一、白细胞介素Ⅰ在矽肺纤维化过程中的作用（论文文献综述）
李楠楠[1]（2021）在《黄芪甲苷Ⅳ通过PPM1A调控TGF-β1/Smad信号通路减轻矽肺肺损伤和纤维化》文中研究表明研究背景及意义长期暴露性吸入二氧化硅粉尘可引起以肺结节和肺纤维化为主要病理特征的肺部疾病,称为矽肺病,该疾病常表现为进行性加重的呼吸困难及肺功能下降,最终结局呼吸衰竭直致死亡。由于该病的致残、致死率极高,被称为“第二肺癌”。中国拥有最大的矽肺患者人群,近年,由于预防措施仍不完备,发病人数持续上升。在西方发达国家,职业健康机构也被同样的问题所困扰。目前由于矽肺发病的病理生理作用机制仍未被完全阐释,迄今尚未发现对实际治疗有较高价值的药物,所以,矽肺深入具体的作用机制及更实际有效的治疗方案值得进一步探讨。多项研究表明,TGF-β1在相关纤维化疾病中参与细胞增殖、迁移、分化、基质沉积、免疫应答反应、炎症系统调节等反应,为其中重要的调控因子,并在组织的修复和纤维化中发挥关键作用。有大量研究证实TGF-β1对组织纤维化进程的干预通过Smads信号通路的激活而发挥作用,事实上TGF-β1/Smad信号通路被证实参与在机体诸多器官、组织发生纤维化病变的病理生理过程。PPM1A即镁离子依赖的蛋白磷酸酶1A,隶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族,此因子参与真核细胞压力相关细胞内信号通路的调节过程。相关科研实验证实p-Smad2/Smad3可以特异性选择被PPM1A去磷酸化,激活大鼠中p-Smad2/3的高表达,而这个过程将被PPM1A的干预而受到抑制。这也表明PPM1A能够负向调控TGF-β1/Smad信号通路的活性。黄芪甲苷Ⅳ（ASV）是黄芪的主要活性物质之一。在过去的几十年中,ASV通过体外和体内实验证明了其潜在的心脏保护和免疫增强作用。近年来,对ASV药理作用的研究已经得到广泛而深入地开展。研究表明,ASV能够有效治疗脑血管疾病、心肺血管疾患、胰岛功能异常及肝损害等免疫相关损害而引起的多种疾病,且越来越多的证据支持ASV用于治疗器官纤维化、炎症反应、氧化应激和细胞凋亡。我们前期实验亦证实ASV对矽肺肺损伤及纤维化具有保护作用。鉴于以上理论基础,我们认为:PPM1A的低表达使Smad3持续性高磷酸化状态,维持了TGF-β1/Smad信号通路的高水平激活,加速了肺组织纤维化进程;ASV能够有效调控PPM1A的表达水平,抑制Smad3的持续磷酸化,进而延缓矽肺大鼠的肺纤维化。我们将进一步阐明ASV矽肺保护作用的相关机制及可能涉及的信号通路,寻找矽肺治疗中潜在的生物靶向诊断和治疗中的生物标志物及药物作用靶位点,提高矽肺患者生命质量,改善临床预后。第一部分 黄芪甲苷Ⅳ（ASV）对矽肺损伤及纤维化的保护作用目的旨在研究黄芪甲苷Ⅳ对矽肺肺损伤及纤维化的影响。方法1.动物实验部分:非气管暴露法构建矽肺大鼠模型,分为对照组、ASV组、矽肺组和实验组（矽肺+ASV）组,行相关处理后检测各组组织学形态变化（HE及Masson染色）,随后采用RT-PCR、免疫组化方法对纤维化标记物Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白1和α-平滑肌肌动蛋白的表达情况进行检测。2.细胞实验部分:体外SiO2刺激人胚肺成纤维细胞构建矽肺细胞模型。行RT-PCR及Western blot和免疫荧光检测纤维化标记物Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达情况。结果1.HE染色及Masson染色证实矽肺大鼠模型构建成功,经ASV处理后矽肺肺损伤及纤维化减轻。矽肺大鼠模型肺组织中存在Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白1和α-平滑肌肌动蛋白异常高表达;经黄芪甲苷Ⅳ处理后纤维化标记物表达较矽肺组明显减低。2.体外细胞实验亦证实黄芪甲苷Ⅳ可降低纤维化标记物Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达。小结黄芪甲苷Ⅳ（ASV）可缓解矽肺大鼠的肺损伤及纤维化;体内体外实验证实:ASV可减少矽肺纤维化相关蛋白I型胶原（collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（collagenⅢ）、纤维连接蛋白1（FN1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达。第二部分 黄芪甲苷Ⅳ通过调控TGF-β1/Smad信号通路抑制炎症和氧化应激发挥矽肺保护作用目的探索黄芪甲苷Ⅳ矽肺保护作用可能参与的病理生理过程及对经典纤维化通路TGF-β1/Smad信号通路的影响。方法构建矽肺大鼠模型,将实验动物分为对照组、ASV组、矽肺组和实验组（矽肺+ASV）,细胞计数法检测肺泡灌洗液中炎症细胞募集情况,ELISA法检测氧化应激和炎症因子的情况。RT-PCR和Westernblot检测TGF-β1/Smad通路相关因子在各组的表达情况。结果1.矽肺中氧化应激、炎细胞和炎性因子水平明显增高,ASV可降低矽肺大鼠的氧化应激、炎细胞募集和炎性因子水平;2.TGF-β1/Smad通路在矽肺中异常激活,ASV不能降低TGF-β1/Smad信号通路中Smad2、Smad3基因的表达,而是通过影响Smad2、Smad3磷酸化抑制矽肺组织中TGF-β1/Smad通路的活性。小结ASV通过影响Smad2、Smad3的磷酸化阻断矽肺组织TGF-β1/Smad通路,削弱氧化应激与炎症反应。第三部分 黄芪甲苷Ⅳ通过调节PPM1A的表达调控TGF-β1/Smad信号通路目的探讨黄芪甲苷Ⅳ靶向调节PPM1A的表达对TGF-β 1/Smad信号通路的影响。方法Westernblot检测矽肺组织和细胞模型中黄芪甲苷Ⅳ对PPM1A表达的影响。行黄芪甲苷Ⅳ浓度梯度及时间梯度检测明确其对PPM1A的调控作用。构建si-PPM1 A 载体,分为 si-Control 和 si-PPM1 A 组,两组均分为对照、SiO2、SiO2+ASV亚组,检测各亚组内PPM1A的表达、肺纤维化指标以及TGF-β1/Smad信号通路相关因子的蛋白表达情况。结果1.体内体外实验证实:在矽肺中ASV促进PPM1A的表达,同时降低p-Smad2/3的表达。2.体外实验证实:矽肺细胞模型中PPM1A的表达对ASV具有浓度依赖性和时间依赖性。3.PPM1A与p-Smad2/3表达显着负相关。4.PPM1A基因沉默后,黄芪甲苷Ⅳ对Smad2/3磷酸化和下游纤维化因子的抑制作用减弱,表明黄芪甲苷Ⅳ可能通过PPM1A介导调节Smad2/3磷酸化和下游纤维化信号因子。小结黄芪甲苷Ⅳ可能通过PPM1A介导调节Smad2/3磷酸化调控TGF-β1/Smad信号通路发挥矽肺保护作用。结论我们成功在体内外构建矽肺模型,经研究发现黄芪甲苷Ⅳ（ASV）可缓解矽肺大鼠的肺损伤及纤维化;体内体外实验证实ASV可减少矽肺纤维化相关蛋白collagen Ⅰ、collagenⅢ、FN1和α-SMA表达。ASV可降低矽肺大鼠的氧化应激、炎细胞和炎性因子水平。ASV通过影响Smad2、Smad3磷酸化抑制TGF-β1/Smad信号通路发挥抗矽肺纤维化作用。进一步研究发现PPM1A在矽肺中低表达,p-Smad2/3高表达;ASV可促进PPM1A表达,降低p-Smad2/3表达;ASV处理时间及浓度与PPM1A的表达显着正相关;同时p-Smad2/3表达与ASV处理时间及浓度负相关;PPM1A同p-Smad2/3表达之间的负相关联系是非常密切的;而PPM1A表达受到黄芪甲苷Ⅳ的靶向调节,降低Smad2/3磷酸化水平,负向调控TGF-β1/Smads信号通路的传导。黄芪甲苷Ⅳ能够靶向调控PPM1A的表达干扰Smad2/3磷酸化进程,实现对TGF-β1/Smad信号通路的调控,影响炎症反应和氧化应激发挥矽肺保护作用。
宋楠楠[2]（2020）在《基于NLRP3-IL-1β通路抑制的姜黄素治疗肺纤维化的机制探讨》文中提出目的:阐释姜黄素通过阻断肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体活化,下调肺组织IL-1β、IL-18等炎症因子分泌,进而改善矽肺纤维化进展的分子机制。方法:首先构建一次性气管注射SiO2致肺纤维化的小鼠矽肺模型,对药物干预后矽肺纤维化小鼠肺组织中NLRP3炎症小体相关炎症因子IL-1β、IL-18和肺纤维化相关指标TGF-β1、羟脯氨酸含量进行检测,并观察比较各组肺组织纤维化病理变化,探讨姜黄素对矽肺纤维化的干预作用;进一步在SiO2刺激肺泡巨噬细胞模型上应用qRT-PCR、Western-Blot、ELISA、免疫荧光、流式细胞术等实验技术对姜黄素阻断NLRP3炎症小体活化、抑制IL-1β和IL-18分泌的具体分子机制进行了深入研究;最后,通过SPR-MS技术进行了小分子-蛋白垂钓,对姜黄素的潜在分子靶点进行了筛选。结果:（1）姜黄水煎液和姜黄素各剂量,尤其是姜黄素大剂量（400mg/kg/天）、中剂量（200mg/kg/天）干预可有效抑制SiO2刺激诱导的小鼠分泌NLRP3炎性小体相关的炎症因子IL-1β和IL-18,其中假手术对照组检测值分别为77.13±14.94pg/mL和53.7±3.269pg/mL,姜黄素大剂量组检测值分别为 107.6±15.91pg/m 和 80.82±12.69pg/mL,姜黄素中剂量组检测值分别为215.2±17.62pg/mL和243.4±35.27pg/mL。并且检测结果可见,姜黄素下调炎症因子IL-1β和IL-18分泌的药物活性作用呈剂量依赖性。进一步检测发现姜黄素大剂量组（178.5±45.50pg/mL、327.9±38.84μg/g）和中剂量组（262.7±11.58 pg/mL、433.7±39.07μg/g）小鼠肺组织肺纤维化指标TGF-β1、羟脯氨酸含量较假手术对照组（77.3±14.07pg/mL、236.8±24.07μg/g）均显着下降,并且此两组小鼠肺组织病理炎症和纤维化程度均较模型组明显改善。（2）姜黄素在SiO2诱导的巨噬细胞炎症反应模型中对NLRP3炎症小体相关基因的转录水平具有抑制活性,并且能明显下调NF-κB信号通路活化导致的TNF-α分泌,提示其具有抑制NF-κB通路的作用,这与之前的研究报道相符;但姜黄素对NLRP3活化导致的Caspase-1剪切和IL-1β、IL-18分泌具有较NF-κB通路抑制剂TPCA-1更显着的抑制作用,提示姜黄素除通过NF-κB通路抑制NLRP3相关基因转录外,还能通过其他未知途径对NLRP3炎性小体活化发挥直接抑制作用。（3）姜黄素干预可有效逆转SiO2刺激诱导的肺泡巨噬细胞溶酶体损伤和细胞酸化;还通过改变受刺激细胞线粒体转运功能阻止线粒体向核周转位和聚集,进而阻断NLRP3炎性复合物的组装活化;进一步检测线粒体膜电位发现,姜黄素能改善受刺激细胞的线粒体膜电位稳定性,提示姜黄素阻止线粒体转位聚集的功能可能与改善线粒体膜电位稳定性有关。（4）采用SPR-MS技术,筛选得到63个姜黄素候选靶点蛋白,其中线粒体功能相关功能蛋白7个,功能酶类蛋白19个。随后对筛选得到的可疑候选蛋白进行了蛋白质结构功能初步分析,为下一步明确鉴定姜黄素的靶点蛋白奠定了基础。结论:（1）姜黄素干预用药可显着降低染矽尘小鼠肺组织炎症因子IL-1β、IL-18和纤维化指标TGF-β1、羟脯氨酸含量,进而改善小鼠肺纤维化病变。（2）姜黄素可通过直接阻断NLRP3炎性小体的活化、组装及下游分子剪切,发挥阻断NLRP3炎性小体活化的作用。（3）姜黄素直接阻断NLRP3炎症小体活化的作用机制一方面与阻止溶酶体破坏、避免细胞酸化对NLRP3炎症小体的激活作用有关;另一方面通过稳定线粒体膜电位,阻止线粒体功能障碍导致的线粒体重分布和聚集,阻断了 NLRP3炎性小体蛋白复合体的组装。（4）通过分子垂钓筛选得到了姜黄素潜在的细胞内靶点候选蛋白信息,为下一步鉴定和验证姜黄素作用靶点、从分子水平上揭示姜黄素药理作用机制提供了研究基础。
冯菲菲[3]（2020）在《丹参酮IIA对矽肺肺损伤及纤维化的保护作用及机制研究》文中提出研究背景目前,职业性尘肺病依然是我国最为严重的职业病,而矽肺是尘肺中最常见的类型。矽肺由长久暴露于含大量游离二氧化硅的粉尘所引起,以肺脏弥漫性结节性纤维化为特征,并呈进行性发展,最终严重损害肺功能,导致呼吸衰竭甚至死亡。近年来,由于工业化进程的发展,矽肺的发病率和流行率一直在上升,特别是在发展中国家。中国拥有最大的矽肺患者人群,每年全国因矽肺病导致的直接经济损失达80多亿,间接损失难以计数。在发达国家,矽肺同样也是一个备受瞩目的职业健康问题。但矽肺的发病机制目前尚不明确,且缺乏有效的治疗措施,因此,研究和探索矽肺的发病机制及新的防治方法十分必要。矽肺的发病与进展是一个多因素的复杂过程,其中包括二氧化硅引起的持续性肺部炎症和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积,最终导致正常肺组织结构的不可逆性破坏和肺纤维化。既往研究已经发现了许多矽肺的重要致病机制,其中氧化应激是调节多种生物过程和信号转导途径的重要分子机制。当机体吸入二氧化硅颗粒时,它们被肺泡巨噬细胞吞噬并持续存在,通过活性氧（reactive oxygen species,ROS）和活性氮的形成引起氧化应激反应。氧化应激可导致上皮细胞表型异常,包括激发细胞因子产生、促进上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）和诱导上皮细胞凋亡,导致成纤维细胞的增殖和ECM在肺组织中的过度沉积,并进一步诱导细胞毒性、氧化应激和肺部炎症,最终导致矽肺的发生。在此过程中,许多细胞因子成分参与了对肺纤维化的正向或负向的调节,其中转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是强有力的致纤维化的关键细胞因子。TGF-β1主要通过经典的TGF-β1/Smad信号途径对纤维化疾病中的细胞增殖、分化、迁移、免疫调节及ECM转变过程具有重要的调控功能。大量研究表明TGF-β1/Smad信号通路的失调是组织纤维化的重要致病机制,其作为一种有效的抗纤维化治疗靶点受到了越来越多的关注,因此,抑制TGF-β1/Smad信号通路可能是缓解矽肺肺纤维化的一种治疗策略。为了保持适当的氧化还原平衡,我们的机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统,包括一系列内源性抗氧化酶。肺损伤可同时导致TGF-β1和氧化应激水平的升高。越来越多的证据表明,ROS和氧化应激的产生与许多细胞因子和促纤维化生长因子的产生和激活有关。TGF-β1/Smad信号通路的激活是纤维化形成的主要驱动力,而氧化应激是与TGF-β1的促纤维化活性有关的重要有害促进因素。