一、西藏牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离和鉴定（论文文献综述）
王妍瑾[1]（2021）在《牛病毒性腹泻病毒HB-1株的分离鉴定及间接ELISA检测方法的建立》文中研究说明牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea,BVD）又称粘膜病,是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的一种以肠黏膜脱落为主要特征的一种呈世界性分布的传染病,早期诊断和检测是防控、净化该病的重要环节。NS3蛋白是BVDV编码的重要的非结构蛋白,保守性强,是BVDV的免疫优势蛋白。因此,利用NS3蛋白建立BVDV检测方法具有重要意义。主要研究内容包括:1.BVDV毒株的分离鉴定收集了实验室2019～2020年送检发病牛的9份病料,经RT-PCR检测鉴定其中3份BVDV阳性。将阳性病料进行病毒分离,盲传5代后通过RT-PCR进行验证,验证正确后继续传5代。最终本研究成功分离了一株NCP型BVDV毒株,将其命名为HB-1。通过设计全基因组引物,对基因序列进行扩增,最终得到了HB-1的全基因组序列。全基因组核苷酸序列同源性显示HB-1与ZM-95的同源性最高,为86.9%,系统发育进化树显示HB-1与BVDV-1m几个参考毒株处于同一分支,证明HB-1分离株为BVDV-1m亚型;E0、E2和NS3蛋白氨基酸序列分析结果与全基因组分型结果一致。2.间接ELISA检测方法的建立本研究通过RT-PCR扩增出HB-1的NS3基因,构建了重组表达质粒p ET-32a-NS3,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中表达,通过SDS-PAGE鉴定NS3蛋白在上清中表达。经Western blot分析鉴定NS3蛋白具有反应原性。之后用纯化浓缩后的NS3蛋白作为包被抗原建立了BVDV抗体间接ELISA检测方法。NS3重组蛋白仅与BVDV阳性血清发生特异性反应,不与BRV、IBRV阳性血清发生反应,特异性良好;该方法的敏感性实验显示BVDV阳性血清在1:12800倍稀释时结果仍呈阳性,敏感性高;该方法的批内、批间变异系数均小于10%,重复性好。用建立的方法对临床收集的68份免疫血清,289份未免血清进行抗体检测,免疫血清总体阳性率95.59%,未免血清总体阳性率86.16%。建立的该检测方法为国内BVDV抗体的检测提供了技术支撑。
拜小强[2]（2021）在《牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立》文中提出牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起牛病毒性腹泻病,也是导致牛呼吸道疾病综合征（BRDC）主要病原之一。牛病毒性腹泻病临床表现复杂,以孕牛流产、胎牛木乃伊化、犊牛先天性缺陷,染疫牛只呈双向热、腹泻脱水、共济失调、免疫抑制和持续感染为主。该病在世界范围内广泛流行,目前我国20多个省、市、自治区的牛群中检测到病原,牛、羊﹑猪和鹿等偶蹄类动物也存在不同程度地感染,严重影响着畜牧业的健康发展。BVDV基因组中ORF编码结构蛋白和非结构蛋白,结构蛋白包括核心蛋白C和糖基化囊膜蛋白Erns、E1、E2,在病毒适应环境和维持自身稳定方面发挥着重要的作用。本实验利用MDBK细胞对BVDV毒株培养增殖和滴度测定,设计全序列引物对编码结构蛋白的基因进行克隆和鉴定,在此基础上应用生物信息学分析工具对基因组序列以及蛋白结构、性质和功能进行预测分析。结果显示MDBK细胞接毒培养至24h开始出现细胞病变,测定BVDV TCID50=10-5.112/0.1m L,PCR扩增出结构蛋白基因条带分别为306bp、681bp、585bp和1122bp,测序结果与NCBI数据库中BVDV-1、BVDV-2、CSFV和BDV共17株同源性比对显示,与BVDV-1 NADL株同源性最高,分别为100%、99.71%、97.78%和100%;构建系统进化树显示,与BVDV-1 NADL株进化关系密切,与同属的CSFV和BDV进化关系较为疏远。BVDV Npro和Erns蛋白较为保守且具有特征性功能,是与同科不同属病毒进行鉴别的差异化蛋白,Npro和ErnsRNase在阻断干扰素诱导和引起宿主持续感染中发挥重要的作用。本实验构建BVDV Npro和Erns重组表达载体,利用哺乳动物真核表达系统对Npro和Erns蛋白进行表达。成功构建了p CMV-Myc-Npro和p CMV-Myc-Erns真核表达质粒,并将重组质粒瞬时转染至HEK 293细胞中,经Western blot验证后,分别在21k D和27k D处出现目的条带。BVD常用的诊断方法包括临床诊断、病原学检验、免疫学检验和分子生物学检验技术。本实验建立了BVDV RT-PCR、q RT-PCR和RT-LAMP三种核酸检测方法,并对检测方法进行优化、验证和比较。实验证实建立的三种检测方法均有良好的特异性;对不同浓度标准质粒样品检测显示,q RT-PCR方法灵敏度最高（8.134×101copies/μL）,分别是RT-LAMP和RT-PCR的10和1000倍,RT-LAMP灵敏度次之（8.134×102copies/μL）,RT-PCR灵敏度最低（8.134×104copies/μL）;对67份临床样本检测结果进行Kappa和Mc Nemar校正检验分析,得出三种方法临床检出率高、检测结果一致性较好。诊断BVDV时建议在条件有限的情况下采用RT-LAMP检测方法,实验室条件允许时进一步采用q RT-PCR检测方法复检确诊。
赵玉宾[3]（2021）在《新疆南疆地区马鹿感染BVDV流行病学调查》文中进行了进一步梳理牛病毒性腹泻病（Bovine viral diarrhea,BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染动物机体引起动物黏膜溃烂、糜烂和腹泻为主要特征的一种接触性传染病,近年来牛病毒性腹泻病毒不仅在世界范围内广泛传播,而且在我国新疆地区也广泛存在。不仅影响我国新疆地区养牛业的发展,也给新疆养鹿业造成巨大的经济损失,因此,本研究通过对新疆南疆部分地区的马鹿进行BVDV血清学流行病学调查和分子生物学分析,以期掌握该地区马鹿感染BVDV的流行情况以及毒株类型,能够为该地区鹿场的防控提出可行性方案。1.2019年对新疆南疆某地区的14个规模化牛场和8个鹿场分别以发现疫病或证明无疫抽样策略每场采集10份血清样本,进行BVDV抗体ELISA检测,14个规模化牛场的BVDV抗体阳性率为90%～100%,8个鹿场BVDV抗体阳性率为10%～30%。2.2019年对新疆南疆某地区马鹿按照预期流行率的抽样原则,场内按照95%置信水平（CI）、10%可接受误差、50%预期流行率进行抽样,共采集736份血清样本,BVDV抗体ELISA检测出196份抗体阳性样本,抗体阳性率为26.63%;BVDV抗原ELISA检测出4份抗原阳性血清和1份疑似阳性血清,抗原阳性率为0.68%。3.ELISA抗原检测得到的4份抗原阳性样本和1份疑似阳性样本分别提取RNA,经BVDV 5’UTR、Npro基因特异性引物进行RT-PCR检测,检出4份阳性样本。经核苷酸同源性比较、系统进化树分析,4份样本均为BVDV-1c型。4.将本试验的鹿源BVDV与该地区牛源BVDV进行核苷酸同源性比较,相似度高达99.2%,推测牛与马鹿存在交叉感染是引起该地区马鹿感染BVDV的主要因素。
