.鸡传染性支气管炎病毒S蛋白单克隆抗体的制备本研究用超速离心浓缩的IBV-CK/CH/2014/FJ14尿囊液病毒免疫6-8周龄BALB/C小鼠,每七天免疫一次,三免7天后对小鼠进行尾静脉采血,使用研究内容二获得的转染pCAGGS-FJ14S1-IgGFc载体的293T细胞测定效价,其IFA效价为1:800。通过细胞融合,借助研究内容二构建得到的pCAGGS-FJ14S1-IgGFc载体转染293T细胞进行IFA筛选。最终获得三株单克隆抗体,分别命名为Mab-IBV-S1-1H9,Mab-IBV-S1-5D3,Mab-IBV-S 1-5G11。Western blot实验表明三株单抗均能与纯化的重组蛋白FJ14S1-IgGFc良好反应。
马彩红[4]（2021）在《鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及鸡5种病毒多重PCR诊断方法的初步建立》文中研究说明
刘昊昀[5]（2021）在《噬菌体介导的禽传染性支气管炎病毒ELISA诊断方法及初步应用》文中指出
赵成龙[6]（2021）在《禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒的质量研究及应用》文中提出禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽急性呼吸系统疾病,可感染多种家禽和野生鸟类。禽流感病毒自发现以来,每年都有疫病流行的报道,目前在全球多个国家和地区呈大范围流行。其中,H5和H7亚型高致病性禽流感每次暴发都会给养禽业造成巨大的经济损失。H5和H7亚型禽流感病毒均有感染人的报道,对人类生命健康构成巨大威胁,严重危害公共卫生安全。因此,建立禽流感病毒高通量的快速检测和鉴定方法,对于开展禽流感疫情的监测预警和保障公共卫生安全具有重要意义。为了更快速准确的检测禽流感病毒,尤其是H5和H7亚型禽流感病毒,本研究在已有的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测方法的基础上,根据生产需求进一步优化,组成完整的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒制品,用制备的质控品对该试剂盒进行质量研究,并将该试剂盒用于大量临床样品检测,评价检测效果。为了对禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒进行质量研究,本研究选择了 14株不同亚型禽流感病毒株、1株新城疫病毒株、1株鸡传染性支气管炎病毒株、1株鸡传染性法氏囊病毒株、1株禽白血病毒株、1株禽网状内皮组织增生症病毒株和2只SPF鸡组织样品作为质控品,进行试剂盒质控品制备与鉴定。首先,对质控品制备工艺进行研究,确定最合适的灭活剂和冻干保护剂组合。结果显示,β-丙内酯与蔗糖脱脂乳作灭活冻干组合效果最佳,冻干品在4℃保存第7 d、30 d、90 d分别检测,结果无明显差异;其次,将所有毒株进行培养、灭活、冻干,并用已公布的特异性荧光检测引物进行鉴定;选择1株H5亚型禽流感病毒株和1株H7亚型禽流感病毒株作为敏感性质控品并进行标定,用对应的引物探针检测结果为阳性,且未出现非特异性扩增,禽流感病毒通用检测引物探针检测敏感性质控品H7-2强阳性Ct值为25.296±0.981,H5亚型禽流感病毒强阳性Ct值为25.439±1.161,H7亚型禽流感病毒强阳性Ct值为27.658±1.020;将其余的毒株作为特异性质控品,用对应的引物探针检测结果为阳性,且未出现非特异性扩增;最后,将2只SPF鸡的血清、匀浆液上清和拭子作为阴性质控品,鉴定结果均为阴性。制备的敏感性质控品、特异性质控品和阴性质控品能满足禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒质量研究的需要。为了检验禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒的质量是否符合标准,做了以下研究:（1）敏感性研究:分别用3个批次的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒按照试剂盒说明书对敏感性质控品、特异性质控品、阴性质控品、45份H5亚型禽流感病毒阳性临床样品和45份H7亚型禽流感病毒阳性临床样品进行检测,同时用OIE推荐或论文公开发表的检测方法进行平行试验,与标准方法检测结果符合率为100%;将敏感性质控品H5-2 和 H7-2 用 PBS 进行 10 倍梯度稀释,选择 101、102、103、104、105、106、107、108倍稀释度样品提取核酸,用禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒进行检测,每个稀释度做20个重复,确定检测结果中阳性检出率刚好大于等于95%时的样品稀释度,该稀释度即为对应亚型的最低检出量,对应的Ct值即为阳性判定标准。结果显示,检测禽流感病毒通用型的引物探针对敏感性质控品H7-2的最低检测限为107倍稀释度,Ct值为37.614±0.250,检测H5亚型禽流感病毒的引物探针对敏感性质控品H5-2的最低检测限为106倍稀释度,Ct值为37.736±0.210,检测H7亚型禽流感病毒的引物探针对敏感性质控品H7-2的最低检测限为107倍稀释度,Ct值为37.833±0.312;（2）特异性研究:分别用3个批次的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒对敏感性质控品、特异性质控品、阴性质控品和60份阴性临床样品进行检测,3批试剂盒检测均未出现异常扩增曲线;（3）重复性研究:分别用3个批次的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒检测敏感性质控品,敏感性质控品需进行10倍梯度稀释至最低检出限,每个稀释度做3个重复,批内平均变异系数为1.31%,批间平均变异系数为1.84%,批内批间变异系数均小于3%。结果证明禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒敏感性、特异性和重复性均较好。为了在实际应用的条件下评估禽流感病毒（通用、H5、H7）荧光RT-PCR检测试剂盒的临床适用性,本试验用试剂盒对4个省份活禽交易市场1920份拭子样品进行检测。结果显示,禽流感病毒阳性样品775份,其中61份为H5亚型禽流感病毒,6份为H7亚型禽流感病毒。由此说明,试剂盒可以用于禽流感病毒临床检测,既能检出禽流感病毒,同时可以区分H5和H7亚型高致病性禽流感病毒,能够满足临床检测需求。
