一、中国鲎胚胎血细胞生成的初步电镜观察（论文文献综述）
郭育[1]（2021）在《中华鲎血液中凝血相关蛋白的制备及应用》文中研究表明中华鲎是一种古老的海洋生物。中华鲎的先天免疫系统完全依赖于一套独特且有效的凝血系统。凝血系统的凝血级联反应主要由Factor C（FC）、Factor G（FG）、Factor B（FB）以及Proclotting Enzyme（PCE）等4种凝血血蛋白和一种凝固蛋白原组成的。该系统为一种由内毒素激活FC途径,另外一种由（1,3）-β-D-葡聚糖激活FG途径。天然的鲎血制品广泛地应用于药品和食品的内毒素和真菌葡聚糖的检验、医疗器械、临床医学研究等多个领域。但由于鲎资源过度消耗,导致鲎的数量急剧减少。2019年,中华鲎已经被列入到世界自然保护联盟（IUCN）红色名录——濒危（EN）。因此,鲎试剂的制备需要通过其他的方法替代天然鲎血获得鲎试剂的原材料。本课题实验旨在通过在大肠杆菌工程菌中表达异源蛋白获得凝血蛋白,来构建检测内毒素或（1,3）-β-D-葡聚糖的反应体系,使检测更加灵敏、特异性更强,从而替代提取天然鲎血,解决生产鲎试剂原材料短缺的问题。本论文通过大肠杆菌表达系统分别异源表达FGα、FGβ和PCE等凝血因子蛋白,构建特异性检测（1,3）-β-D-葡聚糖的单一途径反应体系。通过改变诱导条件、与分子伴侣素CpkA共表达、设计融合标签肽等实验方法提高FGα和PCE的可溶性表达。对诱导表达的包涵体进行体外复性实验,利用得到的复性蛋白构建检测（1,3）-β-D-葡聚糖的反应体系,并测定不同凝血因子组合（双因子和三因子）的反应体系的肽酶活性;我们还尝试利用分子伴侣素辅助FGα和PCE体外复性。结果表明,我们在Esherichia coli BL21（DE3）中分别成功表达出FGα、FGβ和PCE重组蛋白,但主要以包涵体形式存在。分子伴侣素在体内/体外都能辅助鲎凝血因子折叠。标签肽/分子伴侣素共表达体系可提高FGα的可溶性表达:FGα’可溶性表达提高2倍;FGα’与分子伴侣素MA4386共表达,可溶性表达提高7.5倍。三种鲎凝血因子蛋白的复性均有活性,在1M和2M的尿素浓度范围内都具有肽酶活性,并在2M尿素环境中活性最高,其中CpkB辅助复性的FG a+PCE双因子检测体系具有最高的（1,3）-β-D-葡聚糖诱导的肽酶活性9.6 U/mg,且高于鲎试剂的比活为0.9 U/mg;此外非葡聚糖糖类无法诱导肽酶活性实验表明双因子检测体系对（1,3）-β-D-葡聚糖的高特异性。本实验成功表达了三种鲎凝血因子蛋白,并应用标签肽/分子伴侣素共表达体系提高了FGα的可溶性表达;最终构建了一个高活力、高特异性地用于检测（1,3）-β-D-葡聚糖反应体系。
颜玉烨[2]（2020）在《中华绒螯蟹VEGFR基因在螺原体感染过程中的功能研究》文中进行了进一步梳理中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）,不同地域对其称呼也有所不一样,常见的称呼有河蟹或者大闸蟹,有的地域称为清水蟹或者毛蟹。随着养殖强度、面积的不断扩大及水域环境的日趋恶化,中华绒螯蟹养殖过程中的病害问题愈来愈严重。其中“颤抖病”是制约我国中华绒螯蟹养殖产业可持续发展的主要瓶颈之一。前期研究证实一种螺原体（Spiroplasma eriocheiris）为中华绒螯蟹“颤抖病”的病原体,该病原通过鳃或体表进入蟹体内,侵染其靶细胞——血淋巴细胞,并通过血液的循环进而侵染各器官结缔组织,前期中华绒螯蟹感染螺原体后表现为无力、不食,后期病原大量侵染神经组织主要表现为附肢颤抖,直至死亡。因此,探究中华绒螯蟹的免疫防御机制,对减少该病原对中华绒螯蟹的损失具有十分重要的意义。本论文首先利用串联质谱标签（TMT）技术和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术,筛选出了螺原体侵染血淋巴细胞早期的差异表达蛋白;而后通过RACE技术扩增得到了中华绒螯蟹血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor,EsVEGFR）基因全长,并分析了其序列特征、表达模式;最后通过基因干扰等实验研究了EsVEGFR在螺原体侵染过程中的作用。本论文为明确螺原体的侵染机理以及中华绒螯蟹的防御机制奠定了良好的基础,本研究主要从以下三个方面展开:1.TMT（串联质谱标签）技术筛选螺原体感染前后中华绒螯蟹血淋巴细胞的差异蛋白通过TMT技术筛选螺原体感染中华绒螯蟹蟹血淋巴细胞早期（24 h）差异表达的蛋白,筛选出差异蛋白共212个,其中上调蛋白127个、下调蛋白85个,它们与细胞骨架、免疫、生理过程等相关,其中42个差异蛋白与免疫相关。上调蛋白包括组织蛋白酶L（cathepsin L）、谷胱甘肽s-转移酶（glutathione s-transferase,GST）、凝血因子B/B2（clotting factor B/B2）、黑化作用蛋白酶1（melanization protease 1）、丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）、过氧化物酶1（peroxiredoxin 1,Prx1）等。下调蛋白包括铁蛋白2/3（ferritin2/3,Fer2/3）、凝集素（lectin）、脂多糖-1,3-葡聚糖结合蛋白（Lipopolysaccharides-1,3-glucan binding proteins,LGBP）、血管内皮生长因子受体蛋白1（Vascular endothelial growth factor receptor 1）、NADPH氧化酶5（NADPH oxidase 5,NOX5）、溶菌酶（lysozyme C）等。本文选择以上与免疫相关的8种蛋白,包括四种上调蛋白（cathepsin L、hemocytin、peroxiredoxin 1和NADPH oxidase 5）和四种下调蛋白（LGBP、ferritin2、Kazal-type protease inhibitor和VEGFR1）,利用实时定量PCR检测这8种蛋白在基因水平上的变化,实验结果与TMT筛选结果保持一致。2.EsVEGFR1和EsVEGFR2基因克隆、信息学分析、组织表达和功能研究通过RACE技术扩增了中华绒螯蟹VEGFR基因的两个亚型EsVEGFR1和EsVEGFR2,EsVEGFR1 c DNA序列全长6470 bp,包含一个4380 bp的开放阅读框,编码1459个氨基酸的多肽,SMART网站预测EsVEGFR1蛋白的第802到第1261个氨基酸残基为一个Tyr Kc结构域。EsVEGFR2 c DNA序列全长5548bp,包含一个4704 bp的开放阅读框,编码1567个氨基酸的多肽,SMART网站预测第864到1259个氨基酸残基为一个Tyr Kc结构域。EsVEGFR的序列分析发现其蛋白序列与一些水生甲壳类的VEGFR的序列相似性达到99%,而与昆虫类以及其他无脊椎生物VEGFR序列的相似性也有60-80%。EsVEGFR1在神经组织中表达量最高,其他组织较少;EsVEGFR2在血淋巴细胞中表达量最高,其次是鳃,其他组织较少。中华绒螯蟹螺原体感染后EsVEGFR1在血淋巴细胞中的表达量在第1天下降,第3天和第5天有上升趋势,而后又呈现下调趋势。EsVEGFR2在第1天上升,第3天和第5天表达量下降,而后呈现上调趋势,说明EsVEGFR1和EsVEGFR2在螺原体侵染过程中起着重要的相互调节作用,这为进一步研究EsVEGFR的免疫功能奠定了基础。3.RNA干扰技术研究EsVEGFR1的功能利用人工转录合成的dsRNA将EsVEGFR1基因沉默,在注射dsRNA后使用qRT-PCR技术检测干扰效率,结果显示注射了EsVEGFR1特异性的dsRNA后该基因的转录水平与对照组（PBS、ds GFP）相比显着降低,这证明EsVEGFR1特异性dsRNA可显着降低血淋巴细胞中EsVEGFR1的转录水平。dsRNA将EsVEGFR1基因成功沉默后再用螺原体侵染中华绒螯蟹,结果显示血淋巴细胞中的螺原体拷贝数与对照组相比显着增多,同时中华绒螯蟹的死亡率与对照组（PBS+S.eriocheiris）相比,ds EsVEGFR1+S.eriocheiris组中中华绒螯蟹从第7 d开始死亡并且死亡率增加。这进一步说明沉默EsVEGFR1后降低了中华绒螯蟹的免疫力,促进了中华绒螯蟹螺原体对中华绒螯蟹的感染。总之,这些实验结果为更加深入了解中华绒螯蟹螺原体侵染中华绒螯蟹的机制奠定了一些理论基础,并且为实际应用中生产防治该病害的药物等提供一定的参考价值。
张小溪[3]（2020）在《凡纳滨对虾基因家族扩张和可变剪切在环境适应中的作用研究》文中进行了进一步梳理对虾是对虾科动物的统称,属于甲壳动物亚门十足目,是水生动物的重要代表类群,具有不可替代的科学价值。同时,对虾又作为世界重要的水产养殖对象,具有重要的经济价值。对虾基因组的破译和大量组学数据的积累,不仅对阐明对虾特殊的生命现象、解析对虾的适应性机制、研究对虾乃至甲壳动物的演化历史和生态地位具有重要意义,而且可以为以对虾代表的经济甲壳动物的遗传育种奠定重要的基础。本论文以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的组学数据为基础,系统研究了对虾基因组中三个基因家族的扩张和基因可变剪切与对虾环境适应的关系。本研究不仅为阐明对虾等甲壳动物对环境适应的分子机制奠定重要基础,而且对对虾养殖环境和生态调控具有一定指导意义。主要研究结果如下:1.凡纳滨对虾肌动蛋白（Actin）和肌球蛋白重链（Myosin heavy chain,MYH）基因家族的结构和功能研究凡纳滨对虾具有发达的腹部肌肉系统,使其能够迅速躲避敌害袭击,适应底栖生活,而Actin和MYH是两种主要的肌肉组成蛋白。本论文结合基因组和转录组数据,从凡纳滨对虾基因组中鉴定出37个Actin基因和16个MYH基因。综合序列结构、功能域和系统发生分析的结果,将它们分为4类:快肌型、慢肌型、心肌型和细胞质型。相比于其他近缘物种,快肌型Actin、慢肌型Actin和快肌型MYH基因在对虾基因组中均发生了显着扩张。这些基因家族成员之间高度的序列相似性和在基因组上成簇分布的特征表明它们可能是通过串联复制实现扩张的。不同类型的对虾Actin和MYH基因在时空表达上存在显着差异。在不同组织中的表达分析结果表明,快肌型Actin和MYH基因主要在腹部肌肉中高表达,慢肌型Actin和MYH基因主要在包含肌肉成分的组织中表达,心肌型Actin和MYH基因在心脏中高表达,而细胞质型Actin和MYH基因在所有组织中均表达。大多数Actin和MYH基因在胚胎发育的肢芽期至膜内无节幼体期开始转录表达,并随着幼体的发育和运动能力的加强,表达量逐渐提高,显示对虾肌肉系统主要在溞状幼体期和糠虾幼体期开始发育。通过对慢肌型Actin和MYH基因的原位杂交,证实对虾腹部的表层肌肉和游泳足内的肌肉属于慢肌型。以上结果表明,对虾基因组中显着扩张的快肌型Actin和MYH可能是对虾腹部肌肉发达的原因之一,从而使其拥有很强的爆发力;显着扩张的慢肌型Actin使对虾的游泳足可以持久游泳。这两者的配合使对虾既具有快速逃逸躲避敌害的能力,又具有比其他甲壳动物更强的游泳能力。2.凡纳滨对虾保幼激素酯酶样羧酸酯酶（CXE）基因家族的结构和功能多样性分析对虾一生要经历约50次左右蜕皮,如此频繁的蜕皮为对虾快速生长提供了保障。昆虫的保幼激素酯酶（juvenile hormone esterase,JHE）在早期发育和蜕皮过程中起重要作用,甲壳动物中的保幼激素酯酶样羧酸酯酶（JHE-like carboxylesterase,CXE）与JHE基因同源,但是在对虾复杂的蜕皮通路中,CXE基因的功能尚不清楚。