在整个纤维化过程中,TGF-β1与氧化应激信号之间有明显的相关性。TGF-β1可提高肺组织的ROS水平,ROS反过来刺激TGF-β1相关的成纤维细胞活化和肌成纤维细胞分化。研究发现与TGF-β1相关的纤维化事件与活性氧清除酶的降低和/或ROS产生酶的诱导生成增加有关。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶（NADPH oxidases,NOX）是内源性ROS产生的主要来源。其中NOX4具有独特的组成活性,作为细胞外ROS产生的主要酶源,NOX4衍生的ROS已被公认为氧化应激的主要来源。NOX4作为TGF-β1诱导的促纤维化反应的下游介质,诱导ROS的形成,并通过调节TGF-β1诱导的成纤维细胞活化、肌成纤维细胞分化参与了纤维化的发病机制。研究表明NOX4在纤维化疾病中上调,对肝、肾、肺和心脏纤维化的发病机制有重要贡献。NOX4被认为是肺纤维化与TGF-β1信号传导增强相关的潜在治疗靶点。核因子-红系 2 相关因子-2（nuclear factor erythroid 2-related factor-2,Nrf2）是一个重要的氧化还原敏感转录因子,参与宿主防御氧化应激。Nrf2在静止时与其抑制剂胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1）结合,在组织损伤介导的ROS或亲电刺激下从Keap1释放,进入细胞核,激活抗氧化反应原件（antioxidantresponse element,ARE）,诱导下游抗氧化剂和解毒酶的表达,包括血红素加氧酶-1（Hemeoxygenase-1,HO-1）和NADPH 醌氧化还原酶（NADPH quinone oxidoreductase,NQO-1）等,是维持细胞氧化还原稳态的必需因素。研究证明Nrf2参与了纤维化形成的动态过程,并似乎是组织纤维化的负调节因子。Nrf2不仅平衡氧化应激,而且对TGF-β1介导的纤维化促进信号转导有负调节作用。研究证明Nrf2似乎可发挥细胞自主抗纤维化的作用。在持续性的器官纤维化中,Nrf2激活受损,从而改变了 NOX4-Nrf2氧化还原平衡和导致肌成纤维细胞获得抗凋亡表型。Nrf2作为多种抗氧化、抗炎和抗纤维化通路的主调节器的证据使其具有作为治疗目标的潜在价值,Nrf2信号的激活可减轻肺损伤和肺纤维化的进展,提示靶向Nrf2/ARE信号通路的策略具有抗矽肺肺纤维化的潜能。天然产物在药物的研发中起着非常重要的作用。丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA,Tan ⅡA）是中药丹参中最重要的有效活性成分,具有良好的生物利用度和多种药理效用,其在多种器官中被报道具有抗炎、抗氧化、抗纤维化等特性。然而,对丹参酮ⅡA治疗矽肺的疗效研究甚少,丹参酮ⅡA是否具有对矽肺的治疗作用,以及其分子作用机制仍然未知。它是否可以有效缓解矽肺的肺损伤及肺纤维化呢?研究目的1.研究丹参酮ⅡA腹腔注射对矽肺大鼠模型的治疗作用,从肺组织病理学、气道炎症细胞募集、肺组织炎症因子含量等方面观察丹参酮ⅡA对矽肺的保护和治疗作用。2.体内实验研究丹参酮ⅡA是否可抑制矽肺大鼠的TGF-β1/Smad信号通路;体外实验研究丹参酮ⅡA是否可抑制二氧化硅诱导的A549及HBE细胞的上皮间充质转化（EMT）及TGF-β1/Smad信号通路的激活,从而减轻二氧化硅诱导的肺纤维化。3.体内及体外实验探讨丹参酮ⅡA是否能减轻二氧化硅导致的氧化应激,并通过抑制NOX4表达、激活Nrf2/ARE抗氧化应激信号通路来发挥对二氧化硅诱导的肺损伤及纤维化的保护作用。实验方法1.体内实验1.1动物造模及给药处理1)48只SD大鼠（年龄6～8周,体重200±20g）随机分为四组（每组12只）:ⅰ)对照组;ⅱ)丹参酮ⅡA组;ⅲ)矽肺组;ⅳ)矽肺+丹参酮ⅢA组。气管插管法建立矽肺大鼠模型:SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后,矽肺组及矽肺+丹参酮ⅡA组大鼠气管内置入硬膜外麻醉导管,然后将1 ml二氧化硅粉尘悬浮液（50mg/ml）及0.25ml空气灌入气管。之后,立即旋转大鼠,使注射液均匀地分布在肺部。对照组及丹参酮ⅡA组气管插管法灌入等量生理盐水及空气。2)造模2天后,给予丹参酮ⅡA组和矽肺+丹参酮ⅡA组大鼠每日腹腔注射25 mg/kg体重的丹参酮ⅡA共40天,对照组和矽肺组大鼠同时每日腹腔注射等量无菌生理盐水。造模42天后,4组大鼠均收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,后麻醉处死获取肺组织。1.2观察丹参酮ⅡA对矽肺大鼠的治疗作用1)测量各组大鼠肺组织的湿/干重比。2)取各组大鼠肺组织石蜡包埋切片行H&E染色和Masson染色。3)免疫组织化学染色及RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）、纤维连接蛋白1（FN1）及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。4)Giemsa染色法计数各组大鼠BALF中的总细胞数及中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的数量。5)ELISA试剂盒测定各组大鼠肺组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）和白介素1β（IL-1β）的含量。1.3检测各组大鼠肺组织内氧化应激水平采用活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒检测各组大鼠肺组织内氧化应激水平。1.4 TGF-β1/Smad信号通路关键因子测定1)采用定量RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中Tgfb1及其下游Smad2、Smad3和Smad7的mRNA表达水平;2)采用 Western Blot 法检测肺组织中 TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、p-Smad3、Smad3及Smad7的蛋白表达水平。1.5 NOX4及Nrf2/ARE信号通路关键因子的测定1)采用定量RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中Nox4、Nrf2、Keap1及其下游Ho1、Nqo1的mRNA表达水平;2)采用Western Blot法定量检测各组大鼠肺组织中NOX4、细胞质Nrf2、细胞核Nrf2、Keap1及其下游HO-1、NQO-1的蛋白表达水平。2.体外实验2.1二氧化硅（Si02）及丹参酮ⅡA处理浓度筛选体外培养A549及HBE细胞,接种于96孔板,应用CCK-8试剂盒测定不同浓度二氧化硅及丹参酮ⅡA对A549和HBE细胞活力的影响。将细胞分别用不同浓度的 Si02（0、25、50、100、200、400、800μg/ml）或丹参酮 ⅡA（0、2.5、5、10、20、40、80μM）处理24h。CCK-8试剂盒检测细胞活性。筛选适当的Si02及丹参酮ⅡA处理浓度用于后续实验。2.2细胞分组及处理体外培养A549及HBE细胞,更换无血清培养基后,将A549细胞和HBE细胞分为以下几组:1)空白对照组;2)Si02组:单独Si02（100 μg/ml）处理细胞24 h;3)Si02+丹参酮ⅡA组:Si02（100μg/ml）联合不同剂量的丹参酮ⅡA（5、10 或 20μM）处理细胞 24 h。2.3 EMT标志物及TGF-β1/Smad信号通路关键因子测定1)采用 Western Blot 法检测各组细胞中 E-cadherin、Vimentin、FN1、CollagenⅠ和α-SMA的蛋白表达水平。2)采用 Western Blot 法检测各组细胞中 TGF-β1、p-Smad3、Smad3 及 Smad7 的蛋白表达水平。3)采用细胞免疫荧光法检测各组细胞中TGF-β1的表达水平。2.4检测各组细胞中的ROS水平应用ROS检测试剂盒检测各组细胞中的ROS水平。2.5 NOX4及Nrf2/ARE信号通路关键因子的测定1)采用 Western Blot 法检测各组细胞中 NOX4、Nrf2、Keap1、HO-1 及 NQO-1的蛋白表达水平。2)采用细胞免疫荧光法检测各组细胞中Nrf2的表达水平。3.统计学分析应用IBM SPSS Statistics 19.0统计学软件进行数据处理,计量资料若符合正态分布以平均值±标准差（Mean±SD）表示,组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或Kruskal-Wallis非参数检验,组间两两比较采用LSD法或Dunn-Bonferroni法。P<0.05为差异有统计学意义。实验结果1.丹参酮ⅡA对矽肺大鼠的治疗作用1.1丹参酮ⅡA可缓解矽肺大鼠的肺损伤及纤维化矽肺组大鼠的肺湿/干重比较对照组显着增加,经丹参酮ⅡA治疗后显着下降。对各组大鼠肺组织进行组织病理染色,H&E染色显示矽肺组大鼠肺组织失去正常肺泡结构,肺泡壁增厚,伴有大量炎性细胞浸润,并在支气管树和血管床周围形成特征性的矽肺结节,表现为弥漫性肺纤维化,而经丹参酮ⅡA治疗后这些破坏作用得到缓解。Masson染色结果提示丹参酮ⅡA治疗能显着降低矽肺大鼠肺组织中的胶原沉积。免疫组织化学染色及RT-PCR检测显示丹参酮ⅡA治疗能显着降低矽肺大鼠肺组织中的Collagen Ⅰ、FN1及α-SMA的表达水平。以上结果表明丹参酮ⅡA治疗可减轻矽肺大鼠的肺损伤及纤维化。1.2丹参酮ⅡA可降低矽肺大鼠的炎症水平与对照组相比,矽肺组大鼠肺泡灌洗液中的总细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞数量均显着增加,而经丹参酮ⅡA治疗后显着减少;矽肺组大鼠肺组织中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平较对照组显着增加,而经丹参酮ⅡA治疗后显着下降。2.丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的EMT及TGF-β1/Smad信号通路的激活2.1丹参酮ⅡA可抑制矽肺大鼠TGF-β1/Smad信号通路的激活通过RT-PCR和Western Blot分析,我们测定了 TGF-β1及其下游信号通路Smad2、Smad3和Smad7的活性。结果显示,矽肺大鼠肺组织的TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平均显着升高,而经丹参酮ⅡA治疗后显着下降;矽肺大鼠肺组织的Smad2和Smad3的mRNA和蛋白水平均无显着改变,而p-Smad3和p-Smad2/3的蛋白表达水平显着升高,而经丹参酮ⅡA治疗后显着下降;作为TGF-β1/Smad通路的负调控因子,Smad7的mRNA和蛋白表达水平在矽肺大鼠肺组织中显着下调,而经丹参酮ⅡA治疗后显着上调。上述结果表明丹参酮ⅡA对TGF-β1/Smad信号通路的抑制作用与其对矽肺肺纤维化的保护作用有关。2.2丹参酮ⅡA抑制二氧化硅诱导的A549和HBE细胞的上皮间质转化（EMT）及TGF-β1/Smad信号通路的激活2.2.1丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的A549及HBE细胞的EMT我们用Western Blot检测丹参酮ⅡA对二氧化硅（Si02）诱导的A549和HBE细胞的EMT的抑制作用。结果显示:用Si02（100μg/ml）处理A549和HBE细胞24 h后,其上皮标志物E-cadherin表达下调,间充质标志物Vimentin、FN1、Collagen Ⅰ和α-SMA的表达均上调。而丹参酮ⅡA共处理可上调两种细胞中E-cadherin的表达,下调Vimentin、FN1、CollagenⅠ和α-SMA的表达,并呈剂量依赖性。这些结果表明丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的A549和HBE细胞的EMT。2.2.2丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的A549及HBE细胞的TGF-β1/Smad信号通路的激活我们用Western Blot检测丹参酮ⅡA对二氧化硅（Si02）诱导的A549和HBE细胞的TGF-β1/Smad信号通路激活的抑制作用。结果显示:Si02（100 μg/ml）处理24 h后,A549和HBE细胞的TGF-β1及其下游p-Smad3表达显着上调,同时Smad7表达显着下调,而Smad3表达无显着变化,表明SiO2刺激对A549和HBE细胞中TGF-β1/Smad信号通路具有激活作用。而丹参酮ⅡA共处理可显着下调TGF-β1和p-Smad3的表达,上调Smad7的表达,并呈剂量依赖性。细胞免疫荧光分析也证实了丹参酮ⅡA对Si02诱导的A549和HBE细胞中TGF-β1表达的抑制作用。以上结果表明,丹参酮ⅡA在体外部分通过抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活抑制二氧化硅诱导的肺纤维化。3.丹参酮ⅡA可减轻二氧化硅诱导的氧化应激,抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路3.1丹参酮ⅡA可减轻矽肺大鼠的氧化应激,抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路我们采用活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒检测各组大鼠肺组织内氧化应激水平,结果可见矽肺组大鼠的ROS和MDA含量升高,伴随着SOD和GSH-Px活性的下降,而矽肺+丹参酮ⅡA治疗组大鼠的ROS和MDA含量相对于矽肺组大鼠下降,SOD和GSH-Px活性上升。以上结果表明丹参酮ⅡA具有减轻矽肺大鼠氧化应激的作用。我们通过RT-PCR和Western Blot检测丹参酮ⅡA是否可抑制NOX4的表达,并激活矽肺大鼠的Nrf2/ARE信号通路,从而对矽肺大鼠的氧化应激损伤起保护作用。结果显示矽肺组大鼠肺组织中NOX4的mRNA及蛋白表达水平显着升高,经丹参酮ⅡA治疗后其mRNA及蛋白表达水平均显着下降。矽肺组Nrf2及其下游HO-1和NQO-1的mRNA水平显着升高,经丹参酮ⅡA治疗后进一步上调。