一、鼻咽癌的基因改变和EB病毒感染（论文文献综述）
桂勋[1]（2014）在《鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究》文中研究说明鼻咽癌是我国南部地区及东南亚常见的恶性肿瘤之一,给人类健康及经济稳定造成了极大的危害。由于鼻咽癌发生部位的解剖结构较复杂,不易于手术治疗,而且对化学药物不敏感,因此,当前鼻咽癌的治疗主要依赖放射治疗。目前的临床放射治疗对早期鼻咽癌治愈效果可达90%以上,但由于缺乏有效的早期诊断方法,大部分鼻咽癌患者被确诊时都接近中、晚期,错过了放射治疗的最佳时机,导致了患者五年生存率的大大降低。因此,寻找适合鼻咽癌早期诊断的血清学诊断标志物已成为目前鼻咽癌临床与基础研究的一个重要研究方向。此外,经初次放射治疗后的鼻咽癌患者,部分容易出现复发,部分容易出现远端转移,且对放射治疗不再敏感,此类复发或转移患者的预后生存率极低,因此,寻找适合易复发或易转移鼻咽癌患者个性化诊断的血清学标志物并探索适合鼻咽癌治疗的生物治疗靶标也日渐成为重要的鼻咽癌研究方向。为此,本研究针对鼻咽癌的早期诊断、个性化诊断以及治疗性抗体药物研发等三部分进行有意义的前期探索。本论文的第一部分旨在寻找高特异性的鼻咽癌诊断标志物,建立鼻咽癌的血清学早期诊断方法及组织学特异性检测工具。鼻咽癌的发生及发展过程与EB病毒的感染密切相关,EB病毒相关标志物已被用于开发鼻咽癌临床诊断试剂,如EBNA1/IgA、VCA/IgA等,此类标志物对鼻咽癌的早期筛查有很好的检测灵敏度,但特异性尚达不到临床检测的要求。鉴于EB病毒主要以II型潜伏态的形式存在于鼻咽癌细胞中,本研究拟以EB病毒II型潜伏态特异性表达蛋白LMP1、LMP2A及BARF1为研究对象,探索此类标志物应用于鼻咽癌早期筛查的可能性。首先,利用原核表达的方式制备了 LMP1、LMP2A不同亲水区基因及BARF1全长基因的重组蛋白,并分别用于检测鼻咽癌患者及健康人血清中针对上述三种抗原的IgA及IgG抗体水平,结果发现,仅鼻咽癌患者血清中抗LMP1第3个胞外区（LMP1-EX3）的IgA抗体和抗LMP2A第5个胞外区（LMP2A-EX5）的IgA抗体水平显着高于健康人,提示LMP1-EX3/IgA和LMP2A-EX5/IgA有望成为鼻咽癌特异诊断的标志物;其次,利用LMP1羧基端重组蛋白（rLMP1-C.ter,aa187-aa386）及LMP2A氨基端重组蛋白（rLMP2A-N.ter,aal-aa119）免疫BALB/c小鼠,分别制备了抗LMP1-C.ter单抗25株和抗LMP2A-N.ter单抗16株,Western blot及免疫荧光的鉴定结果显示,抗LMP1-C.ter单抗14B6和5H8对过表达LMP1的293T细胞有反应,抗LMP2A-N.ter单抗13A12和12A 2对过表达LMP2A的293T细胞有反应,提示这些单抗能识别天然构象的EB病毒表达抗原,有望成为鼻咽癌检测的研究工具;最后,选取抗LMP1-C.ter单抗代表株14B6和抗LMP2A-N.ter单抗代表株13A12,分别测试它们在免疫组化实验中对临床鼻咽癌患者组织切片的检测效果,结果显示,上述两个单抗对鼻咽癌组织切片有良好的免疫组化活性和特异性,有望成为鼻咽癌临床组织学诊断工具。综上,本研究发现EB病毒的潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2A是两个重要的鼻咽癌特异性诊断标志物,其一是证明LMP1-EX3/IgA及LMP2A-EX5/IgA可用于建立适合鼻咽癌血清学特异筛查的免疫诊断试剂,其二是证明LMPI单抗14B6及LMP2A单抗13A12可用于建立适合鼻咽癌组织学特异诊断的免疫组化检测试剂,这些发现为研究EB病毒潜伏期膜蛋白在鼻咽癌发生发展中的作用机制和临床诊断意义奠定良好的工作基础。本研究的第二部分旨在寻找适合鼻咽癌个性化诊断的标志物,探索研制易复发或易转移性鼻咽癌的早期诊断试剂的可能性。尽管当前放射治疗对原发性鼻咽癌已取得很好的治疗效果,但仍有15-58%的患者预后容易复发或转移,并产生放疗抗性,此类病人的再次治疗的预后很差,成为鼻咽癌临床治疗中的一个难点。因此,研究适合复发性鼻咽癌早期诊断用的诊断标志物,有助于高度个性化治疗方案的制定,对提高复发性鼻咽癌的治疗效果具有重要意义。文献报道EB病毒II型潜伏态BARTs区的转录产物与鼻咽癌的发生发展密切相关,可能与鼻咽癌预后发展有关。为此,本研究拟以EB病毒II型潜伏态BARTs区的转录产物A73为研究对象,探索其作为鼻咽癌个性化诊断标志物的可能性。首先,利用原核表达方式制备了高纯度的A73重组蛋白rGST-A73-NP9,并用于检测鼻咽癌患者血清中抗A73的IgA及IgG抗体水平,结果发现,A73/IgA的检测值可以将鼻咽癌患者分成两类,提示A73/IgA是一个不同类型鼻咽癌的分类诊断靶标;其次,利用rGST-A73-NP9免疫BALB/c小鼠,制备了抗A73的特异性单抗18株,并采用Western blot及免疫荧光方法证明A73单抗6A2对过表达A73的293T细胞有良好反应,提示A73单抗能识别自然状态下的A73抗原,为利用A73单抗研究A73表达产物提供了有用的研究工具;然后,利用单抗6A2分别对EB病毒感染的淋巴细胞系B95-8及上皮细胞系C666-1进行了 Western blot及免疫荧光的检测,结果显示,在这两种传代细胞系中均未检测到A73蛋白的表达,但在部分鼻咽癌组织中检测到A73蛋白的存在,提示A73蛋白有可能作为一个鼻咽癌分类诊断用的免疫组化检测靶标;最后,通过分离鼻咽癌细胞系C666-1细胞培养上清及鼻咽癌患者血清中的外泌体,用RT-PCR检测方法首次在外泌体中发现了 A73 mRNA的存在,提示鼻咽癌细胞中高表达的A73 mRNA很可能通过外泌体的方式转运至胞外,而此种转运方式和鼻咽癌患者血清中A73 mRNA的水平可能与鼻咽癌的复发和转移有关。综上,可能存在A73高表达和低表达两种鼻咽癌类型,而此两种鼻咽癌的转归结果是否存在差异还需要进一步鉴定。本研究的第三部分是研究LMP1和LMP2A抗体治疗鼻咽癌的效果探索LMP1及LMP2A作为鼻咽癌抗体治疗靶标的可行性。抗体药物由于具有毒副作用小及特异性强等特性,在肿瘤的治疗上表现出了明显的优势。LMP1及LMP2A是EB病毒在鼻咽癌细胞中表达的膜蛋白,具有很强的肿瘤组织表达特异性,而且在肿瘤的发生及发展过程中起重要作用,本研究拟通过实验证明其作为鼻咽癌抗体治疗靶标的潜在可能性。首先,基于鼻咽癌细胞系CNE-2Z构建了同时表达虫荧光素酶的LMP1及LMP2A稳定表达细胞株CNE-2Z-Luc-LMP1及CNE-2Z-Luc-LMP2A;其次,通过以白喉毒素为载体的展示肽免疫BALB/c小鼠,分别制备了抗LMP1-EX3特异性单抗25株及抗LMP2A-EX5特异性单抗6株,并用Western blot及免疫荧光检测方法证明抗LMPI-EX3单抗14H5和12AI与过表达LMP1的293T细胞有反应,抗LMP2A-EX5单抗5E9和7H3与过表达LMP2A的293T细胞有反应,在此基础上鉴定出LMP2A-EX5单抗所识别的线性B细胞表位382SLSSTEFIP390;最后,用肿瘤细胞体外生长抑制实验评估了抗LMP1-EX3单抗及抗LMP2A-EX5单抗对鼻咽癌细胞系CNE-2Z-Luc-LMPI及CNE-2Z-Luc-LMP2A的生长抑制效果,结果显示抗LMP1-EX3单抗2B8、5D4及7G9,抗LMP2A单抗5E9及7H3在体外对鼻咽癌细胞系有很好的生长抑制活性,从而初步证明LMP1-EX3及LMP2A-EX5作为鼻咽癌抗体治疗靶标的可行性。总之,本论文针对EB病毒II型潜伏态的基因转录产物进行鼻咽癌诊断靶标及治疗靶标的的探索研究,发现LMP1-EX3及LMP2A-EX5是很好的鼻咽癌诊断及治疗靶标,还发现A73是一个潜在的鼻咽癌个性化诊断靶标,为研制鼻咽癌特异性早期诊断试剂和鼻咽癌治疗性抗体药物奠定了基础。