通过对对虾基因组和转录组数据进行分析,本研究鉴定出21条CXE基因（Lv CXE）,为对虾基因组中发生显着扩张的基因家族之一。所有Lv CXE均有保守的催化三联体位点和特征性的Gx Sx G结构域,其中有14个基因的特征性结构域为GESAG,并且13个含GESAG的Lv CXE在系统发育树中聚为一支,表明含GESAG结构域的CXE基因在对虾中发生特异性扩张。大多数Lv CXE在对虾的肝胰腺、肠道和卵巢中高表达,其组织分布特征与甲基法尼酯（MF）降解的主要部位相吻合,暗示它们之间可能存在功能关系。从对虾不同的发育时期来看,有10个Lv CXE在溞状幼体期至仔虾期高表达,其中包含7个含GESAG结构域的基因。在对虾的不同蜕皮时期,有16个Lv CXE（包含11个含GESAG结构域的基因）的表达模式相似:在蜕皮间期和D0期高表达,D3期表达量降到最低,D4期表达量又急剧升高。在对虾蜕皮前期注射昆虫CXE的抑制剂OTFP后,可导致对虾不能完成蜕皮过程而死亡,且OTFP的注射可引起蜕皮激素应答关键转录因子基因如Lv E75、Lv Br-c、Lv Hr3、Lv Ftz-f1等的表达量显着下调,说明Lv CXE在对虾蜕皮过程中发挥着重要作用。以上结果表明对虾中特异性扩张的Lv CXE具有功能多样性,在幼体发育和生长蜕皮过程中均起重要的调节作用。3.凡纳滨对虾全基因组范围可变剪切事件及功能多样性研究可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的主要方式之一,然而对虾中可变剪切相关研究的报道很少。结合对虾基因组和多个转录组数据,本研究在对虾中共鉴定到9209个基因存在38,781个可变剪切事件,其中外显子跳跃（ES）、3’端可变剪切（A3SS）、5’端可变剪切（A5SS）、内含子保留（RI）和外显子互斥（MXE）的比例分别为13.35%、11.43%、10.8%、6.77%、2.36%。所有基因的内含子边界剪切模式以GT-AG模式最多,占92.3%,其次是GC-AG,AT-TC,AT-AC。与非可变剪切基因相比,可变剪切基因的平均长度更长、外显子数目更多、外显子长度更长、内含子更短。非可变剪切基因的功能主要包括:DNA整合、DNA代谢、核酸代谢、神经系统等生物学过程,而多可变剪切基因的功能主要包括响应生物胁迫和响应外界刺激等相关过程。根据剪切形式增加趋势的差异,可变剪切基因可分为typeⅠ基因和typeⅡ基因。typeⅠ基因是指只在胁迫后发生可变剪切的基因,即这类基因在正常状态下只有一种转录本,但是胁迫后转录多种形式的转录本;typeⅡ基因是指正常状态下已经可以转录多种可变剪切转录本,但是一些特定剪切形式的转录本只在胁迫状态后转录。微生物（白斑综合症病毒WSSV、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌）感染后,对虾全基因组可变剪切事件的总数目显着增多,而且各种类型的可变剪切的数目均大幅度增加。其中typeⅠ基因的功能相似,主要与物质和能量代谢相关,起到维持基础代谢平衡、确保物质和能量供应的作用;typeⅡ基因的功能主要和免疫相关,但针对不同病原有所差异:WSSV组主要富集在NLR受体通路;副溶血弧菌组主要富集到细胞外基质受体相互作用和产生Ig A的肠道免疫网络通路;金黄色葡萄球菌组显着富集到“志贺氏菌病”、“致病性大肠杆菌感染”、“上皮细胞的细菌感染”等抵御病原的通路。该结果表明对虾在受到微生物感染后,通过改变免疫相关基因的可变剪切模式达到清除不同病原的目的。同时有7个剪切因子（splicing factor）基因的表达量在微生物感染后显着上调,表明可变剪切在微生物感染过程中的调控有一定的相似性。可变剪切在物理因子胁迫过程中也发挥着重要作用。对虾全基因组的可变剪切事件的数量在低盐胁迫后显着增加,typeⅠ基因主要富集到嘌呤代谢和过氧化物酶体等过程,typeⅡ基因主要和阳离子结合、离子结合、甜菜碱合成等过程相关,维持机体内外的渗透压平衡。另外,高温胁迫促进了ES、A3SS、A5SS的特异性可变剪切而抑制了RI的特异性可变剪切;其中鳃中与RNA结合、结合、核酸结合等过程相关基因的可变剪切模式的变化可能是下游大规模的可变剪切调节或转录表达调控的基础;肝胰腺中与泛素转移酶活性、核内泛素连接酶复合物过程相关基因的可变剪切模式的变化,可能与机体内错误折叠蛋白的清除过程相关。以上结果表明可变剪切在凡纳滨对虾响应外界环境胁迫过程中起着重要作用。对虾基因组中基因家族的扩张和可变剪切形式的增加丰富了基因组成和表达形式的多样性,进而促进了基因功能多样性的发挥。Actin和MYH基因家族的显着扩张促进了对虾快肌和慢肌的进化,提升了对虾迅速躲避敌害袭击的能力;CXE基因家族的扩张则为对虾的频繁蜕皮提供精确的调控保障;对虾中丰富的可变剪切事件在增加了转录本和蛋白质的结构与功能多样性的同时,也使得对虾获得较强的环境适应能力,在应对生物因子和物理因子刺激时,体现出了独特的响应和适应机制。以上结果表明,基因扩张和可变剪切均是对虾适应环境的重要途径。
蓝军南[4]（2020）在《四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）配子发生、性腺发育以及性逆转的研究》文中提出繁殖是鱼类生活史中极为重要的环节之一。本文从形态学、组织学和细胞学层面对四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）的精子和卵子发生、精巢和卵巢发育及其性逆转的过程进行初步研究,旨在了解四指马鲅的繁殖规律和繁殖策略,丰富四指马鲅的繁殖生物学资料,为开展其种质资源保护和开发利用以及提高人工繁育技术提供必要的理论参考。主要研究结果有以下几点:1. 四指马鲅的精巢发育和精子发生研究为了解四指马鲅的精巢发育和精子发生过程,本研究一方面运用组织切片H-E染色方法对其精巢发育和精子发生过程进行观察,另一方面采用透射电镜对其精子发生过程中各级生精细胞的超微结构变化及精子的超微结构进行观察。结果显示,四指马鲅精巢位于腹腔背侧,紧贴中肾和鳔的腹面,呈对称分布,两支精巢于后端融合,呈“Y”字形,组织学上属典型小叶型精巢。根据精巢发育及精子发生的组织学特点可将其分为6个时期,3月龄精巢发育至第I期（精原细胞增殖期）,4月龄发育至第II期（精母细胞增长期）,5～7月龄发育至第III期（精母细胞成熟期）,7～9月龄发育至第IV期（精子开始出现期）,最早在10月龄发育至第V期（精子完全成熟期）达到初次性成熟;参与生殖排精后的精巢为第VI期（精子退化吸收期）。精子发生过程经历初级精原细胞、次级精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子6个时相,其细胞及细胞核直径逐级减小,核质比发生规律性变化;精子发生过程中,细胞核内染色体逐渐浓缩,电子密度增加,线粒体数量减少,体积增大,内嵴结构逐渐丰富;精子由头部、中部和尾部组成,鞭毛轴丝为典型“9+2”结构。2. 四指马鲅的卵巢发育和卵子发生研究为了解四指马鲅的卵巢发育和卵子发生过程,本研究运用组织切片H-E染色方法对其卵巢发育的组织结构变化和卵子发生过程中各时相卵母细胞的结构进行观察。结果显示,四指马鲅卵巢为被膜型卵巢,紧贴中肾腹面,两支卵巢前端分离于后端融合,呈“Y”字形。卵子发生过程分可分为5个时相,由直径为6.60～40.86μm的卵原细胞逐渐发育成直径为348.02～462.84μm的成熟卵子;在II时相中期卵母细胞周围开始出现滤泡细胞,II时相晚期形成单层滤泡细胞,直至III时相中期滤泡细胞层外形成一层鞘膜细胞;卵黄核在II时相中期开始出现,至III时相早期消失;卵黄泡在III时相早期的细胞核附近及胞质边缘出现;卵黄颗粒在III时相晚期开始出现于卵黄泡之间,并在IV时相早期填充卵黄泡,至IV时相晚期形成卵黄小板。卵巢发育过程中,每个时期都存在不同时相的卵母细胞;V期卵巢的卵径呈双峰分布,分别在50.00～100.00μm和300.00～350.00μm区间出现峰值。四指马鲅卵巢发育模式为非同步发育-分批产卵类型。3. 四指马鲅的性逆转过程初步研究为了解四指马鲅的繁殖策略,本研究对循环水养殖的四指马群体进行形态测量性和别比列统计,并用形态学和组织学方法对其性腺进行观察。结果显示,在养殖盐度10.8～13.0,水温28.0～30.7℃的条件下,在228尾7月龄四指马鲅样本中检测到雄性、雌性和雌雄同体三种个体,其比列分别为85.53%、5.70%和8.77%;各类个体的体重、全长、体长和体高等形态性状无明显差异;雌雄同体四指马鲅的体重与全长、体长、体高的相关拟合曲线方程分别为y=0.6568x2-12.431+解剖学观察显示,雌雄同体性腺的两背内侧为精巢,呈白色,两腹外侧为卵巢,呈浅黄偏红色;组织学显示精巢侧已有成熟精子形成,为典型精巢的IV或V期特征,卵巢侧具卵巢腔,主要为卵原细胞和早期II时相卵母细胞,为典型卵巢的II期特征,可判断四指马鲅为雄性先熟雌雄同体;其性逆转过程可分为早期、中期、晚期三个时期,主要组织结构变化特征为精巢组织逐渐退化消失,卵巢结构逐渐形成并发育成II期卵巢,在整个性逆转过程均检测到精巢的凋亡细胞信号。
顾文彬[5]（2020）在《拟穴青蟹干露胁迫应答及其细胞凋亡机制的研究》文中研究指明拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）是分布在太平洋和印度洋地区的河口和沿海水域的蟹类。它也是亚洲、特别是中国东南沿海地区的重要经济养殖蟹类之一。为了满足全国乃至世界各地的消费需求,青蟹在捕捞后被运至内陆出售。从我国东南沿海运输至西北内陆时,运输时长通常超过72 h。为了降低运输费用,增加运输效率,生产实践中采用无水运输。但无水运输法可能导致蟹类失去充足的氧气补给,造成组织功能性缺氧最终导致发病和死亡,造成经济损失。该现象的发生是因为干露胁迫下的青蟹体内氧分压（PO2）降低,二氧化碳分压（PCO2）升高导致内部缺氧,引起氧化应激并造成氧化损伤最终导致细胞凋亡的产生。本文主要以拟穴青蟹为研究物种,通过研究青蟹在干露胁迫下组织形态学、生化水平、亚细胞水平及分子水平的变化,进而探究在该胁迫下细胞凋亡的产生机制。1.干露和再浸润胁迫下拟穴青蟹组织形态及抗氧化应激能力的变化扫描电子显微镜观察发现,在干露胁迫下,鳃整体结构皱缩,鳃小片相互粘连且断裂,鳃表面变得粗糙且产生褶皱。同时,分析了干露-再浸润胁迫下,青蟹抗氧化酶活性的变化。青蟹鳃在干露胁迫下,SOD、GST活性在24 h和48 h显着升高。CAT活性在24 h时显着升高,并在之后降低恢复到正常水平。总抗氧化能力（T-AOC）在48 h时显着升高（P<0.05）,但在其他时间均无显着性变化。在再浸润胁迫下,SOD的活性在干露72h和96h后再浸润时,活性显着升高为1.8倍和2.9倍。GST和CAT的活性在干露胁迫72 h后再浸润时,活性显着升高。肝胰腺在干露胁迫下,SOD和T-AOC均在48 h显着升高,而CAT和GST均无显着性变化。在再浸润胁迫下,SOD活性在干露96 h再浸润时显着升高,GST和CAT的活性在干露胁迫72 h再浸润时显着升高,T-AOC则在干露48 h和72 h再浸润时活性显着性升高。本研究发现,干露胁迫会破坏鳃的组织结构。同时,短时间干露胁迫及长时间干露后再浸润胁迫时会上调青蟹抗氧化酶活性来应对氧化应激,防止细胞遭受氧化损伤。2.拟穴青蟹干露胁迫下鳃组织转录组分析在研究中,采用鳃作为研究对象,进行了转录组测序、差异表达基因（DEGs）分析。通过转录组测序获得Transcripts共计565,051个,平均长度为1000 bp,N50 为 1756 bp;得到 Unigene 195,726 个,总长度为 141,868,154 bp,平均长度为724bp,N50为1,377bp。