盛洁[7]（2021）在《表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价》文中认为鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性上呼吸道传染病,对全球家禽养殖业危害严重,是目前养禽业面临的最重要疫病之一。有必要基于IBV流行病学研究结果,针对目前我国主要流行的毒株类型研制新型疫苗。纤突（Spike,S）蛋白是IBV病毒粒子表面重要的糖蛋白,在病毒入侵以及受体结合等方面发挥重要作用。纤突蛋白在成熟过程中进一步裂解为S1亚基和S2亚基,其中S1亚基含有病毒主要的中和表位,是IBV重要的免疫原基因,往往将其作为IBV型特异性疫苗设计的主要靶点。鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）引起的影响家禽生产的另一大病毒性呼吸道传染病。该病往往呈地方性散发,但近年来国内鸡群频繁暴发ILT,造成较大的经济损失,弱毒疫苗作为防控该病的有效手段,引起养禽业界的重视。ILTV和IBV作为两种重要呼吸道病毒,由于两者对宿主的感染部位和免疫机理相似,研制联合疫苗成为同时防控这两种疫病的迫切需求,ILTV具备作为疫苗载体表达其他病原保护性抗原的潜质。鉴于此,基于ILT弱毒株来构建表达IB重要免疫原基因的重组ILT基因工程载体联合疫苗便成为同时防控IB和ILT两种疫病的最优选择。本研究以ILTV弱毒株CK/CH/LHLJ/120305株为亲本毒株,将其US9基因缺失并插入增强型绿色荧光蛋白表达盒（EGFP）后获得的ILTV突变体ILTV-ΔUS9-G株作为中间病毒,采用基因同源重组技术,将ILTV-ΔUS9-G株病毒的EGFP基因分别替换为IBV GI-19（QX）型强毒株CK/CH/LDL/091022株的S基因和S1基因,获得表达IBV S蛋白的重组病毒ILTV-ΔUS9-S株及表达IBV S1蛋白的重组病毒ILTV-ΔUS9-S1株。两株重组病毒插入的外源基因S基因和S1基因不影响其体外复制能力,且ILTV-ΔUS9-S1株较亲本弱毒CK/CH/LHLJ/120305株复制滴度更高。两株重组病毒在LMH（Leghorn male hepatocellular cell,鸡肝癌细胞系）上连续传代15代,并以本研究制备的抗IBV S1蛋白的单克隆抗体对重组病毒进行间接免疫荧光检测,结果显示,IBV S蛋白和S1蛋白分别在两株重组病毒中能稳定表达,但表达量较低。两株重组病毒接种SPF鸡后,无不良临床反应,说明重组病毒对鸡是安全的。为评价两株重组病毒对ILTV强毒的免疫保护效果,采用间接ELISA对免疫鸡的血清抗体进行检测,结果显示,免疫后7 d两株重组病毒即能诱导鸡只产生高水平的血清抗体,其中ILTV-ΔUS9-S1株诱导产生的抗体水平更高。从ILTV WG株攻毒后的临床表现来看,两株重组病毒免疫组鸡只不表现呼吸道症状,喉头、气管中的病毒载量远低于对照组鸡只,且ILTV-ΔUS9-S株免疫组鸡只的咽拭子攻毒后8 d不再排毒,ILTV-ΔUS9-S1株免疫组攻毒后12 d不再排毒,显示两株重组病毒均能提供针对ILTV强毒株的完全保护。对于重组病毒针对IBV CK/CH/LDL/091022强毒株的免疫保护效果,s Ig A及IFN-γELISpot检测结果显示,两株重组病毒仅能诱导部分鸡只产生有限的特异性粘膜免疫及细胞免疫反应,对免疫后鸡只进行血清抗体检测,显示免疫后两个免疫组仅有部分鸡血清抗体转阳。两株重组病毒免疫组与对照组在IBV强毒攻毒后5 d时气管和肾脏内均可检测到病毒,各组病毒载量无显着差异,但攻毒后8 d重组病毒ILTV-ΔUS9-S株及ILTV-ΔUS9-S1株免疫组的咽拭子排毒率分别为50%,60%;攻毒后12 d分别为10%,0;相对于对照组在攻毒后8 d和12 d排毒率为80%和20%而言,两株重组病毒免疫后能够在一定程度上加速免疫鸡呼吸道内病毒的清除,但总体而言所激发的免疫保护作用较弱。综上所述,本研究成功构建了分别表达GI-19（QX）型IBV S蛋白和S1蛋白基因的重组ILTV,ILTV-ΔUS9-S株及ILTV-ΔUS9-S1株,两株重组病毒都能对ILTV强毒株攻击提供完全保护,也能够激发针对IBV GI-19（QX）型强毒株S1蛋白的免疫反应,但并不能提供针对IBV强毒的完全免疫保护作用,有待进一步改进和优化外源免疫原基因的表达水平,提升ILTV作为重组基因工程载体的潜在价值。
栾勇娇[8]（2021）在《血清4型禽腺病毒广西分离株全基因组测序分析、检测方法和致病性研究》文中指出血清4型禽腺病毒（FAdV-4）可引起心包积液-肝炎综合征（HHS）等家禽疾病,于1987年在巴基斯坦首次报道。2015年以来,一种新发FAdV-4（FAdV-4变异株）在我国山东、河南、吉林、广东、广西等地鸡群暴发流行,主要感染3～6周龄的肉鸡,且死亡率较高,给我国养禽业造成严重的经济损失。本研究对6株FAdV-4广西分离株全基因组序列测定与遗传进化分析,结果显示基因组全长为43714～43721 bp,包括43个开放阅读框。与之前的FAdV-4毒株（FAdV-4非变异株）相比,6株FAdV-4广西分离株核苷酸序列发生明显变异,主要是基因组右端存在1966 bp大片段缺失。Hexon、Penton和Fiber主要结构蛋白的氨基酸位点均有不同程度变异,其中Fiber-2突变位点最多,与国内近年报道的高致病性FAdV-4分离株的变异相似。目前,尚未有同时鉴别FAdV-4变异株和非变异株的检测方法,本研究从Gen Bank下载FAdV-4变异株和非变异株的核苷酸序列,结合利用Primer Explorer V5和Premier 5.0引物设计软件,设计筛选了两套环介导等温扩增（LAMP）引物和2条分子信标探针,对反应时间、反应温度、引物浓度等进行优化,建立了鉴别诊断FAdV-4变异株和非变异株的二重荧光LAMP检测方法。该法特异性好,在520 nm和670 nm双荧光通道下,对FAdV-4变异株、非变异株的扩增结果分别为绿色和红色,对FAdV-4变异株和非变异株混合感染样品的扩增结果为黄色,而对FAdV其它血清型、新城疫病毒、禽呼肠孤病毒等毒菌株的检测结果均为阴性;灵敏度高,检测下限为100 copies/μL;干扰性小,高浓度模板不影响低浓度模板的扩增。建立的二重荧光LAMP检测方法可区分FAdV-4变异株、非变异株和二者混合感染。为了解FAdV-4广西分离株的致病性,以不同剂量和途径感染SPF鸡。以不同剂量肌肉注射感染4周龄SPF鸡,记录每组发病和死亡情况;以101.5TCID50剂量通过肌肉注射和口服途径感染SPF鸡,剖检观察病变,并采集组织样品和棉拭子样品,通过荧光定量PCR方法检测病毒载量,通过组织切片观察病理学变化。结果显示,剂量为107～103TCID50,可造成鸡100%死亡;剂量为102TCID50、10 TCID50和1 TCID50,死亡率分别为90%、30%和10%。肌肉注射比口服方式更易感,剖检发现明显的心包积液和肝脏肿胀发黄。肝脏出现广泛性的细胞变性坏死和核内包涵体,脾脏、法氏囊和胸腺三个免疫器官出现了广泛的淋巴细胞变性坏死。FAdV-4侵害肝脏、心脏等组织,主要的靶器官是肝脏,感染FAdV-4的鸡可通过咽喉和泄殖腔进行排毒。本研究对6株FAdV-4广西分离株进行了全基因组测序,并与国内外FAdV-4毒株序列进行比较分析,掌握了FAdV-4广西分离株的序列信息和变异情况。通过设计筛选两套LAMP引物,优化反应条件,建立了鉴别诊断FAdV-4变异株和非变异株的二重荧光LAMP检测方法。以不同的剂量和途径感染SPF鸡,结果发现FAdV-4对4周龄SPF鸡致病性强,肌肉注射方式更易感,组织嗜性广泛,主要的靶器官是肝脏,可通过泄殖腔和咽喉排毒。本研究对FAdV-4全基因组测序分析、鉴别诊断变异株的检测方法和致病性进行研究,为我国新发FAdV-4的防控提供理论依据和技术支撑。