由于Nrf2核移位是Nrf2活化的必要步骤,因此我们分别评估了 Nrf2在细胞核内和细胞质中的表达,结果显示:矽肺组细胞核Nrf2蛋白表达上调,而胞质Nrf2蛋白表达降低,经丹参酮ⅡA治疗后这些作用进一步增强。与Nrf2一致,其下游蛋白HO-1和NQO-1的蛋白表达水平在矽肺组也显着上调,而丹参酮ⅡA治疗后这两种蛋白的表达水平进一步上调。与Nrf2相反,其抑制剂Keap1的mRNA和蛋白表达水平在矽肺组下调,而丹参酮ⅡA治疗进一步下调了 Keap1的表达。以上结果表明,丹参酮ⅡA部分通过抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路,来对矽肺的氧化应激损伤起保护作用。3.2丹参酮ⅡA减轻二氧化硅诱导的A549和HBE细胞的氧化应激,抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路我们采用活性氧（ROS）检测试剂盒检测丹参酮ⅡA对二氧化硅（Si02）诱导的A549和HBE细胞的氧化应激的抑制作用。用SiO2（100μg/ml）处理A549和HBE细胞24 h后,采用DCFH-DA检测ROS显示,A549细胞和HBE细胞的绿色荧光强度显着增强,而与丹参酮ⅡA共处理组绿色荧光强度显着下降。为了进一步阐明丹参酮ⅡA的抗氧化机制,我们用Western Blot检测了 A549和HBE细胞中NOX4的表达及Nrf2/ARE信号通路的活性。结果显示,Si02刺激导致细胞中NOX4蛋白表达增加,而丹参酮ⅡA共处理抑制了 NOX4蛋白的表达。Si02刺激导致细胞中Nrf2蛋白表达增加,而丹参酮ⅡA共处理进一步增加了 Nrf2蛋白的表达。细胞免疫荧光分析显示丹参酮ⅡA可增加Nrf2的表达并促进其在A549和HBE细胞中的核内聚集。相应的,SiO2刺激导致Nrf2下游HO-1和NQO-1的蛋白表达水平上调,丹参酮ⅡA共处理可进一步上调其表达。与Nrf2相反,其抑制剂Keap1的蛋白表达水平在SiO2组下调,而丹参酮ⅡA共处理进一步下调其表达。这些数据表明,丹参酮ⅡA在体外部分通过抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路来减轻二氧化硅诱导的氧化应激。结论1.丹参酮ⅡA可有效缓解矽肺大鼠的肺组织结构破坏及纤维化,并减轻矽肺大鼠的肺部炎症反应。2.丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的上皮间充质转化（EMT）及TGF-β1/Smad致纤维化信号通路的激活。3.丹参酮ⅡA可通过抑制NOX4的表达、激活Nrf2/ARE信号通路来减轻二氧化硅诱导的氧化应激,从而发挥对矽肺的保护作用。意义在本研究中,我们应用矽肺大鼠模型和体外细胞实验,明确了中药单体丹参酮ⅡA对矽肺的抗炎、抗氧化及抗纤维化的保护作用,并进一步探讨了其分子效用机制,证明了丹参酮ⅡA可通过抑制二氧化硅诱导的上皮间充质转化（EMT）及TGF-β1/Smad信号通路的激活来减轻矽肺肺纤维化,并通过抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路来减轻二氧化硅诱导的氧化应激,从而发挥对矽肺肺损伤及纤维化的保护和治疗作用。本研究表明丹参酮ⅡA可作为矽肺治疗的潜在药物,为矽肺防治提供了理论支持,并为新药的研发提供了理论基础。
徐秋敏[4]（2020）在《PPARγ-LXR-ABCA1信号通路对矽肺巨噬细胞泡沫化作用的研究》文中提出目的探讨PPARγ-LXR-ABCA1在游离SiO2诱导的U937细胞泡沫化中的作用及机制。方法第一阶段实验,将处于对数生长期的人淋巴组织瘤细胞（U937细胞）,使用100 ng/mL的豆蔻酸佛波醇乙酸酯（PMA）经过48小时诱导分化为U937源性巨噬细胞,实验分为5个组:空白对照组,细胞不进行任何的处理;25μg/mL SiO2组,给予25μg/mL SiO2组的培养基含终浓度为25μg/mL的SiO2培养基;50μg/mL SiO2组,给予50μg/mL SiO2组的培养基含终浓度为50μg/mL的SiO2培养基;100μg/mL SiO2组,给予100μg/mL SiO2组的培养基含终浓度为100μg/mL的SiO2培养基;200μg/mL SiO2组,给予200μg/mL SiO2组的培养基含终浓度为200μg/mL的SiO2培养基,培养24、48小时后,通过蛋白质印迹法检测细胞中LXR、ABCA1表达的情况。第二阶段实验,建立巨噬细胞泡沫化模型,分为4个实验组:空白对照组不给予任何的处理,SiO2组给予终浓度为50 mg/L的SiO2悬液,ox-LDL组给予终浓度为50 mg/L的ox-LDL的悬液,50 mg/L SiO2和ox-LDL的混悬液组给予终浓度50 mg/L的SiO2和ox-LDL的混悬液,培养48 h后,油红O染色法和胆固醇试剂盒观察肺泡巨噬细胞脂质蓄积情况;蛋白质印迹法检测细胞中LXR、ABCA1的表达情况。第三阶段实验,采用同样的方法建立泡沫细胞模型,用基因沉默的方式使LXR、ABCA1低表达,设立组别为对照组（NC组）,SiLXR组（沉默LXR）,阴性对照组（NC+50 mg/L SiO2和ox-LDL的混悬液）,SiLXR实验组（SiLXR+NC+50 mg/L SiO2和ox-LDL的混悬液）,对于ABCA1同样设立为这四个组对照组（NC组）、SiABCA1组（沉默ABCA1）、阴性对照组（NC+50 mg/L SiO2和ox-LDL的混悬液）、SiABCA1实验组（SiABCA1+NC+50mg/L SiO2和ox-LDL的混悬液）,培养48 h,采用第二阶段的实验方法检测LXR、ABCA1表达变化及泡沫化情况。第四阶段实验,采用激动剂的方法,使LXR过表达,设立组别为对照组（DMSO组）,T0901317组（激动组）,模型组（DMSO+50 mg/L SiO2和ox-LDL的混悬液）,实验组（T0901317+50 mg/L SiO2和ox-LDL的混悬液）,每个组培养48 h。使用与第二阶段相同的检测方法观察细胞泡沫化情况以及LXR、ABCA1的表达情况。结果1蛋白印迹结果显示:与对照组比较,SiO2质量浓度为50μg/mL且刺激48h时,LXR、ABCA1的表达最高（P<0.01）。2油红O染色结果显示,与空白对照组相比,50 mg/L SiO2和ox-LDL混悬液组泡沫样变显着。3与空白对照组比较,ox-LDL对照组、50 mg/L SiO2和ox-LDL混悬液组细胞内TC、FC表达水平均升高（P<0.01）,且CE比重增加（P<0.01）。4巨噬细胞LXR沉默后,与NC组相比,细胞中LXR的表达降低（P<0.01）;实验组（SiLXR+NC+50 mg/L SiO2和ox-LDL混悬液）脂滴明显增加,与阴性对照组（NC+50 mg/L SiO2和oxLDL混悬液）相比,实验组细胞内TC、FC表达水平均升高（P<0.01）且CE比重增加（P<0.01）。巨噬细胞ABCA1沉默后,与NC组相比,细胞中ABCA1的表达降低（P<0.01）;实验组（SiABCA1+NC+50 mg/L SiO2和ox-LDL混悬液）脂滴明显增加,与阴性对照组（NC+50 mg/L SiO2和ox-LDL的混悬液）相比,实验组细胞内TC、FC表达水平均升高（P<0.01）且CE比重增加（P<0.01）。5激动LXR后,与对照组（DMSO组）相比,细胞内LXR表达明显增加（P<0.01）,油红O染色结果显示,实验组（T0901317+50 mg/L SiO2和ox-LDL混悬液）细胞橘红色脂滴明显减少;与模型组相比,实验组细胞内TC、FC表达水平均降低（P<0.01）且CE比重减少（P<0.01）。结论1 LXR、ABCA1在巨噬细胞泡沫化过程中的表达发生变化。2 LXR、ABCA1参与巨噬细胞泡沫化过程且发挥一定的作用。3 PPARγ-LXR-ABCA1参与调控矽肺巨噬细胞泡沫化。图20幅;表19个;参130篇。
李丹[5]（2020）在《Ac-SDKP对巨噬细胞活化的调控在抑制矽肺纤维化中的作用》文中研究表明目的研究N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysylproline,Ac-SDKP）对巨噬细胞活化的调控在矽肺纤维化中的作用。方法1采用HPOE-ED8050动式染尘系统构建矽肺大鼠模型。SPF级Wistar雄性大鼠70只,每组10只,随机进行实验分组。1)观察矽肺纤维化发生过程中巨噬细胞的活化情况。实验分为（1）对照4周、16周组:常规喂养至4周（Control 4 w,C4W）、16周（Control 16 w,C16W）处死动物;（2）染尘4周、16周组:分别染尘至4周（Sicosis 4 w,S4W）、16周（Sicosis 16 w,S16W）处死动物;2)探讨AcSDKP对巨噬细胞活化的调控作用。实验分为（1）对照组:常规喂养至16周,腹腔内埋入含有生理盐水的微量缓释胶囊,喂养至24周处死（Control 24 w,C24w）;（2）染尘组:染尘至16周时,腹腔内埋入含有生理盐水的微量缓释胶囊,喂养至24周处死（Sicosis 24 w,S24）;（3）Ac-SDKP干预组:染尘至16周时,在大鼠腹腔内埋入含有Ac-SDKP（800μg/kg/d）的微量缓释胶囊,喂养至24周处死（Ac-SDKP intervention,Ac-SDKP）。2培养小鼠源性细胞系小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7细胞）。采用二氧化硅（silicon dioxide,Si O2）诱导RAW264.7细胞,实验分组为（1）对照组（Control）;（2）Si O2诱导组（Si O2）;（3）Ac-SDKP处理组（AcSDKP+Si O2）。采用免疫组织化学染色法、免疫荧光法检测煤矽肺患者肺组织和大鼠矽肺模型肺组织中I型巨噬细胞标记物（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、Ⅱ型巨噬细胞标记物（Arginase-1,Arg-1）的定位。Western blot法检测I型胶原（collagen type I,COLI）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、iNOS、Arg-1、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）蛋白在大鼠肺组织与RAW264.7细胞中的表达变化。结果1人体煤矽肺尸检标本观察显示,煤矽肺发生发展有一个动态演变的过程,即巨噬细胞性肺泡炎、细胞性矽结节、细胞纤维性矽结节和纤维性矽结节。免疫组织化学染色结果显示,在人体煤矽肺组织标本的细胞性和细胞纤维性矽结节内,有大量煤尘沉积,分别可见CD68、Arg-1标记的阳性细胞分布与表达,iNOS阳性表达缺如。2大鼠肺组织标本对照组中偶见iNOS、Arg-1阳性细胞表达,染尘4周组的大鼠肺组织中可见较多iNOS阳性细胞表达,和较少量Arg-1阳性细胞表达,染尘16周组的大鼠肺组织的矽结节内可见较多Arg-1阳性细胞表达,少量iNOS阳性细胞表达,在结节周围肺泡腔内可见iNOS阳性细胞分布与表达;3免疫荧光结果显示,矽肺模型4周组有较多iNOS标记阳性的巨噬细胞表达,而染尘16周组肺组织中有较多Arg-1阳性标记的巨噬细胞表达;Western blot结果显示,与相应对照组比较,染尘4周组、染尘16周组大鼠肺组织中iNOS、Arg-1蛋白表达均上调;其中染尘16周组iNOS表达较染尘4周组有所下降,染尘16周组Arg-1表达较染尘4周组有所上升。4与染尘24周组比较,给予Ac-SDKP干预后MCP-1、iNOS、Arg-1、α-SMA和COLI表达均下调,差异有统计学意义（P<0.05）。5与对照组比较,Si O2诱导RAW264.7细胞MCP-1、iNOS和Arg-1表达水平上调;与Si O2诱导组比较,Ac-SDKP干预组MCP-1、iNOS和Arg-1表达水平均下调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1矽肺纤维化的形成伴随有巨噬细胞活化和不同表型的改变。2 Ac-SDKP可能通过对巨噬细胞活化的调控,发挥其抑制矽肺纤维化的作用。图10幅;表5个;参151篇。
吴丽娟[6]（2020）在《大黄?虫丸基于TGF-β1/Smad信号通路抑制矽肺纤维化的作用机制研究》文中研究表明研究目的矽肺是世界范围内最主要的职业病,尽管各国不断在改进预防矽肺的方法,但无论在发达国家还是在中低收入国家,每年仍然有大量的新发病例。二氧化硅（Si O2）在肺组织中的沉积是矽肺的主要致病原因。Si O2进入肺部后所引起的肺纤维化病变是不可逆的,患者因此而导致肺功能逐渐下降乃至衰竭。迄今国内外均没有针对矽肺纤维化特殊的治疗药物和措施。因此,研究矽肺的发病机制,进行中医药的相关探索,为治疗矽肺另辟蹊径非常重要。大黄?虫丸是《金匮要略》中的经典名方,我们的前期预实验表明,它对于小鼠矽肺纤维化有改善作用。本研究通过动物实验和细胞实验,由TGF-β1/Smad信号通路入手,从整体、细胞和分子水平揭示大黄?虫丸治疗矽肺纤维化的作用机制。研究方法第一部分:小鼠矽肺纤维化模型造模方案的确定将80只SPF级昆明种小鼠随机分为正常对照组、暴露气管注射组、气管插管组、鼻腔滴入组和静式染毒组,共5组,每组16只,其中正常对照组不做任何干预。第1-4组一次性造模后第40天,第5组连续造模40天,比较各组小鼠体重、肺脏系数、存活率、肺组织病理情况,综合确定实验造模方案。第二部分:大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠的作用机制研究小鼠共108只,其中90只用静式染毒法造模40天后随机分成模型对照组、汉防己甲素组、大黄?虫丸高、中、低剂量组5组,每组18只。不染毒小鼠18只为正常对照组。低、中、高剂量组按照临床大黄?虫丸成人等效剂量的1倍、1.5倍和3倍剂量灌胃给药,一日一次。汉防己甲素按照临床成人等效剂量一天一次灌胃给药;正常对照组和模型对照组每次灌胃等量生理盐水。分别在给药后14、21、28天每组各处死6只小鼠,计算肺脏系数,取血清检测TNF-α、IL-6、IL-1β、HYP的含量,并用HE、Masson染色观察病理改变,用Western-Blot法检测大黄?虫丸对TGF-β1/Smad通路相关蛋白（TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7）表达的影响,用RT-PCR法检测大黄?虫丸对TGF-β1/Smad通路相关基因（TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA、Smad7m RNA）表达的影响。第三部分:大黄?