得到共计为21,349条DEGs序列,其中上调基因为281条,下调基因为21,068条。我们随机挑选了 6个基因,通过荧光定量分析验证了转录组数据的准确性。在KEGG富集分析中发现,总共有26,656条序列富集在KEGG数据库的信号通路中,其中免疫相关通路基因（IMD and Toll pathway,lysosome pathway）及细胞凋亡通路（Apoptosis pathway）相关基因表达显着下调,证明干露胁迫可能会影响青蟹免疫水平并且引发细胞凋亡。本研究首次分析了干露胁迫下拟穴青蟹鳃组织的转录组及形态的变化,为今后蟹类抗干露的分子机制研究提供了理论支持。3.凋亡抑制蛋白IAP克隆及干露胁迫下的应答机制凋亡抑制蛋白是参与调节细胞凋亡的重要蛋白之一。因此我们对凋亡抑制蛋白IAP进行克隆,并分析了其功能及干露胁迫下的应答机制。SpIAP的全长序列为3,351bp,包含长度为1,986bp的开放阅读框（ORF）。SpIAP蛋白序列长662 aa,并包括IAP家族保守结构域RING结构域和BIR结构域。SpIAP在所有检测的组织中均有表达,在肝胰腺组织中呈显着性高表达。干露胁迫下,SpIAP的表达量显着升高;在该基因被干扰沉默,干露胁迫后肝胰腺细胞凋亡率显着升高。这些研究结果证明了SpIAP通过抑制细胞凋亡的产生参与了抗干露的应答机制。4.BAX/Bcl-2在拟穴青蟹干露再浸润胁迫中的应答机制为了研究干露-再浸润胁迫下细胞凋亡的应答机制,在拟穴青蟹中克隆了线粒体凋亡通路中关键的激活/抑制蛋白BAX/Bcl-2。本研究在拟穴青蟹中克隆得到SpBAX和SpBcl-2。SpBAX编码一条278aa氨基酸,包含了 BH1,BH2,BH3和一个TM结构域。SpBcl-2编码一条长为207 aa的氨基酸,包含了 BH1,BH2,BH3,BH4和TM结构域。SpBAX和SpBcl-2在所有检测的组织中均有表达,并在肝胰腺中表达量最高。在HEK293T细胞中过表达SpBAX会导致细胞凋亡的产生,共转染SpBcl-2可抑制由SpBAX所引发的细胞凋亡。SpBAX和SpBcl-2在干露-再浸润胁迫下表达水平均显着上升。在干露胁迫下,肝胰腺中SpBcl-2的表达水平始终高于SpBAX,使BAX/Bcl-2比率保持稳定,防止细胞凋亡的产生;在干露-再浸润胁迫下,SpBAX的表达水平超过SpBcl-2,使BAX/Bcl-2比率显着升高,造成Caspase 3活性升高引发细胞凋亡。通过透射电子显微镜观察发现,干露胁迫48 h和96 h后进行再浸润时,肝胰腺细胞部分线粒体肿胀破裂。上述研究表明,在干露-再浸润胁迫下,SpBAX和SpBcl-2蛋白通过调节线粒体膜的通透性控制细胞凋亡的发生。本研究可为拟穴青蟹干露胁迫的应答机制提供理论基础。综上所述,干露胁迫会损伤青蟹鳃的组织结构并造成氧化应激从而刺激抗氧化活性的上调防止氧化损伤。同时,干露胁迫下抑制凋亡蛋白SpIAP,SpBcl-2表达上调,从而抑制SpBAX和Caspase的活性,保护线粒体结构完整从而阻碍细胞凋亡的产生。干露-再浸润胁迫下,促凋亡蛋白SpBAX表达上调,使得BAX/Bcl-2比率升高,线粒体结构遭到破坏导致线粒体凋亡通路激活,Caspase-3活性升高最终导致细胞凋亡的产生。
黄欣[6]（2018）在《凝集素、Dorsal及Ras在主要经济虾中的免疫功能研究》文中研究说明虾养殖业带来巨大的经济价值,在全世界范围内受到高度关注。随着环境生态的日益紧张,集约化养殖模式的发展壮大,营养供给的逐渐失衡以及包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等在内的多种病原的侵袭,使得虾类病害频发,并给整个水产养殖业造成了一定的经济损失。鉴于此,研究虾类抵抗病原体感染的免疫应答机制对疾病防控具有深远意义。凝集素在病原识别和清除过程中发挥重要作用,但目前对C-型凝集素和L-型凝集素在先天免疫防御中的功能研究却依然有限。Toll信号通路在回应革兰氏阳性细菌和真菌感染,进而调节抗菌肽表达的体液免疫过程中发挥重要作用。作为Toll信号通路中的关键转录因子,Dorsal参与调控抗肽的表达。小G蛋白参与多种细胞生命活动,已有的研究表明在对虾感染病毒的过程中,小G蛋白具有调控血细胞吞噬的作用。为了阐明以上免疫相关基因在甲壳类动物先天免疫系统中的具体功能与作用机制,本研究选取沼虾和对虾作为实验动物,研究了一种含发夹结构域（Clip）的C-型凝集素（Mn-clip-Lec）、一种L-型凝集素（MrVIP36）、Toll信号通路关键转录因子Dorsal（MrDorsal）以及三种Ras小G蛋白（MjRap,MjRas和MjRal）在宿主抗细菌和（或）抗病毒先天免疫防御中的作用。本研究得到如下结果:1.日本沼虾含Cl ip结构的C-型凝集素在细菌感染过程中的功能研究我们在日本沼虾中发现了一种以前没有报道过的含Clip结构域的新的C-型凝集素,命名为Mn-clip-Lec。该凝集素的cDNA全长为1315 bp,含有一个1098 bp的开放阅读框,编码一个包含365个氨基酸残基的蛋白,该蛋白包含一个Clip结构域在N-端以及两个C型凝集素样结构域在C-端。Mn-clp-Lec在血细胞中表达相对较高。在受到金黄色葡萄球菌刺激后,Mn-clip-Lec、酚氧化酶原激活系统主要成员（MnPPAF,MnPPAE和MnPo）以及抗菌肽（MnALF和MnCRU）的表达量明显上调。利用RNA干扰敲低Mn-clip-Lec会减少金黄色葡萄球菌刺激后酚氧化酶原激活系统主要成员和抗菌肽的表达。此外,Mn-clip-Lec基因沉默会降低金黄色葡萄球菌刺激后总血淋巴PO活性。纯化的Mn-clip-Lec重组蛋白（rMn-clip-Lec）能够结合5种细菌且结合活性不同。rMn-clip-Lec能够凝集金黄色葡萄球菌且这种凝集活性依赖钙离子。rMn-clip-Lec可以结合病原菌表面的多糖,如脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）。在结合金黄色葡萄球菌后,rMn-clip-Lec可以在日本沼虾体内促进机体对该菌的清除作用。这些结果表明作为含Clip结构域的C-型凝集素,Mn-clip-Lec参与包括病原识别、诱导酚氧化酶原系统的活化以及调控抗菌肽的表达在内的先天免疫应答。在以上研究的基础上,我们进一步运用酵母双杂交技术从日本沼虾cDNA文库中筛选出了可能与Mn-clip-Lec存在相互作用的蛋白,但需要进一步的验证。这些筛选结果为进一步研究机体对抗病原体入侵的先天免疫应答机制奠定了基础。2.罗氏沼虾L-型凝集素对细菌和病毒感染的免疫应答研究我们从罗氏沼虾中克隆得到了一个L-型凝集素,命名为Mr VIP36。MrVIP36的cDNA全长为1687 bp,开放阅读框为972 bp,共编码323个氨基酸。预测的MrVIP36蛋白包含一个L-型凝集素样结构域（LTLD）和一个跨膜区。进化分析显示,与脊椎动物相比,MrVIP36与无脊椎动物L-型凝集素的进化距离更近。Mr VIP36广泛分布在健康的罗氏沼虾的不同组织,其中在肝胰腺和肠中尤为丰富。在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌以及白斑综合征病毒（WSSV）刺激后,血细胞中MrVIP36的表达明显上调。MrVIP36的LTLD结构域重组蛋白（rMrLTLD）能够结合所有测试的细菌,并且以钙离子依赖的形式凝集金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌。rMrLTLD还可以结合脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）。此外,rMrLTLD能够在体外抑制细菌的生长,并且在体内促进机体对侵入的细菌的清除。rMrLTLD与WSSV共同孵育后能够抑制WSSV在罗氏沼虾体内的复制。同时,存活率分析也表明rMrLTLD能够减少WSSV感染罗氏沼虾后导致的死亡。这些结果表明MrVIP36可能作为模式识别受体,在罗氏沼虾的抗细菌和抗病毒免疫中发挥重要作用。3.罗氏沼虾Dorsal转录因子在WSSV感染过程中调控甲壳肽的表达我们在罗氏沼虾中鉴定了一个Dorsal同系物,命名为MrDorsal。它的全长cDNA为2533 bp,含有一个1986 bp的开放阅读框,可以编码661个氨基酸。氨基酸序列分析显示MrDorsal含有一个Rel同源结构域（RHD）和一个IPT/TIG结构域,并且包含Dorsal蛋白的特征序列FRYMCEG。MrDorsal在血细胞和鳃中的表达高于在其他组织中的表达。WSSV刺激引起了 MrDorsal与甲壳肽（MrCrustin2和MrCrustin4）的表达增加。沉默MrDorsal会抑制病毒感染后鳃组织中以上两种甲壳肽的转录。这些结果表明在病毒感染罗氏沼虾的过程中,MrDorsal参与调控甲壳肽的表达并发挥重要的免疫作用。4.日本囊对虾小G蛋白家族的3个成员在WSSV感染过程中的功能鉴定我们对日本囊对虾Ras小G蛋白家族的3个成员（分别命名为MjRap、MjRa和MjRal）进行了克隆和鉴定。MjRap、MjRas和MjRal的cDNA全长分别为1236、1330和2074 bp,分别拥有570、609和597 bp的开放阅读框,并分别编码189、202和198个氨基酸。进化分析显示来自不同物种的Rap、Ras和Ral分别聚集在一起。MjRap、MjRas和MjRal广泛分布在健康对虾的血细胞、肝胰腺、鳃、胃和肌肉中。在受到WSSV刺激后的48和72 h,MjRal在鳃中的表达上调,而MjRap和MjRas的转录水平没有变化。进一步研究发现利用RNA干扰沉默MjRal基因后能够显着增加WSSV的拷贝数。此外,体外重组表达的MjRal蛋白（rMjRal）与WSSV共孵育后注入对虾体内,48 h之后检测鳃中VP28的表达和病毒拷贝数。结果显示VFP28的表达没有明显变化,然而病毒拷贝数却明显降低。这些结果表明只有MjRal能够抑制病毒在日本囊对虾体内的复制,并在抵御病毒感染的免疫反应中发挥重要作用。