刘勃兴[4]（2021）在《河北部分地区四种肉犊牛腹泻病原调查及BVDV抗体检测方法建立》文中进行了进一步梳理在河北省,犊牛腹泻病是造成肉犊牛死亡和经济损失的主要疾病。在犊牛腹泻病的病因中,大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）、牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCo V）和牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）是主要致病原。为了解上述四种传染性病原在河北地区犊牛腹泻病料中的阳性率,本研究自2018年至2020年收集河北省秦皇岛市、唐山市、石家庄市等市患腹泻病肉犊牛样品共计804份,19.28%（155/804）的样品检测出上述四种病原。肉犊牛腹泻样品中共计分离E.coli 649株,分离数量最多,进一步通过小鼠致病性试验验证分离E.coli的致病性,共计有120株E.coli具有致病性,检出率为14.93%（120/804）。其中,O114型是致病性E.coli检出率最高的血清型,其次为O86型。通过RT-PCR检测样品中BVDV、BCo V和BRV三种病毒性病原,BCo V检出率为3.61%（29/804）、BRV检出率为2.99%（24/804）、BVDV检出率为0.87%（7/804）。混合感染样品数量占比14.84%（23/155）,检出率较高的病原混合感染组合形式为:致病性E.coli+BCo V、致病性E.coli+BRV、BCo V+BRV。在国内,BVDV抗体ELISA检测试剂盒主要进口于国外,而国内商品化试剂盒的品牌和种类较少,这导致我国BVDV抗体检测成本较高。BVDV的Erns蛋白可诱导产生中和抗体,是疫苗和诊断试剂研发的靶蛋白。为了降低BVDV抗体检测成本,了解河北地区牛群BVDV抗体阳性率,本研究以河北地方BVDV毒株为试验材料,用E.coli原核表达系统成功获得了Erns蛋白。以该蛋白为包被抗原建立BVDV抗体间接ELISA检测方法,并应用该方法检测河北地区牛血清样品的BVDV抗体阳性率。试验结果显示,本研究建立的BVDV抗体ELISA检测方法能特异性识别BVDV抗体阳性血清,具有较高的灵敏度（阳性血清最大稀释倍数为1 600倍）和重复性（批内和批间的变异系数均小于10%）,与IDEXX试剂检测同一批样品的总符合率为93.33%。应用该方法对河北地区18家牛场的477份血清样品进行检测,其中接种疫苗牛场的血清阳性率为30.43%～92.86%,未接种免疫牛场抗体阳性率为0～100%。本研究通过对河北地区肉犊牛腹泻样品中四种病原进行流行病学调查,为河北地区由四种病原引起的肉犊牛腹泻病的防控提供数据参考,同时本研究建立的BVDV抗体ELISA检测方法为河北地区BVDV的监测和防控提供技术支持。
吴陈华[5]（2021）在《PD-1阻断对BVDV小鼠急性感染模型中T细胞活性的影响》文中提出牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）对世界养牛业造成了严重的经济损失。BVDV急性感染常导致宿主白细胞数量严重的减少,从而引起了机体的免疫抑制;不同BVDV毒株的毒力强弱不同,导致的淋巴细胞衰竭的程度也不同,且具有可逆性。BVDV可感染多种哺乳动物,研究表明小鼠可以作为BVDV的急性感染模型,感染后引起淋巴细胞、白细胞和血小板的明显降低,然而不同致病型BVDV体内感染及PD-1阻断对小鼠外周血淋巴细胞等的影响尚不明确。本研究拟构建不同致病型毒株的BVDV急性感染小鼠模型,明确PD-1阻断对非致细胞病变（Noncytopathic,NCP）型和致细胞病变（Cytopathogenic,CP）型BVDV急性感染小鼠模型中T细胞活性的影响。首先,通过将CP型和NCP型BVDV分别腹腔注射感染BALB/c小鼠,通过血常规、荧光定量PCR、免疫组化和组织病理学等方法检测感染情况,构建BVDV急性小鼠感染模型。结果显示,小鼠表现出一定的临床症状,体重增加效率降低。CP组和NCP组的白细胞、淋巴细胞和血小板均在第7 d降到最低。CP组比NCP组的下降更为显着。CP组和NCP组BVDV在第7 d的检出率最高,血液中检出率最高。感染后第7 d CP组和NCP组各脏器中BVDV抗原检出率均为100%,镜检可见CP组BVDV抗原组织分布高于NCP组。感染后7 d两种生物型BVDV感染小鼠后均可引起组织病理损伤。研究表明成功建立了两种生物型BVDV的小鼠急性感染模型,CP型BVDV的致病性高于NCP型。其次,应用荧光定量PCR、ELISA和流式细胞术检测不同致病型BVDV感染小鼠后外周血和血清中的PD-1表达量、细胞因子、T细胞数量和细胞凋亡的变化。结果显示,仅感染后第7 d CP组PD-1表达极显着升高,NCP组PD-1表达显着升高;CP组的IL-2含量显着降低,NCP组IFN-γ含量显着降低。在感染后第7 d CP组CD3+、CD4+和CD8+T细胞数量均极显着降低;NCP组中CD4+、CD3+和CD8+T细胞均极显着降低;CP组以及NCP组的细胞凋亡均极显着增加。最后,应用ELISA和流式细胞术检测不同致病型BVDV感染小鼠后PD-1抗体阻断后外周血细胞因子、T细胞数量及凋亡的变化。结果显示,CP-Anti-PD-1组IL-2含量显着升高,IFN-γ含量升高不显着;NCP-Anti-PD-1组IFN-γ含量显着增加,IL-2含量增加不明显。CP-Anti-PD-1组CD3+和CD4+T细胞极显着升高,CD8+T细胞极显着升高。NCP-Anti-PD-1组CD3+和CD4+T细胞显着升高,CD8+T细胞极显着升高。CP-Anti-PD-1组小鼠外周血淋巴细胞凋亡极显着降低,NCP-Anti-PD-1组小鼠外周血淋巴细胞凋亡极显着降低。综上所述,本研究成功建立了CP型和NCP型BVDV的BALB/c小鼠急性感染模型。证实了BVDV感染小鼠后外周血淋巴细胞的PD-1表达量增加、T细胞活性降低以及细胞凋亡量增加。PD-1单抗阻断后恢复了T细胞的活性,降低了细胞凋亡。本研究为进一步探索BVDV免疫抑制的分子机制和免疫阻断策略提供了基础。
王丽屏,金显栋,毕峻龙,苏云顺,杨聪,李蛟龙,亐开兴,尹革芬[6]（2021）在《云南省牛病毒性腹泻—黏膜病血清流行病学调查》文中提出[目的]牛病毒性腹泻—黏膜病（bovine viral diarrhea-mucosal disease, BVD）引起牛腹泻、呼吸系统疾病、生殖功能障碍、免疫抑制、母畜流产、死胎等,对牛产业发展危害严重。牛病毒性腹泻—黏膜病病毒（bovine viral diarrhea-mucosal disease virus, BVDV）在我国大部分牛群中普遍存在,各地流行情况严重程度不同,本调查旨在调查云南省BVDV的流行情况。[方法]调查通过采用商品化的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒对BVDV感染和流行情况进行调查,采集了云南省4个州10个县（市）的部分规模牛场及散养户的牛血清样品456份。[结果]结果发现,云南省不同地区所检的牛血清样品总抗体阳性率为16.45%（75/456）,抗原阳性率为0.53%（2/378）,其中抗体阳性率以大理州洱源县60.0%（9/15）最高,而丽江市华坪县的血清样品中未检测到抗体阳性,大理州宾川县和丽江市宁蒗县的抗原阳性率较低,分别为7.69%（1/13）和4.00%（1/25）。云南省规模场牛的血清样品抗体总阳性率为27.27%（45/165）,抗原阳性率为1.15%（1/87）,散养户牛的分别为10.31%（30/291）和0.34%（1/291）。[结论]云南省的牛群中存在着BVDV感染的情况,其抗体抗原的阳性率水平跟地区有着紧密的联系,不同的养殖方式抗原抗体水平存在着一定差异,必须要加强云南省BVDV监测与防控,减少其造成的经济损失。
王标[7]（2020）在《新疆某规模化牧场犊牛IBR、BVD的诊断与防制》文中研究指明牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR）和牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea,BVD）是威胁养牛业的两种重要疾病,不同阶段的牛均可感染发病,以犊牛最为敏感,且病型复杂,对多个组织器官可造成伤害,目前尚无特效药进行治疗,同时会造成牛只的免疫耐受现象,易继发其它病原的混合感染而造成死亡。目的:2019年3月新疆某规模化牧场的犊牛群发生疑似IBR病例,同年6月发生疑似BVD病例,这两种疾病的先后发生使得牧场遭受了严重的经济损失。本试验通过对该牧场犊牛所患疾病进行诊断,确定病原、病因,根据诊断结果制定防制方案。方法:首先采用现场诊断的方法,对发病犊牛的临床症状、病死犊牛的病理剖检变化、犊牛的饲养管理条件、流行病学史等进行探究,查明病因病原,进行初诊;其次采用PCR、RT-PCR方法进行病原核酸检测及序列分析,同时进行细菌学检测,确定病原,做出最终的诊断结果;最后根据病原的种类及特征,进行疫苗免疫及效果评价、新生犊牛抗体监测试验,选择免疫效果较好的疫苗制定免疫程序,并结合改善饲养管理及饲养条件进行防制。结果:1.新疆某规模化牧场犊牛发生IBR的诊断发病率为38.36%（61/159）,病死率55.74%（34/61）。其中1～30日龄犊牛发病率为18.87%（30/159）、病死率73.33%（22/30）;31～60日龄犊牛发病率为8.18%（13/159）、病死率为61.54%（8/13）;61～90日龄犊牛发病率为6.92%（11/159）、病死率为27.27%（3/11）;91～120日龄犊牛发病率为4.40%（7/159）、病死率为14.29%（1/7）。