虫丸对Si O2诱导的矽肺纤维化体外细胞模型作用机制研究用Si O2诱导MH-S细胞构建矽肺纤维化细胞模型,提取大黄?虫丸大鼠含药血清,采用串联质谱法检测血清中主要药理成分,再用不同浓度的含药血清干预,观察细胞形态,用CCK8法检测细胞活性、Elisa法检测细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量、Western-Blot法检测含药血清对TGF-β1/Smad通路相关蛋白（TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7）表达的影响,通过免疫荧光染色法观察以上蛋白的表达。研究结果第一部分:将静式染毒法作为本实验的造模方法1 各组一般情况正常对照组一般情况正常。各造模组小鼠后期体重增长缓慢,明显低于正常对照组,皮毛稀疏缺乏光泽,污秽粘连。静式染毒组小鼠时有挠鼻现象,可见鼻尖、嘴唇暗紫。2各组存活率及肺脏系数比较正常对照组为100%,暴露气管注射组为62.5%、气管插管组为87.5%,鼻腔滴入组为93.8%,静式染毒组为100%,静式染毒组明显高于其余三组。各模型组小鼠肺脏系数与正常组相比,均具有显着性差异（P<0.01）。3各组肺组织病理结果肺组织HE染色结果:正常对照组肺泡结构正常。各造模组均可见部分肺泡腔萎陷,局部肺泡上皮细胞变性坏死,胞核固缩。其中,暴露气管注射组、气管插管组及静式染毒组肺间质不同程度的增厚,伴纤维组织增生和新生上皮细胞增生,炎细胞浸润,主要为圆形深染的淋巴细胞。Masson染色结果显示,正常对照组肺组织形态无明显改变。四个模型组小鼠肺泡结构破坏,肺泡间隔增宽,肺野内见大量密集的弥漫性蓝色胶原纤维增生,呈片状或束状分布。4本部分实验结论综上,暴露气管注射法、气管插管法、静式染毒法三种方式皆可以成功复制小鼠矽肺弥漫性纤维化模型,鼻腔滴入法相对成功率低,这可能是因为小鼠经鼻滴最终进入食道而未进入呼吸道所致。综合造模方法和真实疾病形成的拟合程度、成功率、存活率等相关因素,实验选取静式染毒法作为造模方法。第二部分:大黄?虫丸能够通过调控TGF-β1/Smad通路抑制小鼠矽肺模型的肺纤维化进程1大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠一般情况的影响结果造模期间,正常组小鼠一般情况状态良好。模型组小鼠精神逐渐萎靡,时有挠鼻现象,活动减少,体重增加不明显,皮毛稀疏缺乏光泽,污秽粘连,鼻尖、嘴唇较正常组偏暗,部分尾部可见散在紫色血丝。给药后大黄?虫丸高剂量组精神状态良好,接近正常组,中剂量组与模型组相比情况有改善,低剂量组总体情况不如高、中组,但优于模型组。2 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠肺脏系数的影响结果肺脏系数:模型组显着高于正常组（P<0.01）;在给药14天后,可见大黄?虫丸高剂量组低于模型组,有统计学意义（P<0.05）;给药21天后,大黄?虫丸高、中剂量组显着低于模型组（P<0.01）。28天后,高、中、低组均显着低于模型组（P<0.01）。3 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠肺组织病理染色的影响结果肺组织病理结果:HE染色:正常对照组肺泡形态结构正常;模型组组织充血,肺泡的萎陷、融合,上皮细胞变性坏死,胞核固缩。不同程度的肺泡间隔增厚,纤维组织增生或上皮细胞增生;以及局部淋巴细胞浸润。大黄?虫丸高剂量组肺组织形态结构改善明显,最接近正常组。Masson染色:正常对照组未见明显的蓝染胶原沉积;模型组可见弥漫性蓝染的胶原纤维,肺泡壁厚薄不一;大黄?虫丸治疗后,不同程度地减少了肺组织中胶原纤维沉积,其中以大黄?虫丸高剂量（1.170 g/kg）改变最为明显,蓝染颜色明显变浅,面积也明显减少。两种染色方法都说明大黄?虫丸高剂量组对肺组织炎症和纤维化有明显的改善作用。4 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠细胞因子的影响结果模型组小鼠血清中HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显着高于正常组（P<0.01）。14天时,大黄?虫丸高、中剂量组HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β显着低于模型组（P<0.01）,低剂量组TNF-α、IL-6也显着低于模型组（P<0.01）。21天时,大黄?虫丸高剂量组HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β显着低于模型组（P<0.01）;中剂量组HYP、IL-6、IL-1β均显着低于模型组（P<0.01）;低剂量组IL-1β的含量显着低于模型组（P<0.01）。28天时,大黄?虫丸高剂量组HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显着低于模型组（P<0.01）,中剂量组的IL-1β也显着低于模型组（P<0.01）。5 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠TGF-β1/Smad通路蛋白表达的影响结果模型组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白含量与正常组相比显着增加（P<0.01）,Smad7显着降低（P<0.01）。14天时,大黄?虫丸高剂量组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的蛋白含量较模型组显着降低（P<0.01）,Smad7显着增加（P<0.01）。大黄?虫丸中剂量组Smad2较模型组显着降低（P<0.01）,α-SMA、Smad3较模型组降低,有统计学意义（P<0.05）;Smad7显着增加（P<0.01）。低剂量组Smad2蛋白含量较模型组显着降低（P<0.01）,Smad7显着增加（P<0.01）。21天时,除低剂量组的Smad2低于模型组,具有统计学意义外,其余大黄?虫丸高、中、低剂量组的TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白含量较模型组显着降低（P<0.01）,Smad7显着增加（P<0.01）。28天时,大黄?虫丸高剂量组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白含量较模型组明显降低,Smad7明显增加,其中TGF-β1、Smad2与模型组的差异具有统计学意义（P<0.05）,其余三个指标差异均显着（P<0.01）。大黄?虫丸中、低剂量组Smad3的蛋白含量较模型组显着降低（P<0.01）,Smad7显着增加（P<0.01）。6 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠TGF-β1/Smad通路基因表达水平的影响结果模型组Smad2m RNA在14天、21天,Smad3m RNA在14天表达水平高于正常组,具有统计学意义（P<0.05）;Smad7m RNA在21天表达水平低于正常组具有统计学意义（P<0.05）。其余各时间段模型组TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA表达水平显着高于正常组（P<0.01）,Smad7m RNA表达水平均显着低于正常组（P<0.01）。14天时,大黄?虫丸高剂量组与模型组相比,Smad2m RNA、Smad3m RNA降低（P<0.05）,TGF-β1m RNA降低（P<0.01）,Smad7m RNA升高（P<0.01）。中、低剂量组TGF-β1m RNA较模型组显着降低（P<0.01）,Smad7m RNA显着升高（P<0.01）。中剂量Smad2m RNA较模型组降低,有统计学意义（P<0.05）。21天时,高剂量组TGF-β1m RNA、Smad3m RNA表达水平与模型组相比显着降低（P<0.01）,Smad2m RNA表达比模型组低（P<0.05）,Smad7m RNA表达比模型组高（P<0.05）。中、低剂量组TGF-β1m RNA、Smad3m RNA显着低于模型组（P<0.01）。28天时,大黄?虫丸高、中、低剂量组TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA明显降低,与模型组相比均具有显着性差异（P<0.01）;Smad7m RNA的表达水平明显升高,同样与模型组相比具有显着性差异（P<0.01）。第三部分:大黄?虫丸含药血清能够通过调控TGF-β1/Smad通路抑制体外细胞的纤维化水平1大黄?虫丸含药血清对Si O2诱导的MH-S细胞活力的影响结果经过Si O2混悬液刺激细胞后,细胞活力明显下降（P<0.05）。大黄?虫丸不同浓度干预后,细胞活力均高于模型对照组,且呈浓度依赖性。2大黄?虫丸含药血清对Si O2诱导的MH-S细胞因子的影响结果模型对照组细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量显着高于正常对照组（P<0.01）,大黄?虫丸含药血清15%组及含药血清10%组的IL-6含量显着低于正常对照组（P<0.01）,含药血清15%组的TNF-α及IL-1β含量低于模型组,有统计学意义（P<0.05）。含药血清10%组的TNF-α含量低于模型组,有统计学意义（P<0.05）。3大黄?虫丸含药血清对Si O2诱导的MH-S细胞系TGF-β1/Smad通路蛋白表达的影响结果（1）Western-Blot结果:模型对照组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白表达显着高于正常对照组（P<0.01）,Smad7表达相反,模型对照组低于正常组,且具有统计学意义（P<0.05）。大黄?虫丸含药血清15%组的TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白表达显着低于模型对照组（P<0.01）,Smad7蛋白表达相反,高于模型组,有统计学意义（P<0.05）。含药血清10%组的TGF-β1、α-SMA、Smad2蛋白表达显着低于模型对照组（P<0.01）。含药血清5%组α-SMA蛋白表达显着低于模型对照组（P<0.01）,TGF-β1、Smad2的蛋白表达低于模型组,具有统计学意义（P<0.05）。（2）细胞免疫荧光结果:从细胞免疫荧光的结果可以看出,模型对照组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3表达的平均光密度值（average optical,AO）,显着高于正常对照组（P<0.01）,Smad7表达的AO值低于正常对照组（P<0.01）。加入大黄?虫丸含药血清后,15%含药血清组的TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的AO值显着低于模型对照组（P<0.01）,Smad7的AO值明显高于模型对照组（P<0.01）;10%含药血清组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的AO值显着低于模型对照组（P<0.01）,Smad7表达的AO值高于模型对照组,有统计学意义（P<0.05）;5%含药血清组α-SMA、Smad2的AO值显着低于模型对照组（P<0.01）,TGF-β1、Smad3的AO值低于模型对照组,有统计学意义（P<0.05）,Smad7表达的AO值显着高于模型对照组（P<0.01）。说明大黄?虫丸能够明显降低TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的AO值,同时增强Smad7的AO值,尤其是15%含药血清组的效果更加明显,结论同Western-Blot相一致。研究结论1、通过造模实验研究,显示暴露气管注射法、气管插管法和静式染毒法三种方式皆可以成功复制小鼠矽肺纤维化模型,但是为了减少造模过程中创伤的影响,降低小鼠的死亡率,更加贴合和接近真实矽肺发生的条件,最终选择了静式染毒法作为本课题造模方法。2、从动物实验的肺系数、病理;血清HYP含量、血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量;肺组织α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达;肺组织TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA、Smad7m RNA表达,证实大黄?虫丸可通过调控TGF-β1/Smad通路抑制小鼠矽肺模型肺纤维化进程,且存在一定的剂量和时间依赖性。3、体外细胞实验用大黄?虫丸含药血清干预Si O2诱导的肺泡巨噬细胞MH-S细胞系,CCK8测试细胞活力,同样观察相关炎性因子含量,以及Western-Blot和免疫荧光法检测TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白的表达,结论同动物实验一致,证明大黄?虫丸在体外细胞水平也可以通过调控TGF-β1/Smad通路抑制肺纤维化,且存在浓度依赖性。