伍磊[7]（2018）在《纤维蛋白原相关蛋白与Kruppel样因子在罗氏沼虾先天免疫中的初步功能研究》文中进行了进一步梳理自然界中一般认为高等脊椎动物是既具有先天性免疫,也具有获得性免疫的,而在无脊椎动物中由于缺乏真正的抗体和特异性的免疫性细胞,因此机体的防御反应只有先天性免疫。本文对罗氏沼虾的先天性免疫做出了相关研究。1.WSSV刺激后罗氏沼虾淋巴器官的转录组分析。罗氏沼虾（Macrobrachiumrosenbergii）是一种具有经济重要性的甲壳类动物,一般认为成虾对白斑综合征病毒（WSSV）感染耐受。本研究采用新一代测序来确定WSSV感染淋巴器官和对照组淋巴器官之间的转录组差异。从对照样品和WSSV感染样品中分别产生总共44,606,694和40,384,856个纯净读段并组装成73,658和72,374个基因。基于同源搜索,KEGG,GO和COG分析,21,323个基因被注释。其中,鉴定出4951个差异表达基因,并将其分类到244个代谢途径。以凝血级联和模式识别受体信号通路为例,讨论宿主对WSSV感染的反应。我们还鉴定了 12,308个简单序列重复序列,可以进一步用作功能标记。该结果有助于更好地理解虾淋巴器官对WSSV的免疫应答,在缺少虾基因组背景下,可以提供虾的新基因信息。2.纤维蛋白原样凝集素在罗氏沼虾中作为模式识别受体参与先天免疫抗菌反应。纤维蛋白原样凝集素广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中,本次课题从罗氏沼虾中克隆得到一个纤维蛋白原样凝集素基因,命名为MrFREP。罗氏沼虾MrFREP的cDNA全长为1649bp,其中包含一个长1086bp的开放阅读框（ORF）,其编码了一个含有361个氨基酸残基的蛋白,5’端有一个74bp的非编码翻译区UTR,3’端有一个包含多聚腺苷酸polyA尾巴,长492bp的非编码翻译区UTR。MrFREP包含一个由20个氨基酸组成的信号肽和一个由223个氨基酸组成的Fibrinogen-related domain（MrFReD）。系统发育树表明,MrFREP与日本囊对虾中的FREP亲缘关系最为接近,有43%的相似性。通过对该基因组织分布和表达模式分析可以看出,MrFREP在罗氏沼虾血细胞,心脏,肝胰腺,鳃,胃,肠道,肌肉中均有所表达,并且在鳃和肠道中具有较高水平的表达量。在受到副溶血弧菌和白斑综合症病毒（WSSV）刺激后基因表达量会在24h时上升。MrFREP的FReD结构域重组蛋白在Ca2+存在的情况下可凝集革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌,并能够与革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌相结合。此外,该重组蛋白还能够结合脂多糖与肽聚糖,并且明显提高虾体内弧菌清除的效率。3.Kruppel样因子参与罗氏沼虾先天免疫反应调控。Kruppel样因子家族在真核生物中广泛存在。MrKLF的cDNA全长为1799bp,其中包含一个长1335bp的开放阅读框（ORF）,其编码了一个含有444个氨基酸残基的蛋白,5’端有一个193bp的非编码翻译区UTR,3’端有一个包含多聚腺苷酸polyA尾巴,长274bp的非编码翻译区UTR。MrKLF包含两个由12和13个氨基酸组成的低复杂度区域（low complexity region）和三个分别由25个、25个和23个氨基酸组成的锌指蛋白结构域。系统发育树表明罗氏沼虾Kruppel样因子与斑节对虾和凡纳滨对虾的Kruppel样因子亲缘关系最为接近,相似性分别达到59%和58%。在mRNA水平上,MrKLF在罗氏沼虾体内广泛分布,其中在肝胰腺、鳃和肠道中的表达量明显高于在其他器官的表达量。在受到白斑综合症病毒和副溶血弧菌刺激时,MrKLF表达量会在24h时降低,并在48h升高。将该基因敲低后,虾体内某些抗菌肽的表达量也会出现降低,受到了MrKLF的调控,表明该基因有可能参与罗氏沼虾先天免疫防御。
赵曼曼[8]（2016）在《杂色鲍血蓝蛋白基因结构和表达规律研究》文中提出血蓝蛋白（hemocyanin）又称血蓝素,与蚯蚓血红蛋白（hemerythrin）、血红蛋白（hemoglobin）并称自然界三大呼吸蛋白。血蓝蛋白主要分布在节肢动物和软体动物血淋巴中,含量非常丰富,具有运输氧气、调节渗透压、表皮固化、调节蜕皮过程、转运金属离子、储存蛋白质、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种功能。然而,近年来对于血蓝蛋白的研究多集中在其蛋白结构和功能方面,而对于血蓝蛋白的基因结构尤其是软体动物血蓝蛋白基因多亚型和其多功能之间的关系方面研究较少。本文运用基因序列分析、荧光定量PCR（qPCR）和荧光原位杂交技术（FISH）对杂色鲍（Haliotis diversicolor）血蓝蛋白的基因结构及其对病原刺激的响应等进行了研究,对深入了解软体动物血蓝蛋白这种多序列、多功能、高分子量免疫分子的基因演化和免疫响应机理具有重要的意义。首先,运用生物信息学工具软件对课题组克隆得到的杂色鲍血蓝蛋白基因Hd Hc1、Hd Hc2-1和Hd Hc2-2序列进行分析。结果显示,Hd Hc与欧洲鲍（H.tuberculata）、钥孔戚（M.Crenulata）等腹足纲动物的Hc聚为一支,遗传距离较近;Hd Hc基因结构与Ht Hc的基因结构相似,也有8个功能单元（FU-aFU-h）,FU-a、FU-f、FU-g分别由4、3、2个外显子编码,其余5个功能单元则是连续的。和欧洲鲍相同的是,Hd Hc也含有0、1、2三种内含子相位,不同的是Hd Hc1和Hd Hc2-1的7个连接内含子均是1相位,6个内部内含子中有3个0相位,1个1相位,2个2相位,而Hd Hc2-2的7个连接内含子都是0相位,6个内部内含子有1个0相位,2个1相位,3个2相位。其次,人工注射病原哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、鲍类疱疹病毒（Abalone herpesvirus,Ab HV）刺激健康杂色鲍,检测血淋巴中可溶性总蛋白的浓度、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、酸性磷酸酶（Acid Phosphatase,ACP）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AKP）活性的变化以及无细胞血浆的抑菌性,结果表明,（1）哈维弧菌和Ab HV刺激后,杂色鲍血淋巴中可溶性总蛋白浓度先显着升高,后显着下降。（2）哈维弧菌和Ab HV刺激后,杂色鲍血淋巴中ACP和AKP活性显着升高,哈维弧菌刺激组的SOD先显着升高,后显着下降,Ab HV刺激组的SOD显着下降。（3）杂色鲍无细胞血淋巴对哈维氏弧菌、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliiluyitcus）这三种病原均表现出了不同程度的抑菌性增强的作用。这些结果表明病原刺激引起了杂色鲍免疫相关因子的变化,使得血淋巴的抑菌性增强。然而,作为血淋巴中含量最高的一种免疫分子,血蓝蛋白的表达可能也受到了调控。运用荧光定量PCR（qPCR）技术检测鲍胚胎发育各时期以及哈维氏弧菌,溶珊瑚弧菌,Ab HV,Poly（I:C）刺激后杂色鲍腹足、外套膜、鳃、肝胰腺中血蓝蛋白基因Hd Hc1、Hd Hc2-1和Hd Hc2-2相对表达量的变化,从而分析其与血淋巴免疫活性变化的关系。结果显示:（1）血蓝蛋白两个基因Hd Hc1、Hd Hc2-1在杂色鲍的发育初期即有表达,Hd Hc2-1的相对表达量高于Hd Hc1的表达量,未见Hd Hc2-2的表达。（2）哈维氏弧菌、溶珊瑚弧菌、Ab HV、Poly（I:C）刺激杂色鲍后,腹足、肝胰腺、鳃、外套膜中的血蓝蛋白基因Hd Hc1、Hd Hc2-1的相对表达量均有变化,但是不同组织、不同刺激组的变化规律不同。与0 h的空白对照组相比,哈维氏弧菌刺激组Hd Hc1表达量先升高后降低,Hd Hc2-1表达量先降低后升高再降低;溶珊瑚弧菌刺激组Hd Hc1表达量呈降低趋势,Hd Hc2-1表达量升高降低再升高;Ab HV刺激组Hd Hc1表达量先降低后升高再降低,Hd Hc2-1表达量先降低后升高再降低;Poly（I:C）刺激组Hd Hc1表达量先降低,在48 h突然升高,然后再降低,Hd Hc2-1表达量先降低在48 h突然升高,然后再降低;注射PBS的对照组:Hd Hc1和Hd Hc2-1表达量变化趋势相同,均是先升高后降低;注射PBS的对照组以及四个刺激组的杂色鲍的4种组织中均未检测到Hd Hc2-2的表达。根据qPCR结果,进一步运用FISH技术对外界刺激后血蓝蛋白基因在组织中的具体表达部位进行了研究。Poly（I:C）刺激48 h后腹足中的Hd Hc的FISH结果表明,Hd Hc1阳性信号主要集中在腹足的边缘处,即接触环境的那一侧,而腹足肌肉的内部Hd Hc1阳性信号较少;腹足边缘Hd Hc2-1的阳性信号明显少于Hd Hc1,腹足肌肉内部的Hd Hc2-1的阳性信号也成零星分布。综上所述,杂色鲍血蓝蛋白与欧洲鲍血蓝蛋白亲缘关系最近,软体动物血蓝蛋白不同亚基的进化早于种属的进化,Hd Hc2-2可能是假基因。杂色鲍血蓝蛋白基因Hd Hc1和Hd Hc2-1为诱导型表达基因,参与了幼体发育、抗细菌及抗病毒的免疫过程;细菌和病毒刺激后,杂色鲍无细胞血浆的抑菌性显着增强可能与血蓝蛋白的表达调控有关。
朱珊珊[9]（2016）在《中国鲎注射副溶血弧菌后miRNA表达变化分析及miRNA电子挖掘》文中指出中国鲎（Tachypleus tridentatus）是一种珍稀濒危的水生节肢动物。当其受到细菌尤其是副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染时会严重影响其正常的生理活动甚至导致死亡。许多研究表明,micorRNA（miRNA）作为一类生物体内非编码小RNA,其可参与动物免疫系统发育和功能调节,但目前与中国鲎免疫相关miRNA的研究尚未见报道。因此,对中国鲎miRNA的研究将有助于揭示其体内的免疫应答机制。本文采用副溶血弧菌感染中国鲎,构建了其血细胞小RNA文库,对感染前后的血细胞小RNA文库进行了Solexa测序,并结合生物信息学方法分析其miRNA表达谱及表达差异。共获得537条miRNA,其中保守miRNA序列有397条,新发现的miRNA序列有140条,感染后共发现89条差异表达的miRNA（P≤0.05）。采用荧光定量PCR技术对感染副溶血弧菌前后差异表达的miRNA进行了验证分析。结果表明,中国鲎在感染副溶血弧菌后,其体内的mir-745、miR-87和miR-305的表达量上调,而miR-10的表达下调。这些结果为进一步研究中国鲎miRNAs调控的先天免疫反应提供重要理论依据。利用同源序列比对方法挖掘了中国鲎miRNA及其前体序列,共获得63条miRNA前体,其长度在46102 nt之间,这些前体包含49条成熟miRNA,其长度为1923 nt。同时分析了中国鲎重要miRNA家族与斑马鱼、小鼠、人类、黑腹果蝇等物种之间的保守性。结果表明,中国鲎与上述几种两侧对称动物存在miR-10、miR-219、miR-1和miR-190四个相同的miRNA家族,其前体序列具有高度的保守性。使用miRanda和PITA预测软件对筛选出的ttr-miR-34-5p、ttr-miR-2b和ttr-miR-8-3p进行了靶基因预测和功能分析,发现ttr-miR-34-5p的靶基因功能主要与细胞内凝固抑制剂Ⅱ型、丝氨酸蛋白水解酶、血细胞转谷氨酰胺酶等有关;ttr-miR-2b的靶基因功能主要与HDID支架、精氨酸激酶、核糖体蛋白SA等11种相关蛋白有关;ttr-miR-8-3p调控的靶基因功能较为广泛,涉及到细胞组分、分子功能和生物学过程三大类。本研究首次获得中国鲎血液miRNA转录组图谱,靶基因预测若干作用于鲎免疫因子的miRNA。本研究获得的miRNA为后续开展miRNA在中国鲎各种生理活动中的调控机理研究奠定了基础。
许道全[10]（2016）在《北部湾潮间带鲎体重金属的组织分布及与主要环境因子的相关性》文中提出圆尾鲎和中国鲎是北部湾特色生物,也是该区域重要的海洋生物资源,重金属污染已经成为制约鲎生存和鲎资源科学利用的潜在因子,因此,鲎体的重金属污染问题应当受到更广泛的关注。本文主要研究内容为：（1）从重金属蓄积的角度对北部湾潮间带的圆尾鲎和中国鲎进行调查,分析重金属（Cd、Cu、Pb和Zn）在鲎体的含量水平和组织分布规律,并对其生物质量进行评价；（2）分析鲎栖息地海水和表层沉积物中重金属的含量,评价其污染水平,并讨论潜在的污染源；（3）初步探讨重金属在鲎体各组织的含量与主要环境因子的相关性。研究的主要结论如下：（1）各重金属在鲎体各组织内均有分布,圆尾鲎和中国鲎各组织中重金属含量的变化趋势相同,圆尾鲎各组织中Zn含量与Cu含量呈显着性差异,但均显着高于Cd和Pb含量。鲎体各组织的功能特点及代谢差异会影响重金属在生物体内的分布,Cd、Cu和Zn在内脏团中含量明显高于在其他组织的含量,而Pb在书鳃的蓄积最高。（2）对于鲎栖息地环境中重金属污染进行调查与分析,结果表明栖息地海水和沉积物中重金属总体上属于较低的污染水平；沉积物中重金属形态分析结果表明,Cd、Pb和Zn的生物可利用性较高,易被重新释放至环境中形成再次污染,对生态系统产生潜在的危害。（3）利用Pearson相关性分析的方法,初步探讨圆尾鲎各组织中重金属含量与主要环境因子的关系。内脏团Cd、Pb和Zn与沉积物中弱酸提取态重金属,书鳃Cu、Pb与海水Cu、Pb,甲壳Pb与海水Pb均呈显着正相关,这在一定程度上反映了鲎体组织中部分重金属的潜在来源。
