一、鸡球虫的同工酶的研究（论文文献综述）
徐向东,吴文君,蔡为民,李文静,程振扬,刘丹丹,许金俊,李金贵,陶建平[1]（2021）在《柔嫩艾美耳球虫田间分离株对地克珠利和盐霉素的耐药性检测》文中研究说明采用鸡体试验法,利用相对卵囊产量（ROP）、病变记分减少率（RLS）、最适抗球虫百分数（POAA）和抗球虫指数（ACI）4项指标,测定了2株分离自如东县养殖场的柔嫩艾美耳球虫对地克珠利和盐霉素的耐药性。结果显示,2株分离株对地克珠利无耐药性或轻度耐药,对盐霉素均完全耐药。建议如东县养鸡场停用盐霉素,将地克珠利列入抗鸡球虫病药物方案中。
姚亚文[2]（2021）在《基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究》文中研究表明鸡球虫病是一种寄生于鸡肠道危害严重的寄生虫病。目前,该病主要依赖于药物防治,药物的长期广泛使用导致鸡球虫出现严重耐药性。为研究鸡球虫耐药性产生的分子机制,本研究对柔嫩艾美耳球虫敏感株（DS）和盐霉素耐药株（SMR）进行全基因组重测序,利用选择性清除方法筛选出可能与盐霉素耐药相关的候选基因,并对3个耐药相关基因（柔嫩艾美耳球虫保守蛋白35（EtCHP35）、柔嫩艾美耳球虫保守蛋白40（EtCHP40）和柔嫩艾美耳球虫表面抗原（EtSAG））的特性进行了初步分析。1.全基因组重测序与选择性清除筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药相关基因本研究对柔嫩艾美耳球虫10株药物敏感株、3株实验室诱导的盐霉素耐药株和15株单卵囊分离的田间盐霉素耐药株进行了全基因组重测序分析,结果显示样品数据量均在1?Gb以上,Q20≥95%、Q30≥90%,与参考基因组比对结果显示比对率均高于82%,测序深度均大于14%,覆盖度（4×）均高于92%。利用选择性清除方法对柔嫩艾美耳球虫药物敏感株和盐霉素耐药株重测序结果进行分析,获得73个在敏感株受选择基因,共1221个SNPs位点,其中81个SNPs属于非同义突变;获得148个在盐霉素耐药株受选择基因,共2545个SNPs位点,其中118个SNPs位点属于非同义突变。GO富集分析结果显示,敏感株候选基因主要参与生物过程和分子功能,盐霉素耐药株候选基因主要参与生物代谢过程。KEGG通路分析结果显示,敏感株候选基因主要参与吞噬体、氧化磷酸化和新陈代谢等通路,盐霉素耐药株候选基因主要参与吞噬体,新陈代谢等通路。将选择性清除的候选基因与转录组结果关联分析,获得共有基因14个,这些基因主要参与核糖体和ATP转运等通路。2.3个耐药相关基因的克隆和生物信息学分析以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊c DNA第一链为扩增模板,成功克隆了EtCHP35,EtCHP40和EtSAG的ORF序列。对氨基酸序列分析显示,三个蛋白均无跨膜结构,有多个蛋白酶磷酸化位点,其中EtCHP35含一个逆转录酶位点,EtCHP40含一个天冬氨酸蛋白酶活性位点,EtSAG含一个信号肽,一个苏氨酸富集区,属于表面抗原家族（SAG family member）。成功构建原核重组表达质粒并诱导表达了三个重组蛋白（r EtCHP35,r EtCHP40和r EtSAG）,并制备了相应的抗体。3.3个耐药相关基因特性分析间接免疫荧光定位结果显示EtCHP35和EtCHP40主要分布在子孢子的表面和顶端,EtSAG主要分布在子孢子和第二代裂殖子的表面。体外抑制实验结果显示这3个蛋白与子孢子入侵宿主细胞无关。利用实时荧光定量PCR,对3个基因在柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段以及不同虫株（耐药株和敏感株）的mRNA转录水平进行分析,结果显示EtCHP35和EtSAG基因在敏感株孢子化卵囊阶段的mRNA转录水平最高,EtCHP40基因在第二代裂殖子阶段高表达。与敏感株相比,EtCHP35基因的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株和盐霉素耐药株第二代裂殖子阶段上调;EtCHP40基因在3株耐药株（地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株、盐霉素耐药株）第二代裂殖子阶段均上调,且在马杜拉霉素耐药株的转录水平显着高于其他耐药株;EtSAG基因的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株上调,在盐霉素和地克珠利耐药株的转录水平下调。且在不同浓度的盐霉素作用下,EtCHP35和EtCHP40的mRNA转录水平随着药物浓度的升高而升高。上述结果为进一步研究柔嫩艾美耳球虫耐药性产生的分子机制及建立田间鸡球虫耐药性快速检测方法提供了一定的基础。
徐向东[3]（2021）在《鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用》文中研究说明鸡球虫病是由艾美耳球虫（Eimeria spp.）寄生于鸡肠道引起的一种寄生虫病,其病原有7种,常为混合感染。各种鸡球虫的流行病学、致病性、免疫原性以及对药物敏感性不尽一致。因此,对鸡球虫种类鉴定与流行病学调查有助于鸡球虫病的防控。鸡球虫种类鉴定的传统方法,主要根据卵囊形态、虫体寄生部位、眼观病变特征、潜在期等生物学特征,这不仅要饲养无球虫感染的雏鸡,而且鉴定过程费时费力。为此,本文根据鸡球虫核糖体DNA内转录间隔区1（ITS-1）序列设计7对种特异性引物,建立鉴定鸡球虫种类的单重PCR与多重PCR方法;构建球虫ITS-1重组质粒,以重组质粒DNA为球虫rDNA阳性标准品;最后用多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫流行病学调查。本研究建立的方法为鸡球虫病的防控提供了技术手段。1.鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立根据GenBank中柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）巨型艾美耳球虫（E.maxima）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、和缓艾美耳球虫（E.mitis）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）的ITS-1序列,设计7对种特异性引物,以7种鸡球虫的全基因组DNA为模板,分别进行PCR扩增,优化反应条件,建立7种球虫的单重PCR方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每对引物均能扩增出特异性条带,其大小分别为278bp（柔嫩艾美耳球虫）、383bp（毒害艾美耳球虫）、476bp（堆型艾美耳球虫）、220bp（巨型艾美耳球虫）、390 bp（早熟艾美耳球虫）、350bp（和缓艾美耳球虫）和311 bp（布氏艾美耳球虫）,其最小检测浓度为0.01 ng。