武奇[9]（2021）在《IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究》文中研究说明传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要表现为呼吸道与肾脏疾病。IBV目前仍是危害养禽业的重要病原体之一,给全球的养禽业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫在控制IB方面扮演着重要作用,IBV抗原的不断变异严重制约了现有的疫苗研发策略和血清学诊断。S蛋白是含有丰富中和抗原表位的表面蛋白,也是病毒进入宿主细胞的关键蛋白。但是目前对于S蛋白功能的认识及其与宿主细胞的互作还知之甚少。因此,本研究围绕IBV防控关键技术的开发,从S蛋白广谱中和表位鉴定及S蛋白与宿主细胞互作两个方面进行了研究。具体内容如下:1、传染性支气管炎病毒S蛋白新的关键抗原表位鉴定本研究首先利用软件对IBV S蛋白进行分析,根据S蛋白序列的抗原性、亲水性、表面抗原指数、保守性等指标,选取并人工合成五条抗原性和亲水性好、高度保守的多肽。通过多肽和血清交叉反应,证明五条多肽均与IBV血清有反应原性,其中Pep1的反应性最好,可以与检测的5个血清型中的4个血清型血清有很好的交叉反应性,仅仅不与New cluster型毒株CK/CH/2010/JT1的血清发生交叉反应。人工合成CK/CH/2010/JT1株的该段多肽序列,命名Pep6。通过对多肽序列比较分析,发现Pep1与Pep6序列存在5个氨基酸差异。多肽血清交叉反应结果显示Pep6不仅可以与CK/CH/2010/JT1血清反应,同时与所有检测血清均发生交叉反应。为了确定影响抗原性改变的关键氨基酸,对多肽进行截短和单个氨基酸突变,最后确定16R氨基酸是决定抗原表位广谱性的关键氨基酸。对NCBI数据库中所有的全基因毒株进行序列分析,发现传统的Mass型毒株均是16K毒株,而目前在中国流行的QX型,TW-1型等毒株均是16R突变株,进一步分析发现,16R突变株自20世纪90年代开始出现,随后发展成为流行优势株,目前在全球各大洲均有分布。本研究鉴定了一个广谱的抗原表位,并证明了 16R氨基酸是该抗原表位具有广谱性的关键。这为新型广谱疫苗的研发和检测方法的建立提供了一定理论指导。2、检测IBV抗体多肽ELISA方法的建立及初步应用本实验室在前期的IBV流行病学调查过程中发现,现有的商品化IBV抗体检测试剂盒,不能很好的检测出新型IBV变异株的血清抗体。利用Pep6抗原表位多肽作为包被抗原,建立检测IBV抗体的pELISA方法。本研究首先对检测条件进行优化,确定pELISA最佳反应条件为:最佳包被浓度0.63 μg/mL;血清最佳稀释度为1:200;血清最佳孵育时间为60 min;酶标抗体最佳孵育时间60 min;底物最佳反应时间20 min。确定pELISA的临界值为0.185。批间和批内重复性检测结果显示变异系数均小于10%,具有很好的重复性。特异性检测结果表明pELISA其他禽类病毒阳性血清均不发生非特异性反应。以IFA为参考方法,测定了 250份临床血清样品,结果显示,pELISA的敏感性、特异性和准确性分别为99.14%、94.12%和98.80%,显着高于商品化试剂盒。为评估pELISA在检测IBV疫苗引起的免疫应答中的适用性,本研究测定了 IBVH52、4/91疫苗免疫后不同时间点采集的血清,结果显示pELISA最早在疫苗接种后7 d就能检测出IBV特异性抗体,而商品化试剂盒在免疫后14 d才能检测出IBV特异性抗体。进一步分析发现,pELISA检测出的阳性率明显高于商品化的ELISA试剂盒,提示本研究建立的pELISA在检测IBV抗体和评价IBV疫苗方面具有一定的应用价值。3、应用pELISA替代中和实验评估IBV疫苗免疫应答的初步研究鸡群中血清的中和抗体是反映鸡群免疫状况的主要指标,也是评价疫苗免疫效果的关键指标之一。传统上用中和试验测定血清中和抗体,但中和实验操作复杂,技术程度较高,制约了疫苗应用后的效率评价。然而,目前还没有简单、快速的检测IBV中和抗体的替代方法。为此,探究了 pELISA作为一种潜在替代中和实验评价IBV疫苗的免疫应答的可能。首先制备Pep6的多抗血清,ELISA结果显示,多肽血清与多肽能发生特异性反应。病毒与血清的交叉中和实验结果显示Pep6的多抗血清能够中和IBV病毒,中和效价为1:8,表明Pep6含中和抗原表位。随后,应用pELISA与中和实验比较检测IBV 阳性血清,结果显示血清中和效价与pELISA效价具有很好的正相关性。进一步比较检测了 M41、H52、CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 毒株免疫/攻毒后不同时间点采集的血清,结果显示免疫/攻毒后血清的中和效价和ELISA效价均随免疫时间逐渐升高。各毒株血清的中和效价与pELISA效价的具有明显的正相关性,总相关系数达到0.83。该方法的建立为临床基层IBV疫苗免疫效果评价提供了技术条件。4、IBV S1蛋白与宿主细胞膜蛋白互作的研究IBV S蛋白在病毒感染复制过程起关键作用,通常S1与识别宿主受体并结合细胞相关,而S2促进病毒囊膜与细胞膜融合。尽管IBV是最早发现的冠状病毒,目前对IBV S1与宿主细胞互作的认识仍非常有限,还没有鉴定出IBV的蛋白受体,同时对于IBV入胞机制仍知之甚少。为此本研究构建了正确表达S1-IgGFc融合蛋白的真核质粒pCAGGS-S1-IgGFc,利用Protein G纯化柱纯化了 S1-IgGFc融合蛋白,然后应用细胞膜提取试剂盒提取CEK细胞的膜蛋白,将纯化的融合蛋白与CEK细胞膜蛋白进行免疫共沉淀（Co-IP）,SDS-PAGE银染结果显示,与对照相比发现了 3条差异条带。