均表现有发热、呼吸困难、“红鼻头”的症状,13头病牛有神经症状;剖检6头病死犊牛,可见肺脏严重肉变、充血,气管表面覆盖粘液,具有IBR特征性的症状。PCR检测可以得到预期255bp大小的目的条带,与标准参考株NC＿001847.1的同源性为91.9%～99.0%,BVDV检测均为阴性。2头死亡犊牛肺脏中检出巴氏杆菌,对小鼠具有致死性,表明部分病牛存在巴氏杆菌的混合感染。综上确诊为IBR。2.新疆某规模化牧场犊牛发生BVD的诊断发病率为39.43%（56/142）,病死率为66.07%（37/56）。其中1～30日龄发病率为23.94%（34/142）、76.47%（26/34）;31～60日龄发病率为9.86%（14/142）、病死率为64.29%（9/14）;61～90日龄发病率为5.63%（8/142）、病死率为25.00%（2/8）。均表现有严重的腹泻,33头病牛呈现水样腹泻、头病牛粪便中带有血液和肠黏膜碎片,15头病牛伴有流鼻涕、咳嗽、呼吸困难的症状。剖检4头病死犊牛可见肠道内有大量出血点、肠黏膜有出血点、肠壁菲薄呈半透明状、胃肠道内容物中有大量气泡、肠系膜淋巴结肿大。RT-PCR检测可以得到293bp大小的目的条带,与Genbank上登录的7株参考株的同源性为80.3%-95.3%,IBRV的检测均呈现阴性。3头病死牛肺脏中检出链球菌,对小鼠具有致死性,表明部分犊牛存在链球菌的混合感染。综上确诊为BVD。3.犊牛BVD、IBR的免疫效果评价及防制BVD-IBR二联灭活苗组BVDV、IBRV免疫抗体阳性率均为85.71%（18/21）,BVD灭活苗免疫抗体阳性率为80.95%（17/21）,IBR灭活苗免疫抗体阳性率为76.19%（16/21）,BVD-IBR二联灭活疫苗的免疫效果优于BVD灭活疫苗、IBR灭活疫苗。新生犊牛抗体监测4周龄时下降至临界值附近,此时进行首次免疫接种。首免21d后抗体达到峰值,28d时抗体水平下降,此时进行二次免疫接种,二免21d后抗体达到最大值。因此犊牛正常免疫时,首免于4周龄,28天后加强免疫一次。奶牛春秋季节普免,干奶期时加强免疫。犊牛紧急免疫接种后28天加强免疫一次。结论:2019年3月该牧场犊牛发生的疾病为IBR,部分犊牛存在巴氏杆菌的混合感染。同年6月该牧场犊牛发生的疾病为BVD,部分犊牛存在链球菌的混合感染。在防制方面,BVD-IBR二联灭活疫苗的免疫效果优于BVD灭活疫苗和IBR灭活疫苗,牧场采用BVD-IBR二联灭活疫苗免疫结合改善饲养管理方式,有效的控制了这两种疾病的再次发生。
徐承倩[8]（2020）在《2018～2019年天津地区奶牛BVDV分子流行病学调查及流行毒株的分离鉴定》文中研究指明牛病毒性腹泻病是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的可以导致养牛业重大经济损失的传染性疾病。本研究针对天津地区部分规模化奶牛场疑似样品,开展病原学方法、病毒分离鉴定以及生物学信息研究与分析,评估BVDV在天津地区奶牛场的流行状况,为定制合理有效的防控措施和疫苗的研发提供理论依据。通过对2018年-2019年天津地区部分奶牛场232份疑似血清样品检测及基因序列和遗传进化树分析,结果显示共有26份样品为BVDV阳性且均为BVDV1型,阳性率为11.2%（26/232）,亚型主要是BVDV 1m（1/26,3.85%）和BVDV 1b（25/26,96.15%）天津各区奶牛牧场均有感染,且阳性检出率呈上升状态。通过对BVDV1b的5’-UTR遗传进化分析发现,临床流行毒株与在西班牙分离鉴定毒株CZ475（2017年）同源性为97.1%,与新疆石河子分离毒株3165（2012年）同源性达96.8%,且所有流行毒株均遗传演化成独立分支,可能已经在天津区域性广泛传播;BVDV-1m遗传进化分析显示,该毒株与2006年猪源BVDV分离的毒株同源性最高,说明存在奶牛与猪的交替感染风险,提示务必加强易感动物防控。通过对优势流行BVDV-1b阳性血清样品进行MDBK细胞病毒分离、RT-PCR,病毒蚀斑纯化和IFA鉴定,证实成功分离得到一株临床毒株,命名为TJ1901。该毒株在细胞上产生拉网,圆缩,空隙增大等明显病变,属于致细胞病变型（CP）,病毒滴度为105.16TCID50/mL。经过遗传演化分析,该毒株与3165株（2012年）和MRI332株（2017年）同源性最高,而且产生了变异,具有一定地域差异性,成功分离到优势流行毒株,丰富了天津地区BVDV基因数据库,为后续疫苗研究奠定了基础。本研究对天津地区奶牛的BVDV流行规律有了初步的了解,证实了2018年-2019年天津地区奶牛BVDV主要流行毒株为1b亚型,同时,BVDV流行毒株的多样性也应引起重视,除了加强免疫筛选淘汰持续性感染牛外,还要制定合理有效的的免疫程序并保持持续监测,加强管理切断BVDV跨物种传播途径。
程佳佳[9]（2020）在《延边黄牛病毒性腹泻、蓝舌病、白血病和布鲁氏菌病的流行病学调查》文中研究说明延边黄牛是吉林省延边朝鲜族自治州地区役、肉兼用的黄牛品种,因独特的品种特征和优良的肉品特性,使其成为国家资源保护品种和中国五大地方良种牛之一。牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral diarrhea virus,BVDV）感染动物后,可导致呼吸系统疾病、腹泻、生殖功能障碍、怀孕母牛流产、生长迟缓、免疫抑制等症状;蓝舌病（Bluetongue,BT）是可经库蠓等昆虫传播的虫媒病毒病,临床特征主要表现为病畜口腔和舌部出现水肿,在患病后期,这些部位可与胃肠道黏膜同样出现溃疡性炎症变化,患病胎儿常出现畸形,患病幼畜则表现为发育不良甚至死亡;牛白血病病毒（Bovine leukosis virus,BLV）感染后大部分病牛无典型的临床症状,该疾病的主要症状取决于患病器官,因肿瘤部位机械性损伤和压迫而使病牛呈现出相应的症状,故此随着疾病的发展,个体的临床症状差异较大;布鲁杆氏菌病（Brucellosis）是人畜共患性传染病,主要侵害生殖系统,感染后可引起怀孕母畜流产、早产、胎盘滞留等,所排出的羊水、分泌物中也含有大量布鲁氏菌,传染力特别强;公畜会出现睾丸炎、关节炎及神经损伤等症状。随着对牛肉和乳制品需求的增加,迫使肉牛养殖量和进出口频率增加,导致疾病的发展呈上升趋势,从而严重威胁地区的公共卫生安全。首先采集了吉林省延边州3个不同市区共627份延边黄牛的血液样本,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对样本进行了血清学检测并分析,结果显示:牛病毒性腹泻-粘膜病的抗体检测流行率在40.26%（93/231）51.67%（139/269）之间,平均抗体检测流行率为44.82%（281/627）,其中最高的是延吉市,感染率为珲春市的1.7倍（OR=1.702）,通过对风险因素的评估得知,只有地区与检测流行率产生相关性（P<0.05）,而性别、年龄和季节因素均没有显着性差异;所有的样本中,蓝舌病的平均抗体检测流行率为12.76%（80/627）,其中龙井市的最高为14.72%（34/231）,延吉市的检测流行率次之为13.38%（36/269）,珲春市的检测流行率最低为7.87%（10/127）;牛白血病的平均抗体检测流行率为29.35%（184/627）,延吉市、龙井市、珲春市的检测流行率分别为17.47%（47/269）、16.54%（21/127）、15.58%（36/231）,分别对这两种疾病的风险因素进行分析,结果显示四种因素的差异均不显着（P>0.05）。随后采用实时荧光定量PCR方法对上述采集的样本进行布鲁氏菌病的检测,并对风险因素进行评估。通过结果发现:该病的平均抗原检测流行率为7.34%（46/627）,不同地区的检测流行率在6.06%（14/231）8.17%（22/269）之间,分析风险因素得知,地区、性别、年龄、季节在统计学上并无显着差异（P>0.05）,不是感染布氏杆菌病的危险因素。综上所述,牛病毒性腹泻-黏膜病、蓝舌病、牛白血病、布鲁氏菌病在吉林省延边州地区普遍存在,同时存在混合感染的情况,潜在危害均较为严重。调查的延吉市、珲春市和龙井市的延边黄牛中,牛病毒性腹泻-黏膜病的抗体检测流行率最高,为44.82%;且存在显着地域差异;蓝舌病、牛白血病、布鲁氏菌病流行率的地区差异不显着。调查的延边黄牛中,四种疾病的流行率在年龄、性别、季节因素上无明显差异。