在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的方法具有很强特异性和较高敏感性。2.鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立在7种鸡球虫中,柔嫰、堆型和巨型艾美耳球虫在临床上最常见;柔嫰、毒害和布氏艾美耳球虫致病性大,均在盲肠中形成卵囊,且卵囊形态相似;早熟、和缓和堆型艾美耳球虫潜在期相近,卵囊形态相似。快速鉴别这些球虫种类,有助于鸡球虫病的准确诊断与防控。为此,应用上述鸡球虫虫种特异性引物,建立了能同时鉴定3种鸡球虫的多重PCR方法,并分别对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每个多重PCR反应中的3对引物均能扩增出其特异性条带,其最小检测浓度为0.01 ng,其敏感性与单重PCR一致,在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的多重PCR方法具有很强特异性和较高敏感性。3.鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中的应用纯化7种鸡球虫的单重PCR扩增产物,分别连接到pGEM-TEasy载体中,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选及限制性酶切分析,获得含ITS-1序列的重组质粒;对重组质粒中插入的片段进行测序,用MegAgin 7.1.0软件进行序列分析,并采用邻位相连法（Neighbor-joiningmethod,NJ）构建系统发育进化树;分别以含鸡球虫ITS-1序列的重组质粒DNA为模板,对应已知球虫的卵囊DNA为阳性对照,用上述特异性引物进行PCR扩增,验证构建的7种鸡球虫重组质粒作为球虫rDNA阳性标准品的可能性。结果显示,柔嫩、毒害、巨型、堆型、早熟、和缓和布氏艾美耳球虫的ITS-1 片段大小分别为 278 bp、383 bp、220 bp、476 bp、390 bp、350 bp、311 bp,经系统发育进化树分析,均与GenBank中相应虫种处于同一分枝,表明重组质粒DNA可用作球虫rDNA 阳性标准品。4.多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用采用饱和盐水漂浮法和多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫种类调查。结果显示,饱和盐水漂浮法检查,65%（13/20）养殖户和64.5%（20/31）鸡群感染球虫;多重PCR检测,75%（15/20）养殖户和70.9%（22/31）鸡群感染球虫;共检测到7种球虫,柔嫩艾美耳球虫感染率为64.5%（20/31）,毒害艾美耳球虫为38.7%（12/31）,堆型艾美耳球虫为35.5%（11/31）,早熟艾美耳球虫为45.2%（14/31）,巨型耳艾美球虫为19.4%（6/31）,和缓艾美耳球虫为19.4%（6/31）,布氏艾美耳球虫为12.9%（4/31）;优势种为柔嫩艾美耳球虫;布氏艾美耳球虫感染率最低;球虫均为混合感染（100%）,混合感染2种球虫最多,为36.3%（8/22）。地面圈养鸡群的球虫感染率（80.0%）高于笼养（33.3%）。调查结果为该地区鸡球虫病有效防治提供了依据。
王一[4]（2021）在《毒害艾美耳球虫普通PCR和纳米PCR检测方法的建立》文中提出毒害艾美耳球虫（Eimeria necatrix）是引起鸡小肠球虫病的主要致病性种类之一,可造成鸡营养吸收障碍、饲料转化率降低、血痢,甚至是大批死亡。E.necatrix感染还常继发产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）感染,引起坏死性肠炎。对E.necatrix感染的诊断一般根据寄生部位、致病性、肠道病变、卵囊形态等,需要专业技术人员,且难于鉴别混合感染。随着分子生物学技术的发展,聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）以其快速、高效和敏感等优点被广泛应用于病原的检测和鉴别。近年来,基于纳米技术的纳米PCR（Nanoparticle-assisted PCR,nano-PCR）被证明具有更高的敏感性和特异性,但目前尚未有利用纳米PCR检测E.necatrix感染的相关报道。基于此,本研究以E.necatrix为研究对象,通过筛选特异靶基因,优化反应体系和反应条件,建立了用于特异性检测E.necatrix感染和E.necatrix孢子化卵囊的普通PCR和纳米PCR方法,并建立了同时检测E.necatrix和C.perfringens的双重PCR和双重纳米PCR方法,获得了如下结果:1.建立了基于ITS-2基因的E.necatrix普通PCR和纳米PCR检测方法:本研究选取E.necatrix ITS-2基因的部分片段分别建立了检测E.necatrix感染的普通PCR和纳米PCR检测方法,二者均能特异性扩增出E.necatrix约380 bp的目的片段;其中普通PCR的敏感性是364 pg,而纳米PCR的敏感性是3.64 pg;所建立的普通PCR扩增柔嫩艾美耳球虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、蓝氏贾第虫、芽囊原虫DNA时无条带,扩增毕氏肠微孢子虫和结肠小袋纤毛虫DNA时虽有条带,但不符合目的基因片段的大小;纳米PCR在扩增上述病原时均无条带;分别利用普通PCR和纳米PCR对20份临床鸡粪便样品进行E.necatrix检测,阳性率均为35.0%。2.建立了E.necatrix和C.perfringens双重PCR和双重纳米PCR检测方法:选取E.necatrix ITS-2基因的部分片段设计特异性引物,结合文献中报道的扩增C.perfringensα毒素基因的引物,建立了同时扩增E.necatrix和C.perfringens的双重PCR和双重纳米PCR检测方法,两种方法均能特异性扩增出E.necatrix约150 bp和C.perfringens约400 bp的目的片段;通过构建重组质粒p MD19-T-ITS2和p MD19-T-cpα进行敏感性试验发现,双重PCR扩增E.necatrix和C.perfringens的敏感性分别是181copies和1050 copies,而双重纳米PCR的敏感性分别是1.81 copies和105 copies;所建立的双重PCR扩增毕氏肠微孢子虫、鸽毛滴虫、贝氏隐孢子虫、柔嫩艾美耳球虫DNA时无条带,扩增蓝氏贾第虫、芽囊原虫和毕氏肠微孢子虫DNA时虽有条带,但不符合目的基因片段的大小;双重纳米PCR在扩增上述病原时均无条带;对20份人为添加DNA的样品分别进行双重PCR和双重纳米PCR检测,E.necatrix的检出率均为100%,C.perfringens的检出率分别为77.8%和100%,E.necatrix和C.perfringens混合样品的检出率分别为75.0%和100%。3.