王红[2]（2018）在《鼻咽癌患者来源EB病毒感染树鼩动物模型的构建》文中研究指明作为一种致瘤病毒,EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）与多种肿瘤的发生密切相关,如:伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、肺癌、胃癌等。然而,EBV参与鼻咽癌发生发展的机制研究尚未明确,其因在于缺乏有效的细胞和动物模型。虽然目前已利用新世界猴、SCID小鼠、转基因动物和兔子、豚鼠等动物构建EBV相关动物模型,但因受限于感染率或动物机体的非自然免疫状态,仍未探明EBV参与NPC发生发展的机制。因此,急需寻找一种高感染率的具有正常机体免疫力的动物构建EBV感染的动物模型。在本课题组前期研究中,已证实机体免疫正常的树鼩可用于构建B95-8细胞系来源的EBV感染的动物模型,感染率可达80%,证实树鼩具有构建EBV感染的动物模型的潜力。因此,本实验希望能利用树鼩构建鼻咽癌患者来源的EBV感染的动物模型。首先,利用鼻咽癌患者来源EBV感染树鼩,拟构建EBV感染的树鼩动物模型,旨在探究人源性EBV感染树鼩的可能性。然后,通过摸索接种剂量,构建长期感染的动物模型,探讨EBV在树鼩内形成感染的时间及感染阶段分类等。再者,通过对BARF1基因片段进行测序和分析,以期阐明EBV分株与亚型。最后,应用环磷酰胺叠加EBV感染因素探索是否可诱导树鼩体内形成肿瘤。总之,本课题希望能通过一系列基础研究为后续开发抗EBV感染的药物和疫苗、研究EBV感染和致瘤机制、深入研究EBV与鼻咽癌发生发展的关系等提供依据。方法:1、鼻咽癌患者来源的EBV状况探索:收集10例血清EBVCA-IgA和EBNA-IgA为阳性的鼻咽癌患者的鼻咽部组织、抗凝外周血和不抗凝外周血,分别用于提取组织悬液、单个核细胞（PBMC）和血清。提取DNA后,利用qPCR方法检测各样品中的EBV DNA拷贝数。同时,使用透射电镜观察3类生物样本中是否有EBV病毒颗粒,再用免疫电镜技术验证。2、树鼩感染EBV需要的EBV DNA拷贝数探究:根据方法1的结果,将获取的鼻咽癌组织悬液按照EBV DNA拷贝数稀释成2×106 copies/μl、2×104 copies/μl、2×102 copies/μl、2×100 copies/μl。设置A-D四个实验组,每组5只树鼩,E组为对照组,含2只树鼩。实验组树鼩通过喷鼻的方式各接种100μl EBV混悬液,对照组给予同等剂量生理盐水喷鼻。每周为各组树鼩抽血,检测其感染程度。在连续观察2个月后,使用免疫抑制剂—环磷酰胺,按照20mg/Kg进行腹腔注射,连续观察3周评估感染效果。3、长期EBV感染树鼩模型的构建和观察:设置实验组树鼩10只,对照组3只。将鼻咽癌患者来源的含EBV病毒混悬液通过喷鼻方式感染实验组树鼩,对照组喷鼻同等体积的生理盐水,定期用qPCR、RT-PCR、ELISA的方法监测所有树鼩外周血PBMC中EBV DNA拷贝数变化、EBV相关基因片段的表达、血清EBVCA-IgG水平。通过对死亡树鼩的器官组织行免疫组织、Western blot和原位杂交检测,了解EBV相关蛋白和EBERs的表达情况。4、BARF1基因测序:采用RT-PCR和cDNA扩增产物基因测序等方法,对BARF1基因进行检测,并参照已发表的文献中人类疱疹病毒4型（HHV-4）、鼻咽癌EBV病毒株（HNNPC1-9）、淋巴瘤病毒株（B95-8）、胃癌病毒株（Akata-GC1）等序列,对所得序列结果进行比对分析,以寻找树鼩被感染的病毒基因型。5、应用环磷酰胺叠加EBV感染探索体内成瘤方法:通过对实验组树鼩连续应用环磷酰胺1周后,饲养3月处死动物。经石蜡包埋和病理切片后,HE染色观察实验组和对照组树鼩的鼻咽部和器官是否有肿瘤形成;免疫组化染色和原位杂交等方法,检测EBV相关蛋白和EBERs在树鼩组织中的表达。结果:1、NPC组织中EBV DNA拷贝数含量最高,可观察到EBV颗粒。通过鼻咽癌组织、外周血单个核细胞和血清三类生物样本的PCR检测,三者的EBV DNA拷贝数分别是（14.3±5.41）×107、（1.58±1.04）×104、（11.6±2.96）×102 copies/DNA,可知鼻咽癌组织中EBV DNA拷贝数的含量最高;透射电镜可观察到疱疹病毒样颗粒存在在7份NPC患者的生物样本中,免疫电镜可观察到8例患者的生物样本中EBV颗粒存在。2、本次实验中获得的树鼩感染EBV需要的EBV DNA拷贝数临界值为2×102 copies。通过对A-D四组树鼩外周血中BamHI-W、BZLF1、BARF1、BHRF1、LMP1、EBNA1等EBV相关基因片段的RT-PCR技术检测和分析可知,A组和B组中的10只树鼩均获得EBV感染,且出现感染的时间早,表达的目的指标强。虽然C组中2只树鼩被EBV感染,但是它们外周血中早期EBV相关指标表达不明显,仅在第2个月末对该组所有存活树鼩行免疫抑制后,逐渐出现BamHI-W片段的表达,第9周达到最强。同样地,在使用环磷酰胺后,A组和B组均可检测到多个EBV相关片段的表达,而D组和对照组始终未见表达。EBVCA-IgG的表达变化情况与体内EBV相关基因片段的表达情况密切相关。因此,可以知道树鼩被EBV感染需要的EBV DNA拷贝数临界值为2×102 copies;而通过2×104 copies接种的B组树鼩表现出较好的感染效果;环磷酰胺的使用可以促使EBV从潜伏感染状态转变为裂解感染。3、树鼩可被鼻咽癌患者组织、PBMC和血清来源的EBV长期感染,并且最终可形成树鼩体内的裂解感染和潜伏感染同时存在的状态。通过10个月的长期观察和监测,取树鼩外周血DNA和RNA分别进行qPCR和RT-PCR检测结果进行分析,可知该组树鼩均被EBV感染,在不同时期伴随EBV相关基因片段BARF1、BHRF1、LMP1和EBNA1的表达。随着树鼩体内EBV DNA拷贝数的变化,EBVCA-IgG的水平也随之发生明显改变。有趣的是,根据RT-PCR结果对EBV感染阶段进行分析可知,可在树鼩体内检测到裂解基因（BARF1和BHRF1）和潜伏基因（LMP1和EBNA1）的表达,可判断在这些树鼩体内同时存在潜伏感染和裂解感染。免疫组化检测EBNA1、EBNA2和LMP1可在树鼩鼻咽部组织表达;Western Blot可检测到EBNA1和EBNA2蛋白在脾脏和/或肝脏组织中表达。原位杂交可在脾、肝、肺和胃组织中检测到EBERs。4、基因测序结果:通过对第三章长期感染树鼩的RT-PCR结果进行深入分析,明确EB病毒早期基因BARF1在整个观察群体和观察周期中表达最佳,比EBNA1、LMP1和BHRF1基因能更好地代表EB病毒在树鼩体内的感染状态。因此选择BARF1进行下一步测序工作。基因测序结果显示送检的BARF1基因序列可与EB病毒的亚型毒株比对,间接证实树鼩被EB病毒感染。另外,通过基因系统进化树分析可知B1、B3、B6和B8号树鼩感染的EB病毒更接近于HHV-4代表的EB病毒亚型,B5、B7和B9号树鼩则更倾向于标准亚型序列之外的EB病毒亚型,B2和B10两组接近于HNNPC1亚型。5、EBV感染叠加环磷酰胺因素诱导树鼩动物模型体内成瘤方法初探:通过环磷酰胺的应用,在实验组8只树鼩的鼻咽部HE染色切片中,有6例发现存在炎性改变,出现淋巴细胞、浆细胞浸润,但是尚未观察到鼻咽部上皮细胞的异型增生或恶变。环磷酰胺的应用可对脾和肝中的EBERs表达有促进作用,对肺和胃组织中的EBERs表达无明显作用。另外,尚未发现树鼩鼻咽部上皮下淋巴滤泡中有EBERs阳性信号表达。通过免疫组化检测,可观察到EBNA1、LMP1、EA和BZLF1在实验组和对照组的鼻咽部、脾脏、肝脏、肺部和胃部出现不同程度的表达,证实不论是否应用环磷酰胺,EBV感染的树鼩体内均可同时表达EB病毒潜伏感染和裂解感染的相关蛋白,说明机体一旦感染EB病毒,可能会同时存在潜伏感染和裂解感染两种状态,这为进一步探究EB病毒在机体内的存在状态提出新的观点。