陆青兰[7]（2020）在《黄根多糖的提取分离及其抗矽肺纤维化的研究》文中进行了进一步梳理目的:⑴提取分离实验所需的黄根多糖（PSPT）,建立其含量的测定方法并对样品含量进行检测。⑵通过Wistar大鼠矽肺纤维化模型,从抑制炎症细胞因子和对上皮间质转化（EMT）的影响等角度探讨PSPT抗矽肺纤维化的作用。方法:⑴采用超声波水加热提取,醇沉淀,Savage法除蛋白质,超滤膜等分离技术从黄根（PT）中提取分离出黄根多糖。用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（HPLC-ELSD）法检测多糖组分含量。用苯酚-浓硫酸法,以D-葡萄糖为对照,在比色波长485nm测定PT总多糖的含量。⑵采用口咽法建立大鼠矽肺模型,将120只无特定病原体（SPF）级雄性Wistar大鼠随机分为对照组和造模组。对照组滴注1.00 ml生理盐水,造模组大鼠滴注50.0 mg/ml Si O2水混悬液1.00 ml制备矽肺纤维化模型。造模成功后将造模组随机分为模型组及PSPT低、中、高剂量（125、250、500 mg/g）组,每组24只。PSPT低、中、高剂量组分别ig给予相应药物,对照组和模型组ig给予等量生理盐水。分别在第7d、14d、28d、56d四个时间点处死各组大鼠6只并采集肺组织。观察大鼠体重及行为学变化;免疫荧光定量PCR（q RT-PCR）检测肺组织中白细胞介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NALP3）炎症小体、肿瘤坏死因子α（TNF-α）m RNA的相对表达水平;计算肺系数,检测肺组织羟脯氨酸含量;HE、Masson染色检测大鼠肺组织病理学变化;q RT-PCR检测肺组织中转化生长因子β1（TGF-β1）、上皮性钙黏附蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形纤维蛋白（Vimentin）m RNA的相对表达水平;同位素标记定量技术（i TRAQ）鉴定肺组织中差异蛋白的表达;Western blotting法检测肺组织中E-cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白含量的表达。结果:⑴10.0 kg PT用该法提取分离得PSPT 560.0 g,得率为5.6%,HPLC-ELSD法检测得其中一多糖组分含量为64.0%。苯酚-硫酸法溶液的吸光度与葡萄糖含量在20.0～120.0μg/ml呈良好线性关系;回归方程为A=0.0089C+0.0455（R2=0.9986）,重现性RSD=0.391%（n=6）,精密度RSD=0.265%（n=6）,120分钟内稳定性RSD=0.386%（n=7）,平均回收率为99.7±1.01%（n=6）,测得4批PT中总多糖的含量在2.10～3.04%之间。⑵（1）对照组和PSPT组大鼠饮食、活动良好;模型组大鼠少动、有弓背症状。对照组大鼠肺叶表面光滑、弹性良好;模型组大鼠体重较其他组轻,但差异不显着（P>0.05）。（2）模型组肺组织表面凹凸不平、萎缩,PSPT各剂量组肺组织颜色、弹性及结节样改变均好转。（3）与7d、14d、28d、56d对照组比较,同时间段模型组大鼠肺组织内IL-1β、IL-6、NALP3、TNF-αm RNA表达水平均升高（P<0.001）;与模型组比较,各同时段PSPT各剂量组大鼠肺组织内IL-1β、IL-6、NALP3、TNF-αm RNA表达水平总体降低（P<0.05）。（4）大鼠矽肺纤维化模型i TRAQ蛋白质组定量结果显示,模型组与对照组比较鉴定出差异蛋白总数为214个,其中表达上调蛋白为137个,表达下调蛋白为77个。（5）与对照组比较,模型组56d大鼠肺泡炎症、肺纤维化程度加重,肺系数和羟脯氨酸（HYP）增高,Vimentin、α-SMA的m RNA和蛋白的表达水平显着升高,E-cadherin m RNA和蛋白表达水平显着降低,TGF-β1 m RNA表达水平显着升高。与模型组比较,PSPT各剂量组56d大鼠肺泡炎症、肺纤维化程度均下降,肺系数和羟脯氨酸均降低,Vimentin、α-SMA的m RNA和蛋白表达水平显着降低,E-cadherin m RNA和蛋白表达水平显着升高,TGF-β1 m RNA表达水平显着降低。结论:⑴PSPT超声提取-超滤膜分离工艺简便、快捷、高效,适合大批量制备。建立的HPLC-ELSD法可简便检测PSPT单一组分含量。苯酚-硫酸法可检测PT总多糖含量。⑵PSPT能够降低促炎细胞因子的表达水平,抑制炎症细胞的浸润,减轻大鼠肺组织的损伤。PSPT能够抑制大鼠肺部的EMT,减少细胞外基质沉积,有效干预矽肺纤维化的进程。PSPT对壮药制剂PT片的质量控制具有重要意义。
何秀[8]（2020）在《转录因子EB在实验性矽肺中的作用及海藻糖对实验性矽肺纤维化保护作用的机制研究》文中认为目的:矽肺是长期吸入大量游离二氧化硅引起的,一种以持续性炎症和不可逆纤维化为特征的职业性肺部疾病,是尘肺中最常见、进展最快、危害最严重的类型。矽肺发病机制尚未完全明确,缺乏临床特效治疗措施,仍是世界范围内最受关注的公共卫生问题之一。我们之前的研究曾证实自噬在矽肺发生发展过程中具有重要作用。虽然肺组织已有的纤维化病变为非可逆性病变且难以消除,但肺纤维化的发病是个慢性、进行性的病理反应过程,从改善自噬溶酶体系统功能的角度寻找治疗的靶标,以延缓肺纤维化的发展进程为目的,仍具有重要的现实意义。本研究探讨转录因子EB在矽尘导致肺部炎症和纤维化中的可能作用机制,并进一步探究海藻糖对实验性矽肺纤维化保护作用的可能机制,以期为矽肺纤维化病程的延缓及治疗提供潜在靶标。研究方法:本研究通过气管非暴露式灌注二氧化硅悬液,构建C57BL/6小鼠矽肺动物模型。利用Western Blot、qRT-PCR和免疫荧光对矽尘暴露早期（7天）和晚期（56天）实验性矽肺模型小鼠肺组织及肺泡巨噬细胞（AMs）中TFEB进行检测,得出矽尘暴露小鼠肺组织及AMs细胞中TFEB入核增多,表达升高。运用MH-S细胞建立体外矽尘暴露模型和TFEB沉默及过表达细胞系,验证TFEB在矽肺模型中的可能作用及机制。使用Western Blot、TUNEL和ELISA,检测TFEB沉默和过表达对体外矽尘暴露MH-S细胞凋亡和炎症的影响,得出TFEB沉默加重凋亡和炎症,而TFEB过表达起到了缓解作用。通过给予自噬阻断剂,应用Western Blot确认矽尘暴露导致MH-S细胞自噬降解受阻。通过Western Blot、吖啶橙染色、Lysotracker染色及免疫荧光检测进一步确认TFEB过表达对矽尘暴露导致MH-S细胞自噬溶酶体系统的影响。同时应用自噬阻断剂,运用TUNEL和ELISA的方法,进一步证实TFEB过表达减轻矽尘暴露导致的MH-S细胞凋亡和炎性因子的分泌是否与自噬溶酶体系统有关。上述实验用以说明TFEB在矽尘暴露MH-S细胞中的的作用。给予矽尘暴露小鼠2 g/kg海藻糖（Tre）,应用Western Blot、qRT-PCR和免疫荧光对各实验小鼠肺组织及AMs中TFEB进行检测。应用Western Blot及免疫荧光检测Tre对矽肺模型自噬溶酶体系统的影响。应用Western Blot、ELISA和HE染色检测Tre对矽尘暴露导致肺部凋亡和炎症的影响。体外给予矽尘暴露MH-S细胞50 mmol/L Tre,运用Western Blot、qRT-PCR检测TFEB的变化情况。并通过构建LC3-GFP-mRFP转染MH-S细胞系,动态观察Tre对自噬的调控。运用TFEB沉默细胞系和Tre两种处理方式,采用Western Blot、吖啶橙染色、Lysotracker染色及免疫荧光检测方法,进一步证实Tre通过TFEB对矽肺模型的自噬溶酶体系统进行调控。采用Western Blot、TUNEL和ELISA检测方法,检测Tre对矽尘暴露MH-S细胞凋亡和炎症的影响。采用羟脯胺酸测定、Western Blot和免疫组织化学（Col-1、Fn）确定Tre对矽尘暴露导致肺组织纤维化的影响,应用Masson染色观察Tre对矽尘暴露导致肺组织纤维化的影响。上述实验用以说明Tre对实验性矽肺纤维化缓解作用的可能机制。结果:1、矽尘暴露小鼠肺组织和AMs细胞中TFEB核转移增加Western Blot、Realtime-PCR、免疫组化和免疫荧光的方法检测矽尘暴7天和56天TFEB的变化。Western Blot结果显示:在矽尘暴露7天、56天,与对照组相比,CS组小鼠肺组织TFEB核蛋白的表达显着升高（P<0.05）;RealtimePCR结果显示,与对照组相比,CS组小鼠肺组织TFEB基因表达显着升高（P<0.05）;免疫组化和免疫荧光结果显示,与对照组相比,CS组小鼠肺泡巨噬细胞TFEB核蛋白表达增多;Realtime-PCR检测在矽尘暴露7天、56天TFEB的变化,与对照组相比,CS组小鼠肺泡巨噬细胞TFEB基因表达显着升高（P<0.05）。2、TFEB沉默加重CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌通过Western Blot和Realtime-PCR检测,与对照组比较,CS暴露导致MHS细胞TFEB核转移增加,基因表达升高（P<0.05）。建立TFEB沉默MH-S细胞系,通过Western Blot、TUNEL和ELISA方法检测凋亡和炎性因子的分泌情况,与对照组比较,CS暴露导致MH-S细胞凋亡和炎性因子的分泌增多,TFEB沉默加重CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌（P<0.05）。3、TFEB过表达减轻CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌建立TFEB过表达MH-S细胞系。通过Western Blot、TUNEL和ELISA方法检测凋亡和炎性因子的分泌情况,与对照组比较,CS暴露导致MH-S细胞凋亡和炎性因子的分泌增多,TFEB过表达减轻CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌（P<0.05）。4、TFEB过表达通过自噬在矽尘暴露MH-S细胞模型中发挥抗凋亡及抗炎性因子分泌的作用Western Blot结果显示,与对照组相比,CS组MH-S细胞表达自噬相关蛋白LC3II,Beclin1和Atg5的水平均显着升高,TFEB过表达进一步促进了CS诱导的Beclin1和Atg5升高,却使LC3II蛋白表达降低（P<0.05）。Western Blot结果显示,CS组MH-S细胞表达溶酶体表面膜相关蛋白LAMP1的水平均显着降低,TFEB过表达减轻了CS诱导的LAMP1降低（P<0.05）。此外Lysotracker Red和AO染色检测同样发现,CS组MH-S细胞溶酶体红色荧光降低,TFEB过表达减轻了CS诱导的酸性结构的碱化。免疫荧光结果显示,CS导致MH-S细胞LAMP1表达降低,LC3II升高,LAMP1与LC3II共定位减少,提示二者结合减少。与CS组相比,TFEB过表达使CS处理的MH-S细胞LAMP1表达升高,LC3II降低,LAMP1与LC3II共定位增多,提示二者结合增多;Western Blot结果显示,TFEB过表达使CS处理的MH-S细胞升高的p62降低（P<0.05）;免疫荧光共定位同样发现CS导致MH-S细胞p62升高,Ubiquitin蛋白表达升高,二者共定位升高,提示CS导致MH-S细胞自噬底物沉积增多;TFEB过表达使CS处理的MH-S细胞p62降低,Ubiquitin蛋白表达升高二者共定位减少,提示TFEB过表达使CS处理的MH-S细胞自噬底物沉积降低。通过自噬抑制剂BAF、CQ和3MA来干预自噬流,TUNEL和ELISA结果显示,TFEB过表达通过自噬溶酶体途径,减轻CS诱导的巨噬细胞凋亡和炎性细胞因子分泌（P<0.05）。5、Tre激活TFEB并调控矽肺模型小鼠肺组织和AMs细胞自噬相关蛋白的表达Western Blot结果显示:在矽尘暴露7天、56天,与CS组相比,CS+Tre组小鼠肺组织TFEB核蛋白的表达显着升高（P<0.05）。Realtime-PCR检测结果显示,与CS组相比,CS+Tre组小鼠肺组织TFEB mRNA表达显着升高（P<0.05）。免疫荧光结果显示,与CS组比较,CS+Tre组小鼠AMs细胞TFEB入核增多。Realtime-PCR结果显示,CS+Tre组与CS组比较,小鼠AMs细胞中TFEB mRNA表达显着升高（P<0.05）。Western Blot结果显示,检测矽尘暴露7天、56天肺组织,与Ctrl组比较,CS组自噬相关蛋白LC3II、Atg5和Beclin1表达显着升高;与CS组比较,CS+Tre组自噬相关蛋白Beclin1和Atg5的水平均显着升高,而LC3II的蛋白表达水平显着降低（P<0.05）。免疫荧光结果显示,在矽尘暴露7天、56天AMs细胞中,与Ctrl组比较,CS组自噬相关蛋白LC3II表达升高;与CS组比较,CS+Tre组LC3II的蛋白表达水平显着降低。Western Blot结果显示,在矽尘暴露7天、56天AMs细胞中,与Ctrl组比较,CS组自噬相关蛋白LC3II和Atg5表达显着升高;与CS组比较,CS+Tre组MH-S细胞表达自噬相关蛋白Atg5的水平显着升高,而LC3II的蛋白表达水平显着降低（P<0.05）。Western Blot结果显示,在肺组织和AMs细胞中均发现,与Ctrl组比较,CS组溶酶体表面膜蛋白LAMP1表达降低;与CS组比较,CS+Tre组LAMP1表达明显升高（P<0.05）。对肺泡灌洗液中CTSB蛋白进行Western Blot检测发现,CS组CTSB蛋白分泌量显着增加,Tre干预有效减少肺泡灌洗液中CTSB蛋白分泌量。Western Blot结果显示,矽肺模型小鼠肺组织中,与Ctrl组比较,CS使肺组织中p62和Ubiqutin蛋白表达显着增加;与CS组比较,CS+Tre组有效减少了p62和Ubiqutin蛋白的沉积（P<0.05）。矽肺模型小鼠AMs细胞中,与Ctrl组比较,CS使AMs细胞p62蛋白表达显着增加;与CS组比较,CS+Tre组有效减少了p62蛋白的沉积（P<0.05）。免疫荧光同样发现,Tre能够有效减少小鼠AMs细胞中p62蛋白的沉积。6、Tre减轻矽肺模型小鼠肺组织凋亡及炎症Western Blot结果显示,与对照组比较,CS暴露导致矽肺模型小鼠肺组织和AMs细胞凋亡加重,Tre干预减轻了矽肺模型小鼠的凋亡（P<0.05）。ELISA结果显示,与Ctrl组比较,CS使7天矽肺模型小鼠肺泡灌洗液中IL-6、MCP-1、TNF-α和IL-1β蛋白分泌量显着增加,56天矽肺模型小鼠肺泡灌洗液,除IL-6以外其它蛋白均显着增加;与CS组比较,CS+Tre使7天、56天矽肺模型小鼠肺泡灌洗液中炎性因子分泌量显着降低（除56天IL-6以外）（P<0.05）。HE染色检测结果显示,与对照组小鼠相比,CS组小鼠肺组织结构遭到破坏,7天矽肺模型小鼠观察到肺组织中存在大量炎性细胞浸润;56天矽肺模型小鼠观察到明显的细胞结节。Tre进行干预处理的矽肺模型小鼠,可以观察到炎性细胞浸润减轻,纤维细胞结节大小明显降低。7、Tre激活TFEB并调控体外矽尘暴露MH-S细胞自噬相关蛋白的表达Western Blot结果显示:矽尘暴露使MH-S细胞TFEB入核增多,Tre进一步促进CS处理的MH-S细胞TFEB入核增多（P<0.05）。Realtime-PCR结果显示,与对照组相比,CS组MH-S细胞TFEB基因表达升高;与CS组比较,CS+Tre组TFEB基因表达进一步升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。mRFP-GFP-LC3结果显示:Tre增强了体外矽肺MH-S细胞自噬流,促进了自噬底物的降解;Western Blot结果显示,与CS组比较,CS+Tre组MH-S细胞表达自噬相关蛋白Beclin1和Atg5的水平均显着升高,而LC3II的蛋白表达水平显着降低,CS+Tre+sh-TFEB与CS或CS+Tre比较均发现LC3II、Beclin1和Atg5显着降低（P<0.05）。