建立了用于特异检测E.necatrix孢子化卵囊的普通PCR和纳米PCR方法:通过对未孢子化卵囊和孢子化卵囊进行RNA-seq分析,发现了152个孢子化卵囊特异的基因,选取其中6个基因进行PCR验证,筛选出了2个孢子化卵囊特异基因,即ENH＿00008300和ENH＿00076120;针对这两个基因分别建立了用于特异检测E.necatrix孢子化卵囊的普通PCR和纳米PCR,其中基于ENH＿00008300基因建立的普通PCR和纳米PCR均能特异性扩增出E.necatrix孢子化卵囊约450 bp的目的片段,对于未孢子化卵囊则无扩增;普通PCR敏感性是25 ng,纳米PCR敏感性是3 ng;基于ENH＿00076120基因建立的普通PCR和纳米PCR均能特异性扩增出E.necatrix孢子化卵囊约280 bp的目的片段,对于未孢子化卵囊则无扩增;普通PCR敏感性是400 pg,纳米PCR敏感性是50 pg。综上,本研究建立了E.necatrix普通PCR和纳米PCR检测方法,以及E.necatrix和C.perfringens双重PCR和双重纳米PCR检测方法,研究结果为E.necatrix感染的快速诊断和继发C.perfringens感染时的鉴别诊断提供了技术支持;本研究还建立了用于特异性检测E.necatrix孢子化卵囊的普通PCR和纳米PCR方法,从分子水平实现了对E.necatrix孢子化卵囊与未孢子化卵囊的特异性鉴别,且具有较高的敏感性,弥补了传统形态学观察的不足。
符德文,王新秋,黄仪娟,刘丽丹,刘园,曾莉,邝春曼,林瑞庆,翁亚彪[5]（2021）在《广东和广西地区鸡艾美耳球虫耐药性调查》文中指出采用相对卵囊产量（Relative oocyst production,ROP）、病变记分减少率（Reduction of lesion scores,R LS）、最适抗球虫活性（Percent of optimum anticoccidial activity,POAA）和抗球虫指数（Anticoccidialindex,ACI）4种指标对采自广东和广西地区的17株鸡球虫分离株的12种抗球虫药的耐药性进行综合评价。结果显示野外分离株普遍存在多重耐药性,47.1%的虫株对3～7种受试抗球虫药呈现完全耐药;5.9%的虫株对其中9种抗球虫药完全耐药,对其余3种抗球虫药也呈现重度耐药。更为严重的是,100%和76.5%的虫株对6种以上的受试抗球虫药分别呈现中度耐药以上及重度耐药以上。100%和75.0%的受试抗球虫药都有至少半数的虫株（9株）分别呈现对其中度耐药以上和重度耐药以上。12种受试抗球虫药中,磺胺氯吡嗪钠粉有4株虫株呈现对其敏感,只有1株呈现对其完全耐药,是本次试验耐药性调查表现最好的药物;其次是尼卡巴嗪、二硝托胺预混剂和盐酸氯苯胍预混剂这3种药物,各有1株呈现对其敏感,其他药物均没有虫株呈现对其敏感,占受试药物的66.7%。
张彤,苏圆圆,张瑞,张淑敏,唐乃栋,孙希宇,张凡,张俊卿,褚秀玲[6]（2021）在《参青球净散和桂枝治疗鸡球虫病的效果观察》文中研究说明考察自拟中药组方参青球净散和桂枝对鸡球虫病的治疗效果。采用人工感染小肠球虫混合卵囊制造鸡球虫病模型,将试验鸡分为6组,即参青球净散高剂量组、中剂量组、低剂量组,桂枝组,感染对照组,健康对照组。除感染对照组和健康对照组外,其余各组试验鸡于攻虫的当天开始给药,连用7 d。检测试验鸡相对增重率、血便记分、卵囊值、病变记分、抗球虫指数及血清相关酶活性等指标,综合评价药物疗效。结果表明,参青球净散组和桂枝组均可防止感染鸡体质量下降,但在精神状态、血便数量、采食量方面参青球净散组显着优于桂枝组（P<0.05）;参青球净散高剂量组抗球虫指数大于160,达到良好水平,中剂量组、低剂量组和桂枝组的抗球虫指数均小于160,大于120,属于有效范围;各组血清乳酸脱氢酶（LDH）的活性显着升高（P<0.05）;除对照组以外,其余各组的血清碱性磷酸酶（ALP）活性显着提高（P<0.05）。提示自拟中药组方参青球净散对鸡球虫病疗效确实。
王一,王钰鑫,李媛,王俊伟,宋军科,赵光辉[7]（2020）在《毒害艾美耳球虫纳米PCR检测方法的建立及初步应用》文中进行了进一步梳理毒害艾美耳球虫（Eimeria necatrix）是引起鸡急性小肠球虫病最重要的病原,为了对毒害艾美耳球虫进行快速特异性检测,本研究基于毒害艾美耳球虫ITS-2基因序列,通过退火温度、引物用量等反应条件的优化,建立了鸡毒害艾美耳球虫特异性纳米PCR检测方法。结果显示,该方法成功扩增出毒害艾美耳球虫约380 bp的特异性片段,其最低检出质量浓度为3.64μg/L,敏感性是普通PCR的100倍;进一步对毒害艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、贝氏隐孢子虫等多种病原的DNA样品进行扩增,该方法仅能扩增出毒害艾美耳球虫的目的片段。利用所建立的纳米PCR检测方法对40份鸡的粪便样品进行检测,发现受检样品中毒害艾美耳球虫阳性率为35.0%（14/40）,与普通PCR检测结果一致。结果表明,本研究建立的毒害艾美耳球虫纳米PCR检测方法能够实现对毒害艾美耳球虫的快速准确检测,且与普通PCR相比具有更高的敏感性和特异性,为毒害艾美耳球虫感染的临床鉴别诊断和防控提供了技术基础。
吴文君[8]（2020）在《如东县鸡球虫种类调查及柔嫩艾美耳球虫的耐药性检测》文中提出鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种严重危害养鸡业的寄生原虫病,其病原有7种,分别是柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）、巨型艾美耳球虫（E.maxima）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、和缓艾美耳球虫（E.mitis）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）。不同种类的球虫其致病性不尽一致,且对同一种药物的敏感性也不一致。在自然情况下,球虫多为混合感染,在不同地区流行的球虫种类有所不同。目前,对该病的防治仍以药物为主,但长期使用药物已导致耐药性产生,影响药物效力。因此,对鸡球虫流行种类的调查与鉴定以及田间分离株的耐药性检测,是防控鸡球虫病的重要基础。为此,本文开展了以下工作。通过采用粪检卵囊、ITS-1序列的PCR检测、卵囊形态观察及动物回归试验相结合的方法,在如东县对21个养殖场（户）的28个鸡群进行了球虫种类和流行病学的调查。结果显示,21个养殖场均检出球虫卵囊,在28个鸡群中26个感染球虫,其中50日龄以下鸡群的卵囊阳性率为83.3%（10/12）,50日龄及以上鸡群的卵囊阳性率为100%（16/16）;共检测到7种鸡球虫,其检出率柔嫩艾美耳球虫为85.7%,堆型艾美耳球虫为92.9%,巨型艾美耳球虫为82.1%,毒害艾美耳球虫为42.9%,和缓艾美耳球虫为42.9%,早熟艾美耳球虫为39.3%,布氏艾美耳球虫为14.3%,优势种为堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫;球虫混合感染率为92.3%（24/26）,其中混合感染4种球虫最高达46.2%（12/26）;PCR检测结果与卵囊形态特征观察及动物回归试验结果相一致。采用动物感染试验法,以相对卵囊产量（ROP）、病变记分减少率（RLS）、最适抗球虫百分数（POAA）和抗球虫指数（ACI）等4项判定指标,分析2株柔嫩艾美耳球虫田间分离株及1株实验室保存株对地克珠利和盐霉素的耐药性。结果显示,分离株1和实验室保存株对地克珠利无耐药性,分离株2对地克珠利无耐药性或轻度耐药;3个虫株对盐霉素均完全耐药。分析其原因,可能是盐霉素在该县曾经或现在已有广泛使用,而地克珠利在该市使用较少或停用时间较长。鉴于这一检测结果,建议养鸡场应停用盐霉素,改用地克珠利。在使用时进行轮换用药或联合用药,以延长药物的使用寿命。结论:如东县养鸡场流行7种鸡球虫,优势种是堆型、柔嫩和巨型艾美耳球虫,多数为混合感染;两鸡场对地克珠利无耐药性或轻度耐药,对盐霉素产生了完全耐药。