陈鑫烨[10]（2020）在《牛病毒性腹泻病毒抗原表位的筛选及其单克隆抗体的制备》文中研究表明牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease,BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）感染引起的一种以腹泻、粘膜溃疡为主要特征的接触性传染病。BVDV的天然宿主为牛,此外,还可以感染羊驼、绵羊、山羊、猪、骆驼、鹿、小鼠等40多种动物,是给全球畜牧业造成重大经济损失的重要病原。目前,BVDV在我国部分地区广泛流行,而我国尚无自主研发的商品化快速检测试剂,缺少有效的治疗和防控技术。随着我国集约化养殖业的发展,BVDV对我国养殖业的危害也将进一步扩大。因此,建立快速、有效的抗原/抗体检测方法对BVDV的防控意义重大。本研究通过对河南省7个地级市的部分养牛场进行了 BVDV流行病学调查,共检测了 429份牛血清,BVDV抗体阳性率高达64.34%,阴性检出率为32.63%,可疑检出率为3.03%,结果表明牛群中确实存在BVDV的感染与流行,并且流行情况较严重,应当引起重视。鉴于BoHV-1感染激发BVDV感染,两者混合感染后可以引起肺炎,死亡率较高。已知众多HDAC抑制剂在临床上已经被广泛应用,并且发现具有抗病毒和抑制炎症反应的作用。本文旨在从中筛选针对两者均具有抗病毒作用和抑制炎症相关信号的药物,以期用于BRDC的治疗。在本研究中,我们筛选到苯丙酸具有抑制BoHV-1复制的活性,但是能够激活炎症反应相关信号,故苯丙酸不具备治疗价值。因此,放弃对BVDV抗病毒作用进行研究。初步研究表明,苯丙酸不适合用于BVDV/BoHV-1引起的BRDC的治疗。获得BVDV B细胞表位对于疫苗研究及检测方法的建立均具有重要意义。本研究利用商品化的BVDV抗血清对噬菌体随机展示肽文库进行了 3轮淘选（吸附-洗脱-扩增）,对第三轮洗脱物进行滴定,随机挑选100个克隆并对其提取噬菌体DNA进行测序,经序列分析获得多个与阳性血清反应的噬菌体克隆（尽管部分克隆用于抗体检测试纸条的研究已申请专利,但是根据相关克隆获得的病毒表位的免疫学功能尚未完全得到验证,专利尚未提交申请,因此本论文中所有来自噬菌体的序列及病毒多肽氨基酸序列暂时不公布）。其中,噬菌体表位P3共重复出现了 35次,相对而言可能具有重要研究价值,所以本研究主要对P3及由P3推导的病毒表位（命名为P3-BVDV1/2）进行研究。用Dot-blot的方法进一步确定噬菌体P3与商品化BVDV抗体结合。根据噬菌体DNA测序与抗原表位鉴定结果,将源于噬菌体的模拟表位P3及P3-BVDV1/2的氨基酸序列送至生物公司合成相应多肽。然后将多肽分别与BSA和KLH偶联,用Western-blot或Dot-blot的方法进一步确定合成多肽与BVDV抗体的结合,结果表明P3及P3-BVDV1/2均能够与BVDV抗血清反应。以KLH-P3及KLH-P3-BVDV1/2免疫BALB/C小鼠,采集三免后的小鼠血清,经Dot-blot确定该血清能够与BVDV结合。结果表明,通过该文库筛选的多肽P3及P3-BVDV1/2也具有免疫原性。为了制备针对P3-BVDV1/2表位的单克隆抗体,根据Dot-blot原理,我们建立了一种快速、有效的筛选单克隆抗体的实验方法,将其命名为Dot-blot in well ECL。尽管本方法与传统方法一样也具有非特异性的缺陷,但是经过连续3次严格筛选,最终获得了一株针对P3-BVDV1/2的单克隆抗体,命名为11G9D10。测其轻链亚型为Kappa,重链亚型为IgM。利用该单克隆抗体进行胶体金标记,发现并不能与细胞培养的病毒反应,所以该单克隆抗体不能用于抗原检测试纸条的制备,所以有关该抗体的免疫学反应特性如亲和力等均无深入鉴定的价值。但是,整个过程证明该筛选的表位能诱导机体产生抗体,该表位或许具有潜在的疫苗研究价值。综上所述,尽管本研究未能获得理想的抗病毒药物,也未获得有价值的单克隆抗体,但是我们筛选到了部分BVDV表位,可能具有疫苗研究价值。另外,针对BVDV的血清学调查结果表明该病毒的确在河南省广泛流行,值得广大科研工作者投入更多的精力对该病毒的防控技术加强研究。
二、西藏牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离和鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、西藏牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离和鉴定（论文提纲范文）
（1）牛病毒性腹泻病毒HB-1株的分离鉴定及间接ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 牛病毒性腹泻病毒 |
| 1.1.1 基因组结构 |
| 1.1.2 病毒粒子结构特征 |
| 1.1.3 编码蛋白及其功能 |
| 1.2 牛病毒性腹泻流行病学 |
| 1.2.1 临床症状及病理变化 |
| 1.2.2 传染源及传播途径 |
| 1.2.3 国内外流行状况 |
| 1.3 牛病毒性腹泻检测方法 |
| 1.3.1 病毒的分离鉴定 |
| 1.3.2 RT-PCR |
| 1.3.3 实时荧光定量PCR |
| 1.3.4 ELISA的检测 |
| 1.4 牛病毒性腹泻疫苗研究 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 牛病毒性腹泻毒株的分离鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 试验试剂及耗材 |
| 2.1.4 试验仪器 |
| 2.1.5 相关试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 临床样品RT-PCR检测 |
| 2.2.3 病毒分离 |
| 2.2.4 病毒电镜观察 |
| 2.2.5 病毒全基因组序列扩增 |
| 2.2.6 病毒全基因组核苷酸序列分析 |
| 2.2.7 病毒E0 蛋白氨基酸序列分析 |
| 2.2.8 病毒E2 蛋白氨基酸序列分析 |
| 2.2.9 病毒NS3 蛋白氨基酸序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 样品的RT-PCR检测 |
| 2.3.2 细胞接种病毒 |
| 2.3.3 分离病毒的PCR鉴定 |
| 2.3.4 病毒电镜观察 |
| 2.3.5 病毒全基因组序列扩增 |
| 2.3.6 病毒全基因组核苷酸序列分析 |
| 2.3.7 病毒E0 蛋白氨基酸序列分析 |
| 2.3.8 病毒E2 蛋白氨基酸序列分析 |
| 2.3.9 病毒NS3 蛋白氨基酸序列分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛病毒性腹泻抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 载体 |
| 3.1.2 试验试剂及耗材 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.1.4 相关试剂的配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 NS3 基因扩增 |
| 3.2.2 NS3 基因与pMDTM-18T载体连接 |
| 3.2.3 连接产物的转化 |
| 3.2.4 阳性质粒的鉴定 |
| 3.2.5 牛病毒性腹泻NS3 的原核表达 |
| 3.2.6 NS3 蛋白的Western blot检测 |
| 3.2.7 NS3 蛋白的纯化 |
| 3.2.8 NS3 蛋白的浓缩 |
| 3.2.9 间接ELISA方法的初步建立 |
| 3.2.10 间接ELISA方法条件的优化 |
| 3.2.11 特异性试验 |
| 3.2.12 重复性试验 |
| 3.2.13 敏感性试验 |
| 3.2.14 间接ELISA方法的初步应用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 菌液PCR鉴定 |
| 3.3.2 NS3 蛋白表达与纯化 |
| 3.3.3 NS3 蛋白的Western blot检测 |
| 3.3.4 NS3 蛋白的浓缩 |
| 3.3.5 间接ELISA方法条件的优化 |
| 3.3.6 特异性试验 |
| 3.3.7 重复性试验 |
| 3.3.8 敏感性试验 |