二、中国鲎胚胎血细胞生成的初步电镜观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国鲎胚胎血细胞生成的初步电镜观察（论文提纲范文）
（1）中华鲎血液中凝血相关蛋白的制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 中华鲎 |
| 1.2 鲎的凝血机制 |
| 1.3 凝血因子蛋白 |
| 1.4 鲎试剂 |
| 1.5 中华鲎凝血蛋白的异源表达研究 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 1.7 研究方法及策略 |
| 第二章 鲎凝血因子蛋白的原核表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌种及质粒 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验药品 |
| 2.1.4 试剂及配方 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 FGα、FGβ和PCE质粒的提取 |
| 2.2.2 感受态的制备及转化 |
| 2.2.3 FGα、FGβ和PCE的诱导表达 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 FGα原核表达结果 |
| 2.3.2 FGβ的原核表达结果 |
| 2.3.3 PCE的原核表达结果 |
| 2.4 结果讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 标签肽/分子伴侣素共表达体系辅助鲎凝血因子蛋白的原核可溶性表达及蛋白质纯化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒及菌株 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验药品 |
| 3.1.4 试剂及配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 FGα和PCE与分子伴侣素CpkA的共转化 |
| 3.2.2 共转菌株的表达及诱导条件的优化 |
| 3.2.3 融合标签肽的FGα/分子伴侣素共表达体系的构建 |
| 3.2.4 FGα’的蛋白纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 FGα和PCE与分子伴侣素CpkA共表达体系的验证 |
| 3.3.2 FGα’的重组质粒的验证及共表达的结果 |
| 3.3.3 FGα’的蛋白纯化 |
| 3.4 结果讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 应用于检测真菌(1,3)-β-D-葡聚糖的鲎凝血因子反应体系的构建 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 质粒及菌株 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验药品 |
| 4.1.4 试剂及配方 |
| 4.2 实验内容 |
| 4.2.1 FGα、FGβ和PCE的体外复性 |
| 4.2.2 FGα、FGβ和PCE的性质表征 |
| 4.2.3 分子伴侣素参与FGα和PCE的体外复性 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FGα、FGβ和PCE的复性结果 |
| 4.3.2 FGα、FGβ和PCE的性质表征结果 |
| 4.3.3 CpkA或 CpkB参与FGα和PCE体外复性结果 |
| 4.3.4 不同肽酶活性反应体系的最高活性对比 |
| 4.4 结果讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5 章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（2）中华绒螯蟹VEGFR基因在螺原体感染过程中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 中华绒螯蟹研究概述 |
| 1.1.1 中华绒螯蟹简介 |
| 1.1.2 中华绒螯蟹养殖现状及面临的问题 |
| 1.2 螺原体的研究概况 |
| 1.2.1 螺原体的发现与命名 |
| 1.2.2 螺原体的基本生物学特性研究 |
| 1.2.3 螺原体的分布及其致病性 |
| 1.3 中华绒螯蟹螺原体研究概述 |
| 1.3.1 中华绒螯蟹螺原体的发现与命名 |
| 1.3.2 中华绒螯蟹螺原体侵染机制研究 |
| 1.4 无脊椎动物的先天性免疫研究概述 |
| 1.4.1 无脊椎动物的先天性免疫系统 |
| 1.4.2 无脊椎动物先天免疫——体液免疫 |
| 1.4.3 无脊椎动物先天免疫——细胞免疫 |
| 1.5 VEGF/VEGFR的研究进展 |
| 1.5.1 VEGF/VEGFR的简介 |
| 1.5.2 VEGF/VEGFR的结构特点 |
| 1.5.3 VEGF/VEGFR在免疫系统中的功能研究 |
| 1.6 本论文的研究目的、内容、意义及技术路线 |
| 第2章 TMT(串联质谱标签)技术筛选螺原体感染早期中华绒螯蟹血细胞差异表达蛋白 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 实验动物和菌株 |
| 2.1.2 主要器材及设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 螺原体侵染中华绒螯蟹及血淋巴细胞收集 |
| 2.2.2 中华绒螯蟹血淋巴细胞总蛋白的提取及浓度测定 |
| 2.2.3 蛋白质酶解、TMT标记和高效液相色谱分离 |
| 2.2.4 TMT信息分析 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测差异表达蛋白基因水平表达变化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 基本鉴定信息 |
| 2.3.2 数据库检索 |
| 2.3.3 qRT-PCR验证mRNA水平表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 中华绒螯蟹VEGFR1和VEGFR2 基因克隆、生物信息学分析及功能特性研究 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 实验动物和菌株 |
| 3.1.2 实验器材及设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RACE技术扩增VEGFR全长基因 |
| 3.2.2 序列特征分析和系统进化分析 |
| 3.2.3 利用qRT-PCR技术检测EsVEGFR1和EsVEGFR2 基因的分布 |
| 3.2.3.1 qRT-PCR检测EsVEGFR1和EsVEGFR2 基因在中华绒螯蟹各组织中的分布 |
| 3.2.3.2 qRT-PCR检测螺原体刺激后EsVEGFR1和EsVEGFR2 在血淋巴细胞中的表达变化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 EsVEGFR1和EsVEGFR2 基因全长的扩增 |
| 3.3.2 EsVEGFR1和EsVEGFR2 cDNA序列分析 |
| 3.3.3 系统进化树分析 |
| 3.3.4 EsVEGFR1和EsVEGFR2 基因在中华绒螯蟹各组织中的分布 |
| 3.3.5 qRT-PCR检测EsVEGFR1和EsVEGFR2 m RNA在 S.eriocheiris刺激后表达变化 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 中华绒螯蟹VEGFR1 基因RNA干扰研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要实验器材及设备 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 EsVEGFR1 双链RNA合成及纯化 |
| 4.2.2 EsVEGFR1 基因干扰 |
| 4.2.3 EsVEGFR1 基因干扰对中华绒螯蟹螺原体侵染的影响 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 EsVEGFR1 双链RNA的合成 |
| 4.3.2 EsVEGFR1 基因干扰效果检测及对其表达量的影响 |
| 4.3.3 EsVEGFR1 基因干扰对中华绒螯蟹螺原体侵染的影响 |
| 4.3.4 EsVEGFR1 基因干扰对中华绒螯蟹死亡率的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 TMT筛选到S.eriocheiris感染24 h前后中华绒螯蟹血淋巴细胞的差异表达蛋白 |
| 5.2 EsVEGFR1和EsVEGFR2 的基因克隆、信息学分析、组织表达及功能分析 |
| 5.3 EsVEGFR1 基因干扰后对中华绒螯蟹螺原体侵染过程的影响 |
| 本研究的主要创新点 |
| 进一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（3）凡纳滨对虾基因家族扩张和可变剪切在环境适应中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 凡纳滨对虾简介 |
| 1.2 凡纳滨对虾适应性进化的研究进展 |
| 1.3 基因功能多样性及其产生机制 |
| 1.4 基因复制和扩张的研究进展 |
| 1.4.1 基因复制和扩张的机制 |
| 1.4.2 基因家族扩张在无脊椎动物环境适应过程中的作用 |
| 1.5 可变剪切的研究进展 |
| 1.5.1 可变剪切的发生机制 |
| 1.5.2 可变剪切的类型 |
| 1.5.3 可变剪切的调控机制 |
| 1.5.4 可变剪切在动物环境适应过程中的作用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 凡纳滨对虾肌动蛋白(Actin)和肌球蛋白重链(MYH)基因家族的结构和功能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 Actin和 MYH家族的鉴定 |
| 2.2.2 多序列比对和系统发生树构建 |
| 2.2.3 基因结构和基因组定位 |
| 2.2.4 不同发育时期和不同组织中的表达模式 |
| 2.2.5 总RNA提取 |
| 2.2.6 c DNA合成 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 石蜡切片及染色 |
| 2.2.9 原位杂交 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 凡纳滨对虾Actin和 MYH家族鉴定 |
| 2.3.2 Actin和 MYH基因的分类 |