黄杰[9]（2020）在《鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株分离与耐药机制研究》文中认为鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染肠道所引起的传染性原虫病,给世界各地的养鸡业带来巨大的经济损失。至今为止,我国公认艾美耳球虫有7种,其中以柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）的感染力和致病力最强。目前对球虫病的主要控制办法还是在饲料或饮水中的添加抗球虫药物,如地克珠利（Diclazuril,DIC）,饲料中仅添加1 mg/kg就可以达到很好的治疗效果,但药物的长期使用会导致球虫产生耐药性,所以本研究通过对田间分离的DIC耐药株进行一系列研究,并通过同工酶谱、随机扩增多态DNA（RAPD）以及DIC潜在作用靶点甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和乳酸脱氢酶（LDH）的mRNA表达等角度来分析耐药性产生的可能机制,为更好地防治球虫病提供理论依据。具体研究内容如下:1、田间柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株的分离本试验为收集了来自江苏、山东、福建、安徽、河南等5个不同地区共13个发病鸡场的粪便样本,并从中分离纯化出其中的E.tenella。为评价13个分离株对DIC的耐药性设立DIC敏感株（SE）作为对照。试验时对每个虫株分别设置感染用药组、感染不用药组和空白对照组,以抗球虫指数、病变记分减少率、相对卵囊产量、最适抗球虫活性百分率四项指标进行综合评定。结果显示来自江苏南通地区虫株中有6株对DIC表现出不同程度的耐药性,有5株表现为重度耐药;河南开封分离株对DIC表现重度耐药;山东地区仅有1株对DIC轻度耐药,其余分离株均对DIC表现敏感。2、南通地区E.tenella分离株耐药性分析本试验选取南通地区5株重度耐药分离株（NT1、NT2、NT3、NT4、NT5）进行体外DIC抗球虫孢子化效果检测,同时运用同工酶技术以及随机多态性DNA分析法对其耐药性进行进一步分析。试验结果表明,与SE株相比,耐药株均可以显着抵抗DIC对球虫孢子生殖抑制;但除NT3的LDH、GPI以及G6PD同工酶与SE有明显差异外,其余耐药株与SE株之间无明显差异,推测耐药性与同工酶谱的变化关系不大。DNA多态性分析发现,有4株耐药株与SE株之间相似度在60%左右,存在较大的差异;NT5与SE之间相似度达到80%以上,差异较小,推测发生了某些关键变化,故选取NT5进行进一步研究。3、NT5分离株耐药性产生的分子机制初探本试验通过鸡体感染试验研究NT5和SE在DIC的刺激下在体内的发育情况,并检测DIC潜在作用靶点GAPDH和LDH的表达情况。试验共分为5组,分别是空白对照组（Con）、NT5攻毒模型组（NT5）,SE攻毒模型（SE）,NT5攻毒+DIC治疗组（NT5+DIC）,SE攻毒+DIC治疗组（SE+DIC）,在感染后的96 h、120 h、144 h、168 h分别采集各组盲肠样品制作组织病理切片观察,检测并比较感染后96h、120h、144h时盲肠组织内的球虫GAPDH、LDH基因mRNA表达变化。病理切片结果显示,DIC处理使SE球虫出现二代裂殖体异常发育以及合子发育异常等情况,并使二代裂殖子数量大量减少;但NT5球虫仅出现少量卵囊发育异常,在其余发育阶段均未发现明显异常。mRNA检测结果显示在球虫体内发育过程中,DIC处理引起SE株球虫内GAPDH的表达量显着上升,而LDH表达量下降;而NT5株球虫在96 h、120 h时,LDH和GAPGH的mRNA表达量均显着下降,说明此时NT5株球虫内的糖酵解代谢途径被DIC抑制,但仍可继续正常发育;在144h时,NT5株GAPDH mRNA表达量显着上升,可能与NT5株球虫在此阶段出现卵囊发育异常有关。经测序后发现,NT5株与SE株的GAPDH蛋白在氨基酸链C端的最后18个氨基酸完全不同,提示NT5株GAPDH基因可能发生突变。综上所述,敏感株虫体使用DIC治疗后,GAPDH mRNA的高表达可能是造成虫体在裂殖生殖阶段与配子生殖阶段发育异常的原因。耐药球虫使用DIC治疗后,GAPDH mRNA表达量降低。NT5株耐药性的产生可能与GAPDH mRNA表达差异有关,是否与GAPDH基因突变相关仍需进一步研究。
王海霞[10]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的诱导及耐药相关基因特性的初步分析》文中认为球虫病是世界上危害严重的寄生虫病之一,对养鸡业造成了巨大的经济损失。随着药物的广泛使用及不合理使用,耐药性成为无法避免的问题,但球虫耐药性形成的机制至今不清楚,也没有找到控制球虫产生耐药性的靶基因。本研究通过实验室诱导获得了柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药虫株,观察了盐霉素耐药株和敏感株子孢子和裂殖子的超微结构,分析了盐霉素耐药株和敏感株的差异表达基因,检测了3个鸡球虫田间分离株的耐药状况,利用单卵囊分离技术获得22个柔嫩艾美耳球虫盐霉素田间耐药株,对柠檬酸合酶（EtCS）、甲硫氨酸氨基肽酶（EtMetAP）、锚蛋白重复序列（EtANK）3个球虫耐药相关基因的特性进行了初步分析。1.柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的实验室诱导与电镜观察采用药物浓度递增法,以15 mg/kg（药物/饲料）为起始诱导浓度,经过24次传代,用鸡体药敏试验检测,获得对盐霉素60 mg/kg完全耐药的柔嫩艾美耳球虫耐药株。利用透射电镜观察了盐霉素耐药株子孢子和裂殖子的超微结构,发现耐药株虫体的形态变得不规则、细胞膜粗糙与肿胀、细胞核形状变得不规则甚至溶解、微线减少、支链淀粉增多等。2.柔嫩艾美耳球虫敏感株和耐药株的比较转录组学分析利用RNA-seq对柔嫩艾美耳球虫敏感株和盐霉素耐药株的子孢子和裂殖子进行转录组测序分析。