Western Blot结果显示,与CS组比较,CS+Tre组MH-S细胞表达溶酶体表面膜蛋白LAMP1显着增高,上清液中CTSB明显减少,CS+Tre+sh-TFEB与CS+Tre组比较发现,sh-TFEB逆转了Tre对矽肺MH-S细胞LAMP1和CTSB的作用（P<0.05）。此外Lysotracker Red和AO染色检测同样发现,Tre减轻了CS对MH-S细胞酸性结构的破坏,而sh-TFEB使Tre这一功能丧失。免疫荧光结果显示,与CS组比较,CS+Tre组MH-S细胞LAMP1表达升高,LC3II降低,LAMP1与LC3II共定位增多,而CS+Tre+sh-TFEB组,LAMP1与LC3II表达均降低;Western Blot结果显示,Tre使CS处理的MH-S细胞p62蛋白表达降低,而CS+Tre+sh-TFEB组,显示sh-TFEB抵消了Tre促进p62降解的作用（P<0.05）。免疫荧光发现,与CS组比较,CS+Tre组MH-S细胞p62表达降低,Ubiquitin蛋白减少,二者共定位减少,而CS+Tre+sh-TFEB组与CS+Tre组比较,发现MH-S细胞p62表达升高,Ubiquitin蛋白增多,二者共定位增多。提示海藻糖通过TFEB使CS处理的MH-S细胞自噬底物沉积减少。8、Tre通过TFEB减轻体外矽尘暴露MH-S细胞凋亡及炎性因子的释放通过Western Blot、TUNEL和ELISA方法检测凋亡和炎性因子的分泌情况,与CS组比较,CS+Tre组,减轻细胞凋亡、使炎性因子的分泌减少,而CS+Tre+sh-TFEB组,使Tre的抗凋亡、抗炎作用丧失（P<0.05）。9、Tre减轻矽肺模型小鼠肺组织纤维化对矽尘暴露56天后的各组小鼠肺组织进行羟脯氨酸含量测定（HYP）、Col-1和Fn蛋白检测,石蜡切片进行Col-1和Fn蛋白检测和Masson三色染色。HYP结果显示,与Ctrl组比较,CS暴露小鼠肺组织中,羟脯氨酸含量明显增加,与CS组比较,Tre处理后,CS暴露小鼠肺组织中,羟脯氨酸含量显着降低（P<0.05）。Western Blot和免疫组化结果显示,Tre有效减轻了矽尘暴露小鼠肺组织Col-1和Fn蛋白的表达（P<0.05）。Masson染色结果显示,Ctrl组小鼠肺组织并未出现明显的胶原沉积,而在矽尘暴露组小鼠肺组织中,纤维结节病变处出现明显的胶原沉积,给予Tre处理后小鼠纤维结节病变明显减少,肺部胶原沉积明显降低（P<0.05）。结论:1、矽尘暴露小鼠肺组织和AMs细胞中TFEB入核增多,表达增高。2、沉默TFEB使体外矽尘暴露MH-S细胞凋亡炎症加重,而过表达TFEB使凋亡和炎症减轻。3、TFEB过表达通过改善自噬溶酶体系统以自噬依赖的方式减轻矽尘导致的MH-S细胞凋亡和炎性因子的释放。4、海藻糖通过TFEB促进矽肺模型自噬溶酶体系统功能的恢复。5、海藻糖通过TFEB减轻矽肺模型凋亡和炎性因子的释放。6、海藻糖减轻矽尘暴露小鼠肺组织纤维化。
李艳[9]（2020）在《FOXM1/lncRNA-PVT1/miR-497-5p信号轴在矽尘诱导肺纤维化中的调控机制》文中研究说明背景矽肺病（Silicosis）是由于在职业活动中长期吸入含有游离二氧化硅的粉尘引起的以肺组织纤维化为主的疾病,属于尘肺病中最常见的类型之一,也是我国影响范围最广泛、危害最严重的一类职业病。预计在未来的20年甚至更长时间内,尘肺病（尤其是矽肺病）仍将给社会和个人带来巨大的经济负担,严重影响患者生命质量,成为我国不容忽视的公共卫生问题。矽肺病的发病机制复杂且尚未完全清楚。目前的研究证实其发生发展涉及多种细胞、多个阶段和大量的细胞因子,且国内外研究仍未找到该病的特异性生物标志物与特效治疗药物。因此,深入探讨矽肺病的发病机制可以为其早期诊断、干预和治疗提供坚实的理论基础。矽肺病的发展进程主要包含早期的炎症反应与晚期的纤维化形成两个阶段,肌成纤维细胞是纤维化阶段的关键参与者。活化的成纤维细胞是肌成纤维细胞的主要来源之一,转化生长因子-β（TGF-β）在其中起着重要的作用。成纤维细胞的活化进程以细胞外基质的异常沉积为特征,是肺纤维化发生的重要事件。本课题围绕TGF-β诱导的肺成纤维细胞活化这一重要事件,深入研究肺纤维化进程中潜在的调控分子及其可能的调控机制（如非编码RNA（nc RNA））。长链非编码RNA（lnc RNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸的nc RNA。它参与多种细胞生物学进程,与疾病的发生、发展和预后密切相关。Lnc RNA的分子功能与其在细胞中的定位密切相关,定位于细胞质的lnc RNA可以与micro RNA（mi RNA）相互作用,进而影响mi RNA的靶基因的表达。尽管已有研究发现一些lnc RNAs与纤维化有关,但在矽尘诱导的肺纤维化中,是否也有相关的lnc RNAs参与调控TGF-β诱导的肺成纤维细胞活化,进而影响矽肺纤维化的进展仍需要进一步的研究。为了探寻哪些关键非编码RNA参与肺成纤维细胞的活化,我们分别对TGF-β1处理与未处理的人胚肺成纤维细胞进行了lnc RNA测序研究。结果共发现28条差异显着的lnc RNAs,其中24条lnc RNAs在TGF-β1处理后表达升高,4条lnc RNAs表达下降。随后在细胞模型中对这些候选lnc RNAs进一步验证,发现8条lnc RNAs的表达水平与测序结果一致,包括lnc RNA-PVT1、NEAT1、DNM3OS等。结合文献检索,我们发现lnc RNA-PVT1在疾病中的调控潜力巨大,但其在肺纤维化中的研究仍然空白,因此本课题选其进行深入的研究。Lnc RNA-PVT1（Plasmacytoma Variant Translocation 1,浆细胞瘤剪切体1）是一条长度为1957个核苷酸的长链非编码RNA。现有研究表明lnc RNA-PVT1通过驱动多种生物学效应发挥巨大的调控作用,并且在肿瘤中具有作为诊断、预后标志物及治疗靶标的潜能。目前lnc RNA-PVT1在纤维化疾病中的研究仍然较少,仅有的几篇报道提示lnc RNA-PVT1可以参与器官纤维化进程,但它对矽尘诱导肺纤维化的作用及具体调控机制仍然未知。我们对lnc RNA-PVT1进行细胞内定位研究,发现其在胞质内表达丰富,提示lnc RNA-PVT1可以通过竞争吸附mi RNA的方式发挥作用。结合生物信息学分析、文献检索与课题组前期小鼠矽肺模型mi RNA芯片数据,我们筛选了lnc RNA-PVT1可能结合的mi R-497-5p进行进一步的研究。Lnc RNA可能受一些转录因子调控。研究报道在胃癌细胞中,lnc RNA-PVT1受FOXM1（Forkhead box M1）的正向调节。FOXM1是叉头盒转录因子家族成员,它与细胞周期密切相关,并可以驱动肺成纤维细胞的活化,促进肺纤维化进展。我们也发现在体内矽肺模型与体外肺成纤维细胞活化模型中,FOXM1表达升高,且降低FOXM1的表达会影响lnc RNA-PVT1与mi R-497-5p的水平。因此,本课题将研究lnc RNA-PVT1在矽尘诱导的肺纤维化过程中的潜在作用,探求其上游是否受FOXM1调控,下游是否竞争结合mi RNA-497-5p,从而揭示FOXM1、lnc RNA-PVT1、mi R-497-5p参与调控肺成纤维细胞活化的具体分子机制,以期为矽尘诱导肺纤维化的防治提供新的线索。目的通过lnc RNA测序筛检与细胞功能研究,明确lnc RNA-PVT1在肺成纤维细胞活化中的作用;在细胞水平上,通过探索lnc RNA-PVT1上游可调控其表达的转录因子及下游可竞争结合的mi RNA,揭示lnc RNA-PVT1上下游信号轴参与调控肺成纤维细胞活化的分子机制;在动物实验中,观察lnc RNA-PVT1结合的mi RNA对矽尘诱导肺纤维化的干预作用,从而为矽肺纤维化的防治提供理论依据。方法（1）通过使用TGF-β1处理人胚肺成纤维细胞系（MRC-5）构建体外肺成纤维细胞活化模型。通过在小鼠气管内滴注粉尘悬浊液构建体内矽尘诱导肺纤维化模型;在此基础上,再通过小鼠尾静脉注射mi R-497-5p agomir构建矽肺干预模型。（2）通过高通量lnc RNA测序研究筛选肺成纤维细胞活化中的关键lnc RNA-PVT1。（3）通过核质分离与FISH实验观察lnc RNA-PVT1在MRC-5细胞中的定位。（4）通过双荧光素酶报告基因实验与RNA Pull-down实验验证lnc RNA-PVT1与mi RNA、mi RNA与靶基因、FOXM1与lnc RNA-PVT1间的结合;（5）通过小鼠肺组织病理切片HE染色与纤维化评分、羟脯氨酸含量检测评价动物模型中肺纤维化的严重程度与分布范围。（6）通过CCK8实验观察细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞周期,Western Blot与免疫荧光检测蛋白表达水平,q RT-PCR检测RNA表达水平。结果1.Lnc RNA-PVT1参与TGF-β1诱导的肺成纤维细胞活化建立TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞（MRC-5）活化模型,用高通量lnc RNA测序技术筛检差异表达的lnc RNAs。依据差异表达在2倍以上或在1.5-2倍之间且表达值（Count）>50的原则,筛选出了28条差异表达显着的lnc RNAs（P<0.05）,通过q RT-PCR验证出包含lnc RNA-PVT1在内的8条lnc RNAs的表达水平与测序结果一致。结合文献报道,lnc RNA-PVT1在疾病中的调控潜力巨大,但在肺纤维化中的研究仍然空白。因此,本课题首先选择了lnc RNA-PVT1进行深入的研究。在TGF-β1激活的MRC-5细胞中,采用特异性si RNA敲低lnc RNA-PVT1的表达,结果显示纤维化标志蛋白（CollagenⅠ、Fibronectin与α-SMA）的表达水平降低、α-SMA荧光强度减弱、细胞迁移速率减缓,这些均证实lnc RNA-PVT1参与了TGF-β1诱导的肺成纤维细胞活化。2.细胞质中表达丰富的lnc RNA-PVT1竞争性结合mi R-497-5p通过核质分离和荧光原位杂交实验探索lnc RNA-PVT1在MRC-5细胞中的定位,结果发现它在胞质中表达丰富,提示lnc RNA-PVT1可能通过ce RNA（竞争性内源性RNA）的形式吸附mi RNA。利用生物信息学网站预测lnc RNA-PVT1可能结合的mi RNA,并结合文献检索与课题组前期小鼠矽肺模型mi RNA芯片结果,而后运用RNA Pull-down和双荧光素酶报告基因实验验证了lnc RNA-PVT1与mi R-497-5p存在结合。3.mi R-497-5p可以抑制肺成纤维细胞的活化为观察mi R-497-5p对肺成纤维细胞的调控作用,首先检测了其在活化MRC-5细胞中的表达水平。发现与对照组相比,TGF-β1处理组中mi R-497-5p表达水平显着下降。升高mi R-497-5p的表达导致纤维化标志蛋白的表达水平降低、α-SMA荧光强度减弱,细胞迁移减缓,即mi R-497-5p抑制了MRC-5的活化。在小鼠肺成纤维细胞NIH-3T3中也观察到类似的结果。这些均证实了mi R-497-5p可以在体外抑制肺成纤维细胞的活化。4.mi R-497-5p能够减轻矽尘诱导的小鼠肺纤维化通过气管滴注粉尘悬浊液构建矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型,而后在矽肺模型中观察mi R-497-5p的作用,结果发现与正常小鼠相比,矽肺模型小鼠肺组织内mi R-497-5p的表达水平显着降低;高表达mi R-497-5p的干预组小鼠肺组织内mi R-497-5p的表达水平显着升高,而纤维化评分、羟脯氨酸含量与纤维化标志蛋白的表达均显着降低,表明mi R-497-5p在体内能够减轻矽尘诱导的肺纤维化。5.mi R-497-5p通过靶向Smad3和Bcl2减弱肺成纤维细胞活化通过生物信息学网站预测mi R-497-5p可能结合的靶基因,并运用双荧光素酶报告基因实验证实了mi R-497-5p与Smad3与Bcl2存在直接结合。在活化肺成纤维细胞模型和小鼠矽肺模型与中,升高mi R-497-5p的表达,可观察到其靶基因Smad3与Bcl2的表达水平显着降低。在细胞水平上,分别利用si RNAs和过表达质粒降低或升高Smad3和Bcl2的表达,证实其在肺成纤维细胞活化中的调控作用,结果显示降低Smad3与Bcl2的表达可以抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞活化;在TGF-β1处理的MRC-5细胞中单独或联合使用mi R-497-5p mimic与靶基因Smad3和Bcl2过表达质粒进行回复实验,发现过表达的靶基因可以逆转mi R-497-5p对纤维化标志蛋白的抑制作用。这些结果均表明在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞活化中,mi R-497-5p是通过调控靶基因Smad3与Bcl2发挥作用的。6.Lnc RNA-PVT1通过mi R-497-5p调控Smad3和Bcl2参与肺成纤维细胞活化为进一步证实lnc RNA-PVT1与mi R-497-5p及靶基因间的调控关系,本课题开展了联合抑制和功能挽救实验。在活化的肺成纤维细胞中,利用si RNA降低lnc RNA-PVT1的表达,可导致mi R-497-5p的靶基因Smad3与Bcl2的RNA和蛋白的表达水平随之下调。在TGF-β1处理的MRC-5细胞中单独或联合转染lnc RNA-PVT1 si RNA和mi R-497-5p mimic,结果发现单独降低lnc RNA-PVT1或单独升高mi R-497-5p的水平均能显着抑制TGF-β1诱导的纤维化标志蛋白与P-Smad3和Bcl2的表达,并且在联合转染时这些指标的表达水平下调更为显着,提示lnc RNA-PVT1si RNA与mi R-497-5p mimic对细胞活化具有联合抑制作用。在活化MRC-5细胞中单独或联合转染lnc RNA-PVT1 si RNA和mi R-497-5p inhibitor,结果与mimic作用相反,联合转染时mi R-497-5p inhibitor可以回复lnc RNA-PVT1 si RNA对纤维化标志蛋白与P-Smad3和Bcl2表达的抑制作用。在正常MRC-5细胞中使用质粒升高lnc RNA-PVT1的水平后,纤维化标志蛋白与P-Smad3和Bcl2的表达也随之上调,提示lnc RNA-PVT1起到类似TGF-β1的作用,可以活化肺成纤维细胞。而在过表达lnc RNA-PVT1的同时转染mi R-497-5p mimic后,相关指标的表达水平进一步回降,表明mi R-497-5p作为lnc RNA-PVT1的下游可以逆转lnc RNA-PVT1对肺成纤维细胞的活化作用。以上研究结果证实了lnc RNA-PVT1通过mi R-497-5p调控Smad3和Bcl2影响肺成纤维细胞的活化。7.FOXM1通过上调lnc RNA-PVT1促进纤维化进展研究表明lnc RNA-PVT1受FOXM1的转录调节,本研究首先在小鼠模型中检测了Foxm1的表达,结果显示与对照组相比,小鼠矽肺模型中Foxm1的表达水平显着升高;而在mi R-497-5p agomir干预模型中,Foxm1的水平则相应降低,提示Foxm1参与了矽肺的发生发展。在活化的MRC-5细胞中FOXM1的表达水平显着升高。而降低FOXM1的表达后,细胞的增殖、迁移与α-SMA荧光强度均被减弱。表明FOXM1是肺成纤维细胞的活化中的正向调控因子。通过启动子区双荧光素酶报告基因实验证实了FOXM1能直接结合到lnc RNA-PVT1启动子区促进其转录。进一步使用si RNA降低FOXM1的表达后,lnc RNA-PVT1的表达水平也随之降低,但mi R-497-5p的水平却显着升高,表明FOXM1转录调控lnc RNA-PVT1的表达,进而影响lnc RNA-PVT1下游的信号转导。在MRC-5细胞中联合转染FOXM1 si RNA与lnc RNA-PVT1过表达质粒,观察到FOXM1 si RNA处理回复了lnc RNA-PVT1过表达质粒对纤维化标志蛋白表达的促进作用,从而抑制了肺成纤维细胞的活化。这些结果证实了FOXM1通过促进lnc RNA-PVT1的转录调控肺成纤维细胞的活化,进而影响矽肺纤维化的进展。结论本研究发现lnc RNA-PVT1在肺成纤维细胞活化中起着关键作用,转录因子FOXM1可以促进lnc RNA-PVT1的转录,从而加强lnc RNA-PVT1对mi R-497-5p的竞争结合作用,解除mi R-497-5p对靶基因Smad3与Bcl2的抑制,进而促进肺成纤维细胞的活化,最终加速矽尘诱导肺纤维化的发展。本研究明确了FOXM1/lnc RNA-PVT1/mi R-497-5p信号轴在矽尘诱导肺纤维化中的调控作用,为矽肺纤维化的防治提供了潜在的生物学靶标。