| 2.3.3 Actin和 MYH基因的序列特征 |
| 2.3.4 Actin和 MYH基因的系统发生分析 |
| 2.3.5 Actin和 MYH基因在基因组上的分布 |
| 2.3.6 细胞质型Actin和 MYH基因的可变剪切 |
| 2.3.7 Actin和 MYH基因在成体组织中的表达模式 |
| 2.3.8 Actin和 MYH基因在早期发育过程中的表达模式 |
| 2.3.9 慢肌型Actin和 MYH基因的组织定位 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 凡纳滨对虾CXE基因家族的结构与功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 凡纳滨对虾CXE基因家族的鉴定 |
| 3.2.2 系统发生树 |
| 3.2.3 不同发育时期和不同组织中的表达模式 |
| 3.2.4 OTFP抑制预实验 |
| 3.2.5 OTFP抑制实验 |
| 3.2.6 总RNA提取和c DNA合成 |
| 3.2.7 实时荧光定量PCR |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 凡纳滨对虾CXE基因家族的鉴定及序列特征 |
| 3.3.2 CXE基因家族的关键氨基酸位点及功能结构域 |
| 3.3.3 系统发生分析 |
| 3.3.4 CXE基因家族在成体不同组织和不同发育时期中的表达模式 |
| 3.3.5 CXE基因家族在不同蜕皮时期的表达模式 |
| 3.3.6 OTFP抑制实验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 凡纳滨对虾全基因组可变剪切分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 数据来源 |
| 4.2.2 可变剪切事件及差异表达基因鉴定 |
| 4.2.3 可变剪切事件的PCR验证 |
| 4.2.4 基因功能富集分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 全基因组水平可变剪切事件的类型、数量和分布 |
| 4.3.2 可变剪切事件的验证 |
| 4.3.3 可变剪切基因和非可变剪切基因的比较 |
| 4.3.4 多可变剪切基因和非可变剪切基因的比较 |
| 4.3.5 全基因组基因的外显子和内含子的边界剪切模式 |
| 4.3.6 微生物感染对可变剪切的影响 |
| 4.3.7 非生物因子对可变剪切的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 凡纳滨对虾全基因组水平可变剪切的特征 |
| 4.4.2 可变剪切在凡纳滨对虾适应微生物感染过程中的作用 |
| 4.4.3 可变剪切在凡纳滨对虾适应非生物胁迫过程中的作用 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 软件和代码 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）配子发生、性腺发育以及性逆转的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 硬骨鱼类性腺发育的研究进展 |
| 1.1 硬骨鱼类性腺的基本结构 |
| 1.1.1 精巢的基本结构 |
| 1.1.2 卵巢的基本结构 |
| 1.2 硬骨鱼类性腺的发育 |
| 1.2.1 精巢的发育 |
| 1.2.2 卵巢的发育 |
| 1.3 硬骨鱼类配子的发生 |
| 1.3.1 精子的发生 |
| 1.3.2 卵子的发生 |
| 1.4 硬骨鱼类的性逆转现象 |
| 第二章 四指马鲅的精巢发育和精子发生研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样本来源 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 精巢的组织结构特征 |
| 2.2.2 精巢发育及精子发生的组织学和超微结构 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 四指马鲅的精巢结构类型 |
| 2.3.2 四指马鲅的精巢发育分期 |
| 2.3.3 四指马鲅的精子发生 |
| 第三章 四指马鲅的卵巢发育和卵子发生研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样本来源 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 卵巢的组织结构特征 |
| 3.2.2 卵子发生过程 |
| 3.2.3 卵巢发育的组织学特征 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 四指马鲅的卵巢结构 |
| 3.3.2 四指马鲅的卵巢发育特点 |
| 3.3.3 四指马鲅的卵子发生特点 |
| 3.3.4 四指马鲅的产卵类型 |
| 第四章 四指马鲅的性逆转过程初步研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 样本来源 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.0 各形态性状和性别比例统计 |
| 4.2.1 性腺的解剖学和组织学特征 |
| 4.2.2 性逆转过程的组织学变化 |
| 4.2.3 性逆转过程中的细胞凋亡 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 四指马鲅性逆转的特点 |
| 4.3.2 环境因子对四指马鲅性逆转的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）拟穴青蟹干露胁迫应答及其细胞凋亡机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词表 |
| 第一章 甲壳动物干露胁迫及其分子应答机制的研究进展 |
| 1.1 鲜活水产品的主要运输模式 |
| 1.1.1 带水运输 |
| 1.1.2 干露运输 |
| 1.2 干露胁迫对水产动物的影响 |
| 1.2.1 干露胁迫导致呼吸性酸中毒 |
| 1.2.2 干露胁迫导致氧化损伤 |
| 1.3 干露/再浸润胁迫对水产动物的影响 |
| 1.4 无脊椎动物细胞凋亡产生机制 |
| 1.4.1 死亡受体通路 |
| 1.4.2 线粒体通路 |
| 1.4.3 内质网途径 |
| 1.5 甲壳动物干露胁迫研究进展 |
| 1.6 选题依据及研究目的与意义 |
| 第二章 干露和再浸润胁迫对拟穴青蟹抗氧化应激能力的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验设计与样品采集 |
| 2.1.3 干露胁迫下拟穴青蟹鳃组织扫描电子显微镜观察(SEM) |
| 2.1.4 组织匀浆制备 |
| 2.1.5 抗氧化酶活测定 |
| 2.1.6 数据分析 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 干露胁迫下青蟹鳃组织中抗氧化酶活性变化 |
| 2.2.2 干露胁迫下青蟹肝胰腺中抗氧化酶活性变化 |
| 2.2.3 干露-再浸润胁迫下青蟹鳃组织中抗氧化酶活性变化 |
| 2.2.4 干露-再浸润胁迫下青蟹肝胰腺中抗氧化酶活性变化 |
| 2.2.5 干露胁迫下鳃组织扫描电子显微镜观察(SEM) |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 拟穴青蟹干露胁迫下鳃组织转录组分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 试验设计与样品采集 |
| 3.1.3 RNA提取 |
| 3.1.4 总RNA样品混样及检测 |
| 3.1.5 文库构建及测序 |
| 3.1.6 原始数据处理、组装及分析 |
| 3.1.7 差异表达和富集分析 |
| 3.1.8 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证分析 |
| 3.1.9 数据分析 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 转录组测序结果统计 |
| 3.2.2 基因功能注释 |
| 3.2.3 干露胁迫下鳃组织差异基因的表达评估(DEGs) |
| 3.2.4 DEGs的GO富集分析 |
| 3.2.5 DEGs的KEGG富集分析 |
| 3.2.6 荧光定量分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 拟穴青蟹凋亡抑制蛋白鉴别及干露胁迫下表达分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 试验设计与样品采集 |
| 4.1.3 模板cDNA制备 |
| 4.1.4 cDNA全长的扩增及序列分析 |
| 4.1.5 SpIAP荧光定量表达分析 |
| 4.1.6 SpIAPRNA干扰 |
| 4.1.7 细胞凋亡检测 |
| 4.1.8 数据分析 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 凋亡抑制蛋白SpIAP cDNA全长扩增及序列分析 |
| 4.2.2 SpIAP组织表达分析 |
| 4.2.3 肝胰腺中SpIAP在干露胁迫下表达分析 |
| 4.2.4 SpIAP RNA干扰及细胞凋亡率的检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 干露-再浸润胁迫下青蟹肝胰腺凋亡应答机制的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 试验设计与样品采集 |
| 5.1.3 模板制备及cDNA全长的扩增 |
| 5.1.4 生物信息学分析 |
| 5.1.5 SpBAX及SpBcl-2荧光定量表达分析 |
| 5.1.6 细胞培养 |
| 5.1.7 重组质粒构建及真核表达 |
| 5.1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 5.1.9 多克隆抗体制备 |
| 5.1.10 Western blot分析 |
| 5.1.11 肝胰腺Caspase 3活性检测 |
| 5.1.12 肝胰腺的透射电镜分析(TEM) |
| 5.1.13 数据分析 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 SpBAX和SpBcl-2 cDNA全长扩增及序列分析 |
| 5.2.2 SpBAX、SpBcl-2蛋白功能分析 |
| 5.2.3 SpBAX、SpBcl-2组织表达分析 |
| 5.2.4 肝胰腺中SpBAX、SpBcl-2在干露胁迫下表达分析 |
| 5.2.5 干露-再浸润胁迫下肝胰腺SpBAX及SpBcl-2蛋白水平变化 |
| 5.2.6 干露-再浸润胁迫下肝胰腺Caspase 3酶活性变化 |
| 5.2.7 干露-再浸润胁迫下肝胰腺线粒体观察 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 总结、创新点及研究展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表SCI论文及荣誉 |