结果显示,与敏感株相比,耐药株子孢子获得17个上调表达基因、13个下调表达基因;耐药株裂殖子获得606个上调表达基因、496个下调表达基因,子孢子和裂殖子共有差异表达基因18个。GO分析发现,耐药株子孢子的差异表达基因主要参与离子结合过程,耐药株裂殖子的差异表达基因主要参与细胞蛋白质代谢过程。用qPCR对差异表达基因进行了验证,结果与转录组测序结果基本一致。3.鸡球虫田间分离株的耐药程度检测与柔嫩艾美耳球虫盐霉素田间耐药株的分离从安徽不同养殖场收集样品,获得3个鸡球虫田间株（AH1、AH2、AH3）,通过鸡体药敏试验检测了田间株对5种抗球虫药物（地克珠利、盐霉素、癸氧喹酯、甲基盐霉素、氯苯胍）的耐药程度,除AH2对氯苯胍中度耐药外,所测虫株对其他药物完全耐药。用琼脂糖技术分离获得22个柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离株,用qPCR分析了4个差异表达基因在2个单卵囊分离株及安徽1混合种的mRNA转录水平,与转录组测序结果一致。4.三个耐药相关基因特性的初步分析对3个球虫耐药相关基因（EtCS、EtMetAP、EtANK）进行克隆、表达与纯化,制备相应抗体,分析3个基因在柔嫩艾美耳球虫球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、裂殖子的转录水平和翻译水平,结果表明这三个基因在四个阶段的转录水平和翻译水平不一致,可能是翻译后修饰的结果。间接免疫荧光表明,EtCS、EtMetAP、EtANK分别定位于子孢子除折光体外的细胞质中、子孢子表面、子孢子的顶端、都定位于裂殖子的细胞膜和细胞质中。体外抑制实验表明,这3个蛋白都参与了子孢子入侵DF-1细胞的过程。用EtCS处理鸡巨噬细胞后发现,EtCS可与巨噬细胞结合,抑制巨噬细胞的增殖及NO的产生。对敏感株和不同耐药株进行转录水平分析,发现这3个基因在柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株中表达都显着上调,而在盐霉素耐药株中差异不显着,与转录组结果一致。但这3个基因在耐药株中的蛋白翻译水平与转录结果不一致。利用qPCR分析3个基因在单卵囊分离的盐霉素田间耐药株、安徽1混合种、单卵囊分离的地克珠利田间耐药株的mRNA转录水平,结果显示,与敏感株相比,3个基因在安徽1混合种的转录水平都很低;在3株地克珠利田间耐药株中,除EtCS在其中2株下调表达外,其余都上调表达;在3株盐霉素田间耐药株中,EtMetAP表达上调和EtCS表达下调,EtANK差异不明显;与盐霉素转录组结果不一致,可能是由于分离的田间耐药株存在多重耐药性。结论:本研究利用诱导获得的柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株和敏感株进行比较转录组学分析获得差异表达基因,用田间分离的柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株进行了验证,选取3个耐药相关基因进行初步分析,结果为进一步研究球虫耐药性产生的分子基础提供了基础。
二、鸡球虫的同工酶的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡球虫的同工酶的研究（论文提纲范文）
（1）柔嫩艾美耳球虫田间分离株对地克珠利和盐霉素的耐药性检测（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验虫株 |
| 1.3 试验药物与给药途径 |
| 1.4 试验分组 |
| 1.5 临床观察与卵囊计数 |
| 1.6 耐药性判定方法与标准 |
| 1.7 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 临床观察与成活率 |
| 2.2 平均增重与最适抗球虫百分数 |
| 2.3 病变记分减少率与相对卵囊产量 |
| 2.4 抗球虫指数 |
| 2.5 耐药性判定结果 |
| 3 讨论 |
（2）基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗球虫药 |
| 1.1.1 聚醚离子载体类抗球虫药 |
| 1.1.2 化学合成类抗球虫药 |
| 1.2 鸡球虫耐药性产生的原因 |
| 1.2.1 遗传因素 |
| 1.2.2 药物选择压力 |
| 1.2.3 生物学因素 |
| 1.3 鸡球虫耐药性的研究现状 |
| 1.4 其他顶复门原虫耐药性的研究现状 |
| 1.5 全基因组重测序 |
| 1.6 选择性清除 |
| 1.7 展望 |
| 第二章 全基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药相关基因 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 试验药物 |
| 2.2.4 实验试剂 |
| 2.2.5 实验仪器 |
| 2.2.6 子孢子的收集与纯化 |
| 2.2.7 基因组重测序 |
| 2.2.8 选择性清除分析结果与转录组测序结果的关联分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 虫体的收集与纯化 |
| 2.3.2 DNA的提取检测 |
| 2.3.3 质控结果 |
| 2.3.4 样品与参考基因组比对结果 |
| 2.3.5 基于Hp&Fst的选择消除分析结果 |
| 2.3.6 候选基因SNP位点的分布 |
| 2.3.7 基因功能富集分析 |
| 2.3.8 与转录组的关联分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 3 个耐药相关基因的克隆和生物信息学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物和实验虫株 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 试验仪器 |
| 3.2.4 敏感株孢子化卵囊的收集与纯化 |
| 3.2.5 cDNA第一链模板的制备 |
| 3.2.6 基因克隆 |
| 3.2.7 生物信息学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因的克隆 |
| 3.3.2 生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 3个耐药相关基因功能特性的初步分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物与细胞 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 实验虫株的收集与纯化 |
| 4.2.6 cDNA模板的制备 |
| 4.2.7 重组表达质粒的构建 |