将差异条带送质谱测序,共鉴定出GRP78、ANXA2、HSPA9、Vimentin等4种宿主蛋白与IBV S1蛋白互作,提示这些蛋白可能在病毒感染细胞发挥某种作用,为进一步探究IBV与宿主细胞膜蛋白的互作机制研究提供一定的材料和理论基础。5、GRP78蛋白促进IBV在CEK细胞中的复制GRP78蛋白又称HSPA5蛋白,是热休克蛋白家族的成员之一。传统上认为GRP78是一种ER伴侣蛋白,目前GRP78蛋白因在多种病毒的感染过程中发挥重要作用而被人们所熟知。在上一部分研究的基础上,通过Co-IP实验,进一步确定了 IBV S1蛋白与GRP78蛋白确实存在相互作用。本研究用抗GRP78多克隆抗体封闭CEK细胞,抑制GRP78蛋白的表达,结果发现抗GRP78多克隆能够有效抑制IBV M41在CEK细胞中的复制。进一步用siRNA干扰实验证明,当CEK细胞表面的GRP78的表达被抑制时,IBVM41的感染也被显着抑制。非易感细胞重建实验结果提示,不同浓度的GRP78真核质粒（0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg）转染CEF细胞,随着转染质粒浓度不断升高,IBVM41感染CEF细胞的感染能力逐渐增强,成明显的正相关。综上所述,GRP78蛋白在IBV感染CEK细胞过程中扮演了重要角色,该GPR78可能促进IBV进入宿主细胞。
孙通行[10]（2021）在《鸡滑液囊支原体与传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒和新城疫弱毒疫苗协同致病作用的研究》文中研究指明滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）是一种常见的鸡呼吸道病原体,在鸡群中的感染率很高。MS是条件致病性菌,其致病作用常需要其他因素的协同。在某些情况下,即使弱毒疫苗引起的轻微呼吸道损伤,也会给MS的感染创造机会。当MS与其它病原混合感染或存在环境应激因素时,会引起呼吸道症状、滑膜炎、产蛋量和蛋品质下降,给养鸡业造成较大的经济损失。本研究将分别探讨MS与传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）、H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）、新城疫（Newcastle disease virus,NDV）弱毒疫苗之间存在协同致病作用。1.MS与IBV协同致病作用的研究将60只1日龄SPF鸡随机均分为4组,分别为MS组、IBV组、MS+IBV组和空白对照组,在负压隔离器中进行试验。待SPF鸡14日龄时,对MS组和MS+IBV组的试验鸡通过滴鼻点眼方式接种MS Ningxia/2017-1株,感染剂量为2.0×108.0CCU/鸡;间隔3日,IBV组和MS+IBV组的试验鸡通过滴鼻点眼方式接种IBV CK/CH/JS/2010/12株,感染剂量为105.5EID50/鸡。试验从MS攻毒起共计14天,每天观察并记录试验鸡的发病和死亡情况。在接种MS后第3、7、10和14天采集血清和腭裂拭子,测定血清中MS和IBV的抗体效价以及腭裂拭子中MS载量。临床结果显示,对照组和MS组未观察到临床症状;IBV组3/15试验鸡表现出呼吸道症状,1/15死亡;MS+IBV组7/15试验鸡表现出严重的呼吸道症状,3/15死亡。相较于对照组、MS组和IBV组,MS+IBV组体重增长明显减慢。剖检显示,MS+IBV组出现气囊炎和气管出血且7/15试验鸡有腹膜炎,而MS组仅表现轻微的气囊病变。MS+IBV组中MS抗体阳性率明显高于MS组,且MS攻毒第3、7、10和14天时,IBV组血清中抗体阳性率分别为0/15、6/15、11/15 和 14/14,MS+IBV 组中 IBV 抗体阳性率分别为 0/15、15/15、14/14 和 12/12。在MS攻毒第7和10天时,MS+IBV组呼吸道中MS排毒量显着高于MS组,在MS攻毒第14天时,MS组呼吸道中检测不到MS的排毒,而MS+IBV组呼吸道中MS的排毒量依然维持在较高水平。结果表明,在MS Ningxia/2017-1株感染条件下,IBV CK/CH/JS/2010/12株的临床发病率及死亡率出现明显升高;同时IBV CK/CH/JS/2010/12株亦可使MS Ningxia/2017-1株的排毒量增加,致病力增强。2.MS与H9亚型AIV协同致病作用的研究将80只1日龄SPF鸡随机分为4组,分别为MS组、H9 AIV组、MS+H9AIV组和空白对照组,在负压隔离器中进行试验。待SPF鸡14日龄时,MS组和MS+H9 AIV组通过滴鼻点眼方式接种MS Ningxia/2017-1株,感染剂量为2.0×108.0CCU/鸡;间隔3日,H9AIV组和MS+H9AIV组通过滴鼻点眼方式接种H9亚型AIV A/Chicken/Shandong/QD4/2013 株,感染剂量为 108.3 EID50/鸡。试验从 MS 攻毒起共计28天,每天观察并记录试验鸡的发病和死亡情况。MS攻毒后第3、7、10、14、21和28天采集血清和腭裂拭子,测定血清中MS和H9亚型AIV抗体效价和腭裂拭子中MS和H9亚型AIV的载量。结果显示,接种H9亚型AIV后,MS+H9 AIV组中部分试验鸡（5/20）出现呼吸道症状,其余组均无症状。剖检时MS+H9AIV组出现气囊炎和胸骨部位囊肿,而MS组只有轻微气囊病变,对照组和H9 AIV组均未出现任何病变。相较于其他3组,MS+H9 AIV组体重增长明显减慢。同时MS+H9 AIV组可以诱导产生较高水平的MS抗体效价。MS+H9AIV组呼吸道MS排毒量显着高于MS组,MS+H9 AIV组呼吸道排毒量显着高于H9亚型AIV组。结果表明,在MS和H9亚型AIV共同感染的情况下,临床发病率升高,甚至出现死亡病例。3.MS与ND弱毒疫苗协同致病作用的研究将80只1日龄SPF鸡随机分为4组,分别为MS组、ND弱毒疫苗组、MS+ND弱毒疫苗组和空白对照组,在负压隔离器中进行试验。待SPF鸡14日龄时,MS组和MS+ND弱毒疫苗组通过滴鼻点眼方式接种MS Ningxia/2017-1株,感染剂量为2.0×108.0CCU/鸡;间隔3日,ND弱毒疫苗组和MS+ND弱毒疫苗组通过滴鼻点眼接种ND弱毒疫苗（LaSota株）,感染剂量为106.5 EID50/鸡。试验从MS攻毒起共计28天,每天观察并记录试验鸡的发病和死亡情况。MS攻毒后第3、7、10、14、21和28天采集血清和腭裂拭子,测定血清MS、NDV抗体效价和腭裂拭子中MS、NDV载量。临床结果显示,接种MS后,MS+ND弱毒疫苗组表现呼吸道症状（5/20）和眼结膜充血（1/20）,其余组均无症状。剖检时在MS+ND弱毒疫苗组发现气囊病变、肾脏肿大和脾脏肿大,其余组均无剖检病变。相较于MS组,MS+ND弱毒疫苗组可以诱导产生较高水平的MS抗体效价。MS攻毒第21天时,ND弱毒疫苗组血清NDV抗体效价高于MS+ND弱毒疫苗组。试验期间MS+ND弱毒疫苗组呼吸道MS排毒量显着高于MS组,MS+ND弱毒疫苗组呼吸道NDV排毒量显着高于ND弱毒疫苗组。结果表明,ND弱毒疫苗亦能使MS的致病力增强。综上所述,本研究采用实验证明在感染MS的情况下,再混合感染IBV、H9亚型AIV等呼吸道病原,甚至接种新城疫弱毒疫苗,都可能造成严重的临床症状和病理变化,影响鸡的生长发育,造成严重的经济损失,进一步证明开展MS净化的重要性和必要性。