| 1 在校期间已发表SCI论文 |
| 2 在校期间获得荣誉 |
（6）凝集素、Dorsal及Ras在主要经济虾中的免疫功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 综述 |
| 1.1 无脊椎动物先天免疫概述 |
| 1.1.1 模式识别受体 |
| 1.1.2 细胞免疫 |
| 1.1.3 体液免疫 |
| 1.1.4 信号转导途径 |
| 1.2 凝集素研究进展 |
| 1.2.1 C-型凝集素 |
| 1.2.2 L-型凝集素 |
| 1.3 小G蛋白研究进展 |
| 1.3.1 小G蛋白的发现及分类 |
| 1.3.2 小G蛋白的结构和作用机制 |
| 1.3.3 小G蛋白的功能 |
| 1.4 本论文研究的目的及意义 |
| 第2章 日本沼虾含Clip结构的C-型凝集素在细菌感染过程中的功能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌株和载体 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 实验动物及免疫刺激 |
| 2.2.4 总RNA提取和cDNA合成 |
| 2.2.5 Mn-clip-Lec全长克隆 |
| 2.2.6 序列分析 |
| 2.2.7 组织分布与表达模式分析 |
| 2.2.8 RNA干扰实验 |
| 2.2.9 Mn-clip-Lec重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.2.10 细菌结合实验 |
| 2.2.11 细菌凝集实验 |
| 2.2.12 糖结合实验 |
| 2.2.13 体内清除实验 |
| 2.2.14 Mn-clip-Lec基因诱饵载体的构建及酵母双杂交筛选 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Mn-clip-Lec全长cDNA克隆及序列分析 |
| 2.3.2 Mn-clip-Lec的组织分布分析 |
| 2.3.3 金黄色葡萄球菌刺激机体后的表达模式分析 |
| 2.3.4 Mn-clip-Lec基因沉默抑制proPO激活系统成员的表达以及抗菌肽的合成 |
| 2.3.5 金黄色葡萄球菌感染过程中proPO系统的激活以及抗菌肽的合成受到Mn-clip-Lec基因的调控 |
| 2.3.6 Mn-clip-Lec基因沉默抑制proPO系统的激活 |
| 2.3.7 Mn-clip-Lec重组蛋白的细菌结合与细菌凝集活性 |
| 2.3.8 Mn-clip-Lec重组蛋白的糖结合活性 |
| 2.3.9 Mn-clip-Lec重组蛋白参与细菌清除作用 |
| 2.3.10 酵母双杂交筛选与Mn-clip-Lec互作的蛋白 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 罗氏沼虾L-型凝集素对细菌和病毒感染的免疫应答研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株、载体、试剂和仪器 |
| 3.2.2 罗氏沼虾免疫刺激与MrVIP36全长克隆 |
| 3.2.3 序列与进化分析 |
| 3.2.4 qRT-PCR分析MrVIP36的组织分布及表达模式 |
| 3.2.5 MrVIP36的LTLD重组表达载体构建 |
| 3.2.6 rMrLTLD的表达及纯化 |
| 3.2.7 细菌结合实验 |
| 3.2.8 细菌凝集实验 |
| 3.2.9 多糖结合实验 |
| 3.2.10 体外细菌生长抑制实验 |
| 3.2.11 体内细菌清除实验 |
| 3.2.12 病毒拷贝数检测 |
| 3.2.13 存活率统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MrVIP36全长cDNA克隆及序列分析 |
| 3.3.2 MrVIP36的组织分布及表达模式分析 |
| 3.3.3 rMrLTLD能够结合和凝集细菌 |
| 3.3.4 rMrLTLD能够直接结合多糖 |
| 3.3.5 rMrLTLD在体外抑制细菌的生长活性 |
| 3.3.6 rMrLTLD在体内加快机体对细菌的清除速度 |
| 3.3.7 rMrLTLD抑制病毒的复制并提高罗氏沼虾的存活率 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 罗氏沼虾Dorsal转录因子在WSSV感染过程中调控甲壳肽的表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 动物与病毒 |
| 4.2.2 组织收集与病毒刺激 |
| 4.2.3 总RNA提取和cDNA合成 |
| 4.2.4 cDNA全长克隆及序列分析 |
| 4.2.5 dsRNA介导的RNA干扰实验 |
| 4.2.6 qRT-PCR分析基因表达 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MrDorsal的全长序列分析 |
| 4.3.2 MrDorsal的组织分布和表达模式分析 |
| 4.3.3 甲壳肽基因的表达模式分析 |
| 4.3.4 沉默MrDorsal抑制病毒感染后MrDorsal的表达上调 |
| 4.3.5 沉默MrDorsal抑制病毒感染后甲壳肽基因的表达上调 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 日本囊对虾小G蛋白家族的3个成员在WSSV感染过程中的功能鉴定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株、载体、试剂和仪器 |
| 5.2.2 免疫刺激及样品制备 |
| 5.2.3 总RNA提取和cDNA合成 |
| 5.2.4 全长克隆及序列分析 |
| 5.2.5 qRT-PCR分析 |
| 5.2.6 沉默MjRal和WSSV感染 |
| 5.2.7 WSSV拷贝数检测 |
| 5.2.8 MjRal重组表达及纯化 |
| 5.2.9 WSSV共孵育rMjRal刺激对虾后VP28的转录分析及病毒拷贝数检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 MjRal、MjRap和MjRas的cDNA克隆及序列分析 |
| 5.3.2 WjRal、 MjRap和MjRas的组织分布和表达模式分析 |
| 5.3.3 MjRal干扰效果检测 |
| 5.3.4 沉默MjRal促进病毒复制 |
| 5.3.5 MjRal重组蛋白抑制病毒复制 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 日本沼虾Mn-clip-Lec参与抗细菌免疫防御及激活酚氧化酶原系统 |
| 6.2 罗氏沼虾MrVIP36参与抗细菌和抗病毒免疫 |
| 6.3 罗氏沼虾MrDorsal转录因子在WSSV感染过程中调控甲壳肽的表达 |
| 6.4 日本囊对虾MjRal参与抗病毒免疫反应 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）纤维蛋白原相关蛋白与Kruppel样因子在罗氏沼虾先天免疫中的初步功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 无脊椎动物的先天免疫 |
| 1.2 甲壳动物的防御系统 |
| 1.2.1 物理屏障 |
| 1.2.2 细胞免疫 |
| 1.2.3 体液免疫 |
| 1.3 转录组分析技术 |
| 1.4 免疫识别 |
| 1.4.1 病原相关分子模式(PAMPs) |
| 1.4.2 模式识别受体(PRRs) |
| 1.5 补体系统 |
| 1.6 本实验研究意义、内容及技术路线图 |
| 第二章 白斑综合症病毒刺激后罗氏沼虾淋巴器官的转录组分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物的准备和WSSV的侵染 |
| 2.2.2 RNA提取,cDNA文库构建和测序 |
| 2.2.3 新的基因组装配和数据分析 |
| 2.2.4 差异表达的分析和功能注释 |
| 2.2.5 简单重复序列的识别与引物设计 |
| 2.2.6 使用qRT-PCR验证基因 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 转录组测序和新的基因组装配 |
| 2.3.2 罗氏沼虾转录组序列的功能注释和分类 |
| 2.3.3 差异表达基因(DEGs)的鉴定和功能鉴定 |
| 2.3.4 差异表达基因(DEGs)的GO网络分析 |
| 2.3.5 简单序列重复的鉴定 |
| 2.3.6 通过qRT-PCR验证RNA序列的结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 纤维蛋白原相关蛋白在罗氏沼虾先天免疫中的功能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验动物、菌株和病毒 |
| 3.2.2 载体、试剂和仪器 |
| 3.2.3 主要实验试剂配方 |
| 3.2.4 罗氏沼虾的免疫刺激 |
| 3.2.5 总RNA的提取 |
| 3.2.6 cDNA的合成 |
| 3.2.7 罗氏沼虾MrFREP cDNA全长克隆 |
| 3.2.8 MrFREP的FReD结构域重组蛋白的表达和纯化 |
| 3.2.9 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MrFREP的组织分布 |
| 3.2.10 MrFREP在mRNA水平上受病原刺激的表达模式 |
| 3.2.11 细菌结合实验 |
| 3.2.12 糖结合实验 |
| 3.2.13 细菌凝集实验 |
| 3.2.14 细菌清除实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 MrFREP全长cDNA克隆和序列分析 |
| 3.3.2 MrFREP组织分布 |
| 3.3.3 MrFREP在白斑综合症病毒感染和弧菌刺激后虾体中的表达模式 |
| 3.3.4 MrFREP的FReD结构域的重组表达和纯化 |
| 3.3.5 MrFReD重组蛋白的细菌结合实验 |
| 3.3.6 MrFReD重组蛋白的糖结合实验 |
| 3.3.7 MrFReD重组蛋白的细菌凝集实验 |
| 3.3.8 MrFReD重组蛋白的细菌清除实验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 罗氏沼虾中Kruppel样因子的克隆和功能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物、菌株和病毒 |
| 4.2.2 载体、试剂和仪器 |
| 4.2.3 主要实验试剂配方 |
| 4.2.4 罗氏沼虾的免疫刺激 |
| 4.2.5 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 4.2.6 罗氏沼虾MrKLF cDNA全长克隆 |
| 4.2.7 MrKLF重组蛋白的表达和纯化 |
| 4.2.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MrKLF的组织分布 |