| 4.2.8 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.2.9 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.10 重组蛋白的反应原性分析 |
| 4.2.11 多克隆抗体的制备 |
| 4.2.12 实时荧光定量PCR |
| 4.2.13 间接免疫荧光定位 |
| 4.2.14 体外抑制实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组表达质粒的构建 |
| 4.3.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.3.3 重组蛋白的纯化 |
| 4.3.4 重组蛋白的反应原性分析 |
| 4.3.5 3个基因在DS不同发育阶段的mRNA转录水平 |
| 4.3.6 三个蛋白在DS虫体上的定位分析 |
| 4.3.7 三个多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验 |
| 4.3.8 3个基因在不同耐药株和敏感株的转录水平分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述: 鸡球虫病研究概述与进展 |
| 1 鸡球虫病的病原生物学 |
| 2 鸡球虫病的临床症状与眼观病变 |
| 3 鸡球虫病的防控 |
| 4 鸡球虫种类的鉴定方法 |
| 5 本研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）毒害艾美耳球虫普通PCR和纳米PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫与鸡球虫病的研究概况 |
| 1.1 鸡球虫的寄生部位及其致病性 |
| 1.2 鸡球虫的生活史 |
| 1.3 鸡球虫病的流行病学 |
| 1.4 鸡球虫病的诊断 |
| 1.4.1 传统方法 |
| 1.4.2 血清学诊断 |
| 1.4.3 分子生物学诊断 |
| 1.5 鸡球虫病的防治 |
| 1.5.1 药物防治 |
| 1.5.2 疫苗防治 |
| 1.5.3 饲养管理 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 E.necatrix普通PCR和纳米PCR检测方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 卵囊镜检结果 |
| 2.2.2 排卵囊规律统计结果 |
| 2.2.3 E.necatrix普通PCR检测方法的建立 |
| 2.2.4 E.necatrix纳米PCR检测方法的建立 |
| 2.2.5 E.necatrix和 C.perfringens双重PCR检测方法的建立 |
| 2.2.6 E. necatrix 和 C. perfringens 体系双重纳米 PCR 检测方法的建立 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 E.necatrix 孢子化卵囊特异普通 PCR 和纳米 PCR 检测方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RNA-seq分析结果 |
| 3.2.2 孢子化卵囊特异表达基因筛选结果 |
| 3.2.3 基于孢子化卵囊特异基因ENH_00008300 的普通PCR方法的建立 |
| 3.2.4 基于孢子化卵囊特异基因ENH_00008300 的纳米PCR方法的建立 |
| 3.2.5 基于孢子化卵囊特异基因ENH_00076120 的普通PCR方法的建立 |
| 3.2.6 基于孢子化卵囊特异基因ENH_00076120 的纳米PCR方法的建立 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）广东和广西地区鸡艾美耳球虫耐药性调查（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验用动物 |
| 1.1.2 试验药物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验虫株采集和分离 |
| 1.2.2 耐药性试验分组 |
| 1.2.3 耐药性评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床观察 |
| 2.2 平均增重和病变计分 |
| 2.2.1 平均增重 |
| 2.2.2 病变记分 |
| 2.3 球虫耐药性评价 |
| 2.3.1 最适抗球虫活性百分率（POAA) |
| 2.3.2 病变记分减少率（RLS) |
| 2.3.3 相对卵囊产量（ROP) |
| 2.3.4 抗球虫指数（ACI) |
| 2.3.5 综合评价 |
| 3 讨论 |
（6）参青球净散和桂枝治疗鸡球虫病的效果观察（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 虫种的来源及传代 |
| 1.2 药物来源及使用浓度 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 试验动物的饲养与分组 |
| 1.5 鸡小肠球虫混合卵囊接种 |
| 1.6 观测指标 |
| 1.6.1 临床观察 |
| 1.6.2 相对增重率 |
| 1.6.3 存活率 |
| 1.6.4血粪记分 |
| 1.6.5 卵囊值 |
| 1.6.6 病变计分 |
| 1.6.7 抗球虫指数（ACI) |
| 1.6.8 中药对球虫感染雏鸡血清乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶活性的影响 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床症状 |
| 2.2 体质量变化 |
| 2.3 血便计分 |
| 2.4 卵囊数 |
| 2.5 病理变化 |
| 2.6 试验药物疗效综合判定 |
| 2.7 试验药物对血清乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响 |
| 2.8 试验药物对血清碱性磷酸酶（ALP）活性的影响 |
| 3 讨论 |
（7）毒害艾美耳球虫纳米PCR检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 样品基因组DNA提取 |
| 1.5 纳米PCR方法建立 |
| 1.5.1 普通PCR方法建立 |
| 1.5.2 纳米PCR反应体系的建立及条件优化 |
| 1.5.3 纳米PCR敏感性试验 |
| 1.5.4 纳米PCR特异性试验 |
| 1.6 临床样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 纳米PCR扩增结果 |
| 2.2 纳米PCR退火温度及引物用量的优化结果 |
| 2.3 敏感性试验结果 |