师晓栋,于丽佳,张岩松[10]（2020）在《间充质干细胞源外泌体干预矽肺纤维化的研究进展》文中认为尘肺是严重危害接尘工人健康的职业病,其中矽尘由于能够引起劳动者肺组织弥漫性纤维化而被视为危害严重的一种尘肺病诱发因素。间充质干细胞（MSCs）是具有多向分化潜能特点的成体干细胞,能够通过分泌胞外囊泡家族成员外泌体行使对肿瘤、心血管疾病、免疫系统疾病和组织损伤等重大疾病的干预和调控功能。本文综述了近年来MSCs及其外泌体在矽肺纤维化干预领域的研究成果,为今后利用MSCs及其外泌体治疗矽肺纤维化的机制和功能研究起到指示方向和策略建议的作用。
二、白细胞介素Ⅰ在矽肺纤维化过程中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、白细胞介素Ⅰ在矽肺纤维化过程中的作用（论文提纲范文）
（1）黄芪甲苷Ⅳ通过PPM1A调控TGF-β1/Smad信号通路减轻矽肺肺损伤和纤维化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 黄芪甲苷Ⅳ(ASV)可缓解矽肺损伤及纤维化 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料及方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 黄芪甲苷Ⅳ通过调控TGF-β1/Smad信号通路抑制炎症和氧化应激发挥抗纤维化作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 ASV通过调节PPM1A的表达调控TGF-β1/Smad信号通路 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 课题的创新点及局限性 |
| 创新点 |
| 局限性 |
| 综述 矽肺发病机制及黄芪甲苷Ⅳ抗纤维化治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| English paper Ⅰ |
| English Paper Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）基于NLRP3-IL-1β通路抑制的姜黄素治疗肺纤维化的机制探讨（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 姜黄素对矽肺纤维化小鼠的干预作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 矽肺纤维化小鼠模型建立 |
| 2.2 姜黄素对矽肺纤维化小鼠的干预作用 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 矽肺纤维化小鼠模型建立 |
| 3.2 姜黄素对矽肺纤维化小鼠的干预作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 矽肺纤维化小鼠模型建模方法评价 |
| 4.2 阳性药物选择和应用剂量 |
| 4.3 中药姜黄药性、用量辨析 |
| 4.4 姜黄素使用剂量和给药途径 |
| 4.5 药物对矽肺纤维化小鼠的干预效果 |
| 5 小结 |
| 第二部分 姜黄素阻断SiO_2刺激肺泡巨噬细胞NLRP3炎症小体活化的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 仪器和设备 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原代细胞制备 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 试剂准备 |
| 2.4 细胞刺激模型的建立 |
| 2.5 姜黄素干预对细胞分泌炎症因子的影响 |
| 2.6 姜黄素阻断NLRP3炎症小体活化机制的初步探讨 |
| 2.7 姜黄素直接阻断NLRP3炎症小体活化的分子机制 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 原代细胞制备和培养 |
| 3.2 细胞刺激模型评价 |
| 3.3 姜黄素干预对细胞分泌炎症因子的影响 |
| 3.4 姜黄素阻断NLRP3炎症小体活化机制的初步探讨 |
| 3.5 姜黄素直接阻断NLRP3炎症小体活化的分子机制 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小鼠肺泡巨噬细胞分离与培养 |
| 4.2 细胞刺激模型评价 |
| 4.3 姜黄素抑制细胞NLRP3炎症小体活化相关炎症因子分泌 |
| 4.4 姜黄素阻断细胞NLRP3炎症小体活化机制的初步探讨 |
| 4.5 姜黄素直接抑制NLRP3炎症小体活化的分子机制 |
| 5 小结 |
| 第三部分 姜黄素分子靶点筛选 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 缓冲液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Biotin-姜黄素化合物制备 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 药物分子靶点垂钓 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Biotin-姜黄素化合物制备 |
| 3.2 药物分子靶点垂钓 |
| 3.3 质谱鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 姜黄素的化学性质及反应性 |
| 4.2 姜黄素抗炎活性和作用靶点 |
| 4.3 姜黄素作用靶点的分子垂钓 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 论文着作 |
| 科研课题 |
（3）丹参酮IIA对矽肺肺损伤及纤维化的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 丹参酮ⅡA对矽肺大鼠肺损伤及纤维化的保护作用研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 丹参酮ⅡA对二氧化硅诱导的EMT及TGF-β1/Smad信号通路激活的抑制作用研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 丹参酮ⅡA通过抑制NOX4表达、激活Nrf2/ARE信号通路减轻二氧化硅诱导的氧化应激研究前言 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）PPARγ-LXR-ABCA1信号通路对矽肺巨噬细胞泡沫化作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 试验方法与步骤 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 LXR、ABCA1在U937细胞中的表达最明显的刺激浓度及时间 |
| 1.2.2 LXR、ABCA1在泡沫细胞中的表达情况 |
| 1.2.3 LXR、ABCA1 在巨噬细胞中的调控作用 |
| 1.2.4 LXR、ABCA1上下游关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活型受体γ) |
| 1.3.2 LXR(肝X受体) |
| 1.3.3 ABCA1(巨噬细胞ATP结合转运体A1) |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 PPARγ-LXR-ABCA1信号通路与矽肺脂质代谢的关系 |
| 2.1 矽肺的国内外研究现状 |
| 2.2 矽肺的发病机制的学说 |
| 2.3 脂质代谢 |
| 2.4 与脂质代谢相关的受体 |
| 2.4.1 PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体) |
| 2.4.2 LXR(肝X受体) |
| 2.4.3 ABCA1(三磷酸腺苷结合盒转运体A1) |
| 2.5 LXR-ABCA1与矽肺泡沫细胞的关系 |
| 2.6 矽肺治疗的研究进展 |
| 2.6.1 抗纤维化的治疗 |
| 2.6.2 中药治疗 |
| 2.6.3 矽肺并发症及其治疗 |
| 2.6.4 其他方面的治疗 |
| 2.6.5 矽肺病防治的应用意义 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（5）Ac-SDKP对巨噬细胞活化的调控在抑制矽肺纤维化中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学处理 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 煤(矽)肺病理变化特点 |
| 1.2.2 iNOS和 Arg-1 蛋白在煤矽肺患者肺组织中的表达 |
| 1.2.3 iNOS和 Arg-1 蛋白在大鼠染尘不同时期肺组织中的表达 |
| 1.2.4 Ac-SDKP对矽肺大鼠肺组织中iNOS、Arg-1、MCP-1、α-SMA和COLI表达的调节作用 |
| 1.2.5 iNOS和 Arg-1 蛋白在SiO_2诱导的RAW264.7 细胞中的表达 |
| 1.2.6 Ac-SDKP对SiO_2诱导的RAW264.7 细胞MCP-1、iNOS和Arg-1表达的调节作用 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 矽肺纤维化的形成伴随有巨噬细胞的活化过程 |
| 1.3.2 Ac-SDKP通过对巨噬细胞活化的调控而抑制矽肺纤维化 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 巨噬细胞的活化与器官纤维化 |
| 2.1 巨噬细胞的活化与肺纤维化 |
| 2.2 巨噬细胞的活化与心脏纤维化 |
| 2.3 巨噬细胞的活化与肾脏纤维化 |
| 2.4 巨噬细胞的活化与肝脏纤维化 |
| 2.5 Ac-SDKP抗器官纤维化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（6）大黄?虫丸基于TGF-β1/Smad信号通路抑制矽肺纤维化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 矽肺流行病学 |
| 2 矽肺发病机制简述 |
| 3 TGF-β1/Smad信号通路及其在矽肺纤维化发病中的重要性 |
| 4 中医对矽肺的认识 |
| 5 大黄?虫丸的简述 |
| 6 本实验的研究思路和技术路线图 |
| 第一部分 :小鼠矽肺纤维化模型造模方案的确定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 其他器材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验前准备 |
| 2.2 四种造模方法 |
| 2.2.1 暴露气管注射法 |
| 2.2.2 气管插管法 |
| 2.2.3 鼻腔滴入法 |
| 2.2.4 静式染毒法 |
| 2.3 取材 |
| 2.4 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 小鼠一般情况及肺组织形态学 |
| 3.2 小鼠存活率 |
| 3.3 体重及肺脏系数 |
| 3.4 小鼠肺组织HE和 Masson染色结果 |
| 4 第一部分实验结论 |
| 第二部分 :大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠的作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂和耗材 |
| 2 动物实验方法 |
| 2.1 动物模型制备及分组 |
| 2.2 大黄?虫丸药液制备 |
| 2.3 动物给药干预 |
| 2.4 动物标本采集及处理 |
| 2.5 Elisa法检测动物血清HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量 |
| 2.6 小鼠肺组织病理切片及HE、Masson染色操作方法 |