二、鸡传染性喉气管炎、传染性支气管炎和新城疫病毒对10个家系BWEL-SPF鸡或鸡胚的感染试验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡传染性喉气管炎、传染性支气管炎和新城疫病毒对10个家系BWEL-SPF鸡或鸡胚的感染试验（论文提纲范文）
（1）鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株S1基因序列及致病性分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料样品 |
| 1.2 SPF鸡胚及SPF雏鸡 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 病料样品处理 |
| 1.5 样品RT-PCR检测 |
| 1.6 病毒分离鉴定 |
| 1.7 分离毒S1基因扩增测序及序列分析 |
| 1.8 分离毒致病性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 样品的RT-PCR检测结果 |
| 2.2 病毒分离鉴定 |
| 2.3 分离株S1基因扩增和分析 |
| 2.5 分离株对1日龄SPF雏鸡的致病性 |
| 2.5.1 临床症状 |
| 2.5.2 气管环纤毛活力变化 |
| 2.5.3 临床剖检病变 |
| 2.5.4 感染鸡排毒情况 |
| 2.5.5 感染鸡中病毒重新分离 |
| 3 讨论 |
（2）鸡新城疫的病原学、流行病学及综合防控措施（论文提纲范文）
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 临床症状 |
| 3.1 最急性型 |
| 3.2 急性型 |
| 3.3 亚急性型或慢性型 |
| 3.4 剖检特点 |
| 4 诊断方法 |
| 5 综合防治措施 |
| 5.1 治疗 |
| 5.2 预防 |
| 5.2.1 制定科学的免疫程序 |
| 5.2.2 加强饲养管理 |
（3）鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的研究及S蛋白表达与单抗制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1. 概述 |
| 2. 流行病学 |
| 3. 临床症状与病理变化 |
| 4. 病原学 |
| 5. 致病机理 |
| 6. 诊断 |
| 7. 防控 |
| 8. 标准物质研究进展 |
| 9. 杆状病毒表达系统介绍 |
| 10. 单克隆抗体研究现状 |
| 11. 研究目的与意义 |
| 研究内容一 鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 IBV抗原参考品的制备 |
| 2.2 IBV抗体参考品的制备 |
| 3. 结果 |
| 3.1 IBV抗原标定结果 |
| 3.2.IBV血清抗体标定结果 |
| 4. 小结与讨论 |
| 研究二: 鸡传染性支气管炎病毒S蛋白在真核表达系统中的表达与鉴定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 设计PCR引物 |
| 2.2 PCR扩增IBV-S基因 |
| 2.3 构建和鉴定重组质粒pGEM-T-FJ14-S |
| 2.4 构建和鉴定重组质粒pFastBacHTA-FJ14-S |
| 2.5 构建和鉴定重组杆状病毒穿梭载体 |
| 2.6 制备重组杆状病毒rBac-FJ14-S |
| 2.7 重组载体pCAGGS-FJ14S1-IgGFc的鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 目的基因的扩增结果 |
| 3.2 阳性重组质粒的筛选及酶切鉴定结果 |
| 3.3 杆状病毒转移载体的构建与鉴定结果 |
| 3.4 PCR鉴定重组杆粒 |
| 3.5 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.6 WB验证S蛋白的表达 |
| 3.7 IFA鉴定重组载体pCAGGS- FJ14S1-IgGFc表达结果 |
| 3.8 SDS-PAGE鉴定纯化重组蛋白FJ14S1-IgGFc结果 |
| 3.9 WB鉴定纯化重组蛋白FJ14S1-IgGFc结果 |
| 4. 小结与讨论 |
| 研究三: 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 动物的免疫 |
| 2.3 单抗筛选方法的构建 |
| 2.4 杂交瘤细胞的制备 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞的间接免疫荧光筛选 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆和建株 |
| 2.7 单克隆抗体生物学特性的鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鼠血清效价 |
| 3.2 单克隆抗体细胞建株 |
| 3.3 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.4 WB分析 |
| 3.5 单抗特异性鉴定 |
| 4. 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒的质量研究及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 禽流感综述 |
| 1.1 禽流感的病原学 |
| 1.2 禽流感的流行病学 |
| 1.3 禽流感的临床症状及病理变化 |
| 1.4 禽流感病毒的检测方法 |
| 1.5 禽流感的防控 |
| 2 病毒的灭活及冻干技术研究进展 |
| 2.1 病毒的灭活 |
| 2.2 病毒的冻干 |
| 3 研究目的与意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 特异性引物探针 |
| 1.6 质控品 |
| 1.7 临床样品 |
| 1.8 阳性对照品 |
| 1.9 阴性对照品 |