结论:根据透射电镜和免疫电镜结果提示在鼻咽癌患者体内存在完整EBV颗粒。树鼩可被鼻咽癌患者来源的EBV感染,间接证实鼻咽癌患者组织中含有具有EBV颗粒。树鼩接受EBV感染的最小EBV DNA拷贝数为2×102copies,而当树鼩接受EBV DNA拷贝数为2×104 copies的EBV液喷鼻感染时,可以达到较好的感染效果。鼻咽癌患者的肿瘤组织、外周血单核细胞和血清来源的EBV均具有感染树鼩的能力,通过长达10个月的观察,树鼩机体对EBV产生的各项证据均体现出我们成功构建鼻咽癌患者来源的EB病毒感染的树鼩动物模型,为后续研究抗病毒感染的疫苗、药物、深入探索EBV与鼻咽癌发生发展的关系与机制提供依据。通过对BARF1基因片段测序,对BARF1基因片段序列进行分析,为深入研究广西鼻咽癌中EBV亚型的探索打下基础。通过对EBV感染叠加环磷酰胺因素诱发树鼩体内成瘤的方法探索,虽然在未观察到组织结构异型或细胞核异型等恶变现象,但是实验结果证实了通过叠加应用环磷酰胺可促进EBV在树鼩脾脏的潜藏,受EBV感染的B细胞可随血流迁移到肝脏,可到达鼻咽部、肺部和胃部引起炎症性病变。这些发现可为后期深入研究EBV的感染特性、EBV的致瘤机理等提供了依据。
陈胜利[3]（2014）在《EB病毒感染猪淋巴细胞的研究》文中进行了进一步梳理背景EB病毒（epstein-barr virus）又称人类疱疹病毒（Human herpesvirus4（HHV-4））。EB病毒主要感染人类B淋巴细胞和口咽上皮细胞,EB病毒与淋巴瘤、鼻咽癌以及胃癌的发生发展息息相关。鼻咽癌又称广东癌,具有明显的地域性。中国的鼻咽癌患者占世界的80%,而且集中在广东一带,特别是在珠江三角洲、西江流域一带。而欧美国家则较为少见；鼻咽癌可分为高分化型鼻咽癌、低分化型鼻咽癌和未分化型鼻咽癌。其中中国患者以低分化型或未分化型鼻咽癌为主,而欧美国家主要是以高分化型鼻咽癌为主。在绝大多数的低分化型和几乎所有的未分化型的鼻咽癌的活检组织中可发现EB病毒。然而在高分化型的鼻咽癌活检组织中EB病毒却较为少见。EB病毒与淋巴瘤之间的关系研究已经越来越清楚。EB病毒进入B淋巴细胞的途径使通过CR2介导的。CR2分为膜内部分、跨膜部分和膜外部分,其中膜外部分是有15-16个短共有重复序列（SCR1-16）组成。EB病毒与人CR2结合的关键区域是人CR2上的SCR1-2与EB病毒的gp350结合。然而EB病毒与鼻咽癌之间的关系依然存在着许多问题有待解决。目前对于EB病毒到底进入鼻咽上皮细胞的具体途径还不清楚,在细胞水平上研究发现,EB病毒可以通过游离EB病毒形式直接感染鼻咽上皮细胞,也可以是感染EB病毒的淋巴细胞与鼻咽上皮细胞通过细胞与细胞接触形式感染鼻咽上皮细胞,而且这个途径EB病毒感染效率远高于直接感染途径。从第二种EB病毒感染鼻咽上皮细胞的途径,目前提出了一种鼻咽癌发生发展假说：EB病毒首先感染B淋巴细胞,人的鼻咽部组织中有丰富的淋巴组织,这样使得感染EB病毒的淋巴细胞与鼻咽上皮细胞接触,从而使鼻咽上皮细胞感染EB病毒。再经过多次的基因突变,最终发展为鼻咽癌细胞。EB病毒对鼻咽癌发生发展起到重要作用,但仍然有许多问题有待解决,目前认为EB病毒的LMP1、LMP2A等基因对鼻咽癌发生发展起到重要作用,其中LMP1已被确认为是一种癌基因。由于鼻咽癌发生的解剖部位隐匿,且鼻咽癌具有明显的区域性,在国际上研究相对较少,这造成目前鼻咽癌的发生发展有许多问题有待解决。这样,构建EB病毒相关的鼻咽癌动物模型对于研究EB病毒与鼻咽癌之间的关系,以及EB病毒在鼻咽癌的发生发展所起到的作用具有重要的意义。目前的鼻咽癌动物模型主要是以小鼠的鼻咽癌模型为主,然而鼻咽癌的猪动物模型还未曾有相关的报道。而且猪的鼻咽癌动物模型相对小鼠鼻咽癌动物模型有几大优势：1、有文献报道猪能够得自发性鼻咽癌。然而,未见小鼠自发性鼻咽癌的报道。2、猪与人之间在遗传水平上的同源性相对比小鼠的同源性更高。3、猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类相近。4、由于解剖结构的原因（小鼠鼻咽部较较为狭窄,成瘤之后容易引起窒息而死）猪的鼻咽癌模型比小鼠鼻咽癌模型在成瘤后生存时间更长。在构建猪鼻咽癌模型前需要先了解EB病毒与猪的亲和性。首先我们知道人淋巴细胞对EB病毒的亲和力比人鼻咽上皮细胞对EB病毒的亲和力更高,并且可以在体外用EB病毒诱导人外周血B淋巴细胞转化为永生化的B淋巴母细胞,而且目前认为EB病毒感染鼻咽上皮细胞是通过感染EB病毒的淋巴细胞通过与鼻咽上皮细胞间接触而感染；其次是猪外周血淋巴细胞相对鼻咽上皮组织取材更加容易。所以本文通过用EB病毒在体外感染猪外周血淋巴细胞,观察是否使猪淋巴细胞感染EB病毒,是否可以使猪淋巴细胞转化为永生化淋巴母细胞。来研究EB病毒对猪的亲和性。从而对构建EB病毒相关的猪鼻咽癌动物模型起到一定的指导意义。研究方法第一部分：EB病毒感染猪淋巴细胞1、从B95-8细胞株（EB病毒转化的绒猴淋巴细胞）中提取EB病毒。2、所提取的EB病毒分别感染猪、人外周血淋巴细胞以及小鼠脾脏淋巴细胞（研究表明EB病毒能够再体外转化人淋巴细胞,设为阳性对照；EB病毒不能在体外转化小鼠淋巴细胞,设为阴性对照）：首先用人淋巴细胞分离液分别从猪、人外周血淋巴细胞中分离出猪淋巴细胞和人淋巴细胞,以及用小鼠淋巴细胞分离液从小鼠脾脏研磨液中分离出小鼠淋巴细胞；然后再用EB病毒分别感染猪、人、小鼠淋巴细胞,此为实验组。未用EB病毒感染的猪、人、小鼠淋巴细胞为对照组；将实验组和对照组在同等条件下培养30天,在第1、4、7、10、13、16、19、22、25、28天的时候通过镜下观察各个实验组和对照组细胞的转化情况。提取DNA,检测EB病毒的感染情况。3、构建CR2的表达载体,通过lipofectamine2000将CR2表达载体转入到猪和小鼠的淋巴细胞上。4、EB病毒感染人淋巴细胞和表达CR2的猪淋巴细胞和小鼠淋巴细胞,此为实验组；EB病毒感染转染空载体的猪淋巴细胞和小鼠淋巴细胞为对照组1；无EB病毒感染的猪、人、小鼠淋巴细胞为对照组2。；细胞培养与EB病毒检测方法同第3步。第二部分：生物信息学对人、猪、鼠的CR2的分析1、从NCBI中搜索出人CR2、猪CR2和鼠CR2的相应的cDNA序列和氨基酸序列。并且分别对人与猪、人与鼠的CR2的cDNA序列以及氨基酸序列进行比对两两比对,来分析人与猪、人与鼠的CR2在cDNA和氨基酸序列上的差异；2、根据所检索的人CR2、猪CR2和鼠CR2的氨基酸序列,对相应的蛋白质的三维空间结构的结构预测。3、EB病毒与人CR2结合关键区域：人CR2的SCR1-2和EB病毒的gp350。从NCBI中搜索SCR1-2和gp350的氨基酸序列；并且通过BLAST找出猪CR2和鼠CR2与人SCR1-2的同源序列。4、根据所得到的猪CR2和鼠CR2与人SCR1-2的同源序列、人SCR1-2、gp350的氨基酸序列,进行相对应的蛋白质的三维空间结构的结构预测,并且找出结合的关键位点,以及找出为什么猪CR2和鼠CR2不能介导EB病毒。第三部分：EB病毒感染鼻咽癌细胞。1、EB病毒通过两种途径感染鼻咽癌细胞株：选取两种鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2。用游离EB病毒直接感染CNE1和CNE2,此为实验组1；用B95-8细胞株分别和CNE1、CNE2共培养的接触感染途径,此为实验组2；并且设立对照组,即没有EB病毒感染的CNE1和CNE2。2、上述的CNE1/CNE2的实验组1、实验组2和对照组进行细胞培养2周之后,采用PCR和Q-PCR方法检测CNE1/CNE2各组的细胞EBNA1基因,用来反映EB病毒感染情况；3、检测感染后的细胞增殖,迁移能力：2周之后,收集细胞,用平板克隆形成实验来检测细胞的增殖能力、用细胞生长曲线实验来检测细胞的增殖能力；并且用划痕实验来检测细胞的迁移能力。