| 2.7 Western-Blot操作方法 |
| 2.7.1 实验仪器 |
| 2.7.2 化学试剂 |
| 2.7.3 抗体 |
| 2.7.4 相关试剂的配制 |
| 2.7.5 具体实验步骤 |
| 2.7.6 实验结果 |
| 2.8 实时定量PCR操作方法 |
| 2.8.1 实验仪器 |
| 2.8.2 化学试剂及耗材 |
| 2.8.3 具体实验步骤 |
| 3 动物实验结果 |
| 3.1 小鼠一般情况 |
| 3.2 肺脏系数 |
| 3.3 小鼠肺组织病理结果 |
| 3.4 Elisa法检测HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β结果 |
| 3.5 Western-Blot法检测TGF-β1/Smad通路相关蛋白的表达水平 |
| 3.6 RT-PCR法检测TGF-β1/Smad通路相关基因表达水平 |
| 4 动物实验小结 |
| 第三部分 :大黄?虫丸对SiO2诱导的矽肺纤维化细胞模型作用机制研究 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 含药血清的制备 |
| 1.2 串联质谱法检测含药血清中三种主要指标成分 |
| 1.2.1 仪器与试剂 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.2.2.1 样品制备 |
| 1.2.2.2 对照品溶液制备 |
| 1.2.2.3 分析条件 |
| 1.2.3 样品测定结果 |
| 1.2.4 讨论 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.3.1 实验材料 |
| 1.3.1.1 实验细胞 |
| 1.3.1.2 主要仪器 |
| 1.3.1.3 主要试剂和耗材 |
| 1.3.2 细胞复苏 |
| 1.3.3 细胞培养 |
| 1.3.4 细胞传代 |
| 1.3.5 细胞计数 |
| 1.3.6 细胞冻存 |
| 1.3.7 细胞模型建立 |
| 1.3.8 分组及给药 |
| 1.3.9 CCK8检测细胞活性 |
| 1.3.10 Elisa检测方法 |
| 1.3.11 Western-Blot操作方法 |
| 1.3.12 细胞免疫荧光操作方法 |
| 2 细胞实验结果 |
| 2.1 细胞一般情况 |
| 2.2 CCK8检测细胞活性 |
| 2.3 Elisa法检测细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β结果 |
| 2.4 Western-Blot检测TGF-β1/Smad通路相关蛋白的表达水平 |
| 2.5 细胞免疫荧光检测结果 |
| 3 细胞实验小结 |
| 第四部分 :总结与讨论 |
| 1 动物模型的评价 |
| 2 阳性药物的选择 |
| 3 各实验指标的结果分析 |
| 3.1 小鼠肺脏系数的分析 |
| 3.2 HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β结果分析 |
| 3.3 TGF-β1/Smad通路相关蛋白及基因结果分析 |
| 3.4 大黄?虫丸治疗作用与时间、剂量的关系 |
| 4 中医对矽肺的辨证治疗 |
| 4.1 矽肺的中医病名 |
| 4.2 矽肺的中医病机分析 |
| 5 大黄?虫丸方解及作用机制讨论 |
| 第五部分 结论 |
| 第六部分 创新点 |
| 第七部分 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 大黄?虫丸的现代临床运用及治疗多脏器纤维化疾病的研究进展 |
| 1 大黄?虫丸的方源及古代文献研究 |
| 2 大黄?虫丸方义分析 |
| 3 大黄?虫丸现代临床运用范围 |
| 4 大黄?虫丸用于治疗脏器纤维化的研究进展 |
| 4.1 关于大黄?虫丸治疗肝纤维化的临床及实验研究 |
| 4.2 关于大黄?虫丸治疗肾纤维化的研究现状 |
| 4.3 关于大黄?虫丸治疗其他脏器纤维化的研究现状 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（7）黄根多糖的提取分离及其抗矽肺纤维化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 黄根多糖的提取分离及含量测定 |
| 引言 |
| 1 材料及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 黄根多糖对大鼠矽肺纤维化的作用 |
| 引言 |
| 1 材料及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 壮药黄根及抗矽肺纤维化机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（8）转录因子EB在实验性矽肺中的作用及海藻糖对实验性矽肺纤维化保护作用的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:转录因子EB在实验性矽肺中的作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂配置 |
| 2.2.1 结晶型二氧化硅(CS)悬液 |
| 2.2.2 完全1640培养基 |
| 2.2.3 吖啶橙染液(AO)配制 |
| 2.2.4 Lysotracker Red染液配制 |
| 2.2.5 4%多聚甲醛 |
| 2.2.6 10× Western Blot电泳缓冲液(running buffer) |
| 2.2.7 10× Western Blot转模缓冲液(Transbuffer) |
| 2.2.8 10×TBS |
| 2.2.9 10×PBS(免疫荧光) |
| 2.2.10 10×抗原修复液(免疫组化) |
| 2.2.11 封闭液、抗体稀释液 |
| 2.2.12 10%APS |
| 2.3 实验动物和分组 |
| 2.4 原代小鼠肺泡巨噬细胞(AMs)提取、纯化 |
| 2.5 细胞实验及分组 |
| 2.6 蛋白的提取和定量 |
| 2.7 Western Blot蛋白免疫印迹检测 |
| 2.8 Realtime-PCR检测 |
| 2.9 细胞免疫荧光 |
| 2.10 组织免疫荧光 |
| 2.11 CCK-8 |
| 2.12 Lysotracker Red和 Acridine Orange(AO)溶酶体染色 |
| 2.13 慢病毒转染 |
| 2.14 凋亡检测(TUNEL) |
| 2.15 ELISA |
| 2.16 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 矽尘暴露小鼠肺组织和AMs中 TFEB核转移增加 |
| 3.2 TFEB沉默加重CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌 |
| 3.2.1 矽尘暴露MH-S细胞中TFEB核转移增加 |
| 3.2.2 TFEB沉默慢病毒MOI及沉默效果的验证 |
| 3.2.3 TFEB沉默加重CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌 |
| 3.3 TFEB过表达减轻CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌 |
| 3.3.1 TFEB过表达慢病毒MOI及过表达效果的验证 |
| 3.3.2 TFEB过表达减轻CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌 |
| 3.4 TFEB过表达通过自噬在矽尘暴露MH-S细胞中发挥抗凋亡及炎性因子分泌的作用 |
| 3.4.1 TFEB过表达调控矽尘暴露MH-S细胞自噬相关基因的表达 |
| 3.4.2 TFEB过表达改善矽尘暴露对MH-S细胞溶酶体功能的损伤 |
| 3.4.3 TFEB过表达促进矽尘暴露MH-S细胞自噬体溶酶体结合及自噬底物的降解 |
| 3.4.4 自噬阻断剂BAF、CQ和3MA抑制了TFEB过表达在矽尘暴露MH-S细胞中的抗凋亡、抗炎性因子分泌的作用 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:海藻糖对实验性矽肺纤维化保护作用的机制研究 |
| 5 前言 |
| 6 材料和方法 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.2 主要试剂的配制 |
| 6.2.1 结晶型二氧化硅(CS)悬液 |
| 6.2.2 完全1640培养基 |
| 6.2.3 (AO)吖啶橙染液配制 |
| 6.2.4 Lysotracker Red染液配制 |
| 6.2.5 4 %多聚甲醛 |
| 6.2.6 10× Western Blot电泳缓冲液 |
| 6.2.7 10× Western Blot转模缓冲液 |
| 6.2.8 10×TBS |
| 6.2.9 免疫荧光用10×PBS |
| 6.2.10 免疫组化用10×抗原修复液 |
| 6.2.11 封闭液、抗体稀释液 |
| 6.2.12 10%APS |
| 6.3 实验动物和分组 |
| 6.4 原代小鼠肺泡巨噬细胞(AMs)提取、纯化 |
| 6.5 细胞实验及分组 |
| 6.6 蛋白的提取和定量 |
| 6.7 Western Blot蛋白免疫印迹检测 |
| 6.8 Realtime-PCR检测 |
| 6.9 免疫荧光 |
| 6.10 免疫组化 |
| 6.11 CCK-8 |
| 6.12 Lysotracker Red和 Acridine Orange(AO)溶酶体染色 |
| 6.13 慢病毒转染及m RFP-GFP-LC3 腺病毒转染 |
| 6.14 凋亡检测(TUNEL) |
| 6.15 ELISA |
| 6.16 Masson染色 |
| 6.17 羟脯氨酸含量测定 |
| 6.18 统计分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 Tre激活TFEB并调控矽肺模型小鼠肺组织和AMs细胞自噬相关蛋白的表达 |
| 7.1.1 Tre促进矽肺模型小鼠肺组织和AMs细胞TFEB入核增多 |
| 7.1.2 Tre调控矽肺模型小鼠肺组织和AMs细胞自噬相关蛋白的表达 |
| 7.1.3 Tre减轻矽肺模型小鼠肺组织和AMs细胞溶酶体损伤 |
| 7.1.4 Tre促进矽肺模型小鼠肺组织和AMs细胞自噬底物的降解 |
| 7.2 Tre减轻矽肺模型小鼠肺组织凋亡及炎症 |
| 7.2.1 Tre减轻矽肺模型小鼠肺组织凋亡 |
| 7.2.2 Tre减轻矽肺模型小鼠肺组织炎症 |
| 7.3 Tre激活TFEB并调控体外矽尘暴露MH-S细胞自噬相关蛋白的表达 |
| 7.3.1 体外MH-S细胞实验海藻糖剂量的确定 |
| 7.3.2 Tre促进体外矽尘暴露的MH-S细胞TFEB入核增多 |
| 7.3.3 Tre通过TFEB体外矽尘暴露MH-S细胞自噬相关蛋白的表达 |
| 7.3.4 Tre通过TFEB减轻体外矽尘暴露MH-S细胞溶酶体损伤 |
| 7.3.5 Tre通过TFEB促进体外矽尘暴露MH-S细胞自噬体溶酶体结合及自噬体物的降解 |
| 7.4 Tre通过TFEB减轻体外矽尘暴露MH-S细胞凋亡及炎性因子的释放 |
| 7.5 Tre减轻矽肺模型小鼠肺组织纤维化 |
| 8 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）FOXM1/lncRNA-PVT1/miR-497-5p信号轴在矽尘诱导肺纤维化中的调控机制（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.主要仪器 |
| 2.小鼠来源与饲养 |
| 3.细胞来源与培养 |
| 4.主要试剂与配制 |
| 5.实验方法与检测指标 |
| 结果 |
| 1.LncRNA-PVT1 参与TGF-β1 诱导的肺成纤维细胞活化 |
| 2.细胞质中表达丰富的LncRNA-PVT1 竞争性结合miR-497-5p |
| 3.miR-497-5p可以抑制肺成纤维细胞的活化 |
| 4.miR-497-5p能够减轻矽尘诱导的小鼠肺纤维化 |
| 5.miR-497-5p通过靶向Smad3和Bcl2 减弱肺成纤维细胞活化 |
| 6.Lnc RNA-PVT1 通过miR-497-5p调控Smad3和Bcl2 参与肺成纤维细胞活化 |
| 7.FOXM1 通过上调lncRNA-PVT1 促进肺纤维化进展 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 PVT1 基因座在疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章及获奖情况 |
| 致谢 |
四、白细胞介素Ⅰ在矽肺纤维化过程中的作用（论文参考文献）
- [1]黄芪甲苷Ⅳ通过PPM1A调控TGF-β1/Smad信号通路减轻矽肺肺损伤和纤维化[D]. 李楠楠. 山东大学, 2021(12)
- [2]基于NLRP3-IL-1β通路抑制的姜黄素治疗肺纤维化的机制探讨[D]. 宋楠楠. 山东中医药大学, 2020(01)
- [3]丹参酮IIA对矽肺肺损伤及纤维化的保护作用及机制研究[D]. 冯菲菲. 山东大学, 2020(11)
- [4]PPARγ-LXR-ABCA1信号通路对矽肺巨噬细胞泡沫化作用的研究[D]. 徐秋敏. 华北理工大学, 2020(02)
- [5]Ac-SDKP对巨噬细胞活化的调控在抑制矽肺纤维化中的作用[D]. 李丹. 华北理工大学, 2020(02)
- [6]大黄?虫丸基于TGF-β1/Smad信号通路抑制矽肺纤维化的作用机制研究[D]. 吴丽娟. 成都中医药大学, 2020(02)
- [7]黄根多糖的提取分离及其抗矽肺纤维化的研究[D]. 陆青兰. 右江民族医学院, 2020
- [8]转录因子EB在实验性矽肺中的作用及海藻糖对实验性矽肺纤维化保护作用的机制研究[D]. 何秀. 中国医科大学, 2020(01)
- [9]FOXM1/lncRNA-PVT1/miR-497-5p信号轴在矽尘诱导肺纤维化中的调控机制[D]. 李艳. 南京医科大学, 2020(06)
- [10]间充质干细胞源外泌体干预矽肺纤维化的研究进展[J]. 师晓栋,于丽佳,张岩松. 中华劳动卫生职业病杂志, 2020(04)