| 3.3.9 临床检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 论文受资助情况 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牛病毒性腹泻病概述 |
| 2 BVDV病原学特性 |
| 2.1 病毒培养及理化性质 |
| 2.2 病毒分型 |
| 3 BVDV分子生物学特性 |
| 3.1 病毒基因组 |
| 3.2 病毒的结构蛋白 |
| 3.3 病毒的非结构蛋白 |
| 3.4 病毒生物型NCP向CP转化 |
| 4 流行病学与临床表现 |
| 4.1 流行病学 |
| 4.2 流行特点 |
| 4.3 临床表现 |
| 4.4 BVDV感染对机体免疫系统的影响 |
| 5 BVDV检测技术 |
| 5.1 病原学检查 |
| 5.2 免疫学诊断技术 |
| 5.3 分子生物学检查技术 |
| 6 防控措施 |
| 6.1 预防与治疗 |
| 6.2 疫苗免疫 |
| 6.3 牛场BVD的净化 |
| 7 研究内容及意义 |
| 第二章 BVDV结构蛋白的基因克隆及生物信息学分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞、质粒和病毒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液及培养基配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒的增殖及滴度测定 |
| 2.2 C、E~(rns)、E1和E2 基因扩增 |
| 2.3 目的基因克隆及序列测定 |
| 2.4 目的基因及蛋白的生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的增殖 |
| 3.2 病毒TCID_(50)测定 |
| 3.3 C、E~(rns)、E1和E2 基因全序列扩增 |
| 3.4 C、E~(rns)、E1和E2 生物学信息分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 BVDV N~(pro)、E~(rns)蛋白的真核表达 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 N~(pro)和E~(rns)基因扩增 |
| 2.2 真核表达载体的构建及双酶切鉴定 |
| 2.3 N~(pro)和E~(rns)蛋白真核表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 BVDV N~(pro)、E~(rns)基因PCR扩增 |
| 3.2 菌液PCR筛选 |
| 3.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.4 转染细胞目的基因检测 |
| 3.5 Western blot蛋白表达验证 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 BVDV三种核酸检测方法的建立、比较与应用 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计合成 |
| 2.2 临床样品处理 |
| 2.3 重组质粒标准品的构建 |
| 2.4 RT-PCR方法的建立及条件优化 |
| 2.5 qRT-PCR方法的建立及条件优化 |
| 2.6 RT-LAMP方法的建立及条件优化 |
| 2.7 BVDV三种核酸检测方法的比较 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2 qRT-PCR检测方法的建立 |
| 3.3 RT-LAMP检测方法的建立 |
| 3.4 BVDV三种核酸检测方法的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（3）新疆南疆地区马鹿感染BVDV流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 牛病毒性腹泻概述 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病病毒生物学特征 |
| 1.2.1 牛病毒性腹泻病毒的病原学特征 |
| 1.2.2 牛病毒性腹泻的基因组结构 |
| 1.3 牛病毒性腹泻病毒分型 |
| 1.4 流行病学和临床症状 |
| 1.4.1 国外流行情况 |
| 1.4.2 国内流行情况 |
| 1.4.3 临床症状 |
| 1.5 诊断方法 |
| 1.5.1 病毒分离鉴定 |
| 1.5.2 电镜检测 |
| 1.5.3 酶联免疫吸附试验检测病毒(ELISA实验) |
| 1.5.4 RT-PCR技术 |
| 1.5.5 荧光定量PCR技术 |
| 1.5.6 血清中和试验 |
| 1.6 BVDV传入风险分析 |
| 1.6.1 传染源 |
| 1.6.2 传播途径 |
| 1.6.3 易感动物 |
| 1.7 防控措施 |
| 1.7.1 无疫苗接种净化 |
| 1.7.2 疫苗防控 |
| 1.8 目的和意义 |
| 第2章 新疆南疆地区马鹿感染 BVDV 发现疫病的调查 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验样品的来源及样本的抽样原则 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 样品处理 |
| 2.2.2 牛病毒性腹泻病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 新疆南疆地区马鹿 BVDV 血清流行病学调查 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验样品来源 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 样品处理 |
| 3.2.2 牛病毒性腹泻病毒抗体ELISA检测 |
| 3.2.3 牛病毒性腹泻病毒抗原ELISA检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 马鹿感染BVDV分子生物学分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 材料来源 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 特异性引物合成 |
| 4.1.5 参考毒株 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 样本RNA提取 |
| 4.2.2 RT-PCR |
| 4.2.3 PCR产物纯化回收及测序 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 BVDV5'-UTR扩增结果 |
| 4.3.2 BVDV Npro基因扩增结果 |
| 4.3.3 RT-PCR检测结果 |
| 4.4 同源性比较 |
| 4.4.1 BVDV5'-UTR基因同源性比较 |
| 4.4.2 BVDV Npro基因核苷酸同源性分析 |
| 4.5 基因遗传进化树分析 |
| 4.5.1 BVDV5'-UTR基因遗传进化树分析 |
| 4.5.2 BVDV Npro基因遗传进化树分析 |
| 4.6 牛源 BVDV 和鹿源 BVDV 核苷酸同源性比较 |
| 4.7 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）河北部分地区四种肉犊牛腹泻病原调查及BVDV抗体检测方法建立（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 犊牛腹泻病及四种传染性病原的研究进展 |
| 1.1.1 犊牛腹泻病的E.coli的研究进展 |
| 1.1.2 BVDV引起的犊牛腹泻病的研究进展 |
| 1.1.3 BCoV引起的犊牛腹泻病的研究进展 |
| 1.1.4 BRV引起的犊牛腹泻病的研究进展 |
| 1.2 研究的目的及意义 |
| 第二章 河北地区致肉犊牛腹泻四种病原流行病学调查 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 肉犊牛腹泻样品采集及来源 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂与试验动物 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 肉犊牛腹泻样品中致病E.coli的分离鉴定 |