结果1、EB病毒能够感染人淋巴细胞,并使入淋巴细胞转化,而不能感染猪、小鼠淋巴细胞EB病毒感染人淋巴细胞第13天出现克隆生长,并且可以多次传代仍然保持克隆生长,说明人淋巴细胞转化成功。PCR检测EBNA1为阳性；猪未出现克隆生长,但猪淋巴细胞聚集现象明显。PCR检测EBNA1为阴性；小鼠未出现克隆生长,但小鼠淋巴细胞未见聚集现象,贴壁现象明显。PCR检测EBNA1为阴性。2、成功构建人CR2（hCR2）表达载体用PCR方法从pMD18-T-CR2载体上获取带BglⅡ和SalI限制性内切酶序列的CR2片段,将回收的CR2片段连接到用上述限制性内切酶酶切后的pEGFP-N1质粒上,对酶切鉴定正确的质粒进行测序,测序结果NCBI中进行blast比对结果是正确的。3、猪和小鼠淋巴细胞在转染hCR2之后,能够被EB病毒感染用hCR2转染猪和小鼠淋巴细胞,再用EB病毒感染,western blot和Q-PCR检测hCR2,结果为阳性,说明转染成功；western blot和Q-PCR检测EBNA1,结果为阳性,说明EB病毒能够感染转染hCR2的猪和小鼠淋巴细胞。4、信息学分析人CR2与猪CR2和鼠CR2存在差异通过BLAST比对发现人CR2与猪CR2、人CR2与鼠CR2在cDNA和氨基酸序列上存在差异；完整的人CR2、猪CR2、鼠CR2蛋白质三维空间结构存在差异；人CR2与EB病毒结合的关键区域SCR1-2的七个关键氨基酸当中,小鼠CR2与人SCR1-2同源比对中关键结合位点Arg-89对应氨基酸为Lys；而猪CR2与人SCR1-2同源比对中关键结合位点Lys-41对应氨基酸为Arg。5、EB病毒通过细胞共培养途径感染鼻咽癌细胞效率高于EB病毒直接感染途径。EB病毒通过细胞共培养途径和直接感染途径分别感染CNE1和CNE22周后,用western blot和Q-PCR检测EBNA发现共培养途径感染效率高于EB病毒直接途径。结论1、EB病毒在正常情况下能够通过CR2感染人淋巴细胞,但是不能感染猪、小鼠淋巴细胞2、猪和小鼠淋巴细胞在转染hCR2之后,能够被EB病毒感染。3、人CR2与猪CR2和鼠CR2存在差异；小鼠CR2不被EB病毒感染可能是与人SCR1-2同源比对中关键结合位点Arg-89对应氨基酸为Lys；而猪CR2不被EB病毒感染可能是与人SCR1-2同源比对中关键结合位点Lys-41对应氨基酸为Arg。4、EB病毒接触感染方式使EB病毒感染CNE2/CNE2的效率高于EB病毒直接感染。
刘真,温晗光,陈缪安[4]（2017）在《X射线交错互补修复基因1多态性和EB病毒感染对鼻咽癌细胞基本特性的影响》文中研究说明目的探讨X射线交错互补修复基因1（X-ray repair cross-complementing gene 1,XRCC1）多态性与EB病毒感染对鼻咽癌细胞基本特性的影响。方法将鼻咽癌细胞株分组,使之分别表达不同的XRCC1基因型,转染EB病毒,比较转染前后不同基因型鼻咽癌细胞的基本特性,并检测XRCC1蛋白的表达水平。结果 XRCC1不同基因型的鼻咽癌细胞之间基本特性无明显差异,XRCC1蛋白水平无差异。EB病毒感染后,各组鼻咽癌细胞生长加快、增殖能力变强、迁移速度加快、凋亡率降低,XRCC1蛋白水平无明显改变。EB病毒感染后,194位点突变型的鼻咽癌细胞与280、399位点突变型细胞相比,细胞增殖和迁移能力改变程度较小,差异有统计学意义。其他基因型细胞基本特性及XRCC1蛋白水平无差异。结论 EB病毒感染可增加鼻咽癌易感性,EB病毒感染后XRCC1 194位点的Trp突变型基因可能对鼻咽癌有保护作用。
姚孟薇[5]（2016）在《鼻咽癌上皮细胞EB病毒感染模型的构建及其相关基因的筛选》文中提出目的:通过EBV颗粒直接感染以及与携带EBV的霍奇金淋巴瘤细胞KMH2共培养两种方式,筛选并建立适宜的EBV感染鼻咽癌细胞系模型。进而通过该模型利用转录组测序技术检测分析鼻咽癌细胞体外感染EBV前后时间序列的差异表达基因,为进一步探讨EBV感染上皮细胞的分子机制奠定基础。方法:通过AGS-EBV-GFP细胞制备EBV-GFP,并建立EBV阳性的KMH2细胞株,用制备的EBV颗粒直接感染鼻咽癌细胞及用携带EBV的KMH2细胞与鼻咽癌细胞直接接触共培养方式,筛选适宜的鼻咽癌细胞EBV 感染模式;通过 KMH2-EBV 细胞与 HONE1、CNE1、CNE2、HK1 四株鼻咽癌细胞株分别直接接触培养,用Realtime-PCR检测各个细胞株的感染率,筛选感染率最高的细胞株构建鼻咽癌细胞EBV感染模型。然后采用RNA-Seq测序技术检测、比较分析共培养前、后HONE1 3d、5d、7d的细胞表达差异基因,运用生物信息学技术对测序所得结果进行分析。采用Realtime-PCR验证转录组测序数据候选基因。结果:1.通过携带EBV-GFP的KMH2与鼻咽癌细胞接触共培养方式,成功构建EBV感染的鼻咽癌细胞模型,其共培养条件下EBV感染效率明显高于EBV颗粒直接感染模式;2.转录组测序数据分析结果表明共培养前、后HONE1细胞的基因表达存在显着差异;3.GO功能显着富集的差异基因在EBV最初感染阶段主要涉及细胞免疫反应、抗原递呈、脂筏转运、细胞粘附等。随着感染推移,GO差异基因主要集中于于囊泡介导的转运、细胞内转运、代谢过程、大分子修饰等方面,而参与抗原递呈、免疫反应、凋亡过程、细胞死亡的基因大多数下调;4.KEGG数据库对差异表达基因Pathway功能富集分析主要集中于Phagosome、Focal adhesion、Herpes simplex infection、PI3K-Akt signaling pathway、Endocytosis等;5.在突变类型分析中,HONE1、HONE1 3d、HONE1 5d、HONE1 7d分别共获得12066、12185、11916、12267个SNP位点和2407、2678、2361、2695个INDEL位点,且突变类型以颠换为主,较多的突变类型发生在3’-UTR区。综合考虑共培养前后突变差异位点,共获得630个SNP位点及115个INDEL位点;6.Realtime-PCR方法验证2个差异表达基因,其差异表达倍数关系与表达谱测序结果总体趋势相一致,且在EBV感染的KMH2细胞及PBMC中,2个基因表达均上调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.成功构建了鼻咽癌EBV感染细胞模型;2、建立体外EBV感染鼻咽癌细胞的差异基因表达谱,发现EBV感染前后的宿主细胞基因表达模式存在明显差异;3.测序结果表明EBV感染鼻咽癌细胞是一个多基因参与,多条通路涉及、病毒与宿主基因相互作用的过程。KEGG数据库对差异表达基因进行Pathway功能富集分析,推测EBV主要通过粘附、内吞等途径进入细胞。