| 1.10 禽流感病毒(通用、H5、H7)三重荧光RT-PCR试剂盒中引物探针的配比 |
| 1.11 禽流感病毒(通用、H5、H7)三重荧光RT-PCR试剂盒的组成及使用方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 核酸提取 |
| 2.2 荧光RT-PCR试验 |
| 2.3 血凝试验 |
| 2.4 质控品制备工艺研究 |
| 2.5 质控品的制备及鉴定 |
| 2.6 禽流感病毒(通用、H5、H7)三重荧光RT-PCR试剂盒的质量研究 |
| 2.6.1 敏感性研究 |
| 2.6.2 特异性研究 |
| 2.6.3 重复性研究 |
| 2.7 样品处理 |
| 结果 |
| 3.1 质控品制备工艺研究结果 |
| 3.2 质控品的制备及鉴定结果 |
| 3.3 禽流感病毒(通用、H5、H7)三重荧光RT-PCR试剂盒的质量研究 |
| 3.3.1 敏感性研究结果 |
| 3.3.2 特异性研究结果 |
| 3.3.3 重复性稳定性研究结果 |
| 3.4 临床样品检测结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (作者简介) |
| 附录B (在研期间发表论文) |
（7）表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎概述 |
| 1.1.1 鸡传染性支气管炎流行病学特征 |
| 1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒生物学特性 |
| 1.1.3 鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白概述 |
| 1.1.4 鸡传染性支气管炎疫苗研究进展 |
| 1.2 鸡传染性喉气管炎病毒及其作为疫苗载体的应用 |
| 1.2.1 疱疹病毒作为疫苗载体的优点 |
| 1.2.2 鸡传染性喉气管炎流行病学 |
| 1.2.3 疱疹病毒的US9 基因 |
| 1.2.4 鸡传染性喉气管炎病毒疫苗研究进展 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒与鸡胚 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 酶及主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 转移质粒的构建 |
| 2.2.2 重组病毒的构建及鉴定 |
| 2.2.3 重组病毒的生长特性研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 转移质粒p ILTΔUS9-S、p ILTΔUS9-S1 的构建 |
| 2.3.2 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株的构建及鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 IBV S1 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及实验动物 |
| 3.1.2 质粒与菌株 |
| 3.1.3 酶及主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器和设备 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组蛋白的构建 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.3 单克隆抗体的制备及效价检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IBV CK/CH/LDL/091022 毒株S1 蛋白的真核表达 |
| 3.3.2 杂交瘤细胞的制备及单克隆抗体鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的免疫效果评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒、鸡与鸡胚 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组病毒对ILTV WG株的免疫保护评价 |
| 4.2.2 重组病毒对IBV CK/CH/LDL/091022 分离株的免疫保护评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株对ILTV的免疫保护作用评价 |
| 4.3.2 重组病毒ILTV-ΔUS9-S株、ILTV-ΔUS9-S1 株对IBV的免疫保护作用评价 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）血清4型禽腺病毒广西分离株全基因组测序分析、检测方法和致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽腺病毒病原学 |
| 1.1.1 分类 |
| 1.1.2 病原特征 |
| 1.1.3 基因组结构特征 |
| 1.1.4 禽腺病毒主要结构蛋白及其功能 |
| 1.1.5 理化特性 |
| 1.1.6 分离鉴定 |
| 1.2 心包积液-肝炎综合征的流行病学 |
| 1.2.1 流行情况 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 自然宿主及易感动物 |
| 1.2.4 临床症状 |
| 1.2.5 组织病理学变化 |
| 1.3 禽腺病毒诊断方法 |
| 1.3.1 血清学诊断方法 |
| 1.3.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.4 环介导等温核酸扩增(LAMP)技术研究概况 |
| 1.4.1 LAMP原理 |
| 1.4.2 可视化LAMP技术 |
| 1.4.3 LAMP技术与其他技术的联合应用 |
| 1.5 防控措施 |
| 1.5.1 加强饲养管理,改善饲养环境 |
| 1.5.2 疫苗预防 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 6 株血清4 型禽腺病毒广西分离株全基因组测序与分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株和鸡胚 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 病毒的增殖 |