| 2.2.2 肉犊牛腹泻样品中三种病毒病原的检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 患腹泻病肉犊牛临床症状 |
| 2.3.2 河北地区肉犊牛腹泻四种病原总检出情况 |
| 2.3.3 肉犊牛腹泻E.coli的分离鉴定 |
| 2.3.4 致肉犊牛腹泻三种病毒病原的检测 |
| 2.3.5 河北地区肉犊牛四种病原混合感染情况 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛病毒性腹泻病毒E~(rns)蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 病毒株、质粒、血清 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 E~(rns)蛋白的基因扩增及分析 |
| 3.2.2 E~(rns)蛋白的原核表达 |
| 3.2.3 重组His-E~(rns)蛋白的浓度测定 |
| 3.2.4 BVDV的 E~(rns)抗体间接ELISA检测方法建立 |
| 3.2.5 BVDV的 E~(rns)抗体间接ELISA检测方法的应用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 E~(rns)蛋白的基因扩增及分析 |
| 3.3.2 E~(rns)蛋白的原核表达 |
| 3.3.3 重组His-E~(rns)蛋白的浓度测定 |
| 3.3.4 BVDV的 E~(rns)抗体间接ELISA检测方法建立 |
| 3.3.5 BVDV的 E~(rns)抗体间接ELISA检测方法的应用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 论文受资助情况 |
| 致谢 |
（5）PD-1阻断对BVDV小鼠急性感染模型中T细胞活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展 |
| 1.2.1 BVDV种属和分型 |
| 1.2.2 急性感染 |
| 1.2.3 持续性感染 |
| 1.2.4 流行病学 |
| 1.2.5 BVDV与机体免疫应答 |
| 1.3 程序性细胞死亡蛋白-1 的概述 |
| 1.3.1 PD-1蛋白生物学特性 |
| 1.3.2 PD-1/PD-L1通路研究进展 |
| 1.3.3 抗PD-1/PD-L1抗体产品的临床应用 |
| 1.3.4 抗PD-1/PD-L1抗体的抗病毒治疗效果 |
| 1.3.5 兽用抗PD-1/PD-L1抗体的研究进展 |
| 1.4 BVDV急性感染模型的进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 不同生物型的BVDV小鼠急性感染模型的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物及分组 |
| 2.1.2 细胞与病毒 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器和设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 感染小鼠及病料采集 |
| 2.2.2 RNA提取 |
| 2.2.3 荧光定量PCR的检测 |
| 2.2.4 血液血常规检测 |
| 2.2.5 免疫组化步骤 |
| 2.2.6 HE染色步骤 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 小鼠的临床症状及剖检病理变化结果 |
| 2.3.2 血常规检测结果 |
| 2.3.3 感染小鼠体重变化结果 |
| 2.3.4 荧光定量PCR检测结果 |
| 2.3.5 免疫组化检测结果 |
| 2.3.6 组织病理变化检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 BVDV感染对小鼠外周血淋巴细胞PD-1、细胞因子和T细胞凋亡的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 动物分组 |
| 3.1.2 细胞和毒株 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 仪器和设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 感染小鼠及病料采集 |
| 3.2.2 体内感染后PD-1的检测 |
| 3.2.3 小鼠外周血淋巴细胞的分离 |
| 3.2.4 细胞因子的检测 |
| 3.2.5 流式细胞仪检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PD-1及PD-L1检测结果 |
| 3.3.2 细胞因子检测结果 |
| 3.3.3 CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞检测结果 |
| 3.3.4 细胞凋亡检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 体内阻断PD-1对BVDV感染小鼠外周血淋巴细胞细胞因子和T细胞凋亡的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 动物分组 |
| 4.1.2 细胞和毒株 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 仪器和设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 BVDV感染小鼠与PD-1阻断 |
| 4.2.2 病料采集 |
| 4.2.3 PD-1阻断后小鼠外周血淋巴细胞的分离 |
| 4.2.4 PD-1阻断后细胞因子检测 |
| 4.2.5 PD-1阻断后流式细胞仪检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 体内阻断PD-1通路对细胞因子的影响 |
| 4.3.2 体内阻断PD-1通路对T细胞影响 |
| 4.3.3 体内阻断PD-1对细胞凋亡影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）云南省牛病毒性腹泻—黏膜病血清流行病学调查（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方 法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同地区BVDV抗体检测 |
| 2.2 不同地区的BVDV抗原检测 |
| 2.3 不同养殖方式的BVDV血清抗体检测 |
| 2.4 不同养殖方式的BVDV血清抗原检测 |
| 3 讨 论 |
（7）新疆某规模化牧场犊牛IBR、BVD的诊断与防制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 一 牛传染性鼻气管炎的研究进展 |
| 1.1 病原特征 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状及病理变化 |
| 1.4 诊断 |
| 1.5 防控 |
| 二 牛病毒性腹泻的研究进展 |
| 2.1 病原特征 |
| 2.2 基因分型及生物学分型 |
| 2.3 流行病学 |
| 2.4 临床症状及病理变化 |
| 2.5 诊断 |
| 2.6 防控 |
| 三 本研究目的及意义 |
| 第二章 试验内容 |
| 试验一 新疆某规模化牧场犊牛发生IBR的诊断 |
| 1 材料 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 试验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 现场诊断 |
| 2.2 PCR检测 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 样品处理 |
| 2.2.3 病毒DNA的提取 |