郑瑛[6]（2012）在《乳铁蛋白干扰EB病毒与宿主细胞的结合及抑制EB病毒感染性炎症的机制》文中研究说明乳铁蛋白（Lactoferrin, LF）是一种铁结合糖蛋白,属于转铁蛋白家族。乳铁蛋白主要由粘膜上皮细胞和多形核淋巴细胞产生,并分泌到乳汁、唾液、鼻腔粘膜分泌物、泪液、肠粘液、生殖道分泌物中。乳铁蛋白的生理功能广泛,包括维持铁稳态、广谱抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等。作为一种天然免疫分子,乳铁蛋白在预防病原微生物感染和抑制过度炎症反应方面发挥关键作用。EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）在人类广泛传播,是单核细胞增多症的病因,并与多种肿瘤的发生密切相关,如霍奇金病、伯基特淋巴瘤和鼻咽癌。EBV具有明显的亲B细胞嗜性。EB病毒能够选择性地黏附到B细胞表面,主要是通过病毒包膜糖蛋白与B细胞表面CD21分子（EB病毒的受体）之间的交互作用；进入细胞之后,EB病毒可使B细胞永生化。上皮细胞中也可检出EB病毒,其是潜在的致癌因素。新近研究发现,EBV能直接感染单核／巨噬细胞等多种免疫细胞,诱导细胞产生大量的炎症因子,在早期可起到抗感染作用,但过度的炎症反应可对器官造成损伤。我们的前期研究对18个湖南鼻咽癌高发家系进行了单体型分析和连锁分析,发现染色体3p21为鼻咽癌易感基因区；进一步搜索和鉴定位于此区域的抑癌基因,发现编码乳铁蛋白的LF基因是重要的候选者。利用鼻咽癌组织芯片和酶联免疫吸附实验,我们发现乳铁蛋白在鼻咽癌组织中表达显着下调或缺失,其表达水平与患者血清中的EBV VCA-IgA滴度呈负相关。我们推测,乳铁蛋白的缺失或表达下调增加了EB病毒感染的几率,并加重EB病毒感染导致的局部组织损伤。研究表明乳铁蛋白能抑制多种病毒的感染,如HCMV、HSV-1、HSV-2、HIV、HBV、HCV等。乳铁蛋白抗病毒感染的机制主要是通过其与病毒颗粒直接结合或者与靶细胞上病毒受体结合,阻止病毒吸附并进入宿主细胞。乳铁蛋白还可抑制多种病毒所致的炎症反应。但目前,仍没有乳铁蛋白抗EB病毒感染及抑制EB病毒感染性炎症的报道。本研究中,我们发现乳铁蛋白具有抗EB病毒感染和抑制EB病毒感染性炎症反应的功能,并阐明了其作用机制。1.乳铁蛋白通过竞争性结合B细胞表面分子CD21,阻止EB病毒吸附并进入B细胞在病毒黏附实验中,利用免疫荧光和细胞流式术,我们发现乳铁蛋白预处理B细胞可部分抑制EB病毒与B细胞结合。定量-PCR和荧光原位杂交（FISH）证实乳铁蛋白能抑制EB病毒进入至B细胞内。EB病毒感染B细胞主要是通过EB病毒包膜糖蛋白gp350与B细胞表面CD21分子结合介导的。乳铁蛋白表面带大量正电荷,可与多种生物大分子结合。其主要抗病毒机制之一是：与病毒受体结合以封闭病毒在靶细胞表面的结合位点。我们通过激光共聚焦和免疫共沉淀实验证实乳铁蛋白与EB病毒受体CD21分子存在交互作用。乳铁蛋白可能通过竞争性地结合CD21以封闭EB病毒结合位点,从而阻止EB病毒吸附并进入B细胞。2.乳铁蛋白不影响EB病毒在B细胞中的复制乳铁蛋白具有抑制一些病毒复制的功能。本研究探讨了乳铁蛋白对EB病毒复制的影响。我们用不同浓度LF分别处理P3HR1细胞和EB病毒转化的B细胞3天、6天、15天和21天,发现：乳铁蛋白对EB病毒在B细胞中的复制无影响。3.乳铁蛋白可抑制EB病毒由B细胞向上皮细胞的传递EB病毒有明显的亲B细胞嗜性,但它也可感染上皮细胞如鼻咽上皮细胞。目前认为,EB病毒感染上皮细胞的方式主要是通过B细胞的传递。我们利用B淋巴细胞与上皮细胞共培养的系统,通过Real-time PCR和FISH实验发现乳铁蛋白可抑制EB病毒由B细胞向上皮细胞的传递。4.乳铁蛋白通过降低NF-κB的活性抑制EB病毒诱导的IL-8和MCP-1的表达EB病毒不仅感染B细胞和上皮细胞,它还能感染巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞,诱导这些细胞产生IL-8、MCP-1、TNF-α、IL-6等炎症因子。在感染的早期,这些炎症因子发挥抵抗EB病毒感染的作用,但过度的炎症反应会对机体局部组织造成损伤。乳铁蛋白具有抗炎作用。我们在THP1诱导的巨噬细胞中观察乳铁蛋白对EB病毒诱导IL-8和MCP-1表达的影响,结果发现：乳铁蛋白能抑制EB病毒所诱导的IL-8和MCP-1的表达上调,且对IL-8的抑制作用更为明显。NF-κB活化是炎症反应启动的核心环节。我们检测了乳铁蛋白对NF-κB活化的影响,发现乳铁蛋白可抑制EB病毒诱导的NF-κB活化。这些结果说明：乳铁蛋白可抑制NF-KB的活化,且其抑制EB病毒诱导炎症反应的作用环节位于NF-κB上游。5.乳铁蛋白通过与TLR2相互作用而抑制经TLR2激活的NF-κB通路EB病毒表面糖蛋白gp350通过与巨噬细胞表面TLR2的相互作用激活NF-κB,从而诱导MCP-1和IL-8的合成和释放。本研究中,我们通过荧光素酶报告检测证明乳铁蛋白可抑制EB病毒经TLR2通路介导的NF-κB活化。前面的结果证明,乳铁蛋白可与EB病毒受体CD21结合,由此推测乳铁蛋白可能与gp350蛋白在结构上存在相似,可能与TLR2存在相互作用。我们通过免疫荧光和免疫共沉淀证实,乳铁蛋白和TLR2存在交互作用。6.乳铁蛋白通过抑制EB病毒DNA所诱导的TLR9活化而降低IL-8的表达前面的实验证明乳铁蛋白可抑制EB病毒诱导的MCP-1和IL-8的表达,且对IL-8的抑制作用更明显。研究发现,EB病毒颗粒、DNA及多种编码产物均可刺激IL-8的分泌。EB病毒DNA被单核/巨噬细胞中的TLR9识别后,可激活下游NF-κB,进而诱导产生IL-8。我们检测了乳铁蛋白预处理对EB病毒DNA诱导IL-8表达的影响。结果显示,乳铁蛋白可抑制EB病毒DNA所诱导的IL-8表达上调。为进一步阐明乳铁蛋白抑制EB病毒DNA诱导炎症反应的机制,我们观察了乳铁蛋白处理后TLR9在内体中的定位情况,发现乳铁蛋白可以抑制TLR9的激活。提示乳铁蛋白可能通过抑制TLR9的激活从而抑制EB病毒DNA所诱导的IL-8表达。7.CD14通过促进EB病毒DNA所诱导的TLR9活化而上调IL-8的表达TLR9可识别EB病毒DNA,激活MYD88介导的NF-KB的活化,从而促进巨噬细胞中IL-8的表达。但TLR9识别EB病毒DNA的具体过程及其相关作用分子尚不清楚。新近研究表明,CD14可同时作为CpG DNA的伴侣和TLR9的共受体,促进CpG DNA向内体的转运并提高TLR9对配体的识别能力。本研究中,我们证实了CD14可促进EB病毒和EB病毒DNA所诱导的IL-8表达。8.乳铁蛋白通过与CD14的结合而抑制EBV DNA对TLR9的激活既往研究发现：乳铁蛋白可与CD14结合,抑制脂多糖诱导的炎症反应。那么,在EB病毒DNA与TLR9相互作用的体系中,乳铁蛋白是否也介导相似的作用呢?我们探讨乳铁蛋白对CD14促炎作用的影响,发现乳铁蛋白可部分逆转CD14促进EB病毒或EB病毒DNA所诱导的IL-8表达。为进一步证实乳铁蛋白通过与CD14的结合而发挥作用,我们构建了乳铁蛋白的缺失突变体（缺失了与CD14结合的部位）,发现：乳铁蛋白的缺失突变体不能逆转CD14的促炎作用,而野生型的可以。我们亦探讨了乳铁蛋白抑制CD14促炎作用的机制,发现乳铁蛋白可抑制CD14和TLR9的结合。乳铁蛋白可能通过与CD14的相互作用,影响CD14与TLR9的结合,从而降低TLR9对EB病毒DNA的识别能力,减轻EB病毒诱导的炎症反应。综上所述,乳铁蛋白可抑制EB病毒感染B细胞和鼻咽上皮细胞。乳铁蛋白抑制EB病毒感染B细胞主要是通过与EB病毒受体CD21的结合,从而阻止病毒黏附并进入B细胞。乳铁蛋白对EB病毒在B细胞中的复制无影响。乳铁蛋白可抑制EB病毒诱导的炎症反应,其作用机制主要包括两个方面：乳铁蛋白与TLR2结合,抑制EB病毒包膜糖蛋白gp350诱导的炎症反应；乳铁蛋白通过与CD14的相互作用,阻止CD14与TLR9的结合,从而抑制EB病毒DNA经TLR9通路所诱导的炎症反应。