| 2.2.3 病毒全基因组序列的测定 |
| 2.2.4 全基因组序列拼接 |
| 2.2.5 全基因组生物信息学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 全基因组测序结果 |
| 2.3.2 全基因组序列比对分析 |
| 2.3.3 全基因组核苷酸序列相似性分析 |
| 2.3.4 系统发育分析 |
| 2.3.5 FAdV-4 主要结构蛋白分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 血清4 型禽腺病毒变异株和非变异株二重荧光LAMP鉴别检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物和探针的设计与合成 |
| 3.2.2 标准品制备 |
| 3.2.3 LAMP反应体系的初步建立 |
| 3.2.4 LAMP反应体系的优化 |
| 3.2.5 LAMP特异性试验 |
| 3.2.6 LAMP敏感性试验 |
| 3.2.7 LAMP干扰性试验 |
| 3.2.8 临床样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 反应体系的优化 |
| 3.3.2 LAMP结果的可视性观察 |
| 3.3.3 二重荧光LAMP方法的建立 |
| 3.3.4 特异性试验 |
| 3.3.5 敏感性试验 |
| 3.3.6 干扰性试验 |
| 3.3.7 临床样品检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 血清4 型禽腺病毒广西分离株致病性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株与试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病毒的增殖 |
| 4.2.2 病毒TCID_(50)的测定 |
| 4.2.3 肌肉注射不同剂量FAdV-4 感染4 周龄SPF鸡 |
| 4.2.4 不同途径相同剂量FAdV-4 感染4 周龄SPF鸡 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 肌肉注射不同剂量FAdV-4感染4周龄SPF鸡 |
| 4.3.2 不同途径相同剂量FAdV-4感染4周龄SPF鸡 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现和分类 |
| 1.2 IBV的形态 |
| 1.3 IBV的理化特征 |
| 1.4 IBV培养特性 |
| 1.5 IBV致病性 |
| 1.6 IBV生活周期 |
| 2 IBV分子生物学特性 |
| 2.1 IBV基因组 |
| 2.2 IBV主要编码蛋白及功能 |
| 2.3 IBV毒株分型 |
| 3 IBV流行病学 |
| 3.1 自然宿主 |
| 3.2 实验室宿主 |
| 3.3 传播方式 |
| 3.4 IBV流行现状 |
| 4 IBV变异机制 |
| 4.1 点突变 |
| 4.2 基因缺失或插入 |
| 4.3 同源重组 |
| 5 诊断技术 |
| 5.1 分离鉴定 |
| 5.2 血清学诊断 |
| 5.3 分子生物学检测 |
| 综述二 IBV疫苗研究进展 |
| 1 疫苗接种 |
| 1.1 疫苗 |
| 1.2 接种时间 |
| 1.3 疫苗接种程序 |
| 2 疫苗的应用 |
| 2.1 喷雾疫苗接种 |
| 2.2 凝胶疫苗接种 |
| 3 疫苗接种后的保护评价 |
| 3.1 病毒分离 |
| 3.2 纤毛停滞 |
| 3.3 qRT-PCR |
| 3.4 血清中和抗体水平评价 |
| 综述三 IBV S蛋白研究进展及与宿主细胞互作研究进展 |
| 1 IBV S蛋白研究进展 |
| 1.1 结构特点 |
| 1.2 序列多样性 |
| 1.3 IBV S蛋白功能 |
| 1.4 影响病毒吸附的宿主因素 |
| 2 IBV与宿主互作的研究进展 |
| 2.1 病毒感染对细胞凋亡的影响 |
| 2.2 病毒感染过程中自噬的激活 |
| 2.3 冠状病毒感染与天然免疫反应 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 IBV S蛋白关键抗原表位的鉴定 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病毒、多肽和血清样品 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 主要试剂配方 |
| 1.4 多肽库合成 |
| 1.5 IBV毒株EID_(50)测定 |
| 1.6 IBV S蛋白序列保守性和抗原性比较分析 |
| 1.7 pELISA实验步骤 |
| 1.8 IDEXX检测试剂盒实验步骤 |
| 1.9 IBV S2蛋序列比较分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 IBV S蛋白抗原性和保守性分析 |
| 2.2 多肽与IBV阳性血清的交叉反应 |
| 2.3 多肽抗原性关键氨基酸的确定 |
| 2.4 16R变异株的流行情况 |
| 3 讨论 |
| 第二章 检测IBV抗体多肽酶联免疫吸附试验(pELISA)方法建立及应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 pELISA方法步骤 |
| 1.5 pELISA方法条件的优化 |
| 1.6 pELISA方法性能的评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 Pep6与不同基因型毒株的血清具有很好的反应性 |
| 2.2 pELISA抗体检测方法条件的优化 |
| 2.3 pELISA临界值、重复性和特异性测定 |
| 2.4 pELISA性能的评价 |
| 3 讨论 |
| 第三章 pELISA评价疫苗免疫效力的潜在作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 ELISA方法实验步骤 |
| 1.4 多肽血清的制备 |
| 1.5 血清中和滴度的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 多肽血清中和效果 |
| 2.2 pELISA与中和实验比较测定血清抗体滴度 |
| 2.3 免疫血清pELISA滴度与中和滴度的相关性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 IBV S1蛋白互作蛋白的宿主蛋白 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 生物试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 病毒总RNA提取 |