| 2.4 特异性试验结果 |
| 2.5 临床样品检测结果 |
| 3 讨论 |
（8）如东县鸡球虫种类调查及柔嫩艾美耳球虫的耐药性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述:鸡球虫病的病原学及其防治研究进展 |
| 1 鸡球虫病的病原学 |
| 1.1 鸡球虫病的病原种类 |
| 1.2 鸡球虫种类的鉴定方法 |
| 1.3 鸡球虫种类的鉴别特征 |
| 1.4 鸡球虫病的流行特点 |
| 2 鸡球虫病的药物防治 |
| 2.1 抗球虫药种类 |
| 2.2 抗球虫药的合理使用 |
| 2.3 抗球虫药的耐药性检测 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 如东县小型鸡场鸡球虫感染情况与种类的调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 鸡球虫卵囊基因组DNA与实验动物 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 粪样采集 |
| 1.4 粪检卵囊 |
| 1.5 卵囊分离与培养 |
| 1.6 鸡球虫种类鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 球虫感染情况 |
| 2.2 球虫种类鉴别特征 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫田间分离株的耐药性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验虫株 |
| 1.3 试验药物与给药途径 |
| 1.4 试验分组 |
| 1.5 感染剂量 |
| 1.6 临床观察 |
| 1.7 耐药性评价指标 |
| 1.8 耐药性判断标准 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 临床观察及血便情况 |
| 2.2 存活率 |
| 2.3 平均增重与最适抗球虫百分数 |
| 2.4 病变记分与病变记分减少率 |
| 2.5 卵囊产量与相对卵囊产量 |
| 2.6 抗球虫指数 |
| 2.7 耐药性判定结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株分离与耐药机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 鸡球虫病简介 |
| 1.1 鸡球虫分类 |
| 1.2 鸡球虫生活史 |
| 2 鸡球虫病的防治 |
| 2.1 聚醚类离子载体抗生素 |
| 2.2 化学合成类药物 |
| 2.3 中草药及中药提取物 |
| 3 地克珠利简介 |
| 3.1 抗球虫效果 |
| 3.2 抗球虫机理 |
| 4 鸡球虫耐药性研究 |
| 4.1 鸡球虫耐药性产生的潜在机理 |
| 4.2 耐药性研究方法 |
| 5 研究意义及目的 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 田间柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株分离 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 耐药性综合判定方法及标准 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 单卵囊纯化结果 |
| 2.2 动物试验各项指标检测结果 |
| 2.3 综合耐药性判定 |
| 3 讨论 |
| 第二章 南通地区E.tenella地克珠利耐药分离株耐药性分析 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 DIC对球虫体外孢子化的影响结果 |
| 2.2 同工酶电泳结果 |
| 2.3 随机引物扩增多态性分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 NT5耐药分离株耐药性产生的分子机制初探 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 各组盲肠组织病理切片 |
| 2.2 各组二代裂殖子数量比较 |
| 2.3 不同发育时期GAPDH与LDH基因mRNA表达 |
| 2.4 GAPDH基因测序对比 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的诱导及耐药相关基因特性的初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 耐药性的定义 |
| 1.2 耐药性的类型 |
| 1.2.1 交叉耐药性 |
| 1.2.2 多重耐药性 |
| 1.3 实验室耐药虫株的诱导 |
| 1.4 耐药性检测的方法 |
| 1.4.1 鸡体检测法 |
| 1.4.2 同工酶分析法 |
| 1.4.3 超微结构的比较法 |
| 1.4.4 PCR技术测定法 |
| 1.5 抗球虫药物作用机理及其耐药性 |
| 1.5.1 离子载体类抗生素及其耐药机理 |
| 1.5.2 磺胺类抗球虫药物的耐药性 |
| 1.5.3 喹啉类抗球虫药物耐药性 |
| 1.5.4 抗硫胺素类抗球虫药物耐药性 |
| 1.5.5 吡啶类抗球虫药物的耐药性 |
| 1.5.6 三嗪类抗球虫药物及其耐药性 |
| 1.6 控制鸡球虫耐药性产生的策略 |
| 1.6.1 控制球虫的传播 |
| 1.6.2 合理的用药方案 |
| 1.6.3 综合治疗 |
| 1.6.4 定期检测耐药性 |
| 1.7 展望 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的实验室诱导 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 试验虫株 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.2.5 试验药物 |
| 2.2.6 柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的实验室诱导 |
| 2.2.7 透射电子显微镜观察盐霉素耐药株与敏感株子孢子和第二代裂殖子的超微结构 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的诱导 |
| 2.3.2 诱导虫株的耐药性检测 |
| 2.3.3 透射电子显微镜观察敏感株与耐药株的超微结构 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 柔嫩艾美耳球虫敏感株与盐霉素耐药株差异基因的筛选与验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验虫株 |
| 3.2.3 实验药物 |