撖子建[7]（2016）在《Eb病毒感染与鼻咽癌细胞钙结合蛋白S100A8、S100A9上调的相关性研究》文中研究指明本文包括三个部分：（一）构建EB病毒感染的鼻咽癌细胞系与S100A8、S100A9蛋白的检测；（二）携带绿色荧光报告基因的EBV-LMP1、 EBV-LMP2A真核表达质粒的构建；（三）LMP1、LMP2A质粒在鼻咽癌细胞中表达及对S100A8、S100A9的影响。第一部分构建EB病毒感染的鼻咽癌细胞系与S100A8、S100A9蛋白的检测目的：探讨S100A8、S100A9在鼻咽癌组织和细胞中的表达上调是否与EBV的感染有关,EBV的潜伏感染是否是S100A8、S100A9表达上调的原因?方法：①采用共培养的方式,B95-8狨猴淋巴瘤细胞与鼻咽癌细胞接触使无EBV感染的鼻咽癌细胞感染EBV。在感染EBV后利用免疫细胞毒性反应杀灭B95-8细胞,建立携带EBV的CNE1-E、CNE2-E细胞株。②根据EBV在鼻咽癌中存在的时间,人为划分感染的时期。③通过流式细胞术对CNE1-E、CNE2-E进行周期检测并用HE染色观察细胞形态变化。④根据细胞克隆形成实验观察感染后细胞克隆形成能力。⑤CCK-8检测EBV感染后鼻咽癌细胞抗5-Fu（IC50浓度）的能力。⑥qRT-PCR检测感染EBV后鼻咽癌细胞中S100A8、S100A9、MMPs的mRNA表达情况。⑦Western-blot验证S100A8、S100A9蛋白的表达。⑧qRT-PCR检测CNE1-E、CNE2-E细胞中S100A8、S100A9高表达时期LMP1蛋白的mRNA表达情况。结果：①细胞数（1：1）共培养后,B淋巴细胞瘤与鼻咽癌细胞相互接触,在杀灭B95-8细胞后剩余细胞呈现上皮细胞状,PCR检测EBV特异性基因BamHI-W呈阳性和狨猴特异性基因CAJA呈阴性,说明EBV成功感染鼻咽癌细胞,并且没有B95-8细胞的残留。②利用PCR检测感染后的EBV在细胞中的存在时间大约在20-±5天。③对于不同分化的鼻咽癌细胞,EBV感染后存在不同的周期变化,CNE1-E首先出现G0/G1期减少、S期+G2期增加,随着时间的递延,G0/G1期逐渐增加、S期+G2期逐渐减少,表现出先增殖后抑制的趋势。而CNE2-E细胞首先出现G0/G1期增加、S期+G2期减少,随着时间的递延,G0/G1期逐渐减少、S期+G2期逐渐增加,表现出先抑制后增殖的趋势。在感染的后期可以明显的观察到细胞中染色质加粗等细胞增殖的特征。④CNE1-E. CNE2-E细胞的平板克隆形成能力均高于CNE1、CNE2细胞（P<0.05）。⑤感染后72h,CNE1-E与CNE1相比有较强的抗5-Fu作用（P<0.05）,而CNE2-E则与CNE2无明显差异（P<0.05）。⑥在CNE1-E、CNE2-E细胞中,S100A8、S100A9的mRNA表达均有上调,但随时间的变化,基本表现出先增加后减少的趋势,其中CNE2-E中的S100A8、S100A9表现出先减少后逐渐增加的趋势。⑦Western-blot的结果与qRT-PCR的结果基本一致。⑧在S100A8、S100A9表达上调时期,LMP1蛋白的mRNA表达呈阳性,S100A8、S100A9的表达可能与EBV的潜伏感染有关。结论：①EBV感染鼻咽癌细胞后可引起S100A8、S100A9的表达上调,感染后EBV所处的时期与S100A8、S100A9的表达有密切的关系。②S100A8、S100A9蛋白的表达上调通常会出现在EBV的潜伏感染期。第二部分携带绿色荧光报告基因的EBV-LMP1、EBV-LMP2A真核表达质粒的构建目的：为验证S100A8、S100A9的表达上调是否与EBV-LMP1、 EBV-LMP2A的表达有关奠定实验基础。方法：①提取B95-8细胞的总RNA逆转录为cDNA。②利用特异性引物扩增调取LMP1和LMP2A的mRNA序列,并且构建含有LMP1、LMP2A序列的亚克隆,PCR和测序验证。③将测序无误的序列经限制性内切酶剪切后定向克隆到携带绿色荧光报告基因的真核表达pIRES2-Zs-Green1载体中,构建pIRES2-Zs-Green1-LMP1和pIRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达质粒。结果：①从B95-8细胞的RNA中成功克隆并获得了LMP1、LMP2A序列。②测序后与NCBI数据库中的LMP1、LMP2A序列比对发现本实验室保藏的B95-8细胞来源的LMP1基因存在6处突变（136位G>A,202位A>C,253位A>C,317位T>A,691位G>T,703位C>T）,但由于密码子的简并性翻译出的氨基酸序列与NCBI一致,LMP2A基因与NCBI数据库一致。③成功将LMP1和LMP2A定向插入pIRES2-Zs-Green1真核表达质粒中,PCR验证及测序验证无误。结论：获得了携带绿色荧光报告基因的pIRES2-Zs-Green1-LMP 1和pIRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达质粒。第三部分LMP1、LMP2A质粒在鼻咽癌细胞中的表达及对S100A8、S100A9的影响。目的：为验证S100A8、S100A9的表达上调是否与EBV的潜伏感染有关,特别是EBV潜伏感染期的两个重要蛋白LMP1和LMP2A是否参与调控鼻咽癌细胞内的S100A8、S100A9蛋白。方法：①利用脂质体转染的方式将pIRES2-Zs-Green1-LMP1、 pIRES2-Zs-Green 1-LMP2A质粒转入鼻咽癌细胞中,使鼻咽癌细胞中表达LMP1蛋白、LMP2A蛋白以及共表达LMP1、LMP2A蛋白,根据载体本身携带的绿色荧光表达强度判断转染效率。②使用RT-PCR、WB、ICC等方法对LMP1、LMP2A的表达进行检测。③提取转染LMP1、LMP2A及LMP1和LMP2A共转染组的鼻咽癌细胞总RNA,qRT-PCR检测S100A8、S100A9蛋白的mRNA和基质金属蛋白酶MMP2、MMP3、MMP7、MMP9的mRNA表达。结果：①CNE1细胞中,单转染LMP1或LMP2A质粒并不能使S100A8、S100A9表达上调,只有同时转染LMP1、LMP2A质粒时,S100A8、S100A9基因才出现表达上调（P<0.05）；CNE2细胞中,单转染LMP1即可上调S100A8、S100A9基因的表达（P<0.05）,共同转染LMP1和LMP2A质粒可上调S100A9（P<0.05）,S100A8基因表达上调但差异不明显（P>0.05）。②CNE1中在S100A8、S100A9上调表达的同时,MMP2、MMP3、MMP9基因表达上调（P<0.05）,CNE2在S100A8、S100A9上调表达的同时,MMP3和MMP7基因表达上调（P<0.05）。结论：①S100A8、S100A9的表达上调与EBV潜伏期编码的LMP1、 LMP2A蛋白有关。③S100A8、S100A9在上调的同时金属基质蛋白酶家族也发生变化,不同分化期的鼻咽癌细胞MMPs的变化有所不同,低分化的CNE1细胞在S100A8、S100A9表达上调时更倾向于表达凝胶酶水解酶类的MMP2、MMP9,而高分化的CNE2细胞在S100A8、S100A9表达上调时更倾向于表达MMP3、MMP7等细胞基质酶。
宗永生,钟碧玲,梁英杰,张敏,林素暇,何洁华,梁小曼,吴秋良,曾益新[8]（2002）在《鼻咽癌变过程生物学特性研究的进展》文中提出作者总结所在研究小组近5年来在鼻咽癌变过程生物学特性研究方面的主要成果,结合国内外这一领城的进展,提出作者对鼻咽癌变机理的看法。为了研究鼻咽癌变,本课题组对20000多例鼻咽癌活检和600多例EB病毒血清学阳性并已随访12年以上的鼻咽活检材料,进行了除组织病理学染色外,还采用动物实验、分子生物学方法（如原位杂交和PCR等）的研究,至今,完成论文26篇,并正式发表在国内外医学生物学杂志上。综合得到的结论是:（1）鼻咽癌变过程中所见的形态发生学顺序为鳞状化生、上皮异型性变、原位癌和微小浸润癌。（2）这种形态发生学顺序常可见于鼻咽粘膜上皮的一定范围,因此鼻咽癌变是一种区域性癌变。（3）EB病毒DNA和小RNAs在上皮呈异型性变时即可被检测到,且若干病毒基因编码产物,特别是LMP1,可在异型上皮、原位癌和微小浸润癌中表达,因此EB病毒在鼻咽癌变过程中可能起着关键的作用。（4）EB病毒基因编码产物与上皮细胞内、由逐步变异了的调节细胞周期相关基因异常表达产物间的相互作用,构成了鼻咽癌变过程中的一系列分子事件。（5）由于EB病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞不但可在癌巢中观察到,且可在周围血液中检测到,因此个体的细胞免疫状态也是影响鼻咽癌变的重要因素。