| 4.2.9 MrKLF在mRNA水平上的表达模式 |
| 4.2.10 RNA干扰实验(RNAi) |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 MrKLF的全长cDNA克隆序列分析 |
| 4.3.2 MrKLF的组织分布 |
| 4.3.3 MrKLF在白斑综合症病毒感染和弧菌刺激后虾体中的表达模式 |
| 4.3.4 MrKLF重组表达和纯化 |
| 4.3.5 MnKLF的RNA干扰实验和基因沉默后对抗菌肽表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（8）杂色鲍血蓝蛋白基因结构和表达规律研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 杂色鲍 |
| 1.2 血蓝蛋白 |
| 1.2.1 血蓝蛋白的结构 |
| 1.2.2 血蓝蛋白的功能 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 杂色鲍血蓝蛋白的基因结构 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 杂色鲍血蓝蛋白基因序列特征 |
| 2.3.2 杂色鲍血蓝蛋白基因的系统进化分析 |
| 2.3.3 不同物种血蓝蛋白基因结构比较 |
| 2.3.4 软体动物血蓝蛋白功能单元系统进化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 杂色鲍血淋巴对病原感染的响应 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 菌种和病毒 |
| 3.1.3 常用试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 常用仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 Ab HV病毒悬液的制备 |
| 3.2.2 哈维氏弧菌菌悬液的制备 |
| 3.2.3 人工注射与无细胞血淋巴的制备 |
| 3.2.4 无细胞血淋巴免疫酶活性的测定 |
| 3.2.5 抑菌性测定 |
| 3.2.6 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 血淋巴可溶性总蛋白浓度的变化 |
| 3.3.2 血淋巴免疫酶活性的变化 |
| 3.3.3 血淋巴抑菌性的变化 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 杂色鲍血蓝蛋白的表达响应 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 菌种和病毒 |
| 4.1.3 试验试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 常用仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 杂色鲍胚胎发育期样品采集 |
| 4.2.2 Ab HV病毒悬液、哈维氏弧菌和溶珊瑚弧菌菌悬液的制备 |
| 4.2.3 人工注射与各组织总RNA提取 |
| 4.2.4 去除RNA中的基因组DNA |
| 4.2.5 cDNA制备 |
| 4.2.6 qPCR引物设计与荧光探针制备 |
| 4.2.7 qPCR反应 |
| 4.2.8 石蜡切片 |
| 4.2.9 荧光原位杂交 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 杂色鲍胚胎发育期血蓝蛋白的表达变化 |
| 4.3.2 病原刺激后杂色鲍血蓝蛋白的表达变化 |
| 4.3.3 杂色鲍血蓝蛋白的组织分布 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 参加会议及发表的文章 |
| 致谢 |
（9）中国鲎注射副溶血弧菌后miRNA表达变化分析及miRNA电子挖掘（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 中国鲎免疫生物学研究概述 |
| 1.1.1 中国鲎概述 |
| 1.1.2 中国鲎免疫系统简介 |
| 1.2 副溶血弧菌研究概述 |
| 1.2.1 副溶血弧菌的生物学特性 |
| 1.2.2 副溶血弧菌对水产动物的危害 |
| 1.3 miRNA |
| 1.3.1 miRNA简介 |
| 1.3.2 miRNA免疫调控研究进展 |
| 1.4 miRNA研究方法 |
| 1.4.1 miRNA传统研究方法 |
| 1.4.2 高通量测序技术 |
| 1.5 miRNA靶基因的研究 |
| 1.6 本文的研究内容和意义 |
| 第2章 中国鲎感染副溶血弧菌后血液中miRNA的表达变化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 测序RNA样品的质检 |
| 2.2.2 microRNA测序数据分析 |
| 2.2.3 差异miRNA靶基因的GO功能分析 |
| 2.2.4 高表达miRNA的靶基因预测及功能分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 miRNA的高通量测序 |
| 2.3.2 保守miRNA的分析 |
| 2.3.3 isc-miR-10_R-1功能预测 |
| 2.3.4 dan-miR-125_R+2_功能预测 |
| 第3章 副溶血弧菌感染中国鲎前后血液中差异miRNA的表达验证 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验动物及菌株 |
| 3.1.2 主要仪器及试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 miRNA的PCR鉴定 |
| 3.2.2 荧光定量表达结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 中国鲎(Tachypleus tridentatus)miRNA的生物信息学预测及家族鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 中国鲎miRNA的预测 |
| 4.3 miRNA家族归类及保守性分析 |
| 4.4 miRNA前体序列系统进化分析 |
| 4.5 结果与分析 |
| 4.5.1 中国鲎miRNA的预测结果 |
| 4.5.2 miRNA家族归类及保守性分析 |
| 4.5.3 中国鲎miR-10前体序列系统发育分析 |
| 4.6 讨论 |
| 4.6.1 miRNA的电子挖掘 |
| 4.6.2 miRNA的保守性分析 |
| 4.6.3 miRNA的多样性 |
| 4.6.4 miRNA的功能 |
| 第5章 中国鲎miRNA的功能预测 |
| 5.1 数据与方法 |
| 5.1.1 数据 |
| 5.1.2 靶基因预测算法 |
| 5.1.3 靶基因功能归类分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 miRNA的靶基因预测结果 |
| 5.2.2 miRNA靶基因功能分类 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间科研成果情况 |
（10）北部湾潮间带鲎体重金属的组织分布及与主要环境因子的相关性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 重金属概述 |
| 1.1.1 重金属定义和特点 |
| 1.1.2 重金属的来源 |
| 1.1.3 重金属对生物体的危害 |
| 1.2 鲎的生物学特征 |
| 1.2.1 分类学 |
| 1.2.2 地理分布 |
| 1.2.3 生活习性 |
| 1.3 鲎资源的价值 |
| 1.3.1 科研和经济价值 |
| 1.3.2 药用价值 |
| 1.3.3 资源现状 |
| 1.4 鲎体重金属污染的研究进展 |
| 1.4.1 美洲鲎 |
| 1.4.2 中国鲎 |
| 1.4.3 南方鲎 |
| 1.4.4 圆尾鲎 |
| 1.5 研究内容、目的及意义 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 研究技术路线图 |
| 第二章 样品采集与测定 |
| 2.1 研究区域环境状况及研究基础 |
| 2.2 样品的采集 |
| 2.3 实验分析 |
| 2.3.1 海水样品预处理与测定 |
| 2.3.2 沉积物样品预处理与测定 |
| 2.3.3 生物样品预处理与测定 |
| 2.3.4 质量控制与质量保证 |
| 2.3.5 数据处理方法 |
| 第三章 北部湾潮间带鲎体重金属的分布特征与评价 |
| 3.1 鲎体重金属的含量分布差异 |
| 3.2 重金属的组织分布差异 |
| 3.3 重金属的空间分布差异 |
| 3.4 鲎体重金属评价 |
| 3.5 北部湾与其他海域鲎体重金属含量的比较 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 北部湾潮间带鲎栖息地环境质量状况 |
| 4.1 栖息地海水重金属的研究 |
| 4.1.1 海水中重金属的空间分布特征 |
| 4.1.2 综合指数法 |
| 4.2 栖息地表层沉积物重金属的研究 |
| 4.2.1 表层沉积物中重金属的空间分布特征 |
| 4.2.2 沉积物质量基准 |
| 4.3 栖息地表层沉积物重金属的形态分布和生物可利用性分析 |
| 4.4 污染源的探讨 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 鲎体重金属含量与主要环境因子的相关性 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
四、中国鲎胚胎血细胞生成的初步电镜观察（论文参考文献）
- [1]中华鲎血液中凝血相关蛋白的制备及应用[D]. 郭育. 长春理工大学, 2021
- [2]中华绒螯蟹VEGFR基因在螺原体感染过程中的功能研究[D]. 颜玉烨. 南京师范大学, 2020(03)
- [3]凡纳滨对虾基因家族扩张和可变剪切在环境适应中的作用研究[D]. 张小溪. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2020(01)
- [4]四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）配子发生、性腺发育以及性逆转的研究[D]. 蓝军南. 上海海洋大学, 2020(02)
- [5]拟穴青蟹干露胁迫应答及其细胞凋亡机制的研究[D]. 顾文彬. 浙江大学, 2020(01)
- [6]凝集素、Dorsal及Ras在主要经济虾中的免疫功能研究[D]. 黄欣. 南京师范大学, 2018(02)
- [7]纤维蛋白原相关蛋白与Kruppel样因子在罗氏沼虾先天免疫中的初步功能研究[D]. 伍磊. 南京师范大学, 2018(01)
- [8]杂色鲍血蓝蛋白基因结构和表达规律研究[D]. 赵曼曼. 上海海洋大学, 2016(02)
- [9]中国鲎注射副溶血弧菌后miRNA表达变化分析及miRNA电子挖掘[D]. 朱珊珊. 集美大学, 2016(05)
- [10]北部湾潮间带鲎体重金属的组织分布及与主要环境因子的相关性[D]. 许道全. 广西大学, 2016(02)