| 2.2.4 PCR反应 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳试验 |
| 2.3 序列测定与分析 |
| 2.3.1 目的条带的回收 |
| 2.3.2 T载体连接 |
| 2.3.3 感受态细胞的转化 |
| 2.3.4 菌液PCR验证 |
| 2.4 BVDV的检测 |
| 2.5 细菌学检测 |
| 2.5.1 病原菌的镜检及培养 |
| 2.5.2 生化鉴定 |
| 2.5.3 药敏试验及致病性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 现场诊断结果 |
| 3.2 PCR检测结果 |
| 3.3 序列测定与分析结果 |
| 3.4 BVDV的检测结果 |
| 3.5 细菌学检测结果 |
| 3.5.1 病原菌镜检及培养结果 |
| 3.5.2 生化鉴定 |
| 3.5.3 药敏试验与致病性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 试验二 新疆某规模化牧场犊牛发生BVD的诊断 |
| 1 材料 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 试验试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 现场诊断 |
| 2.2 RT-PCR检测 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 样品处理 |
| 2.2.3 总RNA的提取 |
| 2.2.4 RNA病毒的反转录试验 |
| 2.2.5 PCR反应 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳试验 |
| 2.3 序列测定与分析 |
| 2.4 IBRV的检测 |
| 2.5 细菌学检测 |
| 2.5.1 病原菌的镜检及培养 |
| 2.5.2 生化鉴定 |
| 2.5.3 药敏试验及致病性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 现场诊断结果 |
| 3.2 RT-PCR检测结果 |
| 3.3 序列测定与分析 |
| 3.4 IBRV的检测结果 |
| 3.5 细菌学检测结果 |
| 3.5.1 病原菌的镜检及培养结果 |
| 3.5.2 生化鉴定结果 |
| 3.5.3 药敏试验及致病性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 试验三 犊牛IBR、BVD的免疫效果评价及防制 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BVD-IBR二联灭活疫苗、BVD灭活疫苗、IBR灭活疫苗的免疫效果对比 |
| 2.2 犊牛BVD、IBR免疫程序的制定 |
| 2.3 BVDV、IBRV抗体ELISA检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫前后BVDV、IBRV抗体及两种疫苗免疫效果对比分析 |
| 3.2 犊牛BVD、IBR的免疫程序 |
| 3.3 防制措施 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（8）2018～2019年天津地区奶牛BVDV分子流行病学调查及流行毒株的分离鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 生物学特性 |
| 1.1.2 基因分型 |
| 1.1.3 基因组结构 |
| 1.2 BVD流行情况 |
| 1.3 感染与临床症状 |
| 1.4 控制措施 |
| 1.5 检测方法 |
| 1.6 疫苗研究进展 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 天津地区部分规模奶牛场BVDV病原学调查 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 样品信息采集 |
| 2.1.1.2 主要试剂与耗材 |
| 2.1.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 引物设计 |
| 2.1.2.2 核酸提取 |
| 2.1.2.3 RT-PCR |
| 2.1.2.4 PCR产物电泳及纯化 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 2018-2019 年天津地区奶牛BVDV流行毒株遗传演化分析 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 主要试剂与耗材 |
| 3.1.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 重组质粒的构建 |
| 3.1.2.2 重组质粒转化 |
| 3.1.2.3 菌落鉴定 |
| 3.1.2.4 质粒提取 |
| 3.1.1.5 测序 |
| 3.1.1.6 5’-UTR遗传进化分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 序列获取 |
| 3.2.2 遗传进化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 一株BVDV毒株的分离与鉴定 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 BVDV 细胞株分离结果 |
| 4.2.2 间接免疫荧光(IFA)结果 |
| 4.2.3 RT-PCR结果 |
| 4.2.4 病毒纯化蚀斑结果 |
| 4.2.5 5’-UTR基因序列进化树分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（9）延边黄牛病毒性腹泻、蓝舌病、白血病和布鲁氏菌病的流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语（Abbreviations） |
| 1 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻 |
| 1.2 延边黄牛简介 |
| 1.2.1 牛病毒性腹泻病原学 |
| 1.2.2 牛病毒性腹泻的流行情况 |
| 1.2.3 诊断 |
| 1.2.4 防治 |
| 1.3 蓝舌病 |
| 1.3.1 蓝舌病概述 |
| 1.3.2 蓝舌病病原学 |
| 1.3.3 蓝舌病的流行情况 |
| 1.3.4 诊断 |
| 1.3.5 防治 |
| 1.4 牛白血病 |
| 1.4.1 牛白血病概述 |
| 1.4.2 牛白血病病原学 |
| 1.4.3 牛白血病的流行情况 |
| 1.4.4 诊断 |
| 1.4.5 防治 |
| 1.5 布鲁氏菌 |
| 1.5.1 布鲁氏菌概述 |
| 1.5.2 布鲁氏菌病原学 |
| 1.5.3 布鲁氏菌的流行情况 |
| 1.5.4 诊断 |
| 1.5.5 防治 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 2 研究内容 |
| 2.1 延边黄牛病毒性腹泻-黏膜病的血清流行病学调查 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 结果与分析 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 延边黄牛蓝舌病的血清流行病学调查 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 结果与分析 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 延边黄牛白血病的血清流行病学调查 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.3 结果与分析 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 2.4 延边黄牛布鲁氏菌病的流行病学调查 |
| 2.4.1 材料 |
| 2.4.2 试验方法 |
| 2.4.3 结果与分析 |
| 2.4.4 讨论 |
| 2.4.5 小结 |