| 3.2.4 实验试剂 |
| 3.2.5 实验仪器 |
| 3.2.6 敏感株与盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子的收集与纯化 |
| 3.2.7 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子转录组测序 |
| 3.2.8 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子差异表达基因的验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子总RNA的提取 |
| 3.3.2 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子测序数据生物信息分析 |
| 3.3.3 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子差异基因的筛选 |
| 3.3.4 敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子差异基因的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 现场鸡球虫感染现状和耐药程度调查及盐霉素田间耐药株的分离 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 试验药物 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 田间株粪便样品的收集及繁殖 |
| 4.2.6 形态学鉴定田间株球虫种类 |
| 4.2.7 多重PCR鉴定球虫种类 |
| 4.2.8 药敏试验验证田间株耐药性 |
| 4.2.9 抗盐霉素田间株单卵囊的分离 |
| 4.2.10 qPCR分析差异表达基因在田间分离株的转录水平 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 形态学鉴定田间株球虫种类 |
| 4.3.2 多重PCR鉴定球虫种类 |
| 4.3.3 药敏试验验证田间株耐药性 |
| 4.3.4 单卵囊分离田间盐霉素耐药株 |
| 4.3.5 差异表达基因在单卵囊分离株和田间混合种转录水平的分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 3个耐药相关基因功能特性初步研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验虫株、原核表达载体及细胞 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 实验仪器 |
| 5.2.5 敏感株孢子化卵囊的收集与纯化 |
| 5.2.6 敏感株孢子化卵囊总RNA的提取与c DNA的合成 |
| 5.2.7 耐药基因的扩增 |
| 5.2.8 基因的生物信息学分析 |
| 5.2.9 重组表达质粒的构建 |
| 5.2.10 重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 5.2.11 重组蛋白反应原性分析 |
| 5.2.12 抗重组蛋白多克隆抗体的制备 |
| 5.2.13 耐药基因在不同发育阶段和不同耐药株的转录水平分析 |
| 5.2.14 耐药基因在不同发育阶段和不同耐药株的翻译水平分析 |
| 5.2.15 耐药相关蛋白在子孢子入侵DF-1细胞后的定位 |
| 5.2.16 田间盐霉素耐药株和地克珠利耐药株对耐药基因进行验证 |
| 5.2.17 多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验 |
| 5.2.18 柠檬酸合酶对体外培养鸡巨噬细胞功能的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 敏感株孢子化卵囊的总RNA提取 |
| 5.3.2 耐药基因的克隆 |
| 5.3.3 基因的生物信息学分析 |
| 5.3.4 重组表达质粒的构建 |
| 5.3.5 重组蛋白的表达与纯化 |
| 5.3.6 重组蛋白的反应原性分析 |
| 5.3.7 三个基因在不同发育阶段的转录水平及翻译水平分析 |
| 5.3.8 三个基因在不同耐药株中的转录和翻译水平分析 |
| 5.3.9 三个基因在田间分离株的mRNA转录水平分析 |
| 5.3.10 三个蛋白在子孢子入侵DF-1细胞后的定位分析 |
| 5.3.11 多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验 |
| 5.3.12 柠檬酸合酶对体外培养鸡巨噬细胞功能的影响 |
| 5.3.13 r Et CS对一氧化氮(NO)生成量的测定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、鸡球虫的同工酶的研究（论文参考文献）
- [1]柔嫩艾美耳球虫田间分离株对地克珠利和盐霉素的耐药性检测[J]. 徐向东,吴文君,蔡为民,李文静,程振扬,刘丹丹,许金俊,李金贵,陶建平. 安徽农业科学, 2021(12)
- [2]基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究[D]. 姚亚文. 中国农业科学院, 2021
- [3]鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用[D]. 徐向东. 扬州大学, 2021
- [4]毒害艾美耳球虫普通PCR和纳米PCR检测方法的建立[D]. 王一. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]广东和广西地区鸡艾美耳球虫耐药性调查[J]. 符德文,王新秋,黄仪娟,刘丽丹,刘园,曾莉,邝春曼,林瑞庆,翁亚彪. 养禽与禽病防治, 2021(04)
- [6]参青球净散和桂枝治疗鸡球虫病的效果观察[J]. 张彤,苏圆圆,张瑞,张淑敏,唐乃栋,孙希宇,张凡,张俊卿,褚秀玲. 中兽医医药杂志, 2021(01)
- [7]毒害艾美耳球虫纳米PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 王一,王钰鑫,李媛,王俊伟,宋军科,赵光辉. 中国兽医学报, 2020(11)
- [8]如东县鸡球虫种类调查及柔嫩艾美耳球虫的耐药性检测[D]. 吴文君. 扬州大学, 2020(04)
- [9]鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株分离与耐药机制研究[D]. 黄杰. 扬州大学, 2020(04)
- [10]柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的诱导及耐药相关基因特性的初步分析[D]. 王海霞. 中国农业科学院, 2020