| 1.5 真核表达载体的构建 |
| 1.6 CEK细胞的制备 |
| 1.7 质粒转染 |
| 1.8 间接免疫荧光(IFA) |
| 1.9 Western-blot |
| 1.10 S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
| 1.11 CEK细胞膜蛋白提取 |
| 1.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 1.13 SDS-PAGE(银染) |
| 1.14 质谱 |
| 2 结果 |
| 2.1 sp-S1-IgGFc片段PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3 重组质粒转染IFA鉴定FJ14S1-IgGFc融合蛋白表达 |
| 2.4 激光共聚焦鉴定重组S1-IgGFc融合蛋白表达 |
| 2.5 Western blot鉴定重组融合蛋白S1-IgGFc的表达 |
| 2.6 重组S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
| 2.7 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.8 质谱鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 GRP78蛋白协助IBV感染宿主细胞 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 生物试剂 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 真核质粒构建 |
| 1.7 CEKC的制备 |
| 1.8 质粒转染 |
| 1.9 共聚焦鉴定真核蛋白表达 |
| 1.10 免疫沉淀(IP) |
| 1.11 抗体封闭实验 |
| 1.12 siRNA干扰 |
| 1.13 GRP78转染293T重建实验 |
| 1.14 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 酶切鉴定构建的真核表达载体 |
| 2.2 共聚焦鉴定蛋白表达 |
| 2.3 GRP78蛋白与IBV S1蛋白的互作 |
| 2.4 多克隆抗体封闭CEK细胞膜表面GRP78蛋白抑制IBV复制 |
| 2.5 siRNA干扰GRP78的表达能抑制IBV的复制 |
| 2.6 非易感细胞感染实验 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）鸡滑液囊支原体与传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒和新城疫弱毒疫苗协同致病作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学特征 |
| 1.3 致病机理 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 病原的分离培养 |
| 1.6 病原的诊断 |
| 1.6.1 血清学方法 |
| 1.6.2 分子生物学方法 |
| 1.7 防制 |
| 1.7.1 药物治疗 |
| 1.7.2 免疫接种 |
| 1.7.3 综合措施 |
| 1.8 滑液囊支原体和常见呼吸道病原协同致病的研究进展 |
| 第2章 鸡滑液囊支原体与传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒和新城疫弱毒疫苗协同致病作用的研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、毒株、鸡胚和动物 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 MS与IBV协同致病试验 |
| 2.2.2 MS与H9 AIV协同致病试验 |
| 2.2.3 MS与ND弱毒疫苗协同致病试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MS与IBV协同致病作用的研究 |
| 2.3.2 MS与H9 AIV协同致病作用的研究 |
| 2.3.3 MS与ND弱毒疫苗协同致病作用的研究 |
| 2.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
四、鸡传染性喉气管炎、传染性支气管炎和新城疫病毒对10个家系BWEL-SPF鸡或鸡胚的感染试验（论文参考文献）
- [1]鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株S1基因序列及致病性分析[J]. 胡晓苗,盛豪,郑忠毅,卞希一,张丹俊,周继勇,廖敏,潘孝成. 中国动物传染病学报, 2021
- [2]鸡新城疫的病原学、流行病学及综合防控措施[J]. 文开. 中国畜禽种业, 2021(09)
- [3]鸡传染性支气管炎病毒抗原抗体参考品的研究及S蛋白表达与单抗制备[D]. 林志娴. 扬州大学, 2021
- [4]鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及鸡5种病毒多重PCR诊断方法的初步建立[D]. 马彩红. 新疆农业大学, 2021
- [5]噬菌体介导的禽传染性支气管炎病毒ELISA诊断方法及初步应用[D]. 刘昊昀. 东北农业大学, 2021
- [6]禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒的质量研究及应用[D]. 赵成龙. 延边大学, 2021
- [7]表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒构建及其免疫效果评价[D]. 盛洁. 中国农业科学院, 2021
- [8]血清4型禽腺病毒广西分离株全基因组测序分析、检测方法和致病性研究[D]. 栾勇娇. 广西大学, 2021(12)
- [9]IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究[D]. 武奇. 扬州大学, 2021
- [10]鸡滑液囊支原体与传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒和新城疫弱毒疫苗协同致病作用的研究[D]. 孙通行. 扬州大学, 2021