| 2.5 延边黄牛四种疫病不同因素间的阳性率 |
| 2.5.1 延边黄牛四种疫病地区因素的阳性率 |
| 2.5.2 延边黄牛四种疫病性别因素的阳性率 |
| 2.5.3 延边黄牛四种疫病年龄因素的阳性率 |
| 2.5.4 延边黄牛四种疫病季节因素的阳性率 |
| 2.5.5 讨论 |
| 3 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）牛病毒性腹泻病毒抗原表位的筛选及其单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) |
| 1.1 BVDV的研究背景 |
| 1.2 BVDV的发现及流行现状 |
| 2 BVDV的分子生物学特性 |
| 2.1 病原特性 |
| 2.2 病原生物分型 |
| 2.3 病毒基因组结构 |
| 2.4 BVDV编码的结构蛋白及功能 |
| 2.5 BVDV编码的非结构蛋白及功能 |
| 3 噬菌体展示技术 |
| 3.1 噬菌体展示技术的原理 |
| 3.2 噬菌体展示系统的类别 |
| 4 噬菌体展示技术的应用 |
| 4.1 抗原表位定位及抗原筛选 |
| 4.2 疫苗制备 |
| 4.3 抗体制备 |
| 5 BVDV的免疫防控 |
| 6 研究的目的和意义 |
| 第1章 河南省部分地区BVDV流行病学调查 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 样品来源 |
| 1.1.2 主要试剂、仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 血清抗体的检测 |
| 1.2.2 结果判定 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 牛病毒性腹泻抗体检测 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 苯丙酸不适合用于治疗BoHV-1/BVDV混合感染引起BRDC的治疗 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞与病毒 |
| 2.1.2 抗体和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒复制抑制实验 |
| 2.2.2 荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.2.3 Western Blotting |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HDAC抑制剂PB对BoHV-1感染具有抗病毒活性 |
| 2.3.2 PB主要影响后期病毒感染 |
| 2.3.3 PB影响某些IE基因的转录 |
| 2.3.4 PB增强了BoHV-1感染刺激的Erk1/2和p38MAPK信号的激活 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 BVDV模拟表位的筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 肽库和抗体 |
| 3.1.2 试剂和仪器 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 噬菌体随机肽库的生物淘选 |
| 3.2.2 特异性噬菌体的扩增和纯化 |
| 3.2.3 噬菌体的滴度测定 |
| 3.2.4 重复筛选 |
| 3.2.5 噬菌体原液的制备 |
| 3.2.6 测序模板的快速纯化 |
| 3.2.7 噬菌体短肽序列的测序分析与表位序列分析 |
| 3.2.8 噬菌体展示模拟表位的鉴定 |
| 3.2.9 多肽的合成及鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BVDV抗原模拟表位的亲和淘选 |
| 3.3.2 噬菌体DNA模板的测序结果分析与抗原表位预测 |
| 3.3.3 噬菌体展示模拟表位的Dot-blot鉴定结果 |
| 3.3.4 多肽与BSA偶联的Westen-blot鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 BVDV模拟表位及其病毒表位免疫小鼠的鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒株和实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 抗原的制备 |
| 4.2.2 多肽与KLH偶联的Dot-blot鉴定 |
| 4.2.3 BVDV病毒的增殖 |
| 4.2.4 动物免疫 |
| 4.2.5 Dot-blot测定小鼠免疫效果 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 多肽与KLH偶联的Dot-blot鉴定结果 |
| 4.3.2 小鼠血清的Dot-blot鉴定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 BVDV病毒表位单克隆抗体的筛选及鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞和实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂、材料 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.1.4 主要试剂的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞融合 |
| 5.2.2 阳性杂交瘤细胞的初次筛选(Dot-blot in well ECL) |
| 5.2.3 阳性杂交瘤细胞的第二、三轮筛选 |
| 5.2.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 5.2.5 单抗腹水的制备 |
| 5.2.6 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 5.2.7 Dot-blot鉴定单克隆抗体11G9D10 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 5.3.2 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 5.3.3 单克隆抗体11G9D10的Dot-blot鉴定结果 |
| 5.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
四、西藏牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离和鉴定（论文参考文献）
- [1]牛病毒性腹泻病毒HB-1株的分离鉴定及间接ELISA检测方法的建立[D]. 王妍瑾. 河北科技师范学院, 2021
- [2]牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立[D]. 拜小强. 西北民族大学, 2021(08)
- [3]新疆南疆地区马鹿感染BVDV流行病学调查[D]. 赵玉宾. 塔里木大学, 2021
- [4]河北部分地区四种肉犊牛腹泻病原调查及BVDV抗体检测方法建立[D]. 刘勃兴. 河北科技师范学院, 2021
- [5]PD-1阻断对BVDV小鼠急性感染模型中T细胞活性的影响[D]. 吴陈华. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [6]云南省牛病毒性腹泻—黏膜病血清流行病学调查[J]. 王丽屏,金显栋,毕峻龙,苏云顺,杨聪,李蛟龙,亐开兴,尹革芬. 中国牛业科学, 2021(01)
- [7]新疆某规模化牧场犊牛IBR、BVD的诊断与防制[D]. 王标. 石河子大学, 2020(05)
- [8]2018～2019年天津地区奶牛BVDV分子流行病学调查及流行毒株的分离鉴定[D]. 徐承倩. 天津农学院, 2020(07)
- [9]延边黄牛病毒性腹泻、蓝舌病、白血病和布鲁氏菌病的流行病学调查[D]. 程佳佳. 黑龙江八一农垦大学, 2020(11)
- [10]牛病毒性腹泻病毒抗原表位的筛选及其单克隆抗体的制备[D]. 陈鑫烨. 扬州大学, 2020