宗永生,吴秋良,林素暇,何洁华,张昌卿[9]（2005）在《EB病毒相关性疾病病理学研究的进展》文中指出报告作者及其同事在鼻咽癌高发的广州地区所做EB病毒相关性疾病病理学研究的进展。内容包括:①EB病毒病理生物学;②EB病毒相关性疾病病理学;③检测组织中的EB病毒;④EB病毒血清学。重点是EB病毒相关性疾病的病理学以及评估各种检测EB病毒相关性疾病患者组织和血清中EB病毒的方法。
周志平,陈威巍,汤勃,赵敏[10]（2013）在《EB病毒感染及其相关性疾病》文中指出EB病毒可在B淋巴细胞中潜伏感染,干扰机体免疫功能,刺激细胞增生和转化,并致癌。EB病毒感染非常普遍,与其相关的疾病有传染性单核细胞增多症、噬血细胞综合征、慢性活动性EB病毒感染、X连锁淋巴组织增生性疾病、鼻咽癌及淋巴瘤等。EB病毒感染最常见及预后最好的疾病是传染性单核细胞增多症。
二、鼻咽癌的基因改变和EB病毒感染（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼻咽癌的基因改变和EB病毒感染（论文提纲范文）
（1）鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 鼻咽癌概述 |
| 1.1.1 鼻咽癌的流行病学 |
| 1.1.2 鼻咽癌的致病因子 |
| 1.1.3 鼻咽癌的临床特征 |
| 1.1.4 鼻咽癌的诊断 |
| 1.1.5 鼻咽癌的治疗 |
| 1.2 EB病毒概述 |
| 1.2.1 EB病毒的发现 |
| 1.2.2 EB病毒的分类 |
| 1.2.3 EB病毒的形态学和生物学特征 |
| 1.2.4 EB病毒的生活周期 |
| 1.2.5 EB病毒的流行病学 |
| 1.2.6 EB病毒的治疗 |
| 1.2.7 EB病毒潜伏态的主要转录产物 |
| 1.2.8 EB病毒相关肿瘤 |
| 1.3 本研究的目的、意义及思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要耗材 |
| 2.3 主要试剂及实验动物 |
| 2.3.1 E.coli菌株 |
| 2.3.2 质粒 |
| 2.3.3 细胞株 |
| 2.3.4 实验动物 |
| 2.3.5 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.3.6 其他常规试剂 |
| 2.3.7 临床标本 |
| 2.4 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.4.1 常规分子生物学实验溶液的配制 |
| 2.4.2 细胞培养/转染用溶液的配制 |
| 2.4.3 病毒抗原及抗体检测用溶液的配置 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.5.2 常规细胞生物学实验方法 |
| 2.5.3 稳定细胞株的构建 |
| 2.5.4 单克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.5.5 肿瘤细胞的生长抑制实验 |
| 2.5.6 免疫学相关实验方法 |
| 2.5.7 本研究中用到的其他实验方法 |
| 2.6 数据处理及统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分: 鼻咽癌特异性诊断试剂的研发探索 |
| 3.1 三种鼻咽癌血清诊断试剂的研发探索 |
| 3.1.1 鼻咽癌LMP1/IgA检测试剂雏形的初步建立 |
| 3.1.2 鼻咽癌LMP2A/IgA检测试剂雏形的初步建立 |
| 3.1.3 鼻咽癌BARFI/IgA及BARF1/IgG检测试剂的研发探索 |
| 3.2 鼻咽癌免疫组化检测试剂的建立 |
| 3.2.1 LMP1免疫组化检测试剂的初步建立 |
| 3.2.2 LMP2A免疫组化检测试剂的初步建立 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分: 鼻咽癌个性化诊断靶标的探索 |
| 3.4 A73蛋白的鉴定及其作为鼻咽癌个性化诊断靶标的探索 |
| 3.4.1 血清中抗A73的抗体作为鼻咽癌个性诊断靶标的评估 |
| 3.4.2 细胞或组织中A73蛋白作为鼻咽癌个性诊断靶标的评估 |
| 3.4.3 血清中A73 mRNA作为鼻咽癌个性诊断靶标的探索 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第三部分: 鼻咽癌免疫治疗靶标的探索 |
| 3.6 基于EB病毒蛋白靶标的治疗性抗体探索 |
| 3.6.1 以LMPI为靶标的鼻咽癌治疗性抗体研发探索 |
| 3.6.2 以LMP2A为靶标的鼻咽癌治疗性抗体研发探索 |
| 3.7 第三部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼻咽癌的血清学早期诊断极为重要 |
| 4.2 EB病毒II型潜伏态的基因转录产物为鼻咽癌提供了很好的早期诊断靶标 |
| 4.3 鼻咽癌个性化诊断试剂研发的必要性 |
| 4.4 抗体药物治疗是鼻咽癌治疗的一个重要发展方向 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（2）鼻咽癌患者来源EB病毒感染树鼩动物模型的构建（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验流程图 |
| 第一章 鼻咽癌患者体内EBV现况调查及病毒源获取 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二章 树鼩感染EBV需要的EBV DNA拷贝数探究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 长期EBV感染树鼩模型的构建和观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 树鼩外周血BARF1 基因片段测序分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 叠加环磷酰胺因素构建EBV感染树鼩动物模型体内成瘤方法初步探索 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述一 |
| Reference |
| 综述二 |
| References |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（3）EB病毒感染猪淋巴细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 EB病毒感染猪淋巴细胞 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第二部分 生物信息学对人、猪、鼠的CR2的分析 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 实验方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第三部分 EB病毒感染鼻咽癌细胞 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）鼻咽癌上皮细胞EB病毒感染模型的构建及其相关基因的筛选（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 英文略缩词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 EBV感染的鼻咽癌上皮细胞的建立 |
| 概述 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 EB病毒感染鼻咽癌细胞的转录组研究 |
| 概述 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）乳铁蛋白干扰EB病毒与宿主细胞的结合及抑制EB病毒感染性炎症的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词简表 |
| 第一章 前言 |
| 乳铁蛋白在鼻咽癌组织中显着下调，是鼻咽癌候选抑癌基因 |
| 乳铁蛋白是一种分泌蛋白，是天然免疫系统的重要组成成分 |
| 孰铁蛋白的抗病毒感染作用及机制 |
| 乳铁蛋白抗炎作用机理及其意义 |
| EB病毒感染与鼻咽癌 |
| EB病毒感染与天然免疫 |
| 科学假设 |
| 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和细胞系 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 菌株和质粒 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 外周血单个核细胞分离(密度梯度离心法,Ficoll法) |
| 2.2 磁珠分选CD19~+B淋巴细胞 |
| 2.3 THP1诱导成为巨噬细胞 |
| 2.4 EB病毒的制备和滴度测定 |
| 2.5 流式细胞术 |
| 2.6 间接免疫荧光 |
| 2.7 EB病毒DNA抽提 |
| 2.8 细胞总RNA抽提 |
| 2.9 消化RNA中痕量DNA |
| 2.10 逆转录 |
| 2.11 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.12 荧光原位杂交(FISH) |
| 2.13 质粒抽提(小量) |
| 2.14 表达载体的构建 |
| 2.15 质粒DNA的转染 |
| 2.16 siRNA的转染 |
| 2.17 病毒DNA的转染 |
| 2.18 CpG DNA处理细胞 |
| 2.19 细胞蛋白的抽提 |
| 2.20 BCA法测蛋白浓度 |
| 2.21 免疫共沉淀 |
| 2.22 Western blot |
| 2.23 荧光素酶报告活性检测 |
| 2.24 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 第一部分 LF抑制EB病毒感染及其机制 |
| 1.1 LF抑制EBV与B淋巴细胞的结合 |
| 1.2 LF抑制EBV进入B淋巴细胞 |
| 1.3 LF与CD21存在交互作用 |
| 1.4 LF不影响B细胞中EBV的复制 |
| 1.5 LF能抑制B淋巴细胞向鼻咽上皮细胞传递EBV |
| 第二部分 LF抑制EBV感染介导的炎症反应的机制 |
| 2.1 LF通过降低NF-κB的活性抑制EBV诱导的IL-8和MCP-1表达上调 |
| 2.2 LF通过与TLR2结合抑制TLR2介导的NF-κB的活化 |
| 2.3 LF通过抑制EBV DNA对TLR9通路的诱导,而下调IL-8表达 |
| 2.4 CD14促进EBV DNA诱导IL-8的表达 |
| 2.5 LF具有抑制CD14促进EBV DNA诱导炎症反应的功能 |
| 2.6 LF抑制CD14与TLR9的结合,进而抑制炎症反应 |
| 第四章 讨论 |
| 第一部分 乳铁蛋白抑制EB病毒感染宿主细胞 |
| 第二部分 乳铁蛋白抑制EB病毒感染性炎症的机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
（7）Eb病毒感染与鼻咽癌细胞钙结合蛋白S100A8、S100A9上调的相关性研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 英汉缩略对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 EB病毒感染的鼻咽癌细胞系的构建与S100A8、S100A9蛋白的检测 |
| (1) 材料与方法 |
| (2) 结果 |
| (3) 讨论 |
| 第二部分 携带绿色荧光报告基因的EBV-LMP1、EBV-LMP2A真核表达质粒的构建 |
| (1) 材料与方法 |
| (2) 结果 |
| (3) 讨论 |
| 第三部分 LMP1、LMP2A质粒在鼻咽癌细胞中表达及对S100A8、S100A9的影响 |
| (1) 材料与方法 |
| (2) 结果 |
| (3) 讨论 |
| 讨论与展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表文献 |
（10）EB病毒感染及其相关性疾病（论文提纲范文）
| 1 病原学特征 |
| 1.1 EB病毒 |
| 1.1.1 EB病毒基因组 |
| 1.1.2 EB病毒潜伏感染的病毒表达产物 |
| 1.2 EB病毒相关的抗原抗体系统 |
| 1.2.1 VCA |
| 1.2.2 EA |
| 1.2.3 EBNA |
| 1.2.4 淋巴细胞决定的膜抗原 |
| 2 流行病学特征 |
| 3 致病机制 |
| 4 EB病毒感染相关性疾病 |
| 4.1 传染性单核细胞增多症 |
| 4.2 EB病毒相关噬血细胞综合征 |
| 4.3 慢性活动性EB病毒感染 |
| 5 EB病毒相关恶性肿瘤 |
| 5.1 Burkitt淋巴瘤 |
| 5.2 NK/T细胞淋巴瘤 |
| 5.3 霍奇金病 |
| 5.4 鼻咽癌 |
| 5.5 胃腺癌 |
| 5.6 平滑肌肉瘤 |
| 6 EB病毒感染与免疫缺陷性疾病 |
| 6.1 X连锁淋巴组织增生性疾病 |
| 6.2 AIDS |
| 6.3 器官移植后B淋巴细胞淋巴增生性疾病 (post-transplant B-cell lymphoproliferative disease, B-LPD) |
四、鼻咽癌的基因改变和EB病毒感染（论文参考文献）
- [1]鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究[D]. 桂勋. 厦门大学, 2014(04)
- [2]鼻咽癌患者来源EB病毒感染树鼩动物模型的构建[D]. 王红. 广西医科大学, 2018(07)
- [3]EB病毒感染猪淋巴细胞的研究[D]. 陈胜利. 南方医科大学, 2014(12)
- [4]X射线交错互补修复基因1多态性和EB病毒感染对鼻咽癌细胞基本特性的影响[J]. 刘真,温晗光,陈缪安. 中国耳鼻咽喉头颈外科, 2017(01)
- [5]鼻咽癌上皮细胞EB病毒感染模型的构建及其相关基因的筛选[D]. 姚孟薇. 广西医科大学, 2016(03)
- [6]乳铁蛋白干扰EB病毒与宿主细胞的结合及抑制EB病毒感染性炎症的机制[D]. 郑瑛. 中南大学, 2012(12)
- [7]Eb病毒感染与鼻咽癌细胞钙结合蛋白S100A8、S100A9上调的相关性研究[D]. 撖子建. 广西医科大学, 2016(02)
- [8]鼻咽癌变过程生物学特性研究的进展[J]. 宗永生,钟碧玲,梁英杰,张敏,林素暇,何洁华,梁小曼,吴秋良,曾益新. 癌症, 2002(06)
- [9]EB病毒相关性疾病病理学研究的进展[J]. 宗永生,吴秋良,林素暇,何洁华,张昌卿. 中山大学学报(医学科学版), 2005(05)
- [10]EB病毒感染及其相关性疾病[J]. 周志平,陈威巍,汤勃,赵